2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Tautvydas Bučnys

„Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė

šviežioje paukštienoje bei žaliame piene“

„Prevalence and species diversity of Arcobacter spp.

isolated from fresh poultry and raw milk“

Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų programos

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: prof., dr.

Mindaugas Malakauskas

KAUNAS, 2015

3

DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir

rūšinė įvairovė šviežioje paukštienoje bei žaliame piene“.

1. Yra atliktas mano paties/pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

2015-04-30 Tautvydas Bučnys

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS

TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

2015-04-30 Tautvydas Bučnys

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

2015-04-30 Prof. dr. Mindaugas Malakauskas

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE

Prof. dr. Mindaugas Malakauskas

(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas,

pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

(gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas)

4

TURINYS

SANTRAUKA ..................................................................................................................................... 6

SUMMARY ......................................................................................................................................... 7

SANTRUMPOS ................................................................................................................................... 8

ĮVADAS............................................................................................................................................... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA .................................................................................................. 10

1.1 Arcobacter spp. genties bakterijos ........................................................................................... 10

1.1.1 Arcobacter spp. klasifikacija............................................................................................. 10

1.1.2 Morfologija ir biologinės savybės..................................................................................... 11

1.2 Arkobakterijų paplitimas maisto gamybos grandinėje ............................................................. 11

1.2.1 Maisto žaliavų užkrėstumas arkobakterijomis .................................................................. 11

1.2.2 Maisto produkų užkrėstumas arkobakterijomis ................................................................ 13

1.2.3 Arkobakterijų išgyvenimas maisto produktuose ............................................................... 14

1.3 Arkobakterijų sąsajos su žmonių susirgimais ŪŽIL ................................................................ 14

1.3.1 Žmonių arkobakteriozė ..................................................................................................... 14

1.3.2 Galimi užsikrėtimo šaltiniai .............................................................................................. 15

1.3.3 Ligos simptomai ir patogenezė ......................................................................................... 15

1.3.4 Gydymas ir profilaktika .................................................................................................... 16

1.4 Arkobakterijų atsparumas antibakterinėms medžiagoms ........................................................ 17

1.5 Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas ................................................................... 18

2. MEDŽIAGOS IR METODAI .................................................................................................... 21

2.1 Tyrimų planas .......................................................................................................................... 21

2.2 Arcobacter spp. išskyrimas iš maisto mėginių ......................................................................... 21

2.3 Arkobakterijų identifikavimas PGR metodu ............................................................................ 22

2.3.1 Arcobacter spp. DNR išskyrimas...................................................................................... 22

2.3.2 Arcobacter spp. identifikavimas PGR metodu ................................................................. 22

2.4 Atsparumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas ............................................................. 23

2.5 Statistinė duomenų analizė ....................................................................................................... 24

3. REZULTATAI ........................................................................................................................... 25

3.1 Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis ...................... 25

3.2 Išskirtų arkobakterijų rūšinė įvairovė ...................................................................................... 26

3.3 Arkobakterijų atsparumas antibiotikams ................................................................................. 28

3.3.1 Arkobakterijų išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumas antibiotikams ........................ 28

3.3.2 Arkobakterijų išskirtų iš žalio pieno atsparumas antibiotikams ....................................... 29

5

4. REZULTATŲ APTARIMAS ..................................................................................................... 30

5. IŠVADOS ................................................................................................................................... 35

6. REKOMENDACIJOS ................................................................................................................ 36

7. PADĖKOS .................................................................................................................................. 37

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ...................................................................................................... 38

6

SANTRAUKA

Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė šviežioje paukštienoje bei žaliame

piene

Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas: prof. dr. Mindaugas Malakauskas

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

Veterinarijos akademija, Veterinarijos fakultetas

Maisto saugos ir kokybės katedra

Kaunas, 2015

Darbo apimtis 41 puslapis, 6 lentelės, 6 paveikslai.

Darbo tikslas buvo įvertinti mažmeninėje prekyboje parduodamos šviežios paukštienos bei

žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp. bakterijomis. Tyrimo metu iš viso ištirta 50 šviežios

paukštienos bei 60 žalio pieno mėginių. Arkobakterijos iš maisto mėginių buvo išskirtos atlikus

selektyvų pagausinimą specifiniame Arcobacter sultinyje su penkių antibiotikų priedu, o po to

tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro su CAT priedu. Arkobakterijos iki rūšies buvo identifikuojamos

naudojant šiek tiek modifikuotą Douidah ir bendraautorių (2010) aprašytą PGR metodą. Taip pat

atliktas iš maisto mėginių išskirtų arkobakterijų izoliatų atsparumo antibiotikams (ciprofloksacinui,

eritromicinui, tetraciklinui, gentamicinui ir ceftriaksonui) įvertinimas agaro praskiedimo metodu.

Tyrimai parodė, kad 23 iš 50 tirtų šviežios paukštienos mėginių (46%) buvo užkrėsti

Arcobacter genties bakterijomis. Tuo tarpu žalio pieno mėginiuose šios bakterijos buvo rastos tik

11 iš 60 tirtų mėginių (18,22%). Šviežia paukštiena dažniausiai buvo užkrėsta A. butlzeri (69,56%),

rečiau A. cryaerophilus (17,39%), A. cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%) rūšies

arkobakterijomis. Žalias pienas buvo išskirtinai užkrėstas tik A. butzleri rūšies arkobakterijomis.

Atlikus arkobakterijų, išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumą antibakterinėms medžiagoms

nustatyta, kad A. cryaerophilus jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios

eritromicinui ir ciprofloksacinui (MSK 4 µg/ml). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir

tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml). A. skirrowii

atsparumas visiems tirtiems antibiotikams siekė 0,5 µg/ml.

Nustatyta, kad A. butzleri išskirtos iš šviežios paukštienos pasižymėjo didesniu atsparumu

eritromicinui (MSK 16 µg/ml) ir ceftriaksonui (MSK 8 µg/ml) nei išskirtos iš pieno (MSK

eritromicinui 8 µg/ml ir ceftriaksonui 4 µg/ml).

Raktiniai žodžiai: Arcobacter spp., užkrėstumas, paukštiena, žalias pienas, atsparumas

antibiotikams.

7

SUMMARY

Prevalence and species diversity of Arcobacter spp. isolated from fresh poultry and raw milk

Master thesis

Thesis supervisor: prof. dr. Mindaugas Malakauskas

Lithuanian University of Health Science

Veterinary Academy

Faculty of Veterinary

Departament of Food Safety and Quality

Kaunas, 2015

The coverage of the work: 41 pages, 6 tables, 6 pictures.

The aim of this study was to evaluate contamination of fresh poultry and raw milk products

with Arcobacter spp. sold at the retail sale. A total of 50 fresh poultry and 60 raw milk samples

were collected and tested. Arcobacters from food samples were isolated by selective enrichment in

Arcobacter broth with 5 antibiotics supplement and then accomplished dirrect inoculation on

mCCDA agar with CAT supplement. Arcobacter species were identified by PCR method described

by Douidah and co-authors (2010) with some modifications. Then was carried out evaluation of

arcobacters, isolated from food samples, resistance to antibiotics (ciprofloxacin, erythromycin,

tetracycline, gentamicin and ceftriaxone) by agar dilution method.

The study showed that out of the 50 tested fresh poultry samples 23 (46%) were contaminated

with arcobacters while in raw milk samples these bacteria were found in 11 out of 60 tested samples

(18,22%). Fresh poultry were contaminated mostly with A. butzleri (69,56%), following A.

cryaerophilus (17,39%), A. cibarius (8,69%) and A. skirrowii (4,34%). Raw milk was contaminated

only with A. butzleri. Examination of antibiotic resistance of Arcobacter spp. isolated from fresh

poultry samples showed, that A. cryaerophilus strains were most sensitive to tetracycline (MIC 0,5

µg/ml), but resistant to erythromycin and ciprofloksacin (MIC 4µg/ml). A. cibarius strains were

mosty sensitive to ciprofloksacin and tetracykline (MIC 0,5 µg/ml), but resistant to erythromycin

(MIC 2 µg/ml). A. skirrowii resistance to all antibiotics was 0,5 µg/ml.

Our findings revealed that A. butzleri isolated from fresh poultry were characterized in higher

resistance (erythromycin 16 µg/ml, ceftriaxone 8 µg/ml) then isolated from raw milk (erythromycin

8 µg/ml, ceftriaxone 4 µg/ml).

Key words: Arcobacter spp., comtamination, poultry meat, raw milk, antibiotic resistance.

8

SANTRUMPOS

µg – mikrogramai

µm – mikrometrai

µl – mikrolitrai

ml – mililitrai

pH – vandenilio potencialas

bp – bazių pora

DNR – deoksiribonukleorūgštis

rRNR – ribosominė ribonukleino rūgštis

ELISA – imonofermentinis metodas

KSV – kolonijas sudarantys vienetai

MIC – minimali inhibuojanti koncentracija

MSK – minimali slopinanti koncentracija

df – laisvų narių skaičius

9

ĮVADAS

Arkobakteriozė – žmonių ūmi žarnyno infekcinė liga, kurią sukelia Arcobacter genčiai

priklausančios bakterijos. Dauguma naminių gyvūnų ir paukščių yra dažnai užsikrėtę

arkobakterijomis, tačiau jie suserga labai retai ir yra vienas iš pagrindinių šių patogeninių bakterijų

rezervuaras. Gyvūnų mėsa skirta maistui dažniausiai užkrečiama arkobakterijomis skerdimo metu, o

maisto produktai – kryžminės taršos būdu. Dažniausiai žmonių susirgimai arkobakterioze siejami su

paukštienos ir jos subroduktų, nepasterizuoto pieno vartojimu, užterštu geriamuoju vandeniu arba

higienos reikalavimų nesilaikymu maisto ruošimo metu [1].

Arkobakteriozė dažniausiai sukelia Arcobacter buzleri, Arcobacter cryaerophilus ir

Arcobacter skirrowii, tačiau yra ir kitų arkobakterijų rūšių, galinčių sukelti susirgimus žmonėms.

Tai ketvirta pagal dažnumą kampilobakteriozės tipo apsinuodijų sukėlėja. Nors yra atlikta nemažai

eksperimentinių tyrimų, tačiau tikslios šią zoonozę galinčios sukelti sukeliančios infekcinės dozės

nėra nustatyta. Visgi turima duomenų, kad didelę įtaką šiam susirgimui lemia ligonio organizmo

atsparumas, amžius bei kitos individualios savybės. Paprastai arkobakteriozė pasireiškia gausia

vandeninga diarėja su pilvo skausmais, pykinimu, vėmimu bei karščiavimu. Ligos simptomai gali

trukti 2 – 5 dienas [1; 2; 3].

Kadangi Lietuvoje iš viso nėra jokių duomenų apie arkobakterijas ir jų paplitimą maisto

produktuose, taip pat galimus susirgimus šia zoonoze, todėl siekėme būti vieni iš pirmųjų, atliekant

tokio pobūdžio tyrimus Lietuvoje.

Darbo tikslas: įvertinti šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp.

bakterijomis.

Darbo uždaviniai:

1. Įsisavinti naujausius Arcobacter spp. mikrobiologinius maisto produktų tyrimo

metodus.

2. Įvertinti šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp.

bakterijomis.

3. Įvertinti Arcobacter spp. rūšinę įvairovę šviežioje paukštienoje bei žaliame piene.

