Upload
oana-spanu
View
209
Download
10
Embed Size (px)
DESCRIPTION
descrierea arahidelor
Citation preview
CUPRINS
INTRODUCERE………………………………………………………………………………….3
CAPITOLUL I: CADRUL NATURAL ŞI INSTITUŢIONAL ÎN CARE SE VOR
DESFĂŞURA CERCETĂRILE ŞI OBSERVAŢIILE
1.1. Cad
rul natural…………………………………………………………………………….........4
1.2. Cadrul
instituţional……………………………………………………………………………7
CAPITOLUL II: DESCRIEREA ŞI TEHNOLOGIA DE CULTURĂ A SPECIEI
ARACHIS HYPOGAEA L.
2.1. Particularităţile morfologice ………………………………………………………………..11
2.2. Particularităţile biologice……………………………………………………………………14
2.3. Cerinţele faţă de climă şi de sol……………………………………………………………..16
2.4. Tehnologia de cultură a alunelor de pământ………………………………………………...16
CAPITOLUL III: DESCRIEREA SUBSTANŢELOR MUTAGENE
3.1. Sulfatul de dimetil…………………………………………………………………………...23
3.2. Azida de sodiu……...………………………………………………………………………..24
3.3. Etil metansulfonat……………………………………………...……………………………25
CAPITOLUL IV: PROIECTAREA PLANULUI EXPERIMENTAL PENTRU
REALIZAREA TEMEI PROPUSE
4.1. Obiectivele tezei de doctorat………………………………………………………………...26
4.2. Materialul biologic folosit.......................................................................................................28
4.3. Metodele de cercetare……………………………………………………………………….30
4.3.1. Metoda de efectuare a tratamentelor la seminţe şi aşezarea experienţei în câmp……...30
1
4.3.2. Metode statistice de prelucrare a datelor........................................................................32
4.3.3. Metode citogenetice …………………………………………………………………...32
4.3.3.1. Efectul substanţelor chimice mutagene asupra facultăţii şi energiei germinative a
seminţelor.......................................................................................................................................32
4..3.2. Efectul substanţelor chimice mutagene asupra ritmului de creştere în lungime a
rădăciniţelor şi tulpiniţelor ............................................................................................................33
4.3.3.3. Identificarea şi frecvenţa aberaţiilor cromozomice în mitoză...............................34
4.3.4. Metode fiziologice...........................................................................................................37
4.3.4.1. Determinarea conţinutului de pigmenţi asimilatori din frunze pe cale
spectrofotometrică .........................................................................................................................37
4.3.4.2. Efectul indus de tratamentul cu substanţe chimice mutagene asupra intensităţii
fotosintezei ....................................................................................................................................39
4.3.4.3. Determinarea intensităţii transpiraţiei…………………………………………...39
CONCLUZII …………………………………………………………………………………….42
BIBLIOGRAFIE……………………………………………………………………………........43
2
INTRODUCERE
Ţara de origine a arahidelor este America de Sud. Cât priveşte zona exactă de origine
persistă incertitudinea. Unii consideră a fi Argentina şi anume în partea muntoasă unde se găsesc
încă specii strict înrudite. După alte păreri zona de origine ar fi platoul înalt central al Braziliei,
unde se găsesc tipuri sălbatice bienale de arahide sau regiunea andină a Argentinei. Indiferent de
zona de origine, un lucru este cert, că în aceste părţi ale lumii arahidele s-au cultivat din vremuri
foarte îndepărtate (Pop L. şi colab., 1986). Astfel, fructe de arahide s-au găsit în grotele peruane
din Ankona, de langă Lima, iar călătorul portughez Gabriel Suarez de Suza menţiona în anul
1570, că arahidele au fost cultivate de către indienii din Peru, care le denumeau anhuc (Pop L. şi
colab., 1986).
În Europa arahidele au fost aduse de marinarii portughezi în secolul al XVI-lea, din India
şi s-au răspândit în zonele sudice mai calde, favorabile pentru cultivare.
Arahidele (alunele de pământ, alunele americane) prezintă o importanţă deosebită
datorită conţinutului ridicat al seminţelor în proteine (25-34%) şi grăsimi (45-60%). În producţia
mondială de ulei, arahidele ocupă locul al treilea (peste 3 milioane tone anual), situându-se după
soia, floarea soarelui şi înaintea bumbacului. În hrana oamenilor, arahidele au folosinţe multiple.
Uleiul (de o calitate foarte bună, conţinut ridicat în vitamina B1) se foloseşte în alimentaţie, în
industria conservelor, a margarinei şi a untului, iar seminţele proaspete şi întregi se consumă
prăjite sau în diferite preparate culinare, la obţinerea pâinii, biscuiţilor, ciocolatei etc. Cojile
rezultate în urma decojirii păstăilor de arahide şi după măcinare se folosesc la prepararea de
nutreţuri furajere, iar frunzele şi tulpinile pot constitui un nutreţ valoros pentru animale dar pot fi
întrebuinţate şi ca îngrăşământ verde (Marin Ş. şi Constantinescu Emilia, 2011).
Arahidele au utilizări variate şi valoroase, iar cultura acestora prezintă o serie de avantaje,
care îi sporesc importanţa, cum ar fi:
- posibilitatea de a obţine producţii mari la unitatea de suprafaţă şi relativ constante;
- solicită un consum redus de îngrăşăminte;
- constituie o plantă bună premergătoare pentru alte culturi, oferind posibilitatea de a forma
asolamente şi succesiuni raţionale;
- valorifică superior solurile cu o capacitate de producţie mică, cum sunt de exemplu cele
nisipoase.
3
CAPITOLUL I
CADRUL NATURAL ŞI INSTITUŢIONAL
ÎN CARE SE VOR DESFĂŞURA CERCETĂRILE ŞI OBSERVAŢIILE
Cercetările care fac obiectul tezei de doctorat se vor desfăşura atât în câmp, la ferma
Ezăreni, din cadrul Staţiunii Didactice a Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară
“Ion Ionescu de la Brad” Iaşi unde se vor cultiva alune de pământ în vederea realizării
observaţiilor pe parcursul perioadei de vegetaţie, cât şi în cadrul laboratorului LECOM, unde se
vor efectua toate analizele citogenetice şi morfo-fiziologice.
1.1. Cadrul natural
Aşezarea Fermei Ezăreni
Ferma Ezăreni aparţine Staţiunii Didactice a Universităţii de Stiinţe Agricole şi Medicină
Veterinară “Ion Ionescu de la Brad” şi se află situată la 2,5 km sud–vest de oraşul Iaşi, fiind
aşezată în extremitatea sud–vestică a Câmpiei Moldovei.
Caracteristici generale ale reliefului şi climei
Relieful
Relieful zonei este strâns legat de alcătuirea geologică. În urma studiilor efectuate s-a
constatat prezenţa în această zonă a unui fundament precambian, puternic cutat şi metamorfozat.
Categoriile de relief specifice zonei, rezultate în urma eroziunii diferenţiate, sunt alcătuite din
două etaje structurale principale, distincte atât prin conformaţie cât şi prin geneză: un etaj
inferior, constituit din roci cristaline, cutate şi un etaj superior de cuvertură, care cuprinde
depozite sedimentare, necutate. Relieful actual al Fermei Ezăreni se integrează în aspectul
geomorfologic general al câmpiei Moldovei.
4
Solul. Conform modificărilor Structurii Sistemului Român de Taxonomie a Solurilor
(S.R.T.S) tipurile de sol formate pe teritoriul fermei Ezăreni sunt: cernoziomul cambic, solul
aluvial molic şi gleiosolul salinic (Blaga şi Filipov, 2005).
Solul pe care a fost amplasată experienţa este un cernoziom cambic mezoalcalic, slab
degradat, luto - argilos, ce prezintă o morfologie de tipul Ap, Atp, Am, AB, Bv1, Bv2, Bv3k
Cca1, Cca2, II Ck (figura 1.1) (Răus şi Jităreanu, 2007).
5
I Ap 0-19 cm; lut argilos; brun cenuşiu foarte închis (10YR 3/2); glomerulară medie; frecvent-macropori fini şi medii; cervotocine rare; rădăcini frecvente, nu face efervescenţa cu acid clorhidric; trecere clară.
Atp 19-25; lut argilos; brun foarte închis (10YR 2/2); structura poliedrică angulară mare; moderat compact; distribuţia rădăcinilor neuniformă, preferenţial pe feţele elementelor structurale; cervotocine rare; nu face efervescenţa cu acid clorhidric; trecere clară, ondulată.
Am 25-32 cm; lut argilos; brun fo arte închis (10YR 2/2); structura glomerulară mare; rădăcini frecvente distribuite relativ uniform atât pe feţele elementelor strucurale cât şi în interiorul agregatelor structurale; nu face efervescenţa cu acid clorhidric; cervotocine rare; trecere treptată.
AB 32-40 cm; lut argilos; brun gălbui închis (10YR 3/4); structura columnoid prismatică; rădăcini frecvente în interiorul şi preferenţial pe suprafaţa elementelor structurale; cervotocine rare; nu face efervescenţa cu acid clorhidric; distribuţia humusului uniform descrescândă; trecere treptată.
Bv1 40-51 cm; lut argilos; brun gălbui închis (10YR 4/4) structura columnoid prismatică medie; slab-moderat compact; distribuţia rădăcinilor preferenţial pe feţele elementelor structurale; melanocornevine rare; nu face efervescenţa cu acid clorhidric; trecere difuză.
Bv2 51- 78 cm; lut argilos; brun gălbui închis (10YR 4/4) structura columnoid prismatică medie; slab-moderat compact; distribuţia rădăcinilor preferenţial pe feţele elementelor structurale; melanocornevine rare; nu face efervescenţa cu acid clorhidric.
Bv3k 78-90 cm; lut argilos; brun gălbui (10YR 5/4); structura columnoid prismatică medie; slab - moderat compact; rădăcini rare distribuite preferenţial pe feţele elementelor structurale; melanocornevine rare; efervescenţa moderată spre puternică; eflorescenţe şi pseudomicelii de CaCO3; trecere treptată.
Cca1 92-108 cm; lut mediu; galben bruniu (10YR 6/6); structura masivă; efervescenţa foarte puternică cu acid clorhidric; rădăcini foarte rare; trecere difuză.
Cca2 108-138 cm; lut mediu; galben bruniu (10YR 6/6); structura masivă; efervescenţa foarte puternică cu acid clorhidric; eflorescenţe, pete şi vinişoare frecvente de carbonat de calciu; rădăcini foarte rare; trecere difuză.
II Ck 138 – 160 cm; lut mediu; galben bruniu (10YR 6/6); structura masivă; efervescenţa foarte puternică cu acid clorhidric; concreţiuni şi păpuşi de loess frecvente de carbonat de calciu.
Vegetaţia
Situată în zona de contact dintre limita nordică a bazinului păduros din Podişul Moldovei
6
Figura 1.1 - Profilul de sol (Răus şi Jităreanu, 2007)
şi Câmpia Jijiei şi Bahluiului, ferma Ezăreni se încadrează din punct de vedere geobotanic în
formaţiunea floristică de silvostepă. Acest fapt explică prezenţa unor elemente specifice stepei şi
silvostepei caracterizate printr-o vegetaţie ierboasă, xeromezofilă şi mezofilă.
Clima
Zona geografică a Iaşului se caracterizează printr-un climat temperat continental cu
particularităţi determinate de influenţa climatului stepei ruseşti. Ferma Ezăreni face parte din
provincia climatică Dfdx (după clasificarea lui Koppen), sau IIDps (după clima României),
caracterizată prin climă boreală, cu ierni geroase şi friguroase, cu temperatura celei mai reci luni
sub –33°C şi temperatura celei mai calde luni de 25 – 27° C.
