Article original

Mécanismes moléculaires de stimulationet désensibilisation de la cellule de Sertoli

par l’hormone folliculo-stimulante

V Laurent-Cadoret F Guillou

INRAlCNRS, URA 1291, station de physiologie de la reproduction des mammifères domestiquesPRMD, 37380 Nouzilly, France

(Reçu le 21 novembre 1994 ; accepté le 24 janvier 1995)

Résumé ― De nombreuses fonctions sertoliennes sont régulées par l’hormone folliculo-stimulante (FSH).L’interaction de cette hormone avec son récepteur membranaire spécifique conduit à la stimulation denombreuses étapes intracellulaires incluant l’activation de la protéine G, l’adénylate cyclase et la pro-téine kinase dépendante de l’AMPc (PKA). Non seulement la FSH présente une action stimulantemais elle est aussi capable de la moduler en induisant progressivement une perte de la capacité deréponse de la cellule : c’est la désensibilisation. En fait, la désensibilisation est dépendante de laconcentration de l’hormone et de son temps d’action. Les processus de découplage du récepteurFSH du complexe protéine G/adénylate cyclase à court terme, et l’augmentation des phosphodiesté-rases, de l’inhibiteur des PKA et la déplétion des récepteurs FSH à plus long terme vont se compléterpour engendrer une désensibilisation des cellules de Sertoli.

cellule de Sertoli / stimulation / désensibilisation / hormone folliculo-stimulante

Summary ― Stimulation and desensitization of Sertoli cells by follicle-stimulating hormone.Many Sertoli functions are regulated by the receptor-mediated action of follicle-stimulating hormone(FSH). The interaction of FSH with its specific cell surface receptors leads to stimulation of a numberof intracellular events, including the activation of guanine nucleotide binding protein (G protein),adenylate cyclase and the cAMP-dependent protein kinase (PKA) pathway. In addition to positive reg-ulation of cell functions, a phenomenon of refractoriness occurs after primary exposure of targetcells to the hormone. Different sites of lesion have been suggested including down-regulation ofFSH receptor, uncoupling of the receptor and the G proteinladenylate cyclase complex, and stimulationof nucleotide phosphodiesterases or inhibition of PKA activity. Alterations of cell responsiveness aremediated by a combination of these different mechanisms occurring over different time-scales and hor-monal concentrations.

Sertoli cell / stimulation / desensitization / follicle-stimulating hormone

*

Correspondance et tires à part

INTRODUCTION

Sécrétée par les cellules gonadotropes anté-hypophysaires, la FSH régule, conjointe-ment avec la LH, la fonction gamétogèneet sécrétoire des gonades. Chez le mâle,le niveau de FSH circulante varie peu et les

taux immunoréactifs de FSH circulante dansle plasma de rats immatures est d’environ100 ng/ml FSH RP1 (Dohler et Wuttke,1975). Chez le rat immature, la FSH inter-vient au niveau testiculaire sur les cellulesde Sertoli en stimulant leurs divisions envi-ron jusqu’au 15e jour puis en assurant leursmaturations finales. Essentielle à la forma-

tion des jonctions serrées intersertoliennes,la FSH participe à l’établissement de la bar-rière hémato-testiculaire. Elle est de plusimpliquée dans l’initiation de la premièrevague de la spermatogenèse. D’autre part,la FSH stimule de nombreuses activités bio-

chimiques intrasertoliennes (Griswold, 1993)comme la synthèse d’ADN, d’ARN et deprotéines ou la sécrétion de nombreux fac-teurs notamment des protéines de trans-port (ABP, transferrine...), des protéases(activateurs du plasminogène...), des hor-mones et facteurs impliqués dans la proli-fération cellulaire (TGF!, IL...), des méta-bolites énergétiques (lactate...), desstéroïdes (oestradiol...) ou des composantsde la matrice extracellulaire.

La cellule de Sertoli est donc essentiel-lement sous la dépendance de cette hor-mone qui, tout en exerçant une action sti-mulatrice, peut induire progressivement uneperte de la capacité de réponse de la celluleselon les conditions physiologiques. Cepen-dant, les mécanismes moléculaires de ce

processus de désensibilisation sont encore

peu clairs et affectent différents niveaux dela voie de transduction du signal hormonalselon la concentration de l’hormone et son

temps d’action.

Les voies transductionnelles de la FSHont été largement explorées et sont décritesà chaque étape dans cette revue afin de

mieux comprendre la régulation de la fonc-tion sertolienne et les mécanismes de

désensibilisation (fig 1 ).

LES ÉTAPES DE TRANSDUCTIONDE L’INFORMATION HORMONALE

Le mécanisme d’action de la FSH met

essentiellement en jeu les étapes de trans-mission suivantes :

- un récepteur membranaire spécifique dela FSH ;- un transducteur : la protéine Gs ;- un effecteur : l’adénylase-cyclase (AC) ;- un second messager : l’adénosine mono-

phosphate (AMPc) ;- une protéine kinase spécifique dépen-dante de l’AMPc (PKA) ;- des protéines phosphorylées par la PKA,qui contrôlent les voies métaboliques de lacellule ou l’expression des gènes cibles.

L’hormone folliculo-stimulante, FSH

La FSH est une gonadotropine qui appar-tient à la famille des hormones glycopro-téiques. Cette famille est composée de 3hormones d’origine hypophysaire : l’hormonefolliculo-stimulante (FSH), l’hormone lutéi-nisante (LH) et l’hormone thyréotrope (TSH)et une hormone d’origine placentaire, la cho-riogonadotropine (CG) existant seulementchez les Primates et les Équidés (Combar-nous, 1992). Ces hormones sont forméespar l’association non covalente de 2 sous-

unités a et fi. La sous-unité a, commune àtoutes ces hormones, est à l’origine de laspécificité d’espèce et la sous-unité fi, dif-férente suivant les hormones, porte essen-tiellement la spécificité biologique et immu-nologique de l’hormone. L’association deces 2 sous-unités est nécessaire pour toute

activité hormonale et la structure du dimère

ainsi formé porte les informations néces-saires à son maintien dans la circulation san-

guine, à la reconnaissance spécifique durécepteur et au déclenchement des

réponses biologiques des cellules cibles.Dans de nombreuses espèces, la

séquence en acides aminés de chaquesous-unité de la FSH est parfaitementconnue et comprend de 92 à 96 résidusaminés pour la sous-unité a et de 110 à à111 résidus aminés pour la sous-unité fi.Chaque sous-unité est codée par un seulgène. De nombreuses cystéines (10 poura et 12 2 pou r fi) formant des ponts disulfuresconcourent au maintien de la structure tri-

dimensionnelle de ces hormones. Leur par-tie polypeptidique est impliquée dans la

reconnaissance et la liaison au récepteur. Lapartie glycannique de ces hormones joueun rôle important dans leur propriétés struc-turales et fonctionnelles (Combarnous,1992). Toute déglycosylation de l’hormoneentraîne une perte de sa faculté à trans-mettre le signal par activation de l’adény-late cyclase bien que sa liaison spécifiqueau récepteur ne soit pas diminuée (Pad-manabhan et al, 1991 D’autre part, lesrésidus distaux des chaînes glycanniquesinterviennent dans le maintien de l’hormone

dans la circulation sanguine (demi-vie del’hormone), en modifiant leur captation auniveau hépatique et/ou leur élimination parfiltration glomérulaire au niveau rénal (Blumet Gupta, 1985).

Le récepteur FSH

Structure

L’étape initiale dans l’action de la FSH sur lacellule de Sertoli est son interaction avecson récepteur membranaire spécifique. Laréponse des cellules de Sertoli à la FSH estdonc dépendante en premier lieu de l’activitéfonctionnelle de son récepteur.

L’analyse de la structure du récepteurFSH est particulièrement difficile du fait dufaible nombre de ces récepteurs existantsur les cellules, de leur forte sensibilité àla protéolyse et de leur complexité. L’iso-lement de son ADNc chez le rat a permis lacaractérisation de la structure primaire durécepteur FSH (Sprengel et al, 1990). Il est

constitué d’une chaîne polypeptique uniquede 675 acides aminés, indiquant un poidsmoléculaire de 75 kDa. Le récepteur FSHprésenterait un motif structural similaire àcelui de la superfamille des récepteursmembranaires couplés à la protéine G (-R7G-), comprenant notamment les récep-teurs de la LH, p-adrénergique, et de larhodopsine (Strosberg, 1991). Ils sontcaractérisés fonctionnellement par leurinteraction avec les protéines G et structu-rellement par une seule chaîne polypepti-dique fortement ancrée en son centre dansla membrane plasmique par un motif de 7segments transmembranaires et exposéeen ses extrémités amino-terminale versl’extérieur et carboxy-terminale vers l’inté-rieur de la cellule. Par analogie, il a étédéterminé 3 domaines pour le récepteurFSH. Un premier domaine amino-terminalhydrophile de 348 résidus est localisé àl’extérieur de la cellule et comprend 3 sitesde glycosylation potentiels. Le deuxièmedomaine de 264 résidus comprend 7 seg-ments hydrophobes de 21 à 24 acides ami-nés intégrés dans la bicouche lipidique dela membrane plasmique sous forme d’hé-lices a. Ces segments transmembranairessont reliés par de courtes boucles expo-

sées à l’extérieur (3) ou l’intérieur (3) de lacellule. Le troisième domaine de 63 acidesaminés forme l’extrémité carboxy-terminalecytoplasmique du récepteur. r.

