Antimykotica und Corticosteroide

Archiv fiir klinische u. experimentelle Dermatologie 231, 250--263 (1968)

Antimykotica und Corticosteroide

W. I~AAB

Mediziniseh-Chemisches Institut der Universitgt Wien (Vorstand Prof. Dr. F. S~ELIO~)

Eingegangen am 18. Januar 1968

Antimycotic Substances and Corticosteroids

Summary. I t has been shown that the eorticosteroids in certain low concen- trations exert a stimulating effect on yeast metabolism in vivo and in vitro; Therefore, investigations seemed warranted to determine the influence of cortieosteroids on the activity of antimycotie substances, as both were used simultaneously in topical dermatologicals. Oxygen uptake of suspensions of candida albieans and saeeharomyees cerevisiae was chosen as model for determination of various in- fluenees on fungal metabolism. Three antimycotic substances (4-chloro-2-hydroxy- benzoic acid n-butylamide, dodecyl-triphenylphosphonium bromide, dodecyl-di(fi- oxyethyl)-benzy]ammonium chloride), one antimetabolie substance (6-hydroxy- 1,3-benzoxathiole-2-one), and five steroids (hydrocortisone, triamcinolone aeetonide, cholesterol, sodium glycocholate, desoxycholic acid) were tested as to their influence of fungal respiration. Despite the fact that corticosteroids enhance oxygen uptake of fungal suspensions, no decrease in antimycotic activity of the tested substances was found due to the presence of steroids or corticosteroids. On the contrary, in three of the four antimycotie substances investigated, an increase in antifungal activity was observed under the simultaneous influence of corticosteroids. This effect might be explained with an enhancement of cellular permeability. An additional result of these series was the observation that two antimycotie substances acting simultaneously exhibit a potentiation of their effects, and not as one might expect an addition only.

Zusammen/assung. Ausgchend yon der Tatsache, dab Cortieosteroide in vivo nnd in vitro zu einer Steigerung des Stoffweehsels yon Pilzen fiihrcn kSnnen, warden Untersuchungen angestellt, ob die gleichzeitige Anwesenheit yon Cortico- steroiden antimykotisehe Aktivit~ten zu beeintriichtigen vermag. Die Versuche er- folgten an Suspensionen yon Candida albicans und Saccharomyces cerevisiae. Als MaB fiir die antimykotische Aktivit~t galt die Sauerstoffaufnahme der Mikroorga. nismen unter l~uhebedingungen (Milieu Ringer mit Glucose). Es wurden die Ver~nderungen der Steffwechselaktivit~t der Pilze unter der Einwirkung yon drei Anti- mycotica (4-Chlor-2-hydroxybcnzoes~ure-n-butylamid, Dodecyl-triphcnylphospho- niumbromid, Dodeeyl-di(fl-oxy~thyl)-benzylammoniumchlorid), einer zellatmungshemmenden Substanz (6-Itydroxy-l,3-bcnzoxathiol-2-on) und fiinf Steroiden (tIy- drocortison, Triamcinolonacetonid, Cholesterin, Natriumglykocholat, Desoxychol- si~ure) gepriift. Obwohl die hormonal wirksamen Steroide zu einer Aktivierung des Pilzstoffwechsels fiihrten, war in keinem einzigen Falle eine Abschw~chung antimykotiseher Aktivitgten bei gleiehzeitiger Auwesenheit yon Steroiden festzustellen. Bei drei der vier gepriiften Wirkstoffe land sich sogar eine Steigerung der antimykotischen Aktivitgt. Dieser Effekt diirfte auf eine Verbesserung der Permeations-

Antimykotic~ und Corticosteroide 251

bedingungen zuriickgehen. Als Nebenbefund ergab sich in den Untersuchungs- reihen, dal~ sich zwei Antimykotica bei gleichzeitiger Einwirkung in ihrer Aktivit~ potenzieren und nicht nur summieren.

Eiuleitung Die Lokalbehandlung mykotischer Hautveri~nderungen erfolgt h~ufig

mit Pr/~parationen, die auger einer antimykotisch wirksamen Substanz noch ein Cortieosteroid enthalten. Aus klinischer Sieht semen die Summierung antimykotiseher Effekte mit den bekannten Cor~ieos~eroid- wirkungen sehr vielverspreehend und die praktisehen Erf~hrungen konnten diese Uberlegungen best/~tigen. In mikrobiologiseher Hinsicht erheb~ sieh bei der gleichzeitigen Anwendung antimykotiseher Sub- stanzen mit Cortieosteroiden allerdings die Frage, ob nieht eine Ab- sehw~ehung der antimykotischen Aktivit~t als Folge der in friiheren Untersuehungen beobaehteten Aktivierung des Pilzstoffweehsels dutch Corticosteroide eintritt [28, 31]. Zur Kl~rung dieser Frage wurden Warburg-Versuehe durehgeffihrt, um die Ver~nderungen yon anti- mykotisehen Aktivit~ten in Gegenwart yon Cor~ieosteroiden am Modell des Sauerstoffverbrauehes yon Pilzzellsuspensionen zu erfassen. Im folgenden wird fiber die Ergebnisse derartiger Untersuehungen an zwei Pilzst/~mmen, Candida albieans und Saceharomyces eervisiao, be- richter.

