Embed Size (px)
Citation preview
Aspektu berriak Eritasun Zeliakoaren Genetikan:
kopia kopuru aldaerak, Metilazioa eta korregulazioa NFKB-rekin erlazionatutako geneetan
Jakintza-arloa: Natur Zientziak
Egilea: NORA FERNANDEZ JIMENEZ
Urtea: 2014
Zuzendariak: JOSE RAMON BILBAO CATALA
Unibertsitatea: UPV/EHU
ISBN: 978-84-8438-581-3
Hitzaurrea
Lan hau ingelesez ekoiztu zen hasiera batean, aldizkari internazionaletan argitaratutako artikulu ezberdinak abiapuntu hartuta. Hala ere, gure laborategian beti euskaratu ditugu tesiak, batetik, euskara gure eguneroko jardun zientifikoan erabili eta itzulpen prozesu horrek doktoregoan zehar egindako hizkuntza mailako aurrerapen zein ikaspenen laburpena jasotzen duelako eta bestetik, hizkuntza bizi, dinamiko eta indartsu mantentzeko ekoizpena alor guztietan eman behar dela deritzogulako. Tesiak euskaraz idaztea zientzian ematen diren aurrerapausoen berri emateko lanabes bikaina izateaz gainera, eztabaida zabaldu eta hizkuntzari bizitasuna emateko ere baliagarri izan liteke.
Nora Fernandez
2016
ASPEKTU BERRIAK ERITASUN ZELIAKOAREN GENETIKAN:
KOPIA KOPURU ALDAERAK, METILAZIOA ETA KORREGULAZIOA NFκB-‐REKIN ERLAZIONATUTAKO GENEETAN
Nora Fernandez Jimenez Jose Ramon Bilbaoren zuzendaritzapean
Leioa 2014
Lan hau Nora Fernandezek jasotako Eusko Jaurlaritzako Hezkuntza, Unibertsitate eta
Ikerketa Saileko Beka Predoktoral (BFI-2009-099) eta Eusko Jaurlaritzako Osasun
(2006111030) eta Industria (SAIO10-PE10BF03) sailek eta Instituto de Salud Carlos
III-Espainiako Berrikuntza eta Zientzia Ministeritzak (PI10/00310) diruz lagundutako
proiektuen bitartez burutu da. SGIkerrek (UPV/EHU, MICINN, GV/EJ, EGEF eta EGIF)
emandako laguntza teknikoa eta lana eskertzen da.
"Nada está perdido si se tiene por fin el valor de proclamar que todo está perdido y que hay
que empezar de nuevo."
Julio Cortázar, Rayuela.
Mundua, bizitza bera, etengabe aldatzeko ausardia dutenei, maitasunez.
Esker onak
Lehenik eta behin eskerrak eman nahi dizkiot nire tesi zuzendari eta lagunari, Buliri. Lehenengo
postu hau ez da itxurazkoa, edo formalismoak errespetatzearren egindako keinu soil bat,
bihotzez eskertzen baitizut urte hauetan emandako guztia. Zerrendatzen saiatzea alferrik da,
baina gutxi batzuk aipatzearren: zure pazientzia amaigabea, congress party-‐ak, zure frikismo
kutsakorra eta zuri esker zabaldutako ate eta leiho guztiak. Abentura zientifiko eta pertsonal
izugarria izan da zurekin tesia egitea eta ezingo dizut sekula aukera hau behar beste eskertu.
També vull agrair la seva ajuda en aquesta tesi a les persones que em van acompanyar i guiar
durant el meu primer any en el món de la ciència: a la Dra. Rosa Miró, per donar-‐me
l’oportunitat de formar part del seu grup i de “cruzar el charco” amb les mostres sota el braç. A
la Dra. Imma Ponsa, perquè durant aquell any vas ser la meva guia en el laboratori i en el món
de la investigació, a més a més d’una gran amiga. Al Dr. Jordi Camps pel seu contagiós amor
per la ciència and to Dr. Thomas Ried for kindly accepting me in your lab at NIH. Per
descomptat, a la Laia, la Glòria, el Javi, la Sandra i tots els companys I companyes del lab, als
nois i noies del Màster, sobretot a la Marina que va estar de pega però tan feliçment va
remuntar, et trobo a faltar! A les meves alumnes de les classes d’euskara, per la seva santa
paciència, i als amics i amigues de Sants, el millor barri dels Països Catalans: Marta, Arantxa,
Iris, Irune, Paula, Pau (aupa Papu, bihotzez mila esker urte zoragarriengatik!)… pel seu
recolzament i la seva acollida a Barna, mai us oblidaré. A la gent de l’Assemblea de Joves de
Sants, de l’Assemblea del Barri i de Can Vies, per esforçar-‐vos en intentar fer d’aquest món un
món millor i aconseguir-‐ho tantes i tantes vegades!
Bigarrenik, eskerrak eman nahi dizkiet nire lankideei, lan hau haiena ere badelako, ikuspegi
guztietatik gainera. Galderri, bere laguntza informatikoagatik eta nire tekno-‐neurosia jasateko
gaitasunagatik. Izortzeri, lehenengo urtean laboan gutxi egon baginen ere, KIR hartzaileei
buruzko ondare zabala utzi eta lanetik kanpo babesleku emateagatik (zelako liada Bruselan,
ezin zaigu bakarrik utzi!! Gora Baraka!!). Nire ahizpa zientifiko handiari, Ainarari, bere
zientziarekiko zaletasun kutsakorragatik, bere proiektu eta ideia onengatik eta noski,
konpartitutako parranda guztiengatik, NY txiki geratzen zaizu dagoeneko!!! Tamarari, biopsia
eta zelulen munduan eman didan laguntzagatik eta egindako barreengatik. Amaiari, etorri
zenetik laboa umore onez jantzi duelako, zure txisteak eta zure despisteak faltan izango
Esker onak
ditudalako eta azken urtean ezinbesteko egin zarelako, etorkizun bikaina duzu aurretik!!! Eta
nola ez, nire gemelita zientifiko eta munduko maketatzailerik eskuzabalenari, Letiri,
desberdinak bagara ere oso igualak ere bagarelako, zu benetan ezagutzeko aukera eman
didazulako eta zurekin asko ikasi dudalako, zientziaz eta bizitzaz; bihotzez, faltan izango zaitut
eta oso probablea da nire sare sozialekiko fobia gainditzea txapak ematen jarraitu ahal izateko
(Malen txikiari ere eskerrak, gure kafeak eta Paris izugarria bera alaitzeagatik!).
Urte hauetan zehar Unibertsitatean eta Gurutzetan bidelagun izan ditudan gainontzeko
zientzialari eta kide guztiei: nire Leioako ikaskideei (bereziki tesi lagun ditudan Ana, Iskander,
Jone, Amaia, Enara eta Pablori), campuseko militantziari (gora Arte Ederretako txokoa!) eta
batez ere Loreari, nire karrerako lagunik minenari (aupa Bilboko ostegunak, EHBE eta
Bortziriak!). Bartzelonako fasean karreran lagun izan nituenei, y en especial a las Irenes y a
Marta, por las cenitas y por dejarme los apuntes tantísimas veces!!
A los Oncos de la Unidad de Investigación de Cruces, Unai, Olaia y Bego, por los viernes de
pintxos y demás ediciones del Gran Hermano Comer-‐Beber, me lo he pasado pipa!!! A Itzi y
Kerman, porque cuando aparecéis alegráis la mañana, y a Jose por los momentos de pitilleo en
la puerta del hospital. A Esti (la chica a la que mejor le sienta el morado), a Xabi y a todos los
que andan por el animalario, a mi co-‐becaria Garbiñe (gracias por los momentos compartidos,
QQ) y a las demás chicas Stem, a Susana, a los del labo de abajo (Gustavo y su secuenciador,
Teba, Teresa, Alex, Ana, Inés y los demás, y cómo no, a Sorkunde por su paciencia infinita con
nuestra incapacidad para reclutar albaranes y dar parte de los pedidos!). A Costy, compañera
de labo (y piso!) temporal a la que no olvido e iré a ver a La Plata seguro. A los doctores Luis
Castaño, Juan Carlos Vitoria, Iñaki Irastorza (por mantener mis capacidades de discutidora en
forma!) y Carlos Tutau. Y por supuesto, a todos los pacientes y sus familias, por su gran
generosidad. Bihotzez, eskerrik asko!
A la doctora África García-‐Orad y a nuestras nuevas compañeras en el Bunker de Medicina
(Idoia, Nereak, Ángela, María, Ziortza y todas las personas que han pasado por aquí) por los
momentos de labo y de café (sobre todo a Eli por las veces que ha salido a acompañarme
cuando estábamos solas aunque ella no lo tome! Mucha suerte, seguro que lo consigues, no
me cabe ni la menor de las dudas!). Y por supuesto, al Dr. Herceg, al Dr. Hernandez-‐Vargas y a
todo su equipo en el IARC de Lyon por acogerme durante la última fase de esta tesis doctoral.
Esaten dute bizitza honetan benetako lagunak esku bakarrez zenbatu daitezkeela. Egia esan
oso zorionekotzat dut neure burua, nik ezin baitut hori egin. Eskerrak eman nahi dizkiet nire
lagun guztiei, aipatuko ditudanei eta baita aipatu gabe geratuko direnei ere, nire bizitza
Esker onak
alaitzeagatik, zer pentsatu emateagatik, maitasunaren dimentsio ezberdinak ezagutzeko
aukera emateagatik, barreengatik, malkoengatik, ezer ulertu gabe entzuteagatik,
proiektuengatik, parrandengatik, momentuengatik, bizitza momentuen bilduma delako
funtsean.
Eskerrak eman nahi dizkiet txikitako lagunei (Saioa, Nai, Yor, Amaia, Idoia, Petxu, Mirentxu,
Lorea, Gaizka, Hektor eta beste hainbati), pasatu ditugun momentu on guztiengatik eta
txarretatik ikasteko gai izan garelako. Azken aldian gutxi egoten bagara ere zuekin topo egiteak
beti sortzen dit poz berezia.
Txotxi Team eta Boka Negra Club!!! Eskerrik asko Aintzane, Esti, Andere, Rule eta Iratiri,
niretzat emakume inspiratzaileak zaretelako, indarrez eta energiaz beteak, bizitza intentsoak
bizitzeko ausardia miresgarria gainezka! Aupa zuek! Eta batez ere Aitziberri, ezagutu dudan
pertsonarik langile eta pasioz beteenetako bat, eredu eta lagun ezin hobe zara niretzat, lortu
dugu!!!
Basetxe Gaztetxeko harrobi guztiari (Anderulio, Jagoba, Almuer, Irati, Nuria, Aimar, Jugatx,
Eder, Txaba, Egoitz dantza kuduro, Argiñe, Eneko eta beste guztiei), dantzariei (aupa Marta!),
txalapartariei eta finean guzti-‐guztiei. Nerea, Zigor eta lagun min dudan Oskarri, laster gara
berriro! Gora Trapagarango Lonjak! Aupa Anabel, Dario, Juanjo, Rafa eta lanean diharduten
pertsona paregabe guztiak! Gora herria!
Lagun izateaz gainera, militantzia kide eta bidelagun ditudan aparteko pertsonei: Oihane
(muxu en los morretes!), Orats, Kimetz, Edu eta Patxiri. Benetan, zorioneko naiz zuek ezagutu
izanaz, Basetxe Unibertsitatean ikasi ditut nik ikaspenik eder eta gogorrenak eta zuekin pasatu
ditudan orduetatik hazitako proiektuek osatzen dute gaur nire itxaropena eta nortasuna! Eman
didazuen guztia biziarteko altxor da niretzat.
Kuadrillari. Lo mejor de cada casa!!! Akelarreko sorginei, Olaiari (ezin hobea zara, nahiz eta
batzutan ez sinestu!), Kuori eta Rubiari (eta Enaitz txikiari, kuadri v.2.0, versión mejorada!
Aitatxu Kokotas, tampoco me olvido de ti!). Elkar faltan izango badugu ere, tesi osteko
abentura planifikatzen sostengua eman didazuelako, txarto egon naizenean nire zatitxoak jaso
eta neure burua berregiten lagundu didazuelako, beti hor zaudetelako, bakoitza mundu bat
izan arren elkar ulertu, errespetatu eta maite dugulako eta ez dagoelako hori aldatuko duen
denbora edo distantziarik. A los jinetes del apocalipsis, Victoria (Ires), Hambre (Jonga) y
Muerte (ese Tatxo conquistando las Américas!). Pila bat maite zaituztet parranderos!!! Beti
egon zarete nirekin baina azken denboran nire euskarririk sendoenetako bat izan zarete.
Esker onak
Aurretik geratzen zaizkigun abentura guztiengatik, prost! Kepari, kristona zarelako! Pero no me
robes el título de Guerra, eh?! Mari, Aizane (nire bihotzeko azukre koskorra) eta Bittorri, gure
bizitzetan agertu zaretenetik eman diguzuen guztiagatik, benetako laguntzat zaituztedalako
eta badakidalako kanpora bizitzera bagoaz ere horrela jarraituko dugula, misión auto-‐caravana
ya!!! Koldito, Gemma eta Markeli, Arrate, Urkito eta Peiori… La kuadri v.2.0 crece… Aupa Izas,
Sheila, Lorea, Naroa eta kuadrilla! Eta gurekin egoten zareten guztiei, denei mila esker!
A toda la familia de Unai, por acogerme con tanta generosidad, eta bereziki Naiarari (oso lagun
ona zara niretzat) eta gure Izaro txikiari… Cómo se puede querer tanto a una cosa tan
pequeña!!! A mi familia. A los que estamos y a los que ya no están, por haberme dado todo
aquello por lo que más orgullosa me siento: la fuerza y la alegría, la capacidad de disfrutar de
las pequeñas cosas, la conciencia, una historia de la que sentirme orgullosa, el valor del trabajo
y el esfuerzo y las herramientas para buscar la felicidad en la vida, además de una mala leche
considerable, que también me ha servido en muchos momentos. A mis aitites y amamas por su
duro trabajo y por su lucha, por esa mezcla increíble de humildad y dignidad, por habernos
legado sus valores, por las grandes personas que fueron. A mis tíos y tías (Luis, Mari Nieves,
Josan, Guiller, Lupe, Montse y Amaia) y a mis primos y primas (Itzi, Amaia, Javi, Joseba, Olaia,
Emma, Marta y Adrián), por todo lo que he aprendido de vosotros y todo lo que me queda por
aprender, por vuestro apoyo incondicional en el estudio y en la vida en general.
A ama, aita y Jon. No puedo describir con palabras la gratitud que siento hacia vosotros. Ama,
estoy muy contenta de parecerme cada vez más a ti, la pasión con la que vives las cosas y tu
manera de querer son una fuente de inspiración, gracias por estar siempre para todos, gracias
por ser como eres. Aita, eres mi mayor referente en la vida, solo te digo que espero que algún
día alguien se sienta tan orgulloso de mí como yo me siento hoy de ti. Gracias por escucharme
siempre. Y mi Jontxi, mi hermano, mi primer recuerdo es la primera vez que te vi, eres un
regalo. Lucha, porque tienes una fuerza desbordante y no sabes lo importante que es esa
alegría vital que nos contagias para todos los que te rodeamos! Os quiero mucho.
Unairi, nire bizikide, maitale zoragarri eta lagun minenari. Eskerrik asko ulertzen ez zenuenean
ez zenuelako nire alboan geratzeko azalpenik behar izan. Eskerrik asko denborarekin elkarren
barruetara salto egin eta ulermen, ezagutza eta errespetu sakon batera heldu garelako. Milioi
bat esker zu zaren pertsona bikain, eskuzabal eta ameslari hori eskaini didazulako. Abenturarik
ederrenak bizitzeke ditugu, bizitza hasi besterik ez dugu egin. Maite zaitut.
Aurkibidea
Laburdurak .................................................................................................................................... 1
Argitalpen orijinalen zerrenda ...................................................................................................... 3
Proiektuaren justifikazioa eta garrantzia ...................................................................................... 5
Sarrera ........................................................................................................................................... 7
1. Eritasun zeliakoa ................................................................................................................... 9
1.1. Ezaugarri klinikoak eta diagnosia .................................................................................. 9
1.2. Epidemiologia .............................................................................................................. 10
2. Eritasun zeliakoaren genetika ............................................................................................. 12
2.1. HLA eremua eta eritasun zeliakoa ............................................................................... 13
2.1.1. HLA eremua ......................................................................................................... 13
2.1.2. Suszeptibilitate geneak eta arrisku genetikoa ..................................................... 13
2.1.3. HLAren rola CDren patogenesian ........................................................................ 15
2.2. Suszeptibilitate genetikoa ekartzen duten geneen bilaketa CDn ................................ 16
2.2.1. Lotura eremuak eta hautagai posizionalak ......................................................... 16
2.2.2. Hautagai funtzionalak .......................................................................................... 19
2.3. Genoma osoko asoziazio azterketak CDn .................................................................... 24
2.3.1. Lehenengo GWASaren emaitzak ......................................................................... 24
2.3.2. Bigarren GWASaren emaitzak ............................................................................. 26
2.3.3. Immunochip proiektua ........................................................................................ 27
2.3.4. Asoziazio azterketen jarraipenak ........................................................................ 27
3. Eritasun zeliakoaren patogenesia ....................................................................................... 30
3.1. Glutena ........................................................................................................................ 31
3.2. Transglutaminasa ........................................................................................................ 32
3.3. Sistema immune adaptatiboa ..................................................................................... 33
3.4. Sistema immune innatoa ............................................................................................. 33
Helburuak .................................................................................................................................... 35
Lehen kapitulua: Kopia kopuru aldaeren analisia CDn ................................................................ 39
1. Aurrekariak .......................................................................................................................... 41
2. Materialak eta metodoak .................................................................................................... 45
2.1. Etikari dagokion adierazpena ...................................................................................... 45
2.2. DNA laginak ................................................................................................................. 45
2.3. Kopia edukiaren determinazioa qPCR bidez ................................................................ 45
Aurkibidea
2.4. Kopia edukiaren determinazioa paralogoen ratio testaren (PRT) bidez ...................... 47
2.5. Datuen analisia ........................................................................................................... 48
3. Emaitzak .............................................................................................................................. 50
3.1. DNA kantitateak eragaina du qPCR bidezko kopia kopuruaren esleipenean .............. 50
3.2. PRT entseguak DNAren degradazioarekiko oso sentikorrak dira ................................ 53
3.3. qPCR eta PRT teknikak konparagarriak dira baldintza kontrolatuetan ....................... 53
3.4. β-‐defensina kopia kopuru baxua CDrekin asoziatuta dago ......................................... 56
4. Eztabaida ............................................................................................................................. 58
Bigarren kapitulua: NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn ............................................... 63
1. Aurrekariak .......................................................................................................................... 65
2. Materialak eta metodoak .................................................................................................... 70
2.1. Pazienteak eta biopsiak ............................................................................................... 70
2.2. Gliadinaren prestaketa eta biopsia kulturak ............................................................... 70
2.3. Adierazpen analisietan erabilitako RNA laginak ......................................................... 71
2.4. Alderantzizko transkripzioa (RT) eta PCR kuantitatiboa (qPCR) .................................. 71
2.5. Metilazio azterketarako DNA laginak ......................................................................... 72
2.6. CpG irlen aukeraketa eta pirosekuentziazioa .............................................................. 73
2.7. Datuen analisia eta estatistika .................................................................................... 75
3. Emaitzak .............................................................................................................................. 77
3.1. NFκB geneen gainadierazpena eta bidezidorraren in vitro modulazioa ..................... 77
3.2. NFκBrekin erlazionaturiko geneen koadierazpena ..................................................... 81
3.3. Erregresio kubikoan oinarritutako zuzenketa mailak qMAMBAren errendimendua aurresaten du .......................................................................................................................... 84
3.4. Promotoreen metilazio maila alteratu eta partzialki itzulgarriak CD aktiboan .......... 87
3.5. Kometilazio eta koadierazpen sareak ......................................................................... 88
4. Eztabaida ............................................................................................................................. 91
Azken hausnarketak .................................................................................................................. 101
Ondorioak ................................................................................................................................. 107
Bibliografia ................................................................................................................................ 111
Laburdurak
1
Laburdurak
APC (antigen presenting cell) zelula antigeno aurkezlea
CD (celiac disease) eritasun zeliakoa
CFS (correlation-‐based feature selection) korrelazioan oinarrituriko
ezaugarrien aukeraketa
CGH (comparative genomic hybridization) hibridazio genomiko
konparatiboa
CNV (copy number variants) kopia kopuru aldaerak
CpG (cytosine-‐phosphate-‐guanine) zitosina-‐fosfato-‐guanina
EGFR (epidermal growth factor receptor) hazkunde faktore
epidermikoaren hartzailea
EMA (anti-‐endomysium autoantibodies) anti-‐endomisio
autoantigorputzak
ESPGHAN (European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology
and Nutrition) Gastroenterologia, Hepatologia eta Elikadura
Pediatrikoaren Elkarte Europarra
FC (fold change) arrazoi aldaketa
GFD (gluten free diet) glutenik gabeko dieta
GWAS (Genome Wide Association Study) Genoma Osoko Asoziazio
Azterketa
HLA (Human Leucocyte Antigen) Giza Antigeno Leukozitarioa
IEL (intraepithelial lymphocyte) linfozito intraepiteliala
KIR Killer Immunoglobulin-‐like receptor
MHC (Mayor Histocompatibility Complex) Histokonpatibilitate
Konplexu Nagusia
NK Natural Killer
Laburdurak
2
PAMP (pathogen-‐associated molecular pattern) patogenoei
asoziaturiko patroi molekularra
PRT (paralog ratio test) paralogoen ratio testa
PTG (pepsin-‐trypsin-‐digested gliadin) pepsinaz eta tripsinaz
liseritutako gliadina
qMAMBA (quantitative methylation analysis of minute DNA amounts after
whole bisulfitome amplification) bisulfitoma osoaren anplifikazio
osteko DNA kantitate txikien metilazio analisi kuantitatiboa
qPCR (quantitative PCR) PCR kuantitatiboa
SD (standard deviation) desbideraketa estandarra
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Nukleotido Bakarreko
Polimorfismoa
T1D (type 1 diabetes) 1 motako diabetesa
TF (transcription factor) transkripzio faktorea
TFBS (transcription factor binding site) transkripzio faktore lotura
gunea
TG2 (transglutaminase) transglutaminasa
TGA (transglutaminase autoantibodies) transglutaminasa
autoantigorputzak
TLDA Taqman Low Density Array
TLR Toll-‐like receptor
Argitalpen orijinalen zerrenda
3
Argitalpen orijinalen zerrenda
1. kapitulua
I) Fernandez-‐Jimenez N, Castellanos-‐Rubio A, Plaza-‐Izurieta L, Gutierrez G,
Irastorza I, Castaño L, Vitoria JC, Bilbao JR. Accuracy in copy number calling
by qPCR and PRT: a matter of DNA. PLoS One. 2011, 6:e 28910.
II) Fernandez-‐Jimenez N, Castellanos-‐Rubio A, Plaza-‐Izurieta L, Gutierrez G,
Castaño L, Vitoria JC, Bilbao JR. Analysis of beta-‐defensin and Toll-‐like
receptor gene copy number variation in celiac disease. Hum Immunol.
2010, 71: 833-‐6.
2. kapitulua
III) Fernandez-‐Jimenez N, Plaza-‐Izurieta L, Lopez-‐Euba T, Jauregi-‐Miguel A,
Bilbao JR. Cubic regression-‐based degree of correction predicts the
performance of whole bisulfitome amplified DNA methylation analysis.
Epigenetics. 2012, 7: 1349-‐54.
IV) Fernandez-‐Jimenez N, Castellanos-‐Rubio A, Plaza-‐Izurieta L, Irastorza I,
Elcoroaristizabal X, Jauregi-‐Miguel A, Lopez-‐Euba T, Tutau C, de Pacorbo
MM, Vitoria JC, Bilbao JR. Coregulation and modulation of NFκB-‐related
genes in celiac disease: uncovered aspects of gut mucosal inflammation.
Hum Mol Genet. 2013.
Proiektuaren justifikazioa eta garrantzia
5
Proiektuaren justifikazioa eta garrantzia
Eritasun zeliakoa (CD) prebalentzia altuko gaixotasun kroniko eta autoimmunea da.
Prebentzioa berebizikoa izango da gaixotasun hau desagerraraziko bada eta beraz,
aurreikuspenerako zein diagnosi goiztiarrerako tresna efizienteak garatu beharko dira.
Eskala tenporalean, sintoma klinikoen agerpenak gaixotasunaren progresio prozesua
oso aurreratuta dagoela esan nahi du. Gaixotasunaren estadio aktibora heldu baino
lehen, ordea, badira beste gertaera batzuk, ehuneko transglutaminasaren aurkako
autoantigorputzen (TGA) eta bestelako markatzaile immunologikoen ekoizpen eta
zirkulazioa kasu, predisposizio genetikoa duten indibiduoetan agertzen den sistema
immuneak eragindako ehunaren endekatze prozesua gertatzen ari den seinale.
Horrela, gaixotasunarekiko suszeptibilitatean parte hartzen duten gene eta
bidezidorrak identifikatzea eta beren arteko elkarrekintzak zein erregulazio
mekanismoak ulertzea funtsezkoa da. Aurrerapen hauek CDren garapenean gako diren
mekanismo patogenikoak argitzen eta gaixotasuna pairatzeko arriskuan dauden
indibiduoak identifikatzeko markatzaile genetiko eta epigenetikoak aurkitzen lagun
lezakete. Gainera, aurkikuntza horiek guztiek beste hainbat gaixotasun konplexu eta
autoimmunetan ere aplika litezke eta gaixotasun arrunten Genetika ulertzeko klabe
berriak azalera litzakete.
Bestetik, eritasunaren historia naturala hobeto ezagutzeak itu terapeutiko berriak
identifikatzen lagunduko du eta, nahiz eta glutenik gabeko dieta (GFD) ordezkatuko
duen alternatiba iraunkorrik nekez sortuko den, tratamenduaren transgresio
puntualek eragindako sintomak arintzeko estrategia berriak aurki litezke.
Lan honetan, CDn konstitutiboki gainadierazita dagoen NFκB erantzunean jarri dugu
arreta. Bestalde, aztergai dugun eritasunean orain arte deskribatu ez diren aldaera
genetiko eta epigenetikoak aurkitzeko lehendabiziko saiakera bat egin dugu eta
azkenik, bidezidorraren erregulazio eta modulazioa argitzeko bidean lehenengo
pausuak eman ditugu.
Sarrera
Sarrera
9
1. Eritasun zeliakoa
Glutenarekiko sentikorra den enteropatia (MIM 212750) edo eritasun zeliakoa (CD)
gaixotasun kroniko eta inflamatorioa da eta bere ezaugarririk nabarmenena heste
meharreko biloxken zapaltzea da, dietan hartutako gariaren glutenarekiko zein zekale
eta garagarrean agertzen diren antzeko proteinekiko intolerantzia dela medio.
1.1. Ezaugarri klinikoak eta diagnosia
Dietan hartutako glutenaren efektu kaltegarriak 1950era arte antzeman ez ziren arren
(Dicke, 1950), eritasun zeliakoaren agerpen klinikoen lehenengo irudi orokorrak 60
urte lehenago ikusi zuen argia (Gee, 1888). Tratatzen ez bada, CDk honako sintomak
aurkeztu ohi ditu: batetik, heste meharrari dagozkion ezaugarriak, hala nola,
beherakoa, distentsio abdominala edota goragalea, eta bestetik, malabsortzioak
eragindakoak, garapenari dagozkionak (pisu baxua, gantzarik eza, ilearen fintasuna)
edo urritasun psikomotorrari dagozkionak (giharren ahultzea…), besteak beste
(Feighery, 1999).
CDri bestelako sintoma atipiko batzuk ere egotzi izan zaizkio. Hauen artean gertaera
neurologikoak, akatsak hortzetako esmaltean, infertilitatea, osteoporosia, artikulazio
mailako sintomak eta gibeleko entzimen kontzentrazio altuak dira nabarmenenak
(Mäki et al., 1997). Ikuspuntu histologikotik, pertsona suszeptibleak glutendun dieta
hartzen duenean, indibiduoaren heste meharrean endekatze graduala gertatzen da.
Prozesu honen emaitza biloxken atrofia eta kripten hiperplasia ezaugarri dituen heste
lesioa izaten da (1. irudia). Glutenak induzitutako hesteko mukosaren kaltearen maila
eta larritasuna Marsh sailkapenean dago definituta (Marsh, 1992). Laburbilduz,
hasieran linfozito intraepitelialen infiltrazioa dago biloxken epitelioan (Marsh I).
Ondoren, kripten hiperplasia ematen da (Marsh II) eta biloxken tamaina mantentzen
da. Estadiorik aurreratuenean (Marsh III), kripten hipertrofiaz gainera, lamina propria
Sarrera
10
hanpatuta dago eta biloxken atrofia partziala, subtotala edo totala gertatzen da (1.
irudia). Hesteko gertaerez gain, CDn glutenaren menpeko diren hainbat
autoantigorputz ere agertzen dira, anti-‐endomisio (EMA) edo anti-‐transglutaminasa
(TGA) antigorputzak kasu (Stenman et al., 2008).
1. irudia: Glutenak induzitutako aldaketak estadio ezberdinetan, Marsh sailkapenaren arabera. www.theglutensyndrome.net orrialdetik hartuta.
Ezaugarri patologiko hauek kontuan hartuta, Gastroenterologia, Hepatologia eta
Elikadura Pediatrikoaren Elkarte Europarrak (ESPGHAN) irizpide diagnostikoak finkatu
ditu. Orain dela gutxi arte, kriterio hauek heste meharreko biopsien kalte histologiko
eta emaitza serologiko positiboetan oinarritu izan dira (azken hauek ezinbesteko izan
ez badira ere) (Mäki et al., 1995), baina badira bi urte irizpide diagnostiko berriak
onartu direla. Azken hauen arabera, duodenoaren biopsia egiteari utz dakioeke baldin
eta umea sintomatikoa bada eta IgA motako TGA maila normaltasunaren goiko muga
baino 10 aldiz altuagoa badu. Giza Antigeno Leukozitarioaren (HLA) genotipaketa oso
baliagarria izan daiteke, CD oso ezohikoa delako arrisku alelorik gabe (Husby et al.,
2012).
1.2. Epidemiologia
Aurreko mende bukaerara arte, CD ezohiko gaixotasuntzat hartzen zuen komunitate
zientifikoak, europarren artean prebalentzia 1/1000 zela pentsatzen baitzen (Feighery,
1999). Dena den, berrikiago argitaratutako zenbait populazio ikerketen arabera,
maiztasuna %1ekoa da mendebaldeko europarren artean, desberdintasunak
GOI JEJUNOKO MUKOSAREN IMMUNOPATOLOGIA
Sarrera
11
desberdintasun (Dubé et al, 2005). Zenbait ikerlanek iradoki duenez, CDren
haurtzaroko agerpenaren maiztasuna haziz joan da 1980 eta 1990eko hamarkadetan
zehar, eta hau umeen elikadura praktikekin erabat lotuta dago (Ivarsson et al., 2000).
Bestetik, diagnostikoek helduengan ere gora egin dute, behintzat informazioa
eskuragarri dagoen lurraldeetan (Collin et al., 1997; Bodé et al., 1996; Murray et al.,
2003). Genetikoak ez diren arrisku faktoreen artean urtaroen araberako patroiak
dituzten inguru faktoreak eta zenbait infekzio biriko aipatu izan dira (Plot et al., 2009).
CD europar jatorriko pertsonek modu ia esklusiboan pairatzen duten gaixotasuna dela
pentsatu izan da, baina test serologiko berrien zabaltzeak CDren maiztasunaren
estimazio zehatzagoak baimendu ditu, zoriz aukeratutako Ipar Amerika eta Australiako
populazioetan eritasunaren maiztasuna 1:100 eta 1:200 artekoa dela agerian utziz
(Cataldo et al., 2007; de Kauwe et al., 2009). Bestetik, CD Latinoamerikan (Galvão et
al., 1992; Rabassa et al., 1981; Sagaró et al., 1981), Afrikako iparraldean (al-‐Tawaty et
al., 1998; Suliman, 1978) eta Ekialde Hurbilean (Khuffash et al., 1987; al-‐Hassany,
1975) ere arraroa eta ezohikoa dela pentsatu izan da, leku hauetan kasu mugatu eta
puntualak soilik behatu izan baitira. Gainera, Ekialde Urrunean (Txina, Japonia,
Korea…) existitzen ez zela uste izan da (Fasano et al., 2001). Dena den, bahetze edo
screening berriek munduko leku hauetan guztietan CDren maiztasuna azpiestimatu
izan dela frogatu dute, agerpen frekuentzia mendebaldeko herrialdeetan
erregistratutakoaren antzekoa dela erakutsiz. Mendebaldeko dieta modernoaren
zabalkundearekin batera, glutendun zerealak eta bereziki garia, munduko leku
guztietara hedatu dira eta CD Osasun Publikoko arazo bihurtu da, baita garapen bidean
dauden herrialdeetan ere (de Kauwe et al., 2009). Generoaren ikuspuntutik,
emakumeak maizago daude afektatuta gizonak baino (proportzioa 3:1 ratiora iristen da
garai emankorrean dauden gaixoen artean) (Feighery et al., 1998).
Egun, tratamendu eraginkor bakarra biziarteko glutenik gabeko dieta (GFD) hertsia da,
gari, zekale eta garagarraren produktuak dietatik ezabatuz (Feighery, 1999; Di Sabatino
et al., 2009). Nolanahi ere, GFD erabat betetzea ez da erraza eta bizi kalitatea gutxitzen
du. Tratamendua modu zorrotzean jarraitzen ez bada konplikazioak ager daitezke, hala
nola, garaiera baxua, desnutrizioa, osteoporosia, gaixotasun autoimmune
sekundarioak, minbiziak eta zailtasunak haurdunaldian (Lerner et al., 2010).
Sarrera
12
2. Eritasun zeliakoaren genetika
Eritasun zeliakoaren herentzia patroia oraindik ezezaguna bada ere, genetikak
gaixotasun honekiko suszeptibilitatean parte hartzen duela aspalditik jakina da. Familia
afektatuetan gauzaturiko prebalentzia ikerketak eta bereziki, bikiak konparatu izan
dituztenak, berebizikoak izan dira inguru faktoreen eta faktore genetikoen ekarpenak
zenbatekoak diren estimatzeko. Azterlan hauen arabera, genetika funtsezkoa da CDren
hasieran zein garapenaren fase guztietan.
Orokorrean, komunitate zientifikoak CDren agerpenean bat datozen biki
monozigotikoen proportzioa %75-‐86 dela onartzen du. Biki dizigotikoen kasuan, aldiz,
kopuru hau nabarmenki jaisten da, %16-‐20ra arte, hain zuzen. Biki mota bien
konkordantzia desberdintasunek CDren osagarri genetikoa estimatzen lagundu dute
eta orain arte bestelako gaixotasun autoimmuneentzat behatutakoa baino
pisuzkoagoa dela argi utzi dute. Adibidez, 1 motako diabetesan (T1D) osagarri
genetikoa baxuagoa da (konkordantzia biki monozigotiko eta dizigotikoetan %30 eta
%6, hurrenez hurren) (Sollid et al., 1993). Gainera, anai-‐arreben eta biki dizigotikoen
arteko konkordantzia ratioak oso antzekoak dira CDn eta beraz, inguru faktoreek
aportazio minimoa dutela ondoriozta daiteke. Laburbilduz, azken urteetan jasotako
ebidentziek CDk osagarri genetiko oso inportantea duela eta gaixotasunaren
heredagarritasuna (faktore genetikoei egotzi ahal zaion CD pairatzeko arriskuaren
proportzioa, inguru faktoreei egotzi ahal zaionarekin alderatuta, beti ere) %87
ingurukoa dela aditzera eman dute (Greco et al., 2002).
Arrisku genetikoaren parterik handiena Giza Antigeno Leukozitarioaren (HLA) zenbait
aleloren presentziari egotzi ahal zaio. Dena den, eta gaixotasunaren patogenesian HLA
molekula hauen papera oinarrizkoa bada ere, herentziari egiten dioten ekarpena ez da
oso handia, eta beraz, HLA lokusetik kanpo efektu txikiko lokus ezezagun ugari dela
uste da.
Sarrera
13
2.1. HLA eremua eta eritasun zeliakoa
2.1.1. HLA eremua
HLA da giza Histokonpatibilitate Konplexu Nagusiari (MHC) ematen zaion izena; 6p21
eremu kromosomikoko superlokusean dago eta sistema immunearekin zerikusia duten
gene ugari dauka. HLA geneek giza zelula gehienetan adierazten diren proteina
antigeno aurkezleak kodetzen dituzte. Hauek ezinbestekoak dira molekula exogeno eta
endogenoen artean bereizteko.
HLA geneek gaixotasun autoimmune eta inflamatorio askotan parte hartzen dute, eta
malaria edo HIESa bezalako eritasun infekziosoak pairatzeko arriskua emenda
dezakete. Hala ere, gene talde zabal honek eragindako suszeptibilitatea azaltzen
dituzten faktore genetiko zehatz eta mekanismo patogeniko gehienak ezezagunak
izaten segitzen dute egun, eremuko konplexutasun genetiko handia dela eta. Izan ere,
HLAk genoma osoko gene dentsitaterik altuena eta adierazpen maila goratua
aurkezten ditu (Horton et al., 2004).
2.1.2. Suszeptibilitate geneak eta arrisku genetikoa
Lehen esan bezala, HLA suszeptibilitate eremurik inportanteena da CDn eta
gaixotasunaren osagarri genetikoaren %40 inguru azaltzen du. HLA eta CDren arteko
lehenengo asoziazio ebidentziek 1972an ikusi zuten argia. Eremuko lotura desoreka
indartsua dela eta, lehenengo azterketek HLA-‐A1, HLA-‐B8 eta HLA-‐DR3 identifikatu
zituzten aldaera etiologiko modura, baina beranduago publikatutako ikerlanek modu
zuzenean inplikaturiko faktoreak HLA-‐DQ2 eta -‐DQ8 kodetzen dituzten II klaseko HLA
geneak direla erakutsi dute (2. irudia). Eremuko asoziaziorik indartsuena HLA-‐DQ2rekin
aurkitutakoa da eta gaixoen %90ak HLA-‐DQ2.5 heterodimeroaren kopia bat dauka
gutxienez (heterodimeroaren α eta β kateak kodetzen dituzten DQA1*05 eta DQB1*02
aleloek osatuta). Bestalde, zeliakoa ez den populazioaren %20-‐30ak HLA-‐DQ2 aldaera
hau eramaten du eta beraz, garrantzitsua izan arren, gaixotasuna garatzeko nahikoa ez
dela argi geratzen da. HLA-‐DQ2 eramaileak ez diren gaixo gehienek HLA-‐DQ8 aurkezten
dute eta ondorioz, gutxienez, DQA1*03:01 eta DQB1*03:02 aleloak kodetzen dituen
haplotipoaren kopia bat daukate (Mäki et al., 1997). Pazienteen proportzio txiki bat
Sarrera
14
DQ2 eta DQ8 negatiboa da, baina kasu gutxi hauetan ere, gaixoak DQ2 molekula
kodetzen duten aleloetako baten eramaileak direla ikusi izan da (DQA1*05 edo
DQB1*02) (Karell et al., 2003; Spurkland et al., 1992).
2. irudia. HLA lokusaren eta CDren arteko asoziazioa. HLA-‐DQ2 molekula CD garatzeko arrisku faktorerik garrantzitsuena da. Gaixo zeliako gehienek HLA-‐DQ2.5 heterodimeroa adierazten dute, HLA-‐DQA1*05 (α katea) eta HLA-‐DQB1*02 (β katea) aleloek kodetuta. Alelo hauek cis eran ager daitezke, DR3-‐DQ2 haplotipoan, edo transen, DR5-‐DQ7 eta DR7-‐DQ2.2 heterozigotoetan. HLA-‐DQ2.2 dimeroak, HLA-‐DQA1*02:01 eta HLA-‐DQB1*02:02 aleloek kodeturiko HLA-‐DQ2ren aldaerak, hain zuzen, gaixotasuna garatzeko arrisku txikia ematen du. DQ2 negatiboak diren paziente gehienek DR4-‐DQ8 haplotipoak kodetzen duen HLA-‐DQ8 adierazten dute. Abadie et al., Annu Rev Immunol (2011) publikaziotik adaptatuta.
HLA-‐DQ2 eta HLA-‐DQ8 aldaerak lotura desorekan daude DR3 eta DR4rekin, hurrenez
hurren, eta hori dela eta, askotan, arrisku alelo hauek haplotipoen izenak hartzen
dituzte, DR3-‐DQ2 eta DR4-‐DQ8, hain zuzen ere (Sollid et al., 1989). Haplotipo
batzuetan, DR3-‐DQ2an kasu, HLA-‐DQ2.5 heterodimeroaren alelo biak (DQA1*05:01
eta DQB1*02:01) kromosoma berean daude eta beraz, cis eran kodetuta. Aldiz, DR5-‐
DQ7 eta DR7-‐DQ2 haplotipoen eramaileak diren heterozigotoen kasuan, arrisku
heterodimeroan parte hartze duten molekulak trans eran daude kodetuta, kromosoma
ezberdinetan kokatuta daudelako. HLA-‐DQ2.5 mota bi hauen arteko desberdintasunak
DQα kateko aminoazido batean (DQA1*05:01 vs. DQA1*05:05) eta DQβ katearen
mintzaren eremuko beste residuo batean (DQB1*02:01 vs. DQB1*02:02) datzate,
DR3-DQ2
DR7-DQ2
DR4-DQ8
0201 0501 03
DR5-DQ7
DR7-DQ2
0301 0501 11/12
0202 0201 07
0202 0201 07
0302 0301 04
DQB1 DQA1 DRB1 02 05
02 05
02 02
03 03
DQ2.5 cis-en oso handia
DQ2.5 trans-en oso handia
DQ2.2 txikia
DQ8 handia
Haplotipoak Heterodímeroak Arriskua
Sarrera
15
baina ez du ematen ondorio funtzionalik dutenik, eta arrisku efektu berdinarekin
asoziatuta daude. Dena den, HLA-‐DQ2.2k (HLA-‐DQ2ren beste aldaera bat) ematen
duen arriskua oso txikia da (Sollid, 2002; Sollid et al., 1993).
CDrekiko suszeptibilitate mailaren eta DQ2.5 heterodimero kopuruaren arteko
harremana ere ikusi da. Bi DR3-‐DQ2 haplotiporen eramaile homozigotoak batetik, eta
DR3-‐DQ2/DR7-‐DQ2 heterozigotoak bestetik, DQ2.5 mailarik altuenak adierazten
dituzten indibiduoak dira eta beraz, CD pairatzeko arriskurik handiena ematen duten
genotipoen eramaileak (van Belzen et al., 2004; Ploski et al., 1993; Lundin et al., 1993).
Zentzu honetan, aipagarria da CD errefraktarioa duten pazienteek (GFDren aurrean
erantzuten ez dutenak, hain zuzen) DR3-‐DQ2 haplotipoaren homozigositate maiztasun
altuagoa aurkezten dutela (%44-‐62) beste gaixo zeliakoekin alderatuta (%20-‐24). DQ8
molekulekin ere, dosiaren menpeko antzeko efektua ikusi izan da.
DQ molekulak kodetzen dituzten geneez aparte, HLA eremuak baditu sistema
immunean parte hartu eta CD pairatzeko arriskua emenda dezaketen beste gene asko
ere. Azterketa ezberdinek MICA, MICB, TNF eta bestelako geneetako polimorfismoek
gaixotasuna izateko arriskuan eragina dutela proposatu dute. Hala ere, orokorrean, lan
hauek ez dute eremuko lotura desoreka indartsua behar beste kontuan hartu, eta
beraz, emaitzak ez dira erabakigarriak. Eremuaren mapaketa zehatzak eta
sekuentziazio sakonak HLA-‐DQ lokusetik gaindi, bestelako suszeptibilitate faktoreak
dauden argitzen lagunduko dute. Nahiz eta HLA geneek berebiziko ekarpena egin
suszeptibilitate genetikoari, gaixotasunaren presentzian bat datozen anai-‐arrebak gutxi
dira, %30 inguru, eta ondorioz, HLA geneak garrantzitsuak izan arren gaixotasuna
garatzeko nahikoak ez direla esan daiteke (Sollid, 2002).
2.1.3. HLAren rola CDren patogenesian
CDren eta II klaseko HLA geneen arteko asoziazioa guztiz lotuta dago CD4+ T zelulek
gaixotasunaren patogenesian duten funtsezko paperarekin. Izan ere, CDn, CD4+ T
linfozitoak gai dira zeliakoen hestean agertzen diren glutenetik eratorritako peptidoak
ezagutzeko, ez ordea indibiduo osasuntsuen kasuan. Zelula antigeno aurkezleen (APC)
gainazaleko HLA-‐DQ2/HLA-‐DQ8 molekulek glutenetik eratorritako epitopoak aurkezten
dituzte, glutenarekiko espezifikoak diren CD4+ T zelulen proliferazioa estimulatuz.
Sarrera
16
HLA eta CDren arteko asoziazioa ulertzeko bidean mugarririk aipagarrienetako bat,
HLA-‐DQ2 edo/eta -‐DQ8 eta gliadina peptidoen arteko lotura afinitateari dagokio; izan
ere, 2 motako transglutaminasa (TG2) entzimaren eraginez eraldatutako peptidoetan
handiagoa baita. Entzimak glutenetik eratorritako peptidoen karga negatiboen
areagotzea dakarren erreakzio bat katalizatzen du, epitopo eraldatuen eta HLA
molekulen (DQ2 eta DQ8) arteko lotura faboratuz eta CD4+ T zelula kopurua
emendaraziz.
Glutenarekiko espezifikoak diren T zelula autorreaktiboen aktibazioan HLA molekulek
duten garrantzia ikusirik, azken hauen sekuentzia kodetzaileetako edozein aldaketak
prozesuaren puntu ezberdinetan alterazioak ekar litzakeela ondoriozta genezake.
Horrela, antigenoaren lotura guneak kodetzen dituen sekuentziaren polimorfismoek
afinitatea aldaraz lezakete, glutenetik eratorritako peptidoen ezagutza faboratuz edo
oztopatuz. Bestetik, lokus erregulatzaileetan kokaturiko zenbait aldaerek HLA
molekulen adierazpena eralda lezake, glutenarekiko erantzun immunea txikiagotuz
edo areagotuz.
2.2. Suszeptibilitate genetikoa ekartzen duten geneen bilaketa CDn
HLAk CDren osagai genetikoaren %40 baino azaldu ezin duenez, saiakera ugari egin
dira azken urteetan, gaixotasunaren genetika konplexua ulertu asmoz, HLAtik kanpoko
suszeptibilitate lokus berriak aurkitzeko. Helburu hau lortzeko bidean, orain arte
erabilitako estrategia nagusiak bi izan dira: batetik, gaixo familietan gauzaturiko lotura
azterketak, eta bestetik, populazioen bahetze orokorrean oinarrituriko asoziazio
ikerketak. Azken urteetan, CD Genoma Osoko Asoziazio Azterketak (GWAS) erabiliz
ikertutako gaixotasunen zerrendan sartu da. Azterketa hauetan, Nukleotido Bakarreko
Polimorfismo (SNP) ugari genotipatu eta analizatzen dira. Lan hauek asoziaturiko
zenbait lokus berri aurkitzen lagundu dute; azterketa funtzionalak funtsezkoak izango
dira proposaturiko hautagaiek gaixotasunean duten inplikazioa argitzeko.
2.2.1. Lotura eremuak eta hautagai posizionalak
Familietako lotura azterketek gaixoen belaunaldi ezberdinetan zehar modu errepikakor
eta kontsistentean heredatzen diren eremu kromosomikoak identifikatzea baimentzen
Sarrera
17
dute. Horrela, gaixotasunaren hasieran zein garapenean inportanteak diren eremuak
aukeratu eta muga daitezke. Eremu genomiko horietan kokaturiko geneei hautagai
posizional deritze. Izan ere, beren kokapena da, hain zuzen, hautagai izaera ematen
diena. CDren kasuan, lotura seinalerik errepikakor eta indartsuena agertzen duen HLA
eremuaz gainera (CELIAC1 ere izendatua), hautagai posizionalak dituzten hiru eremu
gehiago deskribatu izan dira orain arteko lotura analisi ezberdinetan (3. irudia).
3. irudia. CDn, gaixoen familia ezberdinetan modu errepikakorrean aurkitutako hiru lotura eremu nagusiak.
2.2.1.1. CELIAC2
CELIAC2 5q31-‐33 eremu kromosomikoan dago kokatuta. Grecok eta lankideek
identifikatu zuten lehenbiziko aldiz 1998an (Greco et al., 1998). Lokus honen
erreplikazioa ez da unibertsala izan eta momentuz, ez da gaixotasunean inplikatuta
dagoen generik aurkitu. Hala ere, eremuan zenbait zitokina kodetzen dituen gene
multzo bat dago eta erantzun immunearen erregulazioan eta inflamazioan
garrantzitsuak izan daitezkeela pentsatu izan da (Greco et al., 2001). Zenbait azterketa
lotura eremu honetako hautagai zehatz batzuetan zentratu izan da, IL12B edota SPINK
familian, kasu, baina ez da asoziazio kontsistenterik topatu (Seegers et al., 2003).
CELIAC2 eremuan kokaturiko IL4, IL5, IL9, IL13, IL17B eta NR3C1 geneetan, funtzionalak
izan zitezkeen 13 aldaera kohorte irlandar batean genotipatu ziren, baina ez zen
CDrekiko asoziaziorik identifikatu, ez banaka analizatuta ezta haplotipoetan aztertuta
ere (Ryan et al., 2005).
Beste aldetik, gure taldearen ikerlan batean gaixo eta kontrolak alderatzean
adierazpen diferentziala aurkeztu eta lotura eremuetan kokatzen ziren geneetako
CELIAC3:(2q33(
CELIAC4:(19p13.1(
CELIAC2:(5q31133(
Sarrera
18
aldaeren asoziazioak bilatu ostean, CELIAC2n dagoen YIPF5 genea gaixotasunarekin
erlazionatuta zegoela ondorioztatu genuen (Castellanos-‐Rubio et al., 2008).
Beranduago eginiko azterketa batean, kohorte finlandiar eta hungariarrak erabili eta
CELIAC2ren lotura erreplikatu bazen ere, YIPF5en asoziazio ahul bat baino ez zen
identifikatu (Koskinen et al., 2009). Nahiz eta arrisku lokus inportantea ematen duen
eta ikerketa ezberdinetan CDrekin lotuta agertu den, orain arte ezin izan da
asoziazioaren kausa zehatza ebatzi.
2.2.1.2. CELIAC3
Eremu hau Holopainek eta kideek identifikatu zuten lehen aldiz (Holopainen et al.,
2004). 2q33 eremu kromosomikoan dago kokatua, eta beste batzuen artean, erantzun
linfozitarioa erregulatzen duten CD28, CTL4 eta ICOS geneak ditu bere baitan. Lokus
honen eta gaixotasunaren arteko lotura beste lan batzuetan ere agertu izan da, eta
markatzaile ezberdinak erabilita gainera.
Lehenago esan bezala, CELIAC3 lokusean CD28, CTLA4 eta ICOS geneak daude
kokatuta, T zelulen erantzunaren hainbat ezaugarri kontrolatzen dituen 300 kb
inguruko bloke batean, hain zuzen ere. CD28 eta ICOS proteinek, beren ligandoekin
lotzen direnean, proliferazioa eta zitokinen produkzioa induzitu ditzakete. CTLA4k,
aldiz, T zelulen aktibitatea gutxitzen duen seinale negatiboa eratzen du. Azken gene
honen eta CDren arteko asoziazioa kohorte eta populazio ezberdinetan deskribatu izan
da, baina emaitzak ez dira beti positiboak izan. Lan batek gaixotasuna pairatzeko
arriskua haplotipo espezifikoek ematen dutela iradoki zuen, eta ez SNP puntualek.
Dena den, aurkitutako asoziazioa CTLA4rekin edota eremuko beste generen batekin
den ez da argitu eta konfirmatu beharko litzateke (Brophy et al., 2006). Aurretik
aipaturiko gure taldearen lanean (Castellanos-‐Rubio et al., 2008) eremu honetako
asoziazio seinale nagusia SERPINE2 geneak aurkeztu zuen. Gene hau oso garrantzitsua
da CDn alteratuta dagoen matrize extrazelularraren eraketa prozesuaren lehen
urratsetan. Hala ere, asoziazio hau ez da bestelako ikerlanetan errepikatu, eta beraz,
CELIAC3 eremuan identifikaturiko lotura desorekaren kausa ezin izan da argitu (Dema
et al., 2009b).
Sarrera
19
2.2.1.3. CELIAC4
CELIAC4 19p13.1 eremu kromosomikoan dago kokatuta eta Belzen eta kideek
identifikatu zuten lehenengo aldiz, 2003an (van Belzen et al., 2003). Eremu zabal
honek 140 gene baino gehiago biltzen ditu bere baitan eta haietako askok sistema
immune innatoan eta inflamazioan hartzen dute parte. Lotura azterketa independente
batean berretsi bazen ere, ondoren gauzaturiko ikerketa guztiek ez dituzte emaitza
positiboak izan (Capilla et al., 2007).
CELIAC4 eremurako hautagairik onena IXB miosinaren genea (MYO9B) dela esan izan
da, enterozitoen zitoskeletoaren birmoldaketan parte hartzen duen molekula bat
kodetzen duelako. MYO9Bren funtzio espezifikoa, dena den, ez da ezaguna, baina tight
junction motako lotura interzelular hertsietan inplikaturiko proteinek dituzten
domeinuen erako bat agertzen du. Hau dela eta, sekuentziako polimorfismoek hesteko
hesiaren iragazgaiztasuna apurtu eta ondorioz, peptido immunogenikoek lamina
propriara pasatzeko erraztasun handiagoa izan zezaketela iradoki da (Monsuur et al.,
2005). Gainera, asoziazio ikerketa guztiak ez dira bat etorri, MYO9B geneak
gaixotasunaren patogenesian duen eragina zalantzan jarriz.
Bestetik, CELIAC4 eremuan kodetutako 140 geneen artean, badira bestelako
hautagaiak, hala nola CYP4F3, HSH2D, IL12RB1, IFI30 eta KIR familia. CELIAC4ko 10
gene analizatu zituen lan batean, asoziazio ebidentziak aurkitu ziren CYP4F3 eta
CYP4F2 geneentzat. Biek prozesu inflamatorioaren funtsezko bitartekaria den
leukotrienoaren inhibizioan hartzen dute parte (Curley et al., 2006). ICAM1 ere lotura
gune honetan kokatuta dago eta atxikidura interzelularrean paper garrantzitsua
jokatzen du. Gene honek asoziazioa aurkeztu zuen populazio frantsesean (Abel et al.,
2006). Dena den, asoziazio ahul hauek kohorte independentetan testatu beharko
lirateke, gene hauek CD pairatzeko arriskuan duten eragina argituko bada.
2.2.2. Hautagai funtzionalak
Hautagai funtzionalaren metodoa aurretiaz aukeratutako geneetan dauden aldaeren
eta fenotipo edo gaixotasun jakinen arteko asoziazioaren analisian datza. Aldakortasun
arrunta analizatzeko genoma osoko asoziazio ikerketetan (GWAS) ez bezala, azterketa
Sarrera
20
hauetan gene hautagaiak aukeratzen dira analisiak gauzatzeko, geneek gaixotasunean
duten inpaktu biologikoari buruz aurretiaz dakiguna aukeraketarako irizpide hartuta.
Hurbilketa hau askotan erabili izan da gaixotasun konplexuak ikertzeko, baita CDren
kasuan ere.
2.2.2.1. Erantzun immune innatoaren geneak
Orokorrean, CD T zelulen aktibitateak eragindako gaixotasuna dela onartu izan da.
Gliadinatik eratorritako peptidoek, jatorrizko forman zein transglutaminasak
deamidatuta, lamina propria infiltratzen duten T linfozitoak aktibatzen dituzte, sistema
adaptatiboaren parte diren Th1 eta Th17 erantzun inflamatorioak kitzikatuz
(Castellanos-‐Rubio et al., 2009). Azken urteetan, dena den, sistema immune
innatoaren inplikazioaren aldeko ebidentziek pisua hartu dute. Horrela, gliadinatik
eratorritako peptidoek T zelulen aktibazioarekiko independentea den erantzuna eragin
eta ondorioz, T zelulen kitzikapena eta ehunaren kaltetzea ekar ditzakeen giro
proinflamatorioa sor dezaketela ikusi da (Maiuri et al., 2003).
Sistema immune innatoko gene eta gene familia ugari proposatu izan dira gaixotasun
autoimmuneetan, eta bereziki CDn parte hartzen duten suszeptibilitate hautagai
modura. Adibidez, IL1A, IL1B, IL1RN, IL18, RANTES eta MCP1 bezalako bitartekari
proinflamatorioak kodetzen dituzten geneen eremu erregulatzaileetan kokaturiko
polimorfismo funtzionalak aztertu izan dira. Hauetako batek berak ere ez zuen
asoziaziorik aurkeztu. RANTES genearen sekuentzian seinale ahul bat identifikatu zen
(Rueda et al., 2005).
Killer Immunoglobulin-‐like receptor (KIR) gene familia ere aztertu izan da erantzun
immune innatoan duen inplikazioa dela eta. Hartzaile hauek lotura desoreka aurkezten
duen 19q13.4 eremuan daude kokatuta eta normalean, NK (Natural Killer) zelulen
gainazalean agertu ohi dira, zenbait T zelula klasetan agertu ahal badira ere. Aktibitate
zitolitikoaren modulatzaile modura jarduten dute, I klaseko HLA molekulak bitartekari
gisa erabiliz, eta beraz, erantzun innatoaren parte garrantzitsutzat jo daitezke. Gene
hauen edukia, genotipoak eta haplotipoak euskal populazioan aztertu izan dira.
KIR2DL5B(+) / KIR2DL5A(-‐) geneen konbinazioa maizago agertzen zen paziente
zeliakoetan zeliakoak ez ziren indibiduoetan baino, seinale inhibitzaile eraginkor baten
Sarrera
21
falta adieraziz, seguruenik. Asoziazio hau kohorte espainiar batean errepikatu zen
(Santin et al., 2007b). Gure taldearen beste lan batean, KIR3DL1 hartzaile inhibitzailea
zeliakoetan gainadierazia zegoela ikusi genuen; honek hartzailea adierazten zuten T
zelula erregulatzaileen errepresioa azalduko luke, baina ez dirudi alterazioaren jatorria
genetikoa denik (Fernandez-‐Jimenez et al., 2011).
Toll-‐like receptor (TLR) familia aztergai izan dute beste zenbait lanek eta gene horietan
asoziatutako aldaerak bilatu izan dira. TLRek patogenoak ezagutu eta sistema
immunea estimulatzen dute, baina familia honetako zenbait hartzaileren adierazpena
gaixotasunean aldatuta dagoela ikusi bada ere, ez da asoziazio tinkorik frogatu (Dezsofi
et al., 2008; Santin et al., 2007a). MICA eta MICB geneek, aldiz, estres molekulak
kodetzen dituzte eta beren sekuentzietako aldaerak ere ikertu izan dira. Dena den, eta
gene hauek CELIAC1 eremuan kokatuta daudenez, oso zaila da lotura desoreka aintzat
hartuz ondorio definitiboak atera eta asoziazioaren kausak antzematea (Martín-‐Pagola
et al., 2004).
Nahiz eta sistema immune innatoaren aktibazioa nahikoa ezaguna den CDn,
momentuz, proposatutako hautagai funtzionalen artean ez da asoziazio tinko eta
benetan fidagarria aurkezten duen generik aurkitu. Horrela, gaixotasuna garatzeko,
erantzun innatoko efektu ahuleko gene askoren konbinazioa behar den hipotesiak
indarra hartu du.
2.2.2.2. Erantzun immune adaptatiboaren geneak
Th1 erantzuna CDko erantzun inflamatorioen artean garrantzitsuenetako bat da, eta
zitokinarik esanguratsuena INFγ da (INFG geneak kodetua). Zitokina honen produkzioa
modu esangarrian areagotuta dago gaixotasun aktiboan. Atrofia osoa aurkezten duten
pazienteetan, adierazpen maila ohikoa baino 240 aldiz altuagoa izan daiteke. INFG
genea holandar eta finlandiar populazioetan aztertu zen baina ez zen aleloen
banaketan kasu eta kontrolen arteko desberdintasunik aurkitu. Beraz, ez dago INFG
suszeptibilitate genetzat hartzeko inolako ebidentziarik (Wapenaar et al., 2004).
Bestetik, Th17 erantzunean parte hartzen duten zelulak CDren patogenesian
inplikatuta daudela ikusi da. IL23ren hartzailearen (IL23R) bidezko seinalizazioa T zelula
Sarrera
22
heldugabeetatik abiatu eta Th17 zelulak izatera iristeko funtsezkoa da. IL23R psoriasia
eta ultzeradun kolitisa bezalako beste gaixotasun autoimmune eta inflamatorio
batzuekin asoziatuta dago. Aldaera kodetzaile bat dauka, baina holandar populazioan
ikertu zenean, ez zen CDrekin asoziaziorik zegoenik ikusi (Weersma et al., 2008). Dena
den, aldaera hau espainiar populazioan asoziatuta egon zitekeela ikusi zen beste
azterketa batean, nahiz eta maiztasun txikiko aleloak frekuentzia altuagoa zuen
zeliakoetan, beste gaixotasunetan behatutakoaren aurka (Núñez et al., 2008).
Beranduago gauzaturiko lan batean, lotura desoreka ebidentziak topatu ziren IL23R
dagoen eremuan, baina berriro ere, ez zen asoziazioa azal zezakeen polimorfismo
espezifikorik identifikatu (Einarsdottir et al., 2009). 2012ko lan batean, Th17
erantzunarekin erlazionaturiko 16 genetan kokaturiko 100 SNP analizatu ziren eta ez
zen IL23R genean CDrekiko inolako asoziazio seinalerik aurkitu (Medrano et al., 2012).
Azkenik, CIITA II klaseko HLA geneen erregulatzaile inportanteenetako bat dela uste da.
Bere adierazpena konplexua da eta bere promotorean kokaturiko bi aldaera beste
gaixotasun autoimmune batzuekin asoziatuta daudela ikusi da. Polimorfismo hauek
espainiar populazioan aztertu ziren, CDrekin harremana zuten argitzeko, baina ez zen
aurkitu kasu eta kontrolen arteko ezberdintasun esangarririk (Dema et al., 2009a). Hala
ere, CDn gauzaturiko bigarren GWASak, gene hau hartzen duen eremuaren eta
gaixotasunaren artean asoziazioa dagoela antzeman zuen (Trynka et al., 2012).
Orokorrean, gaur arte, ez da CDren eta erantzun adaptatiboan parte hartzen duten
geneen arteko asoziazio garbirik topatu.
2.2.2.3. Heste epitelioaren birmoldaketan inplikaturiko geneak
Heste zeliakoaren permeabilitatea endekatuta dagoela jakina da, eta ondorioz,
gliadinatik eratorritako peptidoek epitelioa zeharkatu eta errazago hel daitezke lamina
propriara, kontrolik gabeko erantzun immunea eraginez. Hesteko hesiaren alterazioak
zelulen arteko loturen aldaketa estrukturalei egotzi izan zaizkie. MYO9B genea
(CELIAC4 lotura eremuan kodetuta) asoziaturiko polimorfismoak aurkitzeko analizatu
izan da, hesteko epitelioaren birmoldaketan parte hartzen duelako (Monsuur et al.,
2005).
Sarrera
23
2008an egindako ikerlan batean, komunikazio interzelularrean inplikaturiko 41
genetako 197 SNP ikertu ziren, holandar eta ingeles populazioetan. Aztertutako
geneetako bi, PARD3 eta MAGI2 hain zuzen, CDrekin modu ahulean asoziatuta zeudela
ikusi zen. Gene hauek, gainera, ultzeradun kolitisarekin ere asoziatuta egon litezke,
gaixotasun bietan hesteko hesiaren akatsen etiologia komuna iradokiz (Wapenaar et
al., 2008).
2.2.2.4. Matrize extrazelularra
Metaloproteinasak matrize extrazelularrari dagozkion osagaiak degradatzeko gai diren
entzimak dira eta CDren estadio aktiboetan gainadierazten direla ikusi izan da,
zeliakoen hesteko mukosaren eraldatze morfologikoa hauspotuz. Gene hauek
asoziaturiko aldaera berriak identifikatzeko helburuarekin ikertu izan dira. Dena den,
bilaketa hau ez da arrakastatsua izan, eta MMP1 bezalako hautagaiek, adibidez, ez
dute eritasunarekin asoziaziorik azaldu (Ciccocioppo et al., 2005).
2.2.2.5. Seinalizazio bidezidorrak
Zenbait seinalizazio bidezidor alteratuta dago CDn, hala nola Jak-‐Stat, NFκB, MAPK edo
TGFB bidezidorrak (Castellanos-‐Rubio et al., 2008). Seinalizazio zelular hauetan parte
hartzen duten gene batzuk ikertu dira, CDrekin asoziatuta dauden aldaerak dituzten
argitzeko. Aipatzekoa da STAT1 (CELIAC3n kokatua), bere adierazpena gaixotasunean
areagotuta baitago. Hala ere, ez zen asoziaturiko SNPik aurkitu (Diosdado et al., 2006).
NFKB1 ere ikertu da, baina CD pazienteetan konstitutiboki aktibatuta badago ere, ez
zen gainadierazpena azal zezakeen aldaera genetikorik antzeman. Horrela, transkripzio
faktore (TF) honi egotziriko efektu patogenikoak akats erregulatzaileen edota ur-‐gora
kokaturiko geneen alterazioen eraginez gertatzen direla iradoki izan da. Bestetik,
bidezidor biologiko honen desregulazioa lehenengo GWASaren jarraipen azterketa
batean identifikaturiko bi generi (REL eta TNFAIP3) ere egotzi izan zaie (Trynka et al.,
2009). Espainiar populazioan, NFκB bidezidorraren aktibazioan inplikaturiko UBD
geneko SNP erregulatzaile bat CDrekin asoziatuta dagoela ikusi da. Gainera, gene hau
gainadierazita dago gaixotasun aktiboan eta asoziaturiko polimorfismoaren distribuzio
alelikoa adierazpen mailarekin korrelazionatuta dago (Castellanos-‐Rubio et al., 2010).
Sarrera
24
Tesi honetan, bidezidor biologiko horretan zentratuko gara, parte hartze erregulatzaile
eta zentrala duten geneetan batetik, zenbait itu genetan, bestetik. Hau guztia
sakonago azalduko da bigarren kapituluan.
2.3. Genoma osoko asoziazio azterketak CDn
GWA azterketek DNA bilduma zabaletan markatzaile genetiko ugari arakatzea
baimentzen dute, gaixotasun zehatzen eta aldaera genetiko ezezagunen (SNPak,
gehienetan) arteko asoziazioa aurkitzeko asmoz. Azterketa hauek bereziki erabilgarriak
dira minbizia, diabetesa edo CD bezalako gaixotasun konplexuen genetikan parte
hartzen duten suszeptibilitate aldaerak identifikatzerako orduan. GWAS bat
gauzatzeko, bi partaide mota behar da: gaixotasuna pairatzen duten indibiduoak
batetik eta gaixotasuna izan ez baina aurrekoen antzeko ezaugarriak dituztenak
(jatorria, adina, sexua…), bestetik.
Asoziatutako aldaerek, gaixotasunaren kausa izan zitezkeen polimorfismoen kokalekua
markatzen dute. Asoziaturiko SNPak ez dira beti aldaera kausalak izaten, eta sakonago
ikertu beharreko eremuak seinalatu baino ez dutela egiten uste da. Hau dela eta,
azterketarekin jarraitu behar da askotan, aldaera kausala aurkitzeko helburuarekin
asoziaturiko eremu genomikoa modu sakonean sekuentziatuz edota analisi
funtzionalak burutuz eta alelo zehatzak adierazpen maila ezberdinekin
korrelazionatzen saiatuz. GWA azterketek aldaera genetiko mota berri bat antzematen
ahalbidetzen dute. Familietan oinarrituriko asoziazio ikerketek efektu fenotipiko
handiko aldaera arraroak identifikatzeko balio duten bitartean, genoma osoko
hurbilketa hauek populazio mailako lagin bildumak erabiltzen dituzte eta beraz, efektu
txikiko aldaera arruntak aurkitzeko erabil daitezke.
2.3.1. Lehenengo GWASaren emaitzak
CDn gauzaturiko lehen GWASean, 778 gaixo eta 1.422 indibiduo kontrol ikertu ziren.
Asoziazio azterketak populazio mailan alelo txikiaren maiztasuna %1 baino handiagoa
zuten 310.605 SNPetan burutu ziren (van Heel et al., 2007). Asoziaziorik indartsuena
HLA lokusean identifikatu zen, espero bezala eta rs2187668*A aleloa HLA-‐DQ2.5 cis
eran kodetzen duen DR3-‐DQ2 haplotipoaren markatzaile efizientea dela ondorioztatu
Sarrera
25
zen. Lehenago aipatu bezala, hau da CDrekin asoziaturiko HLA-‐DQ2 haplotiporik
arruntena. Lehenengo GWAS honetan, Erresuma Batuko populazioan, pazienteen
%89,2k gutxienez HLA-‐DQ2.5 haplotipoaren kopia bat aurkezten zuen, kontrolen
artean indibiduoen %25,5ean soilik agertzen zen bitartean.
HLA eremutik kanpo, p < 10-‐4 aurkezten zuten 56 SNP aurkitu ziren. Haietako batzuk
elkarrengandik gertu zeuden, asoziazioa benetakoa zela eta polimorfismo horiek CDren
osagai genetiko konplexuan parte hartzen zuten aldaera kausalekin lotura desorekan
egon zitezkeela iradokiz.
Dena den, gaixotasunarekin asoziaturiko SNP bakarra (p < 10-‐6) rs13119723 izan zen,
lotura desoreka aurkezten duen eta IL2 eta IL21 hartzen dituen 4q27 eremuan
kokatuta, hain zuzen ere. Emaitza hauek holandar eta irlandar kohorte
independenteetan erreplikatu ziren. Eremu honek gaixotasuna pairatzeko arrisku
genetikoaren %1 soilik azalduko zuela estimatu zen, oraindik ezezagunak ziren
suszeptibilitate gene gehiagoren existentzia iradokiz. Asoziazio indartsuenak agertu
zituzten 1.164 SNPak hiru kohorte europar independenteko 1.643 kasu eta 3.406
kontrol gehiagotan aztertu ziren (Hunt et al., 2008). Azterketa honen ostean
identifikaturiko eremuak sakonago ikertu ziren, CDren garapenenean funtzionalki
inplikaturiko hautagaiak aurkitzeko helburuz, eta bereziki sistema immunean parte
hartzen duten geneak kontuan hartuz (4. irudia).
Sarrera
26
4. irudia. Aurrerapenak CDren genetikan. Immunochip ikerlanaren ostean, gaixotasuna garatzeko arriskuan parte hartzen duten 40 lokus identifikatu dira. Asoziazio hauen kausa diren aldaera espezifikoak ezezagunak izaten jarraitzen dute. Horrela, azterketa funtzionalak beharko dira asoziazio lan erraldoi hauen aplikazioak zeintzuk izan daitezkeen argitzeko.
2.3.2. Bigarren GWASaren emaitzak
CDn egindako bigarren GWASa 2009. urtean gauzatu zen. HLA kanpoko 292.387 SNP
analizatu ziren, jatorri europarreko 4.533 paziente zeliako eta 10.750 kontrol
osasuntsutan. Gainera HLA eremuan ez zeuden beste 231.362 polimorfismo gehiago
aztertu ziren 3.796 gaixoz eta 8.154 kontrolez osaturiko kohorte independente batean
(Dubois et al., 2010).
Aurretik ezezagunak ziren asoziaturiko hamahiru arrisku eremu identifikatu ziren (4.
irudia). Eremu hauetan, sistema immunearekin erlazionatutako funtzioak dituzten
hainbat gene dago: BACH2, CCR4, CD80, CIITA-‐SOCS1-‐CLEC16A, ETS1, ICOSLG, RUNX3,
THEMIS, TNFRSF14 eta ZMIZ1. Beste 13 lokusek ez zuten genoma osoko esangarritasun
maila lortu, baina gaixotasunarekin nolabaiteko erlazioa zutela ikusi zen. Gainera,
funtzio immunea zuten zenbait gene hartzen zuten eremu hauek, hala nola, CD247,
FASLG-‐TNFSF18-‐TNFSF4, IRF4, TLR7-‐TLR8, TNFRSF9 eta YDJC.
1. GWAS
GWAS-en aurretik
2. GWAS
Immunochip
HLA-DQ, CTLA4, MYO9B, KIR…
RGS1, IL18R1, IL18RAP, CCR1, CCR3, IL12A, SCHIP1, LPP, TNFAIP3, TAGAP, SH2B3, ATXN2, PTPN2
IL2/IL21
Jarraipen azterketa
TNFRSF14, MMEL1, RUNX3, PLEK, CCR4, CD80-KTELC1, BACH2-MAP3K7, PTPRK-THEMIS, ZMZ1, ETS1, CIITA, SOCS1-CLEC16A, ICOSLG, PARK7-TNFRS8, NFIA, CD247, FASLG-TNFSF18, FMRF4B, IRF4, ELMO1, ZFP36L1, UBE2L3-YDJC, TLR7-TLR8
UBASH3A, CLK3-CSK, TREH-DDX6, POU2AF1, PFKB3-PRKCQ, PVT1, ARHGAP31, LTF, CD8-CTLA4-ICOS, STAT4, PUS10, C1orf106, RGS1
Sarrera
27
2.3.3. Immunochip proiektua
Asoziaturiko aldaera berriak identifikatzeko xedez gauzaturiko azken proiektu erraldoia
Immunochip izena jaso zuen. Lan honetan, sistema immunearekin erlazionaturiko
bestelako gaixotasun batzuk pairatzen zituzten paziente askoren laginez gaindi, CD
zuten 12.000 lagun baino gehiago eta 12.000 kontrol inguru analizatu ziren, 200.000
aldaera baino gehiago kontuan harturik (Trynka et al., 2011).
Azterketa zabal honetan, HLAtik kanpoko 183 eremu aztertu ziren, sistema
immunearekin erlazionatuta zeudenak. Hauetatik, 36 CDrekin asoziatuta zeudela ikusi
zen (aurretiaz GWASetan aurkitutako eremuak gehi beste 13 lokus berri) (4. irudia).
Asoziaturiko polimorfismo guztiak arruntak ziren eta %5 baino maiztasun handiagoa
aurkezten zuten alelo txikian. Frekuentzia baxuko aldaeren asoziazioa lau eremutan
baino ez zen topatu. Lan honetan, eremu interesgarrien mapaketa zehatza egin zen,
aldaera etiologikoak aurkitzeko asmoz.
Asoziaturiko SNPen anotazio funtzionalaren ostean, ondorio nagusietako bat eremu
kodetzaileetan kokatzen diren aldaerak oso urriak direla izan zen, nahiz eta haietako
asko zenbait generen transkripzio hasiera guneetatik gertu zein 3'UTR eremuetan
zeuden. Asoziazio seinaleen eta eremu erregulatzaileen arteko gertutasuna kontuan
hartuta proposaturiko hautagai batzuk honakoak izan ziren: THEMIS/PTPRK, TAGAP,
ETS1, RUNX3 eta RGS1. Hauetako batzuk GWAS ostean aurkitutako multzoan zeuden.
2.3.4. Asoziazio azterketen jarraipenak
2011. urtean, gure laborategian, CDrekin modurik esangarrienean asoziaturiko GWAS
eremuak aztertu ziren espainiar kohorte batean (Plaza-‐Izurieta et al., 2011). Ikerketa
honetan, gaixotasunaren estatusaren eta asoziaturiko aldaeraren genotipoaren
arabera, heste mukosan adierazpen aldakorra zeukaten lau gene identifikatu ziren
(IL12A, LPP, SCHIP1 and SH2B3). Emaitza hauek, gene multzo hau paziente zeliakoetan
modu konstitutiboan alteratuta dagoela iradokitzen dute, sintomen agerpena baino
lehenagotik, eta CDren patogenesian rol primarioa izan dezakeela pentsarazten dute.
Gure taldearen beste lan batean, asoziazio lokus berean kokaturiko bi gene aztertu
ziren (RUNX3 eta THEMIS) eta gaixotasun aktiboan zein glutenik gabeko dietan
Sarrera
28
egondako pazienteen biopsien in vitro gliadina estimuluaren ostean koadierazten zirela
ikusi zen. Horrela, eremuko SNP asoziatuek geneen adierazpena erregula zezaketela
ondorioztatu zen, baina modu konstitutiboan baldintzatu beharrean, probokazio
immunogenikoari erantzuteko erregulazio mekanismoak azal zitzaketela hipotetizatu
genuen. Aurkikuntza hauen arabera, DNA sekuentzian kodeturiko mekanismo
erregulatzaileek gene ezberdinen adierazpena kontrolatuko lukete, mekanismo hauek
estimulu immunotoxikoaren ostean bakarrik piztuko liratekeela proposatuz (Bondar et
al., 2013).
Bestetik, gaixotasun konplexu gehienetan oraindik azaldu ezin den herentziaren
jatorria argitzeko asmoz, hipotesi berri bat proposatu da azken denboran. Hipotesi
honi “aldaera arraroen genoma osoko asoziazio sintetiko” deritzo eta tag SNP arrunten
bidez identifikaturiko asoziazio eremuetan detektatu ezin diren polimorfismo kausal
arraroak kokatuta dauden ideian oinarritzen da. Dena dela, jatorri europarreko
Erresuma Batuko 41.911 biztanle (sei gaixotasun autoimmune ezberdin pairatzen
zituzten 24.892 paziente eta 17.019 kontrol) aztertu zituen azterketa batean, 25 GWAS
generen exoiak sekuentziatu eta genotipatu ziren eta lokus kodetzaileetako aldaera
arraroen inpaktua oso txikia zela ondorioztatu zen, bai CDn, baita ikerturiko
gainontzeko gaixotasun arrunt autoimmuneetan ere (Hunt et al., 2013).
Ondorioz, lan hauek eta argitaraturiko beste zenbaitek azterketa funtzionalen
garrantzia eta suszeptibilitate hautagaien aukeraketa arbitrarioa saihestearen beharra
azpimarratzen dituzte. Gainera, oraindik egiteke dagoen lan zabalaren berri ematen
dute, genomaren erregulazio elementuak eta GWASetan antzemandako eremuetako
aldaera edo gertakari kausalak identifikatuko baditugu. Lan hauen haritik, etorkizun
hurbilean komunitate zientifikoak aurkituko dituen zenbait erronka azaleratzen dira:
batetik, SNPez gaindi, genomaren bestelako aldaerak ere kontuan hartu beharko dira
herentzia azaltzen duten faktore ezezagunen bilaketan, hala nola, aldaera
estrukturalak eta ezaugarri epigenetikoak; eta bestetik, genoma ez kodetzaile
erraldoiari ere heldu beharko zaio, erantzunen bila.
Doktorego tesi honetan, aurretiaz CDn ikertu ez diren bi aldaera genetiko mota
aukeratu ditugu: kopia kopuru aldaerak (CNV) eta DNAren metilazioa. Helburu
Sarrera
29
honekin, NFκB erantzunean parte hartzen duten zenbait gene modu sakonean aztertu
ditugu. Gainera, bidezidor honen adierazpen patroiak modu globalean ikertzen saiatu
gara, eta gliadina bidezko estimulazioak zein MALT1 proteina erregulatzaile zentrala
inhibitu dezakeen konposatu kimiko baten bidezko modulazioak estadio ezberdinetako
gaixoetan eta kontroletan duten eragina aztertu dugu.
Sarrera
30
3. Eritasun zeliakoaren patogenesia
Gaixotasun zeliakoaren garapenean parte hartzen duten mekanismoen ulermenean
azken urteetan egindako aurrerapenek, CD HLArekin erlazionaturiko gaixotasunen
artean hobekien ezagutzen duguna izatea ekarri dute. Hala ere, prozesu patogeniko
batzuk oraindik azaltzeke daude.
T zelulek CDn parte hartzen dutela aspalditik ezaguna da: glutenaren peptidoak
epitelioa zeharkatzen dute eta lamina propriara iristean, ehuneko transglutaminasak
deamidatu egiten ditu, DQ2 eta DQ8 hartzailedun APCek CD4+ T zelula patogenikoei
aurkezteko. Honek gerora lamina propriaren infiltrazioa, kripten hiperplasia eta
biloxken atrofia eragingo dituen Th1 erantzuna ekarriko du (Schuppan et al., 2009).
Dena den, azken hamarkadetako hainbat azterlanek erakutsi duenez, erantzun
immune innatoak ere berebiziko garrantzia du CDn eta gliadina T zelulak bitartekari ez
dituen erantzuna aktibatzeko gai ere bada (Maiuri et al., 2003; Hüe et al., 2004) (5.
irudia).
Sarrera
31
5. irudia. Eritasun zeliakoaren mekanismo patogenikoak: adar immune adaptatibo era innatoak. Castellanos-‐Rubio et al., 2010etik moldatua.
3.1. Glutena
Glutena alkoholetan disolba daitezkeen glutenina monomerikoen eta prolaminan
aberatsak diren gliadina polimerikoen nahasketa bat da eta gari, zekale eta
garagarrean aurkitzen da. CD suszeptibilitate genetikoa duten indibiduoetan gertatzen
da, dietako glutenaren proteinekin kontaktua dagoenean. Hesteko proteasek ezin
dituzte proteina hauek guztiz endekatu eta 10-‐15 aminoazidoko peptidoak geratu ohi
dira hesteko lumenean. Proteina zati hauek substratu onak dira
transglutaminasarentzat, eta honek deamidatu ditzake, HLA-‐DQ2 eta HLA-‐DQ8
molekulekiko afinitatea handituz eta ondorioz, CD4+ T zelulek gidatzen duten Th1
erantzuna kitzikatuz. Bestalde, glutenak CD8+ T zelulen erantzuna ekar dezake,
linfozito intraepitelialen populazioa emendatuz, HLArekiko independentea den
mekanismo baten bidez (Schuppan et al., 2009; Jabri et al., 2009).
ADAPTIVE
Deamidated 33-mer peptide
Th1/Th17
Th2
ERANTZUN ADAPTATIBOA
ERANTZUN INNATOA
GLIADINA Birusak 31-43 peptidoa
peptido 33-mero
Makrofagoa/DC
B zelula
AGA eta TGA antigorputzak
peptido 33-mero deamidatua
CD4+ T zelula
Epitelioa
LIE
lamina propria
MMP-1 MMP-3
MHC Ia MHC Ib
TCR
IFN-γ"
Sarrera
32
Hesteko kulturetan, zelula antigeno aurkezle primarioetan nahiz lerro zelular epitelial
eta monozitiko ezberdinetan gauzaturiko zenbait in vitro azterketek ideia hau indartu
du. Horrela, glutenaren 31-‐43 aminoazidoak hartzen dituen peptido batek sistema
immune innatoa estimula dezakeen ikertu da. HLA-‐DQ2k ez du peptido hau lotzerik eta
ez du ematen T zelulentzat espezifikoa den erantzunik eragiten duenik. Biopsien bi
orduko estimuluaren ostean, peptido honek apoptosia induzi dezake edota hazkunde
faktore epidermikoaren hartzailearen (EGFR) bidezko bidezidor endozitikoa inhibitu,
glutenaren peptidoaren aurkezpena eta jarraian ematen den CD4+ T zelulen aktibazioa
baino lehen (Jabri et al., 2009; Maiuri et al., 1996a). Ideia honen alde, gliadinarekin
inkubaturiko CD biopsiek MICA genearen gainadierazpena erakutsi dute. Estres
molekula honek, Tγδ eta NK zeluletan adierazten den NKG2D hartzailearekin
interakzionatu eta erantzun innatoko zitokinak aktiba ditzake gaixotasunaren lehen
estadioetan, sistema immune innatoa adaptatiboarekin lotuz (Martín-‐Pagola et al.,
2004).
3.2. Transglutaminasa
Eritasun zeliakoan, glutenak ehuneko transglutaminasaren aurkako IgA klaseko
antigorputzen ekoizpena induzitzen du. TG2 nonahi adierazten den proteina
multifuntzionala da eta orokorrean, espazio estrazelularrean da aktibo. Proteina baten
glutaminaren eta bigarren proteina baten lisinaren arteko lotura itzulezin eta
kobalentea katalizatzen du (Folk et al., 1985; Folk et al., 1966). Glutena prolina eta
glutaminetan aberatsa da eta gainera, oso aminoazido negatibo gutxi ditu (HLA-‐DQ2
eta DQ8 molekulekin interakzionatzeko beharrezko ezaugarria). Glutenetik
eratorritako peptidoek TG2ren bidez deamidatuak izan behar dute, molekulen
eraldaketaren ostean, zitokinen ekoizpen lokal masiboa eragin eta enterozitoen
desberdintzapena eta proliferazioa aldaraziko badituzte (Heap et al., 2009). Bestetik,
TG2k katalizatutako erreakzioan parte hartzen duten peptidoek eta entzimak berak,
TG2-‐gliadina konplexuak eratzen dituzte, autoantigorputzen ekoizpena bultzatuz
(Caputo et al., 2009). T zelulek ezagutu ditzaketen hiru epitopoekin partzialki
gainezartzen den sei aminoazidoko sekuentziadun peptido 33-‐mero bakarra da
immunogenikoena gliadinatik eratorritakoen artean, ehuneko transglutaminasak
deamidatu ostean.
Sarrera
33
Anti-‐transglutaminasa antigorputzek patogenesian eta hesteko mukosaren ohiko
lesioan parte hartzen duten argitzeke dago. Eritasun zeliakoan agertzen diren
autoantigorputzek apoptosian, angiogenesian eta heste iragazkortasunean inpaktu
biologikoa dutela ikusi izan da eta beraz, TG2 patologian paper garrantzitsua izan
zezakeela iradoki da (Caputo et al., 2009; Lindfors et al., 2009).
3.3. Sistema immune adaptatiboa
Sistema immune adaptatiboak T zelulen bidezko immunitatea eta immunitate
humorala induzitzen ditu, eta biak ala biak CD pazienteen heste meharreko mukosan
aktibatzen dira, gliadinaren estimuluz. Hesteko CD4+ T linfozitoek deamidatutako
gliadina peptidoak ezagutzen dituzte, APCetako HLA-‐DQ2 eta HLA-‐DQ8 heterodimeroei
lotuak (Mazzarella et al., 2003; Lundin et al., 1990). Gliadinarekiko espezifiko diren
mukosa zeliakoko T zelulak Th1 fenotipokoak dira batez ere eta inflamazioa sustatzen
duten zitokinak ekoizten dituzte, IFNγ kasu (Nilsen et al., 1995; Troncone et al., 1998).
IFNγ-‐z gain, interleukina 18 eta IFNα ere gainadierazita daude (Monteleone et al.,
2001; León et al., 2006; Steinman et al., 2007). IL6 eta TGFβren presentzian
ezberdintzatu eta interleukina 17 zitokina familiaren ekoizpena bultza dezakeen
bestelako CD4+ T zelula laguntzaileen lerro bat (Th17 linfozitoak) identifikatu da, eta
uste denez, lerro hau lehen IL12/ INFγ sareari egozten zitzaizkion zenbait funtzioren
erantzulea da (Castellanos-‐Rubio et al., 2009). Th1 eta Th17 erantzunek gaixotasun
aktiboan parte hartzen dute, beste zenbait gaixotasun autoimmune batzuetan ikusi
den bezala hain zuzen (Harris et al., 2010; Monteleone et al., 2010; Sjöström et al.,
1998).
3.4. Sistema immune innatoa
Erantzun immune innatoa patogenoen aurkako lehen defentsa harresia da eta agente
infekziosoekin harremana izan osteko lehenengo estadioetan aktibatzen da. CDn,
immunitate innatoak gliadinaren estimuluari aurre egiten dio Tαβ linfozitoekiko
independentea den era batean eta gerora emango den T zelulen aktibaziorako inguru
proinflamatorio egokia sortzen laguntzen du. Zenbait in vivo azterketek erakutsi
duenez, gliadinaren 31-‐43 aminoazido sekuentziak gaixotasunaren sintomak agertaraz
ditzake, eta CDn nabariak diren hainbat aldaketa behatu izan da biopsia kulturetan
Sarrera
34
(Sturgess et al., 1994; Maiuri et al., 1996b; Picarelli et al., 1999). Peptido honek ez du T
zelulen bidezko erantzunaren estimulazioa eragiten (Arentz-‐Hansen et al., 2000;
Anderson et al., 2000) eta beraz, pentsatzekoa da 31-‐43 proteina zatiaren toxizitatea
immunitate innatoa aktibatzeko gaitasunari dagokiola.
Zenbait azterketek Toll-‐like receptor 4 (TLR4) hartzailearen seinale transduktore
nagusia, hau da, MyD88 inplikatu dute TLR4 berarekin batera, monozitoetan,
makrofagoetan eta zelula dendritikoetan zerealen proteinekiko ematen den
erantzunaren hartzaile eta eragile primario modura (Schuppan et al., 2009). Glutenak
eragindako linfozito intraepitelialen (IEL) aktibazio innatoak MICA genearen
adierazpena induzitzen du hesteko epitelioan, NK eta Tγδ zeluletan eta CD4+ nahiz
CD8+ diren zenbait T zelula azpitaldetan adierazten den NKG2D hartzailearen
ligandoarena, hain zuzen ere. MICA epitelialak, gainadierazitako IL15ekin batera,
NKG2Dren aktibazioa sustatzen du IELetan, linfozitoak bitartekari modura dituen
zitotoxizitate antigeno-‐espezifikoa bultzatuz. Azkenik, IL15ekin batera diharduen IL21
immunitate innatoaren gidaritzan aipagarria dela argitaratu da (Hüe et al., 2004; Fina
et al., 2008).
Helburuak
Helburuak
37
Lan honen xede orokorra eritasun zeliakoan aurretik aztertu gabeko zenbait aldaera
genetiko mota eta adierazpen patroi globalak ikertzea zen, horretarako gaixotasun
honetan konstitutiboki gainadierazita dagoen NFκB bidezidorreko gene zerrenda luze
bat aztertuz.
Ikerlan honen helburu nagusiak honakoak ziren:
1. NFκBrekin erlazionaturiko hiru lokusen (β-‐defensina multzoa eta Toll-‐like
receptor 2 eta 4) kopia kopuru aldaerak eritasun zeliakoa pairatzeko
suszeptibilitatearekin asoziatuta dauden analizatzea (1. kapitulua).
a. Kopia kopuru aldaeren estimazioan, errendimendu handiko PCR
kuantitatiboa (qPCR) paralogoen ratio test (PRT) teknika estandarra
bezain sendoa den argitzea.
b. Teknikarik egokiena aukeratu eta DEFB4, DEFB103, DEFB104, TLR2 eta
TLR4 geneen kopia edukia eritasun zeliakoarekin asoziatuta dagoen
egiaztatzea.
2. Eritasun zeliakoan agerikoa den NFκB bidezidorraren aktibazio konstitutiboa
ulertzea, NFκBrekin erlazionaturiko 93 generen adierazpen analisiaren bitartez
(2. kapitulua).
a. Glutenik gabeko dietaren ostean itzulezinak diren adierazpen aldaketak
(konstitutiboak) eta normaliza daitezkeenak (inflamazioari lotuak)
identifikatzea eta gene horiek bidezidorrean dituzten rolak eta beren
arteko elkarrekintzak argitzea.
b. Gliadina bidezko biopsien in vitro kitzikapenak geneen adierazpen
patroian duen efektua ikertzea eta MALT1 parakaspasaren inhibizio
bidezko NFκB bidezidorraren modulazioaren inpaktua ulertzea.
Helburuak
38
3. NFκBrekin erlazionaturiko zenbait generen promotoreetako eta lehenengo
exoietako metilazio patroiak zeliakoen hesteko mukosan aldatuta dauden
ikustea (2. kapitulua).
a. Bisulfitoma osoaren anplifikazio osteko DNA kantitate txikien metilazio
analisi kuantitatiboa (qMAMBA) teknika fidagarria den eta metilazio
azterketetan pirosekuentziazio konbentzionalaren ordez erabili
daitekeen egiaztatzea.
b. Metodorik zehatzena erabiltzea eta zenbait NFκB generen metilazio
mailak eritasun zelikoaren estadio ezberdinetan aldatzen diren argitzea.
1. kapitulua:
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
41
1. Aurrekariak
Kopia kopuru aldaerak (CNV) aniztasun genomikoaren iturri arrunta dira gizakian.
Aldaera estruktural mota hau duplikazio, delezio, insertzio eta inbertsio gertakari
ugariren eta beren arteko konbinazioen emaitza da eta gutxienez, giza genomaren %12
afektatzen duela kalkulatu da (Redon et al., 2006). Genomaren hibridazio konparatiboa
(CGH) eta bestelako teknika sendoak zenbait garapen arazo eta minbizitan
inplikaturiko geneen kopia edukia aldarazten duten alterazio arraroak antzemateko gai
dira, baina arruntagoak diren aldaera estrukturalak gaixotasun konplexuekiko
suszeptibilitatearekin asoziatuta egon daitezkeela uste denez, CNVen populazio
mailako miaketek garrantzia hartu dute eta aztergai bilakatu dira azken hamarkadan.
Jakina da CNVak ezin direla albo tag SNPen bidez inputatu, mutazio errepikariengatik
zein duplikaturiko segmentu genomikoen transposizioa dela eta (Schrider et al., 2010).
Gainera, kasu eta kontrolen arteko konparazioetan oinarrituriko asoziazio proiektuak
zehaztasunik gabeko emaitza gordinekiko bereziki sentikorrak dira eta horrelako
gertakariek asoziazio faltsuak ekar ditzakete gaixotasun ezberdinen eta CNVen artean
(Clayton et al., 2005). Horrela, metodo zuzen eta fidagarriak beharrezkoak dira eskala
handiko CNV azterketetan.
PCRan oinarrituriko metodoek itu/erreferentzia produktuen ratioak kontuan harturik
ezartzen dituzte kopia kopuruak. Paralogoen ratio testean (PRT) hasle pare bakarra
erabiltzen da eta askotan kokapen genomiko urrunak dituzten elementu ezberdinen
sekuentzia antzekotasunak baliatzen ditu. Elementu hauek kopia kopuru aldakorra
duen lokusean (itu lokusa) eta kopia kopuru egonkorra duen beste batean
(erreferentzia lokusa) egoten dira eta ondorioz, anplifikazioak hasle pare bera erabiliz
ematen dira. Estrategia honek anplifikazio efizientzia ezberdinak izan ditzaketen bi
anplikoi desberdinen produktuak konparatzeak ekar ditzakeen arazoak saihesten ditu
(Aldhous et al., 2010). Beraz, PRT errendimendu handiko teknika sendoa dugu CNV
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
42
arrunten populazio mailako analisirako, baina erabilgarria den paralogo baten
identifikazioak denbora eskatzen du (batzuetan ez da posiblea) eta esperimentua
gauzatu aurretik, hasle parea kontu handiz diseinatu behar da. Aldiz, PCR
kuantitatiboak (qPCR) itu genearen eta inolako erlaziorik ez duen eta aldakorra ez den
erreferentzia sekuentzia baten arteko atari zikloak (Ct) konparatzen ditu, CNVen
kalkulurako ΔCt balioak lortzeko. Teorikoki, estrategia hau oso zuzena da, eta askotan
izan da erabilia eskala handiko CNV analisiak egiteko, β-‐defensinen multzoaren eta
Crohn gaixotasunaren (Fellermann et al., 2006; Bentley et al., 2010) zein psoriasiaren
(Hollox et al., 2008) arteko asoziazio azterketetan kasu. Hala ere, ΔCt metodoa
erreakzio bakarrean konpetitzen ari diren entseguen anplifikazio efizientzia
ezberdinekiko oso sentikorra da; %4ko efizientzia ezberdintasunak %400eko errorea
ekar dezake ΔCt balioen kalkuluan (Guescini et al., 2008) eta qPCR bidez lortutako CNV
emaitzak zalantzan jarri dira (Armour et al., 2007).
Kapitulu honen lehen zatian, qPCR teknika CNVen analisirako alternatiba sinple, azkar
eta fidagarria dela erakusten dugu, erreakzioetan DNA kantitate normalizatuak
erabiltzen badira. Bestetik, DNA kalitateak qPCR zein PRT bidezko CNV analisian duen
efektua ikertzen dugu eta bi metodoen errendimendua konparatzen dugu.
Horretarako, hiru gene aukeratu genituen: PRELID1, Th2 giza zelula primarioetan
apoptosi mitonkondrialean inplikaturiko genea (Tahvanainen et al., 2009); SYNPO,
zelula dendritikoen forma eta mugikortasuna erregulatzen dituena (Asanuma et al.,
2012) eta DEFB4, erantzun immune innatoan parte hartu, NFκB transkripzio
faktorearen ur-‐behera kokatu, kopia kopuru aldakorra duen β-‐defensinen multzoan
egon eta zenbait gaixotasun autoimmunerekin asoziatuta dagoen genea, hain zuzen
(Hollox, 2008). PRELID1 eta SYNPOrekiko interesa, kopia kopuru aldakorra duten
eremuetan kokatuta daudelako (Redon et al., 2006), eritasun zeliakoarekin loturiko
lokus batean daudelako eta zeliakoen mukosan adierazpenaren alterazioak ikusi
direnez (Castellanos-‐Rubio et al., 2008) gaixotasunean inplikaturik egon daitezkeelako
piztu zen batik bat.
Bestalde, sistema immune innatoarekin loturiko beste hainbat gene gaixotasun
autoimmune desberdinentzako suszeptibilitate hautagaiak izan litezkeela proposatu
izan da. Besteak beste, KIR geneen edukia CD (Moodie et al., 2002; Santin et al., 2007b)
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
43
edota 1 motako diabetesa (van der Slik et al., 2003; Santin et al., 2006) pairatzeko
arriskuarekin asoziatuta egon daitekeela mahaigaineratu izan da. Toll-‐like receptor
(TLR) 2 eta 4an kokaturiko zenbait SNP kodetzaile eta ez kodetzaile ere ikertu izan dira,
baina ez da gaixotasunarekiko asoziaziorik aurkitu (Dezsofi et al., 2008; Santin et al.,
2007a).
Kapituluaren bigarren partean, CDn gauzaturiko lehen CNV asoziazio ikerketa
plazaratzen dugu. Horretarako hurrengo geneak aukeratu genituen: TLR2 eta TLR4,
zeliakoen mukosan adierazpen alterazioak aurkezten dituzten geneak (Szebeni et al.,
2007), eta DEFB4, DEFB103 eta DEFB104, kopia eduki aldakorreko 8p23.1 eremu
kromosomikoan kokatzen den β-‐defensinen lokuseko geneak. Gene hauek kodeturiko
proteinek funtzio immuneak dauzkate eta bestelako gaixotasun autoimmune eta
inflamatorioekin asoziatu izan dira (Fellermann et al., 2006).
TLRak 1 motako mintzarteko hartzaileak dira eta mikrobio ugaritan ageri diren
patogenoei asoziaturiko patroi molekularrak (PAMPak) ezagutzen dituzte (Saito et al.,
2007). Monozitoek, makrofagoek eta zelula dendritikoek TLR eta ligandoen arteko
loturari erantzuten diote, zitokina proinflamatorioen ekoizpena eta molekula
estimulatzaileen gainadierazpena bultzatuz. B zelulek, aldiz, proliferazioa eta
antigorputzen ekoizpena emendatuz erantzuten dute (Takeda et al., 2003). Zeliako
aktibo eta tratatuen heste mukosan, TLR2 eta TLR4ren adierazpenaren emendioa ikusi
izan da (Szebeni et al., 2007). Bestetik, CD pazienteen seroan aurki daitekeen anti-‐
transglutaminasa IgA antigorputzen azpipopulazio batek antigeno propioak ezagutu
eta hesteko permeabilitatea handitu dezake, TLR lotu ostean monozitoen aktibazioa
kitzikatuz (Zanoni et al., 2006). Dena den, ikerketa desberdinek ez dute TLR2 eta TLR4
geneetako SNPak CDrekin asoziatzea lortu (Dezsofi et al., 2008; Santin et al., 2007a). Y
kromosomako azeleragailu autoimmune (Yaa) arratoian, TLR geneen dosiaren eta
autoimmunitatearen arteko lotura antzeman da, TLR7ren kopia gehigarri batek B
zelulak hartzailearen ligandoekiko sentikorrago egin eta erantzun autoimmunea
areagotzen baitu (Deane et al., 2006).
β-‐defensinen familiak, bere aldetik, rol garrantzitsua betetzen du sistema immune
innatoan eta zenbait partaidek zelula dendritikoekin zein linfozitoekin interakzionatzen
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
44
dute, horretarako CCR6 moduko hartzaileak baliatuz. Gene multzo honek, pertsona
batetik bestera kopia kopuruan aldakorra den unitate errepikakor bat osatzen du
8p23.1 eremu kromosomikoan. Kopia kopururik ohikoena 4 da, eta normalean 2 eta 6
artean aldatzen da (Fellermann et al., 2006; Hollox, 2008). Eremu honetan, sei
defensina ezberdin kodetzen dituzten geneak (DEFB107, DEFB106, DEFB105, DEFB104,
DEFB103, eta DEFB4) eta espermari asoziaturiko 11. antigenoa (SPAG11) ageri dira.
Hautagairik sendoena DEFB4 dugu, hBD-‐2 kodetzen duena. Molekula honek
heldugabeko zelula dendritikoak erakartzen ditu inflamazio guneetara (Hollox, 2008).
Zelula linfoideetan, DEFB4ren adierazpena lokusaren kopia kopuruarekin asoziatu izan
da eta gene edukiak mRNA mailaren aldakortasunaren %50 azal dezakeela iradoki da
(Hollox et al., 2003). Gainera, ezin da ahaztu biak ala biak, TLRak zein β-‐defesinak,
hurrenez hurren NFκBren ur-‐gora eta ur-‐behera kokatuta daudela, bidezidorrean eta
immunitatean paper garrantzitsuak jokatuz eta ondorioz, CDren patogenesian
inplikaturik egoteko hautagai sendo direla.
β-‐defensina geneen multzoak 1. irudia. β-‐defensina geneen multzoak osatzen duen unitate errepikakorra, 8p23.1 eremu kromosomikoan. Literaturan deskribaturiko CNVak barra horien bidez daude adierazita eta ikerlan honetan azterturiko hautagaiak gorriz markatuta daude.
DEFB4
8p23.1
DEFB105 DEFB106 DEFB104 DEFB103SPAG11
β-defensin gene cluster
7600k 7700k 7800k 7900k 8000k
DEFB4
8p23.1
DEFB105 DEFB106 DEFB104 DEFB103SPAG11
β-defensin gene cluster
7600k 7700k 7800k 7900k 8000k
8p23.1
DEFB105 DEFB106 DEFB104 DEFB103SPAG11
β-defensin gene cluster
7600k 7700k 7800k 7900k 8000k
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
45
2. Materialak eta metodoak
2.1. Etikari dagokion adierazpena
Emaileen edota beren gurasoen baimen informatua lortu ostean, odol lagin bilduma
egin zen, gene immuneen CNVen eta CDren arteko asoziazio azterketa burutzeko.
Ikerketa lan honek Gurutzeta Unibertsitate Ospitaleko Etika Batzordearen onespena
lortu zuen, 2006111030 proiektuaren baitan. CD ESPGHAN elkartearen orduko
irizpideen arabera diagnostikatu zen, horretarako anti-‐gliadina, anti-‐endomisio eta
anti-‐transglutaminasa antigorputzen determinazioak eta heste meharreko biopsia
gauzatuz.
2.2. DNA laginak
DNA genomikoa odol osotik erauzi eta ddH2Otan bereseki zen, Nucleospin Blood DNA
extraction kita (Macherey-‐Nagel, Düren, Germany) fabrikatzaileek iradokitakoaren
arabera erabiliz. Lagin bilduma normalizatua prestatzeko, DNA Quant-‐it PicoGreen
dsDNA erreaktiboaren bidez kuantifikatu zen (Invitrogen, Carlsbad, CA) eta
kontzentrazioak 2,5 ng/µl-‐tara doitu ziren, Biomek NXP Laboratory Automation
Workstation sistema automatikoaz (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Lagin ez
normalizatuak 50 µl ddH2Otan bereseki ziren, DNA kontzentrazioak kontuan hartu
gabe. DNAren integritatea elektroforesi bidez testatu zen, %1 agarosa-‐TAE geletan.
2.3. Kopia edukiaren determinazioa qPCR bidez
PRELID1 eta SYNPO geneen kopia kopuruaren analisi kuantitatiboa 400 DNA lagin
normalizatu eta 400 lagin ez normalizatutan gauzatu zen, horretarako aurretiaz
diseinaturiko TaqMan Copy Number Assay entseguak (zenbakiak: Hs01090614_cn eta
Hs00669480_cn, PRELID1 eta SYNPO geneentzat, hurrenenez hurren) erabiliz. Kit
bakoitzak hasle pare bat eta FAM fluorokromoaz markaturiko MGB zunda bat
zekartzan, itu gene espezifikoak anplifikatzeko. Erreakzio bakoitzean RNase P
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
46
erreferentzia lokusa ere anplifikatu zen, VIC fluorokromoaz markaturiko TAMRA
zundadun RNase P Copy Number Reference Assay entsegu komertzialaren bidez
(guztiak Applied Biosystems, Foster City, CA). Esperimentuak Biomek NXP likido
banatzaile automatikoa erabiliz prestatu ziren 384 putzuko plaketan eta 2 µl DNA
(lagin bilduma normalizatutik zein ez normalizatutik), 5 µl TaqMan Genotyping Master
Mix (Applied Biosystems) eta itu eta erreferentzia CNV entseguak (bakoitzetik 0,5 µl)
gehitu ziren 10 µl-‐ko bolumen totalean. PRELID1 genearen entsegua gordetze
baldintza eskasengatik kalitate baxua zuten 96 DNA lagin gehigarritan korritu zen, DNA
kalitateak kopia kopuruaren esleipenean duen inpaktua kuantifikatzeko xedez.
Kopia edukian aldakorra den β-‐defensinen lokusaren kasuan, 376 kontrol eta 376
paziente zeliako hautatu ziren eta qPCR bidez analizatu ziren. Ikerketaren atal honetan,
DEFB4, DEFB103 eta DEFB104 geneen edukia aztertu zen enkarguzko TaqMan hasle
pare eta zundak erabiliz (1. taula). Lagin hauek guztiak normalizatuta zeuden, artean
qPCR eta PRT tekniken arteko konparaketa egiteko erabilitako 366 DNA laginak.
Konparaketan erabilitako DNAk ausaz aukeratu ziren eta DEFB4 baino ez zen kontuan
hartu. qPCR esperimentuak triplikatuan egin ziren 10 µl-‐ko erreakzio bolumenetan,
goian deskribatu bezala. Erreakzio guztiak ABI 7900HT instrumentu batean burutu
ziren (Applied Biosystems) eta termozikladorearen baldintzak eta pausuak honakoak
izan ziren: 95° 10 minutuz lehenbizi eta 95°C 15 s eta 60°C min batez, 40 aldiz.
1. taula. β-‐defensinen kopia kopuruaren analisirako hasle eta zundak.
Genea Aurreranzko haslea Zunda (5'-‐6-‐FAM) Alderantzizko haslea
DEFB4 AGTTTTGAGTTCTTACACGC CCTGCCTTAAGAGTGGAG GGGCAAAAGACTGGATGACATAT
DEFB103 CTTCCTAAAACCTTTCCGT AGATCGGCAAGTGC TTCTTCGGCAGCATTTTTCG
DEFB104 ACAGTGCCATATCCTGTTAT CGCAGCCAAGAATA GGTGTTGGGACATCTTCCAATT
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
47
2.4. Kopia edukiaren determinazioa paralogoen ratio testaren (PRT) bidez
Ezin izan genuen SYNPO genearentzako PRT entsegurik diseinatu, kopia kopuru
egonkorreko paralogorik topatu ez genuelako. Dena den, PRELID1en paralogo bat
identifikatu genuen 1. kromosoman (2. irudia), Basic Local Alignment Search Tool
tresna bioinformatikoa erabiliz (BLAST, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Itu
lokusa eta haren paralogoa anplifikatzeko hasle pareak diseinatu genituen Primer
Express v.2.0 softwarearen bidez (Applied Biosystems) eta UCSCren web orrian
(http://genome.ucsc.edu/cgi-‐bin/hgPcr) in silico PCRak egin genituen, bi sekuentzia
paralogo baino gehiago anplifikatuko lituzketen hasle pare inespezifikoak baztertzeko.
DNAren endekapen mailak PRT teknikan duen inpaktua neurtzeko helburuz, PCR
esperimentuak 25 µl-‐ko erreakzioetan gauzatu ziren, 96 kalitatezko DNA lagin eta
beste horrenbeste lagin degradatu erabiliz. 5 ng DNA, 1 µM aurreranzko
(CCAAGGACCTCGCCAGCAA) eta 1 µM alderantzizko (6-‐FAM-‐
GGCAAGTCACCGCACCTCTGT) hasle, dNTP bakoitzeko 0,5 µM, 1,25 U Taq DNA
polimerasa, 2,5 µl BioTaq buffer (NH4 oinarriduna) eta 1,5 µM MgCl2 (dena BIOLINE,
London, UK) gehitu zen erreakzio bakoitzean. Anplifikazio baldintzak honakoak izan
ziren: 95°C 30 s, 59°C 30 s eta 72°C minutu batez, dena 26 aldiz, detekta daitekeen
produktua lortzeko plateaura heldu gabe. Amaieran, 56°C-‐tan eduki ziren errakzioak 5
minutuz eta ondoren, 72°C-‐tan 20 minutuz, heteroduplexen eraketa saihesteko. PCR
erreakzio bakoitzeko 4 µl hartu eta 100 µM NaCl, 50 µM Tris-‐HCl, 10 µM MgCl2, 1 µM
DTT eta Bcl I errestrikzio entzimaren 15 U-‐rekin nahastu ziren (New England Biolabs,
Ipswich, MA), FAMekin markaturiko bi produktu desberdin izateko: 299 bp-‐ko bat
(PRELID1) eta 169 bp-‐ko beste bat (1. kromosomako paralogoa) (2. irudia).
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
48
2. irudia. PRELID1 genearen PRT entseguaren irudi eskematikoa. Aurreranzko eta FAMez markaturiko alderantzizko hasleek, 299 bp-‐ko bi sekuentzia anplifikatzen dituzte, lokus genomiko ezberdinetan kokatuta (itu lokusa den PRELID1 genean eta haren paralogoan, 1. kromosoman). Bcl I bidezko liseriketak FAMez markatutako 169 bp-‐ko produktua ematen du anplikoi paralogoan. Aldiz, liseritu ezin den PRELID1en sekuentziak 299 bp neurtzen jarraituko du tratamenduaren ostean. Produktu biak elektroforesi kapilar fluoreszentea erabiliz bana daitezke. Koordenatuak GRCh37/hg19 genomari dagozkio.
Gau osoan zehar 50°C-‐tan inkubatu ostean, liseriketa erreakzioaren 2 µl, 10 µl ROX-‐500
markatzailedun HiDi formamidarekin nahastu eta 36 cm-‐ko ABI3130XL kapilare batean
analizatu ziren POP7 polimeroa erabiliz (dena Applied Biosystemsetik), 23s-‐ko injekzio
denboran.
DEFB4ren PRT bidezko analisiak 366 lagin normalizatutan gauzatu ziren, aurretik
deskribatu bezala (Armour et al., 2007). Laburbilduz, PCRak 5 ng DNA erabiliz egin
ziren, 0,5 µM aurreranzko hasle (CCAGATGAGACCAGTGTCC) eta 0,5 µM FAMez
markaturiko alderantzizko hasle (TTTTAAGTTCAGCAATTACAGC) erabiliz. Anplifikazioak
honako pausuak 30 aldiz errepikatuz gauzatu ziren: 95°C 30 s, 53°C 30 s eta 70°C 30 s.
Bukatzeko, fase bat gehitu zitzaion esperimentuari: 53°C min batez/70°C 20 minutuz.
PCR produktuak Hae III errestrikzio entzimaren 5 U erabiliz liseritu ziren, eta aurretik
azaldu bezala analizatu ziren, elektroforesi kapilar bidez.
2.5. Datuen analisia
qPCR entsegu bakoitzaren (PRELID1, SYNPO, DEFB4 eta RNase P kontrol endogenoa)
efizientzia kalkulatu zen E = 10(-‐1/m)-‐1 formula erabiliz, m, Ct vs. DNA lagin bakar baten
diluzioaren logaritmoa (0,02 -‐ 200 ng hasierako DNA) grafikatu ostean lortutako
funtzioaren malda izanik.
krom1:211381179-211381477
PRELID1 krom5:176733510-176733808
TGATCA
TTATCA
Bcl I
FAM
FAM
FAM 299 bp
FAM 169 bp
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
49
qPCR datuen analisia Copy Caller v.1.0 programan (Applied Biosystems) eskuragarri
zegoen probabilitate maximoaren metodoa erabiliz burutu zen. Metodo honek datu
gordinaren balio bakoitzak gertuen duen zenbaki osoa errepresentatzeko duen
probabilitatea ematen du. Kalkuluak ΔCt balioetan daude oinarrituta, eta beraz, itu eta
erreferentzia entseguen anplifikazio efizientzien menpekoak dira guztiz. Hasierako
DNA kantitatearen eta Copy Caller bidez estimatutako kopia kopuru gordinen arteko
Pearsonen korrelazioa http://danielsoper.com/statcalc3/ webgunean eskuragarri
dauden erramintak erabiliz kalkulatu zen. PRT esperimentuen kasuan ere, probabilitate
maximoaren metodoa erabili zen, baina kasu honetan, elektroforesiaren gailurren
azaleren ratioak (itu/erreferentzia) kontuan hartuta. Kasu guztietan, PRELID1, SYNPO
eta β-‐defensinen gene multzoaren kopia kopuru modala hartu zen aintzat (2, 2, eta 4,
hurrenez hurren) (Fellermann et al., 2006). Teknika bien errepikakortasuna aztertzeko,
DEFB4 genearen analisiak bi aldiz egin ziren 366 lagin normalizatuen bilduman, eta
kopia kopuruen estimazioak konparatu ziren.
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
50
3. Emaitzak
3.1. DNA kantitateak eragina du qPCR bidezko kopia kopuruaren esleipenean
Lau diluzio logaritmikoko heinean eraikitako qPCR anplifikazio grafiko guztiak lerro
zuzen batera doitu ziren (R2 > 0,99). PRELID1 eta SYNPO geneen entseguen anplifikazio
efizientziak %108,23 eta %97,84 izan ziren, hurrenez hurren; itu geneen eta
erreferentzia entseguaren (RNase P) arteko efizientzia diferentzia absolutuak %5,95
eta %4,42 puntukoak izan ziren, hurrenez hurren (3. irudia).
PRELID1 eta SYNPO geneak qPCR bidez analizatu ziren 400 DNA lagin normalizatu eta
beste horrenbeste lagin ez normalizatutan. Copy Caller softwaretik eratorritako
kalkulatutako kopia kopuru gordinek banaketa normala jarraitzen zuten,
normalizatutako lagin bildumaren kasuan 2 balioaren inguruan zeharo bilduta. Lagin ez
normalizatuetan, bai PRELID1en baita SYNPOren kasuan ere, bilketa honek ez zuen
horrenbesteko trinkotasunik agertu, eta datuak dispertsoago ageri ziren 1 baliotik 3ra
bitartean sakabanatuta (4. irudia). PRELID1en datuetan, bildumaren batez bestekoa
(13,28 ng; 2-‐120 ng-‐ko heina) baino hasiera kantitate handiagoko DNA laginek kopia
kopuru altuagoen esleipena izateko joera zuten (R = 0,3932; p = 0,0196), baita
muturreko balioak (>75 ng) kenduta ere (5. irudia).
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
51
3. irudia. Taqman Copy Number entsegu pareen (itu eta erreferentzia) anplifikazio efizientzien grafikoak, hasiera DNA kantitatearen lau ordeneko heinetan (0,02-‐200 ng) gauzaturiko erreakzioen bidez kalkulatuta.
Input DNA (ng) 100
PRELID1 (108.23%) R 2 = 0.9939 R 2 = 0.9939
0.02 0.2 2 20 200 0 5
10 15 20 25 30 35
0 5
10 15 20 25 30 35 Ct
Input DNA (ng)
5 10 15 20 25 30 35
100 5
10 15 20 25 30 35
0.02 0.2 2 20 200
R 2 = 0.9949 R 2 = 0.9949 DEFB4 (82.75%)
Ct
0
Ct
0 5
10 15 20 25 30 35 40
0.02 0.2 2 20 100 200 Input DNA (ng)
R 2 = 0.9891 RNaseP (90.10%)
0 5
10 15 20 25 30 35
100
SYNPO (97.84%) R 2 = 0.9936 R 2 = 0.9936
0 5
10 15 20 25 30 35
0.02 0.2 2 20 200
Ct
Input DNA (ng)
PRELID1 - RNaseP Efizientzia absolutuen arteko diferentzia = %5,95
SYNPO - RNaseP Efizientzia absolutuen arteko diferentzia = %4,42
DEFB4 - RNaseP Efizientzia absolutuen arteko diferentzia = %7,36
0.02 100
RNaseP (102.27%) R 2 = 0.9943 R 2 = 0.9943
0.2 2 20 200 Input DNA (ng)
0 5
10 15 20 25 30 35
0 5
10 15 20 25 30 35 Ct
100
RNaseP (93.43%) R 2 = 0.9989 R 2 = 0.9989
0 5
10 15 20 25 30 35 40
0 5
10 15 20 25 30 35 40
0.02 0.2 2 20 200 Input DNA (ng)
Ct
hasierako DNA (ng) hasierako DNA (ng)
hasierako DNA (ng) hasierako DNA (ng)
hasierako DNA (ng) hasierako DNA (ng)
RNaseP (%90,10)
RNaseP (%93,43)
RNaseP (%102,27) PRELID1 (%108,23)
SYNPO (%97,84)
DEFB4 (%82,75)
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
52
4. irudia. PRELID1 eta SYNPO geneen qPCR bidez kalkulatutako kopia kopuruak, normalizatutako laginetan (beltzez) eta ausaz diluitutako bilduman (grisez). Eremu gris argian kokatzen diren laginek bi kopiako predikzioa dute.
5. irudia. qPCR erreakzio bakoitzeko erabilitako hasierako DNA kantitatearen eta kopia kopuru gordinen arteko korrelazioa PRELID1 genearentzat.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Kalkulatutako kopia kopurua
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
zenb
atek
oa
PRELID1
SYNPO
0 20 40 60 80
100 120
1 1,5 2 2,5 3 3,5
hasi
erak
o D
NA
(ng)
Kalkulatutako kopia kopuruak
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
53
3.2. PRT entseguak DNAren degradazioarekiko oso sentikorrak dira
PRT teknikaren bidez lorturiko PRELID1en kalkulatutako kopiek Gauss erako banaketa
trinkoa aurkeztu zuten kalitate oneko DNA laginetan, baina endekatutako DNA laginek,
aldiz, askoz ere banaketa dispertsoagoa erakutsi zuten, banaketa normaletik urrunago
geratzen zen hein zabalago bat irudikatuz (>1 -‐ <3 kopia kopuruak) (6. irudia). PRT
CNVen esleipenerako teknika sendoa dela frogatu bada ere, emaitza optimoak kalitate
altuko DNA laginak erabiltzen direnean soilik lor daitezke. DNAren degradazioak,
ordea, ez dauka qPCR teknikan inpaktu aipagarririk.
6. irudia. DNA integritatearen inpaktua qPCR eta PRT bidez PRELID1entzat kalkulatutako kopia kopuruetan. Kalkulatutako kopia kopuruen banaketa (zutabe beltzak) eta predikzioen frekuentziak (zutabe grisak) a) kalitate handiko eta b) endekatutako DNA laginetan. Lagin bilduma bakoitzeko azpitalde baten elektroforesia. Lehenengo bi kaleak DNA markatzaileei dagozkie (λ-‐Hind III eta 123 bp markatzaileak, hain zuzen) eta gainontzekoak, DNA laginei. Markatzaileen zenbait neurri base paretan adierazi da. Estimatutako kopia kopuruen maiztasunak modu esangarrian ezberdinak dira PRT analisiaren kasuan (χ2 = 38.34; p = 2x10-‐28) eta DNA lagin endekatuetan gauzaturiko tekniken artean (χ2= 3.96; p = 2x10-‐27).
3.3. qPCR eta PRT teknikak konparagarriak dira baldintza kontrolatuetan
DEFB4 genearen kopia edukia kalitate altuko 366 DNA lagin normalizatutan analizatu
zen, horretarako qPCR (RNase P kontrol endogenoarekiko efizientzia diferentzia
246 492
2300
246 492
2300
Kopia kopurua
b)
a) Zenbatekoa
qPCR PRT
0
5
10
15
20
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0
5
10
15
20
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
0
5
10
15
20
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0
5
10
15
20
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
100
50
0
% Zenbatekoa 100
50
0
%
Zenbatekoa 100
50
% Zenbatekoa 100
50
0
%
0
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
54
absolutua = %7,36) eta PRT teknikak erabiliz. Kalkulatutako kopiek antzeko banaketa
zuten, zenbaki osoen inguruan Gauss erako bilketak osatuz (7. irudia).
7. irudia. DEFB4 genearentzat, qPCR eta PRT erabiliz kalkulatutako kopia kopuruen banaketa, kalitate handiko normalizatutako 366 laginetan.
Bestalde, qPCR (triplikatuan) eta PRT teknikek antzeko errepikakortasun maila
aurkeztu zuten, eta metodo bien kasuan, errepliken kalkulaturiko kopia zenbakien
artean korrelazio handia behatu zen (8. irudia). Esleitutako kopia zenbakien
konkordantzia ratioak %66 eta %65ekoak izan ziren qPCR eta PRTren kasuetan,
hurrenez hurren.
0 5
10 15 20 25 30
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
0 5
10 15 20 25 30
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
Zenb
atek
oa
Kalkulatutako kopia kopuruak (PRT)
Kalkulatutako kopia kopuruak (qPCR)
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
55
8. irudia. Erreplika arteko DEFB4 kopia kopuruen korrelazioa qPCR (R = 0,8546) eta PRT (R = 0,8193) teknikak erabiltzean.
Era berean, teknika desberdinekin lortutako emaitzen arteko korrelazioa esanguratsua
zen (R = 0,7956) eta kalkulatutako kopia kopuruen arteko diferentzia 1 baino txikiagoa
zen kasuen %83an (9. irudia).
9. irudia. qPCRrekin konparatuta, PRTz kalkulatutako DEFB4 kopia kopuruen desbideraketa erakusten duen Bland-‐Altman grafikoa.
Esleitutako kopia kopuruen arteko konkordantzia 2. taulan ageri da; laginen %62ak
esleitutako kopia zenbaki bera agertzen du teknika biekin, %23k kopia kopuru altuagoa
qPCRrekin eta gainontzeko laginek (%15ak hain zuzen) kopia gutxiago aurkezten dute
qPCR erabiltzen denean.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kalkulatutako kopia kopuruak (2. erreplika)
Kal
kula
tuta
ko k
opia
ko
puru
ak (1
. err
eplik
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
qPCR PRT
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Kal
kula
tuta
ko k
opia
kop
urue
n ar
teko
dife
rent
zia
(qP
CR
ken
PR
T)
Kalkulatutako kopia kopuruak (qPCR)
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
56
2. taula. DEFB4 genearen konkordantzia maila, qPCR eta PRT bidez egindako kopia kopuru estimazioen artean.
Esleitutako kopia
kopurua
qPCR
1 2 3 4 5 6 7 8
PRT
1 1 2 9 5 3 50 33 4 4 8 103 22 2 5 2 24 45 10 2 1 6 4 11 15 3 2 7 1 1 2 4 8 1 1
3.4. β-‐defensina kopia kopuru baxua CDrekin asoziatuta dago
Anplifikatu ez zuten erreplikak identifikatu ostean, laginen %3,2 eta %6,3 baztertu zen
TLR2 eta TLR4ren kopia edukiaren analisian, hurrenez hurren. Lagin guztiek 2 kopia
agertu zuten hartzaile bien kasuan, eta beraz, ez zen kontrol eta gaixoen arteko
desberdintasunik behatu. β-‐defensina gene multzoaren kasuan, irizpide berdinak
aplikatu zirenean, laginen %1,8 baztertu genituen. β-‐defensinen kopia kopurua 2 eta 9
kopia artean aldakorra zen, eta banaketa CD gaixoen eta kontrolen artean zertxobait
desberdina, baina esangarritasunera heldu gabe (10. irudia).
10. irudia. β-‐defensinen kopia kopuruen maiztasun banaketa CD paziente eta kontroletan.
0
10
20
30
40
2 3 4 5 6 >7
Kontrolak CD gaixoak
kopia kopurua
mai
ztas
una
(%)
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
57
Hala ere, kopia kopuruak taldekatu zirenean, kopia zenbaki altuko taldea (>4)
maiztasun txikiagoaz agertu zen zeliakoen artean, modu esangarrian (3. taula).
3.taula. β-‐defensinen kopia kopuruen taldekaketen konparaketa paziente zeliako eta kontrolen artean.
Multzoa CD gaixoak (%) Kontrolak (%) p balorea OR (%95 KT)
<4 116 (31,6) 111 (29,5)
4 156 (42,5) 139 (37,0)
>4 95 (25,9) 126 (33,5) 0,023* 0,69 (0,50 -‐ 0,96)
* <4 eta 4 kopia kopuruen multzoen baturarekiko
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
58
4. Eztabaida
Beharrezko diseinu esperimentalaren sinpletasuna dela eta, qPCR sarritan erabiltzen
da adierazpen azterketetan, mRNAaren kuantifikazio erlatiboan, eta logika bera erabili
da CNVen analisirako. Dena den, qPCR bidez lorturiko emaitzak ez dira beti behar
bezain sendoak izan eta CNV eta gaixotasun ezberdinen arteko asoziazio analisiak
zalantzan jarri dira. Esate baterako, emaitza gordinetatik abiatu eta kopia kopuruen
estimazioak egiteko erabiltzen den metodoa ΔCt balioetan soilik oinarritzen diren
kalkuluetan datza, eta ondorioz, anplifikazio efizientzia guztiak %100ekoak direla edota
esperimentu batean, aldi berean, parte hartzen duten entseguenak (itu eta
erreferentziari dagozkienak) berdinak direla onartzen du (Livak et al., 2001). Horrela,
qPCR batean erabilitako bi entseguen anplifikazio efizientzien arteko diferentzia diluzio
serialen kurben malden arteko diferentziarekiko zuzenki proportzionala izango da.
Kurben arteko distantzia hasierako DNA kantitatearen arabera aldatuko da, ΔCt
balioetan eta ondorioz, kalkulatutako kopia kopuruetan aldaketak eraginez.
Bestetik, PRT teknikak itu lokusa zein erreferentziazko paralogoa anplifikatzeko hasle
pare bera erabiltzen duenez, entseguen efizientziak aintzat hartu gabe joka daiteke,
berauengan eragina duten faktore bakarrak anplikoi ezberdinen egitura eta sekuentzia
direlako eta normalean, hauek ia berberak izaten direlako (PRELID1en kasuan bezala).
Hala ere, itua eta erreferentzia sekuentzien luzera edota egitura nahikoa ezberdinak
direnean, PCR erreakzioetako hasiera DNA kantitatea kontuan hartu beharko da, kopia
kopuruaren estimazioan gerta daitezkeen erroreak saihesteko.
β-‐defensina gene multzoaren CNV analisiari buruzko azterketa batean, qPCR hurbilketa
DNA kalitatearekiko oso sentikorra zela ondorioztatu zen, asoziazio ebidentzia faltsuak
sorrarazteko moduko alborapen sistematikoak eratuz (Fode et al., 2011). Dena dela,
autoreek kopia kopuruaren esleipenerako funtsezkoa den faktore bat aipatu gabe utzi
zuten. Izan ere, hasierako DNAren kalitatean baino ez zuten jarri arreta eta ez zuten
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
59
kantitatea kontuan hartu (10-‐75 ng erreakzioko), test eta erreferentzia entseguen
arteko efizientzia diferentziak %5etik gertu ageri baziren ere.
Gainera, autoreek ez zituzten CNVen estimazioa aldarazten egon zitezkeen kalitate
faktoreak identifikatu, eta ez zuten DNAren kalitateak qPCR bidezko kopia kopuruaren
analisian duen inpaktua frogatzeko inolako ebidentziarik plazaratu. Bestalde, aurretiaz
argitaratutako beste lan batean, laginaren diluzio mailak eta inhibitzaileen edukiak
(gatzak edota lehiatzen den DNA, kasu) anplifikazio efizientzian eragin nabaririk ez
dutela agertu zen. Horrela, efizientziaren aldakortasunaren parterik handiena
anplikoiaren estruktura eta sekunetziaren menpekoa da (Karlen et al., 2007). Gure
azterketaren arabera, efizientzia diferentziak %4 eta %6 artekoak direnean, hasierako
DNA kantitate aldakorrak ΔCt balioak aldaraz ditzake, PRELID1 eta SYNPO geneen
kasuan (bien kopia kopuru modala bi izanik), kopia kopuruaren esleipen faltsuak
eraginez. Kopia kopuru modal altuagoko geneetan, efektu hau areagotuta agertuko
litzateke, kalkulu ahulagoak ekarriz eta estimazio faltsuak emendaraziz.
Itu eta erreferentzia anplikoien efizientzien arteko desberdintasunek CNV analisirako
qPCRaren optimizazioan kontuan hartu beharreko aldagai nagusia osatzen dute,
hasiera DNA kantitate aldakorrak erabiltzean, kopia kopuruen esleipen artefaktuala
ekar dezakeen ΔCt balioen alboratzea eragiten baitute. Lan honek, hasierako bataz
besteko DNA kantitatetik aldentzeak kopia kopuruaren kalkuluan eragin handia duela
erakusten du. Hala ere, DNAaren normalizazio zehatzak arazo hau gainditzen lagun
dezake, hein handi batean. Kopia kopuruak zenbaki osoak direla aintzat harturik, ΔCt
emaitzetan oinarrituriko kalkuluetatik eratorritako kopia kopuruak zenbaki osoen
inguruan biltzea esperoko genuke, eta hau, askoz hobeto lortzen da normalizatutako
DNA laginak erabiliz, lan honetan ikusi bezala. DNA kontzentrazioak normalizatuz gero,
qPCR teknikan oinarrituriko CNV analisi sinesgarriak gauza daitezke erreferentzia
entsegu bera erabiliz. Ondorioz, hasle eta zundak itu lokusentzat baino ez dira
diseinatu beharko, eta batzuetan, zuzenean erosi ahal izango dira.
Beste alde batetik, DNAren fragmentazioak qPCR bidezko kopia kopuruaren kalkuluan
duen inpaktu eskasa ezin dakioke teknikaren ezaugarri zehatzen bati egotzi. Aldiz,
qPCR bidezko esleipena DNA kalitatearekiko sentikortasun gutxiago izatea, qPCRan
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
60
normalean erabiltzen diren anplikoiak PRT teknikaren kasuan erabiltzen direnak baino
laburragoak izatean datza. PRELID1 eta DEFB4 anplikoien luzerak 107 bp eta 127 bp
dira qPCRaren kasuan eta 299 bp eta 443 bp PRTren kasuan, hurrenez hurren. PRT
teknikaren baldintzak ezartzea oso konplikatua da. Izan ere, bi DNA sekuentzia
paralogo (eta ez gehiago) anplifikatuko dituen hasle parea diseinatu beharra dago, eta
honek anplikoiaren luzera baldintzatuko du. Eremu genomiko luzeagoak maiztasun
txikiagoz errepikatzen dira genoman zehar eta beraz, beren anplifikazioa
espezifikoagoa izatea espero da, baina bestetik, PCR anplikoi luzeagoak hasierako
DNAren degradazioarekiko sentikorragoak direla ikusi izan da (Putkonen et al., 2010).
Gainera, batzuetan, SYNPOrekin gertatu bezala adibidez, PRT entseguaren diseinua ez
da posible, anplifikatu eta itu lokusetik desberdindu daitezkeen paralogoak ez direlako
beti aurkitzen.
Laburbilduz, ikerketa honek DNA normalizazioaren garrantzia azpimarratzen du qPCR
bidezko kopia kopuruaren esleipena zehatza izan dadin, teknika hau itu eta
erreferentzia entseguen anplifikazio efizientzien arteko desberdintasunekiko erabat
sentikorra delako. Era berean, PRT erabiltzen denean DNAren kalitatea berebizikoa
dela erakusten du, beste autore batzuek adierazi bezala (Urban et al., 2009),
sentikortasuna eta espezifikotasuna lortzeko anplikoi luzeagoak behar izaten direlako.
Populazioaren miaketa handietan funtsezkoa da faktore hauek kontuan hartzea,
alborapenak zein asoziazio ebidentzia faltsuak saihesteko. DNAren normalizazio eta
kalitate baldintza optimoetan, teknika bien artean beha daitekeen konkordantzia maila
errepliken arteko konkordantziaren parekoa da, eta beraz, alternatiba sendoak dira
CNVen populazio mailako azterketarako.
Edonola ere, biak, qPCR zein PRT teknikak CNVaren eremua era sakonagoan aztertuz
hobetu daitezke, qPCRaren kasuan hasle eta zunda kantitatea emendatuz, eta PRT
erabiltzen dugunean erreplika zein paralogo kopuru handiagoa erabiliz (Fode et al.,
2011). Horrela CNVen esleipen egokia ziurtatuko dugu.
Bestetik, azterlan honetan, ezin izan genuen kopia kopuru aldakorrik aurkitu TLR2 eta
TLR4 lokusetan, gene hauek pazienteetan erakusten duten adierazpen alterazioak TLR
eremuetako aldakortasunarengatik azaldu ezin den ideia indartuz. β-‐defensinen
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
61
kasuan, ordea, DEFB4 genearen mRNA mailaren %50 arte kopia kopuruaren
polimorfismoen bidez azal daitekeen usteak (Hollox et al., 2003) zientzialariak hainbat
gaixotasun autoimmunerekiko asoziazioa ikertzera bultzatu ditu. Emaitzak ez dira beti
erabakigarriak izan eta askotan kontraesanak sortu dituzte, CNV azterketen
konplexutasun biologiko zein metodologikoa, batetik, eta lagin kopuru baxuak eta
erreplikazio independentearen faltak eratzen dituzten arazoak, bestetik, islatuz.
Hala ere, β-‐defensinen multzoaren kopia kopurua Crohn gaixotasunarekin asoziatu da,
eta 3 kopia baino gutxiago dituzten indibiduoak eritasuna garatzeko arrisku handiagoa
dutela ikusi da (OR = 3,06), seguruenik mikrobioen aurkako defentsa akastuna dela eta
(Fellermann et al., 2006; Wehkamp et al., 2008). Hamarkada hasierako lan batean,
ordea, DEFB4 genearen kopia kopuru altuek (>4) Crohn gaixoen artean maiztasun
handiagoa zutela ikusi zen, DEFB4 kopia ugariren eramaileen ehun epitelialean
erantzun inflamatorioaren emendioa iradokiz eta gaixotasuna eragiten duen
mekanismo modura proposatuz (Bentley et al., 2010).
Dena den, β-‐defensina geneen kopia kopuruaren eta gaixotasunaren arteko asoziazioa
detektatu denean ere, kopia edukiaren eta ehuneko hBD-‐2 proteina mailaren arteko
korrelazioa ez da argia izan. Crohn gaixoen hesteko mukosa hanpatuan, adibidez, kopia
kopuruak adierazpen mailan efektua zuela ikusi zen 2-‐4 kopiaren eramaileengan
(Fellermann et al., 2006). 2010ean, aldiz, kopia zenbaki zehatz baten eramaileen
artean, adierazpena 1000 aldiz alda daitekeela behatu zen, eta gainera, ez zen kopia
kopuruaren eta proteina produkzioaren arteko inolako harremanik aurkitu (Bentley et
al., 2010). Hesteetako hanturazko gaixotasuna aztergai zuen beste ikerlan batean,
koloneko hBD-‐2 mRNA eta proteina mailak estatus inflamatorioaren eta kanpo
estimuluen araberakoak zirela ikusi zen, lerro germinaleko CNVen araberakoak baino
(Aldhous et al., 2009).
β-‐defensina gene multzoaren CNVak azaleko gaixotasun inflamatorio arrunta den
psoriasian ere izan dira aztergai. Kopia kopuru altuak gaixotasuna pairatzeko
arriskuaren emendioarekin asoziatu izan dira (Hollox et al., 2008). Berriro ere, ez da
eritasunaren estadio aktiboan kopia kopuruaren eta genearen funtzioaren arteko
korrelazio esanguratsurik aurkitu (Jansen et al., 2009). Azkenik, gene multzoaren kopia
Kopia kopuru aldaeren analisia CDn
62
kopuru altuak prostatako minbizidun bi kohorte ezberdinetan maiztasun txikiagoaz
agertzen zirela ikusi zen, lokus honen CNV genomikoak kartzinogenesian ere
inplikatuta daudela iradokiz (Huse et al., 2008).
Lan honetan, β-‐defensinen multzoaren kopia kopuru altuak CD pazienteetan
kontroletan baino maiztasun gutxiagorekin agertzen zirela ikusi genuen, gaixotasun
honen kasuan, aztergai diren geneek babesarekin loturiko rola dutela iradokiz. Beste
zenbait baldintza inflamatoriotan proposatu bezala, mikrobioen aurkako hesiaren
indartzeak ekarriko lukeen infiltrazioaren kontrako mekanismoaren sendotzearen
bidez azal liteke babes hau. Horrela, hesteko epitelioaren integritatea emendatu eta
zelula arteko iragazkortasuna txikituko zen. Izan ere, azken honen areagotzea, CDren
ezaugarri nabarienetako bat da. Hemen aipatutakoa hipotesi erakargarria bada ere,
DEFB4k oso proteina induzigarria kodetzen du eta ez du ematen kopia kopuruaren eta
mukosako adierazpenaren arteko harreman zuzena dagoenik. Etorkizunean, ikerketa
berriak gauzatu beharko dira CNVek gene multzo interesgarri honen adierazpen
konplexuarengan duten eragina ulertuko badugu. Ondorio definitiboak atera aurretik,
gure aurkikuntzaren erreplikazio independentea ere gauzatu beharko litzateke.
2. kapitulua:
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
65
1. Aurrekariak
NFκB transkripzio faktorea sistema immune adaptatiboaren funtsezko erregulatzaile
bat da eta linfozitoen aktibazioa, zatiketa zelularra eta biziraupena kontrolatzen ditu.
Gainera, duela ez asko plazaratutako azterketa batean, gliadinak enterozitoengan duen
eragina estres oxidatiboaren, NFκBren aktibazioaren eta IL15en gainadierazpenaren
bidez gauzatzen duela ikusi da (Parmar et al., 2013). NFκBren aktibazioan gako diren
seinalizazio bitartekarien eta mekanismo erregulatzaileen eremuan aurrerapen asko
egin dira (Düwel et al., 2009). Batetik, jakina da TCR/CD28 loturak NFκB bidezidor
klasikoa induzitzen duela, NFKB1/RELA heterodimeroen aktibazio transkripzionala
bultzatuz (1. irudia). Aktibazio honek IκB kinasa (IKK) konplexuaren bidezko IκB
inhibitzaile txiki zitosolikoen fosforilazioa eta degradazioa dakartza (Hayden et al.,
2008). PRKCQ geneak kodetutako C proteina kinasa atipikoaren aktibazioa
ezinbestekoa da TCR/CD28 gertakariaren eta bidezidor osoaren arteko lotura
gauzatzeko (Sun et al., 2000), CARD11ren fosforilazioaren bidez, eta ondorioz ematen
den CARD-‐BCL10-‐MALT1 (CBM) konplexuaren eraketaren bitartez, hain zuzen ere
(Rawlings et al., 2006). Dena dela, bidezidor klasikoa zenbait G proteinei akoplatutako
hartzaileren aktibazioaren bidez ere induzi daiteke, baita IL1 eta Toll-‐like hartzaileen
eta tumoreen nekrosi faktoreen lehen hartzailearen (TNFR1) bidez ere. Gainontzeko
TNFRak, aldiz, NFκB bidezidor alternatiboa kitzikatzen dute, NFK2/RELB heterodimero
aktiboen eraketa bultzatuz (Rosebeck et al., 2011).
Bigarren kapitulu honen lehen zatian, NFκB seinalizazioan parte hartu eta paper
erregulatzaile eta zentralak dituzten zenbait hautagairen eta ur-‐behera kokaturiko eta
CDn garrantzitsuak izan litezkeen beste horrenbeste generen adierazpen maila aztertu
genuen. Gainera, adierazpenaren alterazioa normaltasunera itzultzen saiatu ginen,
horretarako bidezidorra zeharo inhibitu gabe berau modula dezakeen Z-‐VRPR-‐FMK
konposatu kimikoa (Z tesi honetan) erabiliz. Zehazki, konposatu honek MALT1
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
66
parakaspasa inhibitzen du (Rebeaud et al., 2008). Azken honek NFκB erregula dezake,
TCR bidezko fibronektinarekiko lotura, IL1 eta TL hartzaileen ur-‐behera NFκBren
inhibizioaren desagerpena eta JNK bidezidorraren aktibazioa gauzatu baititzake BCL10,
TNFAIP3 eta CYLD proteinen mozketaren bidez, hurrenez hurren (1. irudia). Bestetik,
MALT1ek MAP3K14ren mozketan ere parte har dezakeela proposatu izan da, API2-‐
MALT1 fusio proteinak mukosari asoziaturiko ehun linfoidearen eremu marginaleko B
zelulen linfoman (MALT linfoman) horrela egin baitezake (Rosebeck et al., 2011).
Azkenik, MALT1ek kaspasa-‐8 molekularen aktibazioa kontrolatzen du linfozitoen
zatiketa zelularrean zehar (Kawadler et al., 2008) eta linfozito eta linfoma lerro
zelularretan behatutako NFκBren aktibazio klasikoa gidatzen du RELBren mozketa
bidez (Hailfinger et al., 2011).
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
67
MA
LT1
MA
LT1
MA
LT1
TRA
F3
TRA
F2
REL
B
NFK
B2
REL
B
p100
RN
F11
TAX1
BP1
RN
F11
TRA
F2/5
R
NF8
TRA
F2
TAX1
BP1
REL
A N
FKB
1
REL
A N
FKB
1
TRA
F2/6
RN
F8
RN
F8
TRA
F6
TRA
F6
RN
F8
CA
RD
11
BC
L10
P
CB
M k
onpl
exua
TAB2/3 M
AP3
K7
MA
P3K
7IP1
P
IKBKG
CH
UK
IKB
KB
P
IKK
kon
plex
ua
NFK
BIA
P
P
P
P
MYD
88
IRA
K4
IRA
K1
MYD
88
IRA
K4
IRA
K1
ITC
H
PRK
CQ
TRA
DD
RIP
K1
BIR
C2/
3
HO
IL
HO
IP
TNFA
IP3 IT
CH
TAB2/3
MA
P3K
7
MA
P3K
7IP1
P
CYL
D
TRA
DD
RIP
K1
FADD
Kas
pasa
8
Apo
ptos
ia
CFL
AR
Kas
pasa
8
MA
LT1
CFL
AR
Pro
lifer
azio
a
IL2
ekoi
zpen
a
TCR
G
pro
tein
ari
lotu
tako
har
tzai
leak
IL
1 ha
rtza
ileak
eta
TL
R-a
k TN
FR1
BIR
C2/
3
MA
P3K
14
CH
UK
P
P
P
MA
LT1
??
MA
LT1 B
idez
idor
kan
onik
oare
n ak
tibaz
ioa
IL2
ekoi
zpen
a
TNFR
fam
ilia
NFκ
B b
idez
idor
kan
onik
oa
NFκ
B b
idez
idor
ez-
kano
niko
a
MA
LT1
TNFA
IP3
SC
F ko
nple
xua
BTR
C
SC
F ko
nple
xua
BTR
C
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
68
1. irudia. NFkB bidezidorraren muinaren eskema sinplifikatua, bereziki MALT1 parakaspasan (berdez) eta bere helburuetan arreta jarriz.
Bestalde, ingurumen zein genetikari loturiko arrisku osagai garrantzitsuak dituzten
gaixotasun konplexu arruntak hautagai onak dira geneen metilazioa ikertzeko, DNAren
ezaugarri epigenetiko honek maiz ingurumena eta genoma lotzen baititu. Gaixotasun
konplexu arrunt gehienek aldaketa epigenetikoen metaketa bidez azal litekeen izaera
progresibo eta kuantitatiboa dute (Bell et al., 2010a). Horrela, DNAren metilazio maila
alteratuak topatu izan dira sintoma psikotikoak dituzten pazienteen burmuinetako
aurreko kortexetan, aurretik gaixotasunarekiko lotura azaldu zuten eremu
genomikoetan (Mill et al., 2008).
Biki monozigotikoetan egindako zenbait lanetan, ezaugarri konplexuak azal ditzaketen
aldaera epigenetikoak aurkitu dira, lupus gaixotasun sistemikoarekin asoziaturiko
zenbait generen metilazio mailen jaitsiera kasu (Javierre et al., 2010). Genoma osoko
asoziazio azterketetan identifikaturiko SNPak eta eremuak berrikusi izan dira, jatorri
parentalaren eragina zein modu desberdinean metilaturiko transkripzio faktoreen
lotura guneak aurkitzeko asmoarekin. Teknika hauek arrakastatsuak izan dira 1 eta 2
motako diabetesa bezalako zenbait gaixotasunen kasuan, adibidez (Bell et al., 2010b).
Asoziaturiko lokusetako emaitza epigenomiko eta genomikoen integrazioak
determinante funtzional berriak aurkitzen lagunduko duela uste da. Gainera,
dagoeneko hainbat alterazio epigenomiko giza gaixotasun ezberdinekin asoziatu izan
da (Rakyan et al., 2011).
Minbizi mota desberdinetan gauzaturiko zenbait ikerketek modu desberdinean
metilaturiko promotoreak dituzten ehunka generen existentzia probatzen duten
ebidentziak plazaratu ditu. Aldaketa hauek, gainera, publikazio eta datu base
desberdinetan zehar kontsistenteak eta errepikakorrak direla ematen du (Yao et al.,
2012). Jakina da kartzinogenesian, hipometilazio globala eta promotore geniko
zehatzen hipermetilazioa gertaera garrantzitsuak direla, desegonkortasun
kromosomikoa eta gene tumore supresoreen isilarazpen transkripzionala ekar
ditzaketelako (Yoo et al., 2006; Yang et al., 2004). Azterketa ugaritan errepikatu badira
ere, metilazio aldaketa hauek ez dira kuantitatiboki oso nabarmenak izaten, bularreko
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
69
minbizian bezala, non ehun tumoralen eta ehun normalen arteko ezberdintasunak %5
ingurukoak diren (Wang et al., 2012). Hau guztia dela eta, metilazio mailan aldaketa
txikiak modu zehatz eta errepikagarrian kuantifikatzea ahalbidetzen duten teknikak
garatu beharko dira.
Gaixotasunen estadio jakinetako ehun laginak mugatuak dira eta sarritan, ezin daitezke
ordezkatu; hau dela eta, haietatik erauzitako DNA ikerkuntzarako material preziatua
izaten da. DNA kantitate txikien bisulfitomaren anplifikazioaren osteko metilazio analisi
kuantitatiboa (qMAMBA) lagin kantitate mugatuek ekartzen dituzten arazoak
saihesteko proposatu zen (adibidez, gorputzeko isurietatik erauzitako DNAren kasuan
erabiltzeko) (Vaissière et al., 2009; Paliwal et al., 2010). Azterketa epigenetikoetan
erabiliko diren teknikek metilazio ezberdintasun txikiak fidagarritasun eta
zehaztasunez neurtu beharko lituzketela kontuan harturik, qMAMBA eta bisulfitoz
trataturiko DNAren pirosekuentziazio konbentzionala konparatzeko esperimentu bat
diseinatu genuen.
Horrela, kapitulu honen bigarren partean, aurretik proposaturiko erregresio
polinomiko kubikoaren zuzenketa metodoaren erabilera zuzena egiaztatu (Moskalev et
al., 2011) eta bisulfitomaren anplifikazioa eta gerora erabilitako qMAMBA teknologia
emaitza artefaktualik eratu gabe gauza zitekeen diskriminatzen lagunduko zuen muga
ezarri genuen, horretarako 9 puntutako diluzio kurba bakar bat baliatuz. Gainera, CD
metilazioa ikertzeko gaixotasun hautagai ona izan litekeela hipotetizatu genuen,
eritasun inflamatorio eta konplexu izaera dela eta. Lan hau, gure ustez, CDn metilazio
aldaketak gertatzen diren aztertzen lehena izan da. Bestetik, aldaketa edo alterazio
hauek guztiak glutenik gabeko dietari esker normaltasunera itzul daitezkeen testatu
genuen. NFκB sisteman parte hartzen duten zenbait gene minbizi mota batzuetan
hipometilatuta egoteak (Yao et al., 2012) gure geneen zerrendan hautagai aproposak
aurkitu ahal izatea ekarri zuen.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
70
2. Materialak eta metodoak
2.1. Pazienteak eta biopsiak
Eritasun zeliakoa erreklutamenduaren garaian indarrean zegoen ESPGHAN irizpideen
arabera diagnostikatu zen, horretarako anti-‐gliadina eta anti-‐transglutaminasa
antigorputzen determinazioa eta heste meharreko biopsia baliatuz. Biopsiatu baina CD
zein hesteko hantura ez zituzten pazienteak kontrol modura bildu ziren. Indibiduoak
azterketan sartu eta laginak bildu eta analizatu aurretik, pazienteen zein hauen
gurasoen baimen informatuak eskuratu ziren. Azterketa (SAIO10-‐PE10BF03 eta
PI10/00310 zenbakidun proiektuetan) Gurutzeta Unibertsitate Ospitaleko Etika
Batzordearen onarpena jaso zuen. Duodeno distaleko biopsiak errutinazko
endoskopietan lortu ziren eta berehala izoztu (ehun basalak) edota inkubatu ziren;
gerora nitrogeno likidoan gorde ziren DNA edo RNA erauzi arte.
2.2. Gliadinaren prestaketa eta biopsia kulturak
Gliadina pepsina eta tripsina erabiliz liseritu zen pepsinaz eta tripsinaz liseritutako
gliadina (PTG) lortzeko, lehenago deskribatu bezala (Bondar et al., 2013). Laburbilduz,
500 mg gari gliadina (Sigma-‐Aldrich, Cat. No. G3375) 5 ml 0,2 M HCl-‐tan disolbatu zen
eta 5 mg pepsinarekin inkubatu (Sigma-‐Aldrich, Cat. No. P6887) etengabeko agitazioaz
(37°C 2 h). Inkubazioaren amaieran, pHa 7,4ra doitu zen NaOHz, eta nahasketa 5 mg
tripsinarekin (Sigma-‐Aldrich, Cat. No. T9201) inkubatu zen 37°Ctan 4 h. Entzimak
desaktibatzeko, soluzioa irakiten egon zen 30 minutuz. Liseriketa zentrifugatu zen 2000
g-‐tan 10 min, eta gainjalkina 20 µm-‐ko porodun mintzaren bitartez iragaziz esterilizatu
zen.
Biopsien in vitro inkubazio eredu bat eraiki genuen, PTGk zein NFκB bidezidorraren
modulatzaileak (Z-‐VRPR-‐FMK, Z tesi honetan) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY)
ikertutako geneen adierazpen mailak eta koadierazpen patroiak aldarazten zituzten
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
71
ikusteko. Lau biopsia zati hartu ziren 8 paziente zeliako aktibotik, GFDz trataturiko
beste 8 paziente zeliakotik eta zeliakoak ez diren beste horrenbeste kontroletik.
Biopsia basala berehala izoztu genuen nitrogeno likidotan, baina indibiduo bakoitzetik
eratorritako beste 3 zatiak jarraian azaldutakoaren arabera inkubatu ziren: denak ala
denak 150 µl RPMI-‐1640 10X mediotan jarri ziren 37°Ctan, %5eko CO2-‐rekin, 4 h. Lehen
zatia inongo konposaturik gabe kultibatu zen (kitzikatu gabea), bigarrena 250 μg/ml
PTGrekin jarri zen kulturan (PTG) eta azkena, PTGren kantitate bera erabiliz kitzikatu
zen, 60 µg/ml Zrekin 20 min kultibatu ostean (PTG-‐Z).
2.3. Adierazpen analisietan erabilitako RNA laginak
RNA totala NucleoSpin miRNA kita (Macherey-‐Nagel) erabiliz erauzi zen 16 biopsia
zeliako aktibotik, GFDz trataturiko 16 biopsia zeliako tratatutik, 16 biopsia kontrol ez
zeliakotik, baita in vitro modulazio azterketarako aukeratutako talde bakoitzeko 8
indibiduoren inkubaturiko biopsia serieetatik ere. RNA 20 μl-‐ko bolumen finalean
eluitu zen, Nanodrop espektrofotometroa erabiliz kuantifikatu (Thermo Scientific,
Waltham, MA) eta ddH20tan diluitu 50 ng/µl-‐ko kontzentrazioan utzi arte.
2.4. Alderantzizko transkripzioa (RT) eta PCR kuantitatiboa (qPCR)
Alderantzizko transkripzio erreakzioak 800 ng RNA erabiliz gauzatu ziren C1000
termozikladore batean (BioRad, Hercules, CA), SuperScript VILO cDNA Master Mix
bitartez eta fabrikatzaileek aholkaturiko prozedura jarraituz (Life Technologies,
Carlsbad, CA), 20 μl-‐ko bolumen finalean. PCR kuantitatiborako NFκB bidezidorrarekin
erlazionaturiko geneak itu dituzten 93 Taqman Gene Expression Assay komertzial
erabili ziren (1. taula), 7900HT qPCR sistema batean eta Taqman Low Density Array
(TLDA) formatuan. Matrize hau PCR erreakzio saihodi txikien sare batez dago osatua.
Adierazpen maila erlatiboak PCRan zehar eratutako fluoreszentzia datuetan oinarrituta
kalkulatu ziren, horretarako ABI PRISM 7900HT sekuentzia detekziorako sistema
baliatuz (dena Life Technologies-‐etik). Datuak TLDA bakoitzean aztertutako RPLPO
kontrol endogenoa (Life Technologies) kontuan harturik normalizatu ziren.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
72
1. taula. Taqman Low Density Array (TLDA) matrizean sartutako 93 adierazpen entseguen zerrenda, dagozkien gene sinboloekin.
Entsegu IDa Gene Sinboloa Entsegu IDa Gene Sinboloa Entsegu IDa Gene Sinboloa
Hs00178289_m1 AKT1 Hs00174092_m1 IL1A Hs00153294_m1 RELA
Hs00184839_m1 BCL10 Hs00174097_m1 IL1B Hs00232399_m1 RELB
Hs00608023_m1 BCL2 Hs00168392_m1 IL1R1 Hs00169407_m1 RIPK1
Hs00180403_m1 BCL3 Hs00174114_m1 IL2 Hs00174057_m1 SELE
Hs00977611_g1 BIRC5 Hs00907779_m1 IL2RA Hs00234829_m1 STAT1
Hs00182707_m1 BTRC Hs00174131_m1 IL6 Hs00179410_m1 TBK1
Hs00367225_m1 CARD10 Hs00174103_m1 IL8 Hs00413978_m1 TLR1
Hs00364499_m1 CARD14 Hs00155570_m1 IRAK1 Hs00152932_m1 TLR2
Hs00234140_m1 CCL2 Hs00418138_m1 IRAK1BP1 Hs00152933_m1 TLR3
Hs00171125_m1 CCL20 Hs00176394_m1 IRAK2 Hs00152939_m1 TLR4
Hs00374176_m1 CD40 Hs00236874_m1 LTA Hs00271977_s1 TLR6
Hs00188486_m1 CD83 Hs00158922_m1 LTBR Hs00152971_m1 TLR7
Hs00989507_m1 CHUK Hs00198984_m1 MALT1 Hs00607866_mH TLR8
Hs00231713_m1 CREB1 Hs00394890_m1 MAP3K1 Hs00152973_m1 TLR9
Hs00231733_m1 CREBBP Hs00177695_m1 MAP3K14 Hs00174128_m1 TNF
Hs00174164_m1 CSF1 Hs00177373_m1 MAP3K7 Hs00234713_m1 TNFAIP3
Hs00171266_m1 CSF2 Hs00196143_m1 MAP3K7IP1 Hs00269492_m1 TNFRSF10A
Hs00738431_g1 CSF3 Hs00153408_m1 MYC Hs00366272_m1 TNFRSF10B
Hs00236937_m1 CXCL1 Hs00182082_m1 MYD88 Hs00187192_m1 TNFRSF11A
Hs00369830_m1 EDARADD Hs00765730_m1 NFKB1 Hs01042313_m1 TNFRSF1A
Hs00196470_m1 ENPP2 Hs00174517_m1 NFKB2 Hs00243522_m1 TNFSF11
Hs00538709_m1 FADD Hs00153283_m1 NFKBIA Hs00353710_s1 TNFSF15
Hs00181225_m1 FASLG Hs00182115_m1 NFKBIB Hs00182558_m1 TRADD
Hs99999908_m1 GUSB Hs00234431_m1 NFKBIE Hs00194638_m1 TRAF1
Hs00164932_m1 ICAM1 Hs00384611_m1 NKIRAS1 Hs00184186_m1 TRAF2
Hs00277234_s1 IER3 Hs00383387_m1 NKIRAS2 Hs00237035_m1 TRAF3
Hs00233284_m1 IKBKB Hs00167248_m1 NOS2 Hs00188755_m1 TRAF4
Hs00415849_m1 IKBKG Hs00265399_s1 PTAFR Hs00182979_m1 TRAF5
Hs00174086_m1 IL10 Hs00610420_m1 PTGES Hs00365486_m1 VCAM1
Hs00168405_m1 IL12A Hs00153133_m1 PTGS2 Hs00185658_m1 ZFP36
Hs00233688_m1 IL12B Hs00968436_m1 REL Hs00603247_m1 ZNF675
2.5. Metilazio azterketarako DNA laginak
Metilazio kurbak HeLa DNA genomiko komertziala metilatu gabeko DNA modura (Qian
et al., 2005) eta CpG Methylated HeLa Genomic DNA guztiz metilatutako DNA gisa
erabiliz eraiki ziren (biak New Egland Biolabs-‐etik). Kurbaren puntu ezberdinen
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
73
metilazio mailak honakoak izan ziren: %0, %12,5, %25, %37,5, %50, %62,5, %75, %87,5
eta %100. Lagin guztiak 20 μl-‐ko bolumenean jarri ziren, 100 ng/μl-‐ko kontzentrazioan.
Kurba hauek qMAMBA eta pirosekuentziazio konbentzionalaren arteko konparaketa
egiteko, plaka desberdinetan aztertutako pazienteen laginen datuak kalibratzeko eta
erregresio kubikoaren metodoaren bidez, PCR erreakzioen alborapena zuzentzeko
erabili ziren.
DNA genomikoa hanturarik ez zuten 13 kontrol ez zeliakoren biopsia basaletatik eta
paziente zeliakoen 17 biopsia bikotetik (bata diagnosian hartua eta bestea bi urte
baino gehiago GFDn egon ostean) erauzi zen. Erauzketarako QIAamp DNA Mini kita
erabili zen (QIAGEN, Hilden, Germany), fabrikatzailearen gomendioak jarraituz. Laginak
Quant-‐it PicoGreen dsDNA erreaktiboaren bitartez kuantifikatu ziren (Invitrogen) eta
kontzentrazioak 20 ng/µl-‐ra doitu ziren.
Metilatu gabeko zitosinen sodio bisulfito bidezko konbertsioa DNA lagin bakoitzeko 20
µl erabiliz egin zen eta purifikazioaren ostean, laginak 40 μl ddH2Otan eluitu ziren,
Epitect Bisulfite kita (QIAGEN) fabrikatzaileek deskribatu bezala erabilita. Laburbilduz,
protokoloak honako pausuak deskribatzen ditu: zitosina ez metilatuen bisulfito bidezko
konbertsioa bera, konbertituko kate bakarreko DNAren lotura EpiTect zutabearen
mintzean, DNAren desulfonazioa eta konbertituriko DNA puruaren garbiketa eta
eluzioa.
9 puntuko metilazio kurbaren konbertsioaren ostean, lagin bakoitzaren alikuota bat (5
μl) hartu eta bisulfitoma osoa anplifikatu zen, Epitect Whole Bisulfitome Amplification
kita (QIAGEN) erabiliz, fabrikatzaileek gomendatu bezala. Bisulfitoz trataturiko 250 ng
inguru DNA REPLI-‐g Midi Polymerase 1 μl 40 μl-‐ko bolumen finalera gehituz anplifikatu
zen. Erreakzioak 28°Ctan inkubatu ziren 8 h, gerora 95°Ctan egon ziren 5min eta
azkenik, gau osoan zehar 4°Ctan. Lagin bakoitzaren 30 μl erdira diluitu zen ddH2Otan
PCR erreakzioetan erabiltzeko.
2.6. CpG irlen aukeraketa eta pirosekuentziazioa
NFκBrekin erlazionaturiko 8 gene ezberdin aukeratu ziren metilazio analisirako (2.
taula), ondoko irizpideak jarraituz: batetik, CpG irletan aberatsak ziren promotoreak
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
74
eta lehenengo exoiak zituzten, azken hauek adierazpenarengan uste baino eragin
handiagoa daukatela ikusi izan baita (Brenet et al., 2011). Bestetik, gene horien
analisirako aurretik diseinatutako metilazio entseguak zeuden eskura eta azkenik,
NFκB bidezidorrean paper erregulatzaile eta zentrala jokatzen zutela ezaguna zen.
Aukeraturiko entsegu bakoitzak 4-‐6 CpG irla analiza zitzakeen. Gainera, PyroMark Q24
CpG LINE-‐1 kita (QIAGEN) erabili zen genoma osoko metilazio globala neurtzeko,
erreklutatutako 17 zeliakoen biopsia pare eta 13 kontroletan.
2. taula. Metilazio entsegu eta geneen zerrenda.
Gene sinboloa
Metilazio
entsegu zenbakia
MALT1 PM00185143
MAP3K7 PM00122850
MAP3K7IP1 PM00199521
MAP3K14 PM00177569
NFKBIA PM00056287
RELA PM00048895
TNFAIP3 PM00122129
TRADD PM00061369
Itu lokusen anplifikazioak C1000 termozikladore batean (BioRad) burutu ziren, 25 μl-‐ko
PCR erreakzioetan 1,5 μl DNA, PyroMark PCR kiteko (QIAGEN) erreaktiboak eta
PyroMark CpG entseguetako aurreranzko eta biotinaz markaturiko alderantzizko hasle
espezifikoak gehituz, fabrikatzaileen protokoloari jarraiki. Termozikladorearen
baldintzak honakoak izan ziren: 15 min 95°Ctara (entzimaren aktibaziorako) eta 95°C
30 s (desnaturalizazioa), 56°C 30 s (annealing-‐a) eta 72°C 30 s (luzapena), 45 ziklotan.
Azkenik, azken luzapena burutu zen 72°Ctan, 10 min inkubatuz. PCR erreakzioak
elektroforesi bidez konprobatu ziren, agarosa geletan.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
75
PCR bidezko anplifikazioaren ostean, biotinilatutako PCR produktu bakoitzetik 20 μl
hartu eta estreptabidinaz estaliriko partikulekin lotu ziren (GE Healthcare, Wauwatosa,
WI), 24 putzutako plaketan. Esperimentuak PyroMark Q24an sisteman egin ziren. PCR
produktuak desnaturalizatu ziren eta biotinilatuta ez zeuden DNA kateak baztertu ziren
PyroMark Q24 huts lantokian. Partikulak hibridazio tanpoiaren 25 μl-‐tan bereseki ziren,
CpG entsegu espezifikoen sekuentziazio hasleekin batera (1X). Pirosekuentziazioa
PyroGold Q24 erreaktiboak (QIAGEN) erabiliz gauzatu zen. Nukleotido, substratu eta
dispentsazio ordenak eta bolumenak batetik eta pausu bakoitzaren iraupena bestetik,
PyroMark softwarearen bitartez erabaki ziren, itu sekuentziak oinarri harturik beti ere.
Erreakzioen ostean, emaitza gordinak softwarera inportatu ziren, ohiko kalitate
kontrolak egin eta lehenengo analisiak gauzatzeko.
2.7. Datuen analisia eta estatistika
Gene bakoitzaren adierazpen erlatiboa ΔΔCt metodo zehatza erabiliz kalkulatu zen,
aurretiaz deskribatu bezala (Martín-‐Pagola et al., 2003). Studenten T froga aplikatu zen
taldeen arteko ezberdintasunak ikusteko eta Microsoft Excel 2010 v.10.0 paketeko
Data Analysis ToolPak erabili zen biopsia talde basal eta inkubatu bakoitzaren
Pearsonen korrelazio matrizea eraikitzeko. Inkubazio serieek eragindako
adierazpenaren arrazoi aldaketen (FC) grafikoak zein gainadierazitako geneen bero
mapak Microsoft Excel 2010 v.10.0 paketearen makro ezberdinak erabiliz eratu ziren.
Klase iragarpena eta Z konposatuak adierazpen alteratua normaltasunera itzultzeko
ahalmenaren ebaluazioa online erabilgarri dagoen Babelomics web tresnen bidez
gauzatu ziren (http://babelomics.bioinfo.cipf.es/) (Medina et al., 2010). Laburbilduz,
gene azpitaldea aukeratzeko korrelazioan oinarrituriko ezaugarrien aukeraketa (CFS)
metodoa erabili zen, errorea K-‐means estimazio bidez kalkulatuta (10 errepikapen, 5
bider, berezko parametroak) eta Random Forest algoritmoa aplikatuz. Laginak bi
taldetan banatu ziren modu aleatorioan: trebatze taldea (12 zeliako aktibo eta 12
tratatu) eta test taldea (4 aktibo eta 4 tratatu). Gerora bigarren test talde bat aukeratu
zen, GFDz trataturiko eta in vitro esperimenturako erreklutatutako 8 pazienteetatik
eratorritako PTG zein PTG eta Zrekin inkubaturiko 16 biopsiak, hain zuzen ere.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
76
Metilazio azterketan, entsegu eta hurbilketa metodologiko bakoitzeko, artifizialki
eraikitako metilazio kurbaren emaitzak ekuazio polinomiko kubiko batekin deskribatu
genituen Microsoft Excel v.10.0 erabiliz (y = ax3 + cx2+ dx + e), metilazioaren balio
errealak x ardatzean eta behatutako balio esperimentalak (PyroMark Q24 softwaretik
eratorriak) y ardatzean jarrita. Ekuazio hauei esker, metilazio maila zehatzagoak
estimatu genituen emaitza esperimental bakoitzarentzat, x balioa Cardanoren
metodoaren bitartez ebatziz, aurretik deskribatu bezala (Jacobson, 2009). Metilazio
maila berriak paziente eta kontroletatik eratorritako emaitzentzat ere kalkulatu ziren,
eta erreakzio plaka bakoitzaren kalibrazioa gauzatu zen.
Erregresio kubikoaren metodotik eratorritako estimazioek metilazio balio errealekiko
duten antzekotasun eta zehaztasuna korrelazio linealen koefizienteen bidez neurtu
ziren (R2). b balioa, metilatutako eta ez metilatutako DNA konposizio ezberdinak
dituzten anplikoien hasleekiko lotura efizientzia eta polimerasaren elongazio gaitasuna
islatzen duen anplifikazioaren alborapena kalkulatzeko neurria da eta honako formula
honi jarraiki estimatu zen: b = [y × (100 -‐ x)]/[x × (100 -‐ y)], y zuzendu gabeko datu
esperimentala edota estimazio berria eta x balio erreala izanik. Aurretiaz erakutsi
bezala (Moskalev et al., 2011) b = 1 berdinketak PCR alborapen nabaririk ez dagoela
esan nahi du eta ez metilatutako aleloen anplifikazioaren hobespenak b < 1 ekarriko
du. Bataz besteko b balioak (gene bakoitzaren bataz bestekoa, esate baterako),
metilazio maila estimatuen eta errealen arteko errore karratuen gehiketak eta
errepliken arteko aldakortasun koefizienteak eta berauen desbideraketa estandarrak
kalkulatu ziren gene eta hurbilketa esperimental bakoitzeko, Prism v5.0 (GraphPad
Software Inc., La Jolla, CA) erabiliz.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
77
3. Emaitzak
3.1. NFκB geneen gainadierazpena eta bidezidorraren in vitro modulazioa
NFκBrekin erlazionaturiko 93 geneen adierazpena (1. taula) 16 CD paziente aktiboren,
GFDz trataturiko 16 pazienteren eta hesteko hanturarik gabeko beste horrenbeste
kontrolen biopsia basaletan kuantifikatu zen, horretarako gure taldeak diseinaturiko
TLDA bat erabiliz. Analizatutako geneen artean 22 era konstitutiboan gainadierazita
zeuden pazienteetan, diagnosiaren momentuan (CD aktiboa) eta GFDn gutxienez bi
urtez egon ostean (2. irudia). Azpiadierazpen konstitutibo esangarria agertu zuen gene
bakarra ENPP2 izan zen. Bestetik, 9 gene paziente aktiboen taldean baino ez zueden
gainadierazita.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
78
STAT
1IRAK
1MAP
3K7
FADD
NKIRA
S2TRAF
2CD
40TRAD
DMAP
3K14
MAP
3K1
IKBK
BICAM
1AK
T1IKBK
GMAL
T1PTGE
SNFKB2
TNFRSF10
BMAP
3K7IP1
CARD
10NFKBIE
IL1R
1
IL12
ABC
L10
SELE
IL2R
AIL10
IL8
PTGS
2IL1B
IL6
Overexpressed)genes),)CD
)vs.)non
,CD
Overexpressed)genes),))active)CD
)vs.)inactive,)and
)non
,)CD
ACTIVE
'CD
CD'ON'GFD
NON-CD
Diagno
sia(
GFD(
Kontrolak(
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
79
2. irudia. Modu konstitutiboan gainadierazita dauden 22 NFκB geneen eta gaixotasun aktiboan soilik gainadierazita dauden 9en bero mapa (T frogaren p < 0,05). Zutabeek pazienteetatik hartutako laginak adierazten dituzte. Gorritik urdinerako eskalak gene ezberdinen gain-‐/azpi-‐adierazpen gradientea adierazten du.
Talde bakoitzeko 8 biopsia zati inkubatu ziren pepsina eta tripsinaz liserituriko
gliadinarekin, PTG eta NFκBren modulatzailearekin (Z, Z-‐VRPR-‐FMK) edo bietako bat
bera ere erabili gabe (kitzikatu gabeko biopsia), lau ordutan zehar beti ere. mRNA
mailako aldaketak talde eta baldintza guztietan behatu ziren. Orokorrean, gliadina
bidezko estimulazioaren ostean gene batzuen adierazpena alteratu egin zen, eta PTG
eta Zrekin inkubatzean, aldiz, kitzikatu gabeetan ikusitako mailetara bueltatu zen (3.
irudia). PTG bidezko kitzikapenak eragindako alterazioen norabidea zein intentsitatea
oso aldakorrak izan ziren lagin batetik bestera, Zren eragina, aldiz, uniformeagoa izan
zen.
Z bidezko leheneratzeak ez zuen CD pazienteetan konstitutiboki gainadierazitako
geneen taldearengan eraginik izan, eta hau dela eta, gaixotasunaren estatusen arteko
desberdintasunetan zentratu ginen. Gaixotasunaren aktibitatea eta inflamazioa
ulertzeko gene informatiboenak identifikatzeko asmoz, klase iragarpen analisi bat
burutu genuen. Paziente zeliako aktibo zein tratatuen lagin basalak bi azpitaldetan
banatu ziren ausaz; trebatze azpitaldean paziente talde bakoitzeko 12 lagin erreklutatu
eta test azpitaldean gainontzekoak sartu ziren. CFS metodoa aplikatuta, lau gene
(CCL20, IL1B, STAT1 eta NOS2) nahikoak izan ziren gaixotasunaren estatusen artean
desberdintzeko, 8 test laginetatik 7 kasutan; trataturiko 4 pazienteetatik bat txarto
sailkatu zen, gaixo aktiboen taldean hain zuzen. PTG edota PTG eta Z konposatuez
kitzikaturiko 16 biopsia zati tratatuak bigarren test talde modura erabili zirenean,
PTGrekin inkubaturiko zatiak gaixo aktiboen taldean sailkatu ziren. Z gehitzeak joera
honen errebertsioa ekarri zuen inkubaturiko 8 biopsietatik 5en kasuan, eta beraz, GFDz
trataturiko pazienteen multzoan sartu ziren.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
80
3. irudia. Adierazpen erlatiboaren arrazoien aldaketa (FC) balioak baldintza ezberdinetan (PTG/PTG-‐Z) inkubaturiko biopsietan, indibiduo bakoitzaren kitzikatu gabeko biopsiarekiko. Eremu grisak 0,5 eta 2 arteko FCak markatzen ditu. Lerroek paziente eta kontrol bakoitzaren FCen joerak erakusten dituzte.
0,01
0,1
1
10
100
Ctrl
IL8
0,01
0,1
1
10
100
Ctrl
IL6
0,1
1
10
Dx
IL8 0,1
1
10
GFD
IL8
0,1
1
10
Dx
IL6 0,1
1
10
GFD
IL6
0,1
1
10
Dx
IL1A 0,1
1
10
GFD
IL1A 0,1
1
10
Ctrl
IL1A 0,1
1
10
Ctrl
IL1A
0,1
1
10
Dx
IER3 0,1
1
10
GFD
IER3 0,1
1
10
Ctrl
IER3
0,1
1
10
Dx
CCL2
es#mulurik*ez******PTG*****************PTG/Z*
0,1
1
10
Ctrl
CCL2 0,1
1
10
GFD
CCL2
0,1
1
10
Dx
CSF2 0,1
1
10
GFD
CSF2 0,1
1
10
Ctrl
CSF2
CCL2$Arrazoi'aldaketa'
Arrazoi'aldaketa'
Arrazoi'aldaketa'
Arrazoi'aldaketa'
Arrazoi'aldaketa'
Arrazoi'aldaketa'
CSF2$
IER3$
IL1A$
IL6$
IL8$
Diagnosia' GFD' Kontrolak'
es#mulurik*ez******PTG*****************PTG/Z*es#mulurik*ez******PTG*****************PTG/Z*
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
81
3.2. NFκBrekin erlazionaturiko geneen koadierazpena
Pearsonen korrelazio matrizeak gene bikoteen arteko koadierazpena probatzeko eraiki
ziren. Kontrolen kasuan korrelazio gehiago eta indartsuagoak behatu ziren, batez ere,
CD aktiboarekin konparatuta (4. irudia), zeliakoak ez diren indibiduoetan,
bidezidorraren oreka erregulatzaile hertsia ematen dela iradokiz. GFDz trataturiko
taldeak korrelazioen erdibideko kopuru eta indarra aurkeztu zituen, bidezidorraren
erdi mailako erregulazioa erakutsiz.
4. irudia. Gene pareen koadierazpen matrizeak gaixotasunaren estatus desberdinetan. Lauki txiki bakoitzak gene pare espezifiko baten adierazpen maila erlatiboen arteko korrelazioaren p balorea adierazten du. Zuriak, gris argiak, gris ilunak eta beltzak ondoko Pearsonen korrelazio p balioak adierazten dituzte, hurrenez hurren: >0,05, <0,05, <0,01 eta <0,001.
Bestalde, PTGak zein PTG eta Zren konbinazioak biopsia basaletan behaturiko
koadierazpen joerak afektatu zitzaketen aztertu genuen. Pearsonen korrelazio
matrizeak eraiki ziren estimulu bakoitzak eragindako arrazoien aldaketak irudikatzeko
(kitzikatu gabeko biopsia zatiekiko, beti ere). PTG zein PTG-‐Z bidezko kitzikapenek ez
zuten efektu aipagarririk izan paziente aktiboen taldean (5. irudia). Hala ere, GFDz
trataturiko pazienteen eta kontrolen kasuan, PTG estimuluak jaitsiera nabarmena
eragin zuen geneen adierazpenaren koordinazioan eta gainera, biak, PTG eta NFκBren
modulatzailea konbinatu zirenean, korregulazioa nolabait berrezartzen zela ikusi
genuen. PTG bidezko estimulazioaren ondorioz gertaturiko geneen adierazpen joeren
koordinazio galera nabarmenagoa izan zen GFD zeliakoen kasuan kontrolen kasuan
baino.
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
01
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
00
01
01
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
11
11
01
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
10
01
01
11
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
11
11
00
01
11
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
01
01
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
10
10
00
00
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
10
11
10
00
00
00
11
11
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
00
10
01
01
01
10
01
01
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
01
10
00
11
01
10
00
00
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
11
00
00
01
11
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
00
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
00
01
01
11
10
01
01
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
10
11
10
00
00
00
11
11
00
00
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
10
01
01
11
10
01
01
11
01
00
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
00
01
01
11
10
00
00
11
01
00
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
00
00
01
01
10
01
01
11
01
00
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
11
00
00
10
00
00
11
10
00
11
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
00
11
11
01
00
10
00
10
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
11
10
01
01
11
10
00
00
11
01
00
11
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
00
01
01
10
10
00
00
10
00
00
11
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
00
00
01
01
00
00
00
01
11
00
01
01
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
11
11
00
11
11
00
11
11
00
01
11
10
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
10
11
10
00
00
00
11
10
00
00
11
01
00
11
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
11
10
00
11
11
00
11
11
00
11
11
10
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
11
10
10
01
00
10
01
11
00
10
01
11
11
01
11
11
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
01
10
00
11
11
00
11
11
00
11
11
10
01
11
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
00
11
00
10
11
10
01
11
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
00
11
00
10
11
10
01
11
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
00
00
11
11
01
00
11
00
10
11
10
01
01
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
11
00
10
11
10
00
01
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
11
00
11
00
11
11
10
10
01
00
10
11
10
01
11
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
11
10
01
11
11
10
00
00
11
11
00
11
01
00
00
10
00
11
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
00
00
01
10
00
01
01
01
01
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
00
00
11
11
01
00
11
00
10
11
10
01
01
00
00
00
00
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
00
11
00
10
11
10
01
11
00
01
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
01
01
01
00
11
00
00
00
10
00
01
00
01
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
11
11
00
11
11
10
01
11
01
00
00
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
01
11
00
11
11
10
01
11
01
01
00
00
00
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
11
00
00
01
11
00
00
11
00
11
11
10
01
10
00
01
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
11
00
11
11
10
11
11
00
11
11
10
01
11
01
00
00
00
00
10
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
00
00
10
11
00
01
10
10
01
10
01
00
11
11
10
01
10
01
00
00
00
01
11
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
10
00
10
00
00
11
11
10
00
00
11
11
00
11
11
01
01
00
00
01
10
10
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
11
10
01
01
11
10
00
00
11
11
00
11
01
00
00
10
00
11
11
11
11
01
00
11
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
01
00
00
11
01
00
00
00
01
11
00
10
01
00
00
00
00
11
11
11
00
11
01
01
11
01
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
00
00
00
11
11
01
00
11
00
10
11
10
01
11
00
00
00
00
01
10
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
10
01
01
11
10
01
01
11
01
00
11
01
00
00
10
00
11
10
01
10
00
00
00
00
11
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
01
11
00
11
11
10
01
11
01
01
00
00
00
10
00
00
00
00
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
00
00
00
11
11
01
00
11
00
10
11
10
01
11
00
00
00
00
01
10
00
00
00
10
01
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
11
10
00
11
11
10
00
00
01
11
00
11
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
01
11
11
11
11
00
01
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
01
01
01
00
00
10
01
01
10
00
11
11
00
00
01
10
00
00
01
01
10
10
10
01
01
11
11
01
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
10
11
10
00
00
00
11
10
00
00
10
00
10
11
11
01
01
10
10
10
00
00
11
00
01
00
10
01
00
11
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
11
10
00
00
00
01
10
00
00
11
00
00
01
11
01
01
10
11
10
00
01
10
00
00
00
11
01
10
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
00
00
10
10
00
00
01
11
01
00
00
00
10
01
01
01
10
00
00
00
00
01
11
00
00
00
00
01
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
10
11
10
00
00
00
11
10
00
00
10
00
10
11
11
01
11
10
10
10
00
01
11
00
01
00
10
01
00
10
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
10
10
10
10
00
11
11
10
00
00
00
11
10
11
11
01
01
00
00
01
10
10
11
01
01
11
11
01
00
11
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
10
01
00
00
00
10
01
01
00
00
11
11
00
10
11
01
01
00
00
01
10
10
01
01
01
11
11
01
10
11
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
10
11
00
00
00
10
01
01
00
00
11
11
00
00
11
01
01
00
10
11
10
00
11
01
01
11
11
01
10
01
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
11
11
11
00
11
10
01
11
11
11
01
11
01
01
11
11
10
11
10
11
11
11
10
11
10
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
00
01
01
11
00
01
01
10
01
00
00
01
00
00
00
10
01
00
00
00
00
10
10
00
00
01
10
11
00
11
11
11
10
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
00
00
11
11
01
00
11
00
10
11
10
01
01
00
01
00
00
00
10
00
00
00
00
01
10
00
01
00
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
11
00
00
11
01
00
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
00
11
00
10
11
10
01
11
00
01
00
00
00
10
00
00
00
00
11
00
10
01
10
00
00
11
11
00
01
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
10
00
00
01
11
01
00
00
00
10
11
00
01
10
00
01
00
00
01
10
00
00
00
00
01
00
10
00
10
00
00
01
01
10
00
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
10
11
10
01
11
11
01
01
11
00
11
11
11
01
11
01
01
00
00
00
10
00
00
00
10
11
10
10
01
11
11
11
11
11
10
00
01
11
11
11
11
11
1
01
00
10
10
00
01
10
00
00
01
01
00
00
10
00
00
00
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
11
10
00
00
00
01
01
00
10
01
00
00
10
11
11
11
11
11
1
11
11
10
10
10
00
00
01
11
10
00
00
10
01
10
11
11
01
01
10
10
10
00
00
11
00
01
10
10
01
00
11
00
00
00
00
00
01
10
10
01
11
11
11
11
11
1
00
10
11
00
11
00
01
11
10
10
10
10
01
10
10
01
11
11
11
00
00
01
01
10
00
10
10
01
10
01
11
00
11
00
10
11
00
01
01
11
10
10
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
01
00
00
01
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
10
00
00
11
01
10
11
01
00
00
00
01
01
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
11
00
11
11
00
11
11
00
11
11
10
01
11
01
00
00
00
00
10
00
00
00
01
01
10
00
01
01
11
10
00
11
00
00
00
01
00
11
11
11
1
01
00
00
00
10
01
00
00
11
11
00
00
11
00
11
01
10
00
11
01
01
00
00
00
10
00
00
00
00
11
10
00
01
10
00
00
11
11
00
00
00
01
00
01
11
11
1
01
00
00
01
10
01
00
00
11
11
00
00
11
00
11
11
10
01
11
00
01
00
00
00
10
00
00
00
00
11
00
00
01
10
00
00
11
11
00
00
00
00
00
00
11
11
1
00
00
00
01
10
11
00
00
11
11
00
11
11
00
11
11
10
01
11
01
01
00
00
00
10
00
00
00
00
11
10
10
01
11
00
00
11
11
00
00
00
01
10
00
01
11
1
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
01
00
10
00
00
00
10
00
00
00
11
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
00
10
00
00
11
1
00
00
00
01
01
11
11
00
10
01
10
11
11
00
11
11
11
01
01
00
00
00
01
00
10
10
10
00
01
01
11
10
11
11
11
11
00
00
00
10
00
10
00
00
00
11
1
01
00
00
01
10
00
00
00
11
11
01
00
11
00
10
11
10
01
01
10
10
00
00
01
10
00
00
00
10
01
10
10
01
00
00
00
00
01
10
00
01
00
00
10
00
01
1 01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
01
01
00
00
00
01
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
00
10
01
11
11
00
10
01
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
10
01
01
10
00
00
11
01
10
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
00
00
00
00
01
10
00
11
00
11
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
00
00
00
01
00
00
11
00
01
10
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
10
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
00
00
00
01
00
00
11
00
11
10
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
10
00
01
00
00
01
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
00
00
00
00
01
10
00
11
00
01
10
00
10
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
01
00
00
00
11
00
10
10
01
00
00
01
00
10
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
01
10
01
01
11
00
00
01
01
00
10
00
01
01
01
10
10
01
00
11
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
01
00
11
00
01
00
00
10
01
01
01
00
10
10
01
00
11
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
10
00
00
10
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
01
11
11
10
00
01
11
01
11
10
11
11
11
10
10
01
11
11
11
10
10
11
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
01
10
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
00
10
01
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
10
01
01
10
00
00
01
01
00
10
00
00
01
01
00
10
01
00
11
01
01
00
00
00
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
01
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
00
10
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
11
11
00
11
11
11
10
01
11
10
11
10
11
11
11
10
11
10
01
01
10
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
01
10
00
01
11
11
10
00
10
00
11
10
00
00
01
00
10
11
00
10
00
01
11
01
01
00
11
10
00
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
10
00
01
10
00
00
00
00
11
10
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
00
00
00
00
01
10
00
10
00
00
10
00
10
00
00
00
11
00
10
00
01
01
00
00
01
11
11
11
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
00
00
00
00
01
10
00
11
00
00
10
00
10
00
01
00
01
00
10
00
01
01
00
00
00
00
11
10
10
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
10
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
00
10
10
00
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
11
11
11
11
10
11
01
10
11
11
11
11
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
10
11
11
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
00
10
00
00
01
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
00
00
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
01
00
00
00
01
00
00
10
01
00
01
01
00
11
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
10
10
00
10
01
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
00
00
00
01
00
00
11
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
10
00
01
10
00
00
00
00
11
10
10
01
00
00
00
00
00
00
10
01
01
11
11
11
11
1
10
01
10
11
01
01
10
00
11
01
00
10
00
01
01
01
00
10
01
00
11
01
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
01
01
10
10
10
01
11
10
01
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
10
10
00
10
00
00
00
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
01
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
10
00
00
10
00
00
10
00
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
00
00
00
10
00
00
00
00
01
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
10
10
00
10
00
00
00
00
00
01
1
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
10
00
01
10
00
00
00
00
11
10
00
01
00
00
00
00
00
00
10
01
00
10
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
01
10
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
01
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
11
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
11
01
11
11
01
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
10
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
01
00
00
11
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
01
11
00
11
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
10
00
00
10
01
00
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
10
10
10
11
00
01
11
11
10
10
10
10
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
01
10
01
11
11
10
11
11
11
11
11
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
11
00
10
00
00
00
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
00
00
10
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
10
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
10
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
10
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
11
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
10
10
01
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
10
10
00
00
11
10
10
00
00
00
01
00
10
10
10
00
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
11
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
10
10
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
10
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
01
10
00
00
11
01
00
00
00
00
01
00
10
00
10
01
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
10
00
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
00
01
10
00
10
01
11
11
11
01
11
00
00
11
11
01
01
10
01
10
00
11
11
11
11
00
01
11
10
00
01
00
10
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
01
10
00
00
11
01
00
00
00
00
01
00
10
00
10
01
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
11
01
00
00
11
01
10
00
01
00
01
00
10
00
01
01
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
10
10
01
00
01
10
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
10
01
00
00
00
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
10
10
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
11
1
00
00
10
00
01
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
1
00
00
00
00
01
11
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
10
00
10
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
1
Diagnosia( GFD( Kontrolak(
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
82
5. irudia. Erantzun koordinatua kuantifikatzeko asmoz eraikiriko korrelazio matrizeak (kitzikatu gabeko biopsia zati bakoitzarekiko adierazpen arrazoi aldaketen arteko korrelazioak). Lauki bakoitzak gene pare espezifiko batek aurkezten zituen aldaketen tamainen arteko korrelazioaren esangarritasuna (p balioa) adierazten du, estimulu ezberdinak jaso eta gero (PTG zein PTG eta Zren adizioa, hain zuzen ere). Zuriak, gris argiak, gris ilunak eta beltzak ondoko Pearsonen korrelazio p balioak adierazten dituzte, hurrenez hurren: >0,05, <0,05, <0,01 eta <0,001.
Azkenik, PTG estimuluak eragindako koadierazpen sinadura nabarmenenak identifikatu
ziren GFD pazienteetan eta kontroletan. PTG estimuluaren ostean, kontrolen taldean
(baina ez GFD taldean) adierazpen maila erlatiboen arteko korrelazio oso esangarriak
(p < 0,001) erakutsi zituzten gene pareak koadierazpen sinadura kontrol-‐espezifiko
modura aukeratu ziren. GFDz trataturiko pazienteetan, modu esklusiboan, adierazpen
maila erlatiboen arteko korrelazio oso esangarriak aurkeztu zituztenek, aldiz,
koadierazpen sinadura GFD-‐espezifikoa osatu zuten. PTG sinadura bakoitzean
bildutako geneen korrelazio matrizeak irudikatu ziren, PTG bidezko estimulupean ez
ezik, kitzikatu gabeko eta PTG-‐Z egoeretan ere (6. irudia).