Temperatura medie multianuală (la staţia meteorologică Miroslava) este de 9,6°C, cu
minima de –8,1°C înregistrată în luna ianuarie, iar maxima de +28,4° C realizată în luna iulie.
Temperatura maximă absolută a fost de +40,2° C (27 iulie 1909), iar minima absolută a fost de –
30,6° C (21 ianuarie 1997) (Administraţia Naţională de Meteorologie, 2011).
Precipitaţiile
Precipitaţiile medii multianuale în ecosistemul agricol Iasi sunt de 517,8 mm (la staţia
meteorologică Miroslava), lunile cele mai ploioase fiind: mai, iunie, iulie şi august. Precipitaţii
reduse cantitativ cad în lunile: ianuarie, februarie, martie, noiembrie şi decembrie. Precipitaţiile
sunt repartizate neuniform de-a lungul anului cu un maxim în luna iunie şi un minim în luna
februarie.
Evapotranspiraţia potenţială medie anuală determinată pentru perioada de vegetaţie a
culturilor agricole este de 648,7 mm, cu valori maxime în luna august (115,7 mm) şi minime în
luna octombrie de 65,6 mm. Indicele de ariditate are valoarea de 26,4, corespunzând condiţiilor
climatice de silvostepă.
Regimul eolian
În timpul iernii, dinamica atmosferică se caracterizează prin preponderenţa vânturilor de
la nord–vest şi nord ce bat cu o viteză medie de 2,8 m/s. Vara vânturile au direcţie sudică şi sud –
estică şi o viteză de 5,1 m/s. Vânturile cu o viteză de peste 2,5 m/s au o frecvenţă medie de
7
78,0%, activând puternic evaporarea apei din sol. În general, frecvenţa maximă a vânturilor
coincide cu perioada cea mai ploioasă a anului.
Primăvara cunoaşte cea mai sporită frecvenţă a vânturilor, care bat din toate direcţiile,
ceea ce diminuează procesul de calm. Toamna, când în estul ţarii începe să se simtă influenţa
anticiclonului siberian, se înregistrează o evidentă scădere a frecvenţei vânturilor dinspre nord –
vest. Iarna, deşi frecvenţa vânturilor este mai mică, se manifestă destul de activ crivăţul, care
bate din estul Europei, producând frig şi viscole puternice.
Luminozitatea şi nebulozitatea
Nebulozitatea medie a zilei este de 6 ore. Nebulozitate mică au lunile iunie şi iulie cu
valori de 3,4–5,6 ore, iar cea mai mare nebulozitate se înregistrează în lunile decembrie, ianuarie
şi februarie. Durata de strălucire a soarelui este de 2050 ore anual ceea ce reprezintă 44,5% din
durata teoretic posibilă.
Lunile cu cea mai lungă durată de strălucire a soarelui sunt în ordine descrescătoare:
iulie, august şi iunie, la care durata de strălucire a soarelui este de 294 ore. Durata cea mai redusă
de strălucire a soarelui este întâlnită în cursul lunilor noiembrie, decembrie şi ianuarie.
1.2. Laboratorul L.E.C.O.M
Laboratorul pentru expertiza şi controlul organismelor modificate genetic şi a produselor
agro-alimentare obţinute (L.E.C.O.M.) este parte integrantă a Departamentului de Cercetare al
Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară “Ion Ionescu de la Brad” Iaşi. A fost
creat în anul 2006, în contextul intrării României pe piaţa unică europeană, avându-se în vedere
necesitatea existenţei unor laboratoare care să poată certifica conformitatea şi calitatea
produselor agricole pentru consumul regional, dar şi celor care pătrund pe piaţa europeană.
Suportul tehnic, personalul calificat al laboratorului permit efectuarea de analize genetice
atât la plante cât şi la ADN– ul extras din produse alimentare şi furajere. Aparatura asigură
realizarea analizelor conforme cu metodele de referinţă agreate de directivele şi reglementările
Uniunii Europene.
Fluxul laboratorului este realizat astfel:
8
Camera de primire a probelor - este destinată recepţionării materialului ce urmează a fi
analizat. Camera este utilată cu calculator PC, pentru evidenţa probelor primite şi înregistrarea
lor.
Camera de măcinare a probelor - este dotată cu o moară de laborator de tip RETSCH
MM400 şi un aparat de tip Smasher. Moara este prevăzută cu 4 capsule metalice, iar măcinarea
se realizează cu ajutorul bilelor metalice. Se pot prelucra probe de soia, porumb boabe, fasole
boabe s.a. De asemenea, moara permite măcinarea cu ajutorul criogenei. Folosind acest tip de
măcinare se poate mojara şi material vegetal îngheţat în vederea extragerii ADN. Aparatul de tip
Smasher se foloseşte la mărunţirea butonilor florali, în vederea realizării culturilor de microspori
la diverse plante.
Camera de extragere ADN - probele supuse măcinării sunt aduse aici în vederea
extragerii ADN– ului. Camera are în dotare toate echipamentele necesare acestei operaţiuni, şi
anume:
Nişa chimică – cu rol de protecţie a operatorului şi a mediului înconjurător în cazul manipulării
substanţelor şi pulberilor periculoase, prin utilizarea filtrelor de cărbune activat şi a filtrelor
HEPA;
Ultracentrifugă cu răcire (HETTICH MIKRO 200R) – folosită pentru centrifugarea tuburilor
eppendorf la o temperatura de 4°C;
Balanţa analitică (KERN) – utilizată la cântărirea materialului vegetal;
Baie marină – utilizată pentru incubarea probelor la temperatura de 65ºC;
Incubator (etuva) – folosit(ă) la uscarea pelletului de ADN;
Agitatoare magnetice cu încălzire – folosite pentru prepararea substanţelor necesare în cadrul
procesului de extragere;
Vortexuri de laborator – utilizate la amestecarea componentelor biologice şi chimice în tuburi de
1,5 ml.
Camera de realizare a amestecului PCR – ADN–ul extras şi dizolvat în soluţie de TBE
buffer, este adus aici în vederea realizării amestecului PCR, pentru amplificarea lui.
În acest scop, camera este dotată cu:
- Hota cu flux laminar – funcţionează pe principiul recirculării aerului din interior. Aerul circulă
descendent prin filtrul principal montat deasupra spaţiului de lucru;
9
- Centrifuga (HETTICH MIKRO 120) - folosită pentru centrifugarea tuburilor de 1,5 ml, în
vederea separării compuşilor cu greutate specifică diferită;
- Fluorospectometru (NanoDrop 3300) – utilizat pentru aflarea concentraţiei de ADN după
extragere.
Camera de amplificare - după cititrea concentraţiilor şi realizarea amestecului pentru
reacţia PCR, probele sunt supuse ciclurilor necesare amplificării fragmentelor de ADN.
Camera este utilată cu:
- Sistem de electoforeză în gel vertical – utilizează gel acrilamidic, în timp real, pentru analiza
rapidă a fragmentelor de ADN;
- Sistem pentru apa ultrapură – utilizat pentru obţinerea apei cu grad foarte înalt de puritate,
necesară în diferite diluţii sau medii de reacţie.
Camera de electroforeză – utilizată pentru realizarea gelurilor de agaroză în plan
orizontal, în vederea vizualizării fragmentelor de ADN amplificate în urma reacţiei PCR.
Camera este dotată cu:
- Centrifugă pentru plăci – folosită la centrifugarea plăcilor PCR înainte de încărcarea probelor
pe gelul de agaroză, pentru amestecarea probelor cu colorant;
- Cuptor cu microunde – utilizat pentru prepararea gelului de agaroză;
- Balanţa analitică – folosită la cântărirea diferitelor substanţe chimice folosite în laborator;
- Cuve de electroforeză cu sursele aferente, de diferite mărimi – permit separarea fragmentelor
de ADN din soluţia de reacţie pe principiul vitezei diferite de deplasare, invers proporţională cu
masa moleculară a acestora în gelul de agaroză.
Camera de secvenţiere – dotată cu:
- Secvenţiator ADN (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) – este un analizor cu un singur capilar ce
permite realizarea unui număr mare de aplicaţii (secvenţiere, analiza fragmentelor ADN,
genotipizare, obţinerea de grupe linkage).
- Real time PCR – este un termocycler care permite vizualizarea curbelor de amplificare ADN.
Are 4 detectori, fiind capabil să suporte multiple aplicaţii, inclusiv cuantificarea relativă şi
genotipizarea SNP. Florocromii calibraţi care pot fi detectaţi sunt SYBR Green, FAMTM VICTM,
JOETM, NEDTM, TAMRATM, ROXTM. Poate detecta de la 10 copii de ADN, iar gradul de
confidenţă este de 99,7%.
10
Camera de preluare imagini - vizualizarea fragmentelor de ADN încărcate pe gelul de
agaroză se face în camera destinată special pentru această operaţie, principiul de vizualizare a
fragmentelor bazându-se pe efectul bromurii de etidium.
- Sistemul de preluare a imaginilor – este format din transiluminator, sistem de fotodocumentare
şi computer.
11
CAPITOLUL II
DESCRIEREA ŞI TEHNOLOGIA DE CULTURĂ A SPECIEI
ARACHIS HYPOGAEA L.
2.1. Particularităţile morfologice
Arachis hypogaea L.(figura 2.1) face parte din ordinul Leguminales, familia
Leguminosae, tribul Arachidineae, genul Arachis. Genul Arachis prezintă o singură specie
cultivată, Arachis hypogaea L., această specie nu prezintă forme sălbatice.
Figura 2.1. Alune de pământ - Arachis hypogaea L.
(www.plant-pictures.de)
Rădăcina este pivotantă şi pătrunde la mare adâncime în sol. Pe cernoziomurile din
Podişul Caucazului se citează o adâncime de pătrundere de 186 cm. Din rădăcina principală
pornesc multe rădăcini secundare, care permit explorarea unui volum mare de sol. Rădăcinile
terţiare sunt puţin evidente, subţiri şi scurte, rolul de pătrundere a solului revenind, în acest caz
rădăcinilor primare şi secundare. Sistemul radicular al arahidelor nu posedă rizodermă şi în
consecinţă nici peri absorbanţi adevăraţi. Absorbţia apei şi a elementelor chimice se face direct
12
prin parenchimul cortical. Pe rădăcinile laterale, în special în primii 15 cm de sol, apar
numeroase nodozităţi, ca urmare a prezenţei şi activităţii bacteriilor simbiotice. Nodozităţile sunt
mici, sub 4 mm diametru, în număr de 400-700 la o plantă şi de culoare maro-roşcată. Apar la
15-20 zile de la răsărire şi sunt rotund-sferice sau angular (Gillier P. şi Silvestre P., 1969).
Tulpina arahidelor este ierboasă şi erectă sau târâtoare, în funcţie de subspecie. În
secţiune, tulpina prezintă 5 muchii când plantele sunt tinere şi devine cilindrică într-o fază mai
înaintată de vegetaţie. Înălţimea tulpinilor variază în funcţie de subspecie şi soi. La formele cu
port erect înălţimea tulpinilor poate ajunge la 60-70 cm, pe când la cele cu port târâtor nu
depăşesc 20-25 cm (Pop L. şi colab., 1986).
Frunzele la arahide sunt compuse, paripenate şi formate din două perechi de foliole
opuse. Foliolele sunt ovale, ovoide sau elipsoidale şi ascuţite sau rotunjite la vârf. Forma şi
mărimea foliolelor depinde mult şi de poziţia pe care o ocupă frunzele pe plantă. Astfel foliolele
situate pe frunzele de la baza plantelor sunt mai mici decât cele situate spre vârful plantei. Faţa
superioară a foliolelor este lucioasă, iar cea inferioară este acoperită cu o reţea deasă de perişori
(Pop L. şi colab., 1986).