Material und Methoden 1. Testkeime

a) Candida albicans. Als Testorganismus wurde der gleiehe Stature verwendet wie in frfiheren Untersuehungen [27,28,31]. Frau Dr. J. TH~Nv,~ Yon der II. Universiti~ts-Hautklinik in Wien sei an dieser Stelle nochmals ffir die freundliehe Uberlassung des Candidastammes herz]iehst gedankt. Am zweiten Tag nach der Uberimpfung yon der Stammkultur auf flfissigen S~bouraud wurde zentrifugiert (5 rain bei 4000 r.p.m.), der Uberstand dekantiert und der Bodensatz mehrmals mit Original-Ringer-L5sung pH 7,4 gewaschen. Ffir die Atmungsversuche erfolgte die Bereitung einer 5o/oigen Suspension, yon der 0,3ml in Warburg-Gef/iBe eingebracht wurden.

b) Saccaromyces cerevisiae. Ein etwa bohnengroBes S~fick B~ckerhefe wurde in 25 ml Original-Ringer-LSsung pH 7,4 suspendiert (Magnet- riihrer) und mit zwei Spatelspitzen Glucose ffir 30 rain bei 37~ im Brutschrank inkubiert. Anschliel~end wurde die Suspension yon Saeeharo- myces cerevisiae zentrffugiert (5 rain 4000 r.p.m.) und mehrmals mit Ringer-LSsung gewaschen. Ftir die Atmungsversuche erfolgte die Bereitung einer 5~ Suspension, yon der jeweils 0,1 ml in Warburg- Gef~l]e eingebracht wurden.

252 W. ~ A ~ :

2. Wir~to/]e I n s g e s a m t wurden in den Versuchen f i inf Wirks tof fe eingesetzt ,

yon denen sich jedoch nu t vier als un t e r den geschi lder ten Bedin- gungen v e r w e n d b a r erwiesen. I n Vorversuchen wurde be i den einzelnen Subs t anzen A n t i m y k o t i c a jeweils der Konzen t r a t i onsbe re i ch e rmi t t e l t , in d e m eine s ignif ikante Verr ingerung der Sauers toff~ufnahme der Pilzzell- suspensionen erfolgt.

a) 6-Hydroxy-l-3-benzoxathiol-2-on. Strukturformel, Summenformel und ~ole- kulargewieht dieses zella~mungshemmenden WirksVoffes aus der Gruppe der Ben- zoxa~hiole (vgl. [6, 7, 37]) siald in Schema i darges~elI~. Von dieser Substanz wurden in reinem ~thanol versehieden konzentrierte LSsungen hergestellt: 2 .10-2M, 5 �9 10-3 M, 10 -2 M, 6 �9 10 -a M, 10 -a ~f, 10-4 M und 10 -5 M. Von den LSsungen kamen jeweils 0,l ml in die Warburg:Gef~fle, was bei einem Gesamtvolumen von 3,0ml Endkonzentrationen des Wirkstoffes yon 6,7.10-aM, 1,6.10-3M, 3,3 �9 10 -~ M, 2 �9 10 -a M, 3,3 �9 10 -5 ~ , 3,3 �9 10 -6 ~ und 3,3 �9 10 -7 M entsprich&

/ S

\c=o .o /

Schema 1.6-Hydroxy-l,3-benT, oaxathio]-2-on; C7H4038 M = 168

b) 4-Chlor-2-hydroxybenzoesiiure-n-butylamid Strak~urformel, Summenformel und Molekulargewicht dieses antimykotischen Wirkstoffes [24] sind in Schema 2 dargestellt. 4-Chlor-2-hydroxybenzoes~ure-n-bu~ylamid wurde ebenfalls in reinem _~thanol gel6st (2,4 mg/ml, 1~2 mg/ml), Von diesen LSsungen wurden 0,1 ml in die Warburg-Gef~Be eingebrachr Was Endkonzentrationen des Wirkstoffs yon 80 ixg/ml (3,5.10 -4 ~ ) und 40 ~zg/ml (1,7.10-4 M) entspricht.

/%~ CI-{~-~--C--N.

\CH2__CH2--CH2--CH 3 Schema 2. 4.Chlor-2-hyctroxy-be~oes~,ure-n-bu~ylamid; C~I-II~02~(]] IV[ = 22'I

c) Dodecyl-triphenyl-phosphoniumbromid. S~rukturformel, Summenformel und Molekulargewieht dieses Antimykoticums aus der Gruppe der Inver~seifen Sind ii~ Schema 3 d~rgestell~. Ktinisch und mikrobiologiseh gehSr$ diese SUbs~anz zu deA st~rksten Antimykotic~ [1, 2,8,11-- 15, 20,33,36]. Auch dieser Wirks~off wurde, in ~thano] gel5st. Die Endkonzentrationen im Versuchs~ns~tz betrugen 5 t~g/ml (10 -~ M), 1 ~g/ml (2.10 -~ M) und 0,5 f~g/ml (i0 -6 M).

