Embed Size (px)
Citation preview
Innhold
1 Teori om kromatografi 41.1 Retensjonsparametre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.2 Sonespredning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.3 van Deemter-ligningen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.4 Kolonnematerialet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.5 Væske-væske-fordelingskromatografi (LLC) . . . . . . . . . . . . . . 8
2 Adsorpsjonskromatografi 92.1 Krefter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.2 Adsjorpsjonsmiddelet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.3 Tynnsjiktkromatografi (TLC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.4 Organiske polymere adrorpsjonsmidler . . . . . . . . . . . . . . . . 132.5 Elueringsmiddelet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142.6 Analyttens innvirkning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.7 Temperaturens innvirkning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.8 Tørrkolonnekromatografi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162.9 Lavttrykk og Flash kolonnekromatografi . . . . . . . . . . . . . . . 16
3 Gasskromatografi (GC) 163.1 GSC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173.2 GLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4 Analyser ved hjelp av kromatografi 214.1 Kvalitative analyser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214.2 Kvantitative analyser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
5 Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) 26
6 Ionebytterkromatografi (IEC) 28
7 Elektroforese (EF) 317.1 Teori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317.2 Varmeutvikling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2
7.3 Elektroosmose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327.4 Effektivitet og oppløsning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 337.5 Viktige elektroforesemetoder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
8 Superkritisk fluid kromatografi (SFC) 35
9 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 369.1 Elueringsmiddelet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 379.2 Systemets oppbygging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389.3 Kolonnen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409.4 Detektorer for HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429.5 Solvofobe interaksjoner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 449.6 Spesielle kolonnetyper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
10 Kobling med MS 45
11 Forkortelser i KJ2053 47
3
1 Teori om kromatografi
1.1 Retensjonsparametre
Separasjon skjer som følge av at forskjellige stoffer har forskjellig retensjon. Re-tensjonen kommer av hvor lang tid et stoff bruker i mobilfasen i forhold til hvorlenge det er i stasjonærfasen. Fordelingskoeffisienten for dette kan oppgis som:
KC(X) =Cs,X
CMF,X
(1.1)
Retensjonsfaktoren k for en analytt oppgis som
kX =Ws,X
MF,X=
CS,X · VSCMF,X · VMF
= KC ·VSVMF
(1.2)
Et annet mål på retensjon er retarderingsfaktoren R, som kan uttrykkes som:
R =Mengde X i MFMengde X totalt
=CMF,X · VMF
CMF,X · VMF + CS,X · VS(1.3)
Retensjon i TLC beregnes med RF -verdier, som er et tall som beskriver graden avretensjonen til en flekk eller et bånd.
RF (X) =LX
LMF
(1.4)
hvor LX og LMF er vandringslengdene til henholdsvis analytten X og eluerings-middelet.
For å kunne beskrive akkurat hvor separert to stoff er, kan man beregne separa-sjonsfaktoren α:
α =k2k1
=tR2 − tMFtR1 − tMF
(1.5)
1.2 Sonespredning
Sonepredning er noe man ønsker å ha minst av i kromtografi. Det gjør at topperflyter over i hverandre, og separasjonen blir dårlig. Effektivitet og sonespredning er
4
derfor omvent korrelert. Platetallet N er et mål på effektiviteten av separasjonen,og kan regens ut på flere måter:
N =
(tRσt
)2
= 16 ·(tRwb
)2
= 5.545 ·(tRwh
)2
(1.6)
hvor tR er retensjonstiden til en analytt, wb er baselinjebredden av toppen, og wh
er halvhøyden av toppen.
Direkte fra platetallet kan man finne platehøyden H , som også er et mål på kolon-nens effektivitet hvis man ser bort fra kolonnens lengde, L.
H =L
N(1.7)
Man kan også komme borti at det er brukt effektive platetall og platehøyder. Deneneste forskjellen er at da har man benyttet justerte retensjonstider, som vil si att′R = tR − t0. Da får man Neff og Heff .
Oppløsningen RS mellom to separerte topper kan beregnes. Dette gjøres ved å taavstanden mellom toppene, og dividere på den gjennomsnittlige baselinjebreddentil de to toppene. I Figur 1.1 er dette illustrert.
RS =t2 − t1
0.5 · (wb,1 + wb,2)(1.8)
Figur 1.1: Illustrasjon av hvordan man måler oppløsningen mellom to topper i et kro-matogram.
Det er flere måte å oppgi oppløsningen på, og her er noen flere formler som kan
5
brukes:
RS =1
4·√Neff ·
α− 1
α=
1
4· (α− 1) ·
√N · k
1 + k(1.9)
Når RS = 1 tilsvarer det omtrent 3 % overlapp mellom de to toppene, og hvisRS = 1.5 regnes det som fullstendig baselinjeseparasjon.
En topp kan være svært asymmetrisk, og dette kan føre til at det blir vanskelig åbestemme riktige retensjonsparametere. For å kunne kvantifisere hvor asymmetrisken topp er, er asymmetrifaktoren definert:
AS =b
a(1.10)
hvor a og b er avstandene fra senter og ut til henholdsvis venstre og høyre side avtoppen, ved 10 % av topphøyden. Dersom AS = 1 betyr det at det er en perfektsymmetrisk topp, men om den er <1 betyr det fronting, og >1 indikerer tailing.
Figur 1.2: Asymmetrifaktor for en topp i et kromatogram.
1.3 van Deemter-ligningen
Den forenklede van Deemter-ligningen kan settes opp som:
HETP = A+B
u+ C · u (1.11)
hvor A kommer fra eddy diffusjon, B er fra longitudinal diffusjon, C er fra masse-transport og u er lineær gjennomsnittlig strømningshastighet. Leddet fra eddydiffusjon kan skrives som A = ce · dp, hvor ce er en proporsjonalitetsfaktor og dp erpartikkeldiameteren av pakningsmaterialet. Longitudinalleddet kan forklares vedBu
= cL·DM
uMF, hvor cL er en proposjonalitetsfaktor og DM er diffusjonskonstanten til
6
analytten i løsningsmiddelet. Massetransportleddet betegnes også ofte som mot-stand mot massetransport , og kan utdypes som C · u =
cMT ·d2p·uMF
DM, hvor cMT er en
proporsjonalitetskonstant.
Siden van Deemter-ligningen har en variabel, uMF , er det enkelt å plotte de for-skjellige leddene som funksjon av strømningshastigheten.
Figur 1.3: De forskjellige leddene i van Deemter-ligningen. Det er tydelig at denneligningen vil nå en optimal platehøyde ved en viss strømningshastighet.
1.4 Kolonnematerialet
Pakkematerialet er svært viktig med tanke på å begrense sonespredningen. Det ersærlig to egenskaper ved pakkematerialet som er viktig, og det er formen og størrel-sen av pakkepartiklene. Små homogene partikler gir ofte best separasjon og høyesteffektivitet. Dette kommer av at små partikler ofte er enklere å pakke tett, og atlike store partikler gir tilnærmet like lange strømningsveier gjennom kolonnen. Detfinnes mange typer pakningsmaterialer. Helt porøse partikler gir stor effektivitettil en liten penge, men dersom de er svært inhomogene kan de bli vanskelige åpakke tett nok. Overflateporøse partikler vil være f.eks. glasskuler belagt med ettynt lag stasjonærfase. Dette gjøres fordi det er en begrensning på hvor langt inn i
7
partikkelen prøvepartiklene faktisk diffunderer. Disse er enkle å pakke, tåler fysiskmye, men de har ikke så høy kapasitet.
I det siste er det funnet et nytt pakkemateriale brukt særlig i HPLC og UHPLC.Dette består av svært små partikler (1.5 - 3 µm), som har en kjerne av fused silikaog en stajsonærfase på utsiden. For makromolekyler som analyserer med HPLC kanman bruke kolonnepakningsmateriale som er kompakte sfæriske kuler med størrelserundt 2 µm. Dette kan lønne seg, siden store molekyler vil diffundere svært sakte,og ikke egentlig trenger porøse overflater på pakkematerialet. Gjennomstrømnings-media er en fellesbetegnelse på pakkemateriale hvor hele væskestrømmen passerergjennom makroporer i pakkematerialet. Store partikler med makroporer og mikro-porer i kombinasjon, membranfilterstabler og støpte monolittkolonner er eksemplerpå dette. Monolittkolonnene er veldig greie, med sin ikke-regulære struktur, mende kan løsne fra kolonneveggen, og da dannes kanaler med en gang og kolonnen erødelagt.
1.5 Væske-væske-fordelingskromatografi (LLC)
Denne formen for separasjon kommer av at man lar analyttmolekylene få velgehvilken av to ikke blandbare faser de vil være i. Væske-væaske ekstraksjon er dettidligste eksempelet på denne typen separasjoner. Dersom ett stoff har en prefe-ranse for den organiske fasen, men det andre stoffet trives i vannfasen, så separeresstoffene. Dette ble tidlig gjort i motstrømsoppsett med mange små likevekter.
Mangde slike separasjoner kan settes i kontinuerlig system dersom man lar dentyngere av de to væskefasene være stasjonørfase i form av små bobler, og manbruker den lettere fasen som mobilfase som pumpes forbi. Dette kan gjennomføres ipraksis ofte ved bruk av sentrifuger som stabiliserer stasjonærfasen med mobilfasenpumpes forbi. En slik teknikk vil gi mange små likevekter, men er en langsomseparasjonsteknikk.
8
2 Adsorpsjonskromatografi
Adsorpsjonskromatografi baserer seg på at det virker tiltrekkende krefter mellommolekyler. Kreftene som virker i adsorpsjonskromatografi kan deles inn i tre: Vander Waals krefter, hydrogenbindinger og Coulombkrefter.
2.1 Krefter
Van der Waals interaksjoner kan igjen deles inn i London dispersjonskrefter ogdipolkrefter. London dispersjonskrefter virker mellom store lett polariserbare mo-lekyler, ved at det induseres en dipol på hvert atom, som det virker tiltrekken-de krefter mellom. Dipolkreftene er delt opp i krefter som virker mellom dipol-dipol, og dipol-indusert dipol. Permanente dipoler finner man for eksempel i nitril-,karbonyl-, nitro-, ester- eller syreforbindelser. En illustrasjon av polare vs. upolaremolekyler er vist i Figur 2.1 under.
Figur 2.1: Oversikt over polare vs. upolare analyttmolekyler.
Hydrogenbindinger er sterke bindinger, og kan dannes mellom hydrogen, og etelektronrikt atom (ofte nitrogen eller oksygen). Silikagel er god til å danