(1)

ปยศร สนทรนนท Piyasiri Soontornnon

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาชวเคม

มหาวทยาลยสงขลานครนทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master of Science in Biochemistry Prince of Songkla University

2551 ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

สารตานอนมลอสระในดอกดาหลา Antioxidants in Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith

(3)

ชอวทยานพนธ สารตานอนมลอสระในดอกดาหลา ผเขยน นางสาวปยศร สนทรนนท สาขาวชา ชวเคม ปการศกษา 2551

บทคดยอ งานวทยานพนธน เปนการศกษาสารตานอนมลอสระซงไดรบความสนใจอยางมากในปจจบน สารตานอนมลอสระทพบโดยทวไปจะพบในผก ผลไม เชน วตามนซ วตามนอ สารกลมคารโรทนอยด ฟลาโวนอยด และ กลมไทออล (-SH) พชตวอยางทใชศกษาเปนพชพนบานในภาคใตทงหมด 6 ชนดคอ ผลมะอก (Solanum stramonifolium Jacq.) ดอกดาหลา (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) ผลหวา (Syzygium cumini (L.) Skeels)ดอกเขม (Ixora chinensis lamk) ใบทามง (Litsea petiolata Hook. f.) และ ใบเหมยง (Gnetum gnemon var. tenerum Markgr) ไดทาการศกษาสารตานอนมลอสระทงหมด 4 ชนดคอ ปรมาณสารประกอบฟนอลก ปรมาณเบตา-แคโรทน ปรมาณวตามนอ และ ปรมาณวตามนซ จากผลการทดลองหาปรมาณสารตานอนมลอสระตาง ๆ ในเปลอกมะอก เนอมะอก ดาหลา หวา ดอกเขม ใบทามง และ ใบเหมยง พบวาสารสกดจากพชเกอบทงหมดมสารตานอนมลอสระดงกลาวในปรมาณทสามารถวเคราะหได ยกเวน เบตา-แคโรทน จากใบทามงและใบเหมยง รวมถงวตามนซจากใบทามง การหาคาความสามารถในการดกจบสารอนมลอสระ DPPH •ดวยสารสกดจากพชตวอยางใชสารสกดปรมาณฟนอลกเทานน เนองจากสารประกอบฟนอลกเปนสารทพบมากทสดในพช โดยรายงานในรปของคา 50IC (ความเขมขนของสารประกอบฟนอลกทสามารถลดคาการดดกลนแสงของ DPPH • ได 50%) พบวา สารสกดจากดอกดาหลาจะใหคา 50IC ตาทสด คอ เมอเวลาผานไป 30 นาทมคาเทากบ 3.02 (µg/ml GAE) จากนนจงนาสารสกดจากดอกดาหลาไปทาบรสทธดวยการสกดกบ Dichloromethane และ Ethyl acetate สารสกดทไดจากตวทาละลาย Ethyl acetate มความสามารถในการดกจบอนมลอสระDPPH • ไดดกวา จงนาสารสกดจากตวทาละลาย Ethyl acetate ไปศกษาความบรสทธตอดวยวธ TLC โดยใชตวเคลอนทเปน Hexane: Chloroform: Methanol ในอตราสวน 2: 6: 2 โดยปรมาตร ซงพบมสารประกอบฟนอลกรวมกนอยอยางนอย 4 ชนด โดยสารประกอบฟนอลกในแถบลางสด มความสามารถในการดกจบอนมลอสระ DPPH • ได จงนาไปศกษาตอดวยวธ LC-MS พบสารประกอบฟนอลกอกจานวนมากผสมอยในตวอยาง สามารถระบไดวาสารประกอบฟนอลกทพบในสารสกดดอกดาหลาเปนสารประกอบ

(4)

ฟนอลกในกลมสารประกอบฟลาโวนอยดมมวลทสง อยางไรกดในการศกษาหาชนดและโครงสรางของสารประกอบฟนอลกดงกลาวในดอกดาหลานนตองมการศกษาเชงลกตอไป

(5)

Thesis Title Antioxidants in Etlingera elatior (Jack) R. M. Smith. Author Miss Piyasiri Soontornnon Major Program Biochemistry Academic Year 2008

Abstract Nowadays, the study of antioxidative and free radical scavenging activities in food became increasingly prominent. Antioxidants such as Ascorbic acid, α -tocopherol, carotenoids, flavonoids and thiol group (-SH) are found mostly in vegetables and fruits. Thus, in this study we determined 4 antioxidants (phenolic compounds, β - carotene, α - tocopherol and ascorbic acid) from 6 selected Thai vegetables and fruits; Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith, Solanum stramonifolium Jacq. (peel and flesh), Syzygium cumini (L.) Skeels, Ixora chinensis lamk, Litsea petiolata Hook. f. and Gnetum gnemon var. tenerum Markgr. The result show that all fruits and vegetables had detectable quantities of α - tocopherol and phenolic compound except β - carotene from Litsea petiolata Hook. f. and Gnetum gnemon var. tenerum Markgr. extract. Ascorbic acid is also showed to be very low in Litsea petiolata Hook. f. extract. The plant extracts were assayed for their free radical scavenging activities using 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH • ). Of all the extracts examined in this study, the Torch ginger (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) extract exhibited the strongest scavenging activity ( 50IC 3.02 /g mlµ at 30 minute). Thus, the extract of Torch ginger was further purified by liquid-liquid extraction (Ethyl acetate: Dichloromethan) and the stronger DPPH • scavenging activity were found in Ethyl acetate fraction. The TLC chromatogram of this fraction in Hexane: CHCl3: MeOH (2:6:2) system displayed 4 separated bands. The lowest band showed greatest DPPH • scavenging activity and was subjected to LC-MS analysis. The result showed that the highest activity band from TLC had high molecular weight and likely to be flavonoid compounds. However further study need to be performed in order to see their exact structure.

(6)

กตตกรรมประกาศ

งานวทยานพนธฉบบนสาเรจลลวงดวยด ดวยความเสยสละเวลากรณาใหคาแนะนาแนวทางแกปญหา การถายทอดความรและการตดตามชวยเหลอในการศกษาคนควาวจย ตลอดจนการเขยนและแกไขวทยานพนธใหสาเรจลลวงดวยด จากอาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก ดร. อธยา รตนพทยาภรณ และอาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม รองศาสตราจารย ดร. รพพรรณ วทตสวรรณกล ผวจยขอกราบขอบพระคณเปนอยางสง ณ โอกาสน

ขอขอบคณ ดร. รพพร โสตถพนธ ประธานกรรมการสอบและ ดร.ปยาภรณ ภาษตกล ผแทนจากบณฑตวทยาลย ทไดใหคาแนะนาเพอแกไขวทยานพนธฉบบนใหถกตองสมบรณยงขน ขอขอบคณภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทรทใหทนการศกษาและทนสนบสนนการวจยเพอวทยานพนธจากโครงการสรางความเขมแขงสความเปนเลศทางวชาการ สาขาวชาชวเคม มหาวทยาลยสงขลานครนทร ประจาป 2548 ขอขอบคณคณาจารยและเจาหนาทภาควชาชวเคมทกทานทไดประสทธประสาทความรและใหความชวยเหลอในการศกษาวจยครงนสาเรจลลวง ขอขอบคณ คณสมพงษ บญศร ทชวยเหลอและใหคาแนะนาในการทาการวจย ขอขอบคณพ ๆ เพอน ๆ และนอง ๆ หอง PR. 416 และ PR. 436 เพอนในภาควชาชวเคมทกคนทเปนกาลงใจ ชวยเหลอและใหคาแนะนาในการทาวจยจนเสรจสมบรณ สดทายน ขอกราบขอบพระคณบดา มารดา ทอบรมส งสอน สนบสนนทนการศกษาและเปนกาลงใจทดเสมอมา ผลสาเรจและสงทเปนประโยชนของงานวจยน ขออทศแดผมพระคณทกลาวมาทกทาน ปยศร สนทรนนท

(7)

สารบญ

หนา สารบญ (7) รายการตาราง (8) รายการรป (10) สญลกษณคายอและตวยอ (14) 1. บทนา 1 บทนาตนเรอง 1 การตรวจเอกสาร 2 วตถประสงค 36 2. วสด อปกรณและวธการ 37 วสด 37 อปกรณ 38 วธการ 39 3. ผลการทดลองและวจารณ 60 4. สรป 113 เอกสารอางอง 115 ภาคผนวก 126 ประวตผเขยน 129

(8)

รายการตาราง

ตารางท หนา 1.1 ตวอยางอนมลอสระ 3 1.2 ปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมดทมในผลไมสก 23 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9

สารประกอบฟนอลสวนใหญทพบในพช อนกรมวธานของตนดาหลา อนกรมวธานของตนหวา อนกรมวธานของตนมะอก อนกรมวธานของตนเขม อนกรมวธานของตนทามง อนกรมวธานของตนเหมยง

24 26 28 29 31 32 34

2.1 แถบพลงงานชวงตาง ๆ ของคลนแมเหลกไฟฟา 40 2.2 ผก ผลไมพนบานตวอยางทใชในการวเคราะห 44 2.3 เฟสเคลอนททใชในการทาบรสทธดวยวธ Thin Layer

Chromatography, TLC 53

2.4 รายละเอยดเกยวกบเครองมอ Liquid Chromaography-Mass Spectrometer

58

3.1 คาการดดกลนแสงของสารมาตรฐาน Gallic acid 61 3.2 ปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกดแตละชนด 62 3.3 คาพนทใตพคของสารมาตรฐานเบตา-แคโรทน 63 3.4 ปรมาณ Betacarotene ในสารสกด 64 3.5 พนทใตพคของสารมาตรฐานวตามนอ 69 3.6 ปรมาณ Vitamin E ในสารสกด 70 3.7 พนทใตพคของสารมาตรฐานวตามนซ 75 3.8 ปรมาณ Vitamin C ในสารสกด 76 3.9

3.10

3.11

สรปปรมาณสารตานอนมลอสระชนดตาง ๆ ในสารสกดตวอยางทงหมด 7 ชนด คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากเปลอกมะอกทความเขมขนและเวลาตาง ๆ คา 50IC ของสารสกดจากเปลอกมะอก

80

82

82

(9)

ตารางท

3.12

3.13 3.14

3.15 3.16

3.17 3.18

3.19 3.20

3.21 3.22

3.23 3.24 3.25

3.26

3.27 3.28

คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากเนอมะอกทความเขมขนและเวลาตาง ๆ คา 50IC ของสารสกดจากเนอมะอก คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากดอกดาหลาทความเขมขนและเวลาตาง ๆ คา 50IC ของสารสกดจากดอกดาหลา คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากผลหวาทความเขมขนและเวลาตาง ๆ คา 50IC ของสารสกดจากผลหวา คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากใบทามงทความเขมขนและเวลาตาง ๆ คา 50IC ของสารสกดจากใบทามง คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากใบเหมยงทความเขมขนและเวลาตาง ๆ คา 50IC ของสารสกดจากใบเหมยง คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากดอกเขมทความเขมขนและเวลาตาง ๆ คา 50IC ของสารสกดจากดอกเขม

50IC ของสารสกดชนดตาง ๆ ทเวลาผานไป 5 10 20 30 และ 40 นาท ป ร ม าณส า ร ป ร ะ ก อบฟ น อ ล ก ท ส ก ด ไ ด จ า ก ต ว ท า ล ะ ล า ย Dichloromethane และ Ethyl Acetate คา 50IC ของสารประกอบฟนอลกในตวทาละลาย Dichloromethane และ Ethyl Acetate ปรมาณสารประกอบฟนอลกในแถบสารตาง ๆ บน TLC การศกษาสารประกอบฟนอลกโดยวธ Mass Spectrometer

หนา 84

84 86

86 88

88 90

90 92

92 94

94 98 99

100

102 107

รายการตาราง (ตอ)

(10)

รายการรป

รปท หนา 1.1 การทางานของเอนไซม lipoxygenase ในปฏกรยาออกซเดชน

ของกรดไขมน 5

1.2 ขนตอนการเกดปฏกรยา Lipid peroxdation 8 1.3 สตรโครงสรางของ DPPH 9 1.4 กลไกการจบโลหะของสารประกอบฟลาโวนอยด 13 1.5 การทางานของวตามนอ ในการยบยงปฏกรยาออกซเดชนของไขมน 13 1.6 การเปลยนรปของวตามนอและวตามนซในรางกาย 14 1.7 ตวอยางโครงสรางทางเคมของสารตานอนมลอสระสงเคราะห 15 1.8 การเปลยนรปโครงสรางของวตามนซเมอทาปฏกรยากบอนมลอสระ 16 1.9 สตรโครงสรางของวตามนอ 17 1.10 สตรโครงสรางของ β – carotene 19 1.11 โครงสราง A, B และ C-ring ใน Flavonoids compounds 20 1.12 สตรโครงสรางของสารประกอบฟนอลชนดตางๆ ทพบทวไปในพช 21-22 1.13 ดอกดาหลา 26 1.14 ผลหวา 28 1.15 มะอก 29 1.16 เขม 31 1.17 1.18 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

2.6

ทามง เหมยง ลกษณะของคลนแมเหลกไฟฟา การเกดอนตรกรยาของสารเคมกบการแผรงสหรอแสง กระบวนการเกดการกระตน กระบวนการวดการดดกลนแสง กราฟมาตรฐานแสดงความสมพนธระหวางคา O.D. กบความเขมขนทแนนอนของสารละลายและการใชประโยชนเพอหาคาเขมขนของสารทตองการทราบ องคประกอบทสาคญของเครอง HPLC

32 34 39 41 41 42 43

45

(11)

รปท 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13

2.14 2.15 2.16 3.1 3.2 3.3

3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10

3.11 3.12 3.13 3.14 3.15

ชนดของ Chromatography ทงหมด ตวอยางการแยกของสารบน TLC ลาดบการดดซบของสารชนดตาง ๆ ลาดบสภาพขวของตวทาละลายชนดตาง ๆ ลกษณะของแมสสเปกตรมของสารตวอยางจากแหลงกาเนดไอออน การทางานของ Ionization Source การเดนทางของลาไอออนเมอถกกระตนดวยสนามแมเหลก หรอสนามไฟฟา การหกเหไอออนในสนามแมเหลก การจบอเลกตรอนของประจบวกทผานเขามาในตวตรวจวด ผงการทางานโดยรวมตว Mass Spectrometers กราฟมาตรฐานทใชหาปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกด โครมาโทรแกรมของสารมาตรฐานเบตา-แคโรทน กราฟมาตรฐานระหวางความเขมขนสารละลายเบตา-แคโรทนและ พนทใตพคใชหาปรมาณเบตา-แคโรทนในสารสกด โครมาโทแกรมเบตา-แคโรทนของสารสกดจากเปลอกมะอก โครมาโทแกรมเบตา-แคโรทนของสารสกดจากเนอมะอก โครมาโทแกรมเบตา-แคโรทนของสารสกดจากดอกดาหลา โครมาโทแกรมเบตา-แคโรทนของสารสกดจากผลหวา โครมาโทแกรมเบตา-แคโรทนของสารสกดจากดอกเขม โครมาโทรแกรมของสารมาตรฐานวตามนอ กราฟมาตรฐานระหวางความเขมขนสารละลายวตามนอและ พนทใตพคใชหาปรมาณวตามนอในสารสกด โครมาโทแกรมวตามนอของสารสกดจากเปลอกมะอก โครมาโทแกรมวตามนอของสารสกดจากเนอมะอก โครมาโทแกรมวตามนอของสารสกดจากดอกดาหลา โครมาโทแกรมวตามนอของสารสกดจากผลหวา โครมาโทแกรมวตามนอของสารสกดจากใบทามง

หนา 49 50 51 51 54 56 56

57 57 58 61 63 64

65 66 66 67 67 68 69

70 71 71 72 72

รายการรป (ตอ)

(12)

รปท

หนา 3.16 3.17 3.18 3.19

3.20 3.21 3.22 3.23 3.24 3.25 3.26

3.27

3.28

3.29

3.30

3.31

3.32

3.33 3.34 3.35

โครมาโทแกรมวตามนอของสารสกดจากใบเหมยง โครมาโทแกรมวตามนอของสารสกดจากดอกเขม โครมาโทรแกรมของสารมาตรฐานวตามนซ กราฟมาตรฐานระหวางความเขมขนสารละลายวตามนซและ พนทใตพคใชหาปรมาณวตามนซในสารสกด โครมาโทแกรมวตามนซของสารสกดจากเปลอกมะอก โครมาโทแกรมวตามนซของสารสกดจากเนอมะอก โครมาโทแกรมวตามนซของสารสกดจากดอกดาหลา โครมาโทแกรมวตามนซของสารสกดจากผลหวา โครมาโทแกรมวตามนซของสารสกดจากใบเหมยง โครมาโทแกรมวตามนซของสารสกดจากดอกเขม กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากเปลอกมะอก ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากเนอมะอก ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากดอกดาหลา ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากผลหวา ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากใบทามง ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากใบเหมยง ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากดอกเขม ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 5 นาท การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 10 นาท การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 20 นาท

73 73 74 75

77 77 78 78 79 79 83

85

87

89

91

93

95

96 96 97

รายการรป (ตอ)

(13)

รปท 3.36 3.37 3.38 3.39 3.40 3.41

3.42

3.43

3.44

3.45

3.36

การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 30 นาท การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 40 นาท กราฟ Activity ของสารสกดจากดอกดาหลาใน Dichloromethane กราฟ Activity ของสารสกดจากดอกดาหลาใน Ethyl Acetate การแยกแถบสารสกดดอกดาหลาในตวทาละลาย Ethyl Acetate การทดสอบความสามารถการตานอนมล DPPH •ดวยสารทไดจากแถบ บน TLC โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาทผานการทาบรสทธดวยวธ Liquid Chromatography กอนจะเขาสเครอง Mass spectrometer โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาจากเครอง Mass Spectrometer ออกมาทเวลา 3.641 นาท (พคท 2 จากรปท 3.41) โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาจากเครอง Mass Spectrometer ออกมาทเวลา 41.87 นาท (พคท 4 จากรปท 3.41) โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาจากเครอง Mass Spectrometer ออกมาทเวลา 45.62 นาท (พคท 5 จากรปท 3.41) โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาจากเครอง Mass Spectrometer ออกมาทเวลา 63.74 นาท (พคท 6 จากรปท 3.41)

หนา 97 98 100 101 102 103

105

108

109

110

111

รายการรป (ตอ)

(14)

สญลกษณคายอและตวยอ

๐ซ Abs. BHT DPPH DTT GAE HPLC KOH LC-MS mg min ml mM pH ROS TLC α β µg % IHB [ ]

= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = =

องศาเซลเซยส Absorbance Butyl Hydroxyl Toluene 1, 1 – Diphenyl – 2 – picrahydrazyl Dithiothreitol Gallic Acid Equivalent High Performance Liquid Chromatography Potassium Hydroxide Liquid Chromatography – Mass Spectrometer milligram minute milliliter millimolar -log hydrogen ion concentration Reactive Oxygen Species Thin Layer Chromatography Alpha Beta microgram Percent Inhibition ความเขมขน

บทท 1 บทนา

บทนาตนเรอง สขภาพรางกายทแขงแรงสมบรณเปนสงทคนเราตองการใหเกดขนในชวตแต

ไมสามารถระบไดอยางแนชดวาปจจยในการดารงชวตใดบางทมสวนเกยวของ อยางไรกดมปจ จยหนงท มความสาคญและนาสนใจคอ “สารตานอน มล อสระ (Antioxidant)” ซ ง มคณประโยชนอยางมากตอระบบทสาคญตาง ๆ ในรางกาย ไดแก ระบบหลอดเลอดและหวใจ (Akyon, 2002) ระบบภมคมกน กลมเซลลประสาทททางานเฉพาะในสมอง การตอตานการเกดโรคมะเรงตาง ๆ (Duncan, 2004; Hakimuddin et al., 2004) การชะลอความชรา รวมทงกระบวนการตาง ๆ ในรางกาย ระบบตาง ๆ เหลานเกยวของโดยตรงกบสขภาพรางกาย เชน โรคหวใจทเกดจากการอดตนของเสนเลอด ทอาจเกดขนอยางฉบพลน ซงในบางครงอาจเกดจากการสะสมสารตาง ๆ ทบรเวณหลอดเลอดทาใหผนงหลอดเลอดถกทาลาย และโรคอน ๆ เชน โรคอลไซเมอร (Alzheimer’s disease) (Shetty, 1997) ไขขออกเสบ และตอกระจก (Ames et al., 1993) เปนตน

ตวอยางของสารตานอนมลอสระ (Antioxidants) ไดแก วตามนซ วตามนอ ซลเนยม เบตา-แคโรทน วตามนเอ พฤกษาเคมตางๆ (Phytochemicals) เชน สารประกอบ ฟนอลกจากชา(Vinson and Dabbagh, 1998) และสมนไพรบางชนด เชน ไอโซฟลาโวน (Isoflavones) จากถวเหลอง (Huanga et al., 2008) เปนตน สารตานอนมลอสระทพบในอาหาร ไดแก เบตา-แคโรทน (β-carotene) ซงเปนสารตงตนของเรตนอลพบมากในแครอท (Chantaroa et al., 2007) ผกสเหลองสม ใบผกสเขยวเขมตาง ๆ เชน ผลมะเขอเทศ เนอฟกทอง ใบตาลง ใบผกบง ใบผกกวางตง ใบผกคะนา, วตามนซ (Ascorbic acid) มมากในฝรง (Suntornsuk et al., 2002) สม มะขามปอม มสวนชวยในการสงเคราะหคอลลาเจน แตวตามนซสามารถถกทาลายไดงาย ดวยความรอน ความชนและแสง, วตามนอ (α-Tocopherols) มมากในราละเอยด ธญพช (หญาทใหเมลดทกนได) ทไมขดขาว (Fardet et al., 2008) ขาวโพด ขาวกลอง ถวแดง ถวเหลอง ผกกาดหอม เมลดทานตะวน งา นามนรา นามนจากเมลดพชชนดตางๆ, ซลเนยม พบมากในอาหารทะเล (Hamilton, 2004) เนอสตว ธญพชทไมขดขาว นอกจากนยงมสารทพบในผกและผลไม ทมคณสมบตในการตานสารอนมลอสระ ซงสามารถจบกบอนมลอสระ ลดอตราเสยงในการเกดโรคมะเรงได พบมากในตระกลสม องน และผลไมสดอนๆ เชน กระเทยม และผกตระกลผกกาด

1

2

เพอใหรางกายไดรบสารตานอนมลอสระพอเพยงกบความตองการควรทาน ผก ผลไมสเขมเปนประจาโดยลางใหสะอาดทกครง นอกจากจะไดรบสารตานอนมลอสระแลวยงไดรบใยอาหารดวย รางกายจาเปนตองไดรบใยอาหารเชนกน เนองจากใยอาหารชวยในการขบถาย ชวยนาคอเลสเตอรอลออกจากรางกาย เรงการนาสารพษ ทอาจเปนสาเหตของการเกดโรคมะเรงบางชนดออกจากรางกายเรวขน (Ames, 1993)

กอนหนานไดมการศกษา เกยวกบสารตานอนมลอสระชนดเบตา-แคโรทน โดยวธโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) ในกะหลาปล (Jagdish et.al., 2006) มะเขอเทศ (Lin and Chen, 2003) และในแตงโม (Tadmor et al., 2005) พบวา ปรมาณสารตานอนมลอสระขนอยกบชนดและสถานทเพาะปลกของพชชนดนน ๆ จากการทมรายงานวา สารประกอบกลม Polyphenols โดยเฉพาะอยางยงแซนโธน (Xanthones) และฟลาโวนอยด (Flavonoids) ซงพบในพชพรรณธรรมชาตนานาชนด สามารถตานอนมลอสระไดด ทงในหลอดทดลอง (in vitro) และในสตวทดลอง (in vivo) (Rice-Evans et al., 1996) ประกอบกบประเทศไทยเปนแหลงอดมสมบรณดวยพรรณไมและสมนไพรหลากหลายชนด ทมศกยภาพในการใชรกษาโรคตาง ๆ อนเนองมาจากอนมลอสระไดด จงทาใหการทดสอบสารสกดจากพชพนบานเพอสารวจหาฤทธตานอนมลอสระซงยงไมเคยมรายงานมากอนเปนเรองทนาสนใจศกษาเปนอยางยง การตรวจเอกสาร 1. อนมลอสระ อนมลอสระ (Free radicals) เปนสารทมอเลคตรอนอสระ (Unpaired electron) อยในวงนอกของอะตอมหรอโมเลกลจงมความวองไวในการเขาทาปฏกรยาโดยรบอเลคตรอน จากสารอน ๆ ใกลเคยงยงผลใหตนเองเสถยรขน ในขณะเดยวกนกชกนาใหสารทใหอเลคตรอนไปนนมอเลคตรอนไมครบคจนอาจกลายเปนสารทมความรนแรง ซงถาเกดขนในระบบสงมชวต อาจทาอนตรายกบสวนประกอบสาคญของเซลลรอบ ๆ บรเวณนน ไมวาจะเปนโปรตน ไขมน คารโบไฮเดรต หรอดเอนเอ ทาใหสารชวโมเลกลเหลานเกดการเปลยนแปลงโครงสรางและเสยหนาทการทางาน ดงนนในสภาวะทมการสรางอนมลอสระเปนจานวนมากจะกอใหเกดการบาดเจบของเซลลซงเปนกลไกสาคญทกอใหเกดพยาธสภาพตาง ๆ ไดเชน โรคมะเรง โรคหลอดเลอดหวใจ โรค Parkinson (Banerjee et al., 2004) โรค Alzheimer ไขขออกเสบ และตอกระจก (Ames et al., 1993) เปนตน

โดยปกตจะมการกลาวถงเฉพาะอนมลอสระ (Free radicals) ทเปนสาเหต การเกดปฏกรยาออกซเดชนในรางกายเรา แตแทจรงแลว Reactive oxygen species (ROS) (Halliwell, 1999) คอ ตวการสาคญอกตวหนง โดย ROS เปนโมเลกลทวองไวตอการเกด

3

ปฏกรยากบสารชวโมเลกลตาง ๆ ทอยรอบขางในทนททถกสรางขน ยงผลใหเกดความเสยหายแกองคประกอบตาง ๆ ของเซลลภายในรางกาย ไมวาจะเปน การทาลายโครงสรางดเอนเอ (DNA) (Hsieh et al., 2004) การเปลยนสภาพโปรตนตลอดจนไขมนของเยอหมเซลลหรอการสรางพนธะโควาเลนต (Covalent bond) กบโปรตนหรอเอนไซมบางชนดจนทาใหการทางานของโปรตนหรอเอนไซมนน ๆ ผดปกตไป ทาลายสารชวโมเลกลภายในเซลล เชน กรดนวคลอก คารโบไฮเดรต (Prakash et al., 2006) เปนตน (วลยา เนาวรตนวฒนา และพชร บญศร, 2542) ทงอนมลอสระ และ ROS คอโมเลกลหรออออนทมอเลคตรอนโดดเดยวอยรอบนอก มอายสนมากประมาณ 10-3-10-10 วนาท จงจดวาเปนโมเลกลทไมเสถยรและวองไวตอการเกดปฏกรยาเคม (ตารางท 1) สามารถตรวจวด ดวย Electron Spin Resonance (ESR) โมเลกลหรออออนชนดนเปนตวกอใหเกดปฏกรยาลกโซ ตารางท 1.1 ตวอยางอนมลอสระ

Radicals Non-radicals Reactive oxygen species (ROS) Superoxide, 2O

•− Hydroxyl, OH • Peroxyl, ROO• Alkoxyl, OR− Reactive nitrogen species (RNS) Nitric oxide, NO Nitrogen dioxide, 2NO

Hydrogen peroxide, 2 2H O Hypochorous acid, HOCl Ozone, 3O Singlet oxygen Nitrous acid, 2HNO Dinitrogen trioxide, 2 3N O Peroxynitrite, ONOO−

ในสงมชวตทกชนดทใชออกซเจนในการดารงชพ จะพบอนมลอสระของออกซเจนชนดตาง ๆ เกดขนอยตลอดเวลา การเกดอนมลอสระเหลาน มสาเหตมาจากปจจยตาง ๆ ทงภายในและภายนอกรางกาย 1.1 ปจจยภายในรางกาย 1.1.1 ปฏกรยาออกซเดชนทเกดขนเอง (Auto-oxidation) เชน การเกดออกซเดชนของไขมนซงแบงออกเปน 3 ระยะ (Nawar, 1996) คอ 1) ระยะเหนยวนา (Initiation) เปนระยะทกรดไขมนแตกตวเปนอนมลอสระโดยมแสง อณหภม เปนตวเรง ดงสมการ

4

RH initiator R H• •+ → + 2) ระยะเพมจานวน (Propagation) เปนระยะทอนมลอสระทาปฏกรยากบออกซเจนเกดเปนอนมลเปอรออกซ (Peroxy radical) (1) ซงทาปฏกรยาตอกบกรดไขมนเกดเปนไฮโดรเปอรออกไซด (Hydroperoxide) และอนมลอสระ (2) ซงถามแสงและความรอนเปนตวเรงกจะเกดปฏกรยาตอทาใหอนมลอสระเพมขน และอนมลอสระทเกดขนกสามารถทาปฏกรยากบออกซเจนใหมไดตอเนองไปเรอย ๆ ดงสมการ

2R O ROO• •+ →

ROO RH ROOH R• •+ → + 3) ระยะสนสด (Termination) เปนระยะทอนมลอสระทเกดขนอาจรวมตวกนในรปแบบตาง ๆ ดงสมการ R R RR• •+ → 2ROO ROO ROOR O• •+ → + 1.1.2 ปฏกรยาออกซเดชนทมเอนไซมเปนตวเรง (Halliwell et al., 1995) การทางานของเอนไซมสาคญ 2 ชนดทมผลกระตนการสรางอนมลอสระภายในรางกาย ไดแก 1) เอนไซม Xanthine oxidase ( XO ) ทาหนาทสาคญในกระบวนการสลายเบสพวรน (Purine) โดยเรงปฏกรยาการเปลยน Hypoxanthine เปน Xanthine และ Xanthine เปน Uric acid พรอม ๆ กบขนถายอเลคตรอนใหออกซเจนเกดเปนอนมลซเปอรออกไซด ( 2O

•− ) ดงสมการ 2 2 2 2 2

XOHypoxanthine O H O xanthine H O O•−+ + → + + 2 2 2 2 XOxanthine O H O uric acid H O+ + → + 2) เอนไซม Lipoxygenase (LOX) ทาหนาทเรงออกซเดชนของกรดไขมนไมอมตวสง (polyunsaturated fatty acid) โมเลกลของเอนไซมนมเหลก ( 2Fe + ) เปนสวน ประกอบทาหนาทดงอะตอมไฮโดรเจนจากกรดไขมนและเตมออกซเจนใหกบกรดไขมนเกดเปน Hydroperoxide ซงจะสลายตวเปนอนมลของกรดไขมนตอไปได ดงรปท 1.1

(1)

(2)

5

โดย ,LH L• และ LOO• คอ โมลเลกลของกรดไขมน อนมลของกรด ไขมน และอนมลเปอรออกซของกรดไขมน ตามลาดบ 1.1.3 กระบวนการกาจดสงแปลกปลอมของเมดเลอดขาว ในขนตอนทาลายสงแปลกปลอมโดยเฉพาะเชอโรคทถกกลนกนเขามาภายในเซลลเมดเลอดขาวจะมการดงโมเลกลออกซเจน ( 2O ) มาใชเปนจานวนมากเพอผลตเปนอนมลซเปอรออกไซด ( 2O

•− ) จากปฏกรยาของเอนไซม NADPH oxidase ทอยบนเยอบชนนอก (Outer membrane) ของเมดเลอดขาว (Konstan and Berger, 1993) ดงสมการ 2 22 2NADPHoxidaseO NADPH O NADP H•− + ++ → + + น อ ก จ า ก น ใ น เ ม ด ส (Granule) ข อ ง เ ม ด เ ล อ ด ข า ว ย ง ม เ อ น ไ ซ ม Myeloperoxidase ทาใหเกดอนมลไฮโปคลอรส (Hypochlorus, HOCl• ) ซงเปนสารททาลายจลชพไดดงปฏกรยา 2 2

myeloperoxidaseH O Cl HOCl OH− • −+ → +

2LOX Fe +−

Activation by peroxide

Hydrogen abstraction Product dissociation

Electron transfer

H +

LOOH

3LOX Fe +− LOO•

LH

H + 2LOX Fe +−

L•

3LOX Fe +−

Oxygen insertion

2LOX Fe +−LOO•

รปท 1.1 การทางานของเอนไซม Lipoxygenase ในปฏกรยาออกซเดชน ของกรดไขมน (O´Donnell et al., 1999)

6

1.1.4 โลหะทรานสชน (Transition metal) โลหะทรานสชน 2 ชนดคอ เหลก ( 2Fe + ) และทองแดง ( 2Cu + ) ทมอยทวไปในรางกายสามารถเรงการสรางอนมลไฮดรอกซล (OH • ) จากซเปอรออกไซด ( 2O

•− ) และไฮโดรเจนเปอรออกไซด (hydrogen peroxide, 2 2H O ) ในปฏกรยา Fenton (Fenton’s reaction) (Halliwell, 1999) ดงสมการ 2 2/

2 2 2 2Fe CuH O O OH OH O

+ +•− • −+ → + + 1.2 ปจจยภายนอก

1.2.1 ยารกษาโรค ยาบางชนดสามารถกอใหเกดอนมลอสระขนภายในรางกายได โดยเฉพาะอยาง

ยง ยาในกลมตานจลชพและตานมะเรง เชน Bleomycin, Antracyclines (Voest et al., 1994) และ Methotrexate (Gressier et al., 1994) เนองจากมฤทธเสรมออกซเดชน (pro-oxidation)

1.2.2 รงส การใชรงสรกษาโรค เชน รงสเอกซ (X-ray) รงสแกมมา เปนตน อาจเปนสาเหต

ทาใหเกดอนมลอสระขนในรางกายจากการถายทอดพลงงานใหกบนาซงเปนสวนประกอบของเซลลแลวกอใหเกดปฏกรยาขนตอไป (Secondary reaction) กบออกซเจนทละลายอยในเซลลนนไดอนมลอสระเกดขน (Kobayashi et al., 2003)

1.2.3 ควนบหร ในควนบหรมสวนประกอบของ Nitric oxide (NO), Nitrogen dioxide ( 2NO )

และ Peroxynitrite (ONOO− ) และสารมลพษ ไดแก Sulfur dioxide ( 2SO ) และ Carbontetrachloride ( 4CCl ) ซงจะถกกาจดออกจากรางกายโดยการทางานของเอนไซม Cytochrome P-450 hydroxylase ทมอยมากในเซลลตบและพบไดบางในเซลลปอดและลาไสเลก ทาใหเปนสาเหตของการสรางอนมลซเปอรออกไซดภายในเซลลดงกลาว (Bast et al., 1991)

1.2.4 โอโซน โอโซนไมไดเปนอนมลอสระแตจดเปนสารออกซไดซแรงสงซงสามารถเปลยน

รปเปนอนมลไฮดรอกซลไดจากการกระตนของคลนแสงยว (Valacchi et al., 2004)

7

1.3 การเกดอนมลอสระ 1.3.1 ปฏกรยาการแยกอยางสมมาตร (Symmetric separation)

X X X X• •− → +

1.3.2 อนมลอสระอนๆ

X HR HX R• •− → + 1.4 Lipid peroxidation

คอ การเกดปฏกรยา Oxidative degradation ของไขมน เปนกระบวนการท อนมลอสระแยงอเลกตรอนจากไขมนทเยอหมเซลล (Nair et al., 2007) สงผลใหเซลลถกทาลาย กระบวนการนเกดผานกลไกของปฏกรยาลกโซ โดยอนมลอสระมผลกระทบอยางมากสาหรบกรดไขมนไมอมตว (Polyunsaturated fatty acid) เนองจากไขมนจาพวกนประกอบดวยพนธะค หลายพนธะในระหวางสายของโมเลกลเมทธลน (Methylene, 2CH− − ) ซงทาใหกลมไฮโดรเจนทวองไวตอปฏกรยา (Reactive Hydrogen) ในสวนของการเกดปฏกรยาประกอบดวย 3 ขนตอนหลก คอ ขนเรมตน(Initiation) ขนดาเนนการ (Propagation) และ ขนยต (Termination) ดงแสดงในรปท 1.2 1.4.1 ขนเรมตน (Initiation)

คอขนตอนการผลตอนมลอสระของกรดไขมน (Fatty acid Radicals) โดยม สารกลมออกซเจนทวองไวตอปฏกรยา (Reactive Oxygen Species, ROS) เชน OH• ในเซลล ของสงมชวตเปนตวเรมตน รวมตวกบอะตอมของไฮโดรเจนเกดเปนโมเลกลของนาและอนมลอสระของกรดไขมน 1.4.2 ขนดาเนนการ (Propagation)

อนมลอสระของกรดไขมนเปนโมเลกลทไมมความเสถยร คอวองไวตอ ปฏกรยามาก ดงนน จงสามารถทาปฏกรยาอยางรวดเรวกบโมเลกลของออกซเจนเกดเปนอนมลอสระของ Peroxyl Fatty acid ซงเปนสารในกลมทไมเสถยร เชนเดยวกน สามารถทาปฏกรยากบกรดไขมนอสระอน ๆ เกดเปนอนมลอสระกรดไขมนตาง ๆ และไฮโดรเจนเปอรออกไซด (Hydrogenperoxide, 2 2H O ) หรออาจเกดเปนวงแหวนเปอรออกไซดในกรณทมการทาปฏกรยากนเองภายในโมเลกล วงแหวนชนดนจะทาปฏกรยาตอเนองไปกบอนมลอสระของกรดไขมนกลมใหมในลกษณะเดยวกนได

8

รปท 1.2 ขนตอนการเกดปฏกรยา Lipid peroxdation (http://en.wikipedia.org/wiki/Antioxidant)

1.4.3 ขนยต (Termination)

ในขณะทอนมลอสระเกดปฏกรยานนจะมการผลตอนมลอสระอน ๆขนมาพรอมกน ซงเปนสาเหตทเรยกกระบวนการนวา “กลไกของปฏกรยาลกโซ” (Chain Reaction Mechanism) วธการเดยวทจะยบยงการเกดปฏกรยาของอนมลอสระน คอ ตองทาใหอนมลอสระทง 2 ตวนมาทาปฏกรยากนแลวเกดเปนสารทไมเปนอนมลอสระ (Non-Radical Species) กระบวนการนเกดขนเมอความเขมขนของกลมอนมลอสระสงเพยงพอทสามารถทาให 2 อนมลเกดเปนคอลลอยดแตในสงมชวตมโมเลกลหลายชนดททาหนาทจบอนมลอสระไดและปองกนเยอหมเซลล หนงในนนคอ α–tocopherol หรอทเรยกกนวาวตามนอนนเอง 1.5 1, 1 – Diphenyl – 2 – picrahydrazyl (DPPH) (Braca et al., 2001) เปนสารอนมลอสระทมเสถยรภาพสง และรบอเลกตรอนหรออนมลไฮโดรเจนเพอกลายเปน Diamagnetic molecule ทมเสถยรภาพสงขน (Soares et al., 1997) ดดกลนแสงไดมากทสดทความยาวคลน 515 nm และจะหยดการดดกลนแสงนโดยสารตานอนมลอสระหรอกลมอนมลอสระ (Brand – Williams et al., 1995) กลไกการทาปฏกรยามขนตอน ดงน •• +−→+ AHDPPHAHDPPH RDPPHRDPPH −→+ ••

โดยท AH คอ สารตานอนมลอสระ และ •R คออนมลอสระอน ๆ

9

รปท 1.3 สตรโครงสรางของ DPPH

วธการนใชตรวจสอบความสามารถของสารสกดหรอสารตานอนมลอสระทจะ ใหไฮโดรเจนและ/หรออเลคตรอนทลดการทาปฏกรยาของอนมล DPPH )( •DPPH ขนตอน การทางานของสารตานอนมลอสระตออนมลอสระเปนดงน เมอสารตานอนมลอสระเขาทาปฏกรยากนอนมล DPPH จะเกดการเปลยนแปลงของสคอ จากสมวงเขมเปนสเหลองใสและคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 515 nm กจะลดลงซงเปนวธการศกษากจกรรมของสารตานอนมลอสระ (Antioxidant activity) DPPH Method เปนวธทใชกนอยางแพรหลายในการศกษากจกรรมของสารตานอนมลอสระในสารสกดจากพชธรรมชาต ในป 2006 มการศกษากจกรรมของสารตานอนมลอสระจากมนเทศดวย DPPH Method (Huang et al., 2006) และผลการทดลองทไดใชเปนขอมลตนแบบในการศกษาครงตอไป 2. อนมลอสระแรงสง 2.1 อนมลซเปอรออกไซด ( 2O

•− ) เปนอนมลอสระทพบไดภายในเซลลทวไป สวนใหญเกดขนระหวางการขนสงอ เลคตรอนจากโมเลกลของออกซ เจนไปยงโมเลกลของน าภายในไมโตคอนเดรย (Mitochondria) อนมลนจะไมเขาทาปฏกรยาทาลายเซลลโดยตรงแตเมอทาปฏกรยากบ ไฮโดรเจนเปอรออกไซด ( 2 2H O ) โดยม 2Fe + และ 2Cu + ชวยเรงปฏกรยา Fenton จะไดเปนอนมลไฮดรอกซล (OH • ) ซงเปนสารออกซไดซทมความวองไวสง นอกจากนสงมชวตยงสามารถสราง 2 2H O จาก 2O

•− ไดโดยตรงจากปฏกรยา Dismutation ของเอนไซม Superoxide dimutase (SOD) (Akoh and Min, 1998) ดงสมการ

10

2 2 2 22 SODO H H O O•− ++ → + ไฮโดรเจนเปอรออกไซดทได ถงแมไมเปนอนมลอสระและจดเปนสารออกซไดสทไมทาปฏกรยาทาลายเซลลแตเปนสารตงตนททาใหเกดอนมลไฮดรอกซลและยงมรายงานวาเกยวของกบกระบวนการสรางอนมลไฮโปคลอรส (HOCl• ) ของเมดเลอดขาวชนดนวโตรฟล (Neutrophil) ทถกกระตนดวยจลชพอกดวย จากเอนไซม Myeloperoxidase ทเกบอยในถง ไลโซโซม (Lysosome) (Davies, 1995; Sen, 1995) ดงสมการ 2 2

MyeloperoxidaseH O Cl HOCl OH− • −+ → + อนมลชนดนสามารถผานเยอหมเซลลไดดและสามารถสรางอนมลไฮดรอกซลไดเมอมโลหะทรานสชนอยดวยดงสมการ

2 2

2 3

HOCl O OH Cl O

HOCl Fe OH Cl Fe

• •− • −

• + • − +

+ → + +

+ → + +

2.2 อนมลไฮดรอกซล (OH • ) จดเปนสารออกซไดสแรงสงทมความวองไวสงสด สามารถเขาทาปฏกรยากบสารตาง ๆ ทอยรอบขางในทนททถกสรางขน ดงนนอนมลนจงเปนอนตรายตอสารชวโมเลกลในสงมชวตมากกวาอนมลชนดอน ๆ (Halliwell, 1999) อนมลไฮดรอกซลสรางขนจากไฮโดรเจนเปอรออกไซด ( 2 2H O ) ทมโลหะทรานสชนอยในระบบโดยเหลก ( 2Fe + ) จะทาลายพนธะทยดเหนยวระหวางออกซเจนของสารเปอรออกไซดไดเปนอนมลไฮดรอกซล (OH • ) และไฮดรอกไซดไอออน (Hydroxide ion,OH − ) ในปฏกรยา Fenton ดงสมการ 2 3

2 2Fe O Fe O+ + −+ → + 2 2 2 22 2O H H O O•− ++ → + 2 3

2 2 22Fe O H Fe H O+ − + ++ + → + Fenton’s reaction 2 3

2 2Fe H O Fe OH OH+ + • −+ → + +

2.3 อนมลไนตรกออกไซด ( NO• ) เปนอนมลอสระขนาดเลกทเปนพษกบเซลลปอด สามารถรวมตวกบโลหะทรานสชนหรอโปรตนทมโลหะชนดนเปนองคประกอบ (Metalloprotein) ได อนมลไนตรกออกไซด

11

สามารถเขาจบกบฮโมโกลบน (Hemoglobin) ไดเรวกวาโมเลกลออกซเจนจนอาจเกดการขดขวางกระบวนการขนสงกาซออกซเจนขน (Stamler et al., 1992) นอกจากนยงทาปฏกรยากบอนมลซเปอรออกไซดไดอยางรวดเรวเกดเปนอนมล Peroxynitrite (ONOO• ) ทมความวองไวสง (Huie and Padmaja, 1993) ในสภาวะทมออกซเจน NO• จะถกออกซไดซเปน 2NO

ซงเปนสารมลพษสามารถทาลายเซลลของถงลม (Alveoli) และผนงหลอดเลอด (Vascular endothelium) ภายในปอดได (Stephens et al., 1972; Foubert et al., 1992) 3. สารตานอนมลอสระ (Antioxidants) สารตานอนมลอสระคอสารปรมาณนอยทสามารถปองกนหรอชะลอการเกดปฏกรยาออกซเดชนโดยอนมลอสระชนดตาง ๆ ได (Halliwell et al., 1995) สารเหลานมกลไกการทางานตานอนมลอสระดวยกนหลายแบบ เชน ดกจบ (scavenge) อนมลอสระโดยตรง ยบยงการสรางอนมลอสระหรอเขาจบ (Chelate) กบเหลก ปองกนการสรางอนมลอสระ เปนตน ปกตรางกายคนเรานนจะมสารตานอนมลอสระตามธรรมชาตหลากหลายชนดทงทเปนเอนไซมไดแก Superoxide dismutase (SOD), Catalase (CAT), Glutathione peroxidase (GPX), Glutathione reductase (GR), Glutathione S-transferase (GST) และไมเปนเอนไซม ไดแก Glutathione, Lipoic acid, Ceruloplasmin, Albumin, Transferrin เปนตน เนองจากสารเหลานมจานวนจากด ดงนน เมอใดกตามทมอนมลอสระเกดขนเกนกวาจะกาจดไดหมด อาจกอใหเกดอนตรายตอรางกายได ดงทกลาวมาแลว นอกจากนพวกวตามนบางชนด เชน Tocopherols, Carotenoids, Ascorbic acid รวมทงสารประกอบกลม Polyphenols ตาง ๆ ซงมรายงานพบมากในพช ผก ผลไม ทวไปยงจดเปนสารออกฤทธตานอนมลอสระจากแหลงธรรมชาตทดอกกลมหนง (Sies, 1991) สารแอนตออกซแดนทเหลานจะทาลายอนมลอสระโดยการจบกบอนมลอสระ ลดการเกดปฏกรยา ณ จดตงตนหรอยบยงการเกดปฏกรยาลกโซ การหาขดความสามารถในการเปนตวตานอนมลอสระของสารแอนตออกซแดนทสวนใหญ ทาโดยอาศยขนตอนดงน ขน แรกจะเปนสรางอนมลอสระขนมากอนแลวจงเตมสารแอนตออกซแดนทลงไป จากนนทาการตรวจวดหาอนมลอสระทเหลอหลงจากการเกดปฏกรยา ซงหลกการนสามารถนาไปใชไดอยางหลากหลายขนอยกบการเลอกชนดของตวกาเนดอนมลอสระและชนดของตวตรวจวดอนมลอสระ สารตานอนมลอสระสามารถแบงเปน 2 ประเภทตามลกษณะการออกฤทธ (Sherwin, 1990) คอ 3.1 สารตานอนมลอสระปฐมภม เปนสารทหยดปฏกรยาอนมลอสระโดยการใหอนมลไฮโดรเจน(H • ) หรออเลคตรอนแกอนมลอสระโดยตรงเปนผลใหอนมลนนกลายเปนสารทมความเสถยรขน สารออกฤทธในลกษณะดงกลาว ไดแก สารประกอบกลม Phenolic เชน Flavonoids, Eugenol และ

12

Vanillin เปนตน มรายงานวาสารตานอนมลอสระชนดนทาหนาทไดดทความเขมขนตา ๆ แตเมอมความเขมขนสงขนอาจกลายเปนสารเสรมฤทธออกซเดชนได (Rajalakshmi and Narasimhan, 1996) 3.2 สารตานอนมลอสระทตยภม สารตานอนมลอสระประเภทนไมทาปฏกรยาโดยตรงกบอนมลอสระแตจะชวยการทางานของสารตานอนมลอสระปฐมภมในลกษณะตาง ๆ เชน จบกบ 2Fe + ดกจบออกซเจน ดดซบรงสยวไว เปนตน (Gordon, 2001) 4. กลไกการทางานของสารตานอนมลอสระ (Yanishlieva, 2001) สารตานอนมลอสระมกลไกการทางานแบงไดเปน 6 แบบใหญ ๆ คอ 4.1 ดกจบอนมลอสระ (Radical scavenging) โดยการใหไฮโดรเจนหรออเลคตรอนแกอนมลอสระ ดงสมการ R AH RH A• •+ → + RO AH ROH A• •+ → + R A RA• •+ → RO A ROA• •+ → 4.2 ยบยงการทางานของ singlet oxygen (singlet oxygen quenching) สารกลมแคโรทนอยด (carotenoids) สามารถยงยงการทางานของ singlet oxygen โดยการเปลยน singlet oxygen ( 1 *

2O ) ใหอยในรป triplet oxygen ( 32O ) และปลอย

พลงทไดรบออกไปในรปความรอน โดยท แคโรทนอยด (Car) 1 โมเลกลสามารถทาปฏกรยากบ singlet oxygen ไดถง 1,000 โมเลกล (Sies et al., 1992) 1 * 1 3 3 *

2 2O Car O Car+ → + 3 * 1Car Car thermal→ + energy 4.3 จบกบโลหะทสามารถเรงปฏกรยาออกซเดชนได (Metal chelation) สารทสามารถจบโลหะทสาคญเหลานคอ 2Fe + และ 2Cu + ไดแก Flavonoids, Phosphoric acid และ citric acid เปนตน สาหรบกลไกการจบโลหะของสารประกอบ ฟลาโวนอยดดงแสดงในรปท 1.4

13

รปท 1.4 กลไกการจบโลหะของสารประกอบฟลาโวนอยด

4.4 หยดปฏกรยาการสรางอนมลอสระ (Chain-breaking) วตามนอ (α–tocopherol, Toc-OH) สามารถปองกนเยอหมเซลลถกทาลายจากปฏกรยาออกซเดชนของไขมน (Lipid autoxidation) โดยทาหนาทเปนตวรบอเลคตรอน (Electron-acceptor antioxidants) จากอนมล peroxyl ( 2Cu + ) (Burton and Traber, 1990) ดงแสดงในรปท 1.5

รปท 1.5 การทางานของวตามนอ ในการยบยงปฏกรยาออกซเดชนของไขมน

(www.inchem.org/documents/ ehc/ehc/e39_7.gif) 4.5 เสรมฤทธ (Synergism) สารชนดนจะชวยสนบสนนใหสารตานอนมลอสระทางานไดดขน ตวอยางเชน การทางานรวมกนระหวาง α–tocopherol กบ Ascorbic acid โดยท ascorbic acid ไมสามารถทางานในระบบ Hydrophobic ไดเหมอนกบ α–tocopherol แตจะใหไฮโดรเจนอะตอมแกอนมล α–tocopherol peroxyl ทเกดจากการทาปฏกรยาระหวาง α–tocopherol กบอนมล Peroxyl

14

( ROO• ) เปลยนรปกลบไปเปน α–tocopherol ทสามารถทางานได (Frankel et al., 1998) ดงรป 1.6 4.6 ยบยงการทางานของเอนไซมเรงปฏกรยาอนมลอสระ (Enzyme inhibition) สารประกอบ Phenolic บางชนด เชน Flavonoids, Phenolic acid และ Gallates สามารถยบยง Lipoxygenase โดยสามารถเขาจบกบไอออนของเหลกซงเปนโคแฟกเตอร (Cofactor) ยงผลตอการทางานของเอนไซมดงกลาว (Puerta, 1999) 5. แหลงทมาของสารตานอนมลอสระ (Pokorny et al., 2001) 5.1 สารตานอนมลอสระสงเคราะห สารประกอบ Phenolic สงเคราะห 5 ชนด ไดแก Propyl galltes, 2-butylated hydroxyanisole, 3-Butylated hydroxyanisole, BHT (Butylated HydroxyToluene) และ Tertiary butylhydroquinone ซงมสตรโครงสรางดงรปท 1.7 เปนสารตานอนมลอสระทนยมใชในอตสาหกรรมอาหารเพอยงยงการเกดปฏกรยาออกซเดชนของไขมนอนเปนสาเหตใหอาหารมกลน ส และรสชาตทเปลยนแปลง สารสงเคราะหเหลานมประสทธภาพและความคงตวสงกวาสารตานออกซเดชนจากธรรมชาตทวไปแตมขอจากดของการใชเนองจากปญหาดานความปลอดภยในการบรโภค (Yang et al., 2000)

รป 1.6 แสดงการเปลยนรปของวตามนอและวตามนซในรางกาย (www-users.york.ac.uk/ ~chem77/graph/vitce.gif)

15

รปท 1.7 ตวอยางโครงสรางทางเคมของสารตานอนมลอสระสงเคราะห (Howell and Saeed, 1999)

5.2 สารตานอนมลอสระจากธรรมชาต สารกลมนไดรบความสนใจและมการพฒนาคนควากนอยางมากในปจจบน เนองจากแนวคดเรองกลบคนสธรรมชาต ประกอบกบความเชอมนวามความปลอดภยในการบรโภค สารตานอนมลอสระเหลาน พบไดทงในจลชพ สตว และพชซงมทงทเปนวตามน และสารทไมใหคณคาทางโภชนาการ (Non-nutrient) ซงมโครงสรางเปนสารประกอบ Phenolic โดยเฉพาะ Polyphenols เชน แซนโธน และ ฟลาโวนอยด ซงประกอบดวยหม Aromatic hydroxyl ตงแต 2 หมขนไป หมฟงกชน (Functional Group) เหลานมบทบาทสาคญในการดกจบอนมลอสระตาง ๆ ไมใหไปกระตนหรอกอใหเกดปฏกรยาออกซเดชนได โดยการใหอนมลของไฮโดรเจนแกอนมลอสระเหลานน (Van et al., 2000) นอกจากนสารประกอบ Polyphenols ทมโครงสราง ortho-dihydroxyl phenol อยในโมเลกลยงสามารถยงยงการเกดอนมลไฮดรอกซลในปฏกรยาทมอนมลโลหะทรานสชน คอ 2Fe + และ 2Cu + เปนตวเหนยวนาโดยการเขาจบกบโลหะดงกลาวเกดเปนสารประกอบเชงซอน (Complex) ไดอกดวย (Sanchez-Moreno et al., 2000)

Propyl gallate 3-Butylated hydroxyanisole

2-Butylated hydroxyanisole

Butylated hydroxytoluene Tertiary butyl hydroquinone

16

5.2.1 วตามนซ (Ascorbic acid) วตามนซหรอกรดแอสคอรบค มอยมากในผกสดและผลไมสด โดยเฉพาะสม มลกษณะเปนผลกสขาว รสเปรยว เปนวตามนชนดทละลายนาได (water soluble) เมอละลายนามฤทธเปนกรดและเปนวตามนทสลายตวเรวทสดในจาพวกวตามนดวยกนโดยเฉพาะอยางยงไวตอออกซเจนมาก (ปฏกรยาออกซเดชน) เมอตงทงไวในบรรยากาศทมทองแดงและในสงแวดลอมทมสภาพเปนดาง คณสมบตอยางหนงของวตามนซททราบกนดกคอชวยปองกนและรกษาโรคลกปดลกเปด (scurvy) ได วตามนซมหนาทเปนโคเอนไซมในปฏกรยาทมการเตมหม OH− (Hydroxylation) ทสาคญไดแกการเตม OH− ใหกบทรปโตเฟนในการสงเคราะห เซโรโทนน (Serotonin) ซงเปนสารสงสญญาณประสาท (Neurotransmitter) ตวหนง การเกดอาการเสนเลอดเปราะ แผลหายชาและปวดเมอยกลามเนอทพบในคนไขทขาดวตามนซ เชอวาเนองจากความผดปกตในกระบวนการดงกลาว วตามนซรปทออกฤทธ (Active) ในรางกายคอ Dihydroascorbic acid มคณสมบตเปนสารรดวซ (Reducing agent) สามารถทาหนาทเปนสารตานอนมลอสระปองกนเอนไซมตาง ๆ ขอเสยของวตามนซมอยบาง กลาวคอในเนอเยอทมเหลกและวตามนซสะสมอยมาก จะสามารถเกดลปดเปอรออกซเดชนไดมากกวาปกต ปรมาณวตามนซทกองโภชนาการ กระทรวงสาธารณสขแนะนาไวสาหรบคนไทยคอ ผใหญวนละ 30 มลลกรม และเพมเปน 50 มลลกรมในหญงมครรภและใหนมบตร

รปท 1.8 การเปลยนรปโครงสรางของวตามนซเมอทาปฏกรยากบอนมลอสระ

จากการศกษาทางระบาดวทยามขอมลสนบสนนวาวตามนซ อาจจะเปนปจจยประกอบปจจยหนงทชวยลดอตราการเสยงตอการเกดโรคมะเรง และโรคหวใจ (Byers and Perry, 1992)โดยทวตามนซจะทาปฏกรยากบอนมลอสระ Superoxide และ Hydroxyl ( .HO ) ปองกนไม ให เกดปฏก ร ยาลก โซ ซ งมาจากการสลายต วของกรดไขมนท ไม อมต ว (Polyunsaturated fatty acid) วตามนซอาจจะทาปฏกรยาโดยทางออมในการปองกนการสลายตวของไขมนในเยอบเซลลโดยชวยในการสงเคราะหวตามนอทตดกบผนงเซลลขนมาใหม,