4. Nustatyti Arcobacter spp. bakterijų atsparumą antibakterinėms medžiagoms.

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Arcobacter spp. genties bakterijos

Arkobakterijų gentis priklauso Campylobacteracea šeimai. Pirmą kartą išskirtos iš galvijų

abortuotų vaisių 1977m. [3]. Šis genties pavadinimas buvo suteiktas aerotolerantiškoms ir

gebančioms vystytis žemoje temperatūroje bakterijoms. Šios bakterijos kaip patogenai plačiai

paplitę maisto produktuose bei geriamajame vandenyje ir gali sukelti susirgimus žmonėms. A.

butzleri bei A. cryaerophilus buvo išskirtos iš klinikinių žmonių mėginių, sirgusių diarėja ar įvykus

abortui. Belgijoje ir Prancūzijoje šios minėtos dvi arkobakterijų rūšys dažniausiai aptinkamos

klinikiniuose žmonių išmatų mėginiuose [4]. Taip pat šių rūšių bakterijos išskirtos ir iš mastitu bei

diarėja sirgusių gyvulių. Kita arkobakterijų genties bakterijų rūšis – A. skirrowii siejama su

chroniška diarėja vyresniems pacientams [2].

1.1.1 Arcobacter spp. klasifikacija

Šiuo metu Arcobacter genčiai priklauso 17 bakterijų rūšių: A. butlzeri, A. cryaerophilus

(Grupės A ir B), A. skirrowii, A. nitrofigilis, A. cibarius, A. halophilus, A. molluscorum, A. defluvii,

A. marinus, A. trophiarum, A. mitily, A. thereius [3], A. cloacea, A. ellisii, A. bivalviorum, A.

venerupis ir A. suis [5]. Pagal kilmę Campylobacter cryaerophila pervadinta į Arcobacter

cryaerophilus. Vėliau viena iš šios bakterijos (Arcobacter cryaerophilus) padermių pervadinta į

Arcobacter butzleri [6].

Kartu su Helicobacter, Wolinella ir Sulfurospirillum gentimis arkobakterijos sudaro

svarbiausią rRNR VI superšeimą (1 pav.), arba yra priskiriamos Proteobacteria klasės ɛ grupės

bakterijoms.

1 pav. Arcobacter spp. klasifikacija pagal 16S rRNR geną [6].

11

Iš visų 17 arkobakterijų rūšių - 11 (A. nitrofigilis, A. halophilus, A. molluscorum, A. defluvii,

A. marinus, A. mitily, A. cloacea, A. ellisii, A. bivalviorum, A. venerupis ir A. suis) dažniausiai

išskiriamos iš aplinkos mėginių, o likusios 6 (A. butzleri, A. cryaerophilus, A. skirrowii, A.

trophiarum, A. cibarius ir A. thereius) išskiriamos iš klinikinių žmonių arba gyvūnų išmatų mėginių

[6].

A. skirrowii rūšis pirmiausia buvo išskirta iš ėriukų, sirgusių diarėja, vėliau taip pat išskirta iš

galvijų organų, kiaulių ir avių aborto liekanų, išmatų, vandens mėginių. Kita arkobakterijų genčiai

priskiriama A. cibarius rūšis yra laikoma kaip artimiausias A. cryaerophilus filogenetinis kaimynas.

Ir pirmiausia A. cibarius rūšis buvo išskirta iš paukščių skerdenų. A.thereius išskirta iš abortuotų

kiaulių vaisių (paršelių) organų, taip pat ančių išmatų. A. mytili išskirta iš midijų. A.nitrofigilis yra

azotą fiksuojanti bakterijų rūšis, išskirta iš pelkėse augančių Spartina alterniflora šaknų. A.halophilus

išskirta iš vandens mėginių, paimtų netoli Havajų salų esančiose lagūnose [7; 8].

1.1.2 Morfologija ir biologinės savybės

Arcobacter spp. genties bakterijos yra mažos 0,2 – 0,4 µm. pločio ir 1 – 3 µm. ilgio, išlenktos

arba S formos, Gram neigiamos, sporų neformuojančios, tačiau gebančios sudaryti bioplėveles,

lazdelės. Tai dažniausiai judrios, vieną poliarinį žiuželį turinčios bakterijos. Arkobakterijos gali

augti 15 – 42˚C temperatūroje aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygoms bei joms nėra būtinas

vandenilis (žr. 1 lentelę 11 psl.).

Jų gebėjimas augti 15˚C temperatūroje mikroaerofilinėmis sąlygomis būtent ir skiria nuo

giminingų kampilobakterijų. Optimalus šių bakterijų pH yra 6 – 7 (A. butzleri) ar 7 – 7,5 (A.

cryaerophilus).

1.2 Arkobakterijų paplitimas maisto gamybos grandinėje

1.2.1 Maisto žaliavų užkrėstumas arkobakterijomis

Gyvūnai ir fekalijomis užterštas vanduo yra pagrindinis arkobakterijų šaltinis. Neretai

arkobakterijomis būna užkrėsta ir žalia bei nepakankamai termiškai apdorota gyvūnų mėsa [9].

Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti aptinkamos ir sveikų gyvūnų ekskrementuose.

Arkobakterijų paplitimas sveikų skerdžiamų naminių gyvūnų žarnyne ir fekalijose kelia didelę

grėsmę mėsos bei skerdenos užkrėstumui šiomis bakterijomis. Tačiau arkobakterijos retai

išskiriamos iš naminių paukščių virškinamojo trakto turinio, todėl skerdenos užterštumo šaltinis

lieka iki galo neaiškus [3].

12

1 lentelė. Arkobakterijų biologinės savybės [3].

Bakterijų savybės 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Augimo sąlygos:

+ + + + V + + + N N N N Deguonis +25˚C

Deguonis +37˚C - + V + - V + N + - + +

Mikroaerobinės sąlygos +37˚C - + V + + - + V + - + +

2% NaCl V V V + - + + N N N N N

4% NaCl - - - + - + + + + - - +

Gebėjimas augti ant terpių:

+ - - - - - - N N - - - Mitybinė terpė su 1% glicinu

MacConkey agaras V + V - + - - + N V + +

Minimal medium mitybinė terpė + + + - + - - - N - + -

Fermentinis aktyvumas:

+ V + + V + - + - + + + Katalazė

Oksidazė + + + + + + + + N N N N

Ureazė - - - - - + - - - - + -

Redukuoja nitratus + + V + - + + - + - + +

Indolo acetato hidrolizė + + + + + + + - + + + -

1 – A. thereius, 2 – A. butzleri, 3 – A. cryaerophilus, 4 – A. skirrowii, 5 – A. cibarius, 6 – A.

nitrofigilis, 7 – A. halophilus, 8 – A. mytili, 9 – A. marinus, 10 – A. trophiarum, 11 – A. defluvii, 12

– A. molluscorum.

+ ≥95% teigiamų padermių; - ≤11% neigiamų padermių; V 12 – 94% teigiamų padermių; N nėra

nustatyta.

Pastaruosius 10 metų atlikta nemažai tyrimų, siekant nustatyti arkobakterijų paplitimą

aplinkoje, maisto produktuose ir žaliavose. Japonijoje, Australijoje, Olandijoje, Belgijoje,

Ispanijoje, Italijoje atliktų tyrimų metu nustatyta, kad paukštienos užkrėstumas arkobakterijomis

siekia nuo 23 – 100%, ir yra ženkliai didesnis nei paplitimas raudonoje mėsoje, pavyzdžiui,

kiaulienoje ir jautienoje (2 – 51,5%). Tokie rezultatai sudaro prielaidas manyti, kad paukštiena gali

būti arkobakterijų rezervuaras (žr. 2 lentelę) [10].

2011 metais Malaizijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, kad arkobakterijų paplitimas

paukštienoje (krūtinėlė, sparneliai, šlaunelės) siekė 39% ir identifikuota išskirtinai A. butlzeri rūšis.

Taip pat šviežia paukštiena (41%) buvo labiau užkrėsta arkobakterijomos negu šaldyta (37%) [10].

13

Arkobakterijų paplitimas paukštienoje yra didžiausias lyginant su kitais produktais ir siekia

24 – 96%, tuo tarpu kiaulienoje – 53%, jautienoje – 33 – 40%, jūros produktuose – 40%, vandenyje

3 – 50% [11].

2 lentelė. Arkobakterijų paplitimas gyvūninės kilmės maisto žaliavose [3].

Šalis Mėginių rūšis Arkobakterijų paplitimas (%)

Malaizija Jautiena 38

Belgija Jautiena 31,3

Australija Ėriena 15

Meksika Liesa kiauliena 51,5

JAV Kiauliena 54

Belgija Kiauliena 21

Airija Karvės pienas 46

Belgija Karvės pienas 3,18

1.2.2 Maisto produkų užkrėstumas arkobakterijomis

2014 metais Turkijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatytas karvių, buivolų pieno bei

kaimiškų sūrių užkrėstumas arkobakterijomis. Karvės pieno užkrėstumas arkobakterijomis sudarė

36% ir dažniausiai aptinkamos A. butzleri (38.89%), A. cryaerophilus (22.23%), A. skirrowii

(11.12%) bakterijų rūšys. Buivolų pieno užkrėstumas siekė 48% ir dažniausiai buvo aptinkamos A.

cryaerophilus (33.33%), A. cibarius (20.83%), A. butzleri (12.50%) rūšys. Atitinkamai šviežių

kaimiškų sūrių užkrėstumas Arcobacter spp. genties bakterijos sudarė 56%, iš kurių dažniausiai

aptiktos A. skirrowii (28.57%), A. butzleri (21.43%) ir A. cryaerophilus (14.29%) rūšys [12].

Revez ir bendraautoriai (2013) Suomijoje atliko tyrimus, siekiant išsiaiškinti arkobakterijų

paplitimą ir rūšinę įvairovę žaliame piene. Iš tirtų 177 pieno mėginių arkobakterijų atžvilgiu

teigiamų nustatyta 26 (15% užkrėstumas) iš kurių – 25 A. butzleri ir 1 A. cryaerophilus. Svarbu tai,

kad šios dvi rūšys buvo rastos tame pačiame mėginyje. Brazilijoje ir Turkijoje atlikti panašaus

pobūdžio tyrimai, kurie parodė esant mažesnį pieno užkrėstumą arkobakterijomis, atitinkamai 3% ir

6% [13].

Čilėje 2010 – 2013 metais vykdomi tyrimai, siekiant nustatyti galimą arkobakterijų paplitimą

dvigeldžiuose moliuskuose. Tyrimo laikotarpiu surinkta ir ištirta 106 mėginiai – 21 jūros moliuskas,

18 midijų, 20 austrių, 20 pailgųjų moliuskų, 11 šukučių ir 16 makrelių. Didžiausias arkobakterijų

paplitimas nustatytas makrelėse ir siekė 87,5%, pailguosiuose moliuskuose 65%, midijose 33%,

14

jūros moliuskuose 23,8%, šukutėse 18% ir austrėse 15%. Bendras dvigeldžių moliuskų užkrėstumas

siekė 40,5%. Dažniausiai aptinkama arkobakterijų rūšis A. butzleri (62%), A. cryaerophilus (21%),

A. skirrowii (16%) ir A. defluvii (1%). Tokie atlikto tyrimo rezultatai rodo, kad moliuskai gali būti

vienas iš arkobakteriozės užsikrėtimo šaltinių [14].

1.2.3 Arkobakterijų išgyvenimas maisto produktuose

Atlikti tyrimai, kuriais įrodyta, kad A. butzleri negali išgyventi paukštienoje 5˚C

temperatūroje, esant pH=5, arba kai pH=9, o NaCl koncentracija siekia 8% [15].

Optimali vystymosi temperatūra yra 25 – 35˚C, bet gali svyruoti 15 – 37˚C temperatūros

ribose. Tačiau nors ir ne taip intensyviai gali augti +4 – 8˚C temperatūroje. A. butzleri gali išgyventi

bei daugintis +5˚C temperatūroje, ir tai reiškia, kad šios bakterijos geba išlikti skerdyklų aplinkoje

bei laikino sandėliavimo sąlygose šaldytuvuose [16].