+ Br-

Schema 3. Dodecyl-triphenyl-phosphoniumbromid; C~oH~oPBr M m 511

Antimykotiea und Cortieos~eroide 253

d)Dodecyl-di-(fl-oxy~ithyl)-benzyIammoniumchlorid. Strukturformel, Summen- formal und ~olekulargewieh~ dieses Antimykoticums aus der Gruppe der Invert- seffen sind in Schema 4 darges~ellt. ~ber das antimyko~isehe Spektrum dieser Substanz liegen bereits ausffihrliehe Untersuehungen vor [10]. Dieser Wirkstoff wurde ebenfalls in reinem Jkthanol gelSst ~md in Endko~zentrationen yon 20 ~g/ml (5 �9 10 -~ ~ ) und 15 ~g/ml (3,8 �9 10 ~ M) eingesetzt.

@ - c H 2 - ~-cH2- cH2- cH2- c.2- c~ e- %-cHT%-cH2-c~ e- %-c~s l Cl- CH2--CH2-- OH

Schema 4. Dodeeyl-dioxy~i~hyl-benzyl-ammoninmchlorid; C2~H~O~NC1 M = 399

e) 3,5-Dibenzyl-tetrahydro-l,3,5-thiadiazin-2-thion. S~I~_kturformel, Summen- formel und Molekulargewieht dieses An~imyko~icums aus der Gruppe der Thia- diazine sind in Schema 5 wiedergegeben. Aus Griinden seiner sehlechten LSslichkeit in Wasser und Athanol (vgl. [17,21]) konnte dieser Wirkstoff in den vorliegenden Versuehen nich~ eingesetz~ warden. Der Zusa~z yon 0,1 ml LSsung des Wirkstoffes zu 2,9 ml w~I3riger Phase im Warburg-KSlbchen bewirkte ein Ausfallen des Wirk- stoffs und es kona~e keinerlei antimykotisehe Aktivit~t nachgewiesen werden.

Schema 5. 3,5-Diber~yl-tetrahydro-l,3,5-t~hiaein-2-thion; C16HlsNgS ~ IV[ = 3 0 2

3. Steroide und Corticosteroide

I n don vor l iegendon Unte r suchungen wurdon zwei Cort icosteroide, Hydroco r t i son un4 Tr iamcinolonacetonid , eingesetzt . AuBerdem er- fo lg ten auch Exper imenr fiber die E i~wi rkung yon dre i n ich t ho rmona l wi rksamen Steroiden, Cholesterin, Na t r i umg lykoc ho l a t und Desoxychol- sgure.

Von den untersuehten Steroiden und Corticosteroiden wurden jeweils 10 mg in 10 ml reinem ~thanol gel6st. Von diesen L6sungen kamen jeweils 0,1 ml ( = 100 ~g Steroid) in die Warburg-K61behen, was bei einem GesamCvolumen yon 3,0 ml End- konzentrationen der Steroide yon 33 tzg/ml entspricht (e~wa 10 -a 1~). Dies ist die gleiche Konzentration, die in friiheren Versuehsreihen eingesetzt worden war [27].

Fiir die kombinierten Versuche (Wirkstoff plus Steroid bzw. Cortieosteroid) wurden 10 mg des Steroids oder Cortieosteroids in 10 ml alkoholiseher Wirkstoff- L6sung (vgl. unter Punkt 2) gel6st. Dies erwies sich deshalb als nobwendig, da die Konzentratiorl des Athanols in den Atmungsversuchen 3,30/0 nicht fibersteigen sell (0,1 ml Alkohol auf 3,0 In] Gesamtvolumen).

254 W. RAAB:

4. Durch/iihrung der Versuehe Insgesam~ konnten 112 Atmungsversuche mit je 12 Warburg-Gefgl3en aus-

gewertet werden (54 Versuche mit Candida albicans, 58 Versuche mit Saccharomyces cerevisiae). ~ach Beschicktmg der Warburg-GefgBe mit den PilzzeUen (0,3 ml Candida albicans Suspension, 0,1 ml Saccharomyces cerevisiae Suspension) wurden 0,2 ml 5~ Glucose-L6sung zugegeben und mit Original-Ringer-L6sung pH 7,4 auf 2,9 ml Gesamtvolumen aufgeffillt. Zum SchluB erfolgte der Zusatz yon 0,1 ml Athanol (reinem ~thanol in den Kontrollen, alkoholischer LSsung eines Wirk- s~offes, alkoholischer LSstmg eines Steroids oder alkoholiseher L6sung yon Wirkstoff plus Steroid). Das Zentralgefg~ der Warburg-KSlbehen enthielt in allen Ver- suchen 0,2 ml 20~ Kalflauge zur Absorption yon gebfldetem Kohlendioxyd. Als Gasphase wurde in sgmtlichen Versuchen Luft verwendet, die Temperatur betrug jeweils 37 ~ C. ~qach Temperaturangleichung durch 10 rain wurden die Warburg-Gefgi~e verscblossen und mit der Registrierung des Sauerstoffverbrauchs begonnen (Ablesungen alle 10 rain fiber 1 Std.).