Florile sunt situate la arahide la subsuoara frunzelor şi pot fi solitare sau grupate în
inflorescenţe de tip racem (figura 2.2).
Figura 2.2 – Floarea la arahide
Florile au o culoare galbenă sau galbenă–portocalie şi sunt de două tipuri: flori
chasmogame (de la chayymos–deschis) care se deschid şi sunt poziţionate mai mult la vârful
tulpinii, de obicei sterile (mascule după Gillier P. şi Silvestre P., 1969) şi flori cleistogame care
13
sunt situate spre baza tulpinii şi nu se deschid (trec din faza de boboc la cea de fructificare şi se
autopolenizează). Există flori cleistogame şi pe baza subterană a tulpinii, dar numai la soiurile
precoce (Pîrşan P., 1998).
Gillier P. şi Prevot P. (1960) susţin că androceul este alcătuit din 8 stamine şi 2
rudimente. Anterele staminelor sunt de două tipuri: 4 de formă sferică şi uniloculare şi 4 în formă
de sac, dispuse altern în jurul stilului şi stigmatului. Pistilul este alcătuit dintr- un ovar unilocular,
cu un stil lung filamentos şi un stigmat de formă globulară. Ovarul este situat la baza tubului
caliciului şi are câteva ovule. Corola este alcătuită din 5 petale, stindardul este bine dezvoltat,
larg şi rotunjit, iar carena este alcătuită din 2 petale încovoiate (Pop L. şi colab., 1986).
Fructul arahidelor este o păstaie, de formă mai mult sau mai puţin cilindrică,
indehiscentă şi care prezintă la suprafaţă un desen reticular caracteristic (figura 2.3). La unele
soiuri desenul reticular este abia vizibil, în timp ce la altele este puternic pronunţat. La unele
soiuri, conformaţia păstăilor este asemănătoare cu aceea a gogoşilor viermilor de mătase.
Figura 2.3- Fructul la arahide
Lungimea păstăilor variază între 1-8 cm, iar lăţimea între 0,5-2 cm. Masa a 1000 de
păstăi variază în funcţie de tipul şi soiul de arahide, între 1000–1900 g, iar masa hectolitrică este
de 20–25 kg. Păstăile de arahide prezintă un număr variabil de boabe, între 1–4 boabe, iar în
unele cazuri se ajunge chiar şi la 7 boabe într-o păstaie. Culoarea boabelor variază în funcţie de
soi: gălbuie, galben – deschis, albă, roşie cu diverse nuanţe şi neagră. Boabele prin păstrare mai
îndelungată primesc treptat o nuanţă închisă şi îsi pierd luciul caracteristic iniţial (Pîrşan P.,
1998).
14
2.2. Particularităţile biologice
Arahidele, în special comparativ cu celelalte specii de plante cultivate în ţara noastră,
prezintă o serie de particularităţi biologice.
Germinaţia. La unele soiuri de arahide seminţele germinează numai după parcurgerea
repausului germinal. Soiurile care aparţin tipurilor Valencia şi Spaniol, germinaţia poate avea loc
la maturitatea tehnologică. În condiţii favorabile de umiditate a boabelor aflate în păstăi, şi
anume de 8% şi de temperatură de 15ºC, boabele îşi păstrează capacitatea germinativă timp de 5
ani. Boabele decojite îşi pierd repede capacitatea germinativă dacă nu sunt păstrate în cele mai
bune condiţii de umiditate şi temperatură (Pop L. şi colab., 1986). Temperatura minimă de
germinare este de 12–15 ºC. În cazul soiurilor sensibile, temperaturile sub 15ºC, din perioada
încolţirii, dăunează obţinerii unei semănături viguroase. La încolţire, prima care iese din boabe
este radicela, care este foarte viguroasă şi în condiţii de câmp se înfinge de la început puternic în
sol. Tulpiniţa apare mai târziu, iar radicela înfiptă în sol înlesneşte străbaterea solului de cele
două cotiledoane şi apariţia tulpiniţii la suprafaţa solului (Pîrşan P., 1998).
Creşterea sistemului radicular este relativ lentă la începutul perioadei de vegetaţie şi la
sfârşitul perioadei de vegetaţie. Rădăcinile reprezintă un procent ridicat din greutatea totală a
plantelor la începutul perioadei de vegetaţie. Pe măsura înaintării în creşterea plantelor, ponderea
rădăcinilor scade ca urmare a dezvoltării accentuate a părţii vegetative supraterestre şi a formării
organelor de fructificare.
Apariţia nodozităţilor şi activitatea bacteriilor simbiotice. Nodozităţile apar pe rădăcinile
de arahide începând cu cca. 15–20 zile de la răsărire. Până la apariţia nodozităţilor plantele au o
culoare verde–pal şi perioada corespunde cu o creştere vegetativă slabă. Apariţia şi numărul
nodozităţilor sunt influenţate de condiţiile de sol şi de climă. Astfel, arahidele nu formează
nodozităţi pe terenurile fertile. Minchevici A. I. şi Borcovschi E. V. (1953) arată că, pe
cernoziomurile levigate din nordul Caucazului, arahidele nu formează nodozităţi pe rădăcini, în
schimb numărul lor este mai mare la culturile de pe terenurile nisipoase. Cercetătorii indieni Nair
S. K. et al., (1972) arată că insuficienţa fosforului determină o slabă apariţie a nodozităţilor,
precum şi o slabă aprovizionare cu magneziu.
Creşterea tulpinilor. După ajungerea cotiledoanelor la suprafaţa solului se dezvoltă mai
întâi mugurele terminal, urmat de cei 2 muguri laterali. Înălţimea şi greutatea la care ajung
15
tulpinile plantelor de arahide depind de soi, condiţiile climatice, de sol şi de condiţiile de cultură
(Pîrşan P., 1998).
Creşterea frunzelor. Ritus G. I. (1952) a găsit că pentru formarea frunzelor soiurile
precoce au nevoie de mai multă căldură decât cele tardive şi formează un număr mai mic de
frunze. Un număr mai mare de frunze poate avea un rol important asupra producţiei obţinute. În
acelaşi timp prezenţa unui număr mai mare de frunze în masa supraterestră a plantelor are o
influenţă favorabilă şi asupra calităţii acesteia ca furaj. Acest lucru se datorează conţinutului
ridicat de proteine (Pop L. şi colab., 1986).
Înflorirea. În condiţiile climatice din zona de cultivare a arahidelor, în ţara noastră,
înflorirea începe la 25–30 zile de la răsărire, mai devreme la soiurile timpurii şi mai târziu la
soiurile tardive şi durează o perioadă mai mare de timp la soiurile tardive până la recoltare.
Durata medie de înflorire a unei flori este scurtă. În mod normal florile se deschid dimineaţa
înainte de răsărirea soarelui şi rămân desfăcute până la prânz, când începe ofilirea. În cea de a
treia zi floarea se usucă şi cade (Pop L. şi colab., 1986). Datorită aşezării stigmatului în carena
inchisă a corolei, nu este în general posibilă polenizarea alogamă. Autopolenizarea este mult
uşurată şi de faptul că, anterele se maturează înainte de deschiderea florilor. De aici rezultă
posibilitatea pe care o au arahidele de a realiza fructe din flori situate la nivelul solului. Totuşi
polenizarea încrucişată poate avea loc foarte rar datorită unor specii de albine (Hera Cr. et al.,
1980).
La început ginoforii au o creştere orientată în sus, iar după şase zile se orientează spre
sol, în care pătrund şi unde încep dezvoltarea fructelor. Fructele încep să crească când ginoforii
ajung la o adâncime de 2–7 cm. Păstăile cresc în poziţie orizontală. În situaţia când florile se află
la o înălţime prea mare pe plante, ginoforii nu pot să ajungă la sol şi nu are loc formarea fructelor
(Pop L. şi colab., 1986).
Formarea păstăilor. În condiţiile de cultură a arahidelor din ţara noastră, formarea
păstăilor are loc foarte lent la început şi accelerat spre sfârşitul perioadei de vegetaţie. Culoarea
cojilor de arahide în curs de formare este alb–gălbuie. Pe măsură ce se apropie de momentul
recoltării arahidele primesc o culoare specifică soiului. La începutul formării păstăilor, cojile
sunt netede. Pe măsură ce cresc şi se apropie de maturizare, apare la suprafaţa lor un desen
reticular. Desenul reticular începe să se contureze din momentul în care seminţele au mărimea
unor boabe de mazăre şi începând de la locul de legătură al păstăii cu ginoforul. Apariţia
16
desenului reticular se încheie la vârful păstăii. Mărimea boabelor este un caracter de soi, dar la
acelaşi soi se înregistrează diferenţe mari în funcţie de condiţiile pedoclimatice şi de tehnologia
aplicată (Pîrşan P., 1998).
2.3. Cerinţele faţă de climă şi de sol
Temperatura: În perioada de la semănat la răsărire, temperaturile extreme sunt de 15ºC şi
45ºC, temperatura optimă fiind de 30ºC. În această perioadă nevoile de căldură sunt în general
mai mici. Pentru o răsărire rapidă, în 4 -5 zile, are loc numai dacă se realizează o temperatură de
32–34ºC (Gillier P. şi Silvestre P., 1969). În timpul creşterii şi îmbobocirii nevoile de căldură
sunt mai mari, temperatura minimă fiind de 18ºC. La temperaturi inferioare valorii de 10ºC
creşterea plantelor se opreşte, iar la 0,5ºC plantele mor. Cele mai mari pretenţii privind căldura,
alunele de pământ le prezintă în perioada înflorire–fructificare (temperatura minimă fiind de
20ºC), în perioada de maturare temperatura poate să scadă până la 10-12ºC, optimă fiind 25ºC
(Pop L. şi colab., 1986).
Umiditatea: Consumul direct de apă variază între 370-570 mm, iar nevoile de precipitaţii
sunt cuprinse între 450 – 700 mm, cu o bună repartizare pe parcursul perioadei de vegetaţie.
Umiditatea solului este foarte importantă pentru pătrunderea ginoforilor şi formarea păstăilor. În
perioada recoltării este de dorit ca pământul să fie reavăn, pentru a nu adera la păstăi (Pîrşan P.,
1998).
Lumina: Arahidele nu sunt fotoperiodice. Lungimea zilei nu provoacă modificări în ceea
ce priveşte parcurgerea fazelor de vegetaţie. Pop L. et al. (1986) au constatat că perioadele
intermitente de soare sunt benefice pentru înflorire, fecundare şi creşterea păstăilor.
Solul: Alunele de pământ au nevoie de soluri profunde, uşoare şi fertile. Compoziţia
texturală luto–nisipoasă şi nisipo–lutoasă este foarte importantă pentru pătrunderea în sol a
rădăcinilor şi a ginoforilor. Solurile acide şi alcaline, de asemenea, nu sunt prielnice pentru
cultura arahidelor. Valoarea pH- ului trebuie să fie cuprinsă între 6,5–7,5 (Pop L. şi colab.,
1986).
2.4. Tehnologia de cultură a alunelor de pământ
Locul în asolament: În condiţiile ţării noastre este indicat ca arahidele să urmeze în
cultură după prăşitoare la care s-a asigurat o foarte bună combatere a buruienilor. Bune
17
premergătoare pentru arahide sunt cerealele păioase (grâul şi orzul). Leguminoasele pentru boabe
nu sunt indicate ca plante premergătoare pentru alunele de pământ, atât datorită bolilor şi
dăunătorilor comuni cât şi ca urmare a faptului că arahidele nu pot valorifica calitatea acestora ca
premergătoare. În cazul folosirii ca premergătoare a porumbului, trebuie avut în vedere
sensibilitatea mare a arahidelor la acţiunea remanentă a atrazinului. Pentru a preveni atacul de
boli şi dăunători arahidele nu pot reveni pe aceeaşi solă decât după 3-4 ani (Pop L. şi colab.,
1986).