Arkobakterijos geba daugintis esant 3,5% – 4% NaCl, o išgyventi esant ir 5% NaCl (paprastai

maisto produktuose NaCl koncentracija siekia apie 2%) [3].

A. butzleri esant 64% santykinei drėgmei gali net 4 paras išbūti prisitvirtinusi prie

nerūdijančio plieno, stiklinių bei plastikinių paviršių [17]. Tačiau nuvalius minėtus paviršius 10%

etanolio tirpalu, šios bakterijos yra visiškai sunaikinamos [18].

Arcobacter spp. bakterijos gali būti inaktyvuojamos pakaitinant maisto produktus iki +70˚C

temperatūros ir veikiant jonizuojančia spinduliuote (0,27 – 0,30kGy) 10 sekundžių. >0,2% acto bei

citrinų rūgščių panaudojimas – efektyvi priemonė sumažinant produktų užkrėstumą A. butzleri

bakterijomis. Chloras taip pat gali būti naudojamas A. butzleri inaktyvavimui. Tinkamas vandens

chloravimas galėtų ženkliai sumažinti su užterštu vandeniu užsikrečiamos arkobakteriozės atvejų

skaičių [3].

1.3 Arkobakterijų sąsajos su žmonių susirgimais ŪŽIL

1.3.1 Žmonių arkobakteriozė

Žmonėms susirgimus dažniausiai sukelia A. butzleri rūšis siejama su septicemija ir enteritu,

tačiau A. cryaerophilus ir A. skirrowii buvo išskirtos iš pacientų, sirgusių diarėja, išmatų mėginių.

Arkobakterijozės simptomai yra panašūs į kampilobakteriozės, tačiau su ilgesne vandeninga, kartais

iki dviejų mėnesių trunkančia, diarėja. A.butzleri buvo nustatyta kaip ketvirta pagal dažnumą

kampilobakteriozės tipo apsinuodijimų sukėlėja Belgijos bei Prancūzijos pacientams ir dažniausiai

nustatyta vaikams bei vyresnio amžiaus asmenims, sergantiems lėtinėmis ligomis. A. cryaerophilus

15

išskirta iš pacientų, sirgusių diarėja ir septicemija, kai tuo tarpu A. skirrowii išskirta iš vyresnių

pacientų, sirgusių diarėja [10].

Atlikta studija tyrimų, siekiant išsiaiškinti Campylobacter, Helicobacter ir Arcobacter genties

bakterijų paplitimą iš Pietų Afrikos pacientų, sergančių ir nesergančių ŽIV, išmatų mėginių.

Nustatyta, kad A. butzleri buvo trečia pagal dažnumą nustatoma bakterijų rūšis (6,2%), po

Helicobacter pylori (50,6%) ir C. jejuni (10,2%). Visai neseniai išsiaiškinta, kad Arcobacter spp.

bakterijos gali būti siejamos su europiečių, keliaujančių po Meksiką, Gvatemalą ir Indiją, ūmiais

žarnyno apsinuodijimais (8% paplitimas) [1].

Arkobakterijos gali būti išskirtos ir iš sveikų žmonių išmatų mėginių. Šveicarijos skerdykloje

iš sveikų darbuotojų 1,4% išmatų mėginių buvo išskirtos A. cryaerophilus rūšies bakterijos. Kito

Pietų Afrikoje atlikto tyrimo metu A. bulzleri nustatyta 8,8% sveikų asmenų išmatų mėginiuose,

tačiau diarėja sergančių žmonių mėginiuose šios bakterijos buvo aptinkamos dažniau (12,9%) nei

žmonių, kuriems nepasireiškė jokie susirgimo požymiai[1].

1.3.2 Galimi užsikrėtimo šaltiniai

Arkobakterijų paplitimas vandenyje ir gyvūninės kilmės maisto produktuose, - tokiuose kaip

paukštiena, kiauliena ir jautiena, yra laikomas kaip pagrindinis arkobakteriozės užsikrėtimo šaltinis

žmonėms [19].

Be to, tyrimais įrodyta, kad žmonių kontaktas tarpusavyje ir su gyvūnais gali būti užsikrėtimo

arkobakterioze priežastis [20].

Taip pat arkobakterijų užsikrėtimo šaltiniu laikomi ir naminiai gyvūnai, pavyzdžiui, avys ir

ožkos. 2011 metais Belgijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, kad iš 153 avių išmatų mėginių

arkobakterijų atžvilgiu teigiamų nustatyta 66 (43,1%), atitinkamai ožkų – 19 iš 177 (10,7%).

Pabrėžtina, kad nustatytos dominuojančios rūšys priklausė A. butzleri ir A. cryaerophilus. Tačiau iš

šių naminių gyvūnų pieno mėginių arkobakterijų nebuvo išskirta [21].

Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti siejamos su susirgimais sukeltais C. jejuni, C.

coli, C. concisus ir H. pylori bakterijomis [1].

1.3.3 Ligos simptomai ir patogenezė

Pagrindiniai žmonių arkobakteriozės susirgimo požymiai: gausi vandeninga diarėja su pilvo

skausmais, pykinimas, vėmimas, karščiavimas, smegenų pažeidimai [22]. Taip pat manoma, kad

A.butzleri gali būti susijusi su kitų organų kolonizacija ir su tuo susijusiomis komplikacijomis –

kepenų ciroze, aštria apendicito forma [23].

16

A. butzleri protrūkio Italijos mokykloje metu susirgo 10 vaikų, iš kurių 3 buvo hospitalizuoti.

Pagrindiniai ligos simptomai nustatyti kaip pasikartojantys pilvo diegliai su arba be diarėjos.

Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti perduodamos motinų vaisiui transplacentiniu keliu ir

gali sukelti nėščiosioms gimdos kraujavimą [1].

Kol kas nėra žinių, kaip arkobakteriozė susijusi ligonių amžiumi bei imunine būkle. Tačiau

Samie ir kt. nustatė mažesnį arkobakterijų paplitimą (3%; 2/67) sveikų mokyklinukų (3 – 15 metų

amžiaus) tarpe lyginant su tokio paties amžiaus hospitalizuotų vaikų (10,4%; 12/115) [23].

Net ir po dviejų Arcobacter spp. genties bakterijų tyrinėjimo dešimtmečių yra mažai žinių

apie infekcinę dozę bei patogeniškumą. Vaivorykštinių upėtakių užkrėtimas 2,25x104 A.

cryearophilus lėmė 100% mirtingumą su pažeistomis žiaunomis, kepenimis, inkstais [25]. O

albinoses laboratorines žiurkes užkrėtus 109 KSV/ml. A. butzleri ir A. cryaerophilus buvo

nustatytas 100% arkobakteriozės sergamumas, tačiau nebuvo nustatyta mirties atvejų [26]. Kito

tyrimo metu vienos dienos paršeliai buvo užkrėsti skirtingų rūšių arkobakterijomis, kurios

kolonizavo virškinamąjį traktą ir buvo vėliau išskiriamos su ekskrementais, tačiau tik A. butzleri

gebėjo kolonizuoti kitus organus – kepenis, inkstus, nervinį audinį [3].

1.3.4 Gydymas ir profilaktika

Gydymas antibiotikais skiriamas esant sunkiai ligos eigai ir sisteminei arkobakteriozei.

Gydymui gali būti skiriami tokie antibiotikai kaip cefoperazonas, fluorochinolonai ir tetraciklinas

[1; 27; 28]. Pernelyg didelis ir nepagrįstas antibiotikų naudojimas gydant tokias zoonozes, kaip

kampilobakteriozė ar salmoneliozė, leido arkobakteriozės sukėlėjams tapti atspariems ampicilinui,

chloksacilinui, azitromicinui, klindamicinui [27; 29].

Profilaktikos priemonės, kurios galėtų apsaugoti žmones nuo susirgimų arkobakterioze būtų

šios:

laikytis švaros,

vengti kontakto su naminiais gyvūnais,

atskirti žaliavą ir pagamintą maistą,

maistą kruopščiai termiškai apdoroti,

maistą laikyti saugioje temperatūroje,

naudoti saugų vandenį ir žaliavas.

17

1.4 Arkobakterijų atsparumas antibakterinėms medžiagoms

Arkobakterijos, kaip parodė tyrimai, yra atsparios tokiems antibiotikams kaip eritromicinas

bei ciprofloksacinas, kurie yra naudojami kampilobakteriozės gydymui. Manoma, kad A. butzleri ir

A. cryaerophilus yra jautresnės rezveratroliui nei kitos Gram neigiamos bakterijos [30].

Yesilmen ir bendraautoriai atliko arkobakterijų, išskirtų iš karvių, buivolų pieno bei šviežių

kaimiškų sūrių, atsparumo antibiotikams tyrimus. Rezultatai parodė, kad A. cryaerophilus buvo

atspari cefoperazonui, kloksacilinui ir penicilinui G. Tačiau papildomai A. butzleri ir A. skirrowii

izoliatai buvo atsparūs tetraciklinui, ampicilinui ir eritromicinui [12].

2013 metais Portugalijoje atlikti tyrimai, siekiant nustatyti iš paukščių skerdyklos išskirtų

arkobakterijų atsparumą antibakterinėms medžiagoms (žr. 3 lentelę). Iš išskirtų 43 A. butzleri

izoliatų nustatyta, kad visi jautrūs gentamicinui, 2,3% atsparūs chloramfenikoliui, kai tuo tarpu 24

padermės (55,8%) buvo atsparios ciprofloksacinui [28].

3 lentelė. 43 A. butzleri izoliatų atsparumas antibiotikams [28].

Antibiotikai

Minimali

slopinanti

koncentracija

(MSK)a

MSK50

(mg/L)b

MSK90

(mg/L)c MSK riba

Atsparių

izoliatų

skaičius (%)

Ampicilinas ≥32 128 256 1/>256 42 (97,7)

Ciprofloksacinas ≥4 4 >8 0.03/>8 24 (55.8)

Vankomicinas ≥32 >512 >512 512/>512 43 (100)

Trimetoprimas ≥16 >512 >512 >512 43 (100)

Piperacilinas ≥128 512 >512 8/>512 42 (97,7)

Cefoperazonas ≥64 >512 >512 16/>512 42 (97,7)

Chloramfenikolis ≥32 8 16 4/32 1 (2,3)

Gentamicinas ≥8 0,5 1 0.125/1 0 (0)

Amoksicilinas ≥32 64 128 1/128 42 (97,7)

a MSK – atsparumo antibiotikams riba; jei bakterijos gali augti esant didesnei antibiotiko koncentracijai terpėje nei

nurodyta MSK, jos yra laikomos atspariomis

b, c MSK50 ir MSK90 parodo koncentraciją (mg/L), prie kurios 50% ir 90% tirtų izoliatų augimas buvo slopinamas

atitinkama antibakterine medžiaga

18

2 pav. A. butzleri atsparumas antibakterinėms medžiagoms [31].

Kito Malaizijoje atlikto tyrimo metu siekta išsiaiškinti iš kliniškai sveikų galvijų, ožkų bei

geriamojo vandens išskirtų A. butzleri izoliatų atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Tyrimo

rezultatai pateikti aukščiau esančiame paveiksle (2 pav.).

Išsiaiškinta, kad tik 1 A. butzleri izoliatas buvo jautrus visiems 9 tirtiems antibiotikams.

Nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijų padermės dažniausiai buvo atsparios ampicilinui (55,6%),

cefatoksimui (33,4%) ir ciprofloksacinui (33,4%). Šis tyrimas atskleidė, kad net 20% tirtų izoliatų

buvo atsparūs 4 ir daugiau antibiotikų. Remiantis šio tyrimo rezultatais buvo padaryta išvada, kad

gentamicinas ir enrofloksacinas galėtų būti naudojami arkobakteriozės gydymui [31].