Die Effek~e der nicht hormonal wirksamen Steroide wurden nut an der zellatmungshemmenden Substanz (6-Hydroxy-l,3-benzoxathiol-2-on) ausgetestet. Die Antimycotika wurden aus praktisehen Gesichtspunkten nur in ihrer Beeinflul~- barkeit dureh Corticosteroide untersucht.

Ergebnisse a) Allgemeines. Unter den gew~hlten Versuchsbedingtmgen zeigten

die Suspensionen yon Candida albicans im Durchschnitt einen Verbrauch yon 181 ~1 Sauerstoff pro Stunde. Die verwendeten Suspensionen yon Saccharomyces cerevisiae vera tmeten durchschnittlich 177 ~l Sauer- stoff pro Stunde. Es ist hierbei zu berficksichtigen, dal~ der Sauerstoff- verbrauch yon Pilzzellsuspensionen in einem Mih'eu mit 3~ ~ thanol hSher ist als in reiner Ringer-LSsung. Die einzelnen Ablesungen in den 10miTt-IntervaUen ergaben fiber die gesamte Versuehsperiode eine lineare Ztmahme des Sauers~offverbrauehes. Die beiden verwendeten Testkeime zeigten in ihrem Verhalten gegenfiber den eingesetzten Wirkstoffen nur geringe Unterschiede.

b) Die W~rkung der Testsubstanzen. Die Anwesenheit yon 6-Hydroxy- 1,3-benzoxathiol-2-on, Dodeeyl-triphenylphosphoniumbromid, 4-Chlor- 2-hydroxybenzoes~ure-n-butylamid oder Dodeeyl-di(fl-oxys - benzylammoniumchlorid im Versuchsansatz ergab jeweils einen konzen- trationsabh/~ngigen Abfall des Sauerstoffverbrauches yon Candida albicans und Saccharmomyces cerevisiae. In den Abb. 1 und 2 sin4 die Atmungskurven yon Candida albicans und Saccharomyces cerevisiae in Gegenwar~ yon 6-Hydroxy-1,3-benzoxathiol-2-on in sieben verschiede- nell Konzentrat ionen wiedergegeben. In der Abb. 3 ist der Sauerstoff- verbrauch yon Saccharomyces cerevisiae in Gegenwart yon 40 9g/ml und 80~g/ml 4-Chl0r-2-hydroxybenzoes~ure-n-butylamid dargestellt. Die Ergebnisse tier Atmungsversuche mit den anderen Antimykotica sollen unter Punkt 4 noch ausffi_hrlicher beschrieben werden.

A n t i m y k o t i c a u n d C o r t i c o s t e r o i d e 255

201 ~2�9149 10 20 30 gO 50 60

A b b . 1. D e r S a u e r s t o f f v e r b r a u c h v o n C a n d i d a a l b i c a n s u n t e r d e r E i n w i r k u n g v o n

6 - H y d r o x y - l , 3 - b e n z o x a t h i o l - 2 - o n .

o o K o n t r o l l e ; o o 3 ,3 �9 10 -~ M W i r k s t o f f ;

+ + 3,3 �9 10 -~ ~ W i r k s t o f f ; �9 �9 6,7 �9 10 -4 ~ W i r k s t o f f ;

x x 3,3 �9 10 -~ M W i r k s t o f f ; �9 �9 1,7 �9 10 -a M W i r k s t o f f ;

~ 2 �9 10 -~ 1~I W i r k s t o f f ; * * 6,7 �9 10 -a 1~ W i r k s t o f f

204 . / / /

10 20 30 4,0 50 . 60 m l R

A b b . 2. D e r S a u e r s ~ o f f v e r b r a u c h y o n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e u n t e r d e r E i n -

w i r k u n g y o n 6 - H y d r o x y - l , 3 - b e n z o x a t h i o l - 2 - o n .

o o K o n t r o l l e ; �9 �9 3,3 �9 10 -4 M W i r k s t o f f ;

x x 3 ,3 �9 10 -~ 3/I ~Virks toff ; �9 �9 6,7 �9 10 -4 1~I W i r k s t o f f ;

�9 ~ 3,3 �9 10 -8 M W i r k s t o f f ; �9 �9 1,7 �9 10 -a M W i r k s t ~ f f ;

o ~ 2 �9 10 -4 3/I Wi rks~of f ; �9 * 6,7 �9 10 -a iY[ W i r k s t o f f

17 Arch. klin. exp. Derm.. Bd. 281

256 W. RAin:

Dodecyl-triphenylphosphoniumbromid und Dodecyl-di(fl-oxy~thyl)- benzylammoniumchlorid sind in einem dermatologischen Antimykotieum in kombinierter Form enthalten. Die relativen Konzentrationen be- tragen 1:4. In Atmungsversuchen an C~ndida albicans wurden nun die Ver~nderungen der Sauerstoffaufnahme unter der kombinierten Ein- wirkung der beiden Antimykotica aus der Gruppe der Inver~seifen registriert, wobei die gleichen relativen Konzentrationen eingesetzt

180 -

j~t o 2

120

60

,jo Kontrol/e 3 Y, Alkohol

o ~ o 40jJg / m l COBA

= t - ^ . �9

.,I<' ~ 1 1 " ]4ujJg ~'ml COBA +

~ . , ~ : ~ " " ~ " [ 33 ug / ml Hydrocortison

10 20 30 ~0 50 60 rain

Abb. 3. Der Sauerstoffverbrauch yon Saccharomyces cerevisiae unter der Ein- wirkung yon 4-Chlor-2-hydroxy-benzoes~ure-n-butylamid (COBA) und ttydro-

cortison

wurden, wie sie in der dermatologischen Praparation vorliegen. Die ent- sprechenden Mengen der beiden Substanzen waren in 0,1 ml reinem ~thanol gelSst. Wie in Tab. 1 zusammengestellt, ergab sich Bin deut- lieher Potenzierungseffekt, d. h., die antimykotisehe Aktivitat gemessen an der Verringerung des Sauerstoffverbrauches der Candid~ albicans Suspensionen war in den kombinierten Versuchea h6her ~ls sie auf Grund einer Summierung der beiden Wirkungskomponer~ten zu erwarten gewesen w/~re.

c) Die Wirkung yon Corticosteroiden und Steroiden. An den Sus- loensionen yon C~ndida albicans bewirkten die beiden untersuchten Corticosteroide ]tydrocortison und Triamcinolonacetonid eine deutliche, statitisch signifik~nte Steigerung des Sauerstoffverbrauches ; mit I-iydro- cortison erfolgte die Steigerung auf 107~ der Kontrolle (P ~ 0,05!), mit Triamcinolonacetonid auf 109~ (P ~ 0,01 !). Die nicht hormonal wirksamen Steroide zeigten ein unterschiedliches Verhalten: Cholesterin und Natriumglykocholat nahmen praktisch keine Einwirkung auf die

Antimykotica und Corticosteroide 257

Sauers tof faufnahme, Desoxycholsgure ve rursaeh te einen Abfa l l der A t m u n g s a k t i v i t g t a u f 930/0 der Kont ro l len . E inze lhe i ten s ind in Tab. 2 zusammenges te l l t .

A n den Suspensionen yon Saccharomyces cerevisiae n a h m yon al ien un te r such ten Cort icosteroiden und Stero iden n u t Tr iamcino lonace ton id einen deu t l i chen EinfluB a u f den Sauers tof fverbrauch (vgl. Tab. 2).

Tabelle 1. Die AtmungsaktivitSt yon Candida albicans Suspensionen unter der Ein- wirkung zweier /ungicider Substanzen

Substanz A (Dodeeyl-triphenyl- phosphoniumbromid) b~g/ml

Substanz B (Dodecyl-dioxyEthyl- benzylammonium ehlorid) ~g/ml

Atmungshemmung (o/0 der Kontrolle)

5 -- 58 2,5 -- 30

- - 20 44 10 9

2,5 10 75

Tabelle 2. Der Sauersto//verbrauch von Candida albicans und Saccharomyces cerevisiae unter der Einwirkung yon 6-Hydroxy-l,3-benzoxathiol-2-on und Steroiden

6-Hydroxy-l,3- Steroid (10`4 M) Atmungsaktivitgt benzoxathiol-2-on C. albie. Saech. eerev. (molare Konzentration) ~ O/o

- - - - 100 100 -- Hydrocortison 107 102 -- Triameinolonacetonid 109 106 -- Cholesterin 102 102 -- Natriumglykocholat 98 101 -- Desoxycholsgure 93 104

3,3 �9 10 -4 -- 47 44

3,3.10`4 ttydrocortison 43 39 3,3" 10 ̀4 Triamcinolonacetonid 44 36 3,3.10`4 Cholesterin 47 37 3,3.10`4 Natriumglykocholat 46 38 3,3" 10`4 Desoxycholsgure 48 43

d) Die Wirkung der Testsubstanzen in Gegenwart yon Corticosteroiden und Steroiden. I n Tab. 2 s ind die Vergnderungen der a tmungshemmen- den W i r k u n g yon 6-Hydroxy- l ,3 -benzoxa~hio l -2 -on ( 3 , 3 . 1 0 -4 M) durch zwei Corbicos~eroide und drei n ich t ho rmona l wi rksame S t e r o i d e zu- sammengestel l~. A n Suspensionen yon Candida a lb icans ff ihrten H y d r o - cor t i son und Tr iamcino lonace ton id (jeweils 33 ~g/ml) zu einer Ver- s t~rkung der a t m t m g s h e m m e n d e n W i r k u n g des Benzoxa th io lder iva tes .