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
00
00
10
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
01
01
00
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
01
01
11
00
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
11
10
00
10
11
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
01
01
00
00
10
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
11
10
00
00
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
01
00
11
00
11
10
01
11
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
11
11
00
11
11
11
00
01
01
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
11
00
11
11
11
00
11
11
11
00
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
00
00
00
00
11
10
01
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
10
00
00
00
01
10
00
00
01
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
01
00
01
10
01
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
01
01
00
01
10
01
00
00
00
00
10
00
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
01
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
01
11
01
11
00
11
00
01
00
00
00
00
01
00
01
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
10
10
11
11
01
11
11
11
11
11
01
10
01
01
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
01
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
10
00
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
11
00
01
01
10
00
11
00
10
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
10
00
01
00
10
00
00
00
10
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
10
01
00
00
10
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
11
00
11
11
01
00
01
10
11
00
11
10
10
01
10
00
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
11
10
01
10
11
11
10
00
11
11
00
11
10
10
00
10
00
11
01
11
10
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
01
11
01
11
11
11
00
01
11
01
00
00
10
10
01
00
00
10
00
01
11
00
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
00
01
10
01
00
01
01
01
00
10
11
00
10
00
01
10
00
00
10
00
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
01
10
00
00
01
01
11
00
10
01
00
11
00
10
10
11
01
00
00
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
10
00
00
00
00
10
00
00
00
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
10
00
00
00
00
10
00
00
00
11
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
10
01
00
00
10
00
00
00
00
11
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
10
00
00
00
11
10
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
10
10
00
00
00
00
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
10
00
00
00
01
10
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
10
10
00
00
00
00
10
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
01
11
01
11
10
11
00
01
01
00
00
00
10
10
01
00
00
00
00
00
11
00
11
00
01
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
10
00
00
00
01
10
00
00
01
00
01
00
00
00
11
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
11
01
00
11
11
11
00
11
11
11
00
11
11
10
01
10
11
11
01
01
11
11
10
00
00
01
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
00
00
10
01
11
00
00
10
00
11
10
01
10
10
00
01
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
10
00
01
01
10
00
00
00
10
00
00
00
00
11
10
00
00
00
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
10
01
10
01
10
00
00
11
11
00
11
00
10
00
11
00
11
01
11
11
11
10
00
00
11
11
00
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
10
00
01
01
10
00
00
00
10
10
00
00
00
11
10
00
00
00
10
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
10
00
01
00
10
00
00
00
10
00
00
00
00
11
10
00
00
00
00
10
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
01
10
00
00
00
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
10
00
00
00
10
00
00
00
00
11
10
00
00
00
00
11
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
01
00
01
00
01
00
00
00
00
10
01
11
11
00
00
10
00
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
10
00
00
00
00
10
00
00
00
11
10
00
00
00
00
10
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
01
10
00
00
00
01
01
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
11
01
10
00
00
00
11
01
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
10
00
01
10
00
00
01
00
01
11
10
00
11
00
10
10
00
00
01
11
11
10
00
00
10
11
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
01
10
00
00
00
01
01
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
00
00
10
00
00
10
00
00
00
11
01
10
00
00
00
11
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
11
10
00
00
11
00
00
00
01
01
00
11
00
10
00
00
00
11
01
01
10
11
11
00
01
00
11
00
00
00
00
01
10
11
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
01
10
01
00
11
10
00
11
01
00
00
00
01
10
01
00
10
10
00
01
01
00
11
00
00
00
11
11
00
00
11
11
01
10
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
11
10
01
11
11
10
00
11
01
01
00
11
01
10
01
00
11
10
01
01
11
10
11
00
00
01
11
11
00
00
11
11
01
11
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
1
01
11
00
01
00
11
00
01
10
01
00
10
00
00
10
01
11
11
00
00
10
00
00
00
00
10
10
00
00
11
00
10
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
10
00
10
11
01
11
11
01
10
11
11
11
10
01
11
10
01
01
11
01
11
11
10
01
00
01
01
11
10
01
10
11
11
01
11
01
11
00
01
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
11
10
00
00
11
00
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
11
11
10
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
10
00
01
10
01
00
01
00
01
10
00
00
11
00
00
00
00
00
00
10
10
10
00
00
10
00
00
00
00
00
01
01
00
01
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
11
10
00
00
00
00
10
01
00
00
00
00
10
01
11
00
01
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
10
00
01
01
10
00
00
00
10
10
00
00
00
11
11
10
00
00
10
11
01
00
00
00
00
00
00
01
11
00
01
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
10
00
00
00
00
10
00
00
00
11
10
00
00
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
10
00
01
01
10
00
00
00
10
10
00
00
00
11
10
00
00
00
10
10
01
00
00
00
00
00
00
11
01
00
00
01
11
11
1
00
10
00
01
00
11
00
01
01
11
00
10
00
10
11
00
00
10
11
01
01
00
10
11
00
00
00
01
00
11
00
00
01
00
10
01
11
11
10
00
00
10
01
00
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
10
10
00
00
10
00
01
00
10
00
00
00
00
10
00
00
00
11
01
10
00
00
00
10
01
00
00
00
00
00
01
00
11
00
00
00
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
11
10
00
00
11
00
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
11
10
00
00
10
10
00
00
00
10
00
00
00
00
11
01
00
00
10
11
1
00
00
01
10
11
00
10
00
11
10
01
00
11
00
00
00
00
01
11
10
00
00
00
00
01
11
00
01
10
00
01
01
00
00
01
10
00
00
01
00
10
01
00
00
10
01
1
01
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
00
00
11
10
10
00
00
10
01
01
00
00
00
00
00
00
11
11
00
00
00
00
01
1 11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
11
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
11
00
00
10
10
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
11
10
10
11
11
11
11
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
11
01
11
11
11
10
01
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
11
01
11
11
11
10
01
11
11
10
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
01
10
00
11
11
11
10
11
11
10
10
01
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
11
01
11
11
11
10
01
11
11
10
11
11
10
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
10
00
00
11
11
00
00
01
11
01
11
10
10
00
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
11
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
11
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
01
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
11
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
11
01
00
11
11
00
01
01
11
00
11
10
10
00
10
00
11
01
01
10
11
11
00
00
01
11
00
00
00
00
10
10
11
01
11
10
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
01
11
01
11
11
11
10
11
11
11
00
11
11
10
01
11
00
10
01
01
11
11
11
00
00
11
11
01
01
01
11
11
11
11
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
01
00
00
00
00
01
10
00
00
00
10
00
00
10
00
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
10
00
01
00
10
10
00
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
11
00
11
11
11
11
11
1
00
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
01
10
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
11
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
01
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
11
11
11
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
01
11
11
1
00
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
10
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
01
11
1
00
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
10
00
11
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
1
00
00
00
00
11
00
00
00
10
10
10
00
10
00
01
00
00
00
00
00
00
10
01
00
11
11
01
10
00
11
11
01
10
00
01
10
10
10
01
00
11
01
00
00
10
01
1
01
01
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
00
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
00
11
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
01
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
10
11
10
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
00
00
11
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
01
01
11
11
01
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
11
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
11
00
00
00
01
01
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
01
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
00
00
00
00
01
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
11
00
00
00
01
01
01
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
11
01
00
00
00
10
01
01
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
11
11
00
00
00
11
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
10
11
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
01
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
11
11
00
00
01
01
10
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
11
10
11
01
11
10
00
01
00
11
00
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
00
00
11
00
10
01
01
11
00
00
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
11
00
00
11
00
10
11
00
11
00
00
10
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
00
11
01
00
01
00
10
11
00
11
01
00
00
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
01
01
00
00
00
11
00
01
00
10
00
11
10
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
00
00
11
00
10
11
01
11
00
00
11
01
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
00
00
00
00
11
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
01
00
00
00
11
01
01
00
01
00
00
00
10
00
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
10
00
01
10
00
00
00
01
00
00
00
11
00
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
00
11
11
00
11
01
11
11
01
11
10
00
00
11
01
00
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
11
00
00
11
00
00
11
01
11
00
11
11
01
00
00
10
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
01
11
00
00
00
00
00
10
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
01
00
00
10
01
00
00
11
00
00
10
00
01
10
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
11
11
00
00
00
00
00
01
00
00
01
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
01
11
01
10
11
11
00
10
00
11
00
11
10
10
11
00
00
11
01
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
00
11
00
00
10
00
11
00
10
00
01
10
00
01
10
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
11
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
10
00
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
01
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
01
00
00
00
10
00
10
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
01
00
00
00
10
00
10
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
01
01
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
01
10
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
10
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
01
10
00
00
00
00
00
11
10
00
01
00
01
10
00
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
11
01
00
11
01
10
00
00
01
11
00
00
10
00
00
10
10
10
10
11
01
11
00
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
11
00
00
11
00
10
11
00
11
00
10
10
01
10
00
11
00
00
01
01
00
10
10
11
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
01
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
01
00
00
00
01
11
00
00
00
00
00
11
10
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
11
00
00
00
01
01
11
00
00
00
00
00
01
10
00
01
00
00
10
00
00
01
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
01
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
01
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
10
00
00
10
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
11
01
01
00
01
00
00
10
00
00
10
00
00
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
00
11
11
01
10
01
10
00
01
01
11
00
00
00
10
11
00
10
10
10
01
00
01
11
11
00
10
11
10
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
10
00
00
10
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
01
01
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
01
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
11
10
00
00
01
00
11
00
00
00
00
00
01
10
00
01
10
10
10
00
00
11
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
01
00
00
11
00
10
10
00
11
00
10
10
01
10
00
11
10
01
00
01
00
00
10
11
00
00
10
00
01
10
01
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
00
11
11
11
01
00
00
10
11
01
10
00
01
11
11
10
01
10
10
11
00
00
00
11
11
11
10
11
01
11
01
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
01
01
00
00
11
01
00
01
00
10
00
11
11
00
10
01
11
10
11
10
01
10
10
00
01
10
11
10
00
11
01
11
11
10
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
10
10
01
11
11
01
11
00
10
11
10
00
10
10
11
11
00
11
10
01
01
01
01
01
11
11
10
01
11
11
01
11
11
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
10
00
11
01
00
00
10
10
01
00
11
00
00
01
10
11
11
00
11
10
00
00
00
10
10
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
00
00
00
00
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
11
00
00
11
00
00
11
01
11
00
00
10
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
10
00
00
00
10
00
01
10
00
00
00
01
01
01
10
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
00
00
00
00
11
01
00
00
00
10
00
10
00
01
00
00
01
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
00
01
11
10
01
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
10
11
01
11
00
10
00
11
11
11
01
11
00
11
00
10
00
00
01
11
11
01
11
11
01
11
11
01
11
11
11
00
00
11
11
01
01
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
00
11
00
10
11
00
11
00
10
10
01
10
00
01
10
00
01
00
00
00
10
11
00
00
10
00
01
10
00
00
10
01
01
01
11
00
11
11
11
11
11
11
1
00
01
00
11
10
00
00
01
01
11
00
00
00
10
00
01
10
01
01
11
11
00
10
00
01
00
00
00
00
10
10
00
00
01
00
00
11
11
00
10
01
11
11
11
11
11
1
00
00
01
00
00
11
00
10
11
00
11
00
10
11
01
00
00
11
10
01
00
01
00
10
10
11
00
00
10
00
01
11
11
00
00
01
01
00
11
00
10
11
11
11
11
11
1
01
01
00
01
00
00
00
00
00
11
00
00
00
10
00
00
00
01
01
01
11
10
00
00
10
00
00
00
01
00
10
00
00
00
10
00
01
11
00
10
00
00
11
11
11
11
1
00
00
00
01
01
00
00
00
11
11
00
00
01
00
00
11
10
00
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
10
11
00
00
00
01
01
11
11
11
1
01
01
00
11
11
00
10
01
11
11
00
01
11
00
00
10
10
00
10
10
10
10
00
00
11
00
11
00
00
11
00
00
01
00
00
00
10
00
00
11
11
00
10
11
11
11
1
01
01
00
11
11
00
00
00
10
11
00
00
01
00
00
01
10
00
11
00
10
10
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
10
00
00
10
11
01
00
01
11
11
1
00
10
10
00
00
11
00
00
01
00
11
00
11
00
01
00
00
10
10
00
01
01
00
00
10
11
10
11
11
00
01
11
01
00
11
11
00
01
11
00
00
00
10
11
11
11
1
01
01
00
11
10
00
10
01
00
11
00
00
01
00
00
01
10
00
10
10
10
10
00
01
11
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
10
00
00
10
11
01
00
00
11
11
1
00
00
00
00
01
00
00
00
11
00
01
00
01
00
00
11
00
00
11
00
00
10
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
10
01
10
00
00
11
1
00
10
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
10
00
10
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
01
01
11
10
00
00
00
00
11
01
01
1
01
01
00
11
00
00
00
01
01
11
00
00
00
10
00
01
10
01
01
01
01
10
10
00
01
00
00
00
00
10
10
00
00
00
10
00
11
11
00
10
01
01
00
00
10
00
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
01
10
10
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
01
00
01
00
00
01
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
11
10
10
10
11
11
10
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
11
10
00
00
01
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
01
00
11
00
11
01
00
10
00
00
00
11
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
11
11
00
11
11
11
10
11
10
11
00
11
11
01
00
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
01
10
00
10
11
11
10
11
01
11
00
11
10
11
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
10
10
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
00
00
01
00
01
10
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
11
01
00
00
01
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
11
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
11
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
11
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
01
00
01
00
00
11
00
10
00
00
00
01
00
00
11
00
00
00
00
00
00
10
01
00
00
01
00
01
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
00
11
01
00
00
00
11
11
01
01
00
00
00
11
10
00
11
10
00
10
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
11
01
10
11
11
01
10
11
11
01
11
10
01
10
10
10
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
01
11
11
11
01
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
11
00
00
00
01
00
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
01
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
01
11
11
11
11
11
1
11
01
00
11
01
00
10
00
00
11
01
01
00
00
00
11
10
00
11
10
00
10
00
01
01
00
01
11
00
10
00
00
00
00
01
00
10
01
00
11
01
11
11
11
11
11
1
00
10
10
00
00
01
00
00
11
00
10
00
00
00
01
00
00
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
00
00
00
10
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
10
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
01
11
11
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
11
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
01
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
11
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
01
11
1
00
00
10
01
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
11
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
01
1
00
00
10
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
10
00
00
00
00
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
01
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
10
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
00
11
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
10
11
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
10
11
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
10
01
00
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
11
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
01
11
10
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
10
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
00
01
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
01
00
00
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
01
10
01
00
11
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
11
11
00
10
00
11
10
10
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
11
01
00
00
01
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
01
00
00
01
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
01
01
00
00
01
10
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
10
01
11
10
11
10
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
10
10
01
01
10
00
01
01
00
00
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
11
10
01
00
00
00
01
11
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
00
11
01
01
00
00
10
10
01
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
00
11
01
10
00
00
10
00
00
01
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
10
01
00
11
10
11
10
00
00
00
00
11
11
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
10
00
10
10
00
00
11
00
01
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
10
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
01
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
00
00
01
01
11
11
00
00
10
11
00
10
10
10
01
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
10
00
10
10
00
00
11
00
01
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
10
01
01
00
00
00
11
00
00
01
00
01
00
00
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
10
01
00
01
00
01
11
00
00
00
00
01
00
00
10
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
10
11
11
10
11
10
11
11
11
11
01
11
10
01
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
00
11
01
01
00
01
10
00
00
11
00
01
01
00
10
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
00
01
01
00
00
01
10
00
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
10
01
11
11
11
00
11
11
11
11
11
01
10
11
01
11
10
11
10
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
10
00
10
00
00
00
11
00
01
10
10
00
00
01
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
11
10
11
01
01
00
01
10
00
00
01
00
00
01
00
10
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
11
00
11
11
11
00
01
10
01
01
11
00
00
01
10
10
00
01
10
01
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
01
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
01
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
10
00
10
00
10
00
00
00
01
00
00
00
10
00
11
01
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
10
00
10
00
10
00
00
00
10
00
00
10
10
00
01
01
11
00
00
01
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
10
00
00
00
00
00
01
00
00
01
00
01
10
00
00
10
00
01
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
00
10
00
10
00
10
10
00
00
11
00
01
10
10
00
01
01
01
00
01
01
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
01
01
10
00
10
00
10
10
00
00
10
00
00
01
00
00
00
01
10
00
00
00
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
00
00
00
10
00
10
10
00
00
10
00
01
01
10
00
01
01
11
00
01
00
10
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
00
11
00
00
00
01
10
00
00
01
00
00
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
10
01
11
10
11
10
11
11
11
11
11
11
10
11
01
11
10
11
10
11
10
10
01
00
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
10
00
11
00
01
00
00
10
10
01
11
00
01
00
00
11
10
10
01
10
00
10
10
11
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
10
11
01
00
00
01
01
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
01
00
01
00
00
00
00
10
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
00
10
01
01
11
00
00
01
00
01
00
00
01
00
00
01
10
10
01
01
01
10
10
11
01
11
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
01
01
10
00
10
11
00
00
00
00
10
10
11
11
10
00
01
01
11
10
11
01
10
00
00
00
10
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
10
11
00
10
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
00
10
00
10
00
00
10
00
00
01
00
01
10
10
00
11
01
01
00
01
01
10
00
00
00
01
10
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
01
00
10
00
01
00
01
00
01
00
00
00
00
00
01
10
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
11
11
01
10
11
10
11
11
01
01
00
11
10
10
00
10
00
11
00
11
01
10
00
01
01
01
01
10
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
01
10
00
00
01
00
01
00
00
10
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
00
00
01
10
00
10
10
00
00
10
00
01
01
10
00
01
01
11
10
01
01
10
00
10
00
01
10
10
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
10
00
00
10
00
00
11
00
01
00
10
00
01
01
01
00
01
00
10
00
00
00
01
10
10
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
10
01
00
00
00
00
00
00
11
00
00
10
00
00
00
00
00
00
01
01
10
00
00
00
01
00
10
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
10
10
01
10
00
01
01
00
00
01
00
01
00
00
10
00
00
01
00
01
00
10
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
01
00
01
10
01
11
00
00
11
11
10
11
11
01
01
10
11
00
11
11
11
01
01
00
10
00
11
01
10
10
10
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
00
11
01
10
00
00
10
00
00
11
00
01
00
10
00
01
01
01
00
01
00
00
00
00
00
01
10
10
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
01
11
10
00
10
11
11
00
11
10
11
11
11
11
11
11
10
11
11
00
11
01
01
10
11
11
11
11
10
11
01
10
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
01
10
00
00
01
11
00
01
01
00
01
11
00
01
01
00
11
11
10
01
11
01
10
11
11
11
11
01
00
00
01
11
01
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
10
01
11
10
11
00
11
11
01
01
01
00
00
01
11
10
10
01
10
01
00
10
01
00
11
01
00
11
11
01
00
01
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
10
11
00
00
00
01
11
00
00
01
00
00
00
00
10
10
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
01
00
00
10
10
01
11
11
11
11
11
11
11
1
10
11
00
00
10
11
11
11
01
11
11
11
11
11
10
01
00
11
10
10
00
11
10
11
11
00
11
01
10
00
00
11
11
11
11
11
01
10
01
11
11
11
11
11
11
11
1
00
10
10
01
10
11
11
11
01
10
11
11
10
11
10
01
01
10
00
00
00
01
10
11
01
00
10
01
10
00
00
11
11
11
11
11
00
10
01
01
11
11
11
11
11
11
1
10
10
01
00
10
11
11
11
01
00
11
11
00
11
10
00
01
10
00
00
01
11
10
11
01
00
10
01
10
01
00
11
11
11
11
11
00
10
10
00
11
11
11
11
11
11
1
10
00
10
01
11
11
01
00
10
10
11
11
11
00
00
11
11
00
11
01
10
01
00
10
00
01
01
01
00
10
11
01
11
01
10
11
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
1
10
00
10
00
11
01
01
00
00
11
00
01
01
00
01
00
00
11
10
10
01
00
01
10
10
11
01
11
01
00
01
01
01
01
10
10
01
10
10
00
01
11
11
11
11
11
1
10
00
11
01
01
10
01
00
11
10
01
01
00
00
10
11
10
10
11
01
01
01
00
10
00
00
10
00
01
00
01
00
10
01
00
10
00
01
01
11
00
11
11
11
11
11
1
10
11
10
01
01
01
10
11
10
11
01
00
10
11
10
01
10
01
01
10
10
11
10
11
01
11
01
10
10
01
11
11
10
10
01
11
01
10
01
00
00
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
01
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
01
00
01
00
10
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
00
10
00
10
11
11
01
01
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
10
00
00
00
00
00
01
00
01
00
10
00
01
00
01
00
01
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
00
00
00
00
11
00
11
10
00
10
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
00
10
00
00
01
00
01
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
11
11
00
10
01
11
11
1
00
11
01
00
10
11
10
11
00
00
11
10
00
11
11
01
01
00
00
00
01
10
10
00
11
00
10
00
10
00
00
10
01
10
11
01
00
00
11
00
01
01
01
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
10
11
10
11
10
00
10
00
11
11
1
00
00
10
10
11
01
00
00
01
11
00
00
01
00
01
00
00
10
10
00
01
00
01
00
00
01
01
10
01
00
01
00
00
01
00
00
10
10
00
00
01
00
10
00
00
11
1
11
00
10
01
10
11
10
00
10
01
11
11
11
01
10
11
11
01
10
11
10
01
00
00
01
11
11
11
00
11
11
11
11
10
11
01
11
01
00
00
00
10
01
11
11
11
1
00
11
10
10
01
01
00
00
00
11
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
01
00
10
10
10
00
00
01
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
10
00
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
01
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
01
10
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
11
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
00
00
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
11
00
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
01
01
10
00
00
00
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
00
00
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
11
00
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
01
10
00
00
00
01
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
10
00
00
00
00
01
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
01
11
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
11
01
00
00
01
00
10
00
01
01
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
00
11
00
11
00
01
00
11
00
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
11
10
11
11
11
11
01
11
11
01
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
01
00
10
01
01
11
11
10
10
01
11
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
10
10
11
11
11
11
00
10
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
00
01
10
00
00
10
01
00
00
01
00
10
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
10
11
00
11
11
11
10
10
11
11
10
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
01
11
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
11
10
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
10
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
11
00
00
11
01
11
01
10
00
10
11
11
10
00
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
11
00
00
00
10
00
00
00
00
00
10
11
10
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
01
11
10
00
01
10
00
01
01
11
01
00
00
01
00
01
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
01
11
00
00
01
11
10
01
01
11
01
01
11
11
01
01
01
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
11
00
11
00
11
00
11
00
01
01
01
10
00
11
10
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
00
11
00
00
00
10
00
00
00
00
00
10
10
00
10
01
01
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
10
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
11
00
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
01
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
10
10
01
00
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
01
01
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
10
00
10
00
01
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
10
10
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
10
11
10
01
00
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
01
00
00
00
00
11
00
00
00
01
00
00
11
00
10
01
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
01
10
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
10
11
10
01
00
10
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
11
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
10
00
10
00
01
10
00
00
10
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
10
10
01
00
10
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
01
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
10
00
01
00
10
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
11
00
00
00
00
11
00
01
00
00
00
00
11
11
00
01
00
00
00
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
10
00
01
10
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
11
01
11
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
11
10
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
10
00
00
01
10
10
00
00
10
00
11
11
10
10
01
00
11
00
01
01
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
01
10
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
10
10
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
10
00
11
00
01
00
01
00
01
00
01
00
01
10
00
01
00
10
00
01
10
00
00
10
00
00
00
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
01
01
00
01
10
10
00
10
10
00
11
11
11
10
01
01
10
10
11
01
01
00
10
10
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
00
01
00
00
00
11
01
00
00
01
00
00
10
00
10
01
00
00
00
00
10
00
00
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
10
00
00
01
10
11
00
00
01
11
01
01
10
10
00
00
11
11
00
00
01
00
10
10
01
10
01
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
01
01
00
00
00
01
01
00
00
10
10
00
01
01
01
00
01
01
11
10
10
01
01
00
00
10
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
00
00
10
10
00
10
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
11
10
10
01
01
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
00
00
00
11
10
10
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
10
01
00
00
00
00
10
01
00
00
01
10
10
10
00
11
01
01
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
01
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
10
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
00
00
01
10
00
00
01
00
01
00
01
00
00
00
00
10
01
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
01
10
00
00
00
11
00
00
00
00
00
01
10
11
10
01
00
11
00
00
00
01
00
00
00
01
01
10
00
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
01
10
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
01
11
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
01
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
00
00
01
10
00
10
01
00
11
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
11
01
00
11
10
10
00
10
10
00
11
11
11
10
00
01
00
10
11
01
01
10
10
10
11
01
10
00
00
10
01
00
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
01
01
11
00
00
00
11
10
00
00
00
00
00
10
01
10
00
01
10
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
01
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
10
10
00
11
10
00
01
10
11
10
10
01
00
11
10
00
01
11
01
11
01
01
10
10
01
10
00
01
00
01
00
00
10
11
01
01
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
11
10
10
11
10
11
00
00
01
10
01
01
00
11
00
00
11
10
00
01
01
01
10
10
01
11
11
01
10
00
00
00
00
10
01
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
01
11
00
00
00
11
00
00
00
01
00
10
11
10
10
00
01
10
00
00
10
00
00
00
01
00
10
01
00
00
01
10
00
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
00
11
11
00
00
10
00
00
00
01
01
00
00
00
01
11
00
00
10
00
10
00
00
01
00
01
11
00
10
10
01
10
00
00
10
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
1
10
10
01
01
11
11
00
11
01
10
00
10
00
00
01
00
01
00
00
00
01
11
10
01
11
10
10
00
11
01
10
10
01
10
01
01
00
10
11
11
11
11
11
11
11
11
1
00
00
00
01
00
00
00
00
01
00
00
10
10
00
00
01
00
00
00
01
10
00
00
00
00
00
00
00
00
01
10
00
00
00
01
00
00
11
01
01
11
11
11
11
11
11
1
00
10
00
01
11
00
00
00
00
10
00
10
10
00
01
01
10
10
00
01
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
01
01
00
11
11
11
11
11
11
1
00
00
10
01
01
10
00
00
00
01
00
00
01
10
10
00
10
10
10
01
10
01
00
10
00
00
00
01
00
10
01
00
00
01
11
00
11
00
01
10
01
11
11
11
11
11
1
01
00
11
01
11
00
01
00
01
00
00
01
01
00
00
00
00
10
11
00
00
00
00
10
00
00
10
01
00
10
01
00
00
01
00
00
11
00
00
11
00
11
11
11
11
11
1
01
10
00
00
11
01
00
11
10
10
00
10
10
00
10
11
11
10
01
01
00
00
11
01
01
10
10
10
10
01
10
00
01
10
01
01
00
01
11
00
01
11
11
11
11
11
1
01
11
10
00
11
10
00
11
10
00
10
10
11
11
01
10
00
01
11
01
11
01
11
10
10
11
10
11
11
10
01
00
00
10
11
01
11
00
11
11
00
11
11
11
11
11
1
00
00
01
10
00
00
10
00
01
00
01
00
00
00
01
01
11
00
00
10
01
10
01
00
01
00
01
10
01
01
10
00
01
00
00
10
10
11
10
11
11
01
11
11
11
11
1
01
00
00
00
10
00
00
00
10
00
00
00
00
00
10
10
00
10
01
00
10
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
01
11
11
11
1
01
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
11
10
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
10
00
10
00
01
10
01
11
11
1
00
00
00
01
01
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
01
10
10
00
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
00
00
00
01
00
00
01
01
00
00
10
01
00
11
11
1
01
00
01
10
00
00
00
00
01
00
00
00
00
00
01
01
11
00
00
00
01
10
00
00
01
00
00
10
01
01
10
00
01
00
00
00
00
11
10
10
11
10
10
00
11
11
1
01
00
11
01
10
00
00
00
01
00
00
00
01
00
00
01
10
10
01
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
10
01
00
00
00
00
00
10
10
00
10
00
01
10
00
00
11
1
10
00
11
01
01
00
01
00
11
00
00
00
01
10
00
11
10
10
00
01
10
00
00
10
00
00
00
01
00
10
01
00
00
01
10
00
11
10
00
10
00
01
11
00
01
01
1
01
10
00
10
10
01
00
01
10
10
00
10
10
00
11
11
11
10
01
00
11
00
11
01
01
00
00
10
01
01
10
00
01
00
00
00
00
01
11
00
01
10
10
00
00
11
1
FC#4h#PTG## FC#4h#PTG)Z##
Diagnosia#
GFD#
Kontrolak#
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
83
6. irudia. Gene pareen koadierazpen matrizeak estimulu ezberdinen ostean (kitzikatu gabeak, PTG eta PTG-‐Z), a) kontroletan eta b) GFD taldean, PTG bidezko kitzikapenaren ostean eratutako koadierazpen sinadura espezifikoak irudikatuz (kutxa grisak). Lauki txiki bakoitzak gene pare espezifiko baten adierazpen maila erlatiboen arteko korrelazioaren p balorea adierazten du. Zuriak, gris argiak, gris ilunak eta beltzak ondoko Pearsonen korrelazio p balioak adierazten dituzte, hurrenez hurren: >0,05, <0,05, <0,01 eta <0,001.
PTG estimuluaren osteko sinadura kontrol-‐espezifikoa askoz ere egonkorragoa zen
baldintza guztietan, eta korrelazio indartsua behatu zen kontroletan, kitzikatu gabeko
biopsietan zein PTG-‐Z estimulupean, gene hauen kasuan, korregulazioak NFκB
bidezidorraren modulazioarekiko menpekotasun txikiagoa duela iradokiz. GFD
pazienteen kasuan, aldiz, gene talde honen korrelazioa txikiagoa zela ikusi zen, Zk
zenbait gene pareren arteko koadierazpena nolabait berrezarri zezakeela ikusi bazen
ere. Bestetik, sinadura GFD-‐espezifikoa osatu eta paziente tratatuetan nabarmenki
koadierazten ziren geneek ez zuten talde kontrolean inolako korrelaziorik aurkeztu,
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
10
11
11
11
11
11
11
11
11
10
01
11
11
11
11
11
11
11
10
00
11
11
11
11
11
11
11
10
00
01
11
11
11
11
11
11
01
01
10
11
11
11
11
11
11
01
01
11
01
11
11
11
11
11
01
11
11
00
11
11
11
11
11
01
11
10
00
01
11
11
11
11
01
10
11
00
00
11
11
11
11
01
11
11
00
00
01
11
11
11
01
11
11
00
00
00
11
11
11
01
01
11
00
01
00
01
11
11
00
11
10
00
00
00
00
11
11
00
11
11
00
00
00
00
01
11
00
10
01
00
00
00
00
00
11
00
11
11
00
00
00
00
00
01 11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
00
10
11
11
11
11
11
11
11
00
00
01
11
11
11
11
11
11
01
00
00
11
11
11
11
11
11
00
01
10
01
11
11
11
11
11
00
00
10
00
11
11
11
11
11
00
00
00
00
01
11
11
11
11
00
00
10
00
00
11
11
11
11
00
01
10
00
00
01
11
11
11
01
00
10
00
00
00
11
11
11
00
00
10
00
00
00
01
11
11
00
01
10
00
00
00
00
11
11
00
00
10
00
00
00
00
01
11
01
00
10
00
00
00
00
00
11
01
01
10
00
00
00
00
00
011
11
11
11
11
11
11
11
11
1
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
01
00
11
11
11
11
11
11
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
11
00
00
11
11
11
11
11
11
01
00
00
01
11
11
11
11
11
11
00
00
00
11
11
11
11
11
11
00
00
00
01
11
11
11
11
11
00
00
00
00
11
11
11
11
11
00
00
00
00
01
11
11
11
10
00
00
00
00
00
11
11
11
01
00
00
00
00
00
01
11
11
11
00
00
00
00
00
00
11
11
11
00
00
00
00
00
00
01
11
01
00
01
00
00
00
00
00
11
11
00
00
00
00
00
00
00
01
a)#
b)#
11
11
11
11
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
00
01
11
11
11
11
11
00 0
,10
11
11
11
11
11
00
00
01
11
11
11
11
0,20,1
0,10,2
0,10,1
11
11
11
11
00
00
00 0
,11
11
11
11
00
00
00 0
,10
11
11
11
00
00
00
00
01
11
11
00
00 0
,30 0
,20 0
,10
11
11
0 0,10,3
00
0 0,40,1
0 0,10,3
11
1
00
00 0
,10 0
,30
00
00
11
00
00 0
,10 0
,20
00
0 0,2
011
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
0 0,10,1
11
11
11
11
11
1
0 0,50,5
0,11
11
11
11
11
1
00
00 0
,21
11
11
11
11
0,90,4
0,80,9
1 0,9
11
11
11
11
00
0 0,10,4
0 0,9
11
11
11
1
00
0 0,20,2
0 0,4
01
11
11
1
0,70,4
0,30,6
0,90,4
0,50,4
0,11
11
11
00
00 0
,10 0
,40
0 0,5
11
11
0,10 0
,20 0
,60,2
0,30,2
0,40,7
0,21
11
00
00 0
,10 0
,80
0 0,9
0 0,4
11
00
0 0,10,3
0 0,6
00 0
,20 0
,20
111
11
11
11
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
00
01
11
11
11
11
11
00
00
11
11
11
11
11
00
00
01
11
11
11
11
00
01
00
11
11
11
11
00
00
00
01
11
11
11
00
00
00
00
11
11
11
00
00
00
00
01
11
11
00
00
00
00
00
11
11
00
00
00
00
00
01
11
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
01
11
11
11
11
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
00
01
11
11
11
11
11
00
00
11
11
11
11
11
00
00
01
11
11
11
11
00
00
00
11
11
11
11
00
00
00
01
11
11
11
00
00
00
00
11
11
11
00
00
00
00
01
11
11
00
00
00
00
00
11
11
00
00
00
00
00
01
11
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
011
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
00
01
11
11
11
11
11
00
00
11
11
11
11
11
00
00
01
11
11
11
11
00
00
00
11
11
11
11
00
00
00
01
11
11
11
00
00
00
00
11
11
11
00
00
00
00
01
11
11
00
00
00
00
00
11
11
00
00
00
00
00
01
11
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
011
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
00
01
11
11
11
11
11
00
00
11
11
11
11
11
00
00
01
11
11
11
11
00
00
00
11
11
11
11
00
00
00
01
11
11
11
00
00
00
00
11
11
11
00
00
00
00
01
11
11
00
00
00
00
00
11
11
00
00
10
00
00
01
11
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
01
GFD#
Kontrolak#
es#mulurik*ez* PTG* PTG/Z*
11
11
11
11
11
11
11
11
11
01
11
11
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
00
01
11
11
11
11
11
11
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
00
00
01
11
11
11
11
11
11
00
00
00
11
11
11
11
11
11
00
00
00
01
11
11
11
11
11
00
00
00
00
11
11
11
11
11
00
00
00
00
01
11
11
11
11
00
00
00
00
00
11
11
11
11
00
00
00
00
00
01
11
11
11
00
00
00
00
00
00
11
11
11
00
00
00
00
00
00
01
11
11
00
00
00
00
00
00
00
11
11
00
00
00
00
00
00
00
01
11
00
00
00
00
00
00
00
00
11
00
00
00
00
00
00
00
00
01 1
11
11
11
11
11
11
11
11
1
01
11
11
11
11
11
11
11
11
00
11
11
11
11
11
11
11
11
00
01
11
11
11
11
11
11
11
00
00
11
11
11
11
11
11
11
00
00
01
11
11
11
11
11
11
0 0,10 0,1
0,10,1
11
11
11
11
11
11
00
00
00
01
11
11
11
11
11
00
00
00 0,1
01
11
11
11
11
1
00
00
00
00
01
11
11
11
11
00
00
00
00
00
11
11
11
11
0 0,10 0,1
0,10,1
0 0,10,1
0,10
11
11
11
1
0 0,20 0,1
0,10,1
00 0,1
00
01
11
11
1
0,20,2
0,20,2
0,20,2
0,20,2
0,30,2
0,20,4
0,31
11
11
00
00
00
00
00
00
0 0,11
11
1
00
00
00
00
00
00
0 0,30
11
1
00
00
00
00
00
00
0 0,20
01
1
00
00
00
00
00
00
0 0,30
00
1111111111111111111
011111111111111111
001111111111111111
100111111111111111
000011111111111111
000101111111111111
000000111111111111
000100011111111111
010001001111111111
010001000111111111
000100000011111111
010101000001111111
000000000000111111
011010110111111111
000100000100011111
000100000000010111
000000000000010011
000000000000010001
GFD#
Kontrolak#
CD83%CSF3%CXCL1%
IER3%IL6%IL8%NFKB2%
NFKBIA%
PTGES%
PTGS2%
REL%RELA%RELB%SELE%TNFAIP3%
TNFRSF10B%
TRAF1%
VCAM
1%
CD83%CSF3%CXCL1%
IER3%IL6%IL8%NFKB2%
NFKBIA%
PTGES%
PTGS2%
REL%RELA%RELB%SELE%TNFAIP3%
TNFRSF10B%
TRAF1%
VCAM
1%
CD83%CSF3%CXCL1%
IER3%IL6%IL8%NFKB2%
NFKBIA%
PTGES%
PTGS2%
REL%RELA%RELB%SELE%TNFAIP3%
TNFRSF10B%
TRAF1%
VCAM
1%
CD83%CSF3%CXCL1%
IER3%IL6%IL8%NFKB2%
NFKBIA%
PTGES%
PTGS2%
REL%RELA%RELB%SELE%TNFAIP3%
TNFRSF10B%
TRAF1%
VCAM
1%
CD83%CSF3%CXCL1%
IER3%IL6%IL8%NFKB2%
NFKBIA%
PTGES%
PTGS2%
REL%RELA%RELB%SELE%TNFAIP3%
TNFRSF10B%
TRAF1%
VCAM
1%
CD83%CSF3%CXCL1%
IER3%IL6%IL8%NFKB2%
NFKBIA%
PTGES%
PTGS2%
REL%RELA%RELB%SELE%TNFAIP3%
TNFRSF10B%
TRAF1%
VCAM
1%
CREB1%
CREBBP%
CSF1%IKBKG%
IRAK1BP1%
MAP3K7%
MAP3K7IP1%
NKIRAS1%
NOS2%TLR
1%TLR
9%TNF%TRAF5%
NKIRAS1%
CREB1%
CREBBP%
CSF1%IKBKG%
IRAK1BP1%
MAP3K7%
MAP3K7IP1%
NKIRAS1%
NOS2%TLR
1%TLR
9%TNF%TRAF5%
NKIRAS1%
CREB1%
CREBBP%
CSF1%IKBKG%
IRAK1BP1%
MAP3K7%
MAP3K7IP1%
NKIRAS1%
NOS2%TLR
1%TLR
9%TNF%TRAF5%
NKIRAS1%
CREB1%
CREBBP%
CSF1%IKBKG%
IRAK1BP1%
MAP3K7%
MAP3K7IP1%
NKIRAS1%
NOS2%TLR
1%TLR
9%TNF%TRAF5%
NKIRAS1%
CREB1%
CREBBP%
CSF1%IKBKG%
IRAK1BP1%
MAP3K7%
MAP3K7IP1%
NKIRAS1%
NOS2%TLR
1%TLR
9%TNF%TRAF5%
NKIRAS1%
CREB1%
CREBBP%
CSF1%IKBKG%
IRAK1BP1%
MAP3K7%
MAP3K7IP1%
NKIRAS1%
NOS2%TLR
1%TLR
9%TNF%TRAF5%
NKIRAS1%
es#mulurik*ez* PTG* PTG/Z*
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
84
!
! !qMAMBA!
!Pirosekuentziazio!konbentzionala!
Genea%%
Ekuazioa!! R²!!
Ekuazioa!! R²!
MALT1&&
y!=!0.0003x3!(!0.0248x2!+!0.8973x!+!0.5938! 0.9786! ! y!=!6E(06x3!+!0.0033x2!+!0.5615x!+!0.9619! 0.9916!MAP3K7&
&y!=!0.0001x3!(!0.0099x2!+!0.6164x!+!4.3937! 0.9850!
!y!=!(0.0001x3!+!0.0103x2!+!0.9585x!+!4.2774! 0.9971!
MAP3K7IP1& & y!=!(4E(05x3!+!0.0128x2!(!0.0651x!+!6.5554! 0.9971!!
y!=!(6E(05x3!+!0.0078x2!+!0.6269x!+!2.3469! 0.9949!MAP3K14&
!y!=!(1E(04x3!+!0.0139x2!+!0.2344x!+!3.9821! 0.9804!
!y!=!4E(05x3!(!0.0032x2!+!0.8614x!+!0.9004! 0.9967!
NFKBIA&!
y!=!0.0002x3!(!0.0127x2!+!0.5878x!+!1.1887! 0.9897!!
y!=!4E(05x3!(!0.0026x2!+!0.7626x!+!1.9725! 0.9970!RELA&
!y!=!0.0002x3!(!0.0209x2!+!0.7137x!(!1.2237! 0.9911!
!y!=!1E(05x3!+!0.0032x2!+!0.514x!+!1.8647! 0.9980!
TNFAIP3&!
y!=!0.0002x3!(!0.0203x2!+!0.6534x!+!1.399! 0.9908!!
y!=!(6E(06x3!+!0.0041x2!+!0.5734x!+!2.2256! 0.9979!TRADD&
!y!=!0.0001x3!(!0.0075x2!+!0.5968x!+!3.032! 0.9902!
!y!=!(1E(04x3!+!0.0165x2!+!0.2354x!+!3.2855! 0.9902!
zeliakoetan, gliadinaren esposizio akutuaren ondorioz, NFκB bidezidorraren zenbait
generen alterazio koordinatua gertatzen dela azaleratuz. Kontroletan behatu zen
koadierazpen falta honetan, zenbait salbuespen aurkitu zen. Izan ere, CXCL1, IER3, IL6
eta IL8 berauen artean korregulatuta ageri ziren, gliadinaren estimuluari jarraiki,
indibiduo ez zeliakoetan aktibazio kontrolatu baina esangarria gertatzen dela iradokiz.
Berriro ere, Zk, PTGk induzituriko koadierazpena partzialki leheneratu zuen, biopsia
kitzikatu gabeetan behatutako mailetara hurbilaraziz; kontrolek, bestetik, biopsia
kitzikatu gabeek aurkeztutako korrelazioen antzeko erlazioak eratu zituzten.
3.3. Erregresio kubikoan oinarritutako zuzenketa mailak qMAMBAren
errendimendua aurresaten du
DNA genomikoaren pirosekuentziazio konbentzionala eta qMAMBA tekniken
errendimenduak konparatu genituen DNA metilazio kurba baten bidez (%0, %12,5,
%25, %37,5, %50, %62,5, %75, %87,5 eta %100 metilatutako giza DNA), horretarako
ondoko geneetan kokaturiko zortzi PyroMark entsegu desberdin erabiliz: MALT1,
MAP3K7, MAP3K7IP1 (TAB1), MAP3K14, NFKBIA, RELA, TNFAIP3 eta TRADD. Lehenago
esan bezala, gene hauek NFκB eta TLR erantzunetan duten funtzio erregulatzaile eta
zentrala dela eta, eta inflamazioarekin zein autoimmunitatearekin erlazionatuta
egoteagatik aukeratu ziren. Bederatzi puntuko kurba polinomiko kubikoak eraiki ziren
gene bakoitzaren emaitzak baliatuz, kurbako metilazio balio errealak x ardatzean eta
esperimentalki, PyroMark Q24 softwarearekin, lorturiko balioak y ardatzean kokatuz.
Kurba guztiak ekuazio polinomiko kubikoetan ondo doitu ziren (R2 > 0,975) (3. taula).
3. taula. Ekuazio polinomiko kubikoak eta korrelazio koefizienteak (R2) gene eta metodoko.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
85
Emaitza esperimental bakoitzeko, x ebatzi zen anplifikazio alborapena zuzentzeko, eta
estimazio berriek 1etik oso gertu zeuden b balioak aurkeztu zituzten, ekuazio kubiko
bidezko zuzenketa metodoaren efizientzia frogatuz (Moskalev et al., 2011), bereziki
emaitza gordinekin konparatuta (4. taula). Estimatutako balioak balio errealen kontra
irudikatu zirenean, erregresio linealek kointzidentzia handia aurkeztu zuten y = x lerro
zuzenekiko (7. irudia) eta puntuak funtzioan ondo doitzen zirela ikusi zen, korrelazio
koefizienteek adierazten duten moduan (4. taula), batez ere, pirosekuentziazio
konbentzionala erabili zen kasuetan.
4. taula. b balioak (zuzenduak eta gordinak), balio errealen eta estimazioen arteko errore karratuen batuketak eta erreplika arteko aldagarritasun koefizienteak gene eta metodoko, 9 puntuen bataz besteko eta desbideraketa estandar modura adierazita.