1.5 Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas

Houf ir bendraautoriai (2001) paskelbė daug metodų ir įrodė, kad naudojant mikroaerobinę

aplinką sudarančias sistemas, galima išskirti arkobakterijas iš klinikinių mėginių. Arkobakterijų

patvirtinimas iš maisto ir aplinkos mėginių gali užtrukti iki 6 dienų, tai sukelia sunkumų protrūkių

metu. Naudojant įvairius metodus galima sutrumpinti arkobakterijų išskyrimo ir patvirtinimo laiką.

Šių bakterijų identifikavimui paprastai reikalingas bakterijų pagausinimas [32].

Imunologiniai metodai

Arkobakterijos sukelia užkrėstų šeimininkų antikūnų atsaką ir šitie baltymai gali būti

naudojami greitam patogenų išaiškinimui ir/arba patvirtinimui maiste. Antolin ir kt. (2001)

apibūdino PGR – ELISA metodą arkobakterijų aptikimui ir išskyrė šios rūšies bakterijas iš

paukštienos mėginių. PGR tyrimų taikinys yra arkobakterijų DNR oligonukleotidų zondų 16S

rRNR tarpgeninės sritys. Šie tyrimai parodė, kad PGR – ELISA metodo pagalba galima aptikti

arkobakterijas ir iki galo identifikuoti pagausintuose paukštienos mėsos mėginiuose [33].

19

Fenotipinis metodas

Arkobakterijos neretai nustatomos remiantis klasikinėmis fenotipinėmis savybėmis, įskaitant

kolonijų morfologiją, judrumą, katalazės, ureazės, nitratų rekukcijos testais, indoksilo acetato

hidrolize, jautrumu antibiotikams (cefoperazonas, trimetoprimas) [1]. Klasikinio fenotipinio

identifikavimo metodo trūkumas yra tas, kad rūšių išskyrimas dažnai remiasi viena ar dviem

skirtingomis charakteristikomis, pavyzdžiui, katalazės ir ureazės aktyvumu. Tai sukelia problemų

identifikuojant rūšis, kai išimtinai taikomas tik fenotipinis tyrimas, tačiau šis metodas dažniausiai

naudojamas išskirti Arcobacter spp. įprastose laboratorijose. Norint tiksliai nustatyti kitas

arkobakterijas reikia atlikti papildomus biocheminius testus ir/arba molekulinius metodus.

Molekuliniai metodai

DNR paremti aptikimo metodai, tokie kaip PGR, yra naudojami arkobakterijoms

identifikuoti. Priešingai nei klasikiniais metodais, kai nustatomos tik gyvos, galinčios augti

bakterijos, genomu paremti metodai aptinka DNR tiek iš gyvų, tiek mirusių bakterijų. Tai nesudaro

problemų, kada mėginiai yra šviežių išmatų arba iš aklosios žarnos su dideliu skaičiumi gyvybingų

arkobakterijų, tačiau yra rimtų sunkumų, kada tiriami aplinkos ar maisto mėginiai, kuriuose yra ir

gyvų, ir mirusių bakterijų. Pavyzdžiui, keptoje paukštienoje arba pasterizuotame piene bus didelis

skaičius žuvusių – negyvybingų arkobakterijų. Šis molekulinių metodų trūkumas yra susijęs ne tik

su arkobakterijomis, bet ir su kitais mikroorganizmais.

PGR metodo atradimas sukėlė tikrą revoliuciją molekulinės biologijos technologijų, taikomų

biologijos bei medicinos mokslų tyrimuose, medicininėje diagnostikoje bei teismo medicinos

praktikoje. Tai greita ir nebrangi metodika, leidžianti padauginti DNR fragmentus nuo

pikograminių iki mikrograminių kiekių. Žurnalas „Science” 1989 metais PGR pavadino svarbiausiu

metų mokslo įvykiu. PGR metodo esmė yra individo DNR fragmento padauginimas, dalyvaujant

fermentui polimerazei [34].

Polimerazinė grandininė reakcija (PGR) - tai nebrangus ir greitas specifinių DNR atkarpų

pagausinimo (amplifikacijos) metodas, galintis per keliolika minučių pagaminti tūkstančius

specifinių DNR fragmentų iš nedidelio kiekio DNR.

PGR ciklas susideda iš 3 etapų:

1. DNR išvyniojimas: aukštoje temperatūroje dviguba DNR grandinė išsivyniojama ir tampa

prieinama jungčiai su vienos DNR grandinės specialiai tam pagamintais 2 pradmenimis;

2. Pradmenų prijungimas: sumažinus temperatūrą, DNR pradmenys prisijungia prie bandomos

DNR molekulės atkarpose, kurių sekos sutampa su pradmens sekomis;

20

3. DNR sintezė: pakėlus temperatūrą, pradedant nuo pradmens, sintetinama nauja DNR

grandinė DNR polimerazės enzimo pagalba pagal bandomos DNR nukleotidų sekas. Ciklas

kartojamas kelis kartus, kuo daugiau ciklų tuo daugiau pagaminama DNR fragmentų.

Siekiant aptikti arkobakterijų genties bakterijas naudojamas 16S arba 23S rRNR regionas,

kuris yra PGR taikinys, nors mažiau specifiniai lokusai yra skirti nustatyti konkrečias rūšis.

Tradicinis PGR aptikimas reikalauja didesnės darbuotojų techninės patirties, kurios reikia siekiant

išvengti kryžminės amplifikuotos DNR taršos. Dėl šios ir kitų priežasčių buvo sukurta tikro laiko

PGR. Metodo privalumas yra tai, kad gausinimo reakcijos metu padauginama ne viena, o keletas

DNR sekų. Dauginės PGR eksperimentai reikalauja ypatingo dėmesio reakcijos sąlygų

optimizacijai. Tai pradmenų koncentracija, PGR buferio sudėtis, magnio chlorido ir

nuleozidtrifosfatų (dNTP) koncentracijų balansas, DNR mėginio ir termostabilių polimerazių

koncentracija bei gausinimo režimas. Didžiulis metodo jautrumas gali kelti problemų – reikia labai

saugotis, kad į PGR skirtą reakcijos mišinį nepatektų šalutinės DNR priemaišos [35]. Sėkminga

dauginės PGR optimizacija padidina reakcijos jautrumą, specifiškumą, pagerina netolygų

analizuojamų sričių gausinimo efektyvumą [34].

21

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1 Tyrimų planas

Tyrimai buvo atlikti LSMU Veterinarijos akademijoje Maisto saugos ir kokybės katedros

Gyvūninių maisto žaliavų saugos ir kokybės tyrimų laboratorijoje. Siekiant įvertinti šviežios

paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp. bakterijomis, mėginiai tyrimams rinkti

2014 m. vasario – gegužės ir rugsėjo – spalio mėnesiais. Iš viso surinkta 110 mėginių – 60 žalio

pieno (1 mėginys – 1l. pieno) bei 50 šviežios paukštienos (1 mėginys – 1 paukštienos blauzdelė).

Šviežios paukštienos bei žalio pieno mėginiai buvo renkami pirmadieniais Kauno mieste esančiose

turgavietėse bei prekybos centruose, iš čia esančių žalio pieno pardavimo automatų. Vidutiniškai

per savaitę buvo ištiriama 10 mėginių – vieną savaitę buvo tiriami paukštieno mėginiai, kitą – pieno

mėginiai. Iki tyrimo mėginiai saugoti šaldytuve +4o C temperatūroje ne ilgiau kaip 12 valandų.

Tyrimai atlikti etapais: 1) arkobakterijų išskyrimas iš maisto mėginių; 2) arkobakterijų

identifikavimas PGR metodu; 3) išskirtų arkobakterijų izoliatų atsparumo antibakterinėms

medžiagoms nustatymas; 4) statistinė duomenų analizė.

2.2 Arcobacter spp. išskyrimas iš maisto mėginių

Arkobakterijų išskyrimas iš maisto mėginių atliktas naudojant selektyvų pagausinimą.

Pristačius mėginius į laboratoriją steriliomis priemonėmis tyrimui buvo paimama 1g tiriamos

paukštienos arba 1ml žalio pieno. Tyrimui skirta mėginio dalis perkelta į homogenizavimo maišelį

užpiltant 9 ml Arcobacter selektyvaus pagausinimo sultinio (CMO 965 Oxoid., LTD., Basingstoke,

Hampshire, England) su penkių antibiotikų priedu: 5 – fluorouracilo (100mg/l)(F6627–5G, Sigma–

Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA), amfotericino B (10mg/l)(A9528–100MG, Sigma–Aldrich,

Saint Louis, Missouri, USA), cefoperazono (16mg/l)(C4292–1G, Sigma-Aldrich, Saint Louis,

Missouri, USA), novobiocino (32mg/l)(N1628–1G, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)

trimethoprimo (32mg/l)(T7883–5G Sigma–Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA). Toliau

paukštienos mėginiai buvo homogenizuoti persitaltinėje maišyklėje (BagMixer, Interscience 78860

st. Nom – France), pieno mėginiai – išmaišant homogenizavimo maišelio turinį purtymo būdu. Taip

paruošti mėginiai inkubuoti +30˚C temperatūroje 24 valandas termostate aerobinėmis sąlygomis.

Po selektyvaus pagausinimo arkobakterijos išskirtos užsėjant 20µl pagausinimo sultinio iš

homogenizavimo maišelio ant Petri lėkštelių su mCCDA agaru (Campylobacter Blood Free

Medium Base, Liofilchem s.r.l. Bacteriology products, Italy) su priedais (1– Campylobacter CCDA

Supplement Ref. 81037, Liofilchem s.r.l. Roseto D.A. – Italy; 2 – C.A.T. Selective Supplement

22

SR0174E, Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England). Užsėtos Petri lėkštelės inkubuotos

aerobinėmis sąlygomis +30˚C temperatūroje 48 valandas.

Po inkubavimo būdingos arba į arkobakterijas panašios kolonijos nuo Petri lėkštelių su

mCCDA agaru inokuliacine kilpele persėtos ant Petri lėkštelių su 5% defibrinuoto arklio kraujo

agaru (Blood Agar Base Nr.2 ISO 10560, Liofilchem s.r.l. Bacteriology products, Italy; Lysed

Horse Blood. Ref: HBL 100, E & Labaratories Limited, Burnhouse, Bannybridge, Scotland).

Užsėtos lėkštelės inkubuotos +37˚C temperatūroje 48 valandas termostate aerobinėmis sąlygomis.

Iš kiekvieno mėginio buvo persėjamos po 3 būdingos arba įtariamos kolonijos tolimesniems

tyrimams.

2.3 Arkobakterijų identifikavimas PGR metodu

2.3.1 Arcobacter spp. DNR išskyrimas

Po inkubavimo, nuo Petri lėkštelių inokuliacine kilpele paimtos kelios įtartinos arkobakterijų

kolonijos (0,5 – 1mm pilkai baltos, apvalios kolonijos) ir perkeltos į mėgintuvėlį su 200µl

„PrepMan Ultra“ DNR išskyrimo tirpalo (Applied Biosystems by Life Technologies, 2130

Woodward St. Austin, TX 788744, USA) ir išmaišyta su purtykle (Bio Vortex V1, Profitec, Gunnar

Holm – Petersen, GmbH and Co, Hamburg, Germany). Toliau mėgintuvėlis perkeltas į

termomikserį (Thermomixer compact, Eppendorf AG, Hamburg, Germany), ir kaitintas prie +99oC

temperatūros 10 minučių. Tada mėgintuvėliai buvo centrifūguojami 16 000 aps./min. greičiu ir

paimta 150µl viršutinio „PrepMan Ulta“ tirpalo, ir perkelta į kitą Epindorfo mėgintuvėlį.