Fertilizarea: Alunele de pământ prezintă un consum relativ moderat de elemente chimice
nutritive, mai ales în zonele calde. Azotul este elementul nutritiv necesar în cea mai mare
cantitate, care se asigură pe cale simbiotică. După azot urmează potasiul, calciul, magneziul şi
fosforul. Potasiul, calciul şi magneziul sunt exportate prin tulpini şi frunze, fosforul în principal
prin boabe şi azotul prin păstăi (62%), tulpini şi frunze (Pîrşan P., 1998).
Îngrăşămintele chimice cu azot. Azotul simbiotic nu asigură în totalitate necesităţile
plantelor. Îngrăşămintele chimice cu azot sunt importante mai ales în primele faze de vegetaţie.
Kornienko M. T., citat de Zamfirescu N. et al. (1958) menţionează obţinerea în regiunea Cherson
din U.R.S.S., a unui spor de recoltă de 600 kg/ha cu ajutorul dozei de N60. Îngrăşămintele cu azot
se aplică înainte de semănat şi încorporarea în sol să se facă prin lucrările de pregătire a patului
germinativ (Pop L. et al., 1986).
Îngrăşămintele chimice cu fosfor. Fosforul este absorbit din sol prin sistemul radicular,
dar în proporţie însemnată, de 39%, după Chahal S.R. şi Virmani M. S. (1973) prin ginofori şi
păstăi, iar majoritatea fosforului absorbit pe această ultimă cale se găseşte în zona fructiferă.
Experienţele efectuate în Senegal de către Giller P. şi Prevot P. (1960) au arătat că diferenţele de
producţie între aplicarea localizată şi cea prin împrăştiere sunt mari la doze mici de îngrăşământ
şi scad pe măsură ce dozele cresc. Când fosforul se administrează sub formă de îngrăşăminte
chimice complexe, aplicarea lui se poate administra şi premergător semănatului, iar încorporarea
în sol se face cu grapa cu discuri.
Îngrăşămintele chimice cu potasiu. Arahidele extrag cantităţi mari de potasiu din sol. Cu
toate acestea, dat fiind aprovizionarea bună a solurilor din ţara noastră cu acest element nutritiv,
nu în toate zonele aplicarea lui ca îngrăşământ este însoţită de sporuri de recoltă. Aplicarea
îngrăşămintelor cu potasiu este indicată să se facă premergător efectuării arăturii de bază şi să se
încorporeze odată cu aceasta (Pop L. şi colab., 1986).
18
Lucrările solului: Arahidele necesită un sol afânat, care să permită pătrunderea
rădăcinilor şi mai târziu a ginoforilor, curat de buruieni, în special în prima parte a perioadei de
vegetaţie, când plantele cresc încet şi pot fi uşor înăbuşite de buruieni.
Arătura adâncă trebuie făcută toamna şi lăsată în brazdă crudă, în cazul terenurilor
nisipoase pentru a nu favoriza spulberarea nisipului. Primăvara când încep să răsară buruieni,
arătura se lucrează cu grapa cu discuri. Ultima lucrare cu grapa cu discuri nu trebuie să
depăşească adâncimea de 10 cm pentru că la semănat boabele să nu fie introduse prea adânc în
sol, ceea ce ar întârzia răsărirea arahidelor. Cu 1–2 zile înainte de semănat terenul se lucrează cu
combinatorul. Lucrarea cu combinatorul perfectează patul germinstiv necesar unui semănat de
calitate (Pîrşan P., 1998).
Sămânţa şi semănatul: Sămânţa folosită pentru semănat trebuie să aparţină unor soiuri
superioare, caracterizate prin productivitate ridicată, randament mare de boabe, compoziţie
chimică favorabilă proteinelor sau grăsimilor. Materialul semincer trebuie să fie păstrat până în
preajma semănatului sub formă de păstăi. Se va reduce astfel atacul de Plodia interpunctella
Hubner (molia fructelor) (Pop L. şi colab., 1986).
Boabele folosite la semănat trebuie să fie sănătoase, mari, cu o puritate şi capacitate
germinativă ridicată şi să fie tratate împotriva bolilor şi dăunătorilor care pot ataca seminţele
introduse în sol la semănat. Mărimea boabelor folosite la semănat influenţează nivelul recoltei.
În Argentina se recomandă boabele de mărime mijlocie, care reprezintă, în general, 70–80% din
producţie (Pietrarelli R. J., 1971). Înainte de semănat, seminţele se tratează cu insectofungicide
care dimunuează pierderile la germinare, ameliorează răsărirea, înlesneşte realizarea desimii
stabilite şi asigură obţinerea unor recolte ridicate (Saese H. şi Fahey G., 2006). Pentru tratarea
seminţelor de arahide se folosesc următoarele produse: Captan 80 WDG 2 g/kg şi Vitavax 1
g/kg. Înainte de semănat, semânţa se tratează cu biopreparatele Rhizobium, cu deosebire în
zonele noi de cultivare a arahidelor (Pop L. şi colab., 1986).
În condiţiile din România, epoca optimă de semănat este determinată de realizarea pe
adâncimea de semănat a unei temperaturi minime de încolţire a seminţelor de 12º C şi de
încălzirea progresivă a vremii. Calendaristic, epoca de semănat corespunde cu ultimele zile din
luna aprilie şi primele zile din luna mai. Semănatul mai timpuriu prelungeşte răsărirea, aceasta
fiind neuniformă şi plantele mucegăiesc în sol. Semănatul realizat cu întârziere conduce
19
întotdeauna la reducerea numărului de păstăi ajunse la maturitate, mai ales în cazul soiurilor
tardive (Pîrşan P., 1998).
Arahidele au capacitatea de a compensa o parte din producţie atunci când au o densitate
mai scăzută, printr-o creştere mai viguroasă şi printr-un număr sporit de păstăi ajunse la
maturitate. Rehm S. şi Espig G. (1976) au recomandat desimi de 220–440 mii plante la hectar. În
India, producţiile ridicate s-au obţinut la desimi de peste 200 mii plante la hectar (Saini J.S. et al.,
1971). În cercetările efectuate la S.D.E. Tîmbureşti (Pop L., Chichea I. şi Pitiş S., 1976),
producţiile au crescut când s-au semănat mai multe boabe în cuib.
Cantitatea de boabe la semănat variază între 60–70 kg/ha, obţinută din 100–120 kg păstăi.
Distanţa între rânduri fiind de 50 cm şi 16-20 cm între plante pe rând, în funcţie de vigurozitatea
de creştere a soiului cultivat. Adâncimea de semănat se realizează la 3-5 cm în zonele calde şi
umede şi de 5-7 cm în zonele cu un climat mai răcoros şi mai puţin umed (Pop L. şi colab.,
1986).
În unele ţări din zonele calde, semănatul se efectuează în teren plan, iar altele pe teren
bilonat în prealabil. Semănatul în teren nebilonat se practică în ţările din Africa. Semănatul în
biloane se practică în ţările cu precipitaţii multe şi pe terenuri mai grele şi cu pante de peste 3-5%
(Pîrşan P., 1998).
Lucrările de îngrijire
Combaterea buruienilor: Plantele de arahide prezintă o creştere foarte înceată în primele
aproximativ 45 de zile de la răsărire, perioada când pot fi uşor înăbuşite de buruieni. De aceea, în
această perioadă trebuie asigurată o combatere eficientă a buruienilor. Combaterea buruienilor se
poate face prin praşile şi cu ajutorul erbicidelor. Prima praşilă se aplică în primele 15 zile de la
răsărire. Praşila a doua se efectuează în momentul în care începe înflorirea (la 30–40 de zile) şi
urmăreşte să asigure luminozitatea necesară în acest stadiu vegetativ (Pop L. şi colab., 1986).
La arahide bilonarea este necesară pentru realizarea unui strat de sol afânat capabil să
permită pătrunderea ginoforilor şi formarea păstăilor. Bilonarea este necesară mai ales dacă solul
este predispus tasării şi formării de crustă la suprafaţă. Nu este necesară bilonarea la soiurile
târâtoare, care aparţin subspeciei procumbens. Bilonarea se face la începutul înfloririi şi înainte
de a forma primii ginofori. Întârzierea bilonării poate determina vătămarea ginoforilor şi poate
lipsi plantele de posibilitatea de a forma păstăi din primele flori, care au şansele cele mai mari de
a ajunge la maturitate (Pîrşan P., 1998).
20
Combaterea chimică a buruienilor, metodă folosită pe scară largă în agricultura modernă,
se foloseşte şi în cultura arahidelor. La pregătirea patului germinativ pot fi încorporate în sol
erbicidele Stomp 330 E 4 l/ha şi Dual Gold 960 EC 1-1,5 l/ha. După semănat, în timpul perioadei
de vegetaţie se folosesc erbicidele Basagran forte 2-2,5 l/ha şi Fusilade forte 0,8 l/ha pentru
buruienile monocotiledonate anuale (Pop L. şi colab., 1986).
Bolile şi mijloacele de combatere a lor:
Cercosporioza este boala provocată de Cercospora arachidicola Hori şi de
Cercospora personata. Plantele bolnave prezintă pe frunze pete întunecate sau negre. Boala se
transmite prin rezidurile plantelor bolnave, care rămân în sol, prin plantele spontane şi prin
inoculări la păstăi. Sporii ciupercii pot fi transportaţi pe distanţe mari de vânt şi insecte. Pentru
prevenirea atacului de Cercospora se recomadă cultivarea de soiuri rezistente, revenirea culturii
pe acelaşi teren numai după 2–4 ani, îngroparea rezidurilor plantelor bolnave adânc în sol sau
arderea lor (Pop L. şi colab., 1986).
Botritis cinerea Pers. provoacă putregaiul cenuşiu. Boala se manifestă prin
putrezirea bazei tulpinilor şi ramurilor, pe care apare ca un puf de culoare cenuşie–violacee,
alcătuit din miceliul şi organele de fructificare a ciupercii. Pe păstăi atacul se manifestă când
întârzie recoltarea şi le imprimă acestora un gust amar. Apariţia bolii se poate preveni prin rotaţie
raţională, arături adânci, distrugerea resturilor vegetale bolnave şi prin tratamente cu Captan 50
0,3% la apariţia primelor simptome de atac (Pop L. şi colab., 1986).
Ascochyta arachidis War. produce pătarea brună a frunzelor. Boala se manifestă
prin apariţia pe frunze de pete circulare brune, apoi cenuşii şi delimitate de o dungă brună–
închis. Atacul se previne prin revenirea arahidelor pe acelaşi teren după 3 ani, arături adânci,
îndepărtarea resturilor la recoltare şi prin tratarea seminţelor cu formalină 0,25% (Pop L. şi
colab., 1986).
Fusarium vasinfectum Atk. produce fuzarioza arahidelor sau veştejirea plantelor.
Primele simptome ale bolii apar în perioada înfloririi şi constau în aplecarea bruscă sau treptată a
frunzelor. La suprafaţa tulpinii, în zona coletului, apare pe vreme umedă un mucegai alb sau roz
format din miceliul şi fructificaţiile ciupercii. Se previne şi se combate prin: folosirea la semănat
de sămânţă sănătoasă, rotaţie care să asigure revenirea arahidelor pe acelaşi teren numai după 3–
4 ani şi soiuri rezistente şi tratamente la sol (Pop L. şi colab., 1986).