Estimazioak balio errealen kontra irudikatzean lortutako erregresio linealen korrelazio
koefizienteak 0,99 baino altuagoak ziren entseguetan (4. taula), elkarren alboan
zeuden metilazio kurbaren puntuak erraz ezberdindu zitezkeen. Pirosekuentziazio
konbentzionalaren kasuan, hau 7/8 entsegutan gertatu zen, baina qMAMBAren
kasuan, soilik bitan. Korrelazio balio baxuagoko entseguetan, elkarren alboan zeuden
Gene Hurbilketa esperimentala b gordina zuzenketa osteko b
Akats karratuen batuketa
Bataz besteko
AK R2
MALT1 qMAMBA 0,25±0,12 1,01±0,61 603,68 0,15±0,16 0,9410
PIROSEKUENTZIAZIOA 0,55±0,12 0,97±0,22 100,35 0,10±0,15 0,9886
MAP3K7 qMAMBA 0,48±0,22 1,00±0,30 224,42 0,24±0,13 0,9719
PIROSEKUENTZIAZIOA 1,71±0,41 1,00±0,21 78,12 0,07±0,05 0,9955
MAP3K7IP1 qMAMBA 0,42±0,12 1,02±0,20 26,35 0,11±0,14 0,9960
PIROSEKUENTZIAZIOA 0,78±0,23 0,96±0,19 44,71 0,08±0,10 0,9948
MAP3K14 qMAMBA 0,63±0,25 1,17±0,42 278,96 0,07±0,10 0,9690
PIROSEKUENTZIAZIOA 0,67±0,19 0,96±0,22 34,17 0,09±0,11 0,9961
NFKBIA qMAMBA 0,25±0,07 0,95±0,32 327,06 0,08±0,12 0,9654
PIROSEKUENTZIAZIOA 0,67±0,14 1,02±0,14 30,96 0,03±0,04 0,9964
RELA qMAMBA 0,18±0,06 0,98±0,28 196,92 0,07±0,04 0,9747
PIROSEKUENTZIAZIOA 0,62±0,06 1,02±0,10 18,49 0,04±0,03 0,9979
TNFAIP3 qMAMBA 0,20±0,09 0,98±0,27 483,03 0,10±0,05 0,9555
PIROSEKUENTZIAZIOA 0,70±0,12 1,00±0,10 21,94 0,04±0,05 0,9975
TRADD qMAMBA 0,44±0,12 0,95±0,19 62,28 0,08±0,05 0,9933
PIROSEKUENTZIAZIOA 0,77±0,11 1,01±0,12 17,09 0,06±0,04 0,9971
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
86
diluzio kurbako zenbait puntuk (%12,5eko DNA metilazio diferentziaz) estimazio
antzekoak izan zituzten eta ezin izan ziren modu egokian bereizi, 7. irudian ageri
bezala.
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
MALT1& MAP3K7& MAP3K7IP1&
MAP3K14& NFKBIA& RELA&
TNFAIP3& TRADD&
qMAM
BA"
Pirosekuentziazio
konbentzionala"
qMAM
BA"
Pirosekuentziazio
konbentzionala"
qMAM
BA"
Pirosekuentziazio
konbentzionala"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
0"
20"
40"
60"
80"
100"
0" 20" 40" 60" 80" 100"
R2=0,9410" R2=0,9960"R2=0,9719"
R2=0,9961" R2=0,9979"R2=0,9964"
R2=0,9975" R2=0,9971"
R2=0,9886" R2=0,9948"R2=0,9955"
R2=0,9690" R2=0,9747"R2=0,9654"
R2=0,9555" R2=0,9933"
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
87
7. irudia. Alborapen maila eta zuzenketa esperimentuko. Grafiko guztietan, x ardatzek metilazio errealaren balioak adierazten dituzte. y ardatzek, bestetik, balio esperimentalak (erronbo eta lauki beltzak) eta estimazioak (hiruki grisak) adierazten dituzte. Kurba polinomiko kubiko bakoitza erreplika esperimental baten emaitzei dagokio (erronboak), gehienetan, alelo ez metilatuen lehentasunezko anplifikazioa aurkeztuz (b < 1, MAP3K7 genearen kasuan salbu, pirosekuentziazio konbentzional bidez aztertzen denean). Hiruki grisek balio errealak eta ekuazio kubikoetan oinarrituriko zuzenketa osteko estimazioak irudikatzen dituzte, eta modu egokian doitzen dira x = y erregresio linealera (marra etena). Lerro zuzenen korrelazio koefizienteak agertzen dira esperimentuko.
Errore karratuen batuketak balio errealen eta estimazioen arteko desberdintasun
metatuak kuantifikatzeko erabili ziren, gene eta teknika ezberdinetan. Orokorrean,
errore karratuen batuketa balioak nabarmenki altuagoak izan ziren qMAMBA
emaitzetan. Bestalde, aldakortasun koefizienteek (AK) eta berauen desbideraketek
qMAMBA teknikak aldakortasun handiagoa eragiten duela erakutsi zuten (4. taula).
3.4. Promotoreen metilazio maila alteratu eta partzialki itzulgarriak CD
aktiboan
Gaixo aktibo eta tratatuen eta kontrolen arteko DNA metilazio mailen arteko
konparaketak egin ziren, aukeratutako gene zerrendan. Horretarako, pirosekuentziazio
konbentzionala erabili zen, teknika honen errendimendua qMAMBArena baino
sendoagoa zela ikusi eta gero. Bataz besteko metilazio maila kalkulatu genuen (metilo
talde bat aurkezten duten DNA molekulen ehunekoa). Gene bakoitzean 4-‐6 CpG
posizio aztertu genituen. Azterturiko 8 geneetako lautan, ezberdintasunak ikusi
genituen zeliako aktiboak eta kontrolak konparatzerakoan. Paziente tratatuek erdi
mailako metilazio mailak aurkeztu zituzten, estatus aktiboan ageri zen joeraren
itzulgarritasun partziala iradokiz. RELA salbuespen izan zen; izan ere, aldaketak
esangarriak izaten jarraitu zuten GFD bidezko tratamenduaren ostean (8. irudia).
MALT1, MAP3K7 eta TRADD geneek metilazio maila altuagoak aurkeztu zituzten
gaixotasun aktiboan, eta RELAk kontrako joera zuela behatu zen. LINE-‐1 elementuek,
ordea, ez zuten taldeen arteko ezberdintasunik agertu.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
88
8. irudia. Taldeen artean estatistikoki esangarriak diren bataz besteko metilazio ezberdintasunak ageri dituzten NFκBrekin erlazionatutako geneak. Zirkulu beltz eta txuriek CD aktibo eta tratatuak adierazten dituzte, hurrenez hurren, eta erronboek kontrol ez zeliakoak; y ardatzetan metilazio balioak daude (%tan adierazita), bataz besteko balioak eta desbideraketa estandarrak ageri dira talde bakoitzeko.
3.5. Kometilazio eta koadierazpen sareak
Pearsonen korrelazio testa metilazio eta adierazpen emaitzetan aplikatu zen
aukeratutako 8 geneetan, gene arteko korrelazio posibleak identifikatzeko, metilazio
zein adierazpen mailan. Gene ezberdinen metilazio mailak aztertu zirenean, korrelazio
esangarriak behatu ziren berauen artean paziente zeliakoetan, baina ez zen
horrelakorik ikusi kontroletan zein LINE-‐1 elementuetan (9. irudia). Hala ere,
koadierazpenaren kasuan, kontroletan erlazio indartsu eta esangarriagoak behatu
ziren, batez ere korrelazio hauek gaixo aktiboen taldean eratutakoekin
konparatzerakoan. Paziente aktiboetan, zenbait koadierazpen lotura agertzen bazen
ere, hauek askoz ere ahulagoak ziren eta maiztasun txikiagoz ageri ziren. Orokorrean,
0
10
20
30
p = 0.0189
MALT1
0
10
20
30
p = 0.0043
MAP3K7
0
10
20
30
p = 0.0222
p = 0.0016
RELA
0
10
20
30
p = 0.0352
TRADD
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
89
gene pareen arteko koadierazpena indartsuagoa ematen zuen kometilazioa ahulagoa
zen kasuetan, bereziki zeliako aktiboen taldean.
9. irudia. Metilazio eta adierazpen mailen korrelazioak gene pareetan. Lauki bakoitzak gene pare espezifiko baten metilazio/adierazpen maila erlatiboen arteko korrelazioaren p balorea adierazten du. Zuriak, gris argiak, gris ilunak eta beltzak ondoko Pearsonen korrelazio p balioak adierazten dituzte, hurrenez hurren: >0,05, <0,05, <0,01 eta <0,001.
MALT1 eta RELA batetik, eta MAP3K7 eta TRADD bestetik, kontrol taldean
koadierazten zirela ikusi genuen. MAP3K7 eta TRADD geneek, gainera, metilazio
mailen arteko korrelazio indartsua agertu zuten gaixotasunaren estatus ezberdinetan,
baina ez kontrolen kasuan. MALT1 eta RELAk kometilazio ahula aurkeztu zuten, soilik
paziente tratatuen taldean, gene bien metilazio mailak kontrolek aurkezten
zituztenekin alderatzean joerak aurkakoak baziren ere.
Goian aipaturiko geneen posiziorik metilatuenak online dagoen ConSite tresnarekin
analizatu zirenean (http:/www.phylofoot.org/consite) (Sandelin et al., 2004), gene
pare biek (MALT1-‐RELA eta MAP3K7-‐TRADD) transkripzio faktore lotura gune (TFBS)
komunak partekatzen zituztela ikusi zen, %80tik gorako afinitate puntuazioekin (web
orrialdeko berezko atari balioa) (10. irudia), posizio hauen metilazio diferentzialek CDn
paper garrantzitsua joka zezaketela iradokiz. Konkretuki, lehen gene pareak p65
transkripzio faktorearentzako lotura gunea zeukan, eta bigarrenean, aldiz, Snail lotu
zitekeen.
MALT1&
MAP3K7&
MAP3K14&
NFKBIA&
RELA&TAB1&TNFAIP3&
TRADD&
MALT1&
MAP3K7&
MAP3K14&
NFKBIA&
RELA&TAB1&TNFAIP3&
TRADD&
MALT1&
MAP3K7&
MAP3K14&
NFKBIA&
RELA&TAB1&TNFAIP3&
TRADD&
MALT1&
MAP3K7&
MAP3K14&
NFKBIA&
RELA&TAB1&TNFAIP3&
TRADD&
MALT1&
MAP3K7&
MAP3K14&
NFKBIA&
RELA&TAB1&TNFAIP3&
TRADD&
MALT1&
MAP3K7&
MAP3K14&
NFKBIA&
RELA&TAB1&TNFAIP3&
TRADD&
Diagnosia( GFD( Kontrolak(
kome2lazioa(
koadierazpena(
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
90
10. irudia. Analizatutako lokusetan, CpG metilatuenean in silico identifikaturiko TFBS komunak aurkezten dituzten gene pareak eta berauen adierazpen mailen arteko korrelazioak talde kontrolean (a eta b, MALT1-‐RELA eta MAP3K7-‐TRADD gene pareentzat, hurrenez hurren).
Azkenean, hamabi orduko inkubazioa burutu zen biopsia zeliakoetan, baldintza
ezberdinetan (PTG, PTG-‐Z eta estimulurik gabe). Esperimentu hau anplifikazio
errendimendu hobea erakutsi zuten lau entseguekin soilik egin zen (NFKBIA, MAP3K7,
MAP3K7IP1 eta TRADD). Biopsien kulturak promotoreen metilazioaren alterazio
koordinatua eragin zuen gaixo aktiboetan, baina ez GFD pazienteetan. Inkubazioaren
ostean, PTGk eta NFκBren modulazioak ez zuten eragin aurresangarririk izan metilazio
patroietan, baina metilazio mailak aldatu egin ziren, bereziki NFKBIA genearen kasuan,
non metilazioaren arrazoi aldaketa 1,2 baino handiago eta 0,8 baino txikiagoa izan zen
laginen %63an (15/24) eta %88an (21/24), paziente aktibo eta tratatuetan, hurrenez
hurren. Inkubazioa eta gero, soilik zeliako aktiboetatik erauzitako biopsiek erakutsi
zuten metilazio mailen arteko korrelazioa NFKBIA eta TRADD geneen artean,
fenomeno hau gertatzeko esposizio denbora gehiago behar dela eta kometilazioak
zelula azpipopulazioen migrazio edota hautespenarekiko era independentean
gertatzen direla iradokiz, biopsia kulturak in vitro isolatuta daudela kontuan harturik.
GGAAGCTC%%C"G%
MALT1&
p65$/$c'Rel$
20%
10%
0%
GAAAAGCC%C""G%
RELA&
p65$/$c'Rel$
20%
10%
0%
CACCT%C"
20%
10%
0%
MAP3K7&
Snail$$
CA%C"GTG%
20%
10%
0%
Snail$$
TRADD&
y%=%0,0698x%+%0,0025%R2%=%0,5266%p"="0,0015"
0%0,001%0,002%0,003%0,004%0,005%0,006%0,007%
0% 0,01% 0,02% 0,03% 0,04% 0,05%
y%=%0,1129x%+%0,0003%R2=%0,3991%p"="0,0087"
0%
0,0005%
0,001%
0,0015%
0,002%
0,0025%
0% 0,005% 0,01% 0,015%
RELA&
MAP3K7&
MAL
T1&
0,0025%%
0,0020%%
0,0015%%
0,0010%%
0,0005%
TRAD
D&
Met.%(%)%
Met.%(%)%
Met.%(%)%
Met.%(%)%
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
91
4. Eztabaida
Lan honetan, NFκBrekin erlazionatutako 93 generen adierazpena aztertu eta
bidezidorraren parte hartzaile zentral eta erregulatzaile garrantzitsuenen kopuru
esangarri batek CDn agertzen duen aurretiaz deskribatutako aktibazio konstitutiboa
egiaztatu dugu (Castellanos-‐Rubio et al., 2010). NFκB sistema immuneko geneen
adierazpenaren erregulatzaile gako bat da. Erantzun immunitario innato eta
adaptatiboa eta sistema osoaren parte diren zelula, ehun eta organoen garapen eta
mantenua, NFκB familiako transkripzio faktoreen kontrolpean daude maila ugaritan.
Gainera, NFκB zitokina eta kemokina ugari kodetzen duten geneen transkripzioaren
arduradun ere bada (Hayden et al., 2011). Bestalde, NFκB IL15en bitartekari aipagarria
dela ikusi izan da, epitelioko lotura hertsien klaudina 2 mailak jaitsi eta ondorioz,
zelularteko permeabilitatea handitu baitezake (Stone et al., 2011). Fenomeno hau CDn
errepikakorra, garrantzitsua eta iraunkorra dela gauza jakina da (Bjarnason et al.,
1984). Aurretiaz aipaturiko ezaugarri eta funtzioek eta REL eta TNFAIP3 bezalako
bitartekari nabarmenek CDrekiko agertu dituzten asoziazio zantzuek (Trynka et al.,
2009) bidezidor hau gaixotasunaren garapenean inplikaturik egoteko hautagai
interesgarri gisa aurkezten dute. Lan honek, paziente zeliakoek pairatzen duten
bidezidorraren alterazio genetiko sistemikoak NFkBren aktibazio konstitutiboa eta
anomaloa eragiten duen ideia bultzatzen du eta bidezidorra bera, gaixotasunaren
mugarri dela planteatzen du.
Literaturan bildutako informazioa, aberaste funtzionalari buruzko web tresnak eta
proteina-‐proteina elkarrekintza eta bidezidor datu baseak integratu, eta duela ez asko,
NFκB sistemarekin interakzionatu eta bere aktibazioa erregulatzen duten proteinen
irudi bakar eta ulergarri bat publikatu da (Tieri et al., 2012). Beste emaitza interesgarri
batzuen artean, lan honek bidezidorrean zentralen diren 25 proteinen zerrenda
proposatu du. Gure emaitzen arabera, ikertutako geneen artean konstitutiboki
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
92
gainadierazten diren 22etatik 7 (IKBKB, IKBKG, IRAK1, MAP3K14, NFKB2, NFKBIE eta
TRAF2) 25eko zerrenda honetan daude. Beste hiru interakzio zuzena dela eta, Uniprot
notazio bidez eta banan banakako aukeraketaz NFκB bidezidorrean zentral agertu den
MAPK familiakoak dira (Tieri et al., 2012). Modu iraunkorrean aktibatutako beste bi
gene erabateko garrantzia duen CBM konplexuaren parte diren MALT1 eta CARD10
dira, BCL10ekin batera, eta gainadierazita dauden FADD eta TRADD bezala, TRAF2rekin
zuzenean, fisikoki interakzionatzen dute (1. eta 11. irudiak).
11. irudia. Diferentzialki adierazitako geneen arteko harremanak GeneMANIAren arabera. Konstitutiboki gainadierazitako geneak berdez beteta daude eta soilik gaixotasun aktiboan gainadierazten direnak gorriz markatuak. Talde guztietan diferentzialki adierazten diren geneak (gaixotasun aktibo/tratatu eta kontrolak) berdez beteta eta gorriz markatuta adierazi dira. Interakzio fisikoak (lerro arrosez adierazita) gene zentralen artean ematen dira gehienetan. Kolokalizazioak, aldiz (lerro urdinez), gene periferikoen artean gertatu ohi dira. Gene hauen produktuak zelularen mintzari atxikiak edota isuriak izaten dira. Lerroen loditasunak geneen arteko interakzioaren indarra markatzen du.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
93
Gaixotasun aktiboan soilik gainadierazten ziren geneak bidezidorrarekiko
periferikoagoak ziren, BCL10en salbuespenarekin. Dena den, gene horiek guztiak
gutxienez NFκB familiako transkripzio faktore baten ur-‐behera zeuden kokatuta:
interleukinen artean IL1B (Hiscott et al., 1993), IL6 (Libermann et al., 1990), IL8 (Kunsch
et al., 1993), IL10 (Xu et al., 2002) eta IL12A (Homma et al., 2007); IL2 hartzailearen
alfa katea (IL2RA) (Ballard et al., 1988); PTGS2, (Yamamoto et al., 1995) zikloxigenasa
induzigarria kodetzen duen genea; atxikiduraren bitartekari den leukozitoen proteina
erreklutatzailea, SELE (Schindler et al., 1994), eta azkenik, BCL10 (Borthakur et al.,
2012), NFκB TFen erregulatzaile eta indartzaile inportanteenetako bat.
Orokorrean, gure emaitzek konstitutiboki gainadierazita dauden geneak normalean
bidezidorraren nukleoaren parte direla adierazten dute, NFκB seinalizazio sisteman
paper erregulatzaile eta zentralak dituztelako. CD aktiboan soilik gainadierazten diren
geneak, aldiz, bidezidorrarekiko periferikoagoak dira eta batez ere NFκB bidez
induzitzen diren interleukinak, atxikipen molekulak eta hartzaileak kodetzen dituzte.
GeneMANIA tresnaren arabera (Mostafavi et al., 2008) eraikitako 11. irudian argi
ikusten denez, interakzio fisikoak konstitutiboki gainadierazitako gene zentralen artean
ematen dira, kolokalizazioek isurtzen diren edota mintzari lotuta dauden proteina
periferikoak lotzen dituzten artean.
Beste alde batetik, MALT1 helburu duen NFκB bidezidorraren Z modulatzailea gliadina
bidezko estimulazioak eragindako efektuak bere horretara partzialki itzultzeko gai zela
ikusi genuen. Lagin zeliakoak klase batean sartzeko xedez, korrelazioan oinarritutako
ezaugarri aukeraketa egin ostean, PTG bidez kitzikaturiko GFD biopsiak paziente
aktiboekin batera sailkatu ziren, PTG-‐Z estimulua jaso zuten GFD biopsia gehienak
paziente tratatuekin batera sailkatu ziren artean, adierazpen mailen nolabaiteko
normalizazioa iradokiz (gliadinarekiko esposizio akutuaren ondoren, GFD CD profila
berrezarriz, alegia). Aipagarria da gliadinak erreakzio oso anitzak ekarri zituela
indibiduo ezberdinetan, eta zenbait gene gain edo azpiadierazita agertu zirela
kitzikapenaren eraginez, laginaren arabera aldakor. Behaketa honek giza laginek
gordetzen duten aldakortasun izugarria frogatzen du, bereziki gaixotasun konplexuen
testuinguruan, kanpo estimuluek adierazpen genikoan izan ditzaketen efektuetan, hain
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
94
zuzen. Dena den, Zren eragina askoz ere homogeneoagoa zen, eta PTGren efektuak
indargabetzeko gaitasuna zeukan.
Lan honen aurkikuntza nabarmenenen artean, geneen adierazpen mailen arteko
korrelazio indartsuak behatu ziren, zeliakoak ez ziren indibiduoen artean batik bat, GFD
pazienteen kasuan, erdi mailako koadierazpenak ikusi ziren artean. Kontroletan
behaturiko koadierazpen maila esperokoa izan zen, bidezidor biologiko berdinean
parte hartzen duten geneak mekanismo erregulatzaile komunen menpe egon ohi
direla kontuan harturik. Gainera, Sistemen Biologiaren baitako hainbat hurbilketek
erakutsi duten moduan, koadierazpen sareek fenotipo eta ezaugarri desberdinak azal
ditzaketen modulu funtzionalak osatzen dituzte (de la Fuente, 2010). Glutendun dietan
dauden paziente aktiboek NFκB sistemaren korregulazio ahulagoa agertzeak, paziente
sintomatikoetan, inflamazio kronikoak alteratutako adierazpena eta koordinazio galera
ekar ditzakeen ideia indartzen du.
Gaur arte, saiakera gutxi egon da sare mailako gene koadierazpen azterketa ulergarri
eta konparatiboak egiteko, eta arlo honetan egindako lehenbiziko lanetako bat
Hepatitis B eta Hepatitis C birusek eragindako kartzinoma hepatozelularren arteko
ezberdintasun eta antzekotasunak argitzen saiatu zen, batez ere, infekzio biralak
ekarritako prozesu inflamatorioan fokatuz (He et al., 2012). Lan honek, modulu
onkogeniko eta funtzionalak identifikatzeko, sareetan oinarritutako Sistemen
Biologiaren hurbilketak aurretiaz erabilitako adierazpen diferentzialean eta proteinen
ituetan errotzen diren metodoak baino hobeak direla frogatu du. Laranjondoak (Citrus
sinensis) bakterioen infekzioaren aurrean duen erantzuna analizatzeko koadierazpen
sare bat eraiki zen duela gutxi (Zheng et al., 2013). Autoreek, geneen adierazpen
korrelazio sareek prozesu biologiko zehatzetan inplikaturiko azpimultzo geniko
espezifikoak aurkitzeko eta infekzioarekiko erresistentzia geneen arteko interakzioen
bilaketan laguntzeko balio zezaketela ondorioztatu zuten.
Koadierazpenetan oinarrituriko analisiak adierazpen diferentzialean oinarrituriko
hurbilketa klasikoak baino erabilgarriagoak izan zitezkeela kontuan hartuta,
aukeraturiko NFκB geneen artean, kontroletan behatutako korregulazio hertsiaren
galera gaixotasunaren presentzia/ausentziaren menpekoa izateaz gainera,
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
95
gaixotasunaren estatusak, gliadina bidezko estimulazioak zein NFκB bidezidorraren
MALT1en inhibizio bidezko modulazioak ere eragina zuten ikertu genuen. Beraz, PTG
eta PTG-‐Z kitzikapenen efektuak ikertu genituen, horretarako estimulu ezberdinek
eragindako adierazpen arrazoi aldaketen korrelazio matrizeak eraikiz. Ez genuen
koordinatutako aldaketarik ikusi gaixo aktiboetan; izan ere, korregulazioa guztiz etenda
zegoela ematen zuen. GFD pazienteen eta kontrolen kasuan, aldiz, PTGk PTG-‐Z
konbinaketak baino adierazpen aldaketa koordinatu gutxiago induzitu zituen, batez ere
tratatuen taldean. Emaitza hauek gliadinarekiko esposizioak NFκBrekin erlazionaturiko
geneen desregulazio orokorra eragiten duela iradokitzen dute, baita indibiduo ez
zeliakoen kasuan ere. Baina, dena dela, koordinazioaren galera CDn areagotuta
dagoela argi ikusi zen.
PTG bidez gidaturiko koadierazpen galerak NFκB sistemaren parte diren geneen
adierazpen mailen korrelazioen plastizitate handia adierazten du, eta testuinguru
zabalago baten baitan, efektu fenotipikoa duen gliadina estimuluaren ondorio modura
aurkezten du. Azkenik, fenomeno honek eta beste hainbatek zeliakoek glutenarekiko
duten erantzun areagotua azal lezakete. Koadierazpen erlazio hauen erregulatzaile
potentzialen izaera ezezaguna da, baina baliteke sistema osoaren erregulazio globala
izatea aldaera genetikoek afektatuta dagoena, eta ez soilik gene isolatuak eta
ondorioz, berauen adierazpen diferentzial eta konstitutiboa. Desregulazioa kitzikapen
immunotoxikoaren ostean piztuko litzateke, eta gliadinarekiko esposizioaren eraginez
bilakatuko litzateke nabarmen, zeliako aktiboetan eta tratatuen biopsiak PTGrekin in
vitro inkubatu ondoren, PTPRK eta THEMIS geneen kasuan behaturiko
koadierazpenean bezala (Bondar et al., 2013).
Bestalde, kontrolen taldearen espezifikoa zen koadierazpen sinadurak ez zuen
NFκBren modulazioarekiko menpekotasun handirik agertu, eta erregulazio hertsia
aurkeztu zuen. Gene zerrenda hau, ordea, oso modu ahuelan koadierazten zen PTGz
kitzikatutako GFD pazienteen biopsietan. Bestetik, PTGk eragindako sinadura GFD-‐
espezifikoko geneen adierazpen mailak ez zeuden batere korrelazionatuta indibiduo ez
zeliakoetan (aktibazio immunea iradokitzen zuen zenbait salbuespenekin),
gaixotasunean estimulu immunotoxikoarekiko erantzun alteratu baina koordinatua
gertatzen dela adieraziz.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
96
Orokorrean, Zk kitzikatu gabeko biopsietan ageri ziren koadierazpen patroiak berrezar
zitzakeela ematen zuen, berriro ere. Beraz, inflamazio kronikoa ez duten paziente
zeliakoetan gliadinaren efektuak itzul ditzakeen konposatu modura agertzen da Z.
Beste behin ere, koadierazpen sinaduren atzean dauden mekanismo erregulatzaileak
ezezagunak izaten jarraitzen dute. Etorkizun hurbilean, GFD tratamendua jarraitu
baina noizbehinka dieta apurtzen duten CD pazienteen sintoma akutuak saihesteko
baliagarria izango den ikertzea interesgarria izan liteke.
Metilazio mailen determinazioa helburu, pirosekuentziazioan oinarrituriko bi
metodoen analisiari dagokiola, funtsezkoa da DNA kantitate txikiak erabiliz diferentzia
ez oso nabarmenak neurtzeko gai diren tresna eta teknikak garatu eta DNA metilazio
aldaketek giza gaixotasunetan duten eragina argitzeak izango lukeen garrantziaz
jabetzea. qMAMBA bezalako hurbilketa teknikoak oso erabilgarriak izan litezke
metilazio analisietan, baina horretarako, sendotasun eta errepikakortasun nahikoa
beharko lukete. Bisulfitoma osoko anplifikaziodun laginak analizatzen zuen aurreko lan
batean, metilazio mailako muturreko ezberdintasunak baino ez ziren neurtu, eta kasu
hauetan, qMAMBA efizientea zela ikusi zen (Vaissière et al., 2009; Paliwal et al., 2010).
Aurkezten dugun lan hau, qMAMBA eta bisulfitoz trataturiko DNA genomikoaren
pirosekuentziazioa modu sistematikoan konparatzen lehena izan da, metilazio maila
hein zabal batean eta entsegu desberdinetan.
Orokorrean, gure azterketak PCR aurretik bisulfitomaren anplifikazioa burutzen
denean entseguen errendimendua baxuagoa dela erakusten du, PCR alborapenaren
emendatzea iradokiz, seguruenik, alelo ez metilatuen anplifikazioa lehenesten delako
qMAMBAn. Salbuespen bakarra MAP3K7IP1 da. Kasu honetan, teknika bien bidez
antzeko errendimenduak lortzen dira. Ondorio modura, qMAMBA teknika, metilazio
balio errealak vs. zuzendutakoak irudikatzean lortutako erregresio linealaren R2 balioa
1etik gertu dagoenean soilik (>0,99) aplika daitekeela esan dezakegu. Kasu hauetan,
estimazioen lerro zuzenarekiko desbideraketak txikiak direnez, gainezartzen diren
estimazioak saihestu eta metilazio diferentziak modu egokian bereiz daitezke (7.
irudia). Gutxiagotan gertatzen bada ere, pirosekuentziazio konbentzionala
erabiltzerakoan ere, neurri berdinak hartu beharko lirateke. Beraz, gainontzeko
esperimentuetan pirosekuentziazio konbentzionala erabiltzea erabaki zen.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
97
Ondorioz, aurretiaz proposaturiko erregresio polinomiko kubikoaren zuzenketa
metodoa erabili eta PCRak dakarren alborapena gutxitu eta balio errealetara
hurbiltzeko duen gaitasuna frogatu dugu. Gainera, zuzendu gabeko balioen kasuan, b
balioak 1etik gehiago urruntzen direla ikusi dugu eta erregresio kubikoan oinarrituriko
zuzenketaren erabilpen sistematikoak zehaztasuna eta diskriminazio gaitasuna
emendatzen dituela frogatu dugu.
Azkenik, 9 puntuko kurba eraiki eta esperimentu bakarraren bidez, metilazio maila
hurbilak modu egokian diskriminatuko dituzten entseguak gaitasun hori agertuko ez
dutenetatik bereiz dezakeen atari balioa determinatu da. Atari honen arabera, ekuazio
polinomiko kubikoaren bitartez kalkulatutako estimazio eta balio errealen arteko
korrelazio koefizientea (R2) 0,99 baino altuagoa izan beharko luke emaitza
artefaktualak saihesteko gai izango bagara.
Lan hau, eritasun zeliakoa pairatzen duten pazienteen hestean, NFκBrekin
erlazionaturiko zenbait promotoreren metilazio aldaketak aztertzen ere lehena izan da.
Behatutako aldaketak GFDz trataturiko indibiduoetan ere nolabait mantentzen badira
ere, orokorrean, tratatutako pazienteetan, kontrolekiko metilazio maila
desberdintasunak ez dira horren nabariak izaten, CDrekin erlazionaturiko aldaketak
partzialki itzulgarriak direla edota itzulgarritasun hori osoa izateko, denbora gehiago
beharko litzatekeela iradokiz.
Azken urteetan, elementu epigenetikoak aldagarritasun fenotipikoa eta gaixotasun
arruntekiko suszeptibilitatea azal ditzakeen ideiak indarra hartu du. Adibidez,
hesteetako hanturazko gaixotasuna (IBD) (Hartnett et al., 2012) edota koloneko
neoplasia distala (Hiraoka et al., 2010) bezalako liseri aparatuko zenbait gaixotasun
inflamatorioren kasuan, zein T1D (Bell et al., 2010b) eta psikosia (Mill et al., 2008)
bezalako beste hainbat eritasun konplexutan eta minbizi zerrenda luze batean (Bell et
al., 2011; Wang et al., 2012), DNA metilazio sinadura espezifikoak ikusi izan dira.
Aztertutako 8 geneetatik bostek (MALT1, MAP3K7, MAP3K7IP1, MAP3K14 eta TRADD)
kontrolek baino adierazpen maila altuagoak agertu zituzten gaixo aktibo eta
tratatuetan (12. irudia). Ikertutako gene guztiek, RELAk salbu, joera berdina jarraitu
zuten, nahiz eta esangarria ez izan. Esperokoaren kontrakoa gertatu zen beraz, modu
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
98
esangarrian metilatuago zeuden geneek adierazpen maila altuagoak aurkeztu
baitzituzten.
12. irudia. Estatistikoki esangarriak diren adierazpen mailako ezberdintasunak agertu eta metilazio azterketan analizatutako geneak. Kutxa gris ilun eta argiak gaixo aktibo eta tratatuak adierazten dituzte, hurrenez hurren, eta txuriek kontrolen taldea; y ardatzak adierazpen maila erlatiboak irudikatzen ditu.
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
99
CpG irlen metilazio maila altuak geneen adierazpen maila baxuagoekin asoziatzen
diren ustea oso hedatuta badago ere, CpG irlen funtzioa genomako elementu
erregulatzaileak inguruko DNA metilazio errepresiboaz babestean datza, eta beraz,
berebizikoak dira genomaren erregulazioan, geneen aktibazio zein isilarazpenean, CpG
irla zehatz eta jakin batean kromatinak hartzen duen konformazioaren arabera
(Blackledge et al., 2011). Gainera, zitosina ez metilatuen identifikazioak polycomb
sistema errepresiboa posizioan erreklutatu eta ez metilatutako lokusen adierazpena
eragotzi dezakeela ikusi da lehenbiziko aldiz ugaztunetan (Farcas et al., 2012),
metilazioaren gaitasun erregulatzaile bidirekzionalaren ideia indartuz.
Tesi honetan aurkezturiko emaitza interesgarrienetako bat behatutako kometilazio
erlazioetan datza. Izan ere, gaixotasunaren edozein estatusetan maiztasun handiz
agertzen diren NFκB geneen metilazio mailen arteko korrelazio hauek ez dira inoiz
kontrolen artean gertatzen. Ikerketa gehigarriak beharrezkoak izango badira ere,
behatutako kometilazioak zelula azpipopulazioen migrazio edota hautespen
prozesuekiko era independentean eratzen direla ematen du, biopsien in vitro
kulturetan erreproduzitu baitaitezke.
Minbizian ikusi izan denez, hipermetilatuta eta hipometilatuta agertzen diren geneek
funtzio kontsistenteak izaten dituzte minbizi ezberdinetan (Shen et al., 2012) eta beraz,
funtzio komunak dituzten edota bidezidor berdinetan parte hartzen duten geneak
modu koordinatuan erregulatuta egon litezke gaixotasun jakin batean edo kanpo
estimulu espezifikoei erantzuterakoan. Bestetik, bularreko minbizian buruturiko lan
batek korrelazio altuak aurkezten zituzten gene pareak identifikatu zituen (Akulenko et
al., 2013). Gene hauek antzekotasun funtzional indartsuak aurkeztu zituztela
azpimarragarria da. Autoreek, lan hau gene ezezagunak anotatu eta hautagai berriak
identifikatzeko erabilgarria izan litekeela iradoki zuten.
Tesi honetan, pazienteetan behatutako metilazio mailen korrelazioak gene pare
horietan beraietan ikus zitezkeen koadierazpenen desagerpenarekin asoziatuta
zeudela ematen zuen, NFκB geneen promotoreen metilazio mailen alterazio
koordinatuak geneen adierazpena aldaraz dezakeela iradokiz, bidezidorraren oreka
erregulatzailea nolabait apurtuz. Horrela, aldaera genetiko eta epigenetikoek,
NFκBren korregulazioa eta modulazioa CDn
100
adierazpen eta metilazio patroiak aldaraz ditzaketen eta ingurumenari dagozkion
faktoreekin batera, NFκB bidezidorraren maila ezberdinak afektatu eta sistema
immunearen erantzun optimoa ziurtatzen duen oreka erregulatzaile hertsiaren galera
ekar dezaketela ondoriozta dezakegu. Koordinazio honen galera egonkorrak CD
bezalako gaixotasun inflamatorio kronikoen garapena ekar dezake. Ideia hauek
espekulatiboak badira ere, gure ustez, emaitza hauek sareen, interakzioen eta
elementu edo gertakari erregulatzaile komunen garrantzia azaleratzen du, orain arte
gaixotasun konplexuak azaltzeko ezinbesteko izan ditugun elementu isolatuen aldaketa
txiki eta anitzen gainetik apika.
Azken hausnarketak
Azken hausnarketak
103
Lan honek SNPez gaindiko aldagarritasun genetikoa kontuan hartzearen garrantzia
azpimarratzen du, CNVek zein DNA metilazioak edota bestelako alterazio
epigenetikoek eritasun zeliakoaren eta seguruenik beste hainbat gaixotasun
konplexuren garapena afektatu dezaketen ideia indartuz.
Gainera, azterketa honen beste behaketa aipagarri bat honakoa da: batetik, NFκB
bidezidorraren nukleoa osatzen duten geneak eta bestetik, oraindik identifikatu ez den
baina osasunean aurkituriko koadierazpen patroia erregulatzen duen mekanismo
globala, CDn konstitutiboki alteratuta daude . GFDz trataturiko pazienteek erdi mailako
korregulazioa aurkezten dute eta ondorioz, gene hauen koadierazpena azal dezaketen
mekanismo erregulatzaileek efizientzia galtzen dute batik bat pazienteek estimulu
immunotoxikoak pairatzen dituztenean. MALT1 parakaspasaren Z-‐VRPR-‐FMK
inhibitzaileak gliadinarekiko esposizio akututik eratorritako efektuak, kitzikapenik
gabeko laginen mailetara itzultzen efizientea ematen du eta beraz, aurkikuntza honek
aukera terapeutiko berri bati atea zabaltzen diola esan genezake, GFD ordezkatuko ez
duen arren. Dena den, Z nahigabeko gluten hartzeak ekar ditzakeen sintoma akutuak
saihesteko gai bide da.
Ikerketa gehiago beharko da CD pazienteetan behatutako kometilazio fenomenoek
koadierazpenaren endekatzean paperen bat jokatzen duten edota inflamazio
kronikoaren ondorio diren argitzeko. Hala ere, lan hau CDn promotore mailako
metilazio desberdintasunak deskribatzen lehena izan da, eta gainera, metilazio zein
adierazpenaren eremuetan, alterazio koordinatuak aztertzearen garrantzia ezarri du.
Horrela, tesi honen ondorio nagusietako bat oraindik lan asko egin behar dela da. Alde
batetik, CNVak genometan efektu kaltegarri nabarmenik gabe kodetuta egon
daitezkeela jakina da; dena dela, lokus genomiko batzuek ezin dute horrelako kopia
kopuru mailako alteraziorik pairatu (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001; Girirajan et
al., 2012). Giza espeziaren aniztasuna oso zabala dela oinarri harturik, berrantolaketa
genomikoak aldagarritasun genetiko eta fenotipiko iturri direla jakina da, baita giza
Azken hausnarketak
104
gaixotasunen sortzaile ere. Aldaera genetikoen interpretazio klinikoa, dena den,
sekuentzia kodetzaileetara mugatu izan da askotan, geneen funtzioa aldarazten
dituzten aldaerak soilik aintzat hartuz. Hala ere, sekuentziaturiko genometan,
ezagunak diren aldaeren %95 proteina kodetzaileak ez diren eremuetan kokatzen dela
ikusi da (Spielmann et al., 2013).