Mėgintuvėliai vėl buvo centrifūguojami tomis pačiomis sąlygomis ir po centrifugavimo 70µl viršuje

esančio „PrepMan Ulta“ tirpalo su DNR buvo perkelta į naujus mėgintuvėlius, kurie iki tolesnio

tyrimo saugoti -20˚C temperatūroje.

2.3.2 Arcobacter spp. identifikavimas PGR metodu

Į 200µl PGR mėgintuvėlį buvo įpilama 12,5µl DreamTaq Green PCR Master Mix(2x) mišinio

(#K1081 1,25ml LOT 00121201, Thermo Scientific), po 1µl pradmenų (ButR, SkiR, Ther R, CibR,

ArcoF, Gyras F ir Gyras R (Thermo Fisher Scietific, Life technologies, Invitrogen Custom

Primers), 0,5µl tiriamosios bakterijų DNR ir 5µl sterilaus vandens (Water, nuclease – free 1,25ml

#R0581, LOT 00117365, Thermo Scientific). Reakcijos mišinį viso sudarė 25µl. PGR reakcija

vykdyta termocikleryje (Programmable Thermal Controller PTC – 100 SN:19176, MJ Research

Inc., Grove Street, Watertown, USA), esant tokioms sąlygoms (4 lentelė):

23

1. Pradinė denatūracija (94˚C 3min.)

2. Denatūracija (94˚C 45 s.)

3. Pradmenų prilipinimas (58˚C 45 s.)

4. Sintezė (72˚C 2 min.)

5. Galutinė sintezė (72˚C 5 min.)

4 lentelė. Polimerazinės grandininės reakcijos sąlygos

Temperatūra Laikas Ciklų skaičius

94˚C 3 min. 1

94˚C 45 sec.

30 58˚C 45 sec.

72˚C 2 min.

72˚C 5 min. 1

4˚C - -

Viso: 2 val. 32

Po DNR amplifikacijos į paruoštus 2% agarozės gelio (TopVision Agarose #R0491, LOT

00220705, Thermo Scientific) šulinėlius (pirmą ir paskutinį) buvo atmatuojama po 3µl DNR

žymeklio (GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, #SM0323, LOT 00117273, Thermo Scientific), o į

likusius po 11µl PGR produkto. Lovelis su geliu buvo įstatomas į elektroforezės vonelę pripildytą

buferiu (10xTBE Electrophoresis Buffer #B52, LOT 00114844, Thermo Scietific, Fermentas).

Elektroforezė vykdyta naudojant 120 V elektros srovę, kurios dažnis 98 mA, 1 valandą. Pasibaigus

elektroforezei, agarozės gelis perkletas į BioRAD (Molecular Imager Gel Doc XR+) aparatą ir

Image Lab kompiuterinės programos pagalba padaryta agarozės gelio fotografija, naudojant

ultravioletinius spindulius.

2.4 Atsparumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas

Arkobakterijų atsparumas antibiotikams buvo nustatytas agaro praskiedimo metodu užsėjant

atskiras šių bakterijų padermes ant paruoštų Petri lėkštelių su Mueller – Hinton agaru ir 5%

defibirinuoto avies kraujo priedu (Mueller Hinton Agar Ref. 610033, LOT 12159202 Liofilchem,

Italy; Defibrinated Sheep Blood 25ml, Ref. DSC025, LOT 70423168, E&O Labaratories Limited,

Burnhouse, Bonnybridge, Scotland) bei su skirtingomis antibiotikų koncentracijomis. Tyrimui buvo

pasirinkti 5 skirtingi antibiotikai (gentamicinas G3632–1G, cefriaksonas C5793–250MG,

24

eritromicinas E5389–1G, ciprofloksacinas 17850–5G–F ir tetraciklinas T3258–5G Saint Louis,

Missouri, USA) ir 7 skirtingos šių antibiotikų koncentracijos: 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 (µg/ml).

Tyrimams buvo paruošta bakterijų suspensija atitinkanti 109 KSV/ml bakterijų kiekį (vertinant

spektrofotometru bakterijų suspensijos optinį tankį OD600). Kiekvienos tiriamos padermės taip

paruoštos suspensijos pipete 5 µl buvo perkeliami ant atitinkamos koncentracijos Petri lėkštelių su

atitinkamais antibiotikais.

Taip užsėtos Mueller – Hinton agaro lėkšteles su antibiotikais inkubuotos +37˚C

temperatūroje 16 – 20 valandų termostate aerobinėmis sąlygomis. Vertinta kaip antibakterinės

medžiagos slopino bakterijų augimą ir kokia buvo minimali augimą slopinanti antibiotikų

koncentracija.

2.5 Statistinė duomenų analizė

Statistiškai duomenys buvo įvertinti Microsoft Office Excel 2007 programa ir SPSS 16.0

programiniu paketu, apskaičiuojant rodiklių statistinį patikimumą, o skirtumai tarp imčių

besiskiriančių pagal vieną požymį buvo vertinami skaičiuojant vienfaktorinę ANOVA analizę.

25

3. REZULTATAI

3.1 Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis

Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad šviežios paukštienos mėginių užkrėstumas Arcobacter spp.

bakterijomis buvo labai didelis ir siekė net 46%, t.y., iš 50 tirtų paukštienos mėginių arkobakterijos

buvo aptiktos 23 mėginiuose (df=50, p<0,001) (žr. 2 pav.). Tuo tarpu tirti žalio pieno mėginiai buvo

užkrėsti ženkliai rečiau (18,33%) ir iš 60 tirpų žalio pieno mėginių arkobakterijos aptiktos tik 11

mėginių (df=60, p=0,001) (žr. 2 pav.). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp šviežios

paukštienos bei žalio pieno užkrėstumo (χ2=14,55; df=4; p=0,006).

2 pav. Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis

Iš trečiame paveiksle pateiktų duomenų galime matyti, kad žiemą tirti šviežios paukštienos

mėginiai buvo santykinai mažiau užkrėsti arkobakterijomis (8 užkrėsti mėginiai), nei rinkti pavasarį

(15 užkrėstų mėginių).

3 pav. Sezono įtaka šviežios paukštienos užkrėstumui Arcobacter spp. bakterijomis

26

Tuo tarpu vertinant sezoninį žalio pieno užkrėstumą (4 pav.), galime matyti, kad didžioji dalis

arkobakterijomis užkrėstų mėginių buvo nustatyta pavasario laikotarpiu rinktuose mėginiuose.

4 pav. Žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. skirtingu laikotarpiu

3.2 Išskirtų arkobakterijų rūšinė įvairovė

Iš tiriamųjų maisto mėginių išskirtų arkobakterijų izoliatų identifiakvimas PGR metodu leido

sėkmingai identifikuoti visas keturias dažniausiai maisto žaliavose ir produktuose aptinkamas

arkobakterijų rūšis (5 pav.).

5 pav. Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas dauginės PGR metodu (1,9,16 –

DNR žymeklis GeneRuler 100 bp Plus; 2,12 – A.cryaerophilus (400bp); 3,5,6,7,8,11,13,14 –

A.butzleri (2061 bp); 4 – A. cibarius (1120 bp); 10 – A. skirrowii (198 bp); 15 – neigiama kontrolė)

Įvertinus išskirtų iš tiriamųjų maisto mėginių arkobakterijų izoliatų rūšių įvairovę PGR

metodu nustatyta, kad šviežios paukštienos mėginiai buvo užkrėsti skirtingomis arkobakterijų

rūšimis (6 pav.). Dominuojanti arkobakterijų rūšis buvo A. butzleri aptikta 16 paukštienos mėginių,

27

tuo tarpu A. cryaerophilus – keturiuose, A. cibarius dvejuose, o A. skirrowii tik viename tirtame

mėginyje.

Tyrimai taip pat parodė, kad tas pats mėginys gali būti užkrėstas ir keliomis skirtingomis

arkobakterijų rūšimis, nes dvi arkobakterijų rūšys buvo aptiktos tame pačiame šviežios paukštienos

mėginyje – A. butzleri ir A. cryaerophilus.

Tuo tarpu visi arkobakterijų izoliatai išskirti iš 11 žalio pieno mėginių, pirktų prekybos centre

esančio pieno automato, buvo identifikuoti kaip A. butzleri rūšis.

6 pav. Arkobakterijų paplitimas šviežioje paukštienoje

28

3.3 Arkobakterijų atsparumas antibiotikams

3.3.1 Arkobakterijų išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumas antibiotikams

Atlikti išskirtų iš šviežios paukštienos arkobakterijų padermių atsparumo antibakterinėms

medžiagoms tyrimai atskleidė, kad šių bakterijų atsparumas tam pačiam antibiotikui buvo gana

panašus (5 lentelė).

5 lentelė. Arkobakterijų, išskirtų iš šviežios paukštienos mėginių, atsparumas antibiotikams

Eil.

Nr. Arkobakterijų rūšis

Antibiotikų minimali slopinanti koncentracija (MSK) µg/ml

Gentamicinas Eritromicinas Ciprofloksacinas Tetraciklinas Ceftriaksonas

1. A. butzleri 1 16 4 0,5 4

2. A. butzleri 1 16 4 0,5 4

3. A. butzleri 1 16 4 0,5 4

4. A. butzleri 1 16 4 0,5 4

5. A. butzleri 2 16 4 0,5 4

6. A. butzleri 1 16 4 0,5 4

7. A. butzleri 1 16 4 0,5 4

8. A. butzleri 1 16 4 0,5 8

9. A. butzleri 1 16 2 0,5 4

10. A. butzleri 1 32 2 1 8

11. A. butzleri 1 16 4 0,5 4

12. A. butzleri 1 16 4 0,5 4

13. A. butzleri 0,5 16 4 0,5 4

14. A. butzleri 1 32 4 0,5 4

15. A. butzleri 1 32 4 1 4

16. A. butzleri 0,5 16 4 0,5 4

17. A. cryaerophilus 1 4 4 0,5 1

18. A. cryaerophilus 2 4 4 1 2

19. A. cryaerophilus 1 4 4 1 2

20. A. cryaerophilus 1 2 2 0,5 1

21. A. cibarius 1 2 0,5 0,5 1

22. A. cibarius 1 2 0,5 0,5 0,5

23. A. skirrowii 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Tyrimai parodė, kad net 13 iš 16 tirtų A. butzleri rūšies padermių augimą slopino 1 µg/ml

gentamicino koncentracija, 1 vienos padermės - 2 µg/ml koncentracija ir tik vienintelė padermė

buvo dar jautresnė gentamicinui, kada ir 0,5 µg/ml gentamicino koncentracija slopino šios

bakterijos augimą. Nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijos išskirtos iš šviežios paukštienos buvo

jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml; 14 iš 16 padermių), o atspariausios eritromicinui (MSK

16 µg/ml (13 iš 16 padermių); 32 µg/ml (3 iš 16 padermių)). A. cryaerophilus rūšies bakterijos

jautriausios taip pat tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (3 iš 4 padermių); 1 µg/ml (1 iš 4 padermių)), o

29

atspariausios eritromicinui ir ciprofloksacinui (MSK 2 µg/ml (1 iš 4 padermių); 4 µg/ml (3 iš 4

padermių)). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (2 iš 2

padermių)), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml (2 iš 2 padermių)). Vienintelės išskirtos A.

skirrowii rūšies atsparumas visiems tirtiems antibiotikams tesiekė 0,5 µg/ml.