i7"

258 W. RAA~:

A n Saccha rom y ces cerevis iae war dieser Ef fek t noch deu t l i che r aus - gepr~gt . Die n i c h t h o r m o n a l w i r k s a m e n Stero ide v e r u r s a c h t e n p r a k t i s c h ke ine V e r ~ n d e r u n g e n der a t m u n g s h e m m e n d e n A k t i v i t s y o n 6 - I t y d r o x y - 1 ,3 -benzoxa th io l -2 -on a u f Can d i d ~ a lb icans , a n d e n S u s p e n s i o n e n y o n S a c c h a r m o y c e s cerevis iae t r a t j edoch z u m Tei l e ine V e r s t ~ r k u n g de r a t m u n g s h e m m e n d e n W i r k t m g e in (Tab. 2).

I n Versuchsans i~tzen m i t ge r inge ren K o n z e n t r a t i o n e n y o n 6 - H y d r o x y - 1 ,3 -benzoxa th io l -2 -on erfolgte d u t c h Z u g a b e y o n Cor t i cos te ro iden e ine

Tabelle 3. Der Sauersto]]verbrauch yon Candida albicans unter der Einwirkung von Antimykotica (bzw. zellatmungshemmender Substanz) und Corticosteroiden

Wirkstoff Endkonzentration Restatmung (~ der Kontrolle)

ohne Hydro- Triamcinolon- Cortico - cortison acetonid

i~g/ml steroid (33 ~g/ml) (33 ~g/ml)

6-Itydroxy-l,3-benz- 57 (3,3 �9 10 -4 M) 47 43 44 oxathiol-2-on 39 ( 2 �9 10 -4 h~) 81 70 67

4-Chlor-2-hydroxy- 80 (3,5 �9 10 -~ M) 31 26 27 benzoes~ure-n-butyl- 40 (1,7 �9 10 -4 M) 83 72 77 amid

Dodecyl4riphenyl- 5 ( 10 .5 M) 42 43 45 phosphoniumbromid 1 ( 2 �9 10 .6 )]I) 76 75 79

0,5 ( 10 -6 ~ ) 95 90 93

Dodecyl-dioxy~thyl- 20 ( 5 �9 10 -5 M) 56 48 50 benzylammoniumchlorid 15 (3,8 .10 -5 M) 70 59 57

Tabelle4. Der Sauersto]]verbrauch yon Saccharomyces cerevisiae ~nter der Ein- wirkung yon Antimykotica (bzw. zellatmungshemmender Substanz) und Cortico-

steroiden

Wirkstoff Endkonzentration

~g/ml

Restatmung (~ der Kontrolle)

ohne Hydro- Triamcinolon- Zusatz cortison acetonid

(33[zg/ml) (33~g/ml)

6-Hydroxy-l,3-benz- 57 (3,3 �9 10 -4 M) 44 oxathiol-2-on 39 ( 2 �9 10 -4 !YI) 76

4-Chlor-2-hydroxy- 80 (3,5- 10 -4M) 40 benzoes~ure-n-butyl- 40 (1,7 �9 10-4 M) 78 amid

Dodecyl-triphenyl- 5 ( 10 -~ M) 49 phosphoniumbromid 1 ( 2 �9 10 -6 M) 80

0,5 ( 10 -eM) 98

20 ( 5 - 1 0 -~M) 60 (3 ,8 .10 -sM) 76

I)odecyl-dioxy~thyl- benzylammoniumchlorid 15

36 34 64 60

34 32 62 63

46 76 95

50 67

48 77 93

48 64

Antimykotica trod Corticosteroide 259

wesentlich deutlichere Steigerung der atmungshemmenden Aktivit~t; bestand z. B. an Suspensionen von Candida albicans in Gegenwart von 6-Hydroxy-l,3-benzoxathiol-2-on in einer Endkonzentration yon 2 �9 10 -4 M noch eine Restatmung yon 81~ der Kontrolle (reines J~thanol), so land sich in gleichen Versuchsansiitzen mit 33 ~g/ml ttydrocortison nur mehr eine Restatmung yon 70~ oder mit 33 ~g/ml Triamcinolon- acetoni4 yon 670]0 (vgl. Tab. 3). Auch an Saccharomyces cerevisiae erfolgte eine deutlichere Verst~rkung der atmungshemmenden Wirkung yon 6-Hydroxy-l,3-benzoyathiol-2-on in einer Konzentration yon 2 �9 10 ~a M durch den Zusatz yon Corticosteroiden (vgl. Tab. 4).