La comparaison entre les structures pri-maires du récepteur FSH testiculaire obte-nues chez le rat, l’homme et le moutondémontre l’existence d’une très forte homo-

logie de l’ordre de 90% (Sprengel et al,1990 ; Kelton et al, 1992 ; Yarney et al,1993). Tous les résidus cystéines, dont cer-tains seraient nécessaires au maintien de la

conformation tridimensionnelle du récep-teur, sont conservés, avec une cystéine enposition 644 supplémentaire pour le récep-teur FSH humain. Trois sites potentiels deN-glycosylation (positions 191, 199, 293)se retrouvent inchangés dans les 3

espèces ; un quatrième site (position 318)existe sur le récepteur FSH humain. Deplus, il existe 5 sites dibasiques de clivagebien conservés (positions 242, 253, 282,572 et 634), ce qui pourrait expliquer l’ob-tention de plusieurs sous-unités par lestechniques classiques biochimiques lorsdes premières tentatives de caractérisa-tion du récepteur. Le domaine intracellu-laire est très riche en sérines, thréoninesqui sont des sites potentiels de phospho-rylation.

Un seul gène de structure très complexecode pour le récepteur FSH. Il pourrait déri-ver de la fusion de 2 familles de gènes. Il

se subdivise en 10 exons et possède unetaille minimale de 85 kilobases (Heckert etal, 1992). Les 9 premiers exons codent pourla portion amino-terminale du récepteur.L’exon 1 contient le peptide signal, une zonecodant pour une portion spécifique au récep-teur FSH et une première séquence richeen leucines. Les exons 2 à 9 codent pourles séquences répétées riches en leucines.Ces exons dériveraient de gènes codantpour les protéines dites «riches en leu-cines». Le dernier exon, particulièrementlong, code pour une faible portion dudomaine amino-terminal, la totalité du

domaine transmembranaire et l’extrémité

carboxy-terminale cytoplasmique du récep-teur. Il provient probablement d’un mêmegène ancestral codant pour tous les récep-teurs couplés aux protéines G. Le gène durécepteur FSH est localisé sur le chromo-some 2p21, très proche du gène codantpour le récepteur LH (Rousseau-Merck etal, 1993).

Le domaine extracellulaire particulière-ment long est la caractéristique majeuredes récepteurs aux gonadotropines qui lesdistingue des autres récepteurs couplésaux protéines G (R7G). Leur domaineamino-terminal présente 14 copies impar-faites d’un motif riche en leucines d’environ20-25 résidus chacun. Ces séquencesrépétées comportent des zones amphipa-thiques (prenant une conformation enfeuillets fi) qui favorisent la formation desurfaces peptidiques prédisposées auxinteractions spécifiques protéines/pro-téines. L’étendue d’un tel domaine, qui estimpliqué dans la liaison avec l’hormone,peut s’expliquer par la grande taille et lacomplexité de la structure hétérodimériquedes gonadotropines. Ce domaine confé-rerait au récepteur ses propriétés de recon-naissance de l’hormone glycoprotéique(affinité et spécificité). Ainsi, il a été identifiédans ce domaine, 2 régions qui constitue-raient des sites de reconnaissance de la

sous-unité a commune à ces gonadotro-pines sur leurs récepteurs respectifs. Enrevanche, une région proche de l’extrémitéamino-terminale serait plus spécifique durécepteur et interagirait avec la sous-unitéfi de l’hormone correspondante (Datta-treyamurty et Reichert, 1992). L’ensemblede ces travaux conduit actuellement à 2

hypothèses non exclusives sur l’interac-tion gonadotropine/récepteur entraînant latransmission du signal hormonal (Braun etal, 1991 Selon la première hypothèse, laliaison de l’hormone à son récepteur indui-rait un changement conformationnel del’ensemble du récepteur. Dans la seconde

hypothèse, l’hormone se lierait au domaineextracellulaire du récepteur (site à hauteaffinité de liaison), puis, par un change-ment conformationnel, l’hormone et/ou unepartie du récepteur serait amenées encontact avec le domaine transmembranairedu récepteur (site à faible affinité de liai-son), entraînant l’activation de l’adénylate-cyclase. Ce modèle suggère l’existenced’un site d’activation du récepteur analogueà la poche de liaison du ligand décrite pourles autres types de récepteurs couplés à laprotéine G.

Le domaine transmembranaire des

récepteurs aux gonadotropines présentefort peu d’homologie (20 à 25%) avec celuides autres R7G (Misrahi et al, 1993 ; Sava-rese et Fraser, 1992). Cependant, l’impor-tance de ce domaine dans la structure, l’an-

crage au niveau membranaire et l’interactionavec la protéine G de ces récepteurs sug-gèrent que les acides aminés ou même lesséquences peptidiques conservés entre euxsont capitaux. On retrouve par exemple, 2cystéines conservées (Cys 441 et Cys 516 6pour R FSH) qui forment dans ces récep-teurs un pont disulfure extracellulaire. Cesobservations suggèrent un arrangement tri-dimensionnel similaire au sein de la mem-

brane pour tous les récepteurs de cettefamille.

La queue carboxy-terminale localiséedans le cytoplasme est particulièrement dif-férente pour ces récepteurs du fait de saséquence et de sa taille. Cependant, cedomaine comporte une forte proportion desérines et thréonines qui sont de nombreuxsites potentiels de phosphorylation. L’impli-cation de ces sites de phosphorylation dansle contrôle de l’activité du récepteur, parfai-tement démontrée pour les récepteurs [3-adrénergiques (Lefkowitz etal, 1990) et rho-dopsine (Wilden et Kühn, 1982), commenceseulement a été à être étudiée pour le

récepteur LH (Hipkin et al, 1993). Malgréune existence potentielle de ces sitesconsensus de phosphorylation, leur impli-

cation n’a pas encore été mise en évidence

pour le récepteur FSH.

Expression et régulation des récepteursFSH

Chaque cellule de Sertoli comporte unnombre très limité de récepteurs de FSHqui évolue en fonction de l’âge de l’animal.Chez le rat, le nombre moyen de récepteurspar cellule est d’environ 1 600 à 1 900 jus-qu’à 21 j passant à environ 4 000 à 40 j et7 000 à 60 j (Bortolussi et al, 1990). Surhomogénats de tubes séminifères, laconstante de dissociation (Kd) est de l’ordrede 6,7 10-10 M. Sur membranes tubulairesde rat, 2 types de sites de liaison de l’hor-mone ont été mis en évidence avec des Kdde 7 10-11 1 M et 2,6 10-9 M (Reichert et Dat-tatreyamurty, 1989).

Des études fonctionnelles sur des sec-tions de tubes séminifères de rats adultesont montré une modification de la liaison dela FSH ainsi que de la production d’AMPc enfonction des stades du cycle de la sperma-togenèse. La liaison de la FSH est 3 foissupérieure aux stades XIII à I par rapportaux stades VI à VII (Kangasniemi ef al,1990a). Le niveau d’AMPc (basal ou stimulépar la FSH) est plus faible aux stades VII-XIIpar rapport aux stades Xll l-1-Vl (Kangas-niemi et al, 1990b).

L’identification des ARNm du récepteurFSH dans les cellules de Sertoli et la mesurede leur taux d’expression en fonction del’âge ont été réalisées par Heckert et Gris-wold (1992). Il existe un transcrit majeur durécepteur FSH de 2,6 kb et un transcritmineur de 4,5 kb supposé contenir uneextrémité polyA étendue, ce qui indiqueraitque les 2 transcrits codent pour la même

protéine finale. Ces ARNm sont détectableschez le rat de 10 j et leurs niveaux seraientsimilaires chez le rat âgé de 20 ou 60 j. Aucours du cycle spermatogénétique, le tauxdes ARNm du récepteur FSH varie suivantles différents stades de différentiation. Ainsi,

un contrôle de la réponse induite par FSHsur les cellules de Sertoli pourrait s’exercerpar une régulation du nombre de ses récep-teurs par les cellules germinales ou la FSHelle-même.

D’autre part la FSH diminue le tauxd’ARNm de son propre récepteur, sans alté-ration de sa transcription. Cette chute post-transcriptionnelle du nombre d’ARNm durécepteur FSH par l’hormone ne peut êtreimputable à l’intervention d’une protéineintermédiaire car ce phénomène n’est passensible à un inhibiteur de la synthèse pro-téique. L’hormone exercerait donc un rétro-contrôle sur l’expression de son recépteurvia une diminution de la stabilité des ARNmde son récepteur (Themmen et al, 1991). ).