3.3.2 Arkobakterijų išskirtų iš žalio pieno atsparumas antibiotikams

Atlikus išskirtų iš žalio pieno arkobakterijų izoliatų analogišką atsparumo antibakterinėms

medžiagoms įvertinimą, gauti tyrimo rezultatai (6 lentelė) atskleidė, kad šių bakterijų atsparumas

tiems patiems antibiotikams buvo gana panašus. Tyrimai parodė, kad A. butzleri rūšies bakterijų

padermės išskirtos iš žalio pieno buvo jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (8 iš 11 padermių);

1 µg/ml (3 iš 11 padermių)), bei gentamicinui (MSK 0,5 µg/ml (4 iš 11 padermių); 1 µg/ml (MSK 7

iš 11 padermių)). Atspariausios A. butzleri padermės nustatytos eritromicinui (MSK 4 µg/ml (3 iš

11 padermių); 8 µg/ml (7 iš 11 padermių)).

6 lentelė. Arkobakterijų išskirtų iš žalio pieno atsparumas antibiotikams

Eil.

Nr. Arkobakterijų rūšis Antibiotikų minimali slopinanti koncentracija µg/ml

Gentamicinas Eritromicinas Ciprofloksacinas Tetraciklinas Ceftriaksonas

1. A. butzleri 1 8 4 0,5 4

2. A. butzleri 1 8 4 0,5 4

3. A. butzleri 1 8 4 1 4

4. A. butzleri 0,5 8 2 0,5 2

5. A. butzleri 1 8 4 0,5 4

6. A. butzleri 0,5 4 4 0,5 4

7. A. butzleri 1 8 4 1 4

8. A. butzleri 1 4 4 0,5 4

9. A. butzleri 1 8 4 1 2

10. A. butzleri 0,5 4 2 0,5 4

11. A. butzleri 0,5 4 4 0,5 4

30

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Šių tyrimų metu buvo įvertinta šviežios paukštienos bei žalio pieno, įsigyto iš mažmeninės

prekybos vietų Kaune, užkrėstumas Arcobacter genties bakterijomis bei nustatytas išskirtų

arkobakterijų izoliatų atsparumas antibakterinėms medžiagoms.

Siekiant gauti kiek įmanoma patikimesnius ir tikslesnius rezultatus, buvo pasirinktas

arkobakterijų nustatymo metodas – apimantis pagausinimą specifiniame Arcobacter sultinyje su 5

antibiotikų priedu bei po to sekantį sėjimą ant mCCDA agaro su CAT priedu, inkubuojant 30˚C

temperatūroje aerobinėmis sąlygomis. Merga ir bendraautoriai (2010) Jungtinėje Karalystėje atliko

tyrimus, kurių tikslas buvo ištirti jau naudojamų arkobakterijų nustatymo metodų jautrumą ir

specifiškumą [36]. Buvo pasirinkti 5 dažniausiai mokslininkų taikomi arkobakterijų aptikimo

metodai:

HH (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su 5 antibiotikų

priedu: 5-fluorouracilas (100mg/l), amfotericinas B (10mg/l), cefoperazonas (16mg/l),

novobiocinas (32mg/l), trimetoprimas (64mg/l); bakterijų išskyrimas ant H medium agaro su

tais pačiais 5 antibiotikais; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis sąlygomis) [32].

HCC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su 5 antibiotikų

priedu: 5-fluorouracilas (100mg/l), amfotericinas B (10mg/l), cefoperazonas (16mg/l),

novobiocinas (32mg/l), trimetoprimas (64mg/l); bakterijų išskyrimas ant mCCDA agaro su

CAT priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis sąlygomis) [37].

ACH (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su CAT priedu

(cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l); bakterijų

išskyrimas ant H medium agaro 5-ių antibiotikų priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis

sąlygomis) [38].

ACCC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su CAT priedu

(cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l); bakterijų

išskyrimas ant mCCDA agaro su CAT priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis

sąlygomis).

CC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Campylobacter sultinys su 5%

defibrinuoto arklio kraujo ir CVTC priedu (cefoperazonas (20mg/l), vankomicinas (20mg/l),

trimetoprimas (20mg/l), cikloheksimidas (50mg/l); bakterijų išskyrimas ant Campylobacter

specific agaro; inkubuota 36˚C temp. mikroaerofilinėmis sąlygomis) [37].

Autoriai (Merga ir kt., 2010) atlikę tyrimus padarė išvadą, kad pats specifiškiausias (63,9%) ir

jautriausias (70,7%) yra HCC arkobakterijų nustatymo metodas, po to sekė HH (59,7% ir 41,5%),

31

CC (43,2% ir 43,9%), ACH (23,9% ir 43,9%) ir mažiausiai specifiškas (16,6%) bei jautrus (43,9%)

– ACCC metodas [36].

Iki šiol tokių tyrimų Lietuvoje nebuvo atlikta ir šis tyrimas buvo pirmasis kurio metu

nagrinėtas arkobakterijų paplitimas maiste. Tyrimų rezultatai parodė, kad tirtų maisto mėginių

užkrėstumas arkobakterijomis buvo labai didelis ir šviežios paukštienos užkrėstumas (46%) buvo

didesnis nei tirtų žalio pieno mėginių (18,22%).

Skirtingai nei Lietuvoje, panašūs tyrimai yra atliekami ir kitose šalyse. Ispanijoje paukštienos

užkrėstumas arkobakterijomis siekė 45% (23 iš 51 mėginių) [39], Irane Arcobacter spp.

užkrėstumas paukštienoje siekė 45% (244 iš 540 mėginių) [40]. Malaizijoje buvo tirtas šaldytos ir

žviežios paukštienos užkrėstumas, kuris siekė 39% (48 iš 123 mėginių). Arkobakterijų išskyrimui

naudotas HCC metodas. Verta pažymėti, kad šviežios paukštienos užkrėstumas arkobakterijomis

buvo šiek tiek didesnis (25 iš 61 (41%)), nei atšaldytos (23 iš 62 (37,1%)) [10].

Vertinant sezoniškumo įtaką šviežios paukštienos užkrėstumui arkobakterijomis atlikti

tyrimai rodo, kad paukštienos mėginiai buvo santykinai mažiau užkrėsti arkobakterijomis (8

užkrėsti mėginiai) žiemą, nei rinkti pavasarį (15 užkrėstų mėginių). Tyrimų, nagrinėjančių

sezoniškumo įtaką arkobakterijų paplitimui maisto produktuose kol kas nėra, tačiau galėtume daryti

prielaidą, kad aplinkos temperatūra susijusi su spartesniu arkobakterijų dauginimusi produkte.

Tuo tarpu analizuojant žalio pieno užkrėstumą arkobakterijomis situacija įvairiose šalyse

buvo skirtinga – Malaizijoje pieno užkrėstumas siekė 5,7% (naudotas ACH metodas) [20],

Suomijoje – 15% (26 iš 177 mėginių; ACCC metodas) [13], Turkijoje - 36% (18 iš 50 mėginių;

modifikuotas AC metodas – selektyviam bakterijų pagausinimui naudotas specifinis Arcobacter

sultinys su CAT priedu (cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l);

bakterijų išskyrimui naudotas kraujo agaras)) [12], Šiaurės Airijoje – 46% [41].

Vertinant sezoniškumo įtaką žalio pieno užkrėstumui arkobakterijomis atlikti tyrimai rodo,

jog didžioji dalis arkobakterijomis užkrėstų žalio pieno mėginių buvo nustatyta pavasario

laikotarpiu. Tačiau šiltesnio rudens sezono metu, iš 20 pieno mėginių nei viename nebuvo nustatyta

arkobakterijų. Tokius rezultatus sudėtinga vertinti, nes nėra atlikta tyrimų vertinančių sezoniškumo

įtaką pieno užkrėstumui arkobakterijomis. Visgi gautus tyrimo rezultatus galėtume sieti su tuo, kad

galbūt žalio pieno pardavimo automatai buvo kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti, arba pardavimui

buvo tiekiamas sveikų arkobakteriozės atžvilgiu karvių pienas.

Atlikus išskirtų izoliatų rūšinės įvairovės nustatymą PGR metodu (atliktas remiantis Douidah

ir bendraautorių (2010) aprašytu metodu [42] su tam tikromis modifikacijomis – vietoj 5 µl

10×PCR buferio naudota 12,5µl DreamTaq Green PCR Master Mix (2x), o galutinis reakcijos

mišinys sudarė 25 µl vietoj 50 µl) nustatėme, kad mažmeninėje prekyboje parduodamoje

32

paukštienoje dominavo A. butzleri rūšies bakterijos (69,56%), A. cryaerophilus (17,39%), A.

cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%). Skirtingi rezultatai gauti Vokietijoje, kai paukštienoje

nustatytos išskirtinai A. butzleri rūšies arkobakterijos (15 iš 56 tirtų mėginių) [43]. Tačiau panašūs

rezultatai gauti lyginant Irano mokslininkų atliktus tyrimus, kurių metu nustatyta, kad paukštienoje

dominavo A. butzleri rūšies bakterijos (73%), po to sekė A. cryaerophilus (9%) [40]. Korėjoje

atlikto tyrimo metu nustatyta, kad vėl dominavo A. butzleri (18,9%), A. cryaerophilus (3,3%) [44],

o Malaizijoje visi 48 iš 123 teigiami arkobakterijų atžvilgiu mėginiai priskirti imtinai A. butzleri

rūšiai [10].

Mūsų atlikto tyrimo duomenis piene nustatytos tik vienos rūšies arkobakterijos – A. butzleri

(100%). Tačiau remiantis kitais mokslininkų atliktais tyrimais ir studijomis kitose šalyse, nustatyta,

kad piene, tirtame Turkijoje taip pat dažniausiai dominavo A. butzleri (38,89%), po to sekė A.

cryaerophilus (22,23%) ir A. skirrowii rūšies bakterijos (11,12%) [12]. Papildomai, pieno

mėginiuose kartu rastos kelios arkobakterijų rūšys – A. butzleri ir A. cryaerophilus. Kito 2011

metais Suomijoje atlikto tyrimo metu piene dominavo A. butzleri (96%), A. cryaerophilus – 4%

[13]. Taip pat pieno mėginiuose tirtuose Malaizijoje kartu rastos netgi kelios arkobakterijų rūšys –

A. butzleri ir A. skirrowii bei A. butzleri ir A. cryaerophilus [20].

Atlikus išskirtų iš maisto mėginių arkobakterijų izoliatų atsparumą antibakterinėms

medžiagoms nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijos išskirtos iš šviežios paukštienos bei žalio

pieno atspariausios eritromicinui, o jautriausios tetraciklinui. Tiesa, verta pažymėti, jog A. butzleri

padermių, išskirtų iš šviežios paukštienos, augimą slopino 16 µg/ml eritromicino koncentracija (13

iš 16 padermių), kai tuo tarpu išskirtų iš žalio pieno 8 µg/ml (7 iš 11 padermių). Tačiau vertinant A.

butzleri padermių jautrumą tetraciklinui tokių skirtumų nepastebėta: 0,5 µg/ml (14 iš 16 iš

paukštienos išskirtų padermių), 0,5 µg/ml (8 iš 11 iš žalio pieno išskirtų padermių). Atlikti tyrimai

parodė labai panašius rezultatus, vertinant A. butzleri padermių atsparumą kitoms antibakterinėms

medžiagoms. Nustatyta minimali A. butzleri bakterijų augimą slopinanti antibiotiko gentamicino

koncentracija 1µg/ml (13 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 7 iš 11 iš žalio pieno išskirtų

padermių), ciprofloksacino 4 µg/ml (14 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 9 iš 11 iš žalio pieno

išskirtų padermių) ir cefriaksono 4 µg/ml (15 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 9 iš 11 iš žalio

pieno išskirtų padermių).

Insook ir bemdraautoriai (2007) atliko panašius tyrimus, kurių metu siekė išsiaiškinti

arkobakterijų, išskirtų iš paukštienos skerdienos mėginių, atsparumą antibakterinėms medžiagoms.