Gleiche Ergebnisse hatten auch die Versuchsansi~tze mit Dodecyl- di(fl-oxy~thyl)-benzylammoniumchlorid und 4-Chlor-2-hydroxybenzoe- ss Der Zusatz von Corticosteroiden ffihrte zu einer Versti~rkung des antimykotischen Effektes, wobei diese Wirkung beim Vorliegen geringerer Konzentrationen des Antimykoticums deutlicher war als bei hSheren Konzentrationen. In den Tab. 3 und 4 sind die Ergebnisse an Candida albicans und Saccharomyces cerevisiae zusammengestellt.

Abb. 3 zeigt den Verlauf der Atmungskurve von Saccharomyces cerevisiae unter der Einwirkung yon zwei verschiedenen Konzeutra- tionen an 4-Chlor-2-hydroxy-benzoesi~ure-n-butylamid mit u n d ohne Zusatz yon Hydrocortison. Auch bier ist die Steigerung der antimykotischen (atmungsdepressiven) Wirkung durch das Corticosteroid bei der geringeren Wirkstoffkonzentration deutlicher als bei der hSheren.

Der sti~rkste in den vorliegenden Versuchen gepriifte antimykotische Wirkstoff, Dodecyl-triphenyl-phosphoniumbromid, zeigte die schw~chste BeeinfluBbarkeit seiner Aktivit~t durch Corticosteroide. In Konzen- trationen yon 5 vg/ml (10 -5 M) war weder an Candida albicans noch an Saccharomyces cerevisiae eine Steigerung der atmtmgshemmenden Wirkung dutch Corticosteroide festzustellen. Bei Vorliegen geringster Konzentrationen (0,5~g/ml) land sich in Gegenwart yon Cortico- steroiden regelm~Big eine schwache Zunahme der antimykotischen Aktivit~t (vgl. Tab. 3 und 4).

Diskussion

Die Registrierung der Sauerstoffaufnahme yon Pilzzellsuspensionen in Ruhe- oder Proliferationsphase eignet sich sehr gut zur Beurteilung antimykotischer Aktivit~ten ~md erweist sich bei bestimmten Frage- stellungen den iiblichen Methoden (Plattentest, Diffusionstest, Reihen- verdfinnungstest) mitunter fiberlegen. Aus diese Tatsache wurde bereits yon mehreren Autoren hingewiesen [3, 5, 22, 23, 35]. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dad die Warburg-Methode die Erfassung kombinierter Effekte unter der Einwirkung verschiedener Wirkstoffe

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ermSglicht. Die Grenzen :der l~ethoden liegen auch bier in dot LSslichkeit der zu prfifenden Substanzen. 3,5-Dibenzyl-tetrahydro-l,3,5-thiadiacin- 2-thion konnte z.B. in den vorliegenden Untersuchuugsreihen nicht eingesetzt werden. I-IJerfiir scheint der Plattentest giinstiger, da er trotz Ausfallen der unlSslJchen Substanzen eine Beurteilung der antimykotischen Aktivit~t zul~13t [17, 21].

Die zellatmungshemmende Wirkung yon 6-Hydroxy-l,3-benzoxathiol-2-on auf Pilze l~Bt sich im Warbarg-Versuch noch bis zu einer Konzentration yon 5,7 ~g/ml (3,3.10 -5 M) nachweisen; in den iiblichen Testungen warden erst 35mal h6here Konzentr~tionen errant [6,7, 37]. Von den beiden getesteten Invertseifen, Dodecyl-triphenylphosph0nium- bromid und Dodecyl-di(fl-oxy~thyl)-benzylammoniumchlorid werden die antimykotischen Grenzkonzentrationen gegen Helen mit 1:50000 und 1:20000 angegeben [10]. Die Prfifung der fungiciden Aktivit~t dieser beiden Substanzen im Warburg-Versuch ergab praktisch die gleiche Relation.

Die Corticosteroide Hydrocortison und Triamcinolonacetonid zeigten in den vorliegenden Untersuchungen einen deutlich aktivierenden Ein- flul~ auf den Sauerstoffverbrauch von Candida albicans und Saccharo- myces cerevisiae. In gleichen Untersuchungsreihen hatte sich bei Ver- wendung wasserlSslicher Corticosteroide (6-Methyl-prednisolon-hemi- succinat, Methylenprednisolon-di/~thylaminoacetat-HCl) eine noch st/irkere Aktivierung (bis zu 130~ der Kontrolle) ergeben [31]. Die nicht hormonal wirksamen Steroide (Cholesterin, Natriumglykochola~, Desoxychols/~ure) nahmen keine signifikante Einwirl~ng auf den Sauer- stoffverbrauch yon S~ccharomyces cerevisiae. An Candida albicans fiihrte Desoxychols/~ure zu einer Abnahme des Sauerstoffverbrauches auf 930/0 der Kontrolle.