17

ชวยในการทาลายพษของสารกอมะเรงโดยการสกดกนขบวนการเกดเซลลมะเรงเนองมาจากคณสมบตทเปน Antioxidant โดยการจบกบอนมลอสระทเกดขนและกระตนใหมภมตานทาน 5.2.2 วตามนอ (Tocopherol)

วตามนอเปนอนพนธของ2 methylchromanol− มชอทางเคมวา โทโคเฟอรอล (Tocopherol) เปนสารตานอนมลอสระทสาคญในรางกาย แตรางกายไมสามารถสรางขนเองไดเปนพวกแอลกอฮอลไมอมตวมอยในธรรมชาต 7 ชนดดวยกน 90 % อยในรป tocopherolα − ซงเปนตวทสาคญทสดเนองจากมความสามารถในการตานอนมลอสระไดดวตามนอทบรสทธจะมสเหลองออนคอนขางเหนยวเหมอนนามน สามารถละลาย ไดในไขมนและตวทาละลายไขมน ทนความรอนไดสงถง 200 องศาเซลเซยส ทนตอกรด แตถกทาลายไดงายในดาง แสงอลตราไวโอเลต ออกซเดชนหรอในนามนทมกลนหน การขาดวตามนอทาใหเกดโรคตาง ๆ ทพบบอยคอ เมดเลอดแดงจะแตกงายกวาปกตเมอทาปฏกรยากบ 2 2H O

รปท 1.9 สตรโครงสรางของวตามนอ

วตามนอจะชวยปกปองเซลลในรางกายจากสารอนมลอสระ (Combs, 1992) โดยไปขดขวางปฏกรยาออกซเดชนของสารในรางกาย โดยอาศยคณสมบตของมนเองทเปนตวทไวตอการถกออกซไดสมากจงเปนตวทถกออกซไดสเองแทนสารอนๆในรางกายทมความไวตอการถกออกซไดสไดนอยกวาปองกนไขมนไมอมตวทกนเขาไปรวมกบออกซเจนซงจะกอใหเกดอนมลอสระเปนสารตานไมใหหลอดเลอดแขงตวและยงขยายหลอดเลอดฝอยเลกๆ ไดอกดวยทาใหการไหลเวยนดขนปองการการเกาะตวของเกรดเลอดทผนงหลอดเลอด จงชวยลดการอดตนของคอเลสเตอรอล ทงตวมนเองยงมฤทธลดคอเลสเตอรอลสงผลใหรางกายใชออกซเจนไดดขน ชวยทาใหระบบสบพนธเปนปกต รกษาอาการเปนหมน ชวยปองกนการเกดตอกระจกไดและยงเชอวาทาลายฤทธของสารกอมะเรงไดดวย วตามนอพบมากในนามนพช เชน ถวเหลอง

18

ขาวโพด และดอกคาฝอย นามนจมกขาวสาล นามนตบปลา นามนมะกอก นามนเมลดทานตะวน นอกจากนนยงพบในผกใบเขยวและพบนอยลงใน เนอ ปลา ผลไม เปนตน

ปฏกรยาขดขวางการเกด Lipid peroxidation (http://www.tcd.ie/tsmj/2000/antiox.html)

α -tocopherol + LO• α - tocopherol• + LOH α -tocopherol + LOO• α - tocopherol• + LOOH α -tocopherol• + LOO• LOOH + Non-free radical product

กระบวนการ Regenerate วตามนอ (α -tocopherol )

α -tocopherol • + ascorbic acid α -tocopherol + ascorbate • 5.2.3 วตามนเอ (Retinol) และ เบตา–แคโรทน (β – carotene) วตามนเอ หรอเรยกอกชอหนงวาเรตนอล ซงตบสรางขนโดยใชสารเบตา- แคโรทน (Beta Carotene) และสารนจะเปลยนเปนวตามนเอ อาศยปฎกรยาของเอนไซม ไดออกซจเนส (Dioxygenase) และเรตนน รดกเทส (Retinene reductase) ในขณะเมออยในลาไสเลก (Intestinal Mucosa) ในตบและในเนอเยออน ๆและจะเปลยนเฉพาะเทากบจานวนทรางกายตองการเทานน ดงนนถาสามารถรบประทานวตามนเอในรปของแคโรทนไดจะดมากเนองจากปองกนการสะสมของวตามนเอและไมทาใหเกดการเปนพษแกรางกาย เพยงแตทาใหมแคโรทนในเลอดสง (Carotinemia) จะทาใหตวเหลองแตกตางกบโรคดซานตรงทนยนตาไมเหลองโดยทวไปจะไมมอนตรายอยางอน เมอหยดกนแคโรทนอาการตวเหลองกจะหายไปเอง แตอยางไรกดไมควรปลอยไวเปนเวลานานอาจเกดโทษไดเชนกน แคโรทนเปนสารทมสเปนสเหลอง สม แดง และเขยว เปนวตามนทละลายในไขมน สามารถละลายไดบางในแอลกอฮอลมมาก ในแครอทและผกใบเขยวบางชนด เชน ผกบรอคโคล ในธรรมชาตจะพบแคโรทนในหลายรปแบบ เชน รปแบบ แอลฟา-แคโรทน เบตา-แคโรทน แกมมา-แคโรทน แตชนดทรางกายสามารถเปลยนใหเปนวตามนเอไดมากทสดคอ เบตา-แคโรทน รางกายสามารถเปลยนแคโรทนเปนวตามนเอไดเพยง 1 ใน 3 ของแคโรทนทไดรบเทานนในกรณทมความผดปกตของรางกายทไมสามารถใชแคโรทนโอกาสของการขาดวตามนเอจะมสง แคโรทน ทาหนาทเปนสารตอตานปฏกรยาออกซเดชน (Antioxidant) ซงคอยกาจดอนมลอสระ (Free radicals) กอนทมนจะทาปฏกรยาทาลายสวนประกอบตาง ๆ ของเซลลจนทาใหเซลลนนมการเจรญเตบโตทผดปกตเปนตนเหตใหเกดโรคมะเรง (Tsuchihashi et al., 1995)

19

รปท 1.10 แสดงสตรโครงสรางของ β – carotene 5.2.4 ซลเนยม (Selenium)

ซลเนยมเปนแรธาตทจาเปน มหนาทสาคญในการรกษาสขภาพทดสรางเสรมภมคมกนและยงเปนสวนหนงของเอนไซมททาหนาทตอตานอนมลอสระ เปนสวนประกอบของ Glutathione peroxidase ซงเรงปฏกรยาการเปลยนลปดไฮโดรเปอรอกไซดไปเปนลปดแอลกอฮอลโดยอาศยกลธาไธโอน (Glutathione) เปนสารรดวซ ชวงวยทารกและวยเดกมความตองการซลเนยม เนองจากอตราการเจรญเตบโตทรวดเรว ซลเนยมเปนสารตานอนมลอสระชวยปองกนตอกระจกและจอประสาทตาเสอมโดยจะทางานรวมกนวตามนซและวตามนอ อาหารทใหซลเนยม ไดแก อาหารทะเล เนอสตวตาง ๆ ขาวซอมมอ ผกบางชนด เชน เหด กะหลาปลและบลอกโคล 5.2.5 พฤกษาเคม (Phytochemical)

สถาบนมะเรง (NCI: The National Cancer Institute) ของสหรฐอเมรกาและ นกวทยาศาสตรจากหนวยงานอนๆ ไดดาเนนโครงการศกษาวจยหาเนองกนมานบทศวรรษทงทดาเนนการโดย NCI เอง พบวา พชผก ผลไมและธญพชอยางนอย 40 ชนด พบสารทมสมบตในการปองกนและตอตานมะเรงโดยไดเรยงลาดบความสาคญในการปองกนและตอตานมะเรงไว 22 ชนดดงน (1) กระเทยม (2) กะหลาปล (3) ชะอม (4) ถวเหลอง (5) ขง (6-8) ผกจาพวกหวผกกาด เซเลอร และ แครอท (9) หอม (10) ชา (11) ขมน (12-14) ผลไมจาพวกสม กะทกรกและมะนาว (15) ขาวสาล (16) ฝาย (17) ขาวซอมมอ (18-20) ผกจาพวกมะเขอ มะเขอเทศและพรกยกษ (21-22) ผกจาพวกบลอกโคลและดอกกะหลา ในจานวน 8 ชนดแรกเปนอาหารท NCI ใหความสนใจและทมงบประมาณเปนพเศษในการศกษาซงกพบวาในพชผกผลไมและอาหารธรรมชาตทมฤทธในการปองกนและตอตานมะเรงนนจะมสารทเกดจากธรรมชาตบางประเภทเปนองคประกอบสารนเรยกวา "Phytochemical"

20

Phytochemical ทพบในอาหารชนดตางๆ ทมฤทธยบยงการเกดมะเรงนนม อย14 ประเภทดวยกน ดงน Sulfide, Phylate, Flavonoid, Glucarate, Carotenoid, Coumarin, Monoterpene, Triterpene, Lignans, Phenolic acid, Indole, Isothiocyanate, Phathalate, Polyacetylene 5.2.6 สารประกอบฟนอลก (Phenolic compound) สารประกอบฟนอลกเปนสารทพบในธรรมชาตมากทสดชนดหนง แบงได 4 กลมใหญ ๆ คอ Flavonoid compounds, Phenolic acid Hydroxycinnamic acids derivatives และ Lignans จากการศกษาเมแทบอลซมของสารประกอบฟนอลกพบวา Phenolic acids เกดมาจาก B-ring ของ Flavonoids ดวยเหตนเองชนดของ Phenolic acids จงขนอยกบกระบวนการ Hydroxylation ของ Phenolic acids เอง (Williamson et al., 2000) ดงแสดงโครงสรางในรป 1.11

รปท 1.11 แสดงโครงสราง A, B และ C-ring ใน Flavonoids compounds สารประกอบฟนอลกเปนสารเคมกลมหนง (Kim et al., 2003) ทถกนามาใชกนอยางมากในภาคเกษตรกรรมและอตสาหกรรม ในภาคอตสาหกรรมสารประกอบ ฟนอลกถกนามาใชเปน Intermediate ในการผลตพลาสตก ยา ส เรซน และอตสาหกรรมปโตรเคม สวนในภาคเกษตรพบวาสารประกอบฟนอลกถกนามาใชในการผลตยาฆาแมลง ยาฆาเชอรา และยาปองกนการตดเชอและอนๆ สารประกอบฟนอลก (Phenolic compound หรอ phenolics) ไดแก สารประกอบทม aromatic ring และอยางนอย 1 hydroxyl group และรวมไปถงอนพนธของสารประกอบฟนอลซงมการแทนทดวยหมเคมตางๆ สารประกอบฟนอลกเปนตวแทนของสารในธรรมชาตทนบวามปรมาณมากชนดหนงและมความสาคญตอสรรวทยาหลงการเกบเกยว เนองจากหนาททเกยวของกบสและกลนรส ความเขมขนของสารประกอบฟนอลกแตกตางกนไป

21

Catechol

อยางมากมายในผลตผลหลงการเกบเกยว เชน ในผลไมสกอาจมปรมาณตงแตนอยมาก ไปจนถง 8.5% ของนาหนกแหงในผลพลบ (persimmon, Diospyros kaki, L.) สารประกอบฟนอลในพชโดยทวไปแสดงคณสมบตเปนกรด ซงจะสรางพนธะไฮโดรเจนกบโมเลกลอนอยางรวดเรว และพบบอยททาปฏกรยากบพนธะเปปไทดของโปรตน และเมอโปรตนนเปนเอนไซมปฏกรยาทเกดขนมกทาใหเอนไซมหมดสภาพ ซงมกเปนปญหาทเกยวของกบการศกษาเอนไซมในพช โดยรวมแลวสารประกอบฟนอลกจะไวตอการเกดออกซเดชนโดยเอนไซม Phenolases ซงเปลยน Monophenols ไปเปน Diphenols และเปลยนตอไปเปน Quinones นอกจากนสารประกอบฟนอลบางตวยงสามารถ chelate กบโลหะ สารประกอบฟนอลกภายในเซลลทอยในรปอสระนนพบนอยมาก สวนใหญมกพบรวมอยกบโมเลกลอน หลายชนดพบในรป Glycosides โดยเชอมตอกบโมโนแซคคาไรดหรอไดแซคคาไรด โดยเฉพาะกลมของ Flavonoids ซงมกรวมกบนาตาล นอกจากนสารประกอบฟนอลกยงอาจรวมกบสารประกอบอนอกหลายชนด เชน Hydroxycinnamic acid อาจพบรวมกบ Organic acids, Amino groups, Lipids, Terpenoids, Phenolics และกลมอนๆ นอกเหนอจากนาตาล การรวมตวในลกษณะนภายในเซลลเปน Monophenols และ Diphenols ทาใหเกดความเปนพษกบพช (Phytotoxic) นอยกวาในรปอสระ โครงสรางของสารประกอบฟนอลกทพบโดยทวไปในพชแสดงใน รปท 1.12 สารประกอบฟนอลกเหลานยงอาจแบงยอยลงไปอกตามจานวนอะตอมของคารบอนและรปแบบโครงสรางของคารบอนในโมเลกล ดงแสดงในตารางท 1.2

Phenol Caffeic acid

Gallic acid Hydroquinone

p-coumaric acid

MONOCYCLIC

22

รปท 1.12 ตวอยางสตรโครงสรางของสารประกอบฟนอลชนดตางๆ ทพบทวไปในพช (www.fao.org/ag/ags/ agsi/ENZYMEFINAL/Image13b.gif)

Proanthocyanin

DICYCLIC

Cyanidin Petunidin

POLYCYCLIC

23

ตารางท 1.2 ปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมดทมในผลไมสก (coursewares.mju.ac.th/section2/pt331/08.htm) ปรมาณสารประกอบฟนอล Apple Various cultivars ‘Cox’s Orange Pippin’ ‘Faldwin’ Cider apple ‘Lannette’ Cider apple ‘Waldhofler’ Banana Date Cherry Montmorency Grape Riesling, cluster ‘Tokay’. cluster ‘Muscat’. skin ‘Muscat’. pulp ‘Muscat’. seed Passion fruit Peach Mixed cultivars ‘Elberta’ ‘Elherta’ Pear ‘Muscachet’ Persimmon Plum ‘Victoria’, flesh ‘Victoria’, skin

0.10-1.0 g/100 g FW 2.0-5.5 g/100 g DW 0.25 g/100 g FW 1.1 g/100 g FW 0.45 g/100 g FW 0.53 g/100 g DW 0.5 g/100 g FW

0.5 g/100 g FW

0.95 g/100 g FW 0.48 g/100 g FW 0.35 g/100 g FW 0.10 g/100 g FW 4.5 g/100 g FW

1.4 mg/100 g FW

0.028-0.141 g/100 g FW 0.069-0.180 g/100 g FW

0.240 g/100 g FW

0.4 g/100 g FW 8.5 g/100 g DW

2.1 g/100 g DW 5.7 g/100 g DW

24

ตารางท 1.3 สารประกอบฟนอลสวนใหญทพบในพช (coursewares.mju.ac.th/section2/pt331/08.htm) จานวนอะตอมคารบอน

โครงสรางพนฐาน

ชนด ตวอยาง

6 7 8 9

10 13 14

15

18

30 n

6C

6 1C C− 6 2C C−

6 3C C−

6 4C C−

6 2 6C C C− −

6 3 6C C C− − ( )6 3 2C C−

( )6 3 6C C C− −

( )6 3 nC C− ( )6 nC

( )6 3 6C C C− −

Simple phenol Benzoquinones Phenolic acids Acetophenones Phenylacetic acids Hydroxylcinnamic acids Phenylpropenes Coumarins Isocoumarins Chromones Naphthoquinones Xanthones Stilbenes Anthraquinones Flavonoids Isoflavonoids Lignans Neolignans Biflavonoids Lignins Catechol melanins Flavolans (condensed tannins)

Catechol, hydroquinones 2,6-Dimethoxybenzoquinones p-Hydroxybenzoic, salicylic 3-Acetyl-6-methpxybensaldehyde p-Hydroxyphenylacetic Caffeic, fernlic Myristicin, endenol Umbelliferone Berginin Engenin Juglone, plumbagin Mangiferin Lunulaic acid Emodin Qnercetin, cyanidin Genistein Pinoresinol Eusiderin Amentoflavone

หนาททางชววทยาโดยทวไปของสารประกอบฟนอลในพชจะปรากฏในหลาย

ลกษณะเชน รงควตถ ฮอรโมน abscisic acid, Lignin, Coenzyme Q หรอบางชนดอาจมสวนเกยวของในการเปน Allelopathic agents, Feeding deterrents, Antifungal agents และ

25

Phytoalexin อยางไรกตามหนาททแนนอนของสารประกอบฟนอลสวนใหญในพชนนยงเปนทสงสย แตทงนอาจจาแนกหนาทความสาคญของสารประกอบฟนอลออกเปน 3 ประการดงน 1.การตานทานโรค สารประกอบฟนอลหลายชนดสามารถปองกนหรอยบยงการเจรญเตบโตของเชอราบางชนดได เชน Protocatechuic acid ซงเปนสารประกอบฟนอลทมมากในหอมหวใหญสมวง จะตานทานตอโรค Smudge ทเกดจาก Colletotrichum circinan ไดด แตในหอมพนธสขาวจะไมมสารตวนจงออนแอตอโรค smudge สารสกดทไดจากหวหอมนสามารถปองกนการงอกและยบยงการเจรญของเชอราชนดนดวย 2.รสฝาด รสฝาดของผลไมหลายๆ ชนด จะขนอยกบปรมาณของสารประกอบฟนอลในผล ชวงนาหนกโมเลกลของสารประกอบฟนอลทจะใหความฝาดนนอยในชวง 500-3,000 ซงสามารถทจะรวมตวกบโมเลกลของโปรตนในปากทาใหรสกฝาดได เมอผลไมสกมากขน สารประกอบฟนอลจะลดลงนอกจากนสารประกอบฟนอลยงเกดการรวมตวเปนโมเลกลใหญ (Polymerization) และการรวมตวของสารประกอบฟนอลเปนโมเลกลใหญจะเกดขนเรอยๆ จากโมเลกลทละลายนากลายเปนโมเลกลทไมละลายนา ซงทาใหความฝาดลดลงเมอผลไมสกเตมท สวนรสขมในผลไมตระกลสมนนเปนผลจาก Naringin ซงพบมากและเปนสารประกอบฟนอลทใหรสขมสง สวนรสขมซงเกดจาก Cucurbitacin ของแตงกวาหรอรสขมซงเกดจาก Limonoids ในพวกสม ไมใชสารประกอบฟนอล แตเปนสารประกอบพวก Triterpenoid 3.ส สของผกผลไมซงเปนสของแอนโทไซยานนกเปนสของสารประกอบฟนอล นอกจากนการทผกหรอผลไมเกดสนาตาลเนองจากการทางานของเอนไซม Polyphenol oxidase (PPO) ซงเปลยนโมเลกลของฟนอลไปเปน Quinone แลวเกด Polymerization และมสนาตาล การยบยงปฏกรยานทาไดโดยเกบไวภายใตสภาพทม O2 นอย หรอใช Ascorbic acid ไป eeduce quinone ไมใหเกด Polymerization ปรมาณของ PPO จะมมากในผลไม เมอผลยงเลกและจะลดลงเมอผลบรบรณและสก สนนษฐานวา Quinone ทไดจากการทางานของ PPO มคณสมบตในการยบยงการเจรญ เตบโตของเชอราได

26

6. ชววทยาของพชทนามาศกษา 6.1 ดาหลา รปท 1.13 ดอกดาหลา (http://www.kruaklaibaan.com)

ตารางท 1.4 อนกรมวธานของตนดาหลา ชอวทยาศาสตร: Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith ชอพอง: Phaeomeria magnifica, Nicolaia elatior ชอสามญ : ดาหลา วงศ : Zingiberales ชออน ๆ: กาหลา, กะลา ถนกาเนด: เอเชยตะวนออกเฉยงใต

6.1.1 การปลกดาหลา ดาหลาเปนไมดอกทมการปลกมาเปนระยะเวลานานแลวทางภาคใตของไทย ซงเดมไดมการนาหนอออนและดอกมาใชเปนผกประกอบอาหารบางประเภท ปจจบนไดมการนามาปลก เปนไมตดดอกมากขน เนองจากดาหลาเปนไมดอกทใหดอกดกในฤดรอน ขณะทไมดอกชนด อน ๆ ไมคอยจะมดอก ประกอบกบดอกมขนาดใหญ สสดใส รปทรงแปลกตา ทาใหเปนทสนใจ ของผพบเหนและเปนทตองการของตลาด ดาหลาเปนพชทเจรญเตบโตไดดในทมแสงแดดราไรหรอทรมไมยนตน ถาหากโดนแดดจดเกนไปสของกลบประดบจะจางลง และทาใหใบไหม การปลกดาหลาสามารถปลกไดทกฤด แตฤดปลกทเหมาะสมทสดคอ ฤดฝน เรมตงแตเดอนพฤษภาคมถงเดอนสงหาคม ซงดาหลาจะมการเจรญเตบโตทางดานลาตนและแตกหนอ ชวงทดาหลาแตกหนอไดมากคอ เดอนกรกฎาคม ถงเดอนสงหาคม แตในท ๆ มนาเพยงพอไมจาเปนตองรอฤดฝน

27

6.1.2 ลกษณะทางพฤกษศาสตร ลาตน ดาหลาเปนพชทมลกษณะคลายขา มลาตนใตดนเรยกวาเหงา (Rhizome) เหงาเปนบรเวณทเกดของหนอดอกและหนอตน ดาหลา 1 ตน สามารถใหหนอใหมไดประมาณ 7 หนอ ในเวลา 1 ป สวนลาตนเหนอดนเปนกาบใบทโอบซอนกนแนน เชนเดยวกบพวกกลวย สวนนคอลาตนเทยม (Pseudo stem) ลาตนเหนอดนสง 2-3 เมตร มสเขยวเขม ใบ มรปรางยาวร กลางใบกวางแลวคอย ๆ เรยวไปหาปลายใบ และฐานใบ ใบไมมกานผวเกลยงทงดานบนและดานลาง ใบยาว 30-80 เซนตเมตร กวาง 10-15 เซนตเมตร ปลายใบ แหลมฐานใบเรยวลาดเขาหากานใบ เสนกลางใบปรากฏชดทางดานลางของใบ ดอก ดอกดาหลาเปนดอกชอมลกษณะดอกแบบ (Head) ประกอบดวยกลบประดบ (Bracts) ม 2 ขนาด สวนโคนประกอบดวยกลบประดบขนาดใหญ จะมสแดงขลบขาวเรยงซอนกนอยและจะบานออก กลบประดบขนาดเลกอยสวนบนของชอดอกมสเดยวกบกลบประดบขนาดใหญ กลบประดบเลกนจะหบเขาเรยงเปนระดบ ภายในกลบประดบขนาดใหญทบานออกจะมดอกขนาดเลกกลบดอกสแดง ซงเปนดอกสมบรณเพศอย จานวนมาก ดอกบานเตมทจะมขนาดความกวางดอกประมาณ 14-16 เซนตเมตร ลกษณะกานชอดอกแขงตรง ดอกจะพฒนามาจากหนอดอกทแทงออกมาจากเหงาใตดน ลกษณะของหนอจะมสชมพ ทปลายหนอ พนธ ปจจบนพนธดาหลาทปลกตดดอกมอย 3 พนธดวยกนคอ พนธสชมพ พนธสขาวและพนธสแดง 6.1.3 การขยายพนธพช การแยกหนอควรแยกหนอทมความเหมาะสมนาไปปลกคอ สงประมาณ 60-100 ซ.ม. ขนไปและมกงออนกงแกนประมาณ 4-5 ใบ ใชมดตดใหมเหงา และรากตดอยดวย ซงหนอชนดนจะมหนอดอกออน ๆ ตดมาดวยประมาณ 3 หนอ นาไปชาในถงพลาสตก 1 เดอนเพอใหหนอแขงแรงกอนปลก การแยกเหงา โดยการแยกเหงาทเกดใหมทโคนตน แลวนาไปชาในแปลงเพาะชา วธนจะใชเวลาประมาณ 1 ป จงจะเรมใหดอก การปกชาหนอแก โดยนาไปชาในแปลงเพาะชาใหแตกหนอใหมแขงแรง แลวจงคอยยายมาปลกลงแปลง

28

6.2 หวา รปท 1.14 ผลหวา (http://dnp.go.th) ตารางท 1.5 อนกรมวธานของตนหวา

ชอวทยาศาสตร: Syzygium cumini (L.) Skeels ชอพอง: - ชอสามญ : Jambolan Plum, Java Plum วงศ : Myrtaceae ชออน ๆ: หวาขแพะ (เชยงราย) ถนกาเนด: เอเชยเขตรอน จากอนเดยถงมาเลเซย

6.2.1 ลกษณะทางพฤกษศาสตร ตนหวา หรอทชาวฮนดเรยกวา “จามาน” หรอ “จามน” เปนพนธไมพวกชมพ เปนไมตนขนาดใหญชอบดนชนทอดมสมบรณ ขนตามปาดบ และปาผลดใบ ทวไป สง 10-25 เมตร ลาตนคอนขางตรง เปลอกคอนขางเรยบสเทาออนกงกานมาก แขงแรง ปลายกงหอยยอยลง ใบเดยวดกหนา ทาใหเกดเปนพมทรงรปไข แนนทบ ใบออนจะแตกสแดงเรอ ๆ ใบแกหนา ออกเปนค ๆ ตรงขามกน รปใบมนหรอ แกมรปหอก เกลยง เปนมน เสนแขนงใบละเอยดออนและเรยงขนานกน กวาง 5-9 เซนตเมตร ยาว 9-15 เซนตเมตร ดอกสขาว ออกรวมกนเปนชอสน ๆ ตามกง ยอม ๆ เหนอรอยแผลใบ ผล กลม ร ๆ กวางประมาณ 0.8 เซนตเมตร ยาว 1.5-3 เซนตเมตร มเนอเยอหม ผลออนสเขยว พอเรมแกออกสชมพ แตพอแกจดออกสดา ใชรบประทานได มรสเปรยว ๆ หวาน ๆ แมคาทขายลกหวาจะพรมนาเกลอเลกนอย เพอเพมรสชาดใหนารบประทานยงขน 6.2.2 การขยายพนธ สวนใหญใชเมลดเพาะ และสตวพวกนก และคางคาว สามารถชวยในการแพรพนธไดอยางด โดยนาเมลดทกนเขาไปถายในทอน ๆ นอกจากนยงใช การตอนหรอทาบกงกไดผลของ

29

หวาจะมขนาดเลก ใหญ ไมแนนอน สภาพดนรวนทอดมสมบรณ ขนไดทวไป ตงแตระดบใกลนาทะเล จนถงระดบความสง 1,100 เมตร ชวงการออกดอกจะเปนชวงเดอน ธนวาคม - มกราคม จะออกผลในชวงเดอน กมภาพนธ-พฤษภาคม 6.2.3 ประโยชน สวนของหวาทนาไปใชประโยชนคอ เปลอกตน ตมนาดมแกบด อมแกปากเปอยเนอไม ใชทาสงปลกสรางทอยในรม ผลดบ แกทองเสย ผลสก รบประทานได ใชทาเครองดม มรสเปรยวอมฝาด สามารถนาไปทานาผลไม ไวนเปนเครองดมทใหสมวงกนแกทองรวงและบด เมลดมสารชวยลดนาตาลในเลอด แกทองเสย ถอนพษจากเมลดแสลงใจ 6.3 มะอก รปท 1.15 มะอก (http://diarylove.com) ตารางท 1.6 อนกรมวธานของตนมะอก

ชอวทยาศาสตร: Solanum stramonifolium Jacq. ชอสามญ : - วงศ : Solanaceae ชออน ๆ: หมากอก มะเรอป มะป

ถนกาเนด: พบทวไปของทกภาค ปาผลดใบ ปาละเมาะทรกราง

มะอกมคณคาทางโภชนาการคอ ประกอบดวย คารโบไฮเดรต โปรตน เสนใย ฟอสฟอรส เหลก วตามนเอ วตามนบ1 วตามนบ2 ไนอาซน วตามนซ

