Atina Hussaana

Dept. Pharmacology & Therapy

Medical Faculty of UNISSULA

Preparasi

BahanEKSTRAKSI

Identifikasi

Kualitatif

Identifikasi

Kuantitatif

(Penetapan

Kadar)

Fraksinasi

Isolasi

Pemurnian

Pembuatan

Simplisia

STANDARISASI

(senyawa marker)

Alkaloid

Flavonoid

Terpenoid

Saponin

Bioassay in vitro

Bioassay in vivo

Clinical

assay

ALUR PENELITIAN BA /TO/OT

GOLONGAN

Penentuan

Struktur

kimia

TEKNIK IDENTIFIKASI KUALITATIF

Fraksinasi Pereaksi Pewarna Reaksi

Warna

Kromatografi

(KLT)

Pereaksi Pewarna

(Semprot)

Bercak

Berwarna

Sinar UV

254 dan 366 nm

Bercak

Berpendar

+

+

GOLONGAN

APA?

Dibandingkan

warna / Rf

dengan bercak

senyawa standar

SENYAWA

APA?

Identifikasi

Kualitatif

Alkaloid

GOLONGAN

Identifikasi Alkaloid : Metoda Culvenor-Fiztgerald

Kira-kira 4 gram sampel segar dirajang halus dan digerus dalam

lumpang dengan bantuan pasir, lalu ditambahkan kloroform

sedikit sampai membentuk pasta.

Tambahkan 10 ml larutan amoniak-kloroform 0.05 N dan digerus

lagi, saring campuran kedalam sebuah tabung reaksi kering.

Tambahkan 10 ml H2SO4 2 N dan kocok kuat. Diamkan larutan

sampai terbentuk dua lapisan.

Dengan menggunakan pipet yang telah diberi kapas pada

ujungnya untuk menyaring, ambil lapisan asam sulfat dan

masukan kedalam tabung reaksi kecil ( Lapisan kloroform

disimpan untuk pengujian terpenoid ).

Filtrat diuji dengan pereaksi Mayer, Wagner dan Dragendorf.

Terbentuknya endapan putih atau keruh dengan pereaksi Mayer.

Endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan orange

dengan pereaksi Dragendorf menunjukan sampel mengandung

alkaloid.

Pereaksi PewarnaFraksinasi +

Identifikasi

Kualitatif

Flavonoid

GOLONGAN

Identifikasi Flavonoid : Shinoda Test / sianidin Test

Kira-kira 0.5 mg sampel yang telah dirajang halus,

diekstrak dengan 5 ml metanol dan dipanaskan selama

5 menit dalam tabung reaksi. Ekstraknya ditambahkan

beberapa tetes HCl pekat dan sedikit serbuk

magnesium. Bila terjadi perubahan warna merah/pink

atau kuning menunjukan sampel mengandung

flavonoid.

Pereaksi PewarnaFraksinasi +

Identifikasi

Kualitatif

Terpenoid

GOLONGANIdentifikasi Steroid / terpenoid : Metode Lieberman-

Burchard

Beberapa tetes kloroform pada uji alkaloid,

ditempatkan pada plat tetes. Tambahkan anhidrida

asetat 5 tets dan biarkan mengering. Kemudian

ditambahkan 3 tetes H2SO4 pekat. Timbulnya warna

merah jingga atau ungu menandakan uji positif

terhadap terpenoid, warna biru atau hijau

menunjukkan positif terhadap steroid

Pereaksi PewarnaFraksinasi +

Identifikasi

Kualitatif

Saponin

GOLONGANIdentifikasi Saponin : Uji Busa

Uji saponin ini sebaiknya digunakan sampel yang

telah dikeringkan, karena test yang digunakan adalah

test pembentukan busa. Bila sampel yang basah

dididihkan dengan air suling, kemungkinan cairan sel

akan membentuk busa bila dikocok.

Caranya : sampel kering dirajang halus, dimasukan

kedalam tabung reaksi dan ditambahkan air suling,

didihkan selama 2-3 menit. Dinginkan, setelah dingin

dikocok dengan kuat. Adanya busa yang stabil selama

5 menit berarti sampel mengandung saponin.

Pereaksi PewarnaFraksinasi +

METODA PEMISAHAN

Kromatografi : adalah suatu tehnik pemisahan tertentu, yang

pada dasarnya menggunakan dua fase yaitu satu fase tetap

(stationary) dan yang lain fase bergerak (mobile).

Kromatografi kertas (KKt)

Kromatografi lapisan tipis (KLT)

Kromatografi gas cair (KGC)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

KKt untuk senyawa yang mudah larut dalam air (misalnya :

karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat, asam organik,

senyawa fenolat).