La voie principale de transmissionde l’action de la FSH

La voie principale de transduction du signalgénéré suite à l’occupation par la FSH deson récepteur se déroule selon le schémaclassique de la voie (AMPc).

Transmission par les protéines G

Le complexe FSH/récepteur active l’adé-nylate cyclase via un transducteur protéiquede la famille des protéines G. Ces protéinesrégulatrices sont des composants clés dessystèmes de transmission du signal,relayant l’information des récepteurs mem-branaires activés par leur ligand vers leseffecteurs intracellulaires, tels l’adénylatecyclase (AC), les phospholipases ou lesphosphodiestérases ainsi que les canauxpotassiques, calciques ou même sodiques(Simon ef al, 1991 ).

Il existe une grande variété au sein dela famille des protéines G (plus de 40connues à ce jour) et une classification selonleur identité dans leur séquence peptidiquea été établie. Les plus connues sont les pro-

téines de type Gs (Ns) activatrices et Gi (Ni)inhibitrices de l’adénylate cyclase. Ellesrépondent à l’activation de récepteurs telsles récepteurs des gonadotropines ou adré-nergiques. Les protéines G sont des pro-téines hétérotrimériques comprenant lessous-unités a, [3 et y liées de manière noncovalente. Les sous-unités as et ai ont un

poids moléculaire apparent de 45-52 kDaet 40-41 kDa respectivement. Les sous-uni-tés 13 et y communes aux différents typesde protéines G ont une taille respectivementde 36 kDa et 8 kDa. Les protéines G sontcaractérisées par la nature de leur sous-unité a. C’est en effet la sous-unité a quiest l’élément spécifique de la protéine et quiva déterminer la nature du récepteur et del’effecteur qu’elle va coupler. Elle comporteaussi la capacité de moduler l’activité del’effecteur. Les sous-unités 13 et y jouentaussi un rôle au niveau structural commefonctionnel dans l’hétérotrimère. La sous-unité y très hydrophobe présente en sonextrémité carboxy-terminale une isoprény-lation de la cystéine qui participe à la régu-lation de la transduction du signal et à l’an-crage dans la membrane de la protéine G.Lors de la transmission du signal, le dimèrel3y peut stabiliser l’intéraction des sous-uni-tés a avec les récepteurs et induire ainsi laformation d’une conformation appropriée àl’activation du complexe récepteur/Ga maisaussi moduler les effets des sous-unités a.

La protéine Gas et 3 formes de protéinesGai (ai1,2,3) ont été identifiées dans lescellules de Sertoli, les cellules péritubu-laires ainsi que dans les spermatocytespachytènes et spermatides (Paulssen etal, 1991). Leur niveau d’expression variede manière importante au cours du déve-loppement testiculaire (Lamsam-Casalotti etal, 1993). La FSH induit une diminutionconséquente des ARNm des protéinesGai1 (75%) et Gai2 (50%) et une aug-mentation du niveau des ARNm de la pro-téine Gai3 (3 fois) (Loganzo et Fletcher,1992). Cette action de la FSH est due à un

mécanisme post-transcriptionnel. Enrevanche, la FSH ne modifie aucunement letaux des ARNm de Gas.

La protéine Gs est localisée préféren-tiellement à la périphérie des tubes sémi-nifères, au niveau basal des cellules de Ser-toli où sont présents les récepteurs FSH(Dym ef al, 1991 ). Dattatreyamurty et al(1987) ont démontré l’association physiqueet fonctionnelle des récepteurs FSH avecla protéine Gs. L’interaction entre les sur-faces intracytoplasmiques du récepteur et laprotéine Gs se réalise via la sous-unité as.Cependant, les régions de couplage avecla protéine Gs n’ont pas encore été déter-minées. Mais les homologies structuralesentre le récepteur FSH et les autres R7Gindiqueraient une similarité de ces domainesclés de la reconnaissance et de la liaison

spécifique avec as (Savarese et Fraser,1992). Une fois le complexe hormone/récep-teur formé, la protéine G est activée parfixation du GTP sur la sous-unité as à la

place du GDP. La liaison du GTP entraîne ladissociation des sous-unités, libérant del’hétérodimère (3y la sous-unité as qui vainteragir avec l’adénylate-cyclase et l’acti-ver. L’inactivation du système est réaliséegrâce à l’activité GTPasique intrinsèqued’as. L’hydrolyse du GTP qui lui est lié enGDP entraîne la réassociation d’as avec le

complexe !3y. La sous-unité a comportedonc, en parallèle de sa capacité d’activationde l’effecteur, l’information pour sa propreinactivation. Ceci permet, d’une part, deréguler le temps d’action de la protéine Gsur l’adénylate-cyclase et donc l’intensitédu signal transmis et, d’autre part, de réini-tialiser le système. L’activation de l’adénylatecyclase par la FSH via la protéine G estdonc dépendante du GTP (Fletcher et Rei-chert, 1986). Or, il existe 2 types de sitesde liaison du GTP : l’un à haute affinité etfaible capacité de liaison, l’autre à faible affi- i-

nité et forte capacité de liaison. Zhang et al(1991) ont démontré une action différentedu GTP suivant le type de site de liaison

qu’il occupe. L’occupation des sites de liai-son à haute affinité pour le GTP seraitessentielle pour l’activation de l’adénylatecyclase alors que les sites de liaison à basseaffinité pour le GTP, une fois occupés, régu-leraient la liaison de FSH à son récepteursans être impliqués dans l’activation del’adénylate cyclase.

Cette première étape intracellulaire detransmission du signal apporté par la FSHprésente un niveau d’amplification : en effet,le complexe hormone/récepteur peut sti-muler plusieurs protéines Gs.

Activation de l’adénylate-cyclase

Les protéines G, une fois activées par lecomplexe FSH/récepteur, stimulent l’adé-nylase-cyclase. La découverte d’une diver-sité structurale et fonctionnelle des adény-late-cyclases (8 types identifiés) suggèreun rôle d’intégration du signal à leur niveau(lyengar, 1993).

Les adénylate cyclases sont majoritaire-ment des glycoprotéines membranaires.Elles ont une taille de 110 à 180 kDa. L’ana-

lyse de leur séquence peptidique a permisd’identifier une structure présentant degrandes homologies avec les transporteurset canaux ioniques. Elle se présente en 2domaines de 6 segments transmembra-naires reliés par une boucle cytoplasmique.Les extrémités amino- et carboxy-terminalessont cytoplasmiques. Des régions de laboucle cytoplasmique et de la queue car-boxy-terminale sont fortement conservéesparmi les différents types d’adénylatecyclases et constituent le site catalytiquede l’enzyme. L’effet activateur de Gasconsisterait en une modification conforma-tionnelle de l’adénylate cyclase : as, unefois liée à cette enzyme, faciliterait l’asso-ciation fonctionnelle des 2 domaines cyto-plasmiques de l’adénylate-cyclase pour for-mer un site catalytique actif. L’adénylatecyclase catalyse la réaction de formationde 3,5’-adénosine monophosphate (AMPc)

à partir d’adénosine triphosphate (ATP) avecperte d’un pyrophosphate inorganique (PPi).Ce mécanisme intervient notamment dansl’action de la FSH sur la cellule de Sertoli,l’AMPc ainsi produit constitue le secondmessager. C’est une nouvelle étape d’am-plification du signal extracellulaire car denombreuses molécules d’AMPc vont être

ainsi produites au cours de l’activation del’adénylate cyclase.

Les ARNm des adénylate cyclases detype 4, 5 et 6 ont été détectés dans le testi-cule (Gao et Gilman, 1991 ; Premont etal,1992a). Cependant, la répartition des diffé-rents types d’adénylate cyclases dans lescellules testiculaires n’est pas connue.

Production et dégradation de l’AMPc

L’AMPc, une fois synthétisé par l’adénylatecyclase, se lie et active des protéineskinases spécifiques ou est dégradé par lesphosphodiestérases (PDE). Le taux intra-cellulaire en ce nucléotide cyclique est doncla résultante entre sa synthèse et sa dégra-dation. L’activation de l’adénylate-cyclasepar la FSH va avoir pour conséquenced’élever le taux d’AMPc intracellulaire quiest maximal au bout de 20 min puis revientà son niveau basal après 4 h de stimula-tion hormonale (Verhoeven et al, 1980). Letaux d’AMPc n’est pas seulement dépen-dant de l’activité de l’adénylate cyclase ; il

est également contrôlé par les phospho-diestérases qui hydrolysent l’AMPc en5’AMP. L’intensité du signal transmis parl’AMPc est donc liée à l’activité de cette

enzyme de dégradation.La multiplicité et la diversité tissulaire de

ces phosphodiestérases (au moins 25formes différentes chez les Mammifères)ainsi que leurs propriétés différentes entermes d’affinité pour l’AMPc ou le GMPc,leurs modulations par divers facteurs phy-siologiques et pharmacologiques et leurcinétique d’hydrolyse ont nécessité l’élabo-ration d’une classification de ces enzymes.

Sur la base de leurs caractéristiques struc-turales et fonctionnelles, les différentesformes de PDE se répartissent en 5 familles(Conti et al, 1991 ).

Les phosphodiestérases présentes dansles cellules des Mammifères ont une struc-ture commune avec un domaine catalytiquebien conservé. Les régions amino- et car-boxy-terminales qui encadrent ce domainecatalytique seraient impliquées dans sarégulation et/ou détermineraient la locali-sation intracellulaire de ces enzymes.

Dans le testicule, 2 familles de PDE ontété mises en évidence les Ca2+/CaM-PDEou PDEI et les PDE spécifiques de l’AMPcou PDE IV.

Les PDE I ont la propriété d’être activéesen présence d’ions calcium par la calmo-duline (CaM). Ces enzymes se présententsous une forme dimérique, chaque sous-unité liant une molécule de calmoduline lorsde son activation. Différents sous-types ontété identifiés qui se distinguent essentiel-lement par leur propriété à utiliser l’AMPcou le GMPc comme substrat préférentiel.Trois formes de ces PDE ont été mises en

évidence dans le testicule chez le rat (Gere-mia et al, 1982).

Les PDE IV sont insensibles aux ionsCa2+ et au GMPc, elles présentent une forteaffinité pour l’AMPc. Cette famille de PDE

comprend 4 isoformes (PDE1 à 4), codéeschacune par un gène différent. Les PDE1et 2 sont exprimées spécifiquement dansles cellules germinales et les PDE3 et 4dans les cellules de Sertoli (Swinnen et al,1989).

Au sein de la cellule de Sertoli chez le rat

immature, une régulation positive ou néga-tive par la FSH de l’activité des PDE estobservée suivant le type de PDE. À courtterme (15-20 min), la FSH produit une inac-tivation des PDE 1 (Conti et al, 1991). Àplus long terme (1-24 h), la FSH induit uneaugmentation de l’activité phosphodiesté-rasique liée aux PDE spécifiques de

l’AMPc. ln vitro, cette activation est maxi-male pour des concentrations de 500 à1 000 ng/ml en oFSH (Verhoeven et al,1981 ). Elle est aussi observée in vivo, indi-quant que cette régulation existerait dansles conditions physiologiques (Conti et al,1983a). La stimulation par la FSH de l’acti-vité phosphodiestérasique est la résultanted’une augmentation de la transcription etde la stabilité des ARNm de ces enzymes(principalement pour la PDE3, x100) (Swin-nen et al, 1991) et d’une traduction accrueaboutissant à la néosynthèse des PDE cor-respondantes (Verhoeven et al, 1981).Ainsi, dans la cellule de Sertoli, l’AMPcrégule l’expression de ses propres enzymesde dégradation.

Activation de la protéine kinasedépendante de t’AMPc

L’étape suivante des effets de la FSH estl’activation par l’AMPc de la protéine kinasecytosolique dépendante de l’AMPc (PKA)et la phosphorylation de substrats protéiquesendogènes accompagnée d’une synthèsed’ARNm et de protéines.

Les PKA sont constituées par 2 sous-unités régulatrices et 2 sous-unités cataly-tiques associées de manière non covalente.Deux isoenzymes (types I et 11) ont étédécrites. Ces isoenzymes diffèrent par leurssous-unités régulatrices RI et RII. Ces sous-unités régulatrices présentent chacune 2isoformes a et fi : RI a,!3 et RII a,(3 qui sontcodées par des gènes distincts. Trois sous-unités catalytiques différentes Ca, C(3 etCy ont aussi été identifiées. Malgré uneorganisation structurale globale assezproche, les sous-unités régulatrices pré-sentent des propriétés différentes en termesde stabilité du dimère, d’antigénicité, decapacité d’autophosphorylation et d’affinitépour l’AMPc et ses analogues, laissant sup-poser des rôles divergents suivant lesconditions physiologiques (Taylor et al,1992).

Dans sa forme inactive, la PKA est untétramère. La sous-unité régulatrice pré-sente alors une forte affinité (> 10-9 M) pour rla sous-unité catalytique. L’activation del’enzyme est induite par une augmentationdu niveau intracellulaire en AMPc qui se lieavec une forte affinité à 2 sites sur chaquesous-unité régulatrice. Cette liaison pro-voque une diminution de 4 à 5 ordres de

grandeur de l’affinité des sous-unités régu-latrices pour les sous-unités catalytiques. Il l

se produit alors une dissociation de l’ho-loenzyme en une sous-unité régulatricedimérique et 2 sous-unités catalytiquesmonomériques, libres et actives. Celles-cipeuvent alors phosphoryler des substratsprotéiques endogènes en catalysant letransfert du phosphate y de l’ATP à unesérine ou thréonine de la protéine cible.Lorsque la concentration en AMPc diminueet que l’AMPc lié aux sous-unités régula-trices est libéré, le tétramère R2C2 sereconstitue.

Dans les cellules de Sertoli immatures,l’activité des PKA est maximale (3x) 20 minaprès l’addition de la FSH. Cette activitése maintient pendant 1 h puis décroît pourrevenir à son niveau de base en 4 h. Il

existe ainsi une corrélation très étroite entre

production d’AMPc et activité des PKA(Means ef al, 1974). L’augmentation del’activité des PKA entraîne, d’une part, desmodifications dans la structure ou le fonc-tionnement de protéines préexistantesdans la cellule et, d’autre part, la synthèsede nouvelles protéines spécifiques via l’ac-tivation de l’expression génomique. Ceschangements sont dus à la phosphorylationpar les PKA de protéines (Ireland et al,1986) ou d’enzymes clés du métabolisme,ou après migration de la sous-unité acti-vée dans le noyau, à la phosphorylationde facteurs de transcription comme le«cyclic-AMP responsive element bindingprotein» CREB (Waeber et al, 1991 ).

Dans le testicule, il existe une répartitionspécifique du type cellulaire pour les diffé-

rentes sous-unités des PKA (Rla et fi, Rllaet fi, Ca et y) et une régulation différentiellede leurs expressions en fonction du déve-loppement testiculaire (Landmark et al,1993). Dans la cellule de Sertoli de rat sontprésentes les sous-unités Rla (49 kDa),Rlla (54 kDa) et RII(3 (52 kDa) et Ca (45kDa). En absence de toute stimulation, lessous-unités régulatrices se répartissententre 25% pour Rlla et 75% pour Rla, leniveau de RII(3 étant négligeable (Landmarket al, 1991 L’action de la FSH est préfé-rentiellement médiée par la PKA de type 1,bien que la PKA de type Il joue un rôlenotable dans la transmission de la stimula-tion (Laurent-Cadoret et al, 1993).

Lors d’une stimulation par la FSH une

augmentation très nette du taux des sous-unités régulatrices par rapport aux sous-unités catalytiques est observée dans les 24à 48 h (Landmark et al, 1991 Cependant,l’augmentation du niveau des sous-unitésrégulatrices est répartie différemment sui-vant les isoformes. Le niveau des ARNmde RII[3 augmente de plus de 50 fois alorsque le niveau des ARNm des autres sous-unités n’est augmenté que de 2 à 4 fois.Cependant, il faut noter que le taux d’ARNmde la sous-unité RII(3, bien que fortementaugmenté sous l’action de la FSH, restenégligeable par rapport au niveau desARNm codant pour les sous-unités Rla etRlla. Dans les cellules stimulées, la sous-unité RII(3 reste donc toujours minoritaire,représentant moins de 10% des sous-uni-tés régulatrices. Le rôle de cette sous-unitéRII(3 dans l’action de la FSH est pour l’ins-tant inconnu. Cette régulation différentielledes ARNm résulte d’une modulation diffé-rente tant au niveau transcriptionnel qu’auniveau de la stabilité des messagers (Knut-sen et al, 1991 ). Elle se traduit finalementpar une augmentation des isozymes cor-respondantes. Étant donné qu’il existe uneexpression différentielle de ces isoenzymesen fonction de l’âge ou des conditions phy-siologiques, nous pouvons avancer l’hypo-

thèse que ces isoenzymes pourraient êtreactivées sélectivement et avoir des fonc-tions distinctes au sein de la cellule de Ser-toli.

Les autres voies de transmissionde l’action de la FSH

Alors que l’association de l’action de la FSHavec la voie de l’AMPc est parfaitement bienétablie, le rôle des autres voies de trans-mission de l’information (les phosphoinosi-tides, les PKC et le calcium) qui peuventintervenir plus ou moins directement dans lemécanisme d’action de la FSH est enrevanche nettement moins défini.

La voie des phosphoinositides

La relation existant entre la FSH et la voiedes phosphoinositides dans la cellule deSertoli est peu étudiée. Cet autre systèmede transduction du signal existe cependantau sein de la cellule de Sertoli. L’étude decette voie et de ses interactions potentiellesavec celle activée par la FSH est donc

importante pour mieux cerner les modula-tions possibles de l’action de la FSH au seindes cellules de Sertoli.

Cette voie de transduction du signal enréponse à une stimulation cellulaire consisteen l’activation, via un récepteur et une pro-téine G, d’un effecteur, la phospholipase C(PLC). La PLC activée hydrolyse le phos-phatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) etproduit 2 seconds messagers : l’inositol1,4,5, triphosphate (IP3), qui va mobiliserles stocks de calcium intracellulaires, et le1,2 diacyl-glycerol (DAG), qui, avec le cal-cium, va activer la PKC. Cette enzyme phos-phoryle différents substrats protéiques intra-cellulaires (Farese, 1984). L’inactivation duprocessus de transmission du signal est liéeà l’activité GTPasique de la sous-unité a dela protéine G. Les seconds messagers sont

dégradés et les métabolites ainsi produitsparticipent au cycle de reconstitution dustock de PIP2 membranaire, substrat de laPLC. La voie de transmission du signal paractivation des PLC est fonctionnelle dansles cellules de Sertoli. Elle est activée parstimulation de protéines G spécifiques etmodulée par les protéines Gi mais nesemble pas affectée par la FSH (Quirk etReichert, 1988). Toutefois, bien qu’aucuneffet direct de la FSH sur le métabolismedes phosphoinositides n’ait pu être mis enévidence, cette hormone exercerait un effetinhibiteur sur l’accumulation de leurs méta-bolites obtenue par l’addition de facteursdérivés du sérum (Monaco et al, 1988a).Cet effet inhibiteur de la FSH est mimé partout activateur de la voie AMPc et passe-rait donc par la stimulation des PKA. Le

point d’impact de cette inhibition concernel’étape de synthèse de l’IP3 et impliqueraitsoit une inactivation de la PLC, soit une acti-vation des kinases des phospholipides(Monaco et Conti, 1987).

La protéine kinase C est donc l’enzymecentrale de la voie des phosphoinositides.Cette enzyme est une sérine/thréoninekinase comme la PKA mais les séquencesconsensus de phosphorylation des substratspar la PKC sont généralement différentesdes sites de phosphorylation cibles de laPKA. Neuf isoformes différentes de PKCont été identifiées jusqu’à présent et regrou-pées en 2 familles sur la base de leurs struc-tures et de leurs capacités à être réguléespar le calcium (Hugh et Sarre, 1993). Lapremière famille comprend les isoformes a,!1, p2, y, dépendantes du calcium. Laseconde famille est constituée par les iso-formes 8,r-,!,v et T, indépendantes du cal-cium. L’activité de la PKC est modulée parle DAG et le Ca2+ libéré des stocks intra-cellulaires par l’IP3. La liaison du calciumà la PKC induit la translocation de l’enzymejusqu’à la membrane, plasmique. Le DAG etun cofacteur, la phosphatidylsérine, pré-sents dans la membrane, activent la PKC,

permettant le transfert du groupement phos-phate y de l’ATP sur l’hydroxyle de la sérineou thréonine de la protéine cible.

Chez le rat, la majorité de l’activité PKCtesticulaire est d’origine tubulaire (Nikula etal, 1987) et a été caractérisée comme pro-venant de PKC de type a pour les cellulesde Sertoli et de types a, [3 et y pour les cel-lules de Leydig (Pelosin et al, 1991 LesPKC présentent une distribution intracellu-laire cytoplasmique, membranaire ounucléaire et il existe une translocation

variable de ces enzymes dans la cellule sui-vant son état d’activité. La forme active desPKC est liée à la membrane et correspondà la fraction particulaire. Dans le testicule,les PKC sont majoritairement sous formeinactive (> 70%) retrouvées dans la frac-tion soluble (Nikula ef al, 1987).

Chez le rat, au cours du développementtesticulaire, il existe une excellente corré-

lation, in vitro, entre l’action de la FSH sur laproduction d’AMPc et l’activité des PKC(Eskola etal, 1993). La production d’AMPcstimulée par la FSH augmente de 23 foisentre la naissance et l’âge de 10 j puisdécline jusqu’à l’âge adulte. Au cours decette période pré-pubertaire, une augmen-tation des ARNm codant pour la PKC de

type a et un pic d’activité de la fraction par-ticulaire active de la PKC (6 x) sont obser-vés. D’autre part, l’activation de la PKC pardes esters de phorbol inhibe la productiond’AMPc induite par la FSH. Cet effet est

particulièrement significatif à l’âge de 10 jet n’est plus observable chez le rat adulte.Ainsi, au cours du développement testicu-laire, des changements radicaux intervien-nent dans l’action de la FSH et sa régulationpar les PKC.

Dans la cellule de Sertoli, l’activation dela protéine kinase C par des esters de phor-bol provoque généralement une inhibitionde nombreuses fonctions sertoliennes sti-mulées par la FSH (Monaco et Conti, 1987 ;Eikvar et al, 1993 ; Laurent-Cadoret et al,1994 a, b). Deux points d’impact de l’action

de la PKC sur la transmission du signal FSHont ainsi été mis en évidence : l’un au niveaudu récepteur car l’effet inhibiteur de l’acti-vation de la PKC ne touche que la produc-tion d’AMPc induite par FSH et non celleinduite par activation de la protéine Gs ou del’adénylate cyclase ; l’autre en aval de laproduction d’AMPc car l’activation de la PKCdiminue l’accumulation d’oestrogènes etinhibe la sécrétion de l’activateur du plas-minogène induite par la FSH ainsi que paractivation de la protéine Gs ou de l’adénylatecyclase. Ni les phosphodiestérases, ni lesprotéines Gi ne sont impliquées dans ceprocessus inhibiteur. La PKC donc d’une

part entraînerait un découplage du récep-teur FSH avec la protéine Gs et d’autre partmodifierait certaines activités enzymatiquescomme par exemple la PKA ou l’aromatasequi catalyse la synthèse d’oestradiol.

La voie du calcium

Parallèlement à la production d’AMPc lorsde l’action de la FSH, il a été observé un

système de transduction du signal qui meten jeu des mouvements d’ions calcium dansles cellules de Sertoli (Grasso et Reichert,1993). La concentration en ions calciumdans les cellules de Sertoli non stimuléesest d’environ 90 nM. La FSH induit une aug-mentation rapide (60 s) de la concentrationen calcium intracellulaire (de 2 à 3 fois). Ceteffet est obtenu à des doses très faibles deFSH (ED50 = 5 ng/ml) (Grasso et Reichert,1990 ; Gorczynska et Handelsman, 1991). ).Cette phase initiale particulièrement rapided’augmentation du calcium intracellulaireest suivie d’une phase de maintien de sontaux intracellulaire (jusqu’à 20 min). Aprèsstimulation par la FSH, une augmentationparallèle du calcium et de la productiond’AMPc est observée. Cependant, le lienentre entrée de calcium et activation de lavoie AMPc n’est pas clairement démontré.

L’hypothèse d’une libération de calcium àpartir des stocks intracellulaires via une pro-duction d’IP3, consécutivement à l’action de

la FSH, a été précédement écartée (Quirket Reichert, 1988). L’augmentation du tauxde calcium intracellulaire est due à uneentrée de calcium extracellulaire. Sur lescellules de Sertoli en culture, la FSH stimulel’entrée de calcium extracellulaire via descanaux calciques membranaires sensiblesou non aux variations du potentiel de mem-brane (Grasso et Reichert, 1990 ; Gorc-zynska et Handelsman, 1991 Les modifi-cations électrophysiologiques induites parla FSH sur les cellules de Sertoli consistenten un phénomène biphasique avec unephase d’hyperpolarisation très courte (< 3 s)suivie d’une phase de dépolarisation pro-longée (Wasserman et al, 1992). Ces varia-tions de potentiel pourraient alors provoquerl’ouverture de canaux calcium dépendantsdu voltage (Joffre et Roche, 1988). De plus,elles seraient liées à des changements dansla perméabilité de la cellule aux ions sodiumet potassium.

La possibilité que le récepteur de la FSH,du fait de sa structure transmembranaire,pourrait former un canal permettant le pas-sage des ions calcium a été envisagée parGrasso et Reichert (1990). Néanmoins, Shi-bata et al (1992) ont réfuté cette hypothèse.Sur des cellules embryonnaires de reinhumain (293 F wtl) transfectées et expri-mant en grande quantité un récepteur FSHde rat fonctionnel, aucun courant calciquen’a pu être détecté suite à la stimulation parla FSH de ces cellules.