30

6.3.1 ลกษณะทางพฤกษศาสตร ตน เปนไมพมขนาดเลกอาย 2-3 ป สง 50-150 ซม.แตกกงกานสาขาออกเปนพมคลายมะเขอพวง ลาตนและตนกานใบมหนามแหลม และขนละเอยดสนาตาลออนนมละเอยดปกคลมหนาแนน ใบ เปนใบเดยวสเขยวเรยงแบบสลบ รปไขแผกวาง ขอบใบหยกเวา ปลายใบแหลมฐานใบ 2 ขางไมเทากนมขนนมอาจมหนามทงบนใบและใตใบ และมหนามแขงอยบนเสนใบ ใบยาว 15-26 ซม. กวาง 10-23 ซม. กานใบยาว 7 ซม. ดอก เปนดอกชอมดอกยอย 3-5 ดอก ออกเปนกระจกตามบรเวณซอกใบ กลบดอกเปนแฉก 5 แฉกสขาวหรอสมวงออนม 4-6 กลบ โคนตดกนแตละกลบขนาดเลกปลายแหลม ตรงกลางมถงเกสรตวเมยสเหลองและเมอบานกลบจะโคงลง ผล เปนผลเดยวลกษณะกลม ผลออนสเขยว มขนยาวปกคลมทวทงผล เสนผาศนยกลาง 1.6-9 ซม. ผลสกสเหลองหรอสเหลองอมสม ภายในมเมลดกลมเลกๆ จานวนมากเมลดเรยงเปนแถวอยภายใน 6.3.2 การขยายพนธ ใชเมลดในการขยายพนธ เจรญเตบโตไดดในดนรวนซยในทกลางแจง นาปานกลางทนตอแมลงโรคและทนตอสภาพแหงแลงไดด ออกผลผลตตลอดทงป 6.3.3 ประโยชน ผลมรสเปรยว อมรสขนเลกนอย ผลสกจะมรสเปรยวจด เปนอาหาร กดฟอกเสมหะ แกไอ ใบ เปนยาพอก แกคน ราก แกปวด แกไข พอกแกคน กระทงพษไขหวทกชนด (อาการ ไขทออกตมออกผน ตามผวหนง เชน เหอด หด หด อสกอใส), เมลด แกปวดฟน (โดยเผาสดดมควนเขาไป)

31

6.4 เขม รปท 1.16 เขม (http://www.panmai.com) ตารางท 1.7 อนกรมวธานของตนเขม

ชอวทยาศาสตร: Ixora chinensis lamk ชอพอง: - ชอสามญ : West Indian Jasmine วงศ : Rubiaecae ชออน ๆ: - ถนกาเนด: พบทวไปของทกภาค

6.4.1 ลกษณะทางพฤกษศาสตร ตนเขมเปนพรรณไมยนตนมพมขนาดเลกจนถงขนาดกลางขนาดลาตนมความสงประมาณ3-5 เมตรลาตนเปนตนเดยวหรอแตกกอแผสาขาออกไปเปนตนตนเลกกลมขนาดเสนรอบวงประมาณ 4-10 เซนตเมตรลาตนเรยบสนาตาลกงยอดมสเขยวแตกกงตรงขนดานบน ใบเปนใบเดยวออกเปนคสลบกนรอบตนและกง ใบแขงเปราะมสเขยวสด โคนใบมนปลายใบแหลม ลกษณะใบมขนาดและรปรางแตกตางกนตามชนดพนธออกดอกเปนชอออกตรงสวนยอดซงมกานดอกชไวภายในชอประกอบดวยดอกเลกๆลกษณะเปนหลอดเลก ๆ ซงมกลบอยสวนบน ประมาณ 4-5 กลบ กลบเลกแหลม ลกษณะดอกและสสนแตกตางกนไป 6.4.2 การปลกตนเขม การปลกม 2 วธ 1. การปลกในกระถางเพอประดบภายนอกอาคารบานเรอน ใชกระถางทรงสงขนาด 8-12 นว ใชปยคอกหรอปยหมก : แกลบผ : ดนรวน อตรา 1: 1: 1 ผสมดนปลกควรเปลยนกระถางปละครงเพราะการเจรญเตบโตของทรงพมโตขนและเพอเปลยนดนปลกใหมทดแทนดนปลกเดมทเสอมสภาพไป

32

2. การปลกในแปลงปลกเพอประดบบรเวณบานและสวนนยมปลกเปนกลมตกแตงสวนบรเวณบานหรอปลกเปนแนวรวกได สามารถตดแตง และบงคบรปทรงไดตามความเหมาะสม และความตองการของผปลก ขนาดหลมปลก 30 x 30 x 30 เซนตเมตร ใชปยคอก หรอปยหมก: ดนรวน อตรา 1: 2 ผสมดนปลก แสง ตองการแสงแดดจด หรอ กลางแจง นา ตองการปรมาณนาปานกลาง สามารถทนตอความแหงแลง การใหนา 3-5 วน/ครง ดน ชอบดนรวนซย ดนรวนปนทราย มความชมชน ปย ใสปยคอกหรอปยหมก อตรา 0.5-1 กโลกรม/ตน ควรใส 5-6 ครง/ป 6.4.3 การขยายพนธ การขยายพนธทาไดหลายวธ ไดแก การปกชา การเพาะเมลด การตอน วธทไดผลดและนยมกน คอ การปกชาและการตอน ไมคอยพบและมปญหาเรองโรค เรองแมลงเพราะเปนไมททนทานตอโรคไดด 6.4.4 ประโยชน รากมรสหวานใชรบประทานแกโรคตา เจรญอาหาร ใบใชเปนยาฆาพยาธ ดอกแกโรคตาแดง ตาแฉะ และผลใชแกโรครดสดวงในจมก 6.5 ทามง รปท 1.17 ทามง (http://singburi.doae.go.th)

33

ตารางท 1.8 อนกรมวธานของตนทามง ชอวทยาศาสตร: Litsea petiolata Hook. f. ชอพอง: - ชอสามญ : Litsea วงศ : Lauraceae ชออน ๆ: ไทแมงดา แมงดาตน ชะมง กาดสลอง

ถนกาเนด: ปาดงดบเขา ปาเบญจพรรณ ปาโปรงในภาคใต

6.5.1 ลกษณะทางพฤกษศาสตร ตน เปนไมยนตนขนาดใหญ แผกงกานออกเปนทรงพม เปลอกตนมกลนคลายกลนแมงดา ใบ เปนใบเดยวรปไขกวาง ปลายแหลม ผวใบดานหนาสเขยวเปนมน ขอบใบเรยบ ปลายใบเรยว กวางประมาณ 2-3 นว หลงใบขรขระ ดอกหนาทบ ดอก ดอกปยสขาวออกตามรายกง ผล ผลกลมเวลาสกมสดา 6.5.2 การขยายพนธ ขยายพนธโดยการเพาะเมลด และตอนกง ปลกไดทกฤดกาล ทกสถานทยกเวนทนาทวมหรอนาขง เปนพชทใหผลผลตตลอดป 6.5.3 ประโยชน สวนทใชบรโภค ใบออน เปลอกตน ผลแก ดอกออน ยอดออน การปรงอาหาร ใบ ใสแกงเผด ใบ เปลอกตนและผลแก ใชตานาพรก ใบออนและดอกออนเปนผกเหนาะ ยอดออน ลวกจมกนกบนาพรก มสรรพคณทางยาคอ นาเปลอกมาตาใหละเอยดชวยในการขบลม แกทองอดทองเฟอและจกเสยด

34

6.6 เหมยง รปท 1.18 เหมยง

(http://sinburi.doae.go.th) ตารางท 1.9 อนกรมวธานของตนเหมยง

ชอวทยาศาสตร: Gnetum gnemon L. var. tenerum Markgr. ชอสามญ : Baegu วงศ : Gnetaceae

ชออน ๆ: เหลยง เลยง นะกง นะรง สะเหรยง ปแซ เรยนแก ผกกะเหรยง ผกเมยง

ถนกาเนด: ภาคใตฝงทะเลอนดามน

ปาดบชน ระดบความสง 0-1,000 เมตร

6.6.1 การปลกตนเหมยง เตรยมพนททารมเงาบงแดดใหเรยบรอย นาตนพนธลงปลก ระยะปลก 3 x 3 เมตร ตนพนธทใชตองเปนพนธทแขงแรง วางตนพนธใหเอยง 45 องศา ในหลมทขดแลวกลบดน แตพอแนน รดนาใหชมใชไมหลกปกผกเชอก ใหเรยบรอยเพอปองกนลม ควรปลกในชวงตนฤดฝนหรอชวงฝนตกจะชวยใหไมเสยเวลา และแรงงานในการรดนา การใหปยแบงใส 2 ครง ในชวงตนฤดฝนและปลายฤดฝน ใชปยสตร 15 -7 - 18, 15 - 15 - 15 ผสมกบปยสตร 12 - 5 - 14 อตรา 30 กโลกรม/ไร/ป กรณปลกรวมในสวนยาง ในสวนไมผล ในชวงตนฤดฝนใชปยสตร 15 - 15 -15 อตรา 50 กโลกรม/ไร/ป เรมเกบเกยวเมออาย 2 ปขนไป เกบเกยว 15-30 วน / ครง เกบยอดออนถงยอดเพสลาด ควรเดดใหชดขอไมเดดกลางขอหรอตด เพราะจะทาใหการแตกยอดออนในครงตอไปจะชา เมอเกบแลวอยาใหใบหรอยอดออนนนถกแสงแดดและลม ควรพรมนาแตพอชม สามารถเกบไดนาน ประมาณ 5 - 6 วน สวนทใชบรโภค ยอดออน ใบออน ดอกออน

35

6.6.2 ลกษณะทางพฤกษศาสตร ตน ไมยนตนขนาดกลาง สงประมาณ 2-3 เมตร ไมผลดใบ ตามขอของลาตน

และกงโปงออกคลายขอตอกระดก ใบ เปนใบเดยวคลายใบยางพารา ใบรปรแกมรปขอบขนาน แผนใบดานบนส

เขยวเขมเปนมน กวาง 4 - 10 เซนตเมตร ยาว 10 - 12 เซนตเมตร แตถาอยในทโลงรบแสงแดดสใบจะจาง

ดอก ดอกสเขยวอมเหลอง ออกบนแกนชอยาวไมแตกแขนงจากซอกใบ ดอก ออกเปนกลมเรยงเปนชนๆ ดอกแยกเพศอยตางตนดอกตวผรปทรงกระบอก ดอกตวเมยรปทรงกลม ออกดอกชวงเดอนพฤศจกายน - ธนวาคม ผล รปลกษณะกลมยาวคลายไข กนผลแหลมหรอกลมมน ชนดกนแหลมผลสดทงเปลอกกวางประมาณ 1 ซม. ยาวประมาณ 1.5 ซม. ชนดกนผลกลม ผลสดทงเปลอกกวางประมาณ 1.5 ซม. ยาวประมาณ 2.5 ซม. ผลออนเปลอกผลสเขยว เมอแกจดเปลอกผลและเนอหมเมลดสขาว เปลอกหมเมลดคอนขางบาง หนาและแขงเฉพาะสวนหวในหนงชอม 10-20 ผล 6.6.3 การขยายพนธ การขยายพนธทาไดหลายวธ ไดแก การเพาะเมลด, การตอนกง, การปกชากง และการใชตนจากรากแขนง 6.6.4 ประโยชน (มหาวทยาลยมหดล, 2541) การปรงอาหาร ยอดออน ใบออน นาไปปรงอาหาร (กรมอนามย, 2530) เชน ตมกะท แกงเผด แกงสม แกงพรก แกงจด แกงเลยง แกงไตปลา ผด หรอใชหอเมยงคา รองหอหมก ยายอดออน ใบออน ดอกออน รบประทานเปนผกสดหรอผกลวกกบนาพรก ขนมจนนายา ลกษณะพเศษ ผกเหมยง รสหวานอมมนเลกนอย มคณคาทางอาหารสงทาใหรางกายแขงแรง เวลาเดนทางไกลในปา ใหใชยอดออนผกเหมยงสดใสเขาปากเคยวไปเรอยๆ จะลดความกระหายนาได สรรพคณทางยา นาใบมารบประทานเพอบารงเสนเอน กระดก สายตา และสามารถนามาใชลอกฝาไดอกดวย

36

วตถประสงค 1. เพอศกษาหาชนดของพชพนบานทมสารตานอนมลอสระเปนองคประกอบ

2. เพอศกษาหาปรมาณสารตานอนมลอสระชนดตาง ๆ ในพชพนบาน 3. เพอทดสอบฤทธตานอนมลอสระของสารสกดหยาบจากพชพนบาน

โดยเฉพาะพวกสารประกอบฟนอลกซงคาดวาอาจมศกยภาพดงกลาว และยงไมเคยมรายงานมากอน 4. เพอศกษาหาชนดของสารประกอบฟนอลกทเปนองคประกอบในดอกดาหลา

5. เพอเปนขอมลเบองตนในการคดเลอกสารสกดจากพชสมนไพร สาหรบนาไป คนควาศกษาหาสารออกฤทธ และขยายผลสการทดลองในสตวทดลองและในคนตอไป

บทท 2 วสด อปกรณและวธการ

วสด 1. พชตวอยาง

พชทใชในการศกษาคอดอกดาหลาสแดง ผลมะอก ผลหวา ดอกเขม ใบทามง และ ผกเหมยง จากตลาดพลาซา หาดใหญ จงหวดสงขลา, ตลาดสด อาเภอเมอง จงหวดตรง และลานหนแตก คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร 2. สารเคมทใช

สารเคมทใชในการทดลองเปนชนด Analytical และ HPLC Grade ซงเปนผลตภณฑของบรษทตาง ๆ ดงน

สารเคมทใช

M.W. บรษทผผลต

Analytical grade Absolute Ethanol (EtOH) Acetone Butyl hydroxyl toluene (BHT) Chloroform Dichlorometane (DCM) Ethylacetate, (EtOAc) Folin – Ciocalteu reagent Hexane Phosphoric acid Potassium Hydroxide Silicagel 60 GF254 Sodium carbonate Toluene

46.07 58.08 220.30 119.38 84.93 88.105 260.20 86.18 98.0 56.11 60.09 105.99 92.14

BDH Lab Scan USB BDH Merck BDH BDH Lab Scan BDH J.T Baker Merck Merck Lab Scan

37

38

3. อปกรณ อปกรณทใช รน บรษทผผลต เครองชง 2 และ 4 ตาแหนง เครองหมนเหวยงแบบตงโตะ Micropipette เครองวด ของ pH ของสารละลาย เครองหมนเหวยง เครองวดคาการดดกลนแสง (UV-VIS recording spectrophotometer) เครองผสมสารละลาย (Vortex mixer) เครองกวนสารละลาย (Magnetic stirrer) อางควบคมอณหภม (Water bath) เครองระเหยตวทาละลายแบบหมน Pump for HPLC Detector for HPLC Column for HPLC

GT410 และ AB204-5 5804R Biopette PHM 61 J2-21 UV-1200series 160A G-560E - SS40-D R114 Single Pump Model 515 2487 UV/VIS Dual Wavelength Detector Symmetry® C18 5 µm 3.9 X 150 mm

Ohaus, Switzerland Eppendorf, Germany LabNet Radiometer, Denmark Beckman Shimadzu Scientific Industries Clifton Cerastir Grant, England BUCHI, Switzerland Waters Waters Waters

สารเคมทใช M.W. บรษทผผลต HPLC grade Acetonitrile Tetrahydrofuran (THF) Potassium dihydrogen phosphate Methanol (MtOH) Standard Vitamin E (α-Tocopherol) Gallic acid Beta carotene (β-carotene) Vitamin C (Ascorbic acid) DPPH radical (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)

41.05 72.11 136.09 32.40 430.69 170.12 536.873 176.13 394.30

Fisher scientific Fisher scientific Fisher scientific Fisher scientific Fluka Sigma Fluka Sigma Sigma

39

วธการ 1. อลตราไวโอเลตและวสเบลสเปกโทรสโกป (Ultraviolet and Visible Spectroscopy)

สเปกโทรสโคปเปนการศกษาเกยวกบคณลกษณะการดดกลนแสง (Light absorption) จากหลกการนสามารถนามาใชวเคราะหสารทงในเชงปรมาณ (Quantitative analysis) และในเชงคณภาพ (Qualitative analysis) เนองจากเปนเทคนคทดาเนนการไดอยางรวดเรว แมนยา และใชสารปรมาณนอย ในระดบไมโครกรมหรอนาโนกรม จงนยมมาประยกตใชในวทยาศาสตรเกอบทกสาขาทงวทยาศาสตรชวภาพและกายภาพ เชนทางการแพทย เคม เภสชศาสตร เกษตรศาสตร และสงแวดลอม เปนตน การดดกลนแสงหรอรงสทอยในชวงอลตราไวโอเลตและวสเบล ซงอยในชวงความยาวคลนประมาณ 190-800 นาโนเมตร (nm) ของสารเคมนน สวนใหญไดแกพวกสารอนทรย (Organic compound) หรอ สารประกอบเชงซอน Complex compound) หรอสารอนนทรย (Inorganic compound) ทงทมสและไมมส สารใดทม unsaturated functional group สามารถดดกลนแสงในชวง ยว-วสเบลได โดยอาจทาการวเคราะหอยในรปของธาตหรอโมเลกลกได แตในกรณทจะนาไปใชพสจนวาสารตวอยางนนเปนสารอะไร มโครงสรางอยางไร อาจจะตองใชเทคนคอยางอนเขาชวยดวย เพอใหเกดความแนใจ เชนใชเทคนคทาง IR NMR หรอ Mass spectroscopy (แมน อมรสทธ และ อมร เพชรสม, 2535)

โดยทวไป เทคนคการวเคราะหนบางครงนยมเรยกวา ยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตเมตร แตถาสารททาการวเคราะหมสหรอทาใหเกดสขน สารทมสนนจะดดกลนแสงในชวงวสเบล อาจเรยกวา คลเลอรเมตร (Colorimetry) 1.1 ทฤษฎเบองตนของแสง

แสงเปนคลนแมเหลกไฟฟา (Electromagnetic wave) จงเปนพลงงานรปแบบหนงซงเคลอนทในลกษณะ sine wave ดงแสดงในรปท 2.1

รปท 2.1 แสดงลกษณะของคลนแมเหลกไฟฟา (www.google.com)

40

โดยทวไปรงสทเปลงออกมาจากแหลงกาเนดแสง เชน ดวงอาทตยประกอบดวย พลงงานหลายระดบขนอยกบความถ (Frequency) หรอความยาวคลน (Wavelength) นน ๆ ดงสมการตอไปน

ระดบพลงงาน ( ) hcE hνλ

= =

เมอ h = Plank’s constant (6.63 X 10-34 J-s/molecule)

ν = ความถของคลน (รอบ/วนาท, Hz)

λ = ความยาวคลน (เมตร, นาโนเมตร) เนองจาก h และ c เปนคาคงท ดงนนระดบพลงงานคลนแมเหลกไฟฟาจงแปรผนโดยตรงกบความถหรอจะแปรผนโดยกลบกบความยาวคลน รงสทประกอบดวยพลงงานหลายระดบหรอหลายความยาวคลนผสมกนอยเรยกวา Heterochromatic light ซงเราสามารถแยกออกเปนความยาวคลนเดยว ๆ (Monochromatic light) ไดโดยใช Diffraction grating หรอ Prism อยางไรกตามเพอความสะดวกในการศกษาจงแบงเปนแถบ พลงงานทเปลงออกมาเปนชวง ๆ (Spectrum) ดงแสดงในตารางท 2.1 ตารางท 2.1 แถบพลงงานชวงตาง ๆ ของคลนแมเหลกไฟฟาและการเปลยนแปลงในอะตอมหรอโมเลกลของวตถเมอรงสตกกระทบ แสงหรอรงส ความยาวคลน การเปลยนแปลงในอะตอมหรอโมเลกล

ของวตถทรงสตกกระทบ

Gamma-rays 1-100 pm Rearrangement of nuclear particle X-rays 100 pm-100 nm Electronic distribution Ultraviolet (UV) 100-380 nm Electronic transition Visible 380-700 nm Electronic transition Infrared (IR) 700-300000 nm Vibration, translation และ rotation Microwave 300000-109 nm Vibration, transition Radio waves >109 nm Nuclear transition หมายเหต แสงทมองเหนอยในชวง Visible เทานน

41

1.2 ปรากฏการณทเกดเมอแสงตกกระทบวตถและ spectroscopy ชนดตาง ๆ เมอแสงตกกระทบวตถอาจทาใหเกดปรากฏการณตาง ๆ ขนไดหลายชนด เชน พลงงานถกถายเทไปสอเลคตรอนหรอนวเคลยสในอะตอมหรอโมเลกลทประกอบเปนวตถนน ๆ ปรากฏการณนเองทเรยกวา การดดกลนแสง (Light absorption) และเรยกการศกษาเกยวกบคณลกษณะนวา Absorption Spectroscopy โดยใช Spectrophotometer เปนเครองมอ นอกจากนนแสงทตกกระทบอาจเกดการกระจาย (Scatter) หรอเกดการหกเห (Reflection) กได ดงแสดงในรป 2.2

รปท 2.2 แสดงการเกดอนตรกรยาของสารเคมกบการแผรงสหรอแสง

การทจะเกดปรากฏการณอะไรขนเมอแสงตกกระทบวตถขนอยกบปจจยสาคญ 2 ประการคอ ระดบพลงงานและโครงสรางทางเคมของโมเลกลทแสงตกกระทบ ตารางท 2.1 แสดงใหเหนวาเมอรงส UV ทความยาวคลนเหมาะสมหนงตกกระทบ พลงงานจะถายเทหรอไปกระตนใหอเลคตรอนของวตถซงเดมมพลงงานตา (Ground state) เคลอนยายไปสระดบพลงงานสงขน (Excited state) ทเรยกวา Electronic translation ดงแสดงในรป 2.3 ทงนจะไมมผลกระทบตอนวเคลยสเลย หรอเมอรงส Infrared ไปกระทบวตถกจะเกดการสน (Vibration) การหมน (Rotation) และการเคลอนท (Translation) ของโมเลกล (ปรากฏการณหลงทง 3 ชนดนคอพลงงานความรอน) โดยไมมผลกระทบตออเลคตรอนเลย

1E (Excited state) 1 0E E E hν∆ = − = 0E (Ground state)

รปท 2.3 แสดงกระบวนการเกดการกระตนของอเลคตรอน เนองจากอเลคตรอนทถกกระตนจะอยในสภาวะไมเสถยร (unstable) ในทสดตองปลดปลอยพลงงานออกมา (emission) สระดบตาเชนเดม ในกรณทพลงงานทปลดปลอยออกมามระดบตาลงถงชวงคลนทมองเหนได ปรากฏการณทจะเกดขนตามมาคอการเรองแสง

Po Pt Incident Radiation

Absorbed Radiation

Transmitted Radiation

Reflection (Pr) Scattering (Ps)

42

(luminescence) ซงอาจเปน phosphorescence และ fluorescence ดงนนการศกษาคณ ลกษณะการคายพลงงานของแสงของสารจงเรยกวา emission spectroscopy ดวยเหตน Absorption spectroscopy จงมหลายชนดขนอยกบชวงคลนททาการศกษา อยางไรกตาม ในงานวจยครงนจะกลาวถงคณลกษณะการดดกลนแสงของสารซงเกดขนเฉพาะในชวงคลน UV-visible และการวเคราะหเชงปรมาณเทานน 1.3 การประยกตใช spectroscopy ในการวเคราะหเชงปรมาณ ในการวดปรมาณของแสงหรอ Radiation ทถกดดกลนดวยสารตวอยางนน เราสามารถทาไดโดยใหลาแสงผานเขาไปในสารตวอยาง แลววดปรมาณของแสงทผานทะลออกมาโดยเปรยบเทยบกบแสงททะลออกมาเมอไมมสารตวอยาง ดงรปท 2.4

รปท 2.4 แสดงกระบวนการวดการดดกลนแสง การดดกลนแสงของสารจะเปนไปตามกฎของเบยรและแลมเบอรต (Beer-Lambert’s Law) ซงอาจกลาวสน ๆ ไดวา “คาแอบซอรแบนซของสารละลายจะเปนปฏภาคโดยตรงกบความเขมขน” ดงสมการตอไปน

0logt

PA bcP

ε= =

เมอ A = คาการดดกลนแสง (Absorbency, A หรอ Optical Density, O.D.) 0 , tP P = ความเขมของแสงกอนและหลงจากผานสารละลายตามลาดบ

c = ความเขมขนของสาร

b = ระยะทางทแสงผาน

ε = คาคงทของการดดกลนแสง จากสมการขางตนจะเหนวาคาดดกลนแสง (Absorbance) จะแปรผนโดนตรงกบความเขมขนของสาร ( c ) เมอคา ε และ b (กาหนดใหเปนคาคงทซงมกมคาเทากบ 1 ซม.)

43

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Conc. (mg/ml) หรอ quantity, mg

O.D

.

เปนคาคงท จากหลกการดงกลาวน เราสามารถนามาใชเพอวเคราะหหาความเขมขนหรอปรมาณของสารตวอยางทไมทราบคา (Unknown) ได ในทางปฏบตดาเนนการโดยเตรยมสารละลายชนดนนใหทราบความเขมขนแนนอนเปนมาตรฐาน (Standard solution) มากกวา 3 คา นามาวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลนทเหมาะสมหนง แลวนาคาทไดไปพลอตความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงและความเขมขน จะไดกราฟเสนตรงซงตองมจดเรมตนทศนย (Origin) เรยกวากราฟมาตรฐาน (Standard หรอ Calibration curve) จากนนจงนาสารละลายตวอยางทตองการทราบคาความเขมขนหรอปรมาณไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลนเดยวกน นาคาการดดกลนแสงทอานไดไปเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานกจะทราบคาความเขมขนของสารละลายนน ๆ ดงแสดงในรป 2.5

รปท 2.5 กราฟมาตรฐานแสดงความสมพนธระหวางคา O.D. กบความเขมขนทแนนอน

ของสารละลายและการใชประโยชนเพอหาคาเขมขนของสารทตองการทราบ

2. การเตรยมสารสกดจากพชพนบานเพอวเคราะหหาปรมาณสารประกอบฟนอลก นาผก ผลไมพนบานตามตารางท 2.2 มาหนเปนชนเลก ๆ ตามวธการวเคราะห

ของ Chu และคณะ (2002) ซงสรปไดดงนคอ นาผก ผลไมตวอยาง 500-1,000 กรม ผสมกบ 80% Acetone แลวนาไป Homoginize และปนแยกท 10,000 รอบตอนาท นาสวนใสทไดมาระเหย Acetone ดวยเครองระเหยตวทาละลายแบบหมน (Rotatory Evaporator) ทอณหภม 40-50๐ซ จนมปรมาตรเหลอประมาณ 10% ของสารละลายเรมตน แลวเกบไวท -40๐ซ

Unknown; Absorbance

0.88 mg/ml

44

ตารางท 2.2 ผก ผลไมพนบานตวอยางทใชในการวเคราะห ชอพชตวอยาง สวนทนามาใช*

ดาหลา (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) ดอกสด มะอก (Solanum stramonifolium Jacq.)