KLT untuk senyawa yang larut dalam lipid (misalnya : lipid,

steroid, karotenoid, kuinon).

KGC untuk pemisahan senyawa atsiri yaitu asam lemah,

seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa belerang.

KCKT untuk senyawa yang keatsiriannya kecil.

POLA KROMATOGRAM

Ekstrak ditinbang, diekstraksi dengan pelarut dan cara

tertentu, kemudian dilakukan analisis kromatografi

sehingga memberikan pola kromatogram yang khas.

Kadar Total Golongan Kandungan Kimia

Dengan penerapan metode spektrofotometri, titrimetri,

volumetri, gravimetri atau lainnya, dapat ditetapkan kadar

golongan kandungan kimia.

Ada beberapa golongan kandungan kimia yang dapatdikembangkan dan ditetapkan metodenya, yaitu :

Golongan minyak atsiri

Golongan steroid

Golongan tanin

Golongan flavonoid

Golongan triterpenoid (saponin)

Golongan alkaloid

Golongan antrakinon

Kadar Kandungan Kimia Tertentu

Dengan tersedianya suatu kandungan kimia yang berupa

senyawa identitas atau senyawa kimia utama ataupun

kandungan kimia lainnya, maka secara kromatografi

instrumental dapat dilakukan penetapan kadar kandungan

kimia tersebut.

T U J U A N :

Memberikan data kadar kandungan kimia tertentu sebagai

senyawa yang diduga bertanggung jawab pada efek

farmakologi.

Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

Umumnya dibuat kromatogram pada lempeng silika dengan

berbagai jenis fase gerak sesuai dengan golongan kandungan

kimia sebagai sasaran analisis.

Kromatografi Gas Cair (KGC)

Sistem kromatografi gas cair mempunyai resolusi tinggi

sehingga optimal untuk pemisahan komponen yang stabil

dengan pemanasan.

yang

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT / HPLC)

Umumnya pola kromatogram kandungan kimiatermolabil dibuat dengan HPLC

Penetapan Kadar :

Minyak atsiri : destilasi

Steroid

Tanin

: spektrofotometri

: titrasi dengan KMnO4 (Permanganometri)

Flavonoid spektrofotometri

Saponin

Alkaloid

Antrakuinon

: hidrolisis, ekstraksi dan

: hemolisa

: ekstraksi dan spektrofotometri

: ekstraksi dan spektrofotometri

KLT lebih baik dari KKt yaitu dalam keserbagunaan, kecepatandan kepekaannya. Ini karena pada KLT dapat digunakanbermacam-macam zat penyerap lainnya selain cellulosa, yaitu :silika gel, aluminium oksida, kalsium hidroksida, damar penukarion, magnesium fosfat, poliamida, polivinil pirolidon.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT / HPLC )

Hampir sama dengan KGC

KCKT dilakukan dalam suhu kamar

fenol , KCKT digunakan untuk senyawa-senyawa : terpemoid, alkaloid , lipid , gula.

Setelah senyawa diisolasi dan dimurnikan , pertama-tamaditentukan golongannya dulu, kemudian baru ditentukan jenissenyawa dalam golongan tersebut.

Metoda Identifikasi dilakukan dengan spektrofotometri :

Spektroskopi UV (Ultra Violet)

Spektroskopi IM (Infra Merah)

Spektroskopi Massa ( S.M. )

Spektroskopi RMI ( Resonansi Magnet Inti )

Spektroskopi UV ( Ultra Violet )

Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalamlarutan yang sangat encer dengan pembanding blanko pelarutserta menggunakan spektrofotometer yang merekamotomatis. Senyawa tak berwarna diukur pada jangka 200sampai 400 nm, senyawa berwarna pada jangka 200 sampai700 nm.

Spektroskopi IM ( Infra Merah )

Spektrum infra merah tumbuhan dapat diukur denganspektrofotometri infra merah yang merekam secara otomatisdalam bentuk larutan ( dalam khloroform,karbontetrakhlorida, 1-5 % ), bentuk gerusan dalam minyaknuyol, atau bentuk padat yang dicampur dengan kaliumbromida.

Spektroskopi Massa (S.M. )

Spektroskopi Massa adalah penguraian sesepora

senyawa organik dan perekaman pola fragmentasi

menurut massanya.

Spektroskopi RMI

Spektroskopi

menentukan

RMI

struktur

merupakan

senyawa

sarana

organik

untuk

dengan

mengukur momen magnet atom hidrogennya.