Die atmungshemmende Aktivit/it yon 6-Hydroxy-l,3-benzoxathiol-2- on wurde in Gegenwart yon Corticosteroi4en versts ein Effek~, der mit den nicht hormonal wirksamen Steroiden zum Teil reproduziert werden konnte (vgl. Tab. 2). Diese Ergebnisse stehen in ~bereinstimmung zur Verst~rkung der zellatmungshemmenden Wirkung yon 6-Hydroxy-l,3- benzoxathiol-2-on in anderen Zellsystemen [29, 30].

Die beiden klinisch zusammen mit Corticosteroiden eingesetzten Antimyk0~iCa 4-Chlor-2-hydroxy-benzoes~ure-n-butylamid un4 Dodecyl- di(fi-oxy/~thyl)-benzylammoniumchlorid zeigten ebenfalls in Gegenwart yon Hydrocortison oder Triamcinolonacetoni4 eine vers$/~rk~e fungicide Wirkung. Be'nn Dodecyl-triphenylphosphonlumbromid lag nut eine fragliche Verst/irlmng der antimykotischen Wirkung durch Cortico- steroide vor, zweifellos kam es aber niemals zu einer Abschws der Aktivit~t. ]3etrachte~ man die relativen Konzentrationen an Anti- mykoticum und Cortioosteroiden, so lag nur beim Dodecyl-di(~-oxy-

Antimykotica trod Corticosteroide 261

~thyl)-benzylammoniumchtorid die Verst~rkung des antimykotischen Effektes durch Hydrocortison in dem gleiehen Verhs vor, in dem die beiden Substanzen kombiniert in der Praxis eingesetzt werden.

Untersuchungen des Einflusses yon fungistatisehen Antibiotica (Nystatin, Pimariein) in Gegenwart yon Corticosteroiden (Hydro- cortison, Triamcinoton) auf den Sauerstoffverbrauch yon Candida albicans und Saeeharomyces cerevisiae haben ergeben, dab die Cortico- steroide die antimykotische Aktivits der Antibiotica (Pimariein) steigern [27, 28]. Dies war insofern yon Bedeuttmg, da eine Hemmung der Aktivit~t yon Nystatin dureh versehiedene Sterole beschrieben wurde [4,18]. Bei der Steigerung der Wirksamkeit yon Fmlgistatica dutch Cortieosteroide hatte sich die Frage erhoben, ob dieser Effekt ,fiber eine Verbesserung der LSslichkeit de r Antibiotica oder fiber Steroid- ~wirkungen an der Oberfl~che yon Pilzzellen (vgl. [9, 32]) zustande kommt. Es wurde auch die Uberlegung angestellt, ob nicht die an die Zellober- fl~ehe angelagerten Cortieosteroide zus~tzliche Haftptmkte fiir die Anti- biotica der Tetraenreihe darstellen. Bekanntlich bedarf die Wirksamkeit v0n Nystatin der Gegenwart yon Sterolen an der Oberfl~che des mikrobiellen Organismus [16,19], eine Voraussetzung, die nach den neuesten Untersuchungen ffir Pimaricin nicht ganz zutrifft [34, 38].

Bei den in den vorliegenden Untersuchungen eingesetzten anti- mikrobieI1en Substanzen handel~ es sieh durehwegs um solche, deren Wirksamkeit keiner Sterole an der Oberfi/~che der mikrobiellen Organis- men bedarf, tiler f/~llt also der Faktor der ,,Haftpunkte" ffir eine eortieo- steroidbedingte Verst/irkung der hktiviti~ weg. Da die eingesetzten Substanzen durchwegs in 3~ Alkohol gut 16slieh sindi dfirfte auch die L6slichkeitsverbessertmg keine ausreichende Erkl/irung fiir die Ver- st~rkung der atmungshemmenden Wirkung bei drei der vier geprfiften Substanzen darstellen. Es ist viel wahrscheinlicher, dab die Corticoste- roide ein rascheres Eindringen der Wirkstoffe in die Pilzzellen erm6g- lichen, also die Resistenz der Pilze schwiichen.

l~fir die Praxis liegt die eigentliche Bedeutung der hier berichteten Untersuchungsergebnisse in der Tatsache, dab in keinem einzigen Fall und bei keiner einzigen Konzentration eine Abschwi~chung der antimykotischen Aktivit/it einer der eingesetzten Substanzen durch die gleichzeitige Anwesenheit yon Corticosteroiden zu beobachten war. Diese exl3erimentellen Ergebnisse untermauern die klinische Erfahrung der zufriedenstellenden antimyk0tischen Wirkung yon Lokaltherapeutica, die neben einer antimikrobiellen Substanz noch ein Corticosteroid enthalten.

Als Nebenbefund ergab sieh in den vorliegenden Untersuehungen, dal] sich zwei Antimycotiea ~hnlieher ehemischer Konstitution (Invert, seffen) in ihrer atmtmgsdepressiven Wirkung auf Pilzzellsuspensionen potenzieren und nieht nur addieren, wie zu erwarten gewesen w~re.

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Antimykotica und Corticosteroide