- สวนเปลอก - สวนเนอ

ผลสด

หวา (Syzygium cumini (L.) Skeels) ผลสด เขม (Ixora chinensis lamk) ดอกสด ทามง (Litsea petiolata Hook. f.) ใบสด เหมยง (Gnetum gnemon var. tenerum Markgr.) ใบสด *หมายเหต เปนสวนของพชพนบานชนดนน ๆ ทนยมใชรบประทาน 3. การหาปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกด

วเคราะหดวยวธ Folin–Ciocalteu colorimetric method (Singleton. et al., 1999) โดยนาสารละลาย 100 ไมโครลตร มาเตมนากลนจนครบ 3 มลลลตร เตมสาร Folin–Ciocalteu reagent [ประกอบดวย 10% (w/v) Sodium tungstate และ 0.002% (w/v) Phosphomolybdic acid] ปรมาตร 125 ไมโครลตร หลงจากวางทงไวทอณหภมหอง 6 นาท เตม 7% Na2CO3 1.25 มลลลตร ทงไวนาน 90 นาททอณหภมหองเพอใหเกดส จากนนนามาวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 760 นาโนเมตร เทยบกบ Blank ซงใชนากลนแทนสารสกด หาปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกด โดยเปรยบเทยบคาทวดไดกบกราฟมาตรฐานซงเตรยมจากสารละลาย Gallic acid ความเขมขน 20 - 500 ไมโครกรม / มลลลตร (Wolfe & Lui, 2003) 4. โครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) HPLC เปน Column Liquid Chromatography แบบใหมซงไดพฒนามาตงแตป ค.ศ. 1969 โดยพฒนาเกยวกบคอลมนคอลดขนาดอนภาคของวสดบรรจ (packing material) ลงเหลอประมาณ 3-10 ไมโครเมตร (พวงแกว ลคนทนพร, 2539) ดงนนการทจะใหเฟสเคลอนท (mobile phase) เคลอนไดตองใชเครองปมทมแรงดนสงชวย HPLC เปนเครองมอทนยมใชกนอยางแพรหลายในการวเคราะหและแยกสารเกอบทกชนด เนองจากเปนเครองมอทไวสง (High sensitivity) สามารถประยกตใชในงานวเคราะหหาปรมาณไดอยางรวดเรว แมนยาและม

45

ประสทธภาพโดยเฉพาะสารทไมระเหยและไมคงตวตอความรอน สวนประกอบทสาคญของ HPLC แสดงในรป 2.6

รปท 2.6 แสดงองคประกอบทสาคญของเครอง HPLC (www.elchem.kaist.ac.kr/.../ lc/graphics/hplc-sch.gif)

4.1 Column

สงสาคญทสดอยางหนงททาใหผลการวเคราะหออกมาดหรอไม คอ คอลมน ทใชในการแยกสาร ปจจบนวสดทบรรจในคอลมนเพอการแยก (packing materials) ยงมการพฒนาไปเรอย ๆ เพอใหไดคอลมนทเหมาะกบงานตาง ๆ ไดดทสด ความรเรองการพฒนา packing materials จะชวยใหนกวเคราะหเลอกใชชนดของคอลมนไดเหมาะสมกบงาน

ในระยะแรก ๆ ของ Liquid Chromatography (LC) นน ใชคอลมนทบรรจดวย silica ธรรมดาเปนเฟสอยกบท และใชเฟสเคลอนทเปนพวก non-polar solvent เชน hexane ผสมกบ Methylene chloride LC แบบนเรยกวา Normal phase HPLC เพราะเปนแบบปกตทใชกนในตอนนนแตวธนควบคมยากเนองจากถาปรมาณนาในเฟสเคลอนทเปลยนแปลงเพยงเลกนอยจะมผลตอการวเคราะห นอกจากนยงลาบากในการวเคราะหสารทละลายไดดในนา อยางไรกตาม Normal phase HPLC กยงมใชกนในปจจบนสาหรบการวเคราะหสารทไวตอนา (water sensitive sample) หรอสารทไมละลายในนา ตอมามการเคลอบสารพวกนามนบนผวของ silica แลวใชเฟสเคลอนทเปนพวก polar solvent เชน สวนผสมของเมธานอลกบนา เทคนคนเรยกวา Reverse phase HPLC เนองจากชนดของเฟสอยกบทและเฟสเคลอนทกลบกนกบวธดงเดม อยางไรกตาม การเคลอบสารพวกนามนบนผว silica มขอเสยคอ ผลการ

46

วเคราะหมกไมคงท เนองจากมปจจยหลายอยางทมผลตอการแยกของสารเชน อณหภม และ องคประกอบของเฟสเคลอนท เปนตน 4.2 Ultraviolet-visible absorbance detectors เปนเครองตรวจวดทนยมใชกนมากใน HPLC หลกการทางานอาศยการดดกลนของสารตวอยาง เครองตรวจวดนอาจเปนชนด single beam หรอ double beam กได ขอดของเครองตรวจวดชนดนคอ ไมไวตอการเปลยนแปลงอตราการไหลของเฟสเคลอนทและอณหภม สามารถสแกน UV-Vis spectrum ไดรวดเรวมาก โดยสามารถเปรยบเทยบสเปคตรมของสารตวอยางกบสารมาตรฐานได 4.3 การวเคราะหเชงปรมาณของสารตวอยางดวยวธ HPLC (Quantitative Analysis) หลงจาก HPLC แยกสารออกมาเปนพค (Peak) ตาง ๆ ปรมาณของสารในแตละพคกสามารถคานวณไดดวยวธวดความสงของพค (Peak height) และการวดพนทพค (Peak area) ในการทาวจยครงนไดใชวธการวดพนทพค โดยเทยบกบพนทของสารมาตรฐานททราบปรมาณทฉดเขาไป ซงกราฟของสารมาตรฐานจะพลอตคาระหวางพนทใตพคกบคาความเขมขนทแตกตางกนออกไป กราฟทไดจะเปนกราฟเสนตรงคลายกบวธการหาปรมาณฟนอลคในสารสกด (รป 2.5) 5. การเตรยมสารสกดจากพชพนบานตวอยางเพอวเคราะหปรมาณเบตาแคโรทน และ วตามนอ (Kurilich et al., 1999) นาตวอยางพชพนบานมาเตรยมตามวธการของ Weber(1987) โดยนามาทาแหงดวยวธ Lyophilization แลวนา 300 – 500 มลลกรม (นาหนกแหง) เตมเอทานอลทมสวนผสมของ BHT ทความเขมขน 0.1% (w/v) ปรมาตร 10 มลลลตร นาไปบมท 70๐ซ เปนเวลา 15 นาท แลวเตม 40% KOH เพอใหเกดปฏกรยา Saponification ท 70 ๐ซ เปนเวลา 30 นาท นามาแชในอางนาแขง เตมนากลนปรมาตร 10 มลลลตร จากนนเตมสารผสม Hexane/Toluene Mixture อตราสวน 10: 8 โดยปรมาตร นาสวนใสมาระเหยจนแหง แลวละลายดวย THF หลงจากนนนาไปวเคราะหดวยวธ HPLC เพอหาปรมาณของวตามนอ และ สารเบตาแคโรทนตอไป โดยใชสารตวอยาง 20 ไมโครลตร วดคาการดดกลนแสงท 292 และ 450 นาโนเมตร ตามลาดบ เฟสเคลอนททใช คอ Acetronitrile: Methanol: Tetrahydrofuran อตราสวน 52: 40: 8 โดยปรมาตร โดยใชสารมาตรฐานคอ α – tocopherol และ β – carotene บรสทธ ความเขมขน 500 – 1500 ไมโครกรม / มลลลตร และ 3.0 – 75 ไมโครกรม / มลลลตร ตามลาดบ

47

6. การเตรยมสารตวอยางและการวเคราะหหาปรมาณวตามนซ (Kurilich et al., 1999) นาผก ผลไม ตวอยางแชแขงมา 50 กรม ( นาหนกเปยก) ผสมดวย 1% Phosphoric acid แลวปน ปรบปรมาตรเปน 500 มลลลตรดวย 1% Phosphoric acid หลงจากนนนาไปกรอง นาสารสกดทผานการกรองแลว 1 มลลลตร เตม 5% DTT (Dithiothreitol) 1 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 10 มลลลตร ดวย 1% Phosphoric acid แลวนาไปวเคราะหหาปรมาณวตามนซดวยวธ HPLC ตอไป โดยใชปรมาณสารตวอยาง 20 ไมโครลตร เฟสเคลอนททใชเปน Acetonitrile: 0.05 M KH2PO4 (pH 5.9) (75: 25) โดยวดคาการดดกลนแสงท 268 นาโนเมตร ความเขมขนของสารมาตรฐานวตามนทใชคอ 80 – 800 ไมโครกรม / มลลลตร 7. การสกดสารประกอบฟนอลกดวย Dichloromethane (Backhouse et al., 2008) และ Ethylacetate (Milovanovi et al., 2001) นาสารสกดจาก Acetone ระเหยแลว 100 มลลลตรมาเตม 100 มลลลตร Dichloromethane โดยใชกรวยแยก แลวสกดอกครงดวย 100 มลลลตร Ethyl acetate นาสารสกดทไดทงสองมาระเหยแหง แลวละลายอกครงดวย Ethanol 10 มลลลตร นาสารสกดทงสองไปหาปรมาณสารประกอบฟนอลกและทดสอบฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH radical ตอไป 8. Scavenging activity DPPH Radical Assay

8.1 ฤทธตานอนมลอสระ DPPH •ของสารสกด การทดสอบความสามารถดกจบอนมล DPPH • ในสารละลาย เปนวธทนยมใชกนทวไปสาหรบตรวจสอบฤทธตานอนมลอสระของสารประกอบฟนอลกในสารสกดเบองตน (Zhu et al., 2002) ดงนนในการศกษาครงนจงศกษาเกยวกบสารประกอบฟนอลกทมผลในการดกจบอนมลอสระ DPPH •ณ เวลาตาง ๆ เทานน ซงอาศยหลกการคอ เมออนมล DPPH • ในสารละลายสมวงเขมไดรบอเลคตรอน หรอ H • จากสารทดสอบ จะกลายเปนสารประกอบ DPPH ทเสถยรขนและไมมสมวงเขมเหมอนกบ DPPH •ทาใหตรวจวดความสามารถของสารสกดได จากคาการดดกลนแสงของสารละลาย DPPH •ทลดลงดงกลาว (Bran-Williams et al., 1995)

48

8.2 วธการทดสอบความสามารถในการดกจบอนมลอสระ DPPH • ทดสอบความสามารถดกจบอนมล DPPH • ของสารสกดตามวธการทระบโดย Yen และ Chen (1995) โดยนาสารสกดแตละชนดมาเตรยมเปนสารละลายทมความเขมขนตาง ๆ กนใน Ethanol ปรมาตร 100 ไมโครลตร แลวเตมสารละลาย 0.05 mM DPPH ใน Ethanol ปรมาตร 1 มลลลตร ลงไป ผสมใหเขากน หลงจากทงไวในทมด ณ อณหภมหอง นาน 5, 10, 20, 30, 40 และ 60 นาท ตามลาดบ นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 515 นาโนเมตรเปรยบเทยบกบชดควบคมซงใส Ethanol แทนสารสกด นาคาทไดมาคานวณหาเปอรเซนตการยบยงอนมล DPPH • จากสตร

controlA = คาการดดกลนแสงของชดควบคม sampleA = คาการดดกลนแสงของชดทดสอบ

จากนนคานวณหาคา 50IC จากกราฟระหวาง %Inhibition กบความเขมขนของสาร

สกด ณ เวลาตาง ๆ 9. การคานวณคา 50IC 10. ทาบรสทธสารประกอบฟนอลก โดยวธ Thin Layer Chromatography, TLC (Kusznierewicz et al., 2008) คาวา “โครมาโทกราฟ” มาจากภาษากรก “โครมาโทส (Chromatos)” ซงแปลวา ส ความหมายเดมของโครมาโทกราฟ หมายถง การแยกของผสมทมสซงไดมาจากพชตาง ๆ แตปจจบนนหมายถง วธการแยกและตรวจสอบของผสมทกชนดซงไมจาเปนตองมส (ปฏบตการเคมอนทรย, 2539) โครมาโทกราฟแบงออกเปน 2 ประเภทใหญ ๆ 1. โครมาโทกราฟเชงดดซบ (Adsorption Chromatography) ตวอยกบทเปนของแขง ตวเคลอนทอาจเปนของเหลว (Solid-liquid chromatography) หรอแกส (Solid-gas chromatography) วธการเลอกใชคอตองรถงคณสมบตของของผสมทตองการแยกวาจะถกดดซบบนตวอยกบทในขณะเดยวกนมแนวโนมทจะละลายในตวเคลอนท

50IC = คาความเขมขนของสารสกดทสามารถดกจบอนมล DPPH • ได 50%

( )% { } 100control sample

control

A AInhibition

A−

= ×

49

2. โครมาโทกราฟเชงแพร (Partition Chromatography) ตวอยกบทเปนของเหลวสวนตวเคลอนทอาจเปนของเหลว (Liquid-liquid chromatography) หรอแกส (Liquid-gas chromatography) ในทนสารทแยกมแนวโนมทจะแพรกระจายหรอละลายไดทงในตวอยกบทและตวเคลอนท

รปท 2.7 แสดงชนดของ Chromatography ทงหมด การแยกโดยวธโครมาโทกราฟอาศยหลกการวา สารทตองการแยกมการเคลอนทดวยอตราเรวทแตกตางกน เนองจากแรงกระทา 2 ชนด คอ ก. แรงผลกดน (Propelling forces) หมายถง แรงทตวเคลอนทผลกดนใหสารเคลอนไปบนตวเคลอนอยกบท จะเกดขนเมอตวเคลอนทไหลผานตวอยกบท ข. แรงหนวงเหนยว (Retarding forces) หมายถงแรงทตวอยกบทดงดดหรอดดซบสารไวในระยะเรมตนของโครมาโทกราฟ การแยกสารทมปรมาณนอยนนทาไดยาก ดงนนจงมการพฒนาทาง Paper Chromatography ซงบางครงเรยกวา Planar Technique การแยกสารประกอบนนทาไดโดยใชแผนกระดาษกรอง ซงกลไกของการแบกเปนแบบ partition ขอดของวธการนสงผลใหมการพฒนาเปน Thin Layer Chromatography (TLC) ซงการแยกสารจะทาบนแผนบางของตวดดซบเคลอบบนแผนแกวหรอวสดทแขงอยางอน เชน พลาสตก ในการวจยครงนเปนวธโครมาโทกราฟแบบบาง (Thin Layer Chromatography, TLC)

Chromatography

Adsorption Chromatography Partition Chromatography

Solid-liquid Chromatography เชน TLC, Ion-exchange Chromatography,

Gel filtration Electrophoresis

Solid-gas Chromatography

Liquid-liquid chromatography เชน Paper chromatography

Liquid-gas chromatography

50

10.1 โครมาโทรกราฟแบบบาง (Thin Layer Chromatography, TLC) มลกษณะคลายกบโครมาโทรกราฟกระดาษทรจกกนด ตางกนทเฟสคงท

เปลยนจากกระดาษมาเปนแผนกระจกเคลอบดวยผงของแขงทมรพรนและมขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 5-40 ไมโครเมตร โครมาโทกราฟชนดน อาศยหลกการของตวเคลอนทซงเปนของเหลวจะพาสารใหเคลอนทไปเนองจากสารทมโครงสรางตางกนจะไดรบแรงผลกดนและแรงหนวงเหนยวตางกน สารทถกดดซบไดดกวาจะเคลอนทไดชากวาสารทถกดดซบไดไมด ทาใหเกดการแยกของสารออกเปนแถบ ๆ เรยกวา “โครมาโทแกรม (Chromatogram)” ดงแสดงตวอยางในรปท 2.8

รปท 2.8 ตวอยางการแยกของสารบน TLC 10.1.1 ตวอยกบท (Stationary Phase) ตวอยกบทจะทาหนาทรบโมเลกลของสารเขามาสมผสกบตวมน เรยกวาเกด “Adsorption” และปลอยใหโมเลกลของสารเคลอนทตอไป เรยกวาเกด “Desorption” ตวทอยกบททนยมใช ไดแก ซลกาเจล ( )2 2SiO XH O⋅ และอลมนา ( )2 3Al O ซงเปนสารมขวสงจงดดซบสารทมขวสงไดด สวนสารทมขวตากวาจะถกดดซบไดนอยกวา

Solvent Front

Point of Application

51

ไฮโดรคารบอนอมตว สภาพขวตา (ถกดดซบนอย) ไฮโดรคารบอนไมอมตว เฮไลด แอลดไฮด คโตน เอสเทอร แอลกอฮอร เอมน ไธออล กรดคารบอกซลก สภาพขวสง (ถกดดซบมาก)

รปท 2.9 ลาดบการดดซบของสารชนดตาง ๆ

10.1.2 ตวเคลอนท (Mobile Phase) ตวเคลอนททใชเปนตวเคลอนทในโครมาโทกราฟหลายชนด เรยงลาดบสภาพขวไดดงน สภาพขวตา เฮกเซน คารบอนเตตระคลอไรด เบนซน อเธอร คลอโรฟอรม เอธลอะซเตต อะซโตน แอลกอฮอร สภาพขวสง นา

รปท 2.10 ลาดบสภาพขวของตวทาละลายชนดตาง ๆ

การเคลอนทของสารอนทรยบนตวอยกบทแปรผนโดยตรงกบสภาพขวของตวเคลอนท ขณะทตวเคลอนทเคลอนทผานไปบนตวอยกบท ตวเคลอนทจะดงเอาสารอนทรยทถกดดซบเคลอนทไปดวย สารอนทรยตวใดทมสภาพขวใกลเคยงกบตวเคลอนทจะเคลอนทไปไดไกลกวา โดยทวไปจะใชตวทาละลายเพยงชนดเดยวเปนตวเคลอนท แตในบางกรณอาจไมเหมาะสม เนองจากตวทาละลายนนมสภาพขวสงหรอตาเกนไป ทาใหไมสามารถแยกสารออกจากกนได จงตองใชตวทาละลายผสม เหมอนในการวจยครงนไดทดลองใชตวเคลอนทผสมหลายชนดตามตารางท 2.3

52

การศกษาแบบ Preparative TLC ดงทใชในการวจยในครงน เปนวธการท ใชแยกองคประกอบของสารทมปรมาณนอย ๆ ปรมาณสารทหยดนนควรอยในชวง 100-500 µg เมอใชแผน TLC ขนาด 20 X 20 ซม.2 การใชเวลาในการ Development ของ TLC โดยทวไปจะใชเวลาประมาณ 20-30 นาทสาหรบระยะทาง 10 ซม. ทงนขนอยกบเฟสเคลอนทและขนาดของอนภาคของตวดดซบ เมอเฟสเคลอนทเคลอนทไปจนถงจดสนสดตวทาละลายแลว (แมน อมรสทธ และ อมร เพชรสม, 2535)

ขนตอนตอไปคอขนตอนการตรวจวดบอกตาแหนงของสารทแยกออก ทาได หลายวธเชน การนากรดซลฟรกเขมขนมาพนเปนฝอยลงบนแผนกระจก ทาใหสารอนทรยมสดา แตวธการนจะทาใหสารทไดนนเสยสภาพไปไมสามารถนาไปทาการวเคราะหอยางอนไดอก ผวจยจงใชวธการนาแผน TLC ทไดนน มาสองดวยแสงยว ซงสารททาการวจยสามารถดดซบแสงยวไดจงทาใหเหนเปนจดสดาบนแผนกระจก TLC สามารถบอกตาแหนงของสารทแยกออกมาไดอยางชดเจน หลงจากนนกเปนขนตอนการวเคราะหหาปรมาณสาร ซงทาไดโดยการขด Silica Gels บรเวณทมสารอยนาไปชะลางสารออกดวยตวทาละลายทเหมาะสม แลวนาสารทไดไปวเคราะหตอไป 10.2 การเตรยมแผน TLC เพอทาบรสทธสารสกด

เตรยมแผน TLC ไดโดยใชผง silica gel 60 GF254 ผสมกบนากลนปรมาตร 20: 40 โดยมวลตอปรมาตรใหเปน slurry เทบนแผนกระจกใสใหมลกษณะเหมอนกนทวทงแผน สารละลาย slurry จะเคลอบบนกระจกใสเปนฟลมบาง ๆ โดยทวไปหนาประมาณ 0.2-0.3 มม. วางใหแหงในอากาศ แลวนาไปอบแหงอกครงทอณหภม 110๐C แลววางทงไวใหเยนใน Desiccator หลงจากนน ใชหลอดคาพลลารจมสารสกดแลวนาสารสกดมาหยดบนแผน TLC หยอนแผน TLC ลงในภาชนะทเตรยมตวเคลอนทบรรจไว ปดฝาใหสนท โดยใชตวเคลอนทดงตารางท 2.2 แลวนาสวนทแยกไดไปทดสอบฤทธตานอนมลอสระและวเคราะหหาชนดของสารตานอนมลอสระชนดนน ๆ ตอไป

53

ตารางท 2.3 แสดงเฟสเคลอนททใชในการทาบรสทธดวยวธ Thin Layer Chromatography ตวเคลอนท อางอง

Acetone: Hexane Acetone: Dichloromethane Chloroform: Methanol Chloroform: Ethyl Acetate Toluene: Ethyl Acetate Hexane: Chloroform: Methanol Hexane: Ethyl Acetate Ethyl acetate-methanol-water

- -

Negi et al., 2001 - - -

Kusznierewicz et al., 2008 Chang et al., 2002

11. แมสสเปกโตรสโกป (Mass Spectroscopy, MS) แมสสเปกโทรเมตรเปนเทคนคทางเคมวเคราะหอกชนดหนงทสามารถนามาใชศกษาหาขอมลเกยวกบโครงสรางและมวลโมเลกลของสาร โดยอาศยการทาใหโมเลกลของสารแตกตวเปนไอออนดวยการใหโมเลกลรบพลงงานทมากพอจนทาใหโมเลกลนนเกดการแตกตวเปนไอออน จากนนทาการแยกและตรวจสอบไอออนทเกดขนนนอกครงหนง ในการวเคราะหดวยเทคนคน สารตวอยางทใชจะตองเสยไป แตวธการวเคราะหนใชสารตวอยางปรมาณนอยมาก จงทาใหเปนทนยมใชกนอยางกวางขวาง 11.1 หลกการและทฤษฎทางแมสสเปกโทรสโกป เมอทาใหโมเลกลของสารเกดการสญเสยอเลกตรอน โมเลกลนนจะกลายเปนไอออนและมประจบวก (Molecular ion, M+) โมเลกลทมประจบวกน ถามพลงงานมากพออาจมการแตกตวออกเปนสวนยอย ๆ ซงสวนยอย ๆ เหลานอาจเปนอนภาคทเปนกลาง (Neutral) หรออาจเปนไอออนยอย (Fragment ion) นนคอ เปนแคตไอออนเรดเคล ( A +• ) หรอเปนแคตไอออน (A+) หรอเปนอนภาคทเปนกลาง (N) เชน 2M e M e− + −+ → + A N+ •+ M + A N+ +

54

ในทานองเดยวกน ถาไอออนยอย ( A +• หรอ A+) ยงมพลงงานมากพอกจะแตกตวตอไป เกดเปนไอออนยอยอนใหมตอไปเรอย ๆ จนในทสดเหลอพลงงานนอยลงจนไมพอจะแตกตวตอไปไดอก เชน

...O a b cN N N NM A B C+ − − − −• + + +→ → → →

เปนตน เมอพจารณาจากแมสสเปกตรม จะบงบอกถงลกษณะการแตกตวของโมเลกลไอออน หรอรวมรปแบบของการแตกตวของแตละไอออนทงหมดเขาดวยกนแลว กจะไดรปแบบการแตกตว (Fragmentation pattern) ของโมเลกล ซงเปนลกษณะเฉพาะของสารประกอบแตละชนด แมสสเปกโตรมเตอร (Mass Spectrometer) เปนเครองมอทใชแยกและวดมวลของไอออนดวยการใชอตราสวนของมวลตอประจ (m/Z) โดยทวไปแลวไอออนมกมประจ +1 (Z= 1) ดงนนคา m/Z จงมคาเทากบมวลของไอออนโดยตรง เมอเกดการไอออไนเซชน ถาทราบปรมาณของไอออนเหลานน จะสามารถหาความสมพนธของมนได โดยใหแกน X แสดงคา m/Z และแกน Y แสดงปรมาณสมพทธ (Relative abundance) กจะไดแมสสเปกตรมดงแสดงในรปท 2.11 รปท 2.11 แสดงลกษณะของแมสสเปกตรมของสารตวอยางจากแหลงกาเนดไอออน

ในทางปฏบตมกจะบนทกแมสสเปกตรมในแบบนอรแมไลซ (Normalized form) เปอรเซนตของปรมาณสมพทธ (Percentage relative abundance, %RA) ในการบนทกแบบนอรแมไลซ เรยกพกทสงทสดวาเบสพก (Base peak) และใหมความสงเปน 100 หนวย ความสงของพกอน ๆ จะสมพทธกบเบสพกโดยมคาอยระหวาง 0 ถง 100 หนวย

Ion ab

unda

nce

C+ B+ A+ M + m/Z

55

11.2 เครองแมสสเปกโทรมเตอรและองคประกอบ (Instrumentation of Mass Spectrometer) ไอออนตาง ๆ ทเกดขนจะถกแยกตามขนาดของมวลตอประจ (คา m/Z) และตรวจหาและบนทกผล เครองมอตาง ๆ ทจาเปนในการทาใหเกดสงเหลานประกอบดวยสวนใหญ ๆ 4 สวนดวยกน คอ 11.2.1 ระบบการใสตวอยาง (Inlet systems for vaporization) ระบบการใสตวอยางทใชในเครองแมสสเปกโทรมเตอรมหลายวธ เชน การใสตวอยางแบบเยน การใสตวอยางแบบรอน การใสตวอยางโดยตรง และการใสตวอยางทตอเขากบเครองแกสโครมาโทรกราฟ เปนตน ระบบการใสตวอยางจะตองเลอกใหเหมาะสมกบชนดของสารตวอยางและทมาของสารตวอยางดวย ระบบการใสสารตวอยางโดยทวไปตองสามารถทาใหสารมความดนไอตา เชน สารทมมวลโมเลกลสง ๆ ดงนน ระบบการใสตวอยางจงตองทาทความดนตา ( 4 710 10− −− ทอร) และอณหภมทอาจสงถง 300๐ซ 11.2.2 แหลงผลตไอออน (Ionization Source) แหลงผลตไอออนเปนแหลงททาใหโมเลกลของสารตวอยางเกดเปนไอออนและเกดการแตกตวซงแหลงนถอไดวาเปนหวใจสาคญของเครองแมสสเปกโทรมเตอร ใชเวลาในการทาใหแตกตวนอยมาก ดงนนแมสสเปกตรมจงหาไดอยางรวดเรว แบงออกไดเปน 2 แบบ คอ 1. Electron Ionization (EI) จะทาใหสารเกดการแตกตวโดยใชลาอเลคตรอนโดย electron จาก filament ทรอนจะผานหองนและถกดงเขาหา repeller ทมความตางศกย 70 โวลต ซงจะใหพลงงานกบอเลคตรอนเปน 70 อเลคตรอนโวลตทาใหสารผสมทซบซอนของไอออนเกดการแตกตวซงสามารถใหขอมลเกยวกบโครงสรางของสารได 2. Chemical Ionization (CI) จะทาใหสารเกดการแตกตวดวยวธทางเคมโดยผสมสารตวอยาง เขากบแกสททาปฏกรยาแลวผานสารผสมเขาไปใน ionization chamber โดยการทาใหเกดการแตกตวดวยการชนกบอเลคตรอนเชนเดยวกนแกสทใชไดแก มเทน

56

รปท 2.12 แสดงการทางานของ Ionization Source 11.2.3 การแยกไอออน (Ions Analysis) การแยกไอออนกระทาไดโดยอาศยความแตกตางของมวลตอประจ จากการใชสนามแมเหลกหรอสนามไฟฟา ดงนน ความสามารถและประสทธภาพของเครองแมสสเปกโทรมเตอรทแตกตางกนจงอยทลกษณะของการทาใหเกดสนามแมเหลกหรอสนามไฟฟาซงเปนสวนสาคญทใชในการแยกไอออนเหลานน ดงแสดงในรป 2.13 และ รป 2.14

รปท 2.13 แสดงการเดนทางของลาไอออนเมอถกกระตนดวยสนามแมเหลก หรอสนามไฟฟา

57

รปท 2.14 แสดงการหกเหไอออนในสนามแมเหลก 11.2.4 ดเทคเตอร (Detectors) เมอสารผาน Ion source ออกมาในรปประจทแตกตางกน หลงจากนน จะผานเขาส Detectors โดยการตรวจวดอาศยการเปลยนแปลงของกระแสอเลกตรอนทเกดขนคอ เมอไอออนบวกผานเขามาในตวตรวจวดจะชนกบผนงโลหะเพอเขารบอเลกตรอนจนเกดความเปนกลางทางไฟฟา ทาใหกระแสของอเลกตรอนไหลแตกตางออกไป ดงแสดงตวอยางในรปท 2.15

รปท 2.15 แสดงการจบอเลกตรอนของประจบวกทผานเขามาในตวตรวจวด

58

รปท 2.16 แสดงผงการทางานโดยรวมของ Mass Spectrometers 12. ศกษาชนดและสตรโครงสรางของสารประกอบฟนอลกโดยวธ Mass Spectroscopy (Yamazaki et al., 2007) นาตวอยางสารทแยกไดดวยวธ TLC มาละลายในเอทานอล แลวฉดเขา Electrospray Ionization (ESI) Source ในเครอง Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) โดยเครองมอมรายละเอยดดงตารางท 2.3 หลงจากนนนาผลแมสโครมาโทแกรมมาวเคราะหหากลมของสารประกอบฟนอลกนน ตาราง 2.4 แสดงรายละเอยดเกยวกบเครองมอ Liquid Chromaography-Mass Spectrometer

Liquid Chromatography Mass Spectrometer Column Mobile Phase Gradient Elution Flow Rate Injection Volume Column Temp.