21
Sclerotium omnivorum V.d. Wolk produce putrezirea rădăcinilor şi tulpinilor.
Atacul se manifestă pe tulpini, rădăcini şi fructe, printr- un mucegai albicios, ce reprezintă
miceliul ciupercii, în care apar mai târziu scleroţii sub forma unor corpuşoare negre, mici, de 2-3
mm diametru şi tari. Se previne şi se combate prin: o rotaţie raţională a culturilor, agrotehnică
superioară, eliminarea plantelor bolnave şi prin tratarea seminţelor cu Captan 80 în doză de 250 g
la 100 kg seminţe (Pop L. şi colab., 1986).
Fusarium martii Bark. provoacă putrezirea rădăcinilor. Acesta atacă plantele în
toate fazele de dezvoltare, efectând mai mult sistemul radicular. Rădăcinile plantelor atacate se
acoperă cu un puf alb–roşcat format din miceliul ciupercii şi în final putrezesc. Se previne şi se
combate prin: o rotaţie raţională a culturilor, agrotehnică superioară, eliminarea plantelor
bolnave şi prin tratarea cu fungicide (Pop L. şi colab., 1986).
Dăunătorii şi mijloacele de combatere a lor:
Melolontha hypocastanea Fabr. (viermii albi) atacă arahidele prin roadere totală
sau parţială a rădăcinilor sau tulpinilor la câţiva centrimetri sub nivelul solului. Atacul începe
odată cu încălzirea mai accentuată a timpului şi respectiv a solului. În condiţiile nisipurilor din
sudul Olteniei, atacul viermilor albi se manifestă intens pe vârful dunelor. Viermii albi se pot
combate cu insecticide la sol pe toată suprafaţa cultivată sau numai localizat în zonele cunoscute
ca foarte infestate (Pop L. et al., 1986).
Plodia interpunctella Hubner. sau molia fructelor se întâlneşte în spaţiile de
depozitare a arahidelor. Are 2-3 generaţii pe an. Fluturele îşi depune ponta pe boabe. Când
acestea sunt decojite, atacul este foarte mult înlesnit, în schimb când recolta se găseşte depozitată
sub formă de păstăi sunt atacate numai păstăile care prezintă crăpături ce oferă posibilitatea
fluturilor să îşi depună ouăle pe boabe. Se combate prin măsurile preventive ce privesc produsele
agricole depozitate (Pop L. şi colab., 1986).
Nematozii provoacă pagube mari culturilor de arahide în numeroase ţări
cultivatoare. În S.U.A. se apreciază că 80 % din suprafaţa cultivată cu arahide este infestată cu
nematozi (Wells C.J, 1972).
Careydon fuscus Goeze. ( sin. gonagra) este un coleopter care se găseşte în câmp
şi se aduce în locurile de depozitare odată cu recolta, produce pagube mari în Africa Occidentală
la arahidele nedecortificate. Larvele tinere pătrund în păstăi şi găuresc boabele. Larvele ajunse la
22
maturitate se metamorfozează în păstăi sau între păstăi învecinate. Pentru prevenirea atacului
este necesară dezinfectarea depozitelor (Pop L. şi colab., 1986).
În zonele nisipoase din sudul Olteniei, în funcţie de regimul precipitaţiilor din cursul
verii, sunt necesare 8 udări a câte 300-350 m3/ ha. Pe solurile cernoziomice, numărul udărilor se
reduce până la 5, însă norma de udare va fi de 400-500 m3/ ha (Pîrşan P., 1998).
Recoltarea, condiţionarea şi păstrarea recoltei
Epoca optimă de recoltare a arahidelor este înainte de venirea brumelor, când
temperaturile medii zilnice încep să scadă sub 12ºC. Aceasta corespunde cu ultima decadă a lunii
septembrie. Recoltarea se face prin smulgerea tufelor şi culegerea păstăilor de pe vreji. Se vor
reţine numai păstăile ajunse la maturitate deplină. Pe solurile uşoare şi reavene, la smulgerea
manuală nu rămân, în mod obişnuit, păstăi mature în sol. Când pământul este uscat şi la smulgere
se rup tulpini şi rămân păstăi în sol se recomandă folosirea dislocatorului premergător smulgerii
plantelor (Pop L. şi colab., 1986).
La recoltare, păstăile au un conţinut foarte mare de apă (40-50%) şi din acest motiv ele
mucegăiesc uşor. Pentru a preveni acest lucru, este necesară uscarea pătăilor la soare în strat
subţire şi uscătorii. O păstrare bună se poate asigura dacă în momentul depozitării păstăile au un
conţinut de apă dub 8-10% (Pîrşan P., 1998).
23
CAPITOLUL III
AGENŢII MUTAGENI UTLIZAŢI ÎN CADRUL STUDIULUI
3.1. Sulfatul de dimetil – DMS
Sulfatul de dimetil (sulfat neutru de metil – figura 3.1) este un lichid incolor sau uşor
gălbui, cu uşor miros de ceapă. Substanţa este toxică, corosivă şi mutagenă (Vyskocil A., 1999;
Rippey J. C. R. şi Stallwood M. I., 2005; Pohanish R. P., 2008). Dimetil sulfatul este un compus
chimic cu formula (CH3O)2SO2 şi cu greutatea moleculară de 126,14 g/mol (Brown Terry A.,
1998; Pohanish R. P., 2008).
Cercetările au arătat că, sulfatul de dimetil a determinat inhibarea ADN-ului, deteriorarea
celulelor somatice umane şi schimburile dintre cromatidele surori în celulele fibroblaste umane
(Pohanish R. P., 2008).
Nu are un miros puternic sau iritaţii imediate pentru a putea depista concentraţia letală
din aer. Expunerea pe termen lung la acest reactiv poate determina afecţiuni ale rinichilor,
ficatului şi sistemului nervos la om, în timp ce, la animale poate produce cancerul (Pohanish R.
P., 2008).
Acest agent mutagen este solubil în apă, eter, alcool, acetonă, hidrocarburi aromatice şi
puţin solubil în hidrocarburile alifatice (National Toxicology Program, 2011).
Figura 3.1. Sulfat de dimetil - formula stucturală (http://en.wikipedia.org/wiki/Dimethyl_sulfate)
Utilizat în sinteze organice, este cunoscut ca reactiv de metilare a fenolilor, aminelor şi
tiolilor (IARC, 1999; National Toxicology Program, 2011). De asemenea acest reactiv este
utilizat ca solvent pentru separarea uleiurilor minerale, pentru analiza fluidelor auto (National
Toxicology Program, 2011).
24
Sulfatul de dimetil poate afecta clivajul specific de bază, la guanina din ADN prin
ruperea inelelor de imidazol prezente în guanină (Cartwright I. L şi Kelly S. E., 1991; Rippey J.
C. R. şi Stallwood M. I., 2005).
Unii cercetători consideră această substanţă a fi o posibilă armă chimică (National
Toxicology Program, 2011).
3.2. Azida de sodiu – SA
Azida de sodiu (NaN3) (figura 3.2.) se obţine prin reacţia protoxidului de azot cu amidura
sodică sau din hidrazină, nitrit de etil şi sodă caustică. Se prezintă sub formă de paiete cristaline,
incolore. Este solubilă în apă, puţin alterabilă la umiditate, dar alterabilă în contact cu dioxidul de
carbon din aer. Este sensibilă la şoc, ca fulminantul de mercur, ea este mai puţin sensibilă decât
acesta la căldură. Utilizată la prepararea explozivilor de amorsare pentru detonatoare.
Poate exista pericolul de explozie sau formare de gaz toxic cu următoarele substanţe:
acizi, metale grele, săruri de metale, brom, dimetilsulfat, cupru, diclormetan, disulfură de carbon
şi acid sulfuric.
Este iritantă pentru ochi, piele, mucoase şi tractusul respirator. Pregătirea soluţiei de
azidă de sodiu trebuie realizată cu echipament de protecţie pentru a preveni inhalarea.
Formula chimică: NaN3
Figura 3.2.- Azidă de sodiu - formula structurală
(http://en.wikipedia.org/wiki/File:Sodium_azide.svg)
Azida de sodiu este considerată a fi un agent mutagen chimic foarte puternic în cultura
plantelor. Plantele mutante rezultate în urma tratamentulului cu azidă de sodiu sunt capabile să
supravieţuiască în condiţii de mediu diferite, au un randament mai bun şi sunt tolerante la stres în
comparaţie cu plantele normale (Fahad Al. Q şi Salim K., 2009).
25
Efectul mutagen reiese din producerea unui metabolit anorganic din azida de sodiu. Acest
metabolit intră în nucleu, interacţionează cu ADN- ul şi creează mutaţii punctiforme în genomul
plantelor (Owais W.M. şi Kleinhofs A., 1988).
3.3. Etil metansulfonat - EMS
Etil metansulfonatul (figura 3.3.) determină introducerea în structura nucleotidelor a unor
grupări alchil: la nivelul atomului din poziţia 7 din structura guanidinei (cel mai adesea), în
poziţia 3 a adeninei, foarte rar în poziţia 1 a adeninei. De asemenea, prezenţa grupării alkil la
nivelul guanidinei, slăbeşte legătura β- glucozidică şi determină eliminarea guaninei
(depurinare), cu formarea unor breşe în structura ADN. Bazele azotate pirimidinice sunt mai
rezistente la acţiunea agenţilor alkilanţi, deşi etil metansulfonatul poate determina uneori
alchilarea citozinei. Alkilarea este însoţită de fenomene de denaturare a ADN-ului sau de
formarea unor legături încrucişate sau transversale între nucleotide, ceea ce împiedică
împerecherea normală. Etil metansulfonatul prezintă o eficienţă crescută în modificarea
materialului genetic, atât al celulelor procariote cât şi al celor eucariote.
Etil metansulfonatul este un lichid incolor. Este iritant pentru ochi, piele, mucoase şi
tractusul respirator. Pregătirea soluţiei de etil metansulfonat trebuie realizată cu echipament de
protecţie pentru a preveni inhalarea.
Formula chimică: CH3SO3C2H5
Figura 2.3 Etil metansulfonat- formula structurală
(http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ethyl-mesylate-2D-skeletal.svg)
Masa molară: 124,2 g/mol.
26
CAPITOLUL IV
PROIECTAREA PLANULUI EXPERIMENTAL PENTRU REALIZAREA TEMEI
ALESE
4.1. Obiectivele tezei de doctorat
În prezent, se cunosc un număr foarte mare de substanţe chimice cu efect mutagen.
Modificările produse de ele sunt asemănătoare cu cele ale mutaţiilor spontane. Nici una nu
posedă specificitate pentru inducerea unui anumit tip de mutaţie. Acţiunea acestor substanţe
provoacă în organismul în care au pătruns modificări biochimice şi fiziologice. La nivelul
cromozomilor se produc ruperi cromozomice şi ca urmare reconstrucţii de diferite tipuri, corelate
cu modificări fenotipice. La nivelul genei se produc mutaţii genice. Întreaga acţiune a
substanţelor depinde de foarte mulţi factori.
Scopul principal al cercetărilor este urmărirea efectelor tratamentelor cu substanţe
chimice atât în condiţii de câmp cât şi de laborator, în ideea surprinderii diferenţelor de
sensibilitate a speciei la acţiunea substanţelor mutagene, efecte surprinse prin aplicarea unor
metode fiziologice, biochimice şi citogenetice.
În selecţia şi ameliorarea plantelor cu importanţă economică, un prim pas îl constituie
obţinerea unui material biologic foarte divers, inducerea unei variabilităţi individuale de largă
amplitudine. În practică s-a dovedit că tendinţa spre variabilitate, manifestată la orice specie,
creşte în urma intervenţiei cu diverşi factori fizici, chimici sau biologici, cunoscuţi sub
denumirea de factori mutageni.