Pada analisa hasil yang dilakukan adalah :

Analisa kualitatif

Analisa kuantitatif

Analisa kualitatif : Pada

diharapkan ditemukan beberapa kandungan

analisa kulaitatif, ini

yang

mempunyai struktur baru.

Analisa kuantitatif : Yaitu penentuan banyaknya

( jumlah gram ) senyawa yang ditemukan, biasanya

ditentukan dalam persentase.

Kromatografi

: suatu teknik pemisahan tertentu yang pada

dasarnya menggunakan 2 fase : fase tetap

(stationary) & fase bergerak (mobile).

Penggolongan sesuai dengan sifat-sifat dari

fase tetap, yang bisa berupa zat padat / zat

cair.

Jika fase tetap berupa zat padat disebut :

kromatografi serapan

Jika fase tetap berupa zat cair disebut :

kromatografi partisi.

TEKNIK KROMATOGRAFI

Keuntungan kromatografi :

Merupakan metode pemisahan yang

cepat, mudah, murah & sederhana,

membutuhkan campuran cuplikan sedikit

sekali.

Dapat diulang.

Kromatografi Lapisan Tipis :

metoda pemisahan fisikokimia menggu-

nakan lapisan tipis yang dilekatkan pada

penyokong berupa plat dari gelas / logam.

Keunggulan : lebih peka (dapat memisahkan

bahan yang jumlahnya sedikitnya / ukuran µg)

Deteksinya : dengan penyemprotan pereaksi

pewarna / lampu UV.

Biasanya untuk pemisahan senyawa larut lipid

(misalnya: lipid, steroid, karotenoid, kuinon )

Fase diam biasanya : silica gel

Fase gerak :

campuran pelarut organik dengan polaritas

rendah.

Penempatan cuplikan dengan pipa kapiler

/ mikropipet pada salah satu ujung plat KLT.

Kemudian plat KLT ditaruh dalam bejana

yang sudah ada dan dijenuhi dengan fase

gerak.

Deteksi hasil KLT :

•Untuk senyawa tak berwarna pada

kromatogram dengan alat UV pendek

(254 nm) & atau panjang (365 nm).

•Senyawa dengan 2 ikatan rangkap / lebih &

senyawa aromatik (benzena) punya serapan

kuat di 230 - 300 nm.

•Deteksi dengan pereaksi pewarna semprot.

Menggunakan alat penyemprot khusus.

•Metoda deteksi biologi untuk mendeteksi

senyawa kimia dengan aktivitas biologi

tertentu.

CONTOH KROMATOGRAM dengan pereaksi pewarna

Gambar 32. Hasil KLT trans- dan cis-UCA

Larutan trans-UCA 4% dalam

DMSO dipapar radiasi UVB

selama 60 menit, akan

mengalami isomerasi, sebagian

berubah menjadi konformasi

cis. a. trans-UCA murni b. hasil

ekspose trans-UCA pada

radiasi UVB.

Cis-UCA

Rf : 7/8.5

= 0.82

Trans-UCA

Rf : 4/8.5

= 0.47

a

b

CONTOH KROMATOGRAM dengan deteksi UV

Identifikasi & harga-harga Rf

Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal

Harga Rf = --------------------------------------------------------------------

Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal

Rx / Rstd =

Jarak yang digerakkan oleh senyawa yang tak diketahui

--------------------------------------------------------------------------

Jarak yang digerakkan oleh senyawa standart yang

diketahui

Faktor yang mempengaruhi gerakan noda

dalam KLT (mempengaruhi harga Rf) :

a. struktur kimia dari senyawa yang

sedang dipisahkan.

b. sifat penyerap dan derajat aktifitasnya

c. tebal dan kerataan lapisan penyerap

d. pelarut & derajat kemurnian fase

bergerak

e. derajat kejenuhan dari uap dalam

bejana

f. teknik percobaan

g. jumlah cuplikan yang digunakan

h. suhu

i. kesetimbangan

Pembuatan Kromatogram

Totolkan cuplikan dengan pipa kapiler, pada jarak ± 1

cm dari bagian bawah plat KLT.

(plat kecil noda berupa titik, plat besar noda berupa

deretan titik membentuk garis). Biarkan beberapa saat

hingga kering. Penotolan cuplikan dapat diulang

seperlunya, pada tempat yg sama.

Plat KLT dimasukkan dalam bejana yang berisi fase

gerak (noda jangan sampai tercelup )

Setelah fase bergerak naik sampai hampir ujung atas

plat, plat kemudian diambil dan dibiarkan kering.

Tentukan harga Rf.

33

THANK

Y O

T H A N K Y O U