: Zorbax Eclipse XDB-C18 2.1X150 mm, 5 µm : A= 0.5%Fomic acid in DI water B= Acetonitrile : 0-5 min 95%A, 5%B : 30 min 82%A, 18%B : 90 min 30%A, 70%B : 0.2 ml/min : 5µl : 50๐C

Ionization mode Capillary Sample Cone Extraction Cone RF Lens Desolvation Temp. Source Temp. Desolvation Gas Flow Cone Gas Flow Acquisition Mode

: Electrospray Ionization Negative mode : 3200 V : 42 V : 2 V : 400 V : 150๐C : 120๐C : 341 L/hr : 38 L/hr Scan 100-1000 m/z

Data system

59

13. การสารวจความคลาดเคลอน สวนหนงของการปรบปรงวธว เคราะหให มประสทธภาพ คอการหาวาเกดความคลาดเคลอนตรงไหนของกระบวนการวเคราะห และความคลาดเคลอนมมากนอยแคไหน วธหนงทจะทราบไดคอ ทาการวเคราะหทงกระบวนการใหมหมด ทาการวเคราะหซา ๆ กน ถาผลทไดจากการวเคราะหใกลเคยงกน แสดงวาไมมความคลาดเคลอนทรนแรงเกดขนในการวเคราะห การทาการทดลองซาหลาย ๆ ครง เชนนเปนการแสดงความมนใจ ในทางสถตเรยกวา “ลมตความเชอมน” (Confidence Limit) ในการหาคาลมตความเชอมน ตองทราบคาเบยงเบนมาตรฐาน (Standard Deviation) ซงเปนคาทแสดงถงผลการวเคราะหแตละครงจะใหคาใกลเคยงกนมากนอยแคไหน 13.1 ความแมน (Accuracy) และ ความเทยง (Precission) ความแมน ในทางวทยาศาสตร ตองทราบปรมาณทแทจรงของสาร ถาผลของการวดมคาใกลเคยงกบคาจรงแสดงวามความแมนด แตถาหางไกลแสดงวามความแมนนอย การวดแบบนเปนการตรวจสอบกระบวนการการวเคราะหวามความแมนแคไหน ความเทยง ในดานวทยาศาสตรคาวา “เทยง” ไมจาเปนตอง “แมน” เสมอไป ในการทดลองทกครงตองมความคลาดเคลอนชนดทแกไขไมไดเกดขนเสมอ การทดลองทใหความเทยงสงทาใหสามารถแปลความหมายในเชงปรมาณวเคราะหไดถกตอง 13.2 ความคลาดเคลอนแบบควบคมไมได เกดจากการผนแปรของวธการวเคราะหและมาตรวดตาง ๆ อยเหนอการควบคมของผวเคราะห สาหรบการวเคราะห ผลการวเคราะหททาซาหลาย ๆ ครงจะกระจายระหวางคาทมากและคาทนอย

( )2

1iX X

Nσ

−=

−∑

เมอ σ = คาเบยงเบนมาตรฐาน iX = คาทไดจากการวเคราะหครงท i X = คาเฉลย N = จานวนครงของการวเคราะหกบสารตวอยางอนเดยวกน ในการทาการวจยครงนไดทาการทดลองซา 3 ครงจงไดนาวธการหาคาความคลาดเคลอนแบบคมไมไดหรอการหาคา S.D. มาใช

บทท 3 ผลการทดลองและวจารณ งานวจยชนนศกษาเกยวกบขนตอนการเตรยมสารตวอยางเพอวเคราะหหาปรมาณสารตานอนมลอสระ เชน สารประกอบฟนอลก เบตา-แคโรทน วตามนอ และวตามนซ ในผก ผลไมพนบาน โดยแตละชนดของสารตานอนมลอสระจะมวธสกดดวยตวทาละลายทแตกตางกนออกไป ตวอยางตวทาละลายอนทรยทใชคอ อะซโตน (Acetone) ไดคลอโรมเทน (Dichloromethane) และ เอทลอะซเตต (Ethyl Acetate) เฮกเซน (Hexane) โทลอน (Toluene) เปนตน แลววเคราะหหาปรมาณสารประกอบฟนอลกและศกษาความสามารถการตานอนมลอสระดวยเทคนคอลตราไวโอเลตและวสเบลสเปกโทรสโกป (Ultraviolet and Visible Spectroscopy) ปรมาณเบตา-แคโรทน วตามนอ วตามนซดวยเทคนคโครมาโทกราฟสมรรถนะสง (High Perfomance Liquid Chromatography, HPLC) และศกษาโครงสรางสารประกอบฟนอลกดวยเทคนค Thin Layer Chromatography (TLC) 1. ปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกด

สารประกอบฟนอลกจดเปนสารทตยภม (Secondary metabolites) ซงพบไดใน พชทวไป แตปรมาณและตาแหนงทพบสารกลมนมกแตกตางกนไปตามชนดของพช (Duh and Yen, 1997) ในปจจบนเปนททราบกนดวาสารประกอบฟนอลก อยางเชน ฟลาโวนอยด และ แซนโธน ชนดตาง ๆ ทมตนกาเนดจากพชพรรณธรรมชาตนานบชนดนน สามารถดกจบอนมลอสระไดเพราะมโครงสรางเคมทประกอบดวยหมฟนอลก ซงมสมบตเปนนวคลโอไฟล (nucleophile) ทดจานวนหลายหม (Lopes et al., 1999) ดงนนสารสกดจากพชทพบมสารประกอบเหลานอยมากจงมกออกฤทธตานอนมลอสระไดด (Cai et al., 2004) จากผลการหาปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกดพชพนบานชนดตาง ๆ โดยเทยบกบกราฟมาตรฐานกรดแกลลก (Gallic acid) (รปท 3.1) ซงเปนสารประกอบฟนอลกจากพชทประกอบดวยหม Phenolic พบวา ในแตละมลลกรมของสารสกดจะมปรมาณสารประกอบฟนอลกอย

จากการทหมฟนอลก มคณสมบตดดกลนแสงสงสดในชวงเหนอมวง (Morrison and Boyd, 1975) ดงนน ความสามารถดดกลนแสงเหนอมวงของสารสกดยอมมความสมพนธกบปรมาณของสารประกอบสารประกอบฟนอลกชนดตางๆ ทมอยในสารสกดนนเอง ผลจากการทดลองตามวธการของ Folin–Ciocalteu โดย Folin–Ciocalteu reagent จะบอกถงปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด (และสารทเกดปฏกรยาออกซไดซไดงาย) จะไดสารละลายสนาเงน (Swain and Hillis, 1959)เปนผลมาจากการเกดปฏกรยารดกชนของ heteropolyphospho-molybdate-tungstate anions ซงมสเหลองน ปรากฏวา ผลลกหวาจะใหปรมาณสารประกอบ

60

61

y = 0.0098x + 0.0287R2 = 0.9992

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 50 100 150 200 250

Gallic acid (µg/ml)

Abs

orba

nce

at 7

60 n

m

ฟนอลกมากทสด ดอกดาหลามปรมาณเปนครงหนงของผลหวา รองลงมาคอ ใบทามงซงมคาใกลเคยงกบดอกดาหลา ในเปลอกของผลมะอกจะใหคาสงกวาในเนอ(เมลด) ประมาณ 3 เทา และในดอกเขมใหปรมาณฟนอลกตาลง สวนใบผกเหมยงใหปรมาณฟนอลกตาทสด ดงแสดงในตารางท 3.2 ปรมาณสารทไดนนมาจากการเทยบเทาปรมาณสารประกอบฟนอลกชนดกรดแกล-ลก โดยใชวธนากรดแกลลกความเขมขนตาง ๆ มาเขยนเปนกราฟมาตรฐาน ดงตารางท 3.1 และ รปท 3.1 ตารางท 3.1 คาการดดกลนแสงของสารมาตรฐาน Gallic acid

[Gallic acid] (µg/ml) Absorbance at 760 nm Blank

20 40 80 100 200

0 0.223 0.436 0.839 1.011 1.972

รปท 3.1 กราฟมาตรฐานทใชหาปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกด

นาสารละลายกรดแกลลกความเขมขน 1 mg/ml มาเจอจางดวยสาร ละลาย 80% Ethanol ใหได 5 ความเขมขนคอ 20 40 80 100 และ 200 µg/ml แลวนาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 760 นาโนเมตร โดยใช สารละลาย 80% Ethanol เปน Blank

62

ตารางท 3.2 ปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกดแตละชนด สารสกด คาการดดกลนแสงทความยาว

คลน 760 นาโนเมตร ปรมาณสารประกอบฟนอลก

(mg GAE/100 g fresh weight)* หวา 1.264 (เจอจาง 40 เทา) 914.92 + 12.48

ดาหลา 1.045 (เจอจาง 40 เทา) 462.51 + 5.80 มะอก(เปลอก) 0.773 (เจอจาง 20 เทา) 303.72 + 2.62 มะอก (เนอ) 0.687 (เจอจาง 10 เทา) 126.40 + 6.63

เขม 1.314 226.46 + 1.77 ทามง 1.296 418.16 + 5.49 เหมยง 0.243 65.08 + 5.20

*หมายเหต ผลทแสดงเปนคาจากการทดลอง 3 ครง GAE = Gallic acid equivalent. 2. การศกษาหาปรมาณสารประกอบเบตา-แคโรทน แหลงของเบตา-แคโรทน จะพบไดในผก และผลไมทมสสม เหลอง หรอ แดง สารประกอบเบตา-แคโรทน เปนสารตานอนมลอสระทสาคญอกตวหนงพบไดในสวนทเปนไขมนในระบบทางชวภาพ เบตา-แคโรทน เปนสารแคโรทนอยดตวหนงทมคณสมบตเปนสารตงตนของวตามนเอ (Kurilich et al., 1999) เบตา-แคโรทนซงมโครงสรางเปนวตามนเอสองตวหนหางตอกน แมรางกายมนษยจะสามารถสรางวตามนเอจากเบตา-แคโรทนไมไดหมายความวา เบตา-แคโรทน ทกตวจะเปลยนเปนวตามนเอได เมอเปรยบเทยบกบแคโรทนอยดตวอน ๆ แลว เบตา-แคโรทน เปนสารทเปลยนเปนวตามนเอไดดทสดเบตา-แคโรทนพบทสวนของเซลล เมมเบรนในระบบชววทยาทาหนาทปองกนเยอหมเซลลจากสารวองไวตอปฏกรยาซงทาใหเซลลมการเจรญเตบโตทผดปกตเปนตนเหตของการเกดโรคมะเรงบางชนด เชน มะเรงในชองปาก กลองเสยง ตบ หรอกระเพาะอาหาร (Lin C. H. and Chen B. H., 2003) โรคเสนเลอดหวใจอดตนและโรคตอกระจกในผสงอาย เปนตน การศกษาหาปรมาณเบตา–แคโรทนในครงนวเคราะหดวยวธทาง HPLC โดยนามาเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานระหวางความเขมขนของสารมาตรฐานเบตา-แคโรทนกบพนทใตพค ดงแสดงในรป 3.3 จากการวเคราะหดวยวธ HPLC นนพคทแสดงเบตา-แคโรทนจะมคารเทนชนไทม (Retention time, TR) ประมาณ 13.00-15.00 นาททราบไดจากเมอฉดสารทมความเขมขนเพมขนเรอย ๆ จะไดพคทมพนทเพมขนเชนกนโดยทพคอน ๆ มการเปลยนแปลงเพยงเลกนอย แสดงตวอยางในรปท 3.2 ซงเปนโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานทความเขมขน 12 µg/ml

63

รปท 3.2 โครมาโทรแกรมของสารมาตรฐานเบตา-แคโรทน

นาสารละลายมาตรฐานเบตา-แคโรทนในคลอโรฟอรม ฉดเขา ในเครอง HPLC (C18 column) ชะคอลมนดวย Acetonitrile: Methanol: Tetrahydrofuran อตราสวน 52: 40: 8 โดย ปรมาตร อตราการไหล 0.1 ml/min ตงเวลา 16 นาท ตารางท 3.3 พนทใตพคของสารมาตรฐานเบตา-แคโรทน

Betacarotene (µg/ml) Peak area Baseline

3.0 6.0 12.0 15.0 30.0 60.0

0 431239 1039981 1920546 3005893 5301976 11808755

13.84

7

64

y = 196562x - 179768R2 = 0.9964

-2000000

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

0 10 20 30 40 50 60

Beta-carotene (µg/ml)

Peak

are

a

รปท 3.3 กราฟมาตรฐานระหวางปรมาณสารละลายเบตา-แคโรทน และพนทใตพค

นาสารละลายมาตรฐานเบตา-แคโรทนในคลอโรฟอรมความเขมขน 0.15 mg/ml เจอจางดวยคลอโรฟอรมใหไดปรมาณสาร 3.0, 6.0, 12.0, 15.0

30.0 และ 60.0 µg/ml ฉดเขา HPLC ไดพนทใตพคของแตละความเขมขนแลว นามาเขยนกราฟ

ตารางท 3.4 ปรมาณ Betacarotene ในสารสกด

สารสกด (Extracts)

พนทใตพค (Peak area)

ปรมาณสารเบตา-แคโรทน (µ g /100 g fresh weight)*

หวา 120898 4.722 ดาหลา 167071 2.096 มะอก (เปลอก) 24071388 732.430 มะอก (เนอ) 3817850 185.567 เขม 5454648 167.382 ทามง ND** ND** เหมยง ND** ND** หมายเหต *ผลทแสดงเปนคาเฉลยทไดจากการทาการทดลอง 2 ครง ** ND หมายถง Non-detectable

65

จากผลการทดลองในตาราง 3.4 บงชวา ตวอยางพชทใหปรมาณสารเบตา– แคโรทนมากทสดคอ เปลอกมะอก (732.43 ไมโครกรม / 100 กรมนาหนกเปยก) รองลงมาคอ เนอมะอก (185.57 ไมโครกรม / 100 กรมนาหนกเปยก) และดอกเขม (167.38 ไมโครกรม / 100 กรมนาหนกเปยก) อาจมผลเนองมาจากสเหลองของผลมะอกและสสมจากดอกเขมนนเอง ซงเปนสของเบตา-แคโรทนโดยตรง สวนในดอกดาหลา หวา และ พชพนบานชนดอน ๆ ทใชในการศกษานนใหปรมาณสารเบตา–แคโรทนนอย แมจะเปนพชทมสเขมเชนกนแตอาจจะเปนเมดสชนดอน ๆ ทไมใชเบตา-แคโรทน (Seeram et al., 2005) สวนรปท 3.4 - 3.8 เปนตวอยาง โครมาโทแกรมของสารสกด (โครมาโทแกรมของใบทามงและใบเหมยงมคาตามากไมสามารถวดคาได) ซงวเคราะหดวยวธ HPLC

รปท 3.4 โครมาโทแกรมของสารสกดจากเปลอกมะอก

13.83

6

66

รปท 3.5 โครมาโทแกรมของสารสกดจากเนอมะอก

รปท 3.6 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลา

14.49

4 13

.612

67

รปท 3.7 โครมาโทแกรมของสารสกดจากผลหวา

รปท 3.8 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกเขม

13.65

5 14

.016

68

3. การศกษาหาปรมาณวตามนอ วตามนอ เปนวตามนทมความจาเปนตอรางกาย ทาหนาทเปนสารตานอนมลอสระ ทมประสทธภาพชวยปกปองเซลลในรางกายให ทางานไดอยางปกต ชวยบารงและปองกนโรคหวใจ มคณสมบตบารงกลามเนอหวใจ ชวยปองกนหลอดเลอดตบ ชวยซอมแซมกลามเนอหวใจทเสอมโทรม ในขณะเดยวกนวตามนอ ยงชวยลดปรมาณออกซเจนทเนอเยอตองการ นอกจากนยงลดการเกดลมเลอดจงชวยปองกนการอดตนของเสนเลอดหวใจดวย α – Tocopherol เปนรปทวองไวในการทาปฏกรยาของวตามนอ ทาหนาทปองกนเยอหมเซลลจากสารวองไวตอปฏกรยา (Free Radical) (Weber et al., 1997) การศกษาหาปรมาณวตามนอในครงนใชวธวเคราะหเดยวกบการหาปรมาณสารเบตา-แคโรทน โดยนามาเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานระหวางความเขมขนของสารมาตรฐานวตามนอกบพนทใตพค ดงแสดงในรป 3.10 จากการวเคราะหนนพคทแสดงวตามนอจะมคารเทนชนไทม (Retention time, TR) ประมาณ 5.00-7.00 นาท ดงแสดงตวอยางในรปท 3.9 ซงเปนโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานวตามนอทความเขมขน 100 µg/ml

รปท 3.9 โครมาโทรแกรมของสารมาตรฐานวตามนอ นาสารละลายวตามนอในเอทานอลมาฉดเขา HPLC (C18 column) ชะคอลมนดวย Acetonitrile: Methanol: Tetrahydrofuran อตราสวน 52: 40: 8 โดยปรมาตร อตราการไหล 0.1 ml/min ตง เวลาท 10 นาท

69

y = 8176.8x + 11474R2 = 0.9993

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Vitamin E (µg/ml)

Peak

are

a

ตารางท 3.5 พนทใตพคของสารมาตรฐานวตามนอ

vitamin E (µg/ml) Peak area Baseline 0

20 153879 40 322576 80 719861 100 852057 200 1617524 400 3282921

รปท 3.10 กราฟมาตรฐานระหวางปรมาณสารละลาย Vitamin E และพนทใตพค

นาสารละลายวตามนอในเอทานอลความเขมขน 1 mg/ml มา เจอจางใหไดปรมาณสาร 20 40 80 100 200 และ 400 µg/ml มาฉดเขา HPLC แลวนาคาพนทใตพคมาเขยนกราฟ

70

จากการทดลอง พบวาปรมาณของวตามนอ อยในชวง 62.03 – 28575.71 ไมโครกรม / 100 กรมของนาหนกเปยก ซงตวอยางทใหปรมาณวตามนอมากทสดพบในใบ เหมยง คอ 28575.71 ไมโครกรม / 100 กรมของนาหนกเปยก รองลงมาคอ ใบทามง เปลอกมะอก หวา ดอกเขม ดาหลา และ เนอมะอก คอ 5479.86 618.56 276.52 217.40 62.03 และ 60.65 ไมโครกรม/100 กรมนาหนกเปยก ตามลาดบ ดงแสดงในตารางท 3.6 สวนรป 3.11-3.16 แสดงตวอยางโครมาโทแกรมของปรมาณวตามนอ ตารางท 3.6 ปรมาณ Vitamin E ในสารสกด

สารสกด พนทใตพค ปรมาณ Vitamin E (µ g/100 g fresh weight)**

หวา 583857 276.522 ดาหลา 526151 62.031 มะอก (เปลอก) 1240288 618.555 มะอก (เนอ) 127939 60.648 เขม 555095 217.401 ทามง 9373714 5479.856 เหมยง 86808589 28575.706 **หมายเหต ผลทแสดงเปนคาเฉลยทไดจากการทาการทดลอง 2 ครง

รปท 3.11 โครมาโทแกรมของสารสกดจากเปลอกมะอก

71

รปท 3.12 โครมาโทแกรมของสารสกดจากเนอมะอก

รปท 3.13 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลา

72

รปท 3.14 โครมาโทแกรมของสารสกดจากผลหวา

รปท 3.15 โครมาโทแกรมของสารสกดจากใบทามง

5.695

73

รปท 3.16 โครมาโทแกรมของสารสกดจากใบเหมยง

รปท 3.17 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกเขม

5.678

5.4

58

74

4. การศกษาหาปรมาณวตามนซ วตามนซในอาหารม 2 รปแบบซงรางกายสามารถนาไปใชไดทง 2 ชนดคอ

Ascorbic acid และ Dihydroascorbic acid ซงมผลกสขาวมรสเปรยว เปนวตามนชนดทละลายนาได (water soluble) เมอละลายนามฤทธเปนกรดและเปนวตามนทสลายตวเรวทสดในจาพวกวตามนดวยกนโดยเฉพาะอยางยงไวตอออกซเจนมาก (ปฏกรยาออกซเดชน) เมอตงทงไวในบรรยากาศทมทองแดงและในสงแวดลอมทมสภาพเปนดางและ ascorbic oxidase enzyme ทมอยในผลไม คณสมบตอยางหนงของวตามนซททราบกนดกคอชวยปองกนและรกษาโรคลกปดลกเปด (scurvy) ได

จากการศกษาทางระบาดวทยามขอมลสนบสนนวาวตามนซ อาจจะเปนปจจย ประกอบปจจยหนงทชวยลดอตราการเสยงตอการเกดโรคมะเรง และโรคหวใจ (Byers and Perry, 1992) โดยทวตามนซจะทาปฏกรยากบอนมลอสระ Superoxide และ Hydroxyl ( .HO ) ปองกนไม ให เกดปฏก ร ยาลก โซ ซ งมาจากการสลายต วของกรดไขมนท ไม อมต ว (Polyunsaturated fatty acid) วตามนซอาจจะทาปฏกรยาโดยทางออมในการปองกนการสลายตวของไขมนในเยอบเซลลโดยชวยในการสงเคราะหวตามนอทตดกบผนงเซลลขนมาใหมเปนการปองกนโรคมะเรงอาจเนองจากวตามนซชวยในการทาลายพษของสารกอมะเรงโดยการสกดขบวนการเกดเซลลมะเรงเนองมาจากคณสมบตทเปน Antioxidant โดยการจบกบอนมลอสระทเกดขนและกระตนใหมภมตานทาน

รปท 3.19 แสดงกราฟมาตรฐานระหวางปรมาณวตามนซและคาพนทใตพคของโครมาโทแกรมวตามนซทความเขมขนตาง ๆ เพอใชหาปรมาณวตามนซในสารสกด โดยโครมาโทรแกรมทแสดงปรมาณวตามนซนนจะออกมาทเวลาประมาณ 8.00-9.00 นาท ดงแสดงในรปท 3.18

75

รปท 3.18 โครมาโทรแกรมของสารมาตรฐานวตามนซ

นาสารละลายวตามนซในนา เตม 1% กรดฟอสฟอรก และ 5% DDT มาฉดเขา HPLC (C18 Column) ชะคอลมนดวย Acetonitrile: 0.05 M KH2PO4 (pH 5.95) อตราสวน 75: 25 โดย ปรมาตร อตราการไหล 0.1 ml/min ตงเวลาท 12 นาท ตารางท 3.7 พนทใตพคของสารมาตรฐานวตามนซ

[Vitamin C] (mg/ml) Peak area Baseline 0

0.08 10564 0.16 26147 0.20 27520 0.32 47967 0.80 124318 0.90 143956

8.596

76

y = 159482x - 1693.4R2 = 0.9987

-20000

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Vitamin C (mg/ml)

Peak

are

a

รปท 3.19 กราฟมาตรฐานระหวางปรมาณสารละลาย Vitamin C และพนทใตพค

นาสารละลายวตามนซในนา เตม 1% กรดฟอสฟอรก และ 5% DDT ความเขมขน 0.002 g/ml มาเจอจางใหไดความเขมขน 0.08 0.16 0.20 0.32 0.80 และ 0.90 mg/ml มาฉดเขา HPLC แลวนาคา พนทใตพคมาเขยนกราฟ ตารางท 3.8 ปรมาณ Vitamin C ในสารสกด

สารสกด พนทใตพค ปรมาณ Vitamin C (mg/100 g wet weight) *

หวา ดาหลา มะอก (เปลอก) มะอก (เนอ) เขม ทามง เหมยง

294487 14224 42195 58997 12446 ND** 11853

1856.397 89.683 205.368 300.828 66.348 ND**

84.501 หมายเหต *ผลทแสดงเปนคาเฉลยทไดจากการทาการทดลอง 2 ครง ** ND หมายถง Non-detectable

77

ตารางท 3.8 แสดงปรมาณวตามนซในสารสกดทง 7 ชนดจากการทดลอง พบวา ปรมาณวตามนซทมากทสดจะพบในพชพนบานทมรสชาตเปรยวและฝาดตามลาดบ คอ พบมากในผลหวา (1856.40 mg/100 g wet weight) สวนในผลมะอกนนพบในสวนทเปนเนอมากกวาในเปลอก (300.83 และ 205.37 mg/100 g wet weight) รองลงมาพบในกลบดอกดาหลา (89.68 mg/100 g wet weight) ใบเหมยง (84.50 mg/100 g wet weight) และดอกเขม (66.35 mg/100 g wet weight) สวนในใบทามงนนแทบจะไมพบวตามนซเลย ดงทแสดงในรป 3.20-3.21

รปท 3.20 โครมาโทแกรมของสารสกดจากเปลอกมะอก

รปท 3.21 โครมาโทแกรมของสารสกดจากเนอมะอก

8.550

8.3

68

78

รปท 3.22 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลา

รปท 3.23 โครมาโทแกรมของสารสกดจากผลหวา

8.616

8.364

79

รปท 3.24 โครมาโทแกรมของสารสกดจากใบเหมยง

รปท 3.25 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกเขม

8.199

8.6

16

80

Vitam

in C(

mg/10

0 g

fresh

weig

th)

205.3

68

300.8

28

56 –

129

89.68

3 NR

18

56.39

7 NR

66

.348

NR

ND

NR

84.50

1

β – c

aroten

e(µg/1

00 g

wet w

eight)

732.4

30

185.5

67

32.6

– 38.9

d 2.0

96

NR

4.722

0 .

17d

167.3

82

238.8

a ND

NR

ND

α-To

coph

erol(µ

g/100

g we

t weig

ht)

618.5

55

60.64

8 0.1

1 – 0.

34d

62.03

1 NR

27

6.522

0.1

1 – 0.

15d

217.4

01

NR

5479

.856

NR

2857

5.706

Phen

olic (

mg G

AE/10

0g

fresh

weig

ht)

303.7

2 + 2.

62

126.4

0 + 6.

63

15.29

46

2.51 +

5.80

20

0 91

4.92 +

12.48

9.0

– 25

0.0

226.4

6 + 1.