Prin programul de ameliorare se va urmări obţinerea unor linii care să aibă însuşiri
valoroase privind productivitatea, calitatea producţiei, precocitate, rezistenţa la temperaturi
scăzute, secete, boli şi dăunători şi pretabile pentru mecanizare.
Capacitatea de producţie este controlată de mai multe gene şi este dată de numărul de
păstăi ajunse la maturitate în momentul recoltării, de mărimea acestora şi de procentul de boabe
din greutatea păstăilor.
27
Calitatea recoltei se urmăreşte sub aspectul compoziţiei chimice, şi anume a procentului
de grăsimi, când se urmăreşte realizarea de soiuri pentru extragerea uleiului şi a procentului de
proteine ridicat şi de grăsimi mai moderat (sub 47%) când scopul ameliorării este obţinerea de
soiuri pentru consumul sub formă prăjită. De mare importanţă este şi prezenţa cantitativă a
aminoacizilor esenţiali şi valori scăzute ale indicelui sodic şi al acidităţii.
În cazul arahidelor cultivate pentru consum sub formă prăjită, calitatea interesează şi sub
aspectul procentului de păstăi cu un anumit număr de boabe şi culoarea boabelor, în privinţa
căreia există preferinţe ridicate în anumite ţări şi pentru anumite categorii de consumatori.
Precocitatea constituie un obiectiv de ameliorare important, atât în ţările cu climat în care
alternează perioadele ploioase cu secetoase, cât mai ales în ţările situate la limita nordică a
arealului de cultivare a arahidelor. Precocitatea se apreciază după numărul de zile de la răsărire la
înflorire, procentul de păstăi ajunse la maturitate din totalul păstăilor şi dacă boabele din păstaie
prezintă sau nu repaus germinativ ( soiurile timpurii nu au repaus germinativ şi deci boabele din
păstăi pot să încolţească în sol înainte de recoltare).
Rezistenţa tinerelor plante la temperaturi scăzute şi la oscilaţii bruşte de temperatură
constituie un obiectiv de ameliorare pentru ţările situate la limita nordică a arealului de cultivare
a arahidelor, cum este şi ţara noastră.
Un obiectiv al ameliorării pentru toate zonele de cultură a arahidelor îl constituie
realizarea de soiuri rezistente la secetă, cu deosebire în perioada înfloririi şi formării fructelor. În
vederea recoltării mecanizate este necesar ajungerea la maturitate a unui număr cât mai mare de
păstăi.
Cercetările şi observaţiile realizate au urmărit atingerea următoarelor obiective:
evaluarea cadrului natural, a condiţiilor pedoclimatice, în vederea aprecierii gradului de
favorabilitate pentru cultura arahidelor;
inducerea unor mutaţii cu ajutorul substanţelor chimice în vederea creşterii variabilităţii
speciei Arachis hypogaea L.;
studiul efectului unor substanţe chimice mutagene asupra particularităţilor morfo-
fiziologice la specia Arachis hypogaea L.;
comportarea unor mutante în ceea ce priveşte identificarea de forme biologice valoroase,
în scopul productivităţii;
28
4.2. Materialul biologic folosit
În calitate de material biologic pentru cercetări au fost folosite seminţe de Arachis
hypogaea L., soiurile Tâmbureşti, Jelud, Braziliene negre şi linia L 9184 de la Universitatea din
Craiova din cadrul Facultăţii de Agricultură.
Soiul Tâmbureşti a fost obţinut prin selecţie individuală din populaţia Tâmbureşti. Face
parte din subspecia fastigiata, subtipul Natal Spaniol. Plantele au înălţimea cuprinsă între 30-45
cm, în medie 35 cm şi un număr de 7 tulpini. Portul plantei este erect, frunzele sunt de culoare
verde, compuse din două perechi de foliole lungi de până la 8,6 cm şi late de până la 4,3 cm.
Numărul de flori la o plantă variază între 250-350 şi sunt de culoare galben-portocalie.
Ginoforii au o lungime de până la 21 cm. La recoltare o plantă prezintă între 16-35 de păstăi, iar
greutatea medie a unei păstăi este de 1,43 g. Păstăile au o lungime variabilă, cuprinsă între 0,9 şi
4,7 cm şi o lăţime de 0,7 şi 1,9 cm, o culoare brună-deschis şi sunt de formă cilindrică. Numărul
de boabe în păstăi variază de la 1 la 3, majoritatea păstăilor având 2 boabe.
Cât priveşte însuşirile biologice, soiul Tâmbureşti este semitimpuriu, având o perioadă de
vegetaţie de 130-140 de zile. Primele flori apar, în funcţie de data semănatului şi de condiţiile
climatice din perioada după semănat, între 5-10 iunie. Înflorirea continuă apoi în tot cursul verii
până spre sfârşitul lunii august. Plantele sunt rezistente la boli şi păstăile nu încolţesc în sol în
perioada premergătoare recoltării. Boabele au un conţinut în grăsimi de până la 51,1% şi 28%
proteine (figura 4.1).
Figura 4.1–Soiul Tâmbureşti
Soiul Jelud a fost obţinut la Institutul de cercetări pentru cultura plantelor uleioase din
U.R.S.S. şi aparţine subspeciei fastigiata. Plantele au talie mică şi portul erect. Aparatul foliar
este redus, numărul de flori la o plantă variază între 160-210 şi sunt de culoare galben-
portocalie. Ginoforii sunt scurţi, iar la recoltare pe o plantă se găseşte un număr de 10-30 păstăi,
29
din care mature circa 85%. Păstăile au o culoare brună-deschisă spre galben şi formă cilindrică.
Majoritatea păstăilor au două boabe şi sunt puternic reticulate, iar la recoltare acestea reţin o
cantitate mare de pământ.Bo abele au formă cilindrică şi o culoare brună către roz ( figura 4.2.).
Figura 4.2 - Soiul Jelud
Soiul Jelud este timpuriu având o perioadă de vegetaţie de 120-135 de zile. Primele flori
apar la cca. 20 de zile de la răsărire în ultimele zile ale lunii mai-începutul lunii iunie. Înflorirea
continuă până la sfârşitul lunii iulie. Partea supraterestră a plantelor acoperă mai slab solul, iar
ciorile provoacă pagube mari prin scoaterea păstăilor din pământ şi consumarea boabelor în
perioada imediat premergătoare recoltatului.
Dacă se întârzie cu recoltarea şi timpul este cald, iar solul este umed, unele păstăi
putrezesc şi un procent ridicat de boabe din păstăi încolţesc, de unde reiese lipsa unui repaus
germinativ al seminţelor. Boabele au cca. 50% grăsimi şi cca. 25% proteine.
Soiul Braziliene negre prezintă plante cu talie înaltă, un număr mai mare de tulpini şi port
erect. Plantele asigură o foarte bună acoperire a solului. La recoltare numărul de păstăi în medie
este de 24-28, acestea au o formă cilindrică, foarte fin reticulate şi cu un rostru uşor încovoiat.
Numărul de boabe la o păstaie variază între 1 şi 4, majoritatea 3 boabe, iar MMB-ul în medie
400g (figura 4.3).
Figura 4.3 – Soiul Braziliene negre
30
Boabele sunt negre, cu o formă apropiată de cilindrică, cu unele feţe turtite, determinat
de poziţia pe care o ocupă în păstăi. Soiul braziliene negre este timpuriu, cu o perioadă de
vegetaţie de 130-140 zile.
Plantele au o creştere uniformă şi o rezistenţă mare la boli. Vegetaţia plantelor este
întreruptă de coborârea temperaturii medii zilnice sub 12°C, care are loc la începutul lunii
octombrie. Boabele au un conţinut de grăsimi între 47-51 % şi de proteine între 27-28%.
4.3. Metodele de cercetare
4.3.1. Metoda de efectuare a tratamentelor la seminţe şi aşezarea experienţei în câmp
Pentru realizarea obiectivelor de cercetare propuse s-a stabilit un program de lucru
necesar parcurgerii tuturor etapelor ce s-au desfăşurat în câmp şi în laborator.
În urma documentării, am constatat că literatura de specialitate străină este destul de
bogată în ceea ce priveşte cercetările privind sistematica, tehnologia de cultivare şi compoziţia
chimică a acestei plante.
În România, cercetările referitoare la ameliorarea speciei Arachis hypogaea L., sunt
destul de puţine.
Pentru a testa rezistenţa formelor biologice luate în studiu, şi de asemenea pentru a
provoca o variabilitate cât mai mare în cadrul acestora, seminţele au fost tratate cu cele trei
substanţe chimice mutagene. Etilmetansulfonatul şi sulfatul de dimetil au fost în doze de 0,2%,
0,4%, 0,6% şi 0,8%, iar azida de sodiu a fost în doze de 0,02%, 0,04%, 0,06% şi 0,08%, fiecare
concentraţie având ca timp de acţiune de şase ore.
După efectuarea tratamentelor cu substanţe chimice mutagene seminţele au fost uscate,
apoi semănate în câmpul experimental al disciplinei de Ameliorarea plantelor, din cadrul
fermei Ezăreni, în blocuri randomizate cu trei repetiţii (figura 4.4).
31
Figura 4.4.– Aspecte din câmpul experimetal – Ferma Ezăreni, 2012
Semănatul s-a efectuat manual, primăvara când pe adâncimea de semănat se înregistrează
12ºC şi vremea este spre încălzire. Combaterea buruienilor s-a realizat manual, prin praşile şi
pliviri. Nu s-au folosit erbicide sau substanţe chimice de sinteză pentru combaterea bolilor sau
dăunătorilor.
În cadrul experienţei, în generaţia M1 şi M2, s-au făcut observaţii privind influenţa
agenţilor mutageni chimici asupra următoarelor caractere:
gradul de răsărire al plantelor în câmp
gradul de supravieţuire al plantelor în câmp
înălţimea plantelor
numărul de ramuri principale pe plantă
numărul de boabe pe plantă
numărul de păstăi pe plantă
greutatea boabelor pe plantă
masa a o mie de boabe
32
4.3.2. Metode statistice de prelucrare a datelor
Datele obţinute în urma observaţiilor şi determinărilor efectuate au fost prelucrate
statistic conform modelelor consacrate, menţionate în literatura de specialitate (Snedecor, 1968,
Săulescu N. A., 1967, Ardelean, 1994, Onisie, 1992, Jităreanu, G., 1994, Leonte C., 1997).
Semnificaţia diferenţelor dintre variantele tratate şi martor se vor determinate prin
metoda diferenţelor limită ( DL 5%, 1% şi 0,1%). Caracterele cantitative se vor interpreta
statistic cu ajutorul analizei varianţei şi al coeficientului de variabilitate (s%) ( Săulescu N. A.,
1967).
4.3.3. Metode citogenetice
Investigaţiile citogenetice vor fi realizate pe meristeme radiculare obţinute prin
germinarea seminţelor provenite de la specia Arachis hypogaea L., soiurile Tâmbureşti, Jelud,
Braziliene negre şi linia L 9184.
Pentru colorarea materialului nuclear, respectiv a cromozomilor, se va folosi metoda
rapidă Feulgen, elaborată în anul 1924 de F. Feulgen şi H. Rossenbeck şi modificată de J. A.
Tomasi în 1936 (Tudose, 1996). Metoda se bazează pe faptul că în celulele aflate în diviziune
numai cromatina cromozomilor se colorează selectiv în roşu-violet cu fuxină bazică, în timp ce
ARN-ul din nucleoli şi din citoplasmă, precum şi toate celelalte elemente celulare nu se
colorează.