ENCODE proiektuaren (ENCODE Project Consortium, 2012) epigenetikaren inguruko
ekarpen erraldoia oraindik guztiz ulergarria ez bada ere, aldaera genetikoengatik
afektatuta egon litezkeen eremu potentzialki erregulatzaileak aditzera eman ditu. Izan
ere, proiektu honen aurkikuntza nabarmenetako bat genomaren %80 inguruk funtzio
biokimikoekin loturiko elementuak kodetzen dituen behaketan datza, orain dela gutxi
arte indarrean egon den “zabor DNAren teoria” baztertzeko ebidentzia sendoak
eskainiz. Azken urteetan, zenbait ikerlanek ezaugarri konplexuekin asoziaturiko SNPak
epigenetikarekin erlazionaturiko eremu erregulatzaileetan aberastuta daudela frogatu
dute (ENCODE Project Consortium, 2012; Ernst et al., 2011).
Lehenago esan bezala, geneen arteko eremuak cis-‐en jarduten duten elementu
erregulatzailez beteta daudela gero eta argiago dago, eta aurkikuntza honek berebiziko
garrantzia du giza gaixotasunen genetikaren ulermenean. Horrela, CNVek garapenean
inplikaturiko geneen testuinguru erregulatzailea aldarazi eta indartzaile, isilarazle eta
bestelako elementu erregulatzaileen arteko oreka hautsi dezakete, kromosomen
egitura tridimentsionala eta promotoreen eta elementu horien guztien arteko cis
interakzioak alteratuz. Are gehiago, RNA ez kodetzailetan (ncRNA) dauden CNVak
patogenikoak izan litezkeela uste da (Spielmann et al., 2013). Ondorioz, momentu
honetan, genomaren aldagarritasun estrukturalaren alorreko erronka nagusietako bat,
batez ere, eremu kodetzaileetatik at dauden aldaeren testuinguru erregulatzailea
ulertzean datza.
Beste alde batetik, ezaugarri konplexu jakin batekin asoziaturiko lokusen mapaketatik
benetan fenotipoa azal dezaketen aldaera konkretuetara egin beharko da jauzi,
GWASen interpretazio osoago bat lortuko bada behintzat. Litekeena da ezaugarri
konplexuekin asoziaturiko aldaera genetikoen proportzio esanguratsu bat geneen
erregulazioan inplikatuta egotea. GWA azterketetan fenotipo ezberdinekin
Azken hausnarketak
105
erlazionatutako aldaera gehienak eremu kodetzaileetatik urrun kokatzen dira (Hindorff
et al., 2009). Distribuzio mota hau cis modulu erregulatzaileek erakusten dutenaren
antzekoa da, eta honengatik beragatik, asoziaturiko aldaera askok funtzio
erregulatzailea izatea espero da.
Hau guztia dela eta, fenotipo ezberdinei asoziaturiko aldaeren erresoluzio altuko
mapak eta modulu erregulatzaileen kokapenari buruzko informazioa lotu eta
erlazionatu behar da, indartzaileak erregulatzen dituzten geneetatik oso urrun egon
daitezkeela eta birtualki, edozein sekuentzia ez kodetzailek funtzio erregulatzailea bete
dezakeela aintzat harturik, beti ere (Hardison, 2012). NFκBren kasuan bezala, modu
globalean afektatuta dauden bidezidorretan arreta jarri beharko litzateke. Lan asko
beharko da behatutako koadierazpen patroiak erregulatzen dituzten mekanismoak eta
ingurumeneko estimuluek zein gaixotasunek eragindako berauen deuseztapena
ulertuko baditugu.
Azkenik, CpG testuinguruan dauden zitosinen metilazioa geneen adierazpenaren
erregulazio epigenetikoan inplikatuta dago. Promotoreen metilazioa errepresioarekin
asoziatuta egoten da, metilazio genikoa aktibitate transkripzionalarekin erlazionatu ohi
den bitartean. CpGen %96k metilazio diferentziala aurkezten du ehun eta zelula mota
ezberdinak konparatzean eta metilazio maila kromatinaren irisgarritasunarekin lotuta
dago. Gainera, ENCODE proiektuak inpronta genomikoarekin erlazionaturiko metilazio
alelo espezifikoa identifikatu du hainbat CpG posiziotan, eta lokus hauek minbizi
zeluletan metilazio alteratua agertzen dutela argitaratu da (ENCODE Project
Consortium, 2012). CpG irletatik kanpo kokaturiko zitosinen metilazio errepikakor eta
kontsistentea ere aurkitu da, gizaki helduen ehunetan (Lister et al., 2009), metilazio
fenomeno alternatibo hauek paper garrantzitsua joka dezaketela iradokiz.
Ondorioz, aurkikuntza berri hauek komunitate zientifikoa, askotan genoma ez
kodetzailean kokatutako mekanismo erregulatzaile konplexuak eta ezaugarri
epigenetikoak (ncRNA molekulak, DNA metilazioa, histonen modifikazioak…) aintzat
hartu eta modu integralean aztertzera bultzatu beharko lukete, gene adierazpena
modu multidimentsionalean ulertu eta gaixotasun konplexuei asoziaturiko aldaeren
azalpen molekularrak lortuko baditugu.
Ondorioak
Ondorioak
109
Tesi honen ondorio nagusiak honakoak dira:
1. β-‐defensina multzoaren kopia kopuruaren aldaerak (CNV) eritasun
zeliakoarekin asoziatuta daude eta TLR2 eta TLR4 geneek ez dute gene edukian
aldakortasunik aurkezten.
a. PCR kuantitatiboa (qPCR) eta paralogoen ratio testa (PRT)
konparagarriak dira kontrolatutako baldintzetan. Teknika biek kopia
kopuruen determinazio sendo eta errepikagarriak baimentzen dituzte
populazio mailan, qPCRa DNA normalizazioarekiko sentikorragoa izan
eta PRTarentzat DNA degradazioaren inpaktua handiagoa bada ere.
b. β-‐defensina multzoaren kopia kopuru altuak (>4) maizago agertzen dira
kontroletan zeliakoetan baino, molekula antibiotiko hauek babes
mekanismo baten parte izan daitezkeela iradokiz, seguruenik gene
eduki altuen eramaileetan hesteko hesiaren integritatea indartzen
dutelako.
2. Eritasun zeliakoan konstitutiboki gainadierazita dauden gene gehienak NFκB
bidezidorraren nukleoaren parte dira eta koadierazpenaren deuseztapenak
heste zeliako aktiboa ezaugarritzen du.
a. Konstitutiboki gainadierazitako geneek elkarrekintza fisikoak aurkezten
dituzte eta bidezidorraren nukleoaren parte dira; gaixotasun aktiboan
gainadierazitakoak, ordea, periferikoagoak dira. Heste osasuntsuan
behatzen den erregulazioa guztiz deuseztatuta ageri da gaixotasun
aktiboan eta paziente tratatuek erdi mailako koadierazpen patroiak
aurkezten dituzte.
b. Gliadina bidezko in vitro estimulazioak kontroletan zein paziente
tratatuetan ageri den koadierazpen hertsia aldarazten du, batez ere
Ondorioak
110
zeliakoetan. Bidezidorraren modulazioak gliadinaren efektuak partzialki
itzul ditzake eta beraz, MALT1en inhibizioa hautagai terapeutiko ona
izan liteke eritasun zeliakoaren sintoma akutuak tratatzeko.
3. NFκBrekin erlazionatutako zenbait genek metilazio maila ezberdinak agertzen
dituzte gaixo aktibo, tratatu eta kontrolen artean.
a. Bisulfitoma osoaren anplifikazio osteko DNA kantitate txikien metilazio
analisi kuantitatiboa (qMAMBA) ez da metilazio aldaketa txikiak
neurtzeko teknika fidagarria, erregresio kubiko bidez zuzendutako
balioek eta metilazio ehuneko errealek 0,99 baino korrelazio koefiziente
altuagoak aurkezten ez badituzte behintzat.
b. Zenbait genek (MALT1, MALT3K7, RELA eta TRADD) diferentzia txiki
baina esangarriak aurkezten dituzte zeliako aktibo eta kontrolen artean.
Tratatutako pazienteek erdi mailako metilazio ehunekoak aurkezten
dituzte, alterazio epigenetikoen itzulgarritasun partziala iradokiz.
Metilazio mailen arteko korrelazioak pazienteen artean soilik gertatzen
dira eta koadierazpenaren deuseztapenarekin asoziatuta daudela
ematen du.
Bibliografia
Bibliografia
113
Abel M et al. Adulthood-‐onset celiac disease is associated with intercellular adhesion molecule-‐1 (ICAM-‐1) gene polymorphism. Hum Immunol. 2006, 67: 612-‐7.
Akulenko R et al. DNA co-‐methylation analysis suggests novel functional associations between gene pairs in breast cancer samples. Hum Mol Genet. 2013, 22: 3016-‐22.
Aldhous MC et al. Measurement methods and accuracy in copy number variation: failure to replicate associations of beta-‐defensin copy number with Crohn's disease. Hum Mol Genet. 2010, 19: 4930-‐8.
Aldhous MC et al. Dysregulation of human beta-‐defensin-‐two protein in inflammatory bowel disease. PLoS ONE 2009;4:e6285.
al-‐Hassany M. Coeliac disease in Iraqi children. J Trop Pediatr Environ Child Health. 1975, 21: 178-‐9.
al-‐Tawaty Al et al. Coeliac disease in north-‐eastern Libya. Ann Trop Paediatr. 1998, 18: 27-‐30.
Anderson RP et al. In vivo antigen challenge in celiac disease identifies a single transglutaminase-‐modified peptide as the dominant A-‐gliadin T-‐cell epitope. Nat Med. 2000, 6: 337-‐42.
Arentz-‐Hansen H et al. The intestinal T cell response to alpha-‐gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated glutamine targeted by tissue transglutaminase. J Exp Med. 2000, 191: 603-‐12.
Armour JA et al. Accurate, high-‐throughput typing of copy number variation using paralogue ratios from dispersed repeats. Nucleic Acids Res. 2007, 35: e19.
Asanuma K et al. Synaptopodin regulates the actin-‐bundling activity of alpha-‐actinin in an isoform-‐specific manner. J Clin Invest. 2005, 115: 1188-‐98. Erratum in: J Clin Invest. 2012, 122: 781.
Ballard DW et al. HTLV-‐I tax induces cellular proteins that activate the kappa B element in the IL-‐2 receptor alpha gene. Science. 1988, 241: 1652-‐5.
Bell A et al. CpG island methylation profiling in human salivary gland adenoid cystic carcinoma. Cancer. 2011, 117: 2898-‐909.
Bell CG et al. The epigenomic interface between genome and environment in common complex diseases. Brief Funct Genomics. 2010, 9: 477-‐85.
Bell CG et al. Genome-‐wide DNA methylation analysis for diabetic nephropathy in type 1 diabetes mellitus. BMC Med Genomics. 2010, 3: 33.
Bentley RW et al. Association of higher DEFB4 genomic copy number with Crohn's disease. Am J Gastroenterol. 2010, 105: 354-‐9.
Bjarnason I et al. In vitro determination of small intestinal permeability: demonstration of a persistent defect in patients with coeliac disease. Gut. 1984, 25: 145-‐50.
Bibliografia
114
Blackledge NP et al. CpG island chromatin: a platform for gene regulation. Epigenetics. 2011, 6: 147-‐52.
Bodé S et al. Incidence and prevalence of adult coeliac disease within a defined geographic area in Denmark. Scand J Gastroenterol. 1996, 31: 694-‐9.
Bondar C et al. THEMIS and PTPRK in celiac intestinal mucosa: coexpression in disease and after in vitro gliadin challenge. Eur J Hum Genet. 2013.
Borthakur A et al. Prolongation of carrageenan-‐induced inflammation in human colonic epithelial cells by activation of an NFκB-‐BCL10 loop. Biochim Biophys Acta. 2012, 1822: 1300-‐7.
Brenet F et al. DNA methylation of the first exon is tightly linked to transcriptional silencing. PLoS One. 2011, 6: e14524.
Brophy K et al. Haplotypes in the CTLA4 region are associated with coeliac disease in the Irish population. Genes Immun. 2006, 7: 19-‐26.
Capilla A et al. Genetic analyses of celiac disease in a Spanish population confirm association with CELIAC3 but not with CELIAC4. Tissue Antigens. 2007, 70: 324-‐9.
Caputo I et al. Tissue transglutaminase in celiac disease: role of autoantibodies. Amino Acids. 2009, 36: 693-‐9.
Castellanos-‐Rubio A et al. Combined functional and positional gene information for the identification of susceptibility variants in celiac disease. Gastroenterology. 2008, 134: 738-‐46.
Castellanos-‐Rubio A et al. TH17 (and TH1) signatures of intestinal biopsies of CD patients in response to gliadin. Autoimmunity. 2009, 42: 69-‐73.
Castellanos-‐Rubio A et al. A regulatory single nucleotide polymorphism in the ubiquitin D gene associated with celiac disease. Hum Immunol. 2010, 71: 96-‐9.
Castellanos-‐Rubio A et al. Long-‐term and acute effects of gliadin on small intestine of patients on potentially pathogenic networks in celiac disease. Autoimmunity. 2010, 43: 131-‐9.
Cataldo F et al. Celiac disease in the developing countries: a new and challenging public health problem. World J Gastroenterol. 2007, 13: 2153-‐9.
Ciccocioppo R et al. Matrix metalloproteinase pattern in celiac duodenal mucosa. Lab Invest. 2005, 85: 397-‐407.
Clayton DG et al. Population structure, differential bias and genomic control in a large-‐scale, case-‐control association study. Nat Genet. 2005, 37: 1243-‐6.
Collin P et al. High incidence and prevalence of adult coeliac disease. Augmented diagnostic approach. Scand J Gastroenterol. 1997, 32: 1129-‐33.
Bibliografia
115
Curley CR et al. A functional candidate screen for coeliac disease genes. Eur J Hum Genet. 2006, 14: 1215-‐22.
de Kauwe AL et al. Resistance to celiac disease in humanized HLA-‐DR3-‐DQ2-‐transgenic mice expressing specific anti-‐gliadin CD4+ T cells. J Immunol. 2009, 182: 7440-‐50.
de la Fuente A. From 'differential expression' to 'differential networking' -‐ identification of dysfunctional regulatory networks in diseases. Trends Genet. 2010, 26: 326-‐33.
Deane JA et al. Nucleic acid-‐sensing TLRs as modifiers of autoimmunity. J Immunol 2006;177:6573–8.
Dema B et al. Autoimmune disease association signals in CIITA and KIAA0350 are not involved in celiac disease susceptibility. Tissue Antigens. 2009, 73: 326-‐9.
Dema B et al. Lack of replication of celiac disease risk variants reported in a Spanish population using an independent Spanish sample. Genes Immun. 2009, 10: 659-‐61.
Dezsofi A et al. Frequencies of genetic polymorphisms of TLR4 and CD14 and of HLA-‐DQ genotypes in children with celiac disease, type 1 diabetes mellitus, or both. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008, 47: 283-‐7.
Di Sabatino A et al. Coeliac disease. Lancet. 2009, 373: 1480-‐93.
Dicke WK. Coeliakie. MD Thesis (1950).
Diosdado B et al. The downstream modulator of interferon-‐gamma, STAT1 is not genetically associated to the Dutch coeliac disease population. Eur J Hum Genet. 2006, 14: 1120-‐4.
Dubé C et al. The prevalence of celiac disease in average-‐risk and at-‐risk Western European populations: a systematic review. Gastroenterology. 2005, 128: S57-‐67.
Dubois PC et al. Multiple common variants for celiac disease influencing immune gene expression. Nat Genet. 2010, 42: 295-‐302. Erratum in: Nat Genet. 2010, 42: 465.
Düwel M et al. J Immunol. 2009, 182: 7718-‐28.
Einarsdottir E et al. IL23R in the Swedish, Finnish, Hungarian and Italian populations: association with IBD and psoriasis, and linkage to celiac disease. BMC Med Genet. 2009, 10: 8.
ENCODE Project Consortium et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012, 489: 57-‐74.
Ernst J et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 2011, 473: 43-‐9.
Farcas AM et al. KDM2B links the Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) to recognition of CpG islands. Elife. 2012, 1: e00205.
Fasano A et al. Current approaches to diagnosis and treatment of celiac disease: an evolving spectrum. Gastroenterology. 2001, 120: 636-‐51.
Bibliografia
116
Feighery C et al. Diagnosis of gluten-‐sensitive enteropathy: is exclusive reliance on histology appropriate? Eur J Gastroenterol Hepatol. 1998, 10: 919-‐25.
Feighery C. Fortnightly review: coeliac disease. BMJ. 1999, 319: 236-‐9.
Fellermann K et al. A chromosome 8 gene-‐cluster polymorphism with low human beta-‐defensin 2 gene copy number predisposes to Crohn disease of the colon. Am J Hum Genet. 2006, 79: 439-‐48.
Fernandez-‐Jimenez N et al. Upregulation of KIR3DL1 gene expression in intestinal mucosa in active celiac disease. Hum Immunol. 2011, 72: 617-‐20.
Fina D et al. Interleukin 21 contributes to the mucosal T helper cell type 1 response in coeliac disease. Gut. 2008, 57: 887-‐92.
Fode P et al. Determination of beta-‐defensin genomic copy number in different populations: a comparison of three methods. PLoS One. 2011, 6: e16768.
Folk JE et al. Transglutaminases. Methods Enzymol. 1985, 113: 358-‐75.
Folk JE et al. Transglutaminase: mechanistic features of the active site as determined by kinetic and inhibitor studies. Biochim Biophys Acta. 1966, 122: 244-‐64.
Galvão LC et al. Celiac disease: report of 20 cases in Rio Grande do Norte, Brazil. Arq Gastroenterol. 1992, 29: 28-‐33.
Gee S. On the celiac disease. St Bart Hosp Rep. 24, 17-‐20 (1888).
Girirajan S et al. Phenotypic heterogeneity of genomic disorders and rare copy-‐number variants. N Engl J Med. 2012, 367: 1321-‐31. Erratum in: N Engl J Med. 2012, 367: 2362.
Greco L et al. Existence of a genetic risk factor on chromosome 5q in Italian coeliac disease families. Ann Hum Genet. 2001, 65: 35-‐41.
Greco L et al. Genome search in celiac disease. Am J Hum Genet. 1998, 62: 669-‐75.
Greco L et al. The first large population based twin study of coeliac disease. Gut. 2002, 50: 624-‐8.
Guescini M et al. A new real-‐time PCR method to overcome significant quantitative inaccuracy due to slight amplification inhibition. BMC Bioinformatics. 2008, 9: 326.
Hailfinger S et al. Malt1-‐dependent RelB cleavage promotes canonical NF-‐kappaB activation in lymphocytes and lymphoma cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 108: 14596-‐601.
Hardison RC. Genome-‐wide epigenetic data facilitate understanding of disease susceptibility association studies. J Biol Chem. 2012, 287: 30932-‐40.
Harris KM et al. Monocytes differentiated with IL-‐15 support Th17 and Th1 responses to wheat gliadin: implications for celiac disease. Clin Immunol. 2010, 135: 430-‐9.
Bibliografia
117
Hartnett L et al. Inflammation, DNA methylation and colitis-‐associated cancer. Carcinogenesis. 2012, 33: 723-‐31.
Hayden MS et al. NF-‐κB in immunobiology. Cell Res. 2011, 21: 223-‐44.
Hayden MS et al. Shared principles in NF-‐kappaB signaling. Cell. 2008, 132: 344-‐62.
He D et al. Coexpression network analysis in chronic hepatitis B and C hepatic lesions reveals distinct patterns of disease progression to hepatocellular carcinoma. J Mol Cell Biol. 2012, 4: 140-‐52.
Heap GA et al. Genetics and pathogenesis of coeliac disease. Semin Immunol. 2009, 21: 346-‐54.
Hindorff LA et al. Potential etiologic and functional implications of genome-‐wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106: 9362-‐7.
Hiraoka S et al. Methylation status of normal background mucosa is correlated with occurrence and development of neoplasia in the distal colon. Hum Pathol. 2010, 41: 38-‐47.
Hiscott J et al. Characterization of a functional NF-‐kappa B site in the human interleukin 1 beta promoter: evidence for a positive autoregulatory loop. Mol Cell Biol. 1993, 13: 6231-‐40.
Hollox EJ et al. Extensive normal copy number variation of a beta-‐defensin antimicrobial-‐gene cluster. Am J Hum Genet. 2003, 73: 591–600.
Hollox EJ et al. Psoriasis is associated with increased beta-‐defensin genomic copy number. Nat Genet. 2008, 40: 23-‐5.
Hollox EJ. Copy number variation of beta-‐defensins and relevance to disease. Cytogenet Genome Res. 2008, 123: 148–55.
Holopainen P et al. Candidate gene region 2q33 in European families with coeliac disease. Tissue Antigens. 2004, 63: 212-‐22.
Homma Y et al. The Th2 transcription factor c-‐Maf inhibits IL-‐12p35 gene expression in activated macrophages by targeting NF-‐kappaB nuclear translocation. J Interferon Cytokine Res. 2007, 27: 799-‐808.
Horton R et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 2004, 5: 889-‐99.
Hovhannisyan Z et al. The role of HLA-‐DQ8 beta57 polymorphism in the anti-‐gluten T-‐cell response in coeliac disease. Nature. 2008; 456: 534-‐8.
Hüe S et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 2004, 21: 367-‐77.
Hunt KA et al. Negligible impact of rare autoimmune-‐locus coding-‐region variants on missing heritability. Nature. 2013, 498: 232-‐5.
Bibliografia
118
Hunt KA et al. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nat Genet. 2008, 40: 395-‐402.
Husby S et al. European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition guidelines for the diagnosis of coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2012, 54: 136-‐60.
Huse K et al. Genetic variants of the copy number polymorphic beta-‐defensin locus are associated with sporadic prostate cancer. Tumour Biol 2008;29: 83–92.
Ivarsson A et al. Epidemic of coeliac disease in Swedish children. Acta Paediatr. 2000, 89: 165-‐71.
Jabri B et al. Tissue-‐mediated control of immunopathology in coeliac disease. Nat Rev Immunol. 2009, 9: 858-‐70.
Jacobson N. Basic Algebra. Dover Pubn Inc 2009; Mineola, NY.
Jansen PA et al. Beta-‐defensin-‐two protein is a serum biomarker for disease activity in psoriasis and reaches biologically relevant concentrations in lesional skin. PLoS ONE 2009;4:e4725.
Javierre BM et al. Changes in the pattern of DNA methylation associate with twin discordance in systemic lupus erythematosus. Genome Res. 2010, 20: 170-‐9.
Karell K et al. HLA types in celiac disease patients not carrying the DQA1*05-‐DQB1*02 (DQ2) heterodimer: results from the European Genetics Cluster on Celiac Disease. Hum Immunol. 2003, 64: 469-‐77.
Karlen Y et al. Statistical significance of quantitative PCR. BMC Bioinformatics. 2007, 8: 131.
Kawadler H et al. The paracaspase MALT1 controls caspase-‐8 activation during lymphocyte proliferation. Mol Cell. 2008, 31: 415-‐21.
Khuffash FA et al. Coeliac disease among children in Kuwait: difficulties in diagnosis and management. Gut. 1987, 28: 1595-‐9.
Koskinen LL et al. Fine mapping of the CELIAC2 locus on chromosome 5q31-‐q33 in the Finnish and Hungarian populations. Tissue Antigens. 2009, 74: 408-‐16.
Kunsch C et al. NF-‐kappa B subunit-‐specific regulation of the interleukin-‐8 promoter. Mol Cell Biol. 1993, 13: 6137-‐46.
Lander ES et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001, 409: 860-‐921. Erratum in: Nature 2001, 412: 565. Nature 2001, 411: 720.
León AJ et al. Interleukin 18 maintains a long-‐standing inflammation in coeliac disease patients. Clin Exp Immunol. 2006, 146: 479-‐85.
Lerner A. New therapeutic strategies for celiac disease. Autoimmun Rev. 2010, 9: 144-‐7.
Bibliografia
119
Libermann TA et al. Activation of interleukin-‐6 gene expression through the NF-‐kappa B transcription factor. Mol Cell Biol. 1990, 10: 2327-‐34.
Lindfors K et al. A role for anti-‐transglutaminase 2 autoantibodies in the pathogenesis of coeliac disease? Amino Acids. 2009, 36: 685-‐91.
Lister R et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 2009, 462: 315-‐22.
Livak KJ et al. Analysis of relative gene expression data using real-‐time quantitative PCR and the 2(-‐Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001, 25: 402-‐8.
Ludwig H et al. Association of HL-‐A1 and HL-‐A8 with childhood celiac disease. Z Immunitatsforsch Exp Klin Immunol. 1973; 146: 158-‐67.
Lundin KE et al. Gliadin-‐specific, HLA-‐DQ(alpha 1*0501,beta 1*0201) restricted T cells isolated from the small intestinal mucosa of celiac disease patients. J Exp Med. 1993, 178: 187-‐96.
Lundin KE et al. T lymphocyte recognition of a celiac disease-‐associated cis-‐ or trans-‐encoded HLA-‐DQ alpha/beta-‐heterodimer. J Immunol. 1990, 145: 136-‐9.
Maiuri L et al. Association between innate response to gliadin and activation of pathogenic T cells in coeliac disease. Lancet. 2003, 362: 30-‐7.
Maiuri L et al. Definition of the initial immunologic modifications upon in vitro gliadin challenge in the small intestine of celiac patients. Gastroenterology. 1996, 110: 1368-‐78.
Maiuri L et al. In vitro activities of A-‐gliadin-‐related synthetic peptides: damaging effect on the atrophic coeliac mucosa and activation of mucosal immune response in the treated coeliac mucosa. Scand J Gastroenterol. 1996, 31: 247-‐53.
Mäki M et al. Coeliac disease. Lancet. 1997, 349: 1755-‐9.
Mäki M. The humoral immune system in coeliac disease. Baillieres Clin Gastroenterol. 1995, 9: 231-‐49.
Marsh MN. Gluten, major histocompatibility complex, and the small intestine. A molecular and immunobiologic approach to the spectrum of gluten sensitivity ('celiac sprue'). Gastroenterology. 1992, 102: 330-‐54.
Martín-‐Pagola A et al. Analysis of the expression of MICA in small intestinal mucosa of patients with celiac disease. J Clin Immunol. 2003, 23: 498-‐503.
Martín-‐Pagola A et al. MICA response to gliadin in intestinal mucosa from celiac patients. Immunogenetics. 2004, 56: 549-‐54.
Mazzarella G et al. An immunodominant DQ8 restricted gliadin peptide activates small intestinal immune response in in vitro cultured mucosa from HLA-‐DQ8 positive but not HLA-‐DQ8 negative coeliac patients. Gut. 2003, 52: 57-‐62.
Bibliografia
120
Medina I et al. Babelomics: an integrative platform for the analysis of transcriptomics, proteomics and genomic data with advanced functional profiling. Nucleic Acids Res. 2010, 38: W210-‐3.
Medrano LM et al. Th17-‐related genes and celiac disease susceptibility. PLoS One. 2012, 7:e31244.
Mill J et al. Epigenomic profiling reveals DNA-‐methylation changes associated with major psychosis. Am J Hum Genet. 2008, 82: 696-‐711.
Monsuur AJ et al. Myosin IXB variant increases the risk of celiac disease and points toward a primary intestinal barrier defect. Nat Genet. 2005, 37: 1341-‐4.
Monteleone G et al. Role of interferon alpha in promoting T helper cell type 1 responses in the small intestine in coeliac disease. Gut. 2001, 48: 425-‐9. Erratum in: Gut 2001, 48: 584.
Monteleone I et al. Characterization of IL-‐17A-‐producing cells in celiac disease mucosa. J Immunol. 2010, 184: 2211-‐8.
Moodie SJ et al. Analysis of candidate genes on chromosome 19 in coeliac disease: an association study of the KIR and LILR gene clusters. Eur J Immunogenet. 2002, 29: 287-‐91.
Moskalev EA et al. Correction of PCR-‐bias in quantitative DNA methylation studies by means of cubic polynomial regression. Nucleic Acids Res. 2011, 39: e77.
Mostafavi S et al. GeneMANIA: a real-‐time multiple association network integration algorithm for predicting gene function. Genome Biol. 2008, 9 Suppl 1:S4.
Murray JA et al. Trends in the identification and clinical features of celiac disease in a North American community, 1950-‐2001. Clin Gastroenterol Hepatol. 2003, 1: 19-‐27.
Nilsen EM et al. Gluten specific, HLA-‐DQ restricted T cells from coeliac mucosa produce cytokines with Th1 or Th0 profile dominated by interferon gamma. Gut. 1995, 37: 766-‐76.
Núñez C et al. IL23R: a susceptibility locus for celiac disease and multiple sclerosis? Genes Immun. 2008, 9: 289-‐93.
Paliwal A et al. Quantitative detection of DNA methylation states in minute amounts of DNA from body fluids. Methods. 2010, 52: 242-‐7.
Parmar A et al. Gene Expression Profiling of Gliadin Effects on Intestinal Epithelial Cells Suggests Novel Non-‐Enzymatic Functions of Pepsin and Trypsin. PLoS One. 2013, 8: e66307.
Picarelli A et al. 31-‐43 amino acid sequence of the alpha-‐gliadin induces anti-‐endomysial antibody production during in vitro challenge. Scand J Gastroenterol. 1999, 34: 1099-‐102.
Bibliografia
121
Plaza-‐Izurieta L et al. Revisiting genome wide association studies (GWAS) in coeliac disease: replication study in Spanish population and expression analysis of candidate genes. J Med Genet. 2011, 48: 493-‐6.
Ploski R et al. On the HLA-‐DQ(alpha 1*0501, beta 1*0201)-‐associated susceptibility in celiac disease: a possible gene dosage effect of DQB1*0201. Tissue Antigens. 1993, 41: 173-‐7.
Plot L et al. Infectious associations of Celiac disease. Autoimmun Rev. 2009, 8: 316-‐9.
Putkonen MT et al. Factors affecting the STR amplification success in poorly preserved bone samples. Investig Genet. 2010, 1: 9.
Qian ZR et al. Inactivation of RASSF1A tumor suppressor gene by aberrant promoter hypermethylation in human pituitary adenomas. Lab Invest. 2005, 85: 464-‐73.
Rabassa EB et al. Coeliac disease in Cuban children. Arch Dis Child. 1981, 56: 128-‐31.
Rakyan VK et al. Epigenome-‐wide association studies for common human diseases. Nat Rev Genet. 2011, 12: 529-‐41.
Rawlings DJ et al. The CARMA1 signalosome links the signalling machinery of adaptive and innate immunity in lymphocytes. Nat Rev Immunol. 2006, 6: 799-‐812.
Rebeaud F et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nat Immunol. 2008, 9: 272-‐81.
Redon R et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 2006, 444: 444-‐54.
Rosebeck S et al. From MALT lymphoma to the CBM signalosome: three decades of discovery. Cell Cycle. 2011, 10: 2485-‐96.
Rueda B et al. Association study of functional genetic variants of innate immunity related genes in celiac disease. BMC Med Genet. 2005, 6: 29.
Ryan AW et al. Chromosome 5q candidate genes in coeliac disease: genetic variation at IL4, IL5, IL9, IL13, IL17B and NR3C1. Tissue Antigens. 2005, 65: 150-‐5.
Sagaró E et al. Family studies of coeliac disease in Cuba. Arch Dis Child. 1981, 56: 132-‐3.
Saito T et al. Principles of intracellular viral recognition. Curr Opin Immu-‐nol 2007;19:17–23.
Sandelin A et al. ConSite: web-‐based prediction of regulatory elements using cross-‐species comparison. Nucleic Acids Res. 2004, 32: W249-‐52.
Santin I et al. Toll-‐like receptor 4 (TLR4) gene polymorphisms in celiac disease. Tissue Antigens. 2007, 70: 495-‐8.
Santin I et al. Association of KIR2DL5B gene with celiac disease supports the susceptibility locus on 19q13.4. Genes Immun. 2007, 8: 171-‐6.
Bibliografia
122
Santin I, et al. Killer cell immunoglobulin-‐like receptor (KIR) genes in the Basque population: association study of KIR gene contents with type 1 diabetes mellitus. Hum Immunol. 2006, 67: 118-‐24.
Schindler U et al. Three NF-‐kappa B binding sites in the human E-‐selectin gene required for maximal tumor necrosis factor alpha-‐induced expression. Mol Cell Biol. 1994, 14: 5820-‐31.
Schrider DR et al. Lower linkage disequilibrium at CNVs is due to both recurrent mutation and transposing duplications. Mol Biol Evol. 2010, 27: 103-‐11.
Schuppan D et al. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterology. 2009, 137: 1912-‐33.
Seegers D et al. IL12B and IRF1 gene polymorphisms and susceptibility to celiac disease. Eur J Immunogenet. 2003, 30: 421-‐5.
Shen X et al. Distinct functional patterns of gene promoter hypomethylation and hypermethylation in cancer genomes. PLoS One. 2012, 7: e44822.
Sjöström H et al. Identification of a gliadin T-‐cell epitope in coeliac disease: general importance of gliadin deamidation for intestinal T-‐cell recognition. Scand J Immunol. 1998, 48: 111-‐5.
Sollid LM et al. Evidence for a primary association of celiac disease to a particular HLA-‐DQ alpha/beta heterodimer. J Exp Med. 1989, 169: 345-‐50.
Sollid LM et al. HLA susceptibility genes in celiac disease: genetic mapping and role in pathogenesis. Gastroenterology. 1993, 105: 910-‐22. Erratum in: Gastroenterology 1994, 106: 1133.
Sollid LM. Coeliac disease: dissecting a complex inflammatory disorder. Nat Rev Immunol. 2002, 2: 647-‐55.
Spielmann M et al. CNVs of noncoding cis-‐regulatory elements in human disease. Curr Opin Genet Dev. 2013, 23: 249-‐56.
Spurkland A et al. HLA-‐DR and –DQ genotypes of celiac disease patients serologically typed to be non-‐DR3 or non-‐DR5/7. Hum Immunol. 1992, 35: 188-‐92.
Steinman L. A brief history of T(H)17, the first major revision in the T(H)1/T(H)2 hypothesis of T cell-‐mediated tissue damage. Nat Med. 2007, 13: 139-‐45. Erratum in: Nat Med. 2007, 13: 385.
Stenman SM et al. Secretion of celiac disease autoantibodies after in vitro gliadin challenge is dependent on small-‐bowel mucosal transglutaminase 2-‐specific IgA deposits. BMC Immunol. 2008, 9: 6.
Stone KP et al. NFĸB is an unexpected major mediator of interleukin-‐15 signaling in cerebral endothelia. Cell Physiol Biochem. 2011, 28: 115-‐24.
Sturgess R et al. Wheat peptide challenge in coeliac disease. Lancet. 1994, 343: 758-‐61.
Bibliografia
123
Suliman GI. Coeliac disease in Sudanese children. Gut. 1978, 19: 121-‐5.
Sun Z et al. PKC-‐theta is required for TCR-‐induced NF-‐kappaB activation in mature but not immature T lymphocytes. Nature. 2000, 404: 402-‐7.
Szebeni B et al. Increased mucosal expression of Toll-‐like receptor (TLR)2 and TLR4 in coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2007, 45: 187-‐93.
Tahvanainen J et al. PRELI is a mitochondrial regulator of human primary T-‐helper cell apoptosis, STAT6, and Th2-‐cell differentiation. Blood. 2009, 113: 1268-‐77.
Takeda K et al. Toll-‐like receptors. Annu Rev Immunol 2003;21: 335–76.
Tieri P et al. Charting the NF-‐κB pathway interactome map. PLoS One. 2012, 7: e32678.
Troncone R et al. Majority of gliadin-‐specific T-‐cell clones from celiac small intestinal mucosa produce interferon-‐gamma and interleukin-‐4. Dig Dis Sci. 1998, 43: 156-‐61.
Trynka G et al. Dense genotyping identifies and localizes multiple common and rare variant association signals in celiac disease. Nat Genet. 2011, 43: 1193-‐201.
Trynka G et al. Coeliac disease-‐associated risk variants in TNFAIP3 and REL implicate altered NF-‐kappaB signalling. Gut. 2009, 58: 1078-‐83.
Urban TJ et al. CCL3L1 and HIV/AIDS susceptibility. Nat Med. 2009, 15: 1110-‐2.
Vaissière T et al. Quantitative analysis of DNA methylation after whole bisulfitome amplification of a minute amount of DNA from body fluids. Epigenetics. 2009, 4: 221-‐30.
van Belzen MJ et al. Defining the contribution of the HLA region to cis DQ2-‐positive coeliac disease patients. Genes Immun. 2004, 5: 215-‐20.
Van Belzen MJ et al. A major non-‐HLA locus in celiac disease maps to chromosome 19. Gastroenterology. 2003, 125: 1032-‐41.
van der Slik AR et al. KIR in type 1 diabetes: disparate distribution of activating and inhibitory natural killer cell receptors in patients versus HLA-‐matched control subjects. Diabetes. 2003, 52: 2639-‐42.
van Heel DA et al. A genome-‐wide association study for celiac disease identifies risk variants in the region harboring IL2 and IL21. Nat Genet. 2007, 39: 827-‐9.
Venter JC et al. The sequence of the human genome. Science. 2001, 291: 1304-‐51. Erratum in: Science 2001, 292: 1838.
Wang S et al. Relationship between tumor DNA methylation status and patient characteristics in African-‐American and European-‐American women with breast cancer. PLoS One. 2012, 7: e37928.
Wapenaar MC et al. Associations with tight junction genes PARD3 and MAGI2 in Dutch patients point to a common barrier defect for coeliac disease and ulcerative colitis. Gut. 2008, 57: 463-‐7.
Bibliografia
124
Wapenaar MC et al. The interferon gamma gene in celiac disease: augmented expression correlates with tissue damage but no evidence for genetic susceptibility. J Autoimmun. 2004, 23: 183-‐90.
Weersma RK et al. ATG16L1 and IL23R are associated with inflammatory bowel diseases but not with celiac disease in the Netherlands. Am J Gastroenterol. 2008, 103: 621-‐7.
Wehkamp J et al. Barrier dysfunction due to distinct defensin deficiencies in small intestinal and colonic Crohn’s disease. Mucosal Immunol 2008;1:S67–74.
Xu LG et al. TNFR-‐associated factor-‐3 is associated with BAFF-‐R and negatively regulates BAFF-‐R-‐mediated NF-‐kappa B activation and IL-‐10 production. J Immunol. 2002, 169(12):6883-‐9.
Yamamoto K et al. Transcriptional roles of nuclear factor kappa B and nuclear factor-‐interleukin-‐6 in the tumor necrosis factor alpha-‐dependent induction of cyclooxygenase-‐2 in MC3T3-‐E1 cells. J Biol Chem. 1995, 270: 31315-‐20.
Yang AS et al. A simple method for estimating global DNA methylation using bisulfite PCR of repetitive DNA elements. Nucleic Acids Res. 2004, 32: e38.
Yao C et al. Reproducibility and concordance of differential DNA methylation and gene expression in cancer. PLoS One. 2012, 7: e29686.
Yoo CB et al. Epigenetic therapy of cancer: past, present and future. Nat Rev Drug Discov. 2006, 5: 37-‐50.
Zanoni G et al. In celiac disease, a subset of autoantibodies against transglutaminase binds toll-‐like receptor 4 and induces activation of monocytes. PLoS Med 2006;3:e358.
Zheng ZL et al. Transcriptome comparison and gene coexpression network analysis provide a systems view of citrus response to 'Candidatus Liberibacter asiaticus' infection. BMC Genomics. 2013, 14: 27.