77

387.6

+ 23

c 41

8.16 +

5.49

15

.67 +

3.9b

65.08

+ 5.2

0

ตระก

ล

Solan

acea

e So

lanac

eae

Solan

acea

e Zin

gibera

les

Zingib

erales

My

rtace

ae

Myrta

ceae

Ru

biaec

ae

Rubia

ecae

La

urace

ae

Laura

ceae

Gn

etace

ae

ตวอย

างพช

เปลอ

กมะอก

เนอม

ะอก

มะเขอ

ดาหล

า ขง

หว

า พช

เขม

กาแฟ

ทา

มง

อบเชย

เหมย

ง a =

µg/

g dry

weigh

t from

Sim

kin et

al., 2

008

b = eq

uivate

nt ca

techin

/100

µg w

et we

ight fr

om Ja

yapra

kash

a et a

l., 20

07

c = fro

m Sa

cche

tti et

al., 2

009.

d = fro

m Kim

et al

., 200

7 ND

= No

n dete

ctable

NR

= No

n rep

ort

ตารางท

3.9 ส

รปปร

มาณส

ารตา

นอนม

ลอสร

ะชนด

ตาง ๆ

ในสา

รสกด

ตวอย

างทง

หมด

7 ชน

ดเปร

ยบเทยบ

กบพช

ในตร

ะกลเดย

วกน

81

ตารางท 3.9 แสดงปรมาณสารตานอนมลอสระทง 4 ชนดทพบในสารสกดจากพชตวอยาง โดยนาคาทไดมาเปรยบเทยบกบพชทอยในกลมเดยวกนจากการศกษากอนหนาน พบวา ปรมาณสารตานอนมลอสระของสารสกดพชตวอยางในการวจยครงนสวนใหญใหปรมาณสารมากกวา 5. ความสามารถของสารตานอนมลอสระ การทดลองหาคาความสามารถของสารตานอนมลอสระในครงน ไดใชสารสกดปรมาณสารประกอบฟนอลกในการทดสอบ เนองจากสารสกดเบตา-แคโรทน และสารสกดวตามนอเปนสารทไมมขว ไมสามารถละลายเขากบสารละลาย DPPH • ซงเปนสารทมขวสงได สวนสารสกดปรมาณวตามนซนนเปนสารทสลายตวไดงาย ทาใหสารสกดปรมาณสารประกอบ ฟนอลกมความเหมาะสมทสด จากผลการทดลองของสารสกดทง 7 ชนด ปรากฏวาสารสกดสวนใหญสามารถดกจบอนมล DPPH • ไดดมคา 50IC ไมเกน 50 µg/ml ในขณะทสารสกดจากเนอผลมะอก ใหคา 50IC สงถง 76.05 µg/ml ตามลาดบ (ทเวลาผานไป 30 นาท) ทาใหทราบวา สารสกดชนดนมความสามารถในการดกจบอนมลอสระ DPPH • ไดไมดนก สาหรบสารสกดทแสดงฤทธตานอนมลอสระ DPPH • ไดดทสดไดแกสารสกดจากดอกดาหลา โดยมคา 50IC ตาทสดคอ 3.02 µg/ml ซงจดเปนฤทธทดเมอเทยบกบสารออกฤทธมาตรฐานคอ BHT ซงใหคา

50IC เทากบ 2.76 µg/ml และเมอเปรยบเทยบผลการทดลองดงกลาวกบผลการหาปรมาณสารประกอบฟนอลกในตารางท 3.2 จะเหนวา ลาดบความสามารถดกจบอนมลอสระ DPPH •

กบลาดบของปรมาณสารประกอบฟนอลก ในสารสกดมความใกลเคยงกนเปนสวนใหญ ซงแสดงวา ระดบของการออกฤทธตานอนมลอสระนาจะขนกบปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกดนน ๆ เปนสาคญ ยกเวนสารสกดทไดจากผลหวา ซงมปรมาณสงกวาในสารสกดจากดอกดาหลา อยางไรกตาม ความสามารถใหอเลคตรอนของสารประกอบฟนอลก มไดอยภายใตอทธพลของจานวนหมฟนอลกอยางเดยวเทานน แตอาจขนกบตาแหนงหมไฮดรอกซล (Hydroxyl group, OH) ซงเปนสวนประกอบโครงสรางดงกลาวดวย เนองจากมหลกฐานวา หม ortho-dihydroxyl บนวงแหวนบ (B-ring) ของฟลาโวนอยด สามารถใหอเลคตรอนไดดกวาหม hydroxyl ทตาแหนงอน ๆ บนโมเลกลเดยวกน (Morel et al., 1998)

82

5.1 การศกษาความสามารถในการตานอนมลอสระ DPPH •ของสารสกดจากเปลอกมะอก ตารางท 3.10 คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากเปลอกมะอก ทความเขมขนและเวลาตาง ๆ

5 min 10 min 20 min 30 min 40 min [Extract] (µg/ml) Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm %IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB

20 50 100 300 500

0.830 0.796 0.764 0.856 0.797

23.49 41.70 62.60 74.62 80.93

0.618 0.446 0.334 0.165 0.092

25.54 43.97 63.28 76.72 88.38

0.603 0.392 0.265 0.193 0.183

27.35 50.75 65.31 77.45 87.89

0.593 0.364 0.234 0.183 0.186

28.55 54.27 69.37 77.62 87.51

0.586 0.344 0.239 0.192 0.169

29.40 56.78 68.71 78.57 87.66

ตารางท 3.11 คา 50IC ของสารสกดจากเปลอกมะอก

เวลา สมการ 50IC (µg GAE /ml) 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

y = 17.929Ln(x) - 27.35 y = 19.135Ln(x) - 30.093 y = 17.894Ln(x) - 22.107 y = 17.091Ln(x) - 16.628 y = 16.779Ln(x) - 14.407

74.76 65.74 56.24 49.32 46.46

83

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300 400 500 600

Extract (µg/ml)

% In

hibi

tion

5 min10 min20 min30 min40 min

รปท 3.26 กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากเปลอกมะอก ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ

84

5.2 การศกษาความสามารถในการตานอนมลอสระ DPPH •ของสารสกดเนอมะอก ตารางท 3.12 คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากเนอมะอก ทความเขมขนและเวลาตาง ๆ

5 min 10 min 20 min 30 min 40 min [Extract] (µg/ml) Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB

20 50 100 300 500

0.847 0.761 0.857 0.834 0.804

14.40 29.04 40.27 77.82 88.18

0.697 0.507 0.466 0.101 0.087

17.71 33.38 45.62 87.89 89.18

0.671 0.471 0.401 0.258 0.193

20.78 38.11 53.21 69.06 75.99

0.655 0.450 0.364 0.191 0.100

22.67 40.87 57.53 77.10 87.56

0.645 0.435 0.337 0.109 0.106

23.85 42.84 60.68 86.93 86.82

ตารางท 3.13 คา 50IC ของสารสกดจากเนอมะอก

เวลา สมการ 50IC (µg GAE /ml) 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

y = 23.973Ln(x) - 62.403 y = 24.322Ln(x) - 59.224 y = 17.185Ln(x) - 29.101 y = 20.137Ln(x) - 37.222 y = 20.883Ln(x) - 37.638

108.71 89.19 99.77 76.05 66.46

85

รปท 3.27 กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากเนอมะอก ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300 400 500 600Extract (µg/ml)

% In

hibi

tion

5 min10 min20 min30 min40 min

86

5.3 การศกษาความสามารถในการตานอนมลอสระ DPPH •ของสารสกดดอกดาหลา ตารางท 3.14 คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากดอกดาหลา ทความเขมขนและเวลาตาง ๆ

5 min 10 min 20 min 30 min 40 min [Extract] (µg/ml) Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB

20 50 100 300 500

0.607 0.802 0.727 0.868 0.838

36.41 51.37 69.19 92.97 92.12

0.336 0.275 0.097 0.053 0.068

44.65 65.71 86.66 93.89 88.71

0.286 0.153 0.048 0.048 0.070

52.88 80.92 93.40 94.47 91.65

0.251 0.099 0.043 0.047 0.070

58.65 87.66 94.08 94.58 91.65

0.225 0.072 0.041 0.047 0.070

62.93 90.10 94.89 94.58 91.65

ตารางท 3.15 คา 50IC ของสารสกดจากดอกดาหลา

เวลา สมการ 50IC (µg GAE /ml) 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

y = 18.793Ln(x) - 19.658 y = 15.264Ln(x) + 3.9941 y = 11.525Ln(x) + 26.655 y = 9.5876Ln(x) + 39.394 y = 7.6767Ln(x) + 50.855

40.71 20.37 7.58 3.02 0.89

87

รปท 3.28 กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากดอกดาหลา ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300 400 500 600

Extract (µg/ml)

% In

hibi

tion

5 min 10 min20 min30 min40 min

88

5.4 การศกษาความสามารถในการตานอนมลอสระ DPPH •ของสารสกดจากหวา ตารางท 3.16 คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากผลหวา ทความเขมขนและเวลาตาง ๆ

5 min 10 min 20 min 30 min 40 min [Extract] (µg/ml) Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB

20 50 100 300 500

0.834 0.793 0.854 0.839 0.857

19.90 48.05 53.04 65.79 70.60

0.636 0.328 0.320 0.231 0.246

23.74 58.64 62.53 72.46 71.30

0.603 0.251 0.246 0.245 0.242

27.70 68.35 71.19 70.80 71.76

0.583 0.209 0.205 0.224 0.239

30.10 73.64 75.99 73.30 72.11

0.566 0.180 0.166 0.143 0.138

32.13 77.30 80.56 82.96 83.55

ตารางท 3.17 คา 50IC ของสารสกดจากผลหวา

เวลา สมการ 50IC (µg GAE /ml) 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

y = 14.369Ln(x) - 17.259 y = 13.486Ln(x) - 9.066 y = 12.578Ln(x) - 0.5837 y = 11.654Ln(x) + 7.2166 y = 14.733Ln(x) - 0.141

107.86 79.82 55.79 39.30 30.06

89

รปท 3.29 กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากผลหวา ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 100 200 300 400 500 600Extract (µg/ml)

% In

hibi

tion

5 min10 min20 min30 min40 min

90

5.5 การศกษาความสามารถในการตานอนมลอสระ DPPH •ของสารสกดจากทามง ตารางท 3.18 คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากใบทามง ทความเขมขนและเวลาตาง ๆ

5 min 10 min 20 min 30 min 40 min [Extract] (µg/ml) Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB

20 50 80 100

0.688 0.541 0.408 0.346

0.89 21.48 49.82 80.80

0.665 0.461 0.282 0.101

3.48 33.09 59.06 85.34

0.648 0.342 0.185 0.067

5.95 50.36 73.18 90.28

0.542 0.223 0.117 0.063

21.34 67.63 83.02 90.86

0.509 0.122 0.065 0.063

26.13 82.29 90.57 90.86

ตารางท 3.19 คา 50IC ของสารสกดจากใบทามง

เวลา สมการ 50IC (µg GAE /ml) 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

y = 45.333Ln(x) - 141.89 y = 47.554Ln(x) - 143.73 y = 51.096Ln(x) - 148.1 y = 43.405Ln(x) - 106.77 y = 41.762Ln(x) - 93.489

68.92 58.81 48.28 37.03 31.06

91

รปท 3.30 กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากใบทามง ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ

-20

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

Extract (µg/ml)

% In

hibi

tion 5 min

10 min20 min30 min40 min

92

5.6 การศกษาความสามารถในการตานอนมลอสระ DPPH •ของสารสกดเหมยง ตารางท 3.20 คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากใบเหมยง ทความเขมขนและเวลาตาง ๆ

5 min 10 min 20 min 30 min 40 min [Extract] (µg/ml) Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB

20 50 80 100

0.718 0.689 0.549 0.416

0.28 4.30

23.75 42.22

0.696 0.607 0.489 0.307

3.33 15.69 32.08 57.36

0.560 0.497 0.320 0.209

22.22 30.97 55.55 70.97

0.425 0.375 0.258 0.183

40.97 47.92 64.17 74.58

0.316 0.217 0.205 0.176

56.11 69.86 71.53 75.56

ตารางท 3.21 คา 50IC ของสารสกดจากใบเหมยง

เวลา สมการ 50IC (µg GAE /ml) 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

y = 23.475Ln(x) - 75.648 y = 29.555Ln(x) - 90.327 y = 28.741Ln(x) - 69.282 y = 19.837Ln(x) - 21.918 y = 11.62Ln(x) + 22.091

211.12 115.35 63.45 37.54 11.04

93

รปท 3.31 กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากใบผกเหมยง ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

Extract (µg/ml)

% In

hibi

tion

5 min10 min20 min30 min40 min

94

5.7 การศกษาความสามารถในการตานอนมลอสระ DPPH •ของสารสกดดอกเขม ตารางท 3.22 คาการดดกลนแสงและ % Inhibition ของสารสกดจากดอกเขม ทความเขมขนและเวลาตาง ๆ

5 min 10 min 20 min 30 min 40 min [Extract] (µg/ml) Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB Abs.515nm % IHB

20 50 80

100

0.598 0.464 0.368 0.281

11.16 31.04 45.27 58.25

0.512 0.656 0.301 0.205

24.00 42.56 55.30 69.59

0.403 0.298 0.214 0.122

40.13 55.71 68.22 81.86

0.294 0.216 0.162 0.093

56.25 67.89 75.93 86.15

0.201 0.559 0.088 0.068

70.13 83.06 86.92 89.90

ตารางท 3.23 คา 50IC ของสารสกดจากดอกเขม

เวลา สมการ 50IC (µg GAE /ml) 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

y = 27.813Ln(x) - 74.09 y = 26.493Ln(x) - 57.415 y = 24.157Ln(x) - 34.515 y = 17.17Ln(x) + 3.3256 y = 12.152Ln(x) + 34.213

86.62 57.65 33.07 15.16 3.67

95

รปท 3.32 กราฟแสดง % การยบยงของสารสกดจากดอกเขม ณ ความเขมขนและเวลาตาง ๆ

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120

Extract (µg/ml)

% In

hibi

tion

5 min10 min20 min30 min40 min

96

65.74

89.19

20.37

79.82

58.81

115.35

57.65

11.52

0

20

40

60

80

100

120

65.74

89.19

20.37

79.82

58.81

115.35

57.65

11.52

0

20

40

60

80

100

120

74.76

108.71

40.71

107.86

68.92

211.12

86.62

25.81

0

50

100

150

200

250

จากขอมลในตาราง 3.10 ถง ตาราง 3.23 เมอนาคา 50IC ของสารสกดแตละ

ตวมาเปรยบเทยบดวยสารควบคมในกราฟแทง (รปท 3.33 – รป 3.37) จะทาใหเหนคาการเปรยบเทยบทชดเจนขน

รปท 3.33 การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆเมอเวลาผานไป 5 นาท

รปท 3.34 การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 10 นาท

มะอก

(เปลอ

ก)

มะอก

(เนอ)

ดาหล

า

ทามง

หวา

เหมย

ง

เขม

BHT

มะอก

(เปลอ

ก)

หวา

ทามง

เหมย

ง

เขม

BHT

มะอก

(เนอ)

ดาหล

า

IC 50 (µ

g GAE

/ml)

IC 50 (µ

g GAE

/ml)

97

56.24

99.77

7.58

55.7948.28

63.45

33.07

4.91

0102030405060708090

100

49.32

76.05

3.02

39.3

37.03

37.54

15.16

2.76

0

10

20

30

40

50

60

70

80

รปท 3.35 การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 20 นาท

รปท 3.36 การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 30 นาท

เหมย

ง

มะอก

(เปลอ

ก)

ทามง

มะอก

(เนอ)

ดาหล

า

หวา

เหมย

ง

มะอก

(เปลอ

ก)

ทามง

มะอก

(เนอ)

ดาหล

า หวา

เขม

BHT

BHT

เขม

มะอก

(เปลอ

ก)

มะอก

(เนอ)

IC 50 (µ

g GAE

/ml)

IC 50 (µ

g GAE

/ml)

98

46.46

66.46

0.89

30.06 31.06

11.04

3.670.36

0

10

20

30

40

50

60

70

รปท 3.37 การเปรยบเทยบคา IC50 ของสารสกดชนดตาง ๆ เมอเวลาผานไป 40 นาท ตารางท 3.24 50IC ของสารสกดชนดตาง ๆ ทเวลาผานไป 5 10 20 30 และ 40 นาท

50IC (µg GAE /ml) สารสกด (Extract) 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

เปลอกมะอก เนอมะอก ดาหลา หวา ทามง เหมยง เขม BHT

74.76 108.71 40.71 107.86 68.92 211.12 86.62 25.81

65.74 89.19 20.37 79.82 58.81 115.35 57.65 11.52

56.24 99.77 7.58 55.79 48.28 63.45 33.07 4.91

49.32 76.05 3.02 39.30 37.03 37.54 15.16 2.76

46.46 66.46 0.89 30.06 31.06 11.04 3.67 0.36

จากผลการทดลองตารางท 3.24 พบวา ดาหลาเปนพชทม % การยบยงสงทสด

คอ มคา 50IC ทเวลา 30 นาทเปน 3.02 µg GAE /ml เมอเทยบกบพชชนดอน ๆ ทงหมด คอ สารสกดจากดอกดาหลาจะใหคา 50IC สงเปนอนดบทสองตอจากสารตานอนมลอสระมาตรฐาน BHT จากผลการทดลองน ผวจยจงไดนาสารสกดจากดอกดาหลาเทานนไปศกษาตอเกยวกบโครงสรางของสารประกอบฟนอลกโดยทาบรสทธดวยวธ Thin Layer Chromatography, TLC แลวนาไปหาโครงสรางดวยวธ Mass Spectrometry, MS

ดาหล

า

มะอก

(เปลอ

ก)

มะอก

(เนอ)

หวา

เหมย

ง

ทามง

เขม

BHT

IC 50 (µ

g GAE

/ml)

99

6. ผลการทาบรสทธสารประกอบฟนอลกในสารสกดดอกดาหลาดวยตวทาละลาย จากตารางท 3.24 พบวาปรมาณสารประกอบฟนอลกทพบในสารสกดจากดอก

ดาหลานนมปรมาณสง (219.463 mg GAE/100 g fresh weight) เมอนามาหยดบนแผน TLC ทาใหสารแยกกนไดไมดเทาทควร ผวจยจงนาสารสกดทไดนนมาสกดอกครงดวยตวทาละลาย 2 ตวคอ Dichloromethane และ Ethyl Acetate และนาไปหาปรมาณสารประกอบฟนอลกอกครงดงตารางท 3.25 ตารางท 3.25 แสดงปรมาณสารประกอบฟนอลกทสกดไดจากตวทาละลาย Dichloromethane และ Ethyl Acetate

[Phenolic] mg GAE/100 g FW*

in acetone**

[Phenolic] mg GAE/100 g FW

in Dichloromethane**

[Phenolic] mg GAE/100 g FW in Ethyl acetate**

462.51 30.60 30.70 **หมายเหต ผลทแสดงเปนคาเฉลยทไดจากการทดลอง 2 ครง

จากผลการทดลองในตารางท 3.25 จะพบวาปรมาณสารประกอบฟนอลกทไดจากตวทาละลายทง 2 ชนด (Dichloromethane และ Ethyl acetate) ใหปรมาณสารประกอบ ฟนอลกทใกลเคยงกน คอ 30.60 mg GAE/100 g fresh weight และ 30.70 mg GAE/100 g fresh weight ตามลาดบ เมอนาสารสกดทไดจากตวทาละลายทง 2 มาวดคาการดกจบอนมลอสระ DPPH • ซงแสดงตามตาราง 3.26 พบวาสารประกอบฟนอลกทสกดไดจากตวทาละลาย Ethyl Acetate จะใหสารประกอบฟนอลกทม Activity ในการดกจบอนมลอสระ DPPH •ทดกวาสารประกอบฟนลกทไดจากตวทาละลาย Dichloromethane สงเกตไดจากกราฟในรปท 3.38 และ รปท 3.39 โดยกราฟความสามารถการดกจบอนมลทดนนจะตองมความเขมขนของสารสกดทตาและทางานไดดทเวลานอย ๆ

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 50 100 150 200 250

Extract (µg/ml)

%In

hibi

tion

5 min10 min20 min30 min40 min

ตารางท 3.26 คา 50IC ของสารประกอบฟนอลกในตวทาละลาย Dichloromethane และ Ethyl Acetate

เวลา 50IC ใน Dichloromethane 50IC ใน Ethyl Acetate 5 min 10 min 20 min 30 min 40 min

242.94 58.90 45.50 41.17 38.58

38.95 12.30 11.19 8.02 6.33

จากตาราง 3.26 ทาใหทราบวาสารประกอบฟนอลกทสกดไดจากตวทาละลาย

Dichloromethane นน แมวาจะมปรมาณมากแตมฤทธในการตานอนมลอสระชนด DPPH • ไดนอยหรออาจหมายความไดวามฤทธในการตานอนมลอสระชนดอน ๆ ทไมใชอนมลอสระ DPPH • ไดดกวา

รปท 3.38 กราฟ Activity ของสารสกดจากดอกดาหลาใน Dichloromethane

101

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 50 100 150 200 250

Extract (µg/ml)

%In

hibi

tion

5 min10 min20 min30 min40 min

รปท 3.39 กราฟ Activity ของสารสกดจากดอกดาหลาใน Ethyl Acetate จากรป 3.38 และ รป 3.39 เปนกราฟแสดง Activity ของสารสกดในตวทาละลายทง 2 ชนด ณ เวลาตาง ๆ กนคอ ทก 5 นาทจนครบ 40 นาท จากรปกราฟทไดมานน ทาใหทราบวาสารสกดจากดอกดาหลาในตวทาละลายทง 2 ม Activity ทตางกนอยางเหนไดชด โดยดจากลกษณะการโคง และ การคงทของกราฟ คอ สารสกดทไดจากตวทาละลาย Dichloromethane นนจะตองใชความเขมขนของสารสกดมากกวาในตวทาละลาย Ethyl Acetate ในการตานอนมลอสระ DPPH • ผวจยจงนาสารสกดทไดจากตวทาละลาย Ethyl Acetate เทานนไปศกษาการทาบรสทธดวยวธ TLC ตอไป 7. ผลจากการทาบรสทธสารประกอบฟนอลกดวยวธ TLC หลงจากการทาบรสทธสารสกดดอกดาหลาดวยตวทาละลาย Dichloromethane และ Ethyl Acetate แลวนน ขนตอนตอไปคอการนาสารสกดทไดนนไปทาบรสทธดวยวธ TLC จากการทดลองพบวา สารสกดดอกดาหลาในตวทาละลาย Ethyl Acetate จะใหแถบของสารออกมา 4 แถบ ดงแสดงในรปท 3.40 จากผลการทดลองทาใหทราบวา สารสกดในตวทาละลาย Ethyl Acetate ประกอบดวยสารฟนอลก 4 ชนดเปนอยางตา โดยในแถบท 1 มสทเขมอาจมสารประกอบฟนอลกชนดอน ๆ เจอปนอยอก

102

รปท 3.40 การแยกแถบสารสกดดอกดาหลาในตวทาละลาย Ethyl Acetate

หยดสารสกดลงบน TLC Plate รอใหแหงแลวนามาแชในตวเคลอนท Hexane: Chloroform: Methanol อตราสวน 2: 6: 2 โดยปรมาตร เปนเวลา 2 ชวโมง หลงจากไดแถบการแยกของสารในตวทาละลาย Ethyl Acetate แลว ผวจยได

นาแถบทไดทงหมดนนไปวเคราะหเพอวดหาปรมาณสารประกอบฟนอลกและความสามารถในการตานอนมลอสระ DPPH • ไดผลดงแสดงในตารางท 3.27 และรปท 3.41 ตารางท 3.27 แสดงคาปรมาณสารประกอบฟนอลกในแถบสารตาง ๆ บน TLC

ตวอยาง [phenolic] (µg GAE/ml)

แถบท 1 327.476 แถบท 2 54.381 แถบท 3 27.476 แถบท 4 32.238

แถบท 4

แถบท 3

แถบท 2

แถบท 1

103

รปท 3.41 การทดสอบความสามารถการตานอนมล DPPH • ดวยสารทไดจากแถบบน TLC

จากรปท 3.41 ทาใหทราบวาแถบสารบน TLC ทมฤทธตานอนมลอสระ DPPH • ไดนน เปนแถบสารบนแถบท 1 ซงจะเหนไดจากรปดานบนวา หลงจากเวลาผานไป 15 นาท สารในหลอดท 2 (แถบท 1) สามารถเปลยนสของสารละลาย DPPH • ซงมสมวงใหจางลงเรอย ๆ จนเปลยนเปนสเหลองใสถาวร แสดงวาสารในแถบท 1 มความสามารถในการดกจบอนมลอสระ DPPH • สงทสด จากผลการทดสอบฤทธการตานอนมล DPPH •ผวจยจงทาการขดสารแถบท 1 บน TLC ไปศกษาหากลมของสารตอไปดวยวธลควดโครมาโทกราฟ-แมสสเปกโตรสโกป (Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy, LC-MS) 8. ผลการวเคราะหชนดของสารประกอบฟนอลกทมฤทธตานอนมลอสระ DPPH •ดวย เครอง Mass Spectrometer ในการวเคราะหครงน ผวจยไดทดสอบดวยวธ In house method refer to WI-RES-LC/MS-001 ในเทคนค Liquid Chromatography–Mass Spectrometer โดยรายละเอยดอปกรณไดแสดงไวดงตาราง 2.4 หลงจากททาบรสทธอยางหยาบดวยวธ TLC และนามาหาปรมาณสารประกอบ ฟนอลกแลวนน เหนวาปรมาณสารประกอบฟนอลกทไดนนมปรมาณทมากกวาปรมาณทไดจากแถบอนอยางเหนไดชด (ตารางท 3.26) อาจเปนไปไดวายงมสารประกอบฟนอลกชนดอน ๆ

Control แถบ 1 แถบ 2 แถบ 3 แถบ 4

104

ปะปนอยอกคอ ความบรสทธยงนอยมาก ผวจยจงนาตวอยางทไดจาก TLC มาทาบรสทธตออกขนดวยวธ LC แลวนาไปวเคราะหกลมของสารทสนใจดวยวธ MS พบวา โครมาโทแกรมซงเปนกราฟแสดงการแยกของสารทไดนนยงมสารอกจานวนมากทยงรวมกนอยหลงจากทาบรสทธอยางหยาบดวยวธ TLC แลว ดงรปท 3.42 จากผลการทดลองทาใหทราบวาในสารสกดจากดอกดาหลานนมสารประกอบฟนอลกหลายชนดรวมกนอย จากรปท 3.42 จะเหนวา พคท 1 3 7 9 10 และ 11 นนใหพคทแสดงถงความไมบรสทธเพยงพอ ยากทจะนามาพจารณากลมของสารได สวนพคท 2 4 5 และ 6 เปนพคทนามาพจารณามวลของสารไดพอสมควร ผวจยจงนาพคทไดมาจากการวเคราะหผาน MS นมาเปรยบเทยบกบกลมของสารฟนอลกในพชของการศกษากอนหนาน ตามตารางท 3.27 โดยแสดงโครมาโทแกรมของสารเฉพาะทตองการวเคราะหเทานน (พคท 2 4 5 และ 6) ในรปท 3.43 – รปท 3.46

105

รปท 3.42 แสดงโครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาทผานการทาบรสทธดวย วธ Liquid Chromatography กอนจะเขาสเครอง Mass spectrometer

1 2

3

4 5

6

7

8

9 10 11

106

เมอสารตวอยางผานการแยกดวยเครอง LC แลวจะผานเขาสเครอง MS เพอทาการวเคราะหมวลของสารตวอยางดงกลาว หลงจากนนเมอทาการอานคาทไดจากโครมาโท แกรมแลวพบวาสารประกอบสวนใหญทไดนนนาจะเปนสารประกอบประเภท Flavonoid compound เนองจากมวลของสารทไดนนมคาสง ควรจะประกอบไปดวยโครงสรางวงแหวนอยางตา 3 วงแหวนซงเปนโครงสรางพนฐานของสารประกอบฟนอลกจาพวก Flavonoid compound ไดเคยมการศกษาสรรพคณทางยาของขงซงเปนพชในกลมเดยวกนกบดอกดาหลาพบวาสารประกอบทพบสวนใหญเปนสารประกอบในกลมฟลาโวนอยด ซงสารประกอบกลมฟลาโวนอยดโดยทวไปจะมโมเลกลของนาตาลเกาะตดอยดวยเสมอทาใหมวลทไดจากการวเคราะหสวนใหญมคาสง (http://www.rx12.wsnhosting.com/herb/king.html)

107

ตารางท 3.28 การศกษาสารประกอบฟนอลกโดยวธ Mass Spectrometer

Compounds MW MS MS/MS Reference Procyanidin trimer Rutin Epicatechin p-Coumaric cinnamyl ester Catechin Ellagic acid p-Coumaroyl-glycoside Syringic acid Ferulic acid derivative Methyl-EA-pentose Quercetin-glucoside Quercetin-rutinoside Licorice glycoside A Gallotannin/Ellagitannin Galloyl-HHDP-glucoside Sanguiin-H6

866 610 290 282 290 302 326 342 398 448 464 610 726 784 936 1870

865 609 289 267 289 301 325 327 397 449 463 609 725 783 935 1869

695, 577, 407, 287, 289 301, 447, 373, 271, 255 245, 206, 205, 272 165 245 257, 229 265, 187, 163, 145 312, 297, 342 295, 235 301, 179, 151 301, 179, 151 301, 179, 151 725, 549, 255, 135 481, 301, 257, 229 898, 633, 463, 301, 257, 229 1567, 1265, 935, 633, 301, 257, 229

Seeram et al., 2005 Seeram et al., 2005 Bystrom et al., 2008 Gardana et al., 2005 Bystrom et al., 2008 Seeram et al., 2005 Seeram et al., 2005 Proestos et al., 2005 Bystrom et al., 2008 Seeram et al., 2005 Seeram et al., 2005 Seeram et al., 2005 Zheng et al., 2008 Seeram et al., 2005 Seeram et al., 2005 Bystrom et al., 2008

ตารางท 3.28 เปนตารางแสดงชนดของสารประกอบฟนอลกกลมฟลาโวนอยดทผานการวเคราะหผานเครอง Mass spectrometer ซงแสดงมวลทแทจรงของสารและมวลทผานการแตกตวแลวของสาร ใชเพอเปรยบเทยบมวลของสารสกดทใชในการทดลอง

108

รปท 3.43 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาจากเครอง Mass Spectrometer ออกมาทเวลา 3.641 นาท(พคท 2 จากรปท 3.41)

109

รปท 3.44 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาจากเครอง Mass Spectrometer ออกมาทเวลา 41.87 นาท (พคท 4 จากรปท 3.41)

110

รปท 3.45 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาจากเครอง Mass Spectrometer ออกมาทเวลา 45.62 นาท (พคท 5 จากรปท 3.41)

111

รปท 3.46 โครมาโทแกรมของสารสกดจากดอกดาหลาจากเครอง Mass Spectrometer

ออกมาทเวลา 63.74 นาท(พคท 6 จากรปท 3.41)

112

รปท 3.43 แสดงโครมาโทแกรมของสารทไดจากเครองมอ LC จากการสงเกตพบวาพคท 2 มมวลทแทจรง 818.0 และมเบสพค (base peak) เทากบ 253.8 รปท 3.44 แสดงโครมาโทแกรมของสารในพคท 4 ซงเปนพคทมความบรสทธสงทสด (รปท 3.41) ดจากลกษณะของพคมความคมและชด มมวลทแทจรงเทากบ 725.2 และมเบสพคเทากบ 724.1 รปท 3.45 แสดงโครมาโทแกรมของสารในพคท 5 มมวลทแทจรงเทากบ 967.3 และมเบสพคเทากบ 950.2 รปท 3.46 แสดงโครมาโทแกรมของสารในพคท 6 มมวลทแทจรงเทากบ 298.9 เบสพคเทากบ 265.8 จากการนามาวเคราะหผลนนทาใหทราบวาสารประกอบฟนอลกมฤทธเปนสารตานอนมลอสระทสกดไดจากดอกดาหลานาจะเปนสารกลมฟลาโวนอยด สวนจะเปนสารชนดใด มโครงสรางอยางไร ควรทใชวธการวเคราะหหลาย ๆ วธเพอยนยนผลทได เชน วธ Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Infared Spectrometer (IR) และ Ultraviolet Spectrometer (UV) เปนตน เนองจากสารประกอบฟนอลกทพบในพชมหลายชนด ซงแตละชนดกมคาความแตกตางของมวลเพยงเลกนอยเทานน

บทท 4 สรปผลการทดลอง จากการศกษาหาปรมาณสารตานอนมลอสระชนดตาง ๆ ในพชพนบาน ในงานวทยานพนธนสามารถสรปผลไดดงน 1. สามารถสกดสารตานอนมลอสระชนดเบตา-แคโรทนดวยตวทาละลายอนทรยและวเคราะหผลโดยวธโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงหรอ HPLC จากผลมะอกไดมากทสด คอมคา 732.43 µg/100 g fresh weight เนองจากผลมะอกมสเหลอง ซงเปนสของสารเบตา-แคโรทนโดยตรง สวนดอกดาหลาและผลหวานน ถงแมจะเปนพชทมสเขมแตแทบจะไมมสารเบตา-แคโรทนเลยอาจเนองมาจากมเมดสอนทไมใชเบตา-แคโรทนเปนองคประกอบ 2. สามารถสกดสารตานอนมลอสระชนดวตามนอดวยตวทาละลายอนทรยและวเคราะหผลโดยวธโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงหรอ HPLC จากใบเหมยงไดมากทสด คอมคา 2, 8575.71µ g/100 g fresh weight เมอสงเกตจากผลการทดลองพบวาพชตวอยางทนามาวเคราะหนนมวตามนอทกตวอยางแตพบมากในสวนใบ (ใบเหมยงและใบทามง)

3. สามารถสกดสารตานอนมลอสระชนดวตามนซดวย 1% กรดฟอสฟอรก โดยปรมาตร และวเคราะหผลโดยวธโครมาโทกราฟสมรรถนะสงหรอ HPLC จากผลหวาไดมากทสด คอมคา 1856.40µ g/100 g wet weight เนองจากวตามนซสามารถพบไดในพชทมรสชาดเปรยว สวนในใบทามงนนเนองจากเปนพชทมรสชาตขมจงแทบไมพบวตามนซเลย 4. สามารถสกดสารตานอนมลอสระชนด Phenolic compounds ดวย 80% Acetoneจากผลหวาไดมากทสด รองลงมาคอ ดอกดาหลา มคา 914.92 และ 462.51 mg GAE/100g fresh weight ตามลาดบ

5. เมอนาสารสกดจากพชตวอยางทง 7 ตวอยางมาศกษาความสามารถใน การดกจบอนมลอสระ DPPH • แลวพบวาเมอเวลาผานไป 30 นาท สารสกดจากดอกดาหลามคาความสามารถในการดกจบมากทสดดไดจากคา 50IC ซงเปนคาความเขมขนนอยสดของสารสกดเทากบ 3.02 µg GAE/ml ททาใหอนมล DPPH • ดดกลนแสงไดลดลง 50% และเมอนามาเปรยบเทยบกบ BHT ซงเปนสารตานอนมลอสระโดยตรงแลวมคาไปในทางเดยวกน

6. การศกษาชนดของสารประกอบฟนอลกทมในสารสกดจากดอกดาหลาโดย การทาบรสทธสารดวยตวทาละลายอนทรยชนด Dichloromethane และ Ethyl Acetate พบวา สารสกดทไดจากตวทาละลาย Ethyl Acetate ใหคาความสามารถในการดกจบอนมลอสระ DPPH • ไดดกวาสารสกดทไดจากตวทาละลาย Dichloromethane

113

114

7. จากการแยกสารประกอบดวยวธ TLC ของสารสกดจากดอกดาหลาในตว ทาละลาย Ethyl Acetate พบวามสารประกอบฟนอลกรวมกนอยอยางนอย 4 ชนด โดยสารในแถบท 1 (แถบลางสด) ใหคาความสามารถการดกจบอนมลอสระ DPPH • ไดเมอเวลาผานไป 15 นาท

8. เมอนาสารสกดดอกดาหลาในตวทาละลาย Ethyl Acetate ทผานการทา บรสทธดวยวธ TLC จากแถบท 1 มาศกษาหาโครงสรางของสารประกอบฟนอลกชนดนน ๆ ดวยวธ LC-MS พบวายงมสารประกอบฟนอลกอกจานวนมากรวมกนอยในสารสกดจงยากทจะระบไดวาสารตวไหนทมความสามารถในการดกจบอนมลอสระ DPPH • อยางแทจรง

9. ในการวจยครงนจงสามารถระบไดวาสารสกดจากดอกดาหลาทม ความสามารถในการดกจบ DPPH • นนนาจะเปนสารประกอบฟนอลกในกลม Flavonoid compounds เนองจากโครมาโทแกรมจาก MS ทไดนนมมวลของสารสง การทจะศกษาวาสารประกอบฟนอลกในสารสกดจากดอกดาหลาตวใดบางทมความสามารถในการดกจบอนมลอสระ DPPH • นนสามารถทาไดดวยการทาสารใหบรสทธอยางสงสดแลวจงศกษาในเชงลกตอไปโดยผานขนตอนการวเคราะหดวยเครองมอ NMR, IR, UV และ MS ถงจะไดโครงสรางของสารประกอบฟนอลกดงกลาวอยางแทจรง

รายการเอกสารอางอง คณาจารยสาขาเคมอนทรย. 2539. ปฏบตการเคมอนทรย. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร

มหาวทยาลยสงขลานครนทร. หนา 26-33.

กองโภชนาการ กรมอนามย 2530. ตารางแสดงคณคาอาหารไทยในสวนทกนได 100 กรม. 48 หนา.

เตม สมตนนทน. 2523. ชอพรรณไมแหงประเทศไทย (ชอพฤกษศาสตร-ชอพนเมอง). กรมปา ไม 379 หนา.

มลนธโตโยตาประเทศไทยและสถาบนวจยโภชนาการ มหาวทยาลยมหดล. 2541. มหศจรรยผก 108. พมพครงท 4. 411 หนา.

สถาบนการแพทยแผนไทยและกองทนสงแวดลอมโลก. 2537. ผกพนบาน (ภาคใต) ทางเลอก ในการผลตและการบรโภค 114 หนา.

สานกงานคณะกรรมการการสาธารณสขมลฐาน สานกงานปลดกระทรวงสาธารณสข สถาบน การแพทยแผนไทย กรมการแพทย กระทรวงสาธารณสข. 2538. ผกพนบาน : ความหมายและภมปญญาของสามญชนไทย 261 หนา.

คณะอนกรรมการประสานงานวจยและพฒนาทรพยากรปาไมและไมโตเรวอเนกประสงค. 2540. ไมอเนกประสงค กนได หนา 486.

วลยา เนาวรตนวฒนา และ พชร บญศร. 2542. โปรออกซแดนท: อกโฉมหนาของแอนตออกซ แดนท. ว.วทยาศาสตร. 53(3): 196-198.

สถาบนการแพทยแผนไทย กรมการแพทย กระทรวงสาธารณสข. 2542. ผกพนบานภาคใต 279 หนา.

แมน อมรสทธ และ อมร เพชรสม, Principles and Techniques of Instrumental Analysis, โรงพมพชวนพมพ 2535.

Akyon Y. 2002. Effect of antioxidants on the immune response of Helicobacter pylori. Chin Microbiol Infect. 8, 438 – 441.

Akoh, C. C. and Min, B. D. 1998. Antioxidants In Food Lipids. 423-448. New York.

115

116

Ames, B. N., Shigenaga, M. K. & Hagen, T. M. 1993. Oxidants, antioxidants and the degenerative disease of aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 7915-7922.

Backhouse, N., Rosales, L., Apablaza, C., Goity, L., Erazo, S., Negrete, R., Theodoluz, C., Rodriguez, J., Delporte, C. 2008. Analgesic, anti-inflammatory and antioxidant properties of Buddleja globosa, Buddlejaceae. J. Ethnopharmacology 116, 263- 269.

Banerjee, A., Dasgupta, N., & De, B. 2005. In vitro study of antioxidant activity of Syzygium cumini fruit. J. Food Chemistry. 90, 727 – 733.

Bast, A., Haeren, G. and Doelmen, C. 1991. Oxidants and antioxidants: state of art. Am. J. Med. 91, 2-13.

Braca, A., Nunziatina, De Tommasi, Lorenzo, De Bari, Cosimo, Pizza, Mateo, Politi & Ivano, Morelli. 2001. Antioxidant principles from Bauhinia terapotensis. J. Natural Products. 64, 276 – 287.

Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E. & Berset, C. 1995. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm Wiss Technol 20, 25 – 30. Blois, M.S., 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical.

Nature 181, 1199–1200.

Burton, G. W. and Traber, M. G. 1990. Vitamin E antioxidant activity biokinetics and bioavailability. Annu. Rev. Nutr. 10, 357-382.

Byers, T., Perry, G. (1992). Dietary carotenes, Vitamin C and Vitamin E as protective antioxidants in human cancers. Annu. Rev. Nutr. 12, 139 – 159.

Bystrom, M. L., Lewis, B. A., Brown, D. Y., Rodriguez, E., Obendorf R. L. 2008. Characterisation of phenolics by LC–UV/Vis, LC–MS/MS and sugars by GC in Melicoccus bijugatus Jacq. ‘Montgomery’ fruits. J. Food Chemistry. 111, 1017 – 1024.

Cai, Y., Luo, Q., Sun, M. and Harold, C. 2004. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plans associated with anticancer. J. Agric. Food Chem. 74(17), 2157-2184.

117

Chang, W. C., Sei, C. K., Soon, S. H., Bong, K. C., Hye, J. A., Min, Y. L., Sang, H. P., Soo, K. K. 2002. Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison. Plant Science. 163, 1161-1168.

Chantaro, P., Devahastin, S. and Chiewchan, N. 2007. Production of antioxidant high dietary fiber powder from carrot peels. LWT - Food Science and Technology. 41(10), 1987-1994.

Chu, Yi-Fang., Sun, J., Wu, X. and Rui Hai Liu. 2002. Antioxidant and Antiproliferative Activities of Common Vegetables. J. Agricultural and Food Chemistry. 50, 6910 – 6916.

Combs, G. F., Jr. The Vitamins, Academic Press: San Diago, CA, 1992.

Davies, K. J. 1995. Oxidative stress the paradox of aerobic life. Biochem. Soc. Sym. 61, 1-31.

Duh, P. D. and Yen, G. C. 1997. Antioxidant activity of three herbal water extracts. J. Food Chem. 60, 639-645.

Duncan, A. M. 2004. The role of nutrition in the prevention of breast cancer. AACN Clinical. 15, 119 – 135.

Fardet, A., Rock, E. and Rémésy. C. 2008. Is the in vitro antioxidant potential of whole- grain cereals and cereal products well reflected in vivo? J. Cereal Science.

48(2), 258-276

Foubert, L., Fleming, B., Latimer, R., Tomas, M., Oduro, A., Borland, C. and Higenbottam, T. 1992. Safety guidelines for use of nitric oxide. Lancet. 339, 1615-1616.

Frankel, E. N., Bosanek, C. A., Meyer, A. S., Siliman, K. and Kirk, L. L. 1998. Commercial grape juices inhibit the in vitro oxidation of human low-density lipoproteins. J. Am. Oil Chem. Soc.46, 834-838.

118

Gardana, C., Scaglianti, M., Pietta, P., Simonetti, P. 2007. Analysis of the polyphenolic fraction of propolis from different sources by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 45, 390–399.

Gordon, M. 2001. The development of oxidative rancidity in foods. In J. Pokorny, N. Yanishlieva and M. Gordon (eds.), Antioxidants in food: practical applications. 7-21. New York: CRC Press.

Gressier, B., Lebeque, S. and Brunet, C. 1994. Prooxidant properties of methotrexate evaluation and prevention by an antioxidant drug. Pharmazia 49, 679-681.

Hakimuddin, F., Paliyath, G. and Meckling, K. 2004. Selective cytotoxicity of a red grape wine flavonoid fraction against MCF-7 cells. Breast Cancer Research and Treatment. 85, 65 – 79.

Halliwell, B., Aeschbach, R., Loliger, J., Arouma, O. I. 1995. The characterization of antioxidants. J. Food Chem. Toxic. 33, 601-617.

Halliwell, B. 1999. Antioxidant defense mechanism: from the beginning to the end. (of the beginning). Free Rad. Res. 31, 261-272.

Hamilton, S. J. 2004. Review of selenium toxicity in the aquatic food chain. Science of

The Total Environment. 326(1-3), 1-31.

Howell, N.K. and Saeed, S. 1999. The effect of antioxidants on the production of lipid oxidation products and transfer of free radicals in oxidized lipid-protein systems. In T.K. Basu, N.J. Temple and M.L. Garg (eds.), Antioxidants in human health and disease. 43-54. London: CABI.

Hsieh, T. J., Lui, T. Z., Chia, Y. C., Chern, C. L., Chuang, M. C., Mau, S. Y. 2004. Protective effect of methyl gallate from Toona sinensis (Meliaceae) against hydrogen peroxide-induced oxidative stress and DNA damage in MDCK cells. Food and Chemical Toxicology. 42, 843-850.

Http://diarylove.com

Http://dnp.go.th

119

Http://singburi.doae.go.th

Http://www.panmai.com

Http://www.kruaklaibaan.com

Http://en.wikipedia.org/wiki/Antioxidant

Http://www.tcd.ie/tsmj/2000/antiox.html

Http://www.rx12.wsnhosting.com/herb/king.html Huang, Zih-Rou., Hung, Chi-Feng., Lin, Yin-Ku and Fang, Jia-You. 2008. In vitro and in

vivo evaluation of topical delivery and potential dermal use of soy isoflavones genistein and daidzein. International Journal of Pharmaceutics. 364(1), 36-44.

Huang, Yu-Ching., Chang, Yung-Ho. and Shao, Yi-Yuan. 2006. Effects of genotype and treatment on the antioxidant activity of sweet potato in Taiwan. J. Food Chemistry. 98(3), 529-538.

Huie, R. E. and Padmaja, S. 1993. The reaction of NO with superoxide. Free Radic. Res. Commun. 18, 195-199.

Jagdish Singh, A.K., Upadhyay, A., Bahadur, B., Singh, K.P. Singh, M. R. 2006. Antioxidant phytochemicals in cabbage (Brassica oleradea L. var. capitata). J. Scientia Horticulturae. 108, 233 – 237.

Jayaprakasha, G.K., Negi, P.S., Jena, B.S., Rao, L. J. M. 2007. Antioxidant and antimutagenic activities of Cinnamomum zeylanicum fruit extracts. J. Food Composition and Analysis. 20, 330 – 336.

Jork, H., Funk, W., Fischer, W., Wimmer, H. 1989. Wimmer, Dunnschicht- Chromatographie, Band la, VCH, Weinheim, p. 149

Kim, D. O., Jeong, S. W. and Lee, C. Y. 2003. Antioxidant capacivy of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums. J. Food Chemistry. 81, 321-326.

120

Kobayashi, K., Forohlich, H., Usami, N., Takakura, K. and Lesech, C. 2003. Enhancement of X-ray induced breaks in DNA bound to molecules containing platinum: A possible application to hadrontherapy. Rad. Res. 157, 32-37.

Konstan, M. W., Berger, M. 1993. Infection and inflammation in the lumg in cystic fibrosis. In: Davis PB, ed. Cystic Fibrosis. New York: Marcel Dekker.

Kurilich, A.C., Tsau, G.J., Brown, A. 1999. Carotene, Tocopherol and Ascorbate contents in subspecies of Brassica oleracea. J. Agri. Food Chem. 47(4), 1576 – 1581.

Kusznierewicz, B., Smiechowska, A., Bartoszex, A., namiesnik, J. 2008. The effect of heating and fermenting on antioxidant properties of white cabbage. Journal of Food Chemistry. 108, 853- 861.

Lin C.H., Chen B.H. 2003. Determination of carotenoids in tomato juice by Liquid Chromatography. J. Chromatography A. 1012, 103 – 109.

Lopes, G. K. B., Schulman, H. M. and Lima, M. H. 1999. Polyphenol tannic acid inhibition hydroxyl radical formation from Fenton reaction by complexing ferrous ions. Biochem. Biophys. Acta. 1426, 475-482.

Milovanovi, M., Picuri, K., Jovanovi., Djermanovi, V. and Stefanovi M. 2002. Antioxidant activities of the constituents of Picris echoides. J. Serb. Chem. Soc. 66(10), 7–15.

Morel, I., Cillard, P. and Cillard, J. 1998. Flavonoid-metal interactions in biological system. In C. A. Rice-Evans and L. Packer (eds.), Flavonoids in health and disease (3rd), 163 – 177. New York: Marcel Dekker.

Morrison, R. T. and Boyd, R. W. 1975. Organic chemistry.1258. New Delhi. Prentice- Hall of India Private.

Nair, U., Bartsch, H., and Nair, J. 2007. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radic. Biol. Med. 43, 1109-1120.

121

Navarro, V., Delgado, G. 1999. J. Ethnopharmacol. 66, 223.

Nawar, W. W. 1996. Lipid in O. R. Fennema (eds.), J. Food Chemistry. 210-243. New York.

Negi, P. S., Jayaprakasha, G. K. 2001. Eur. Food Res. Technol. 213, 484.

O’ Donnell, V., Tayler, B., Parthasarathyl, S., Korn, H., Koesling, D and Friebe, A. 1999. 15-lipoxygenase catalytically consumes nitric oxide and impairs activation of guanylate cylase. J. Biol. Chem. 274(29), 20083-20091.

Pei, Y.H., Han, B., Feng, B. M., Hua, H. M. 2002. Chinese Tradit. Herbal Drugs 33, 591.

Pokorny, J., Yanishlieva, N. and Gordon, M. 2001. Antioxidants in food: practical applications. 380, New York: CRC Press.

Prakash, D., Singh, B. N., and Upadhyay, G. 2006. Antioxidant and free radical scavenging activities of phenol from onion(Allium cepa). J. Food chemistry. 1389-1393.

Proestos, C., Boziaris, I. S., Nychas, G.-J.E., Komaitis, M. 2006. Analysis of flavonoids and phenolic acids in Greek aromatic plants: Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity. J. Food Chemistry. 95, 664 – 671.

Puerta, T. 1999. Inhibition of leukocytes lipoxygenase by phenlics from virgin olive oil. J. Biochem. Pharm. 57(4), 445-449

Rajalakshmi, D. and Narasinhan. 1996. Food antioxidants: Sources and method of evaluation. In. D. L. Madhavi, S. S. Despande and D. K. Salunkhe (eds.). Food Antioxidants, 5-64. New York: Marcel Decker.

Rice-Evans, C. A., Miller, N. J. and Paganga, G. 1996. Structure antioxidant activity relationship of flavonoid and phenolic acid. Free Radicals in Biology and Medicine. 20(7), 933-956.

122

Sacchetti, G., Mattia, C. D., Pittia, P., Mastrocola, D. 2009. Effect of roasting degree, equivalent thermal effect and coffee type on the radical scavenging activity of coffee brews and their phenolic fraction. J. Food Engineering. 90, 74–80.

Sanchez-Moreno, C, Jimenez-Escria, A. and Saura-Calixto. J. 2000. Study of low- density lipoprotein oxidizability indexes to measure the antioxidant activity of dietary polyphenols. Nutr. Res. 20(7), 941-953.

Seeram, N. P., Lee, R., Scheuller, H. S., Heber, D. 2006. Identification of phenolic compounds in strawberries by liquid chromatography electrospray ionization mass spectroscopy. J. Food Chemistry. 97, 1 – 11.

Sen, C. K. 1995. Oxygen toxicity and antioxidant: state of art. Indian J. Physio. Pharmacol. 39, 177-196.

Sherwin, E. R. 1990. Antioxidants In A. Bromen, P. M. Daidson and S. Salmine (eds.), Food additive,139-193. New York.

Shetty K. 1997. Biotechnology to Harness the benefits of dietary phenolic: focus on Lamiaceae. Asia Pacific. J. Clin Nutr. 6, 162 – 171.

Sies, H., 1991. Oxidative stress, oxidants and antioxidants. New York: Academic Press.

Sies, H., Stahl, W. and Sundquist, A. 1992. Antioxidant functions of vitamins, vitamin E and C, beta-carotene and other carotenoids. Ann. NY Acad. Sci.368, 7-19.

Simkina, A. J., Moreaua, H., Kuntzb, M., Pagnya, G., Linc, C., Tanksleyc, S., McCarthya, J. 2008. An investigation of carotenoid biosynthesis in Coffea canephora and Coffea Arabica. J. Plant Physiology. 165, 1087 – 1106.

Singleton V. L., Orthofer R., Lamuela-Raventos R. M. 1999. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 299, 152 – 178.

Skoog, D. A., West, D. M. and Holler, F. J., Fundamental of Analytical Chemistry, 6th ed., Saunders College Publishing, New York, 1992.

123

Soares, J. R., Dins, T. C. P., Cunha, A. P., & Ameida, L. M. 1997. Antioxidant activity of some extracts of Thymus zygis. Free radical Research. 26. 469 – 478

Stamler, J. S., Single, D. J. and Loscalzo, L. 1992. Biochemistry of nitric oxide and its redox activated forms. Science. 258, 1898-1902.

Stephens, R. J., Freeman, G. and Evans, M. J. 1972. Early response of lung to low levels of nitrogen light and electron microscopy. Arch. Environ. Health 24: 160- 179.

Suntornsuk, L., Gritsanapun, W., Nilkamhank, S and Paochom, A. 2002. Quantitation of vitamin C content in herbal juice using direct titration. J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 28(5), 849-855.

Swain, T., & Hillis, W. E. 1959. The phenolic constituents of Prunes dometicus (L.). The quantitative analysis of phenolic constituents. J. Science of food and

Agriculture. 10, 63 – 68. Tadmor Y., King S., Levi A., Davis A., Meir A., Wasserman B., Hirschberg J.,

Lewinsohn E. 2005. Comparative fruit colouration in watermelon and tomato. J. Food Research International 38, 837 – 841.

Tsuchihashi, H., Kigoshi, M., Iwatsuki, M. and Niki, E. 1995. Action of b-Carotene as an Antioxidant against Lipid Peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics 323(1), 137-147.

Valacchi, G., Pagnin, E., Corbacho, M. A., Gano, E., Davis, A. P., Packer, L. and Cross, E. C. 2004. In vivo ozone exposure induces antioxidant stress-related responses in murine lung and skin. Free. Biol Med. 36(5), 673-681.

Van Acker, F. A. A., Schouten, O., Haenen, G. R. M. M., van der Vijgh, W. J. F. and Best, A. 2000. Flavonoids can replace alfa-tocopherol as an antioxidant. FEBS Lett. 473, 145-148.

Vinson, Joe A. and Dabbagh, Yousef A. 1998. Tea phenols: Antioxidant effectiveness of teas, tea components, tea fractions and their binding with lipoproteins. Nutrition Research. 18(6), 1067-1075.

124

Voest, E. E., Vreugdenhil, G. and Marx, J. 1994. Iron-chelating agents in non-iron overload conditions. Ann. Intern. Med. 120, 490-499.

Weber, P., Bendich, A., Machlin, L., 1997. Vitamin E and Human health: rationale for determining recommended intake levels. Nutrition. 13, 450 – 460.

Williamson, G., Day, J. A., Plumb, G. W. and Couteau, D. 2000. Human metabolic pathways of dietary flavonoids and cinnamates. J. Biochemical Society Transaction. 28(2), 16-22.

Wolfe, K. L., & Lui, R. H. 2003. Apple peels as a value-added food ingredient. J. Agricultural and Food Chemistry. 51, 1676 – 1683.

www.elchem.kaist.ac.kr/.../ lc/graphics/hplc-sch.gif

www.fao.org/ag/ags/ agsi/ENZYMEFINAL/Image13b.gif

www.inchem.org/documents/ ehc/ehc/e39_7.gif

www-users.york.ac.uk/ ~chem77/graph/vitce.gif

Yamazaki, E., Inagaki, M., Kurita, O., Inoue, T. 2007. Antioxidant activity of Japanese peppers (Zanthoxylum piperitum DC.) fruit. J. Food Chemistry. 100, 171-177.

Yang, J-H., Mau, J-L., Ko, P-T. and Huang, L-C. 2000. Antioxidant properties of fermented soybean broth. J. Food Chem. 71, 249-254.

Yanishlieva, N. V. 2001. Inhibiting oxidation. In: J. Pokorny, N. Yanishlieva and M. Gordon (eds.), Antioxidants in food: practical applications. 22-57. New York: CRC Press.

Yen, G. C., Chen, H. Y. 1995. Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenecity. J. Agric. Food. Chem. 43, 27 – 37.

Kim, Y-N., Giraud, D. W., Driskell, J. A. 2007. Tocopherol and carotenoid contents of selected Korean fruits and vegetables. J. Food Composition and Analysis. 20, 458–465

125

Zheng, X., Shi, P., Cheng, Y., and Qu, H. 2008. Rapid analysis of a Chinese herbal prescription by liquid chromatography–time-of-flight tandem mass spectrometry. J. Chromatography A. 1206, 140 – 146.

126

ภาคผนวก

127

การเตรยมสารสาหรบการวเคราะห 1. 2 37%Na CO โดยมวลตอปรมาตร ชง 2 3Na CO 35 กรม ละลายในนากลน 200 มลลลตร คนตลอดเวลาจนสารละลายหมดไดสารละลายใสไมมส ปรบปรมาตรใหได 500 มลลลตรดวยขวดวดปรมาตร เกบไวในขวดสชาขนาด 500 มลลลตร แชใวในตเยน 2. เตรยมสารมาตรฐาน Gallic acid ทมความเขมขน 1 มลลกรม / มลลลตร ชงสารมาตรฐาน Gallic acid 5 มลลกรม ละลายใน absolute Ethanol 5 มลลลตร ไดความเขมขน 1 mg/ml เกบไวในภาชนะหอฟรอยด หลงจากนนนามาเจอจางดวยนากลนใหไดความเขมขน 20 – 500 ไมโครกรม / มลลลตร เกบไวในตเยน 3. เตรยมสารมาตรฐาน β -carotene ความเขมขน 1.5 มลลกรม / มลลลตร ชงสารมาตรฐาน β -carotene 7.5 มลลกรม ละลายในคลอโรฟอรม 5 มลลลตร ไดความเขมขน 1.5 มลลกรม / มลลลตร ในภาชนะหอฟรอยด หลงจากนนนามาเจอจางดวย Tetrahydrofuran ใหไดความเขมขน 3.0 – 60 ไมโครกรม / มลลลตร เกบไวในตเยน 4. เตรยมสารมาตรฐาน tocopherolα − ความเขมขน 1 มลลกรม / มลลลตร ชงสารมาตรฐาน tocopherolα − 5 มลลกรม ละลายใน absolute Ethanol 5 มลลลตร ไดความเขมขน 1 มลลกรม / มลลลตร ในภาชนะหอฟรอยด หลงจากนนนามาเจอจางดวย Tetrahydrofuran ใหไดความเขมขน 20 - 400 ไมโครกรม / มลลลตร เกบไวในตเยน 5. เตรยมสารมาตรฐาน Vitamin C ความเขมขน 2 กรม / มลลลตร ชงสารมาตรฐาน Vitamin C 2 กรม ละลายใน 1% กรดฟอสฟอรก 1 มลลลตร ไดความเขมขน 2 กรม / มลลลตร เตม 5% DDT 1 มลลลตร ปองกนการสลายตว ในภาชนะหอฟรอยด หลงจากนนนามาเจอจางดวย 1% กรดฟอสฟอรก ใหไดความเขมขน 0.08 – 0.90 มลลกรม / มลลลตร เกบไวในตเยน 6. เตรยมสารละลาย DPPH •ความเขมขน 0.05 mM 50 มลลลตร ชง DPPH 0.001 กรม ละลายใน absolute Ethanol 50 มลลลตรไดความเขมขน 50 mM DPPH ในขวดสชา เกบไวในตเยน หมายเหต : การเตรยมสารละลาย DPPH •ควรเกบไวใชแค 2 – 3 วนเทานน ในการเตรยมแตละครงจะเตรยมในปรมาณนอย

128

7. เตรยมสารละลาย BHT สาหรบเปน Positive control ชง BHT 0.055 กรม ละลายใน absolute Ethanol 50 มลลลตร ไดความเขมขน 0.1 mM ในขวดสชา เกบไวในตเยน หมายเหต : สารละลาย BHT ใชเพอเปน Positive control ในการศกษาความสามารถการดกจบอนมลอสระในสรละลาย

129

ประวตผเขยน

ชอ สกล นางสาวปยศร สนทรนนท รหสประจาตวนกศกษา 4822047 วฒการศกษา วฒ ชอสถาบน ปทสาเรจการศกษา วทยาศาสตรบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร 2546 (วทยาศาสตร – เคม) ทนการศกษา (ทไดรบในระหวางการศกษา) ทนการศกษาระดบบณฑตศกษา จากโครงการสรางความเขมแขงสความเปนเลศทางวชาการ สาขาวชาชวเคม มหาวทยาลยสงขลานครนทร ประจาป 2548 การตพมพเผยแพรผลงาน ปยศร สนทรนนท และอธยา รตนพทยาภรณ. 2550. การตรวจหาปรมาณวตามนท

เปนองคประกอบในผลมะอก ดอกดาหลา และ หวา โดยเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง. การประชมวชาการงานวจยระดบบณฑตศกษาแหงชาต ครงท 8. วนท 7-8 เดอน กนยายน พ.ศ. 2550, มหาวทยาลยมหดล ศาลายา จงหวดนครปฐม.