4.3.3.1. Efectul substanţelor chimice mutagene asupra facultăţii şi energiei
germinative a seminţelor
Germinaţia reprezintă procesul fiziologic de trecere a seminţelor din starea de repaus, de
viaţă latentă, în stare de viaţa activă şi se pune în evidenţă prin transformări biochimice intense,
prin creşterea embrionului. Acest proces nu presupune acumularea de substanţe organice din
mediul extern, ci o nouă repartiţie a celor de rezervă depozitate în sămânţă în timpul formării ei.
Facultatea germinativă măsoară capacitatea semințelor de a germina, exprimată prin
procentul numeric de semințe germinate normal în condiții optime şi într-un timp stabilit pentru
fiecare specie în parte (Mogârzan Aglaia şi colab., 2004).
33
Energia germinativă reprezintă testul prin care se determină viteza de germinare a
seminţelor şi se exprimă prin procentul de seminţe germinate într-o perioadă egală cu 1/3 din
durata stabilită pentru determinarea facultăţii germinative (Starodub, 2008).
Numărul de zile stabilit pentru determinarea energiei germinative a fost de 3 zile, iar cel
pentru stabilirea facultăţii germinative a fost de 9 zile.
După 3 zile se vor număra şi vor fi eliminate din fiecare probă seminţele care vor germina
şi se va calcula valoarea procentuală a energiei germinative (figura 4.5.). Media seminţelor
germinate normal, aflată la prima numărare, reprezintă energia germinativă, care se exprimă în
procente deoarece corespunde la 100 de seminţe.
Figura 4.5. – Seminţe de arahide germinate
Se vor îndepărta la prima numărare seminţele germinate normal cât şi cele mucegăite.
Restul seminţelor se vor lăsa în continuare la germinat până la următoarea numărătoare.
După 9 zile se vor număra restul seminţelor, iar la fiecare probă se va adăuga numărul de
seminţe obţinut la prima citire. La a doua numărătoare, media aritmetică a numărului total de
seminţe germinate normal reprezintă facultatea germinativă (Boldor şi colab., 1983).
4.3.3.2. Efectul substanţelor chimice mutagene asupra ritmului de creştere în
lungime a rădăciniţelor şi tulpiniţelor
Ritmul de creştere a rădăciniţelor şi tulpiniţelor plantelor provenite din boabe tratate cu
agenţi mutageni fizici, chimici sau biologici constituie un criteriu de apreciere a sensibilităţii
materialului biologic, relativ expeditiv, deoarece poate fi urmărit nu numai în câmp ci şi în
laborator sau case de vegetaţie (Ţîrdea Gh., 1984).
34
Pentru determinarea ritmului de creşte în lungime a rădăciniţelor şi tulpiniţelor se vor
realiza măsurători la intervale constante de timp. Intensitatea creşterii se va exprima prin sporul
parametrilor analizaţi, raportaţi la unitatea de timp (o zi, 3 zile), în funcţie de periodicitatea
măsurătorilor efectuate.
În cazul nostru pentru a pune în evidenţă modificările apărute în procesul de creştere al
rădăciniţelor precum şi influenţa substanţelor folosite asupra intensităţii procesului de creştere se
vor efectua măsurători liniare la un interval de 3, 6 şi 9 zile (figura 4.6).
Figura 4.6. - Măsurarea rădăciniţelor de arahide
4.3.3.3. Identificarea şi frecvenţa aberaţiilor cromozomice în mitoză.
Pentru identificarea aberaţiilor cromozomice şi a frecvenţelor acestora se va utiliza
metoda clasică care presupune următoarele etape (Ţîrdea şi Leonte, 2003):
- fixarea;
- hidroliza;
- colorarea;
- efectuarea preparatelor microscopice;
- examinarea preparatelor la microscop.
Fixarea
Când rădăciniţele vor ajunge la lungimea de 1-1,5 cm acesteavor fi introduse în fixatorul
Carnoy I (soluţie de alcool etilic absolut: acid acetic glacial în proporţie de 3:1) la temperatura
camerei, timp de 24 de ore (figura 4.7.).
35
Fixarea are rolul de a omorî celulele în starea în care se află în acel moment, proces care
are loc foarte repede, aproape instantaneu. Prin fixare trebuie să se păstreze structura fină a
tuturor organitelor celulare. În afară de aceasta, prin fixare biocoloizii celulei se coagulează şi ca
urmare, constituenţii celulari se pot colora cu diferiţi coloranţi.
Până în momentul prelucrării rădăciniţelor în vederea colorării, acestea vor fi păstrate în
frigider, în soluţie de alcool etilic 70%.
Figura 4.7. – Fixarea rădăciniţelor recoltate la Arachis hypogaea L.
Hidroliza
Are drept scop macerarea ţesuturilor prin dizolvarea parţială a substanţelor pectice dintre
celule, prin care se uşurează procesul de colorare şi apoi de etalare a celulelor între lamă şi
lamelă.
Rădăciniţele fixate vor fi spălate cu apă distilată, apoi introduse în soluţie de HCl 1 N şi
lăsate timp de 14 minute la etuvă la temperatura de 60°C (figura 4.8.).
Figura 4.8. – Hidroliza rădăciniţelor de arahide
36
Colorarea materialului biologic
Se va efectua prin menţinerea rădăciniţelor în soluţie de carbol-fuxină modificată 10%
(Carr şi Walker, 1961), la frigider, până în momentul în care vârful acestora devine mai intens
colorat (circa 24 de ore). Zona apexului radicular se va colora mai repede şi mai intens întrucât
aici majoritatea celulelor se află în diviziune, în timp ce restul rădăciniţei, unde frecvenţa
diviziunilor este scăzută (celulele sunt mari şi alungite) rămâne vizibil necolorată. Acest colorant
determină colorarea nucleelor şi cromosomilor în roşu-violaceu, citoplasma fiind roz-pal.
Principiul acestei metode de colorare constă în reacţia grupelor aldehidice ale ADN eliberate prin
hidroliza HCl 50% cu fuxina bazică din colorantul Carr (figura 4.9.).
Figura 4.9 – Colorarea rădăciniţelor de arahide
Efectuarea preparatelor microscopice-metoda squash
Pe o lamă de microscop curată, uscată şi degresată, într-o picătură de colorant Carr cu
ajutorul unei pensete se pun rădăciniţele unui bob de arahidă. Cu ajutorul unui ac spatulat sau a
unei lame de bărbierit se vor tăia 1-2 mm din vârful colorat al rădăciniţelor (ale unui singur bob)
peste care se pune o lamelă curată şi degresată.
Cu ajutorul unei hârtii de filtru se fixează lamela pe lamă astfel încât să se absoarbă
excesul de colorant Carr şi în acelaşi timp să se evite glisarea lamelei pe lamă. Cu ajutorul unui
băţ de chibrit se loveşte lamela (în zona unde se află rădăciniţa) la început mai slab, apoi mai
puternic, pentru a se asigura o etalare perfectă a celulelor şi cromozomilor metafazici.
37
După etalare, între lamă şi lamelă, trebuie să se observe cu ochiul liber un strat foarte fin,
abia perceptibil, de material colorat în roşu-violet. Şi această operaţiune trebuie efectuată cu
mare grijă pentru a se evita glisarea lamelei pe lamă. De la locul iniţial, fapt ce duce la
rostogolirea celulelor şi compromiterea parţială sau totală a preparatului.
Examinarea preparatelor la microscop
Observarea preparatelor la microscop se va efectua în lumină puternică, la început cu
obiectivul 10x, cu ajutorul căruia se examinează preparatul în mare, iar citirea preparatului se va
face la obiectivul 40x. Datele obţinute vor ajuta la calcularea indicelui mitotic şi a frecvenţei
tipurilor de celule aflate în diviziune mitotică.
Efectuarea fotografiilor.
Fotografiile se vor realiza cu ajutorul aparatului digital Cannon, adaptat microscopului
optic Hund – Wetzlar, aflat în dotarea laboratului L.E.C.O.M. la obiectivul de 100x cu imersie.
Se vor realiza fotografii celulelor aflate în interfază, profază, metafază, anafază şi
diferitelor tipuri de aberaţii cromosomiale întâlnite.
În urma analizei fazelor mitozei se va determina indicele mitotic. Acesta reprezintă
procentul de celule aflate în diviziune, faţă de numărul total de celule analizate (Ţîrdea şi Leonte,
2003). Indicele mitotic se va calcula utilizând următoarea formulă:
Im% = N m X 100
N t , unde
Im = indicele mitotic;
Nm = numărul de celule aflate în diviziune;
Nt = numărul total de celule analizate.
4.3.4. Metode fiziologice
4.3.4.1. Determinarea conţinutului de pigmenţi asimilatori din frunze pe cale
spectrofotometrică
38
Pentru experimentare se va utiliza material vegetal recoltat în fenofaza de creştere a
frunzelor, înflorire şi coacerea boabelor.
Se cântăresc 0,2-1g material proaspăt şi se introduc într-un mojar. Se adaugă nisip de
cuarţ şi un vârf de cuţit (amestec în părţi egale) de CaCO3 şi MgCO3. Carbonatul de calciu este
folosit în vederea neutralizării sucului celular vacuolar rezultat în urma distrugerii celulelor şi
care, prin aciditatea sa, fixează Mg din moleculele de clorofilă, transformându-le în feofitine
(Boldor şi colab., 1983).
Materialul, în care se adaugă 2-3 ml acetonă 85%, se triturează bine timp de câteva
minute. Cu ajutorul unei hârtii pH se controlează reacţia extractului, care nu trebuie să fie acidă.
După tritrurarea completă a ţesutului vegetal asimilator, acest omogenat se filtrează
printr-o pâlnie cu rondele de hârtie de filtru Watmann. Omogenatul se spală de mai multe ori
până la completa decolorare a ţesutului vegetal (1g-10ml acetonă).
Se adaugă apoi alţi 4-5 ml acetonă 85%, iar conţinutul se filtrează în balon cotat de 25
ml. Se aduce la semn cu acetonă. Extractul astfel obţinut se introduce în cuva aparatului, iar ca
martor se foloseşte numai soluţie de acetonă 85% (Jităreanu Carmen şi colab.; 2011) (figura
4.10).
Figura 4.10 - Extragerea pigmenţilor clorofilieni din frunzele de Arachis hypogaea L.
39
Mai întâi se face o determinare pentru soluţia martor (numai cu reactivi) şi apoi pentru
cea de clorofilă, câte două citiri, iar media va reprezenta valoarea pentru clorofilă/carotenoizi.
Conţinutul de pigmenţi foliari va fi apreciat pe baza absorbţiei luminii, determinată prin
metoda spectrofotometrică, asistată de calculator. Cunoscând gradul de absorbţie la diferite
lungimi de undă, se va stabili tipul pigmentului şi cantitatea acestuia.
Astfel, clorofila a 663 absoarbe lumina în λ = 663 nm, clorofila b 646 în λ = 646 nm, iar
pigmenţii carotenoizi absorb lumina în λ = 470 (Jităreanu Carmen, 2006).
Pentru determinarea cantităţii de clorofila a, clorofila b şi carotenoizi din frunzele de
arahide s-au utilizat formulele de calcul propuse de către Lichtenthaler şi Welburn în anul 1983
(Lichtenthaler şi Wellburn, 1983):
Clorofila a (μg/ml) = 12,21 (A663) – 2,81 (A646)
Clorofila b (μg/ml) = 20,13 (A646) – 5,03 (A663)
Carotenoizi (μg/ml) = (1000A470 – 3,27 [clorofila a] – 104 [clorofila b]) / 227
Se vor determina în acest fel conţinutul de pigmenţi asimilatori şi carotenoizi, raportul
dintre clorofila a şi clorofia b şi raportul dintre pigmenţii clorofilieni şi cei carotenoizi în
dinamica dezvoltării ontogenetice, în funcţie de fenofaza plantelor.
4.3.4.2. Efectul indus de tratamentul cu substanţe chimice mutagene asupra intensităţii
fotosintezei
Sistemul LC pro+ asigura un control complet asupra mediului din interiorul frunzei.
Controlul automat al parametrilor se va realiza în orice condiţii de ambient respectiv: controlul
CO2, controlul H2O, controlul temperaturii respectiv controlul radiaţiei.
40
Figura 4.11 - Determinarea intensităţii fotosintezei cu aparatul LC pro+
Pentru determinarea intensităţii fotosintezei s-au realizat câte 3 determinări pe plantă în
fenofaza de creştere a frunzelor, înflorire şi coacerea boabelor, rezultatele obţinute reprezentând
media aritmetică a citirilor efectuate (figura 4.11).
4.3.4.3. Determinarea intensităţii transpiraţiei
Plantele elimină prin transpiraţie cantităţi considerabile de apă. În condiţii normale
aceasta ajută la desfăşurarea optimă a proceselor fiziologice. În cazul apariţiei unui deficit de apă
în substrat, deşi intervin mecanisme fiziologice de diminuare a transpiraţiei, plantele prezintă
simptome de suferinţă. De aceea, având în vedere efectele favorabile ale acestui proces în viaţa
plantelor, transpiraţia a fost considerată de K. A. Timiriazev ca “un rău necesar” (Boldor, 1991).
Transpiraţia propriu-zisă se raportează fie la suprafaţă, fie la masa (proaspătă sau uscată)
materialului vegetal. În funcţie de suprafaţă se exprimă în grame apă/dm2/h, iar în funcţie de
masă în mg apă/g/h.
Pentru determinarea intensităţii transpiraţiei se va folosi metoda indirectă prin măsurarea
scăderii masei materialului vegetal.
Procedeul cântăririlor rapide (procedeul de moment a lui L. A. Ivanov) (Boldor şi
colab., 1983) constă în cântărirea frunzelor detaşate folosind balanţa de torsiune. Pierderile din
masa vegetală, ca urmare a transpiraţiei, se măsoară prin cântărirea iniţială a materialului vegetal
şi recântărirea lui după intervale scurte de timp (1-2, maximum 3 minute), considerându-se că în
acest timp intensitatea transpiraţiei nu este denaturată prea mult prin detaşarea frunzei.
Pentru calcularea intensităţii transpiraţiei voi folosi următoarea formulă:
(mi−mf )⋅60
P⋅T ,
în care:
mi – masa iniţială a frunzei (în grame);
mf - masa finală (după 1, 2 şi 3 minute) a frunzei (în grame);
60 = factor de raportare a intensităţii transpiraţiei la unitatea de timp (o oră);
41
P = parametrul frunzei faţă de care se face raportarea intensităţii transpiraţiei (masa ei
iniţială sau suprafaţa ei foliară în dm2);
T = durata determinării
Pentru fiecare variantă se va efectua câte 3 cântăriri (C1; C2 şi C3) pe baza cărora am
realizat o medie. Acest lucru ne-a permis şi stabilirea ritmului de deshidratare a frunzelor. Prima
cântărire (C0) se va echivala cu 100% iar celelalte cântăriri ne furnizează valorile de deshidratare
a ţesuturilor, conform relaţiei:
X1 =
100⋅C1
C0 X2 =
100⋅C2
C0 X3 =
100⋅C3
C0
42
CONCLUZII
În selecţia şi ameliorarea plantelor cu importanţă economică, un prim pas îl constituie
obţinerea unui material biologic foarte divers, inducerea unei variabilităţi individuale de mare
amplitudine. Practica a demonstrat că tendinţa spre variabilitate, manifestată la orice specie,
creşte în urma intervenţiei cu diverşi factori fizici, chimici sau biologici, cunoscuţi sub numele
de factori mutageni.
Studiul mutagenezei la specia Arachis hypogaea L. reprezintă un ansamblu de lucrări de
cercetare, care include formarea unei baze teoretice ample, prin informaţii privind: cadrul natural
în care este amplasată experienţa, tehnologia de cultivare şi biologia speciei, cât şi un volum
crescut de metode practice pentru realizarea etapelor din protocolul de lucru. La final se vor
sintetiza rezultatele şi se vor interpreta în urma calculului statisc.
Prin acest studiu ne-am propus investigarea unor particularităţi anatomice şi morfologice,
deoarece considerăm că fenotipizarea unor trăsături morfologice ale suprafeţelor foliare, a
boabelor, genic determinate, în urma tratamentelor cu substanţe chimice mutagene, poate
reprezenta un criteriu suplimentar pentru selecţie.
43
BIBLIOGRAFIE
1. Ardelean M., 1994 - Ameliorarea plantelor horticole- curs. Tipo. Agronomia, Cluj –
Napoca.
2. Blaga Gh., Filipov F., 2005 – Pedologie. Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca.
3. Boldor O., Raianu O., Trifu M., 1983 – Fiziologia plantelor – lucrări practice, Ed. Did.
şi Pedag., Bucureşti:74 -77.
4. Boldor O., Raianu O., Trifu M., 1991 - Fiziologia plantelor, Ed. Did. Şi Pedag.,
Bucureşti: 16 – 18.
5. Brown Terry A., 1998 - Molecular biology Labfax: Gene analysis, vol. II. Academic
Press, California, USA.
6. Carr D. H., Walker J. E., 1961 – Carbol-fuchsin, a dye for human chromosomes. Stain
Technol., 36: 233 – 236.
7. Cartwright I. L, Kelly S. E., 1991 - Probing the nature of chromosomal DNA protein
content by in vivo footprinting. Biotechniques, Nr. 11, pag. 188–190.
8. Chahal S.R. şi Virmani M. S., 1973 - Rev Oléagineux. Revue générale des corps gras, nr.
4.
9. Cîmpeanu M. M., Maniu M., Surugiu I. I., 2002 – Genetica – metode de laborator, Ed.
Corson, Iaşi.
10. Doniţă M., Ivan Doina, 1975 – Metode practice pentru studiul ecologic şi geografic al
vegetaţiei, Ed. Univ. Bucureşti: 37-39.
11. Fahad Al. Quarainy and Salim Khan., 2009 – Mutagenic effects of sodium azide and its
application in crop improvement. World Applied Sciences Journal. 6, pp. 1589-1601.
12. Gillier P. şi Silvestre P., 1969 - L´arachide. Maisonneuve et Larose, Paris.
13. Hera Cr., Toncea I., Ghinea L., 1980 – Rev. Probleme de agrofitotehnie teoretică şi
aplicată. Vol. II, nr. 1.
14. IARC, 1999 – Dimethyl sulfate. In Re-evaluation of some Organis Chemicals, Hydrazime
and Hydrogen Peroxide, vol. 71. International Agency for Research on Cancer, Lyon,
France, pag. 575-588.
44
15. Jităreanu Carmen D., Toma Doina L., Slabu Cristina, Marta Alina E., 2011 – Lucrări
practice de fiziologia plantelor. Editura Ion Ionescu de la Brad, Iaşi.
16. Jităreanu G., 1994 – Tehnică experimental- curs. Editura Universităţii Agronomice, Iaşi.
17. Leonte C., 1997 – Ameliorarea plantelor horticole şi tehnică experimentală - lucrări
practice. Editura Universităţii Agronomice, Iaşi.
18. Lichtenthaler H. K., Wellburn A. R., 1983 - Determinations of total carotenoids and
chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents. Biochemical Society
Transactions, Nr. 11, pag. 591 - 592.
19. Marin Ş. şi Constantinescu Emilia, 2011 – Fitotehnie-Manual universitar pentru
învăţământ la distanţă, Craiova.
20. Mogârzan Aglaia, Morar G., Ştefan M., 2004 - Fitotehnie. Curs. Editura Ion Ionescu de
la Brad, Iaşi.
21. Nair S. K., Ramaswami P. P., Pemmal R., 1972 – Rev Oléagineux. Revue générale des
corps gras, nr. 3
22. National Toxicology Program, 2011 - Report on Carcinogens (12th Ed.). U. S.
Department of Health and Human Services, Public Health Service, pag. 174-175.
23. Onisie T., Jităreanu G., 1992 - Tehnică experimentală- lucrări practice, U.S.A.M.V. Iaşi.
24. Owais W. M. şi Kleinhofs A., 1988 - Metabolic activation of the mutagen azide in
biological systems. Mutat. Res. 197, p. 313-323.
25. Pietrarelli R. J., 1971 - Rev Oléagineux. Revue internationale des corps gras, nr. 8-9.
26. Pîrşan, P., (1998). Leguminoase pentru boabe. Ed.Mirton,Timişoara.
27. Pohanish R. P., 2008 - Sittig's Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and
Carcinogens, William Andrew Inc.
28. Pop L., Bîrnaure V., Marghitu Valeria şi Chichea I., 1986 – Cultura alunelor de pământ,
Editura Ceres, Bucureşti.
29. Pop L., Chichea I. şi Pitiş S., 1976 – Rev. Producţia Vegetală. Cereale şi plante tehnice,
nr.4
30. Răus L., Jităreanu G., 2007 – Corelaţii între unii indicatori ai stării de compactare a
solului şi producţia culturilor de grâu, fasole şi porumb. Compactarea solurilor –
proecese şi consecinţe. Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.
45
31. Rippey J. C. R., Stallwood M. I., 2005 - Nine cases of accidental exposure to dimethyl
sulphate -a potential chemical weapon. Emergency Medicine Journal, Nr. 22, pag. 878-
879.
32. Ritus G.I., (1952) – Fitotehnie, Moscova.
33. Saese H. and Fahey G., 2006 - Comparison of seed dressing treatments of peanut
(Arachis hypogaea L.) at cleanwater in the lower Markham Valley, Papua New Guinea.
ACIAR Proceedings No. 122, p. 51–53.
34. Săulescu N. A., Săulescu N. N., 1967- Câmpul de experienţă. Ediţia a II- a. Editura
Agro-Silvică Bucureşti.
35. Snedecor G. W., 1968 -Metode statistice aplicate în cercetările de agricultură şi
biologie, Editura Didactică şi Pedagogică.
36. Starodub V., 2008 – Tehnologii în fitotehnie. Ed. UASM, Chişinău.
37. Ţîrdea Gh., 1984 – Contribuţii la crearea unor linii noi de linte (Lens esculenta Moench)
prin folosirea agenţilor mutageni. Teză de doctorat, Institutul Agronomic, Iaşi, pag. 138-
141.
38. Ţîrdea Gh., Leonte C., 2003 – Citogenetică vegetală – metode de laborator. Ed. Ion
Ionescu de la Brad, Iaşi.
39. Tsuschiya T., 1971 – An improved aceto-carmine squash method, with special reference
to the modified Rattembury”s method of making a preparation permanent. Barley Genet.
News, 1: 71-72.
40. Tudose I. Gh., Băra I. I., Tudose M., 1996 - Cytogenetic effects induced by nicotine in
Vicia faba (2n=12), Analele ştiinţifice ale Universităţii “Al. I. Cuza” din Iaşi (Serie nouă)
Secţiunea II a. Biologie ,volum: v. 42 pagina: p. 95-99.
41. Vyskocil A., 1999 - Dimethyl sulphate: review of toxicity. Central European Journal of
Occupational and Environmental Medicine, Nr. 5, pag. 72–82.
42. Zamfirescu N., Velican V., Valuţă Gh., Săulescu N., Canţăr F., 1958 – Fitotehnia vol. II,
Editura Agro-Silvică de Stat, Bucureşti.
46