Conjointement à son effet activateur sur rles canaux calciques, la FSH inhibe l’influxdes ions calcium dépendant du sodium dansles cellules de Sertoli (Grasso et Reichert,1993). Ces 2 effets de la FSH sur les mou-vements calciques sont en opposition. Lecontrôle de l’influx calcique par la FSH viaces 2 mécanismes serait donc un moyen, en

régulant le taux approprié en calcium intra-cellulaire, pour moduler le signal apportépar la FSH aux cellules de Sertoli.

Le calcium est nécessaire pour la liaison

optimale de la FSH à son récepteur. Or,une séquence peptidique (1-15) de la sous-

unité p de la FSH est homologue au site defixation du calcium sur la calmoduline (SantaColoma etal, 1992). Cette capacité de l’hor-mone à lier le calcium est corrélée à sa

capacité d’induire l’entrée de cet ion dansles protéoliposomes. Grasso et Reichert(1993) suggèrent donc qu’une autre voied’entrée du calcium dans les cellules seraitreliée à l’internalisation des complexesFSH/récepteurs et la dégradation de l’hor-mone dans les lysosomes. Cet autre sys-tème d’entrée du calcium dans la celluleserait responsable de la seconde phasesoutenue d’élévation du taux de calcium.

DÉSENSIBILISATION

La liaison de l’hormone à son récepteurmembranaire déclenche aussi divers évé-nements qui ont comme conséquence deréduire l’intensité de la réponse cellulaire àune stimulation hormonale continue ou répé-tée. Cette diminution de la réponse cellu-laire à toute stimulation ultérieure est appe-lée désensibilisation. Elle dépend de laconcentration hormonale et de la durée d’ex-

position des cellules à l’hormone. Elle esten fait le résultat d’une combinaison de pro-cessus régulateurs qui se mettent en placetant au niveau du récepteur qu’aux diffé-rentes étapes intracellulaires de la trans-duction du signal hormonal impliquant lesprotéines G, l’adénylate cyclase, les phos-phodiestérases, les PKA, les phosphataseset les mécanismes de transcription desgènes.

Désensibilisation au niveaudu récepteur FSH

Déplétion des récepteurs FSH

La réponse des cellules de Sertoli à une sti-mulation par la FSH dépend en premier lieudu nombre de récepteurs disponibles à lasurface cellulaire. ln viw, il existe une auto-

régulation par la FSH circulante du nombre

de ses récepteurs à la surface de la cellulede Sertoli. Un effet positif de l’hormone sur lenombre de ses récepteurs est suggéré par lefait que le contenu testiculaire en récepteursFSH est fortement augmenté au cours dela période où la FSH circulante est particu-lièrement élevée, c’est-à-dire entre le 15e et

le 40e jour chez le rat (Ketelslegers et al,1978). De plus, chez le rat (Ghosh et al,1992) et la caille (Tsutsui et Ishü, 1980), l’hy-pophysectomie provoque une nette diminu-tion du nombre de récepteurs FSH par tes-ticule. Chez la caille hypophysectomisée,un traitement de remplacement par la FSH etla testostérone restaure le nombre de récep-teurs testiculaires à FSH. En revanche, il

existe aussi un effet négatif de la FSH surses propres récepteurs in vivo mais ceci àfortes concentrations d’hormone. Chez lerat adulte, l’injection intramusculaire (Gna-naprakasam et al, 1979) de FSH induit unediminution dans les 3 j du nombre des récep-teurs FSH. Chez le rat immature, l’injectionintratesticulaire de FSH (25 pg) se traduitpar une diminution des sites de liaison pourla FSH de 50% en 24 h. Cette déplétion enrécepteurs FSH est précédée par une dimi- i-

nution de la production d’AMPc par les cel-lules de Sertoli (O’Shaughnessy, 1980). Cesrésultats suggèrent que, in vivo, la FSH àde faibles concentrations a un effet positifsur le nombre et le maintien de ses récep-teurs et, à plus fortes concentrations, elleinduit leur déplétion.

In vitro, le rétrocontrôle négatif de la FSHsur ses récepteurs a été retrouvé sur descellules de Sertoli de rat en culture. En effet,5 pg/ml de FSH provoquent une diminutionmaximale du nombre de récepteurs, quipeut se maintenir plusieurs jours. Cette pertedes récepteurs s’accompagne d’une dimi-nution de la réponse AMPc de la cellule(Francis et al, 1981 ). Strictement spécifique,ce phénomène n’affecte aucunement laréponse de la cellule à un autre activateur tell’isoprotérénol, ni les différents effecteursde la voie AMPc telles la protéine G ou l’adé-

nylate cyclase (Jahnsen ef al, 1982). Cetteperte des récepteurs FSH en présence del’hormone est liée aux processus d’interna-lisation du complexe hormone/récepteur etde dégradation ou recyclage du récepteurdans la cellule. L’hormone, après liaison àson récepteur membranaire, est internali-sée avec celui-ci dans des vésicules d’en-

docytose qui migrent vers l’appareil de golgiet les lysosomes où l’hormone est dégra-dée (Shimizu et Kawashima, 1989). Lerécepteur FSH est recyclé en partie vers lasurface cellulaire, son accumulation au seindes lysosomes est donc progressive, ce quiconduit à plus ou moins long terme à sadégradation. Chez le porc, la perte dunombre de récepteurs FSH induite parl’hormone dépend de la concentration hor-monale (ED50 = 250 ng/ml) et du tempsd’action (t1/2 = 14 h) (Saez et Jaillard, 1986).Cette déplétion en récepteurs FSH est plusimportante en présence de monensine. Lamonensine est connue pour bloquer, d’unepart, le recyclage des récepteurs par alca-linisation des endosomes et inhibition de ladissociation de l’hormone de son récepteuret, d’autre part, le transport vers la mem-brane de récepteurs néosynthétisés. Ainsi,le processus de «downregulation» serait dûà une accélération de l’internalisation du

complexe hormone/récepteur. Mais le recy-clage partiel des récepteurs atténue ce phé-nomène de déplétion.

De plus, la FSH peut aussi réguler lenombre de ses récepteurs en modulant leursynthèse par la cellule de Sertoli (Them-men et al, 1991 La FSH exerce un rétro-contrôle en diminuant la stabilité des ARNmde son récepteur, sans altérer la transcrip-tion du gène codant pour celui-ci. Cettechute post-transcriptionnelle du nombred’ARNm entraînerait une diminution dunombre des récepteurs FSH néosynthéti-sés et exprimés à la surface cellulaire.

En résumé, la régulation par la FSH deses récepteurs présente à court terme uncycle rapide d’internalisation et de retour

vers la membrane et à long terme une pertenette du nombre des récepteurs par dégra-dation («downregulation») et diminution deleur synthèse.

Découplage du récepteur FSHde sa voie d’activation

Un autre type de désensibilisation, se déve-loppant à court terme, a été mis en évidencesur les cellules de Sertoli en culture stimu-lées par la FSH (Guillou et al, 1987) et surcellules 293 exprimant le récepteur FSHhumain recombinant (Sanchez-Yagüe etal,1993). Cette réduction de la réponse à l’hor-mone est liée à une diminution de la pro-duction d’AMPc (Verhoeven et al, 1980 ;Conti et al, 1983b ; Verhoeven et Cailleau,1986) consécutive à une baisse de l’acti-vité de l’adénylate-cyclase sous l’action dela FSH (Jahnsen et al, 1982 ; Le Gac et al,1985). Ceci serait dû au découplage durécepteur de la protéine G (Laurent-Cadoretet al, 1994a). Ce type de désensibilisationprésente les caractéristiques suivantes :- une grande sensibilité des cellules à ceprocessus. Cette désensibilisation est induite

par de faibles doses de FSH (10-11 à 10-10 °

M) n’entraînant qu’une faible augmentationde l’AMPc pendant la préincubation ;- la rapidité relative du processus, qui atteintson maximum en 1 à 4 h ;- la réversibilité du processus. Une récu-

pération de la sensibilité des cellules à lastimulation par FSH nécessite cependant22 à 48 h ;- l’inactivation importante mais partielle,environ de 60% à 80% d’inhibition, desréponses cellulaires comme l’activité adé-nylate cyclasique ou la production d’AMPcou la sécrétion de l’activateur du plasmino-gène et de 17p oestradiol ;- le maintien du nombre de récepteursFSH ;- le maintien des propriétés fonctionnellesde la protéine Gs ou de la sous-unité cata-

lytique de l’adénylate cyclase ainsi que deleur couplage.

Une étude approfondie de ce type dedésensibilisation par découplage du récep-teur FSH de la protéine G nous a conduits àproposer l’existence de 2 formes de désen-sibilisation bien distinctes quant aux méca-nismes moléculaires qui les régissent : l’unedite homo/hétérologue et l’autre homologue.

La désensibilisation homo/hétérologueimplique la participation de kinases dépen-dantes des nucléotides. En effet, tout agentstimulateur de la voie AMPc/PKA (les ana-logues de l’AMPc ou l’isoprotérénol via lesrécepteurs adrénergiques) peut induireune désensibilisation notable des cellulesde Sertoli à une stimulation ultérieure parla FSH, ceci quel que soit le type de PKAactivée (Laurent-Cadoret ef al, 1994a). Deplus, les esters de phorbol, activateurs desPKC, peuvent provoquer une désensibili-sation similaire (Monaco et Conti, 1987 ;Eikvar et al, 1993 ; Laurent-Cadoret et aI,1994a). Cette désensibilisation homo/hété-rologue est insensible à la cycloheximide(Conti et al, 1983b ; Laurent-Cadoret et al,1994b). Elle est observée pour des doses deFSH très faibles de 10-> M et des doses

d’isoprotérénol ou d’analogues de l’AMPcpeu ou non stimulantes des fonctions ser-toliennes. En bloquant spécifiquement cesprotéines kinases A et C par des inhibiteurspeptidiques, la composante homo/hétéro-logue de la désensibilisation est éliminée(Laurent-Cadoret et al, 1994b).

La suppression de cette première formede désensibilisation dégage le profil d’uneautre composante, cette fois-ci strictementspécifique de la FSH. Cette désensibilisationhomologue est observée pour des dosesde FSH supérieures à 1 0-1 M. La présencede cycloheximide abolit cette composantesans modifier la composante homo/hétéro-logue (Laurent-Cadoret etal, 1994b). Cettedésensibilisation homologue ferait doncintervenir un facteur protéique synthétisésuite à l’action des doses désensibilisantes

de FSH et qui participerait au découplagespécifique récepteur FSH/protéine G.

Sur la base de ces données, le récepteur rFSH serait le principal (ou peut être mêmel’unique) site de lésion de cette forme dedésensibilisation. L’existence d’un tel décou-

plage entre le récepteur FSH et sa voied’activation aurait pour origine une modifi-cation du récepteur affectant ses propriétésde transduction du signal hormonal. Lesdonnées actuelles concernant ce type dedésensibilisation pour le récepteur FSH nepermettent pas d’en préciser les méca-nismes exacts. Cependant, il est intéres-sant de comparer ce processus de désen-sibilisation observé pour le récepteur FSHavec ceux mis en évidence sur d’autres

récepteurs de la famille des récepteurs à7 domaines transmembranaires couplésaux protéines G (R7G) (Sprengel et al,1990 ; Savarese et Fraser, 1992). Parmiceux-ci nous pouvons citer notamment les

récepteurs p-adrénergiques, muscariniques,rhodopsines, cholecystokiniques et lutéo-tropiques (Ligget et Raymond, 1993 ; Lee etFraser, 1993 ; Hargrave et McDowell,1992 ; Williams et Blevins, 1993 ; Segaloffet Ascoli, 1993 ; Hipkin et al, 1993). Cesrécepteurs présentent la propriété d’êtredécouplés de leur voie de transduction lorsde la désensibilisation. L’étude la plus com-plète sur la désensibilisation par décou-plage d’un récepteur de la protéine Gs aété réalisée sur le récepteur R2-adréner-gique, mettant en évidence ses 2 compo-santes, l’une homo/hétérologue et l’autrehomologue stricte.

La désensibilisation homo/hétérologuedu récepteur (32-adrénergique touche laréponse ultérieure à l’agoniste lui-même etcelle à d’autres facteurs utilisant la voie del’AMPc et est induite de manière non spé-cifique par ces différents agents. Elle faitintervenir la phosphorylation du récepteurpar les protéines kinases dépendantes desnucléotides (PKA, PKC ou Ca2+/Calmodu-line protéine kinase) (Lohse et al, 1990a).

L’analyse de la structure du récepteur 13-adrénergique a permis d’identifier ces sitespotentiels de phosphorylation. La troisièmeboucle intracytoplasmique et l’extrémité car-boxy-terminale du récepteur contiennent eneffet chacune une séquence consensus -RRSS- pour la phosphorylation par la PKA.Ces sites sont proches des régions durécepteur qui sont impliquées dans l’inter-action avec la protéine Gs (Savarese et Fra-ser, 1992). Leur phosphorylation modifie-rait la distribution des charges dans ceszones structurées en hélices a et ainsi indui-

rait, par altération de la conformation, ledécouplage récepteur/protéine Gs. La muta-tion de ces sites, sans bloquer la capacité detransduction du signal et d’internalisationdu récepteur, entraîne en revanche unediminution de la capacité du récepteur àêtre phosphorylé et à subir la désensibili-sation (Hausdorff et al, 1989). Cette phos-phorylation catalysée principalement par lesPKA est induite par de faibles concentra-tions en isoprotérénol (nanomolaire) (Haus-dorff et al, 1989) et ses conséquences fonc-tionnelles se concrétisent par une diminution

de la réponse AMPc de la cellule (Ligget etRaymond, 1993).

La désensibilisation homologue du récep-teur (32-adrénergique ne touche que laréponse à l’agoniste responsable de cettedésensibilisation. Elle est aussi liée à la

phosphorylation du récepteur mais par uneprotéine kinase indépendante de l’AMPc etreconnaissant le récepteur occupé par l’ago-niste ; elle est dénommée «/3-adrenergicreceptor kinase» f3ARK (Lefkowitz, 1993).Elle est déclenchée à partir de concentra-tions en isoprotérénol de l’ordre du micro-molaire (Hausdorff et al, 1989). Les sitespotentiels de phosphorylation par cettekinase se situent dans l’extrémité carboxy-terminale du récepteur, riche en sérines etthréonines. La mutation de ces sites (Haus-dorff et al, 1989 ; Ligget et Raymond, 1993)altère la composante spécifique de désen-sibilisation. Les sites de phosphorylation par

la [3ARK sont assez éloignés de zones d’in-teraction entre le récepteur et la protéineG, ce qui pourrait expliquer que ces phos-phorylations n’induisent que partiellementle découplage. L’inactivation fonctionnelledu système nécessite l’intervention d’un fac-teur protéique cytosolique, de type arres-tine, qui va se lier à la forme phosphoryléedu récepteur et par encombrement stériqueva compléter le découplage récepteur/pro-téine G (Lohse et al, 1990b ; Lefkowitz etal, 1992).

Ce processus de découplage par phos-phorylation pourrait être applicable auxrécepteurs des gonadotropines. En effet,Hipkin et ai (1993) ont montré la phos-phorylation in situ du récepteur LH via l’ac-tivation des PKA et PKC. Mais la phos-phorylation du récepteur LH induit

spécifiquement par l’hormone n’est quepartiellement due à l’activation de ces voiesimpliquant les nucléotides. Ces auteurspostulent l’existence d’une kinase indé-pendante de ces seconds messagers etreconnaissant le récepteur occupé et activépar l’hormone. Récemment, Quintana etai (1994) ont montré que le récepteur FSHserait préférentiellement phosphorylé par lavoie PKC stimulé par la FSH ; la phos-phorylation du récepteur ayant pour consé-quence un découplage du récepteur de laprotéine G.

Il apparaît donc que ces processus régu-lateurs mis en jeu au niveau du récepteurpourraient en fait s’appliquer de façon assezgénérale à cette famille de récepteurs à 7domaines transmembranaires.

Désensibilisation au niveau de la

protéine G ou de l’adénylate cyclase

Au niveau des protéines G

Parmi les divers mécanismes de désensibi-lisation de la réponse cellulaire, des modifi-cations du taux de protéines Gi peuvent être

une voie de rétrocontrôle de la transductiondu signal hormonal (Reithmann ef al, 1991 ).

Dans les cellules de Sertoli, il existe une

protéine Gi qui exerce une inhibitionconstante sur l’activité de l’AC (Davenportet Heindel, 1987). L’inhibition de l’activité dela protéine Gi par la toxine pertussis aug-mente la capacité de la FSH à stimuler laproduction d’AMPc (Kangasniemi, 1993).Son activation, notamment par l’adénosinevia les récepteurs A1, peut inhiber la stimu-lation des cellules de Sertoli par la FSH chezle rat (Monaco et al, 1988b) et chez le ham-ster (Davenport et Heindel, 1987). De plus,100 ng/ml de FSH sont capables de modu-ler l’expression des différentes formes deprotéines Gi des cellules de Sertoli, dimi-nuant en 6 h le taux des ARNm d’ai-1 et ai-2 et augmentant ai-3 (Loganzo et Flechert,1992). L’expression de Gs n’est en revanchepas modifiée. Ces observations ne permet-tent pas actuellement de préciser si cetterégulation des isotypes de la protéine G parla FSH peut modifier l’action ultérieure del’hormone au sein de la cellule de Sertoli.

Au niveau de l’adénylate cyclase

L’activité de certaines AC, notamment lestypes 5 et 6, peut être inhibée par phos-phorylation par la PKA (Premont et al,1992b). Dans les cellules où les AC detype 5 et 6 sont exprimées, une désensi-bilisation par tout agent activateur de lavoie AMPc/PKA pourrait donc avoir lieu.Dans le testicule, les 3 types d’AC mises enévidence sont les formes 4, 5 et 6, maisleur répartition suivant le type cellulaire n’apas été déterminée. Cependant, ce typede désensibilisation ne semble pas exis-

ter dans la cellule de Sertoli. En effet, dansles cellules de Sertoli désensibilisées par la

FSH, l’activité de l’AC stimulée par la fors-koline ou le fluorure de sodium n’est pasmodifiée (Jahnsen et al, 1982 ; Conti et al,1983a ; Le Gac etal, 1985 ; Laurent-Cado-ret et al, 1994a).

Désensibilisation en avalde la production d’AMPc

Par les phosphodiestérases

La préincubation avec la FSH résulte enune diminution dose-dépendante de l’ac-cumulation de l’AMPc non seulement dansle milieu mais aussi dans les cellules de

Sertoli, au cours d’une seconde stimulationpar l’hormone (Verhoeven et al, 1980). Cetteinhibition est particulièrement intense, pou-vant atteindre environ 80%. Elle est liéed’une part à une diminution de sa synthèse,par diminution de l’activité adénylate cycla-sique suite au découplage du récepteur desa voie d’activation (phénomène décrit pré-cédemment) et d’autre part à une augmen-tation de son catabolisme par activation de

l’activité phosphodiestérasique au sein de lacellule. En effet, les phosphodiestérases(PDE), seule voie physiologique de dégra-dation par hydrolyse des nucléotidescycliques en nucléotides 5’ correspondant,peuvent jouer un rôle important dans lesprocessus de désensibilisation (Conti et al,1991 Les cellules de Sertoli exprimentconjointement les CaM-PDE et AMPc-PDEcytosoliques. Une modification élaborée del’activité de ces différentes formes de PDEfait suite à l’activation de la voie de l’AMPc

par la FSH. Les Ca2+/CaM-PDE sont lesformes majoritaires des PDE présentesdans le cytosol des cellules de Sertoli derat immature non stimulées. Lors de la sti-mulation par la FSH, l’activité des Ca2+/CaMPDE est rapidement inhibée puis progres-sivement une augmentation de l’activitéphosphodiestérasique apparaît dans les cel-lules, notable après 4 h de stimulation etqui est liée à l’accumulation des AMPc-PDEnouvellement synthétisées. Si le stimulushormonal persiste, la forte activité phos-phodiestérasique peut se maintenir au-delàde 24 h. Cette induction retardée des AMPc-

PDE apparaît après le retour au niveaubasal du taux d’AMPc. Les concentrations

en AMPc sont alors au-dessous du Km de laPDE pour l’AMPc, impliquant que l’enzymen’exprimera son activité catalytique que siles cellules sont à nouveau stimulées. Cemécanisme de régulation servirait de rétro-contrôle négatif, permettant de diminuerplus rapidement la teneur intracellulaire ennucléotides cycliques. L’induction à longterme des AMPc-PDE par une première sti-mulation par la FSH est un facteur majeurde contrôle de la réponse des cellules deSertoli et contribue à une baisse ou mêmeà une suppression de sa réponse ultérieureà la FSH (Conti et al, 1986). Elle est liée àune néosynthèse de molécules et peut êtreinduite par tout agent activateur de la voieAMPc tels le db-AMPc mais aussi, dansune moindre mesure, l’isoprotérénol. C’estdonc une forme hétérologue de désensibi-lisation nécessitant de plus une synthèseprotéique.

Par l’inhibiteur des PKA

Cet inhibiteur des PKA (PKI) a été mis enévidence dans différents tissus, incluant lecoeur, le cerveau, le muscle et le testicule.Cet inhibiteur est un peptide de petite taille(8 kDa) qui, comme la sous-unité régula-trice de la PKA, agit comme pseudo-sub-strat en se liant au site actif de la sous-unité

catalytique de la PKA. Chez le rat, 2 formesde PKI, PKIA et PKIP, ont été identifiéesdans le testicule (Van Patten et al, 1992).Il existe une expression différentielle de ces2 formes au cours du développement : l’ex-pression de PKIA décroît de la naissance

jusqu’à l’âge de 20 j, puis la forme PKI(3apparaît et son expression augmente jus-qu’à l’âge adulte.

L’activité de cet inhibiteur est sous le

contrôle spécifique de la FSH (Tash et al,1979). En effet, chez le rat, l’hypophysec-tomie entraîne une diminution de l’activité

PKI, qui peut être rétablie par traitement del’animal avec de la FSH. L’injection de laFSH est suivie d’une augmentation de l’ac-

tivité PKI en 12 h qui continue lentement side nouvelles injections de FSH sont effec-tuées. Une néosynthèse de l’inhibiteur est àl’origine de cette augmentation d’activité.De plus, la régulation par la FSH de l’activitéPKI dépend de l’âge de l’animal : un picd’activité de cet inhibiteur sous stimulation

FSH est observé chez des rats immatures

âgés de 12 à 19 j, la faible activité résiduelleobservée à l’âge de 20 j décroît jusqu’à l’âgeadulte de l’animal.

ln vitro, la localisation intracellulaire duPKI a été déterminée à l’aide d’anticorps auniveau des microtubules (Tash et al, 1980).L’activité PKI est stimulée par la FSH

(ED50 = 20 ng/ml) significativement dès 4 hpuis se développe sur 24 h. De même, ladépendance de cette stimulation vis-à-visde l’âge de l’animal dont proviennent lescellules est toujours observée (Tash et al,1981 ). Elle explique en partie le fait que lescellules de Sertoli perdent leur faculté deréponse à la stimulation FSH au cours de lamaturation du testicule.

,

Ainsi cet inhibiteur des PKA, dont l’activitéest augmentée par la FSH en quelquesheures par néosynthèse de molécules, estdonc capable en bloquant l’activité de laPKA de désensibiliser les cellules de Sertolilors de stimulations continues ou répétéespar la FSH. Il peut être stimulé par tout agentactivateur de la voie de l’AMPc et notam-

ment l’isoprotérénol. C’est donc une formehétérologue de désensibilisation nécessi-tant de plus une synthèse protéique.

Par les phosphatases

Du fait de leurs facultés à inverser l’action

des PKA, les phosphatases sont desacteurs potentiels de désensibilisation dela réponse cellulaire lorsqu’elle est médiéepar la voie AMPc mais elles pourraientaussi, théoriquement, «résensibiliser» lerécepteur FSH phosphorylé. L’implicationdes phosphatases dans la modulation del’action de la FSH dans le testicule n’a

cependant pas été étudiée. Les seules don-nées disponibles sont l’identification des 4isozymes majeurs de ces sérine/thréoninephosphatases dans le testicule dénomméesPP-1, PP-2A, PP-2B (calcineurine), et PP-2C (Cohen, 1989).

Au niveau transcriptionnel

Dans le cas des gènes dont la transcriptionest contrôlée par l’AMPc, il a été observé

qu’une stimulation de courte durée provoqueune augmentation de la transcription suivied’une inhibition de celle-ci (Hagiwara et al,1992). Ce phénomène a été observé dansla cellule de Sertoli sous stimulation FSH. En

effet, la FSH provoque une augmentationde la transcription du gène de la transfer-rine en 2 h puis une diminution de la trans-cription de ce gène (Suire, communicationpersonnelle). Ce phénomène peut être induitaussi par le db-AMPc.

CONCLUSION

La réponse des cellules de Sertoli à l’actionde la FSH est continuellement ajustée enfonction de l’environnement extracellulairecomme intracellulaire. Notamment, lesautres cellules testiculaires par la sécrétion

de facteurs paracrines ou les modificationsqualitatives et quantitatives des acteurs desvoies de transduction du signal dans la cel-lule de Sertoli ainsi que des niveaux circu-

lants de FSH au cours du développementvont moduler la physiologie sertolienne (pourrevue, voir Russel et Griswold, 1993). Lesmécanismes à l’origine de cette adaptationcellulaire sont complexes. Parmi ceux-ci,les processus de découplage du récepteur rdu complexe récepteur FSH/protéine Gs/ACà court terme puis l’augmentation de l’acti-vité phosphodiestérasique et de l’inhibiteurdes PKA ainsi que la déplétion des récep-teurs à plus long terme peuvent se complé-ter pour engendrer une désensibilisation des

cellules de Sertoli. Il se forme ainsi un savant

équilibre entre stimulation et désensibilisationdont le rôle serait d’une part de protéger lesvoies de transmission et d’intégration dusignal hormonal lors d’une éventuelle aug-mentation pathologique de la concentrationhormonale et d’autre part de réguler positi-vement comme négativement la sensibilitédes cellules à l’action hormonale.

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