Nustatytas atsparumas antibiotikams skyrėsi nuo mūsų tyrimo metu nustatyto atsparumo (MSK):

ciprofloksacino ≥4 µg/ml, eritromicino ≥32 µg/ml, gentamicino ≥16 µg/ml, tetraciklino ≥16 µg/ml.

Iš 140 A. butzleri padermių nei viena nebuvo atspari ciprofloksacinui, gentamicinui ir tetraciklinui

33

bei tik 6 (8,4%) padermės buvo atsparios eritromicinui. Iš 34 A. cryaerophilus padermių

ciprofloksacinui atspari buvo tik 1 (2,94%), o etritomicinui, gentamicinui ir tetraciklinui visos

padermės buvo neatsparios [27].

Lyginant Insook ir bendraautorių (2007) bei mūsų tyrimo rezultatus, pasirenkant tokias pat

MSK ribas, iš šviežios paukštienos išskirtos A. butzleri rūšies atsparumas ciprofloksacinui siekė 4

µg/ml (atsparios 14 iš 16 (87,5%) padermių), eritromicinui 16 µg/ml (atsparios 3 iš 16 (18,75%)

padermių), gentamicinui 1µg/ml (visos neatsparios), tetraciklinui 0,5 µg/ml (visos neatsparios).

Panašūs rezultatai pastebimi ir su A. cryaerophilus rūšimi – ciprofloksacinas 4 µg/ml (atsparios 3 iš

4 (75%) padermių), o eritromicinas 4 µg/ml, gentamicinas 1 µg/ml, tetraciklinas 1 µg/ml – visos

tirtos padermės buvo neatsparios.

Ferreira ir bendraautoriai (2013) [28] taip pat tyrinėjo A. butzleri, išskirtų iš paukštienos

skerdienos mėginių, atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Nustatyta atsparumo ciprofloksacinui

MSK buvo tokia pat kaip ir Insook ir bendraautorių (2007) (≥4 µg/ml), tačiau gentamicinui buvo

per pus mažesnė ir siekė ≥8 µg/ml. Tačiau lyginant su mūsų duomenimis gauti panašūs rezultatai,

net 14 iš 16 (87,5%) padermių yra galėtų būti priskiriamos kaip atsparios ciprofloksacinui, o

gentamicinui visos 16 padermių neatsparios.

Atabay ir bendraautoriai (2001) tyrė A. butzleri, išskirtų iš paukščių skerdenos mėginių,

parduodamų mažmeninės prekybos tinkluose, atsparumą antibiotikams. Nustatytos MSK buvo

tokios: eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 30 µg. Atlikus testus nustatyta, kad 34 iš

39 (87,17%) A. butzleri padermių buvo neatsparios eritromicinui, 38 iš 39 (97,43 %) neatsparios

gentamicinui ir visos 39 (100%) neatsparios tetraciklinui [45].

Po daugiau nei dešimtmečio Abay ir bendraautoriai (2012), atliko panašius tyrimus [46].

Pasirinktos atsparumo antibiotikams MSK ribos buvo identiškos kaip ir Atabay ir bendraautorių –

eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 30 µg. Nustatyta, kad 6 iš 31 (19,3%) A.

butzleri padermių atsparios eritromicinui, 100% neatsparios gentamicinui, o 18 iš 31 (58%)

neatsparios tetraciklinui.

Rahimi 2014 m. irgi atliko panašius tyrimus Irane [47]. Pasirinktos MSK buvo labai panašios

– ciprofloksacino 15 µg, eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 15 µg. Išsiaiškinta, jog

A. butzleri – ciprofloksacinas atsparios 1 iš 64 (1,5%), o eritromicinui, gentamicinui ir tetraciklinui

visos padermės buvo neatsparios. Taip pat visos 5 tirtos A. cryaerophilus padermės buvo

neatsparios minėtiems antibiotikams. Tačiau A. skirrowii viena padermė (1 iš 2) buvo atspari

eritromicinui, o likusiems antibiotikams taip pat buvo neatspari.

Yesilmen ir bendraautoriai (2014) tyrė A. bulzleri, išskirtų iš karvių pieno, atsparumą

antibakterinėms medžiagoms. Nustatytos MSK ribos: eritromicino 15 µg/disc, tetraciklino 30

34

µg/disc, gentamicino+amoksicilino 35 µg/disc. Eritromicinas – 13 iš 16 padermių (81,25%)

atsparios, tetraciklinas – 15 iš 16 (93,75%) atsparios, gentamicinas+amoksicilinas – 10 iš 16

padermių (62,5%) buvo neatsparios [12].

Taigi lyginant mūsų atlikto tyrimo rezultatus su Yesilmen ir bendraautorių (2014) galėtume

daryti prielaidą, kad visos A. butzleri padermės išskirtos iš žalio pieno buvo neatsparios visiems

tirtiesiems antibiotikams.

Fera ir bendraautoriai (2002) metais atliktos studijos metu nustatyta A. butzleri ir A.

cryaerophilus atsparumo ceftriaksonui MSK buvo ≤8 µg/ml [48]. Remiantis mūsų atliktais tyrimais

matyti, kad tiek A. butzleri, tiek A. cryaerophilus iškirtos iš paukštienos ir žalio pieno yra

neatsparios ceftriaksonui.

Lyginant arkobakterijų atsparumą toms pačioms antibakterinėms medžiagoms su jų

filogenetinių kaimynu – kampilobakterijomis pastebimi skirtumai. Insook ir bendraautoriai (2007)

atliktos tyrimų studijos metu nustatyta, kad C. jejuni išskirtų iš šviežios paukštienos mėginių

atsparumas ciprofloksacinui sudarė 30,3% (57 iš 188 padermių), C. coli 3,7% (1 iš 27 padermių) o

iš viso sudarė 27% (58 iš 215 padermių). Tiek eritromicinui, tiek gentamicinui C. jejuni ir C. coli

visos visos tirtos padermės buvo neatsparios. Tačiau tetraciklinui net 99,5% (187 iš 188 padermių)

C. jejuni atsparios, o C. coli 96,3% (26 iš 27 padermių). Tuo tarpu lygiagrečiai tiriant A. butzleri

padermių atsparumą nustatyta, kad ciprofloksacinui, gentamicinui ir tetraciklinui buvo neatspari, o

eritromicinui atsparumas sudarė 8,4% [27].

Kovalenko ir bendraautoriai 2014 metais Latvijoje atliko kampilobakterijų, išskirtų iš

paukštienos, parduodamos mažmeninės prekybos vietose, atsparumo antibakterinėms medžiagoms

tyrimus [49]. Nustatytos atsparumo antibiotikams MSK ribos buvo tokios: eritromicino >4 µg/ml

(C. jejuni), >16 µg/ml (C. coli), ciprofloksacino >1 µg/ml, tetraciklino >2 µg/ml ir gentamicino >1

µg/ml (C. jejuni), o >2 µg/ml (C. coli). Atlikus tyrimus nustatyta, kad C. jejuni padermių

atsparumas eritromicinui sudarė 32,2%, ciprofloksacinui visos 28 tirtos padermės buvo atsparios,

atsparumas tetraciklinui siekė 78,6%, o gentamicinui 57,2%. Kitos tirtos rūšies - C. coli atsparumas

eritromicinui sudarė 56,7%, ciprofloksacinui visos tirtos 30 padermių buvo atsparios, atsparumas

tetraciklinui siekė 76,7%, o gentamicinui – 66,6%.

Mūsų žiniomis, tokio pobūdžio tyrimas, siekiant nustatyti mažmeninėje prekyboje

parduodamos šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą arkobakterijomis, Lietuvoje buvo

atliktas pirmą kartą. Atlikti ir Lietuvoje tyrimai parodė, kad nors ir Europos Sąjungoje šiuo metu

arkobakterijų skaičius paukštienoje ir žaliame piene nėra reglamentuojamas, būtina plėsti tokio

pobūdžio tyrimus, siekiant išsiaiškinti maisto žaliavų ir produktų vaidmenį žmonių arkobakteriozės

epidemiologijoje.

35

5. IŠVADOS

1. Tyrimai parodė, net 46% mažmeninėje prekyboje parduodamos šviežios paukštienos yra

užkrėsta Arcobacter genties bakterijomis, tuo tarpu prekybos centre iš automato

parduodamo žalio pieno užkrėstumas yra mažesnis ir siekia 18,22%. Nustatyta, kad šviežia

paukštiena yra dažniau užkrėsta arkobakterijomis nei žalias pienas parduodamas

mažmeninėje prekyboje (χ2=14,55; df=4; p=0,006).

2. Šviežioje paukštienoje dažniausiai buvo aptinkamos A. butlzeri (69,56%), rečiau A.

cryaerophilus (17,39 proc.), A. cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%) rūšies

arkobakterijomis.

3. Nepasterizuotas pienas buvo išskirtinai užkrėstas tik A. butzleri rūšies arkobakterijomis.

4. A. butzleri išskirtos iš šviežios paukštienos pasižymėjo didesniu atsparumu antibakterinėms

medžiagoms (eritromicino MSK 16 µg/ml, ceftriaksono MSK 8 µg/ml) nei išskirtos iš pieno

(eritromicino MSK 8 µg/ml, ceftriaksono MSK 4 µg/ml).

5. A. butzleri išskirtos išskirtos iš žalio pieno buvo jautriausios tetraciklinui – MSK 0,5 µg/ml

(14 iš 16 šviežios paukštienos išskirtų padermių ir 8 iš 11 žalio pieno išskirtų padermių).

6. A. cryaerophilus jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui ir

ciprofloksacinui (MSK 4 µg/ml). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir tetraciklinui

(MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml). A. skirrowii atsparumas

visiems tirtiems antibiotikams siekė 0,5 µg/ml.

36

6. REKOMENDACIJOS

Kadangi atlikti tyrimai parodė, kad šviežia paukštiena ir žalias pienas yra užkrėsti

Arcobacter spp., todėl būtina skirti ypatingą dėmesį šių produktų terminiam apdorojimui bei

higienos laikymuisi, siekiant išvengti kryžminės taršos.

Manome, kad būtų tikslinga atlikti daugiau tyrimų, siekiant nustatyti užkrėstų

arkobakterijomis maisto žaliavų ir produktų (šviežios paukštienos, žalio pieno ir kt.) galimą

įtaką visuomenės sveikatai.

37

7. PADĖKOS

Dėkoju darbo vadovui prof. dr. Mindaugui Malakauskui už suteiktas vertingas konsultacijas

ruošiant šį darbą. Taip pat norėčiau padėkoti rezidentei Jurgitai Aksomaitienei, doktorantėms –

Viktorijai Lėgaudaitei – Lydekaitienei bei Gintarei Zakarienei už pagalbą Gyvūninių maisto žaliavų

saugos ir kokybės tyrimų laboratorijoje.

38

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Collado L., Figueras J. M. Taxonomy, Epidemiology, and Clinical Prelevance of the Genus

Arcobacter. Clinical Microbiology Reviews 2011, Volume 24, No. 1, P. 174 – 192.

2. Saleem S., Kamili A. N., Kakru D. K., Bandh S. A. Microbiology of Genus Arcobacter: A

Review. Journal of Pharmacy Research 2011, Vol. 4, Issue 12, P. 4615 – 4617.

3. Shah A.H., Saleha A.A., Zunita Z. and Murugaiyah M. Arcobacter An emerging threat to

animals and animal origin food products? Trends in Food Science & Technology 2011,

Volume 22, P. 225 – 236.

4. Hoa T.K. Ho, Len J.A. Lipman, Gaastra W. Arcobacter, what is known and unknown about

a potential foodborne zoonotic agent! Veterinary Microbiology 2006, Volume 115, Issues 1

– 3, P. 1 – 13.

5. Levican A., Collado L., Figueras M. J. Arcobacter cloacae sp. nov. and Arcobacter suis sp.

nov., two new species isolated from food and sewage. Systematic and Applied Microbiology

2013, Volume 36, P. 22 – 27.

6. Kiehlbauch K. A., Brenner D. J. Campylobacter butzleri isolated from humans and animals

with diarrheal illness. Journal of Clinical Microbiology 1991, Volume 29, Number 2, P. 376

– 385.

7. Milesi S. Emerging pathogen Arcobacter spp. in food of animal origin. Doctoral Program in

Animal Nutrition and Food Safety 2010. Universitą degli Studi di Milano.

8. Houf K., Stephen L. W. On, Vandamme P., Coenye T., Jan M., Hoof J. V. Arcobacter

cibarius sp. nov., isolated from broiler carcasses. International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology 2005, Volume 55, P. 713 – 717.

9. Alonso R., Girbau C., Martinez – Malaxetxebarria I., Fernández – Astorga A. Multilocus

sequence typing reveals genetic diversity of foodborne Arcobacter butzleri isolates in the

North of Spain. International Journal of Food Microbiology 2014, Volume 191, P. 125 –

128.

10. Amare L.B., Saleha A.A., Zunita Z., Jalila A., Hassan L. Prevalence of Arcobacter spp. on

chicken meat at retail markets and in farm chickens in Selangor, Malaysia. Food Control

2011, Volume 22, Issue 5, P. 732 – 736.

11. Balamurugan S., Rafath A., Chambers J. R. Survival of Arcobacter butzleri on vacuum

packaged chill stored beef. Food Research International 2013, Volume 52, Issue 2, P. 503 –

507.

39

12. Yesilmen S., Vural A., Mehmet E. E., Yildirim I. H. Prevalence and antimicrobial

susceptibility of Arcobacter species in cow milk, water buffalo milk and fresh village

cheese. International Journal of Food Microbiology 2014, Volume 184, P. 11 –14.

13. Revez J., Huuskonen M., Ruusunen M., Lindstrom M., Hanninen M. L. Arcobacter Species

and Their Pulsed – Field Gel Electrophoresis Genotypes in Finnish Raw Milk during

Summer. Journal of Food Protection 2013, Volume 76, No. 9, P. 1630 – 1632.

14. Collado L., Ronald J., Vasquez N., Telsaint C. Antimicrobial resistance and virulence genes

of Arcobacter isolates recovered from edible bivalve molluscs. Food Control 2014, Volume

46, P. 508 – 512.

15. Park SY, Ha SD. Development of an absorbance-based response model for monitoring the

growth rates of Arcobacter butzleri as a function of temperature, pH, and NaCl

concentration. Poultry Science 2015, Volume 94, No.1, P. 136 –143.

16. Kjeldgaard J., Jorgense K. and Ingmer H. Growth and survival at chiller temperatures of

Arcobacter butzleri. International Journal of Food Microbiology 2009, Volume 131, P. 256

– 259.

17. Cervenka L., Kristlova J., Peskova I., Vytrosova J., Pejchalova M., and Brozkova I.

Persistance of Arcobacter butzleri CCUG 30484 on plastic, stainless steel and glass glasses.

Brazilian Journal of Microbiology 2008, Volume 39, P. 517 – 520.

18. Phillips C. A., Bates P. The survival of Arcobacter butzleri, an emerging human pathogen,

in the presence of acids or ethanol. Nutrition and Food Sciences 2004, Volume 34, Issue 5,

P. 210 – 215.

19. Tabatabaei M., Hesamaddin A. S., Hossein S., Khoshbakht R. Occurrence of six virulence-

associated genes in Arcobacter species isolated from various sources in Shiraz, Southern

Iran. Microbial Pathogenesis 2014, Volume 66, P. 1 – 4.

20. Shah A.H., Saleha A.A., Zunita Z., Cheah Y.K., Murugaiyah M., Korejo N.A. Genetic

characterization of Arcobacter isolates from various sources. Veterinary Microbiology 2012,

Volume 160, P. 355 – 361.

21. De Smet S., De Zutter L., Houf K. Small ruminants as carriers of the emerging foodborne

pathogen Arcobacter on small and medium farms. Small Ruminant Research 2011, Volume

97, P. 124 – 129.

22. Snelling W. J., Matsuda M., Moore J. E. and Dooley J. S. G. Under the microscope:

Arcobacter. Letters in Applied Microbiology 2006, Volume 42, P. 7 – 14.

40

23. Yan J. J., Ko W. C., Huang A. H., Chen H. M., Jin Y. T. and Wu J. J. Arcobacter butzleri

bacteremia in a patient with liver cirrhosis. Journal of Formos Medical Association 2004,

Volume 99, P. 166 – 169.

24. Samie A., Obi C. L., Barrett L. J., Powell S. M., and Guerrant R. L. Prevalence of

Campylobacter species, Helicobacter pylori and Arcobacter species in stool samples from

the Venda region, Limpopo, South Africa: studines using molecular diagnostic methods.

Journal of Infection 2007, Volume 54, Issue 6, P. 558 – 566.

25. Yildiz H., Aydin S. Pathological effects of Arcobacter cryaerophilus infection in rainbow

trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Acta Veterinaria Hungarica 2006, Volume 54, P.

191 – 199.

26. Adesiji Y. O., Benjamin E. O., Jannet O. O. Histopathological changes associated with

experimental infection of Arcobacter butzleri in albino rats. Sierra Leone Journal of

Biomedical Research 2009, Volume1, Issue 2, P. 4 – 9.

27. Insook S., Englen M. D., Berran M. E., Fedorka – Cray P. J., Harrison M. A. Antimicrobial

resistance of Arcobacter and Campylobacter from broiler carcasses. International Journal of

Antimicrobial Agents 2007, Volume 29, P. 451 – 455.

28. Ferreira S., Fraqueza M. J., Queiroz João A., Domingues F. C., Oleastro M. Genetic

diversity, antibiotic resistance and biofilm-forming ability of Arcobacter butzleri isolated

from poultry and environment from a Portuguese slaughterhouse. International Journal of

Food Microbiology 2013, Volume 162, P. 82 – 88.

29. Ünver A., Atabay H. İ., Şahin M., Çelebi Ö. Antimicrobial susceptibilities of various

Arcobacter species. Turkish Journal of Medical Sciences 2013, Volume 43, P. 548 – 552.

30. Ferreira S., Silva F., Queiroz Joćo A., Oleastro M., Domingue F. C. Resveratrol against

Arcobacter butzleri and Arcobacter cryaerophilus: Activity and effect on cellular functions.

International Journal of Food Microbiology 2014, Volume 180, P. 62 – 68.

31. Shah A. H., Saleha A. A., Zunita Z., Murugaiyah M., Aliyu A. B., Jafri N. Prevalence,

Distribution and Antibiotic Resistance of Emergent Arcobacter spp. from Clinically Healthy

Cattle and Goats. Transboundary and Emerging Diseases 2013, Volume 60, P. 9 – 16.

32. Houf K., Devriese L. A., De Zutter L., Hoof J. V., Vandamme P. Development of a new

protocol for the isolation and quantification of Arcobacter species from poultry products.

International Journal of Food Microbiology 2001, Volume 71, P. 189 – 196.

33. Antolı́n A., González I., Garcı́a T., Hernández Pablo E., Rosario M. Arcobacter spp.

enumeration in poultry meat using a combined PCR – ELISA assay. Meat Science 2001,

Volume 59, Issue 2, P. 169 – 174.

41

34. Ambrasienė D. Naujausių mokslinių pasiekimų biotechnologijos srityje mokslinė studija.

VDU Gamtos fakultetas 2007.

35. Houf K., Tutenel A., De Zutter L., Hoof J. V., Vandamme P. Development of a multiplex

PCR assay for the simultaneus detection and identification of Arcobacter butzleri,

Arcobacter cryaerophilus and Arcobacter skirrowii. FEMS Microbiology Letters 2000,

Volume 193, P. 89 – 94.

36. Merga J. Y., Leatherbarrow A. J. H., Winstanley C., Bennett M., Hart C. A., Miller W. G.

and Williams N. J. Comparison of Arcobacter isolation methods, and diversity of

Arcobacter spp. in Cheshire, United Kingdom. Applied Environmental Microbiology 2011,

Volume 77, Number 5, P. 1646 – 1650.

37. Kemp R., Leatherbarrow A. J. H., Williams N. J., Hart C. A., Clough H. E., Turner J.,

Wright E. J. and French N. P. Prevalence and genetic diversity of Campylobacter spp. in

environmental water samples from a 100-square-kilometer predominantly dairy farming

area. Applied Environmental Microbiology 2005, Volume 71, P. 1876 – 1882.

38. Atabay H. I., and Corry J. E. Evaluation of a new Arcobacter enrichment medium and

comparison with two media developed for enrichment of Campylobacter spp. International

Journal of Food Microbiology 1998, Volume 41, P. 53 – 58.

39. González I., Fernández – Tomé S., García T., Martín R. Genus-specific PCR assay for

screening Arcobacter spp. in chicken meat. Journal of the Science of Food and Agriculture

2014, Volume 94, Issue 6, P. 1218 – 1224.

40. Khoshbakht R., Tabatabaei M., Shirzad Aski H., Seifi S. Occurrence of Arcobacter in

Iranian poultry and slaughterhouse samples implicates contamination by processing

equipment and procedures. British Poultry Science 2014, Volume 55, Issue 6, P. 732 – 736.

41. Scullion R., Clare S. H., Robert H. M. Prevelance of Arcobacter species in raw milk and

retail raw meats in Northern Ireland. Journal of Food Protection 2006, Volume 69, Issue 8,

P. 1986 – 1990.

42. Douidah L., De Zutter L., Vandamme P., Houf K. Identification of five human and mammal

associated Arcobacter species by a novel multiplex-PCR assay. Journal of Microbiological

Methods 2010, Volume 80, P. 281 – 286.

43. Lehmann D., Alter T., Lehmann L., Uherkova S., Seidler T., Gölz G. Prevalence, virulence

gene distribution and genetic diversity of Arcobacter in food samples in Germany. Journal

of the Science of Food and Agriculture 2014, Volume 94, Issue 6, P. 1218 – 1224.

42

44. Hwa L. M., Cheon D. S., Choi S., Lee B. H., Jung J. Y., Choi C. Prevalence of Arcobacter

Species Isolated from Retail Meats in Korea. Journal of Food Protection 2010, Number 7, P.

1313 – 1316.

45. Atabay H.I. and Aydin F. Susceptibility of Arcobacter butzleri isolates to 23 antimicrobial

agents. Letters in Applied Microbiology 2001, Volume 33, P. 430 – 433.

46. Abay S., Kayman T., Hizlisoy H., and Aydin F. In vitro Antibacterial Susceptibility of

Arcobacter butzleri Isolated from Different Sources. J. Vet. Med. Sci. 2012, Volume 74, No.

5, P. 613 – 616.

47. Rahimi E. Prevalence and antimicrobial resistance of Arcobacter species isolated from

poultry meat in Iran. British Poultry Science 2014, Volume 55, No. 2, P. 174 – 180.

48. Fera M. T., Maugeri T. L., Giannome M., Gugliandolo C., La Camera E., Blandino G.,

Carbone M. In vitro susceptibility of Arcobacter butzleri and Arcobacter cryaerophilus to

different antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents 2003, Volume

21, P. 488 – 491.

49. Kovalenko K., Roasto M., Šantare S., Berzins A., Hörman A. Campylobacter species and

their antimicrobial resistance in Latvian broiler chicken production. Food Control 2014,

Volume 46, P. 86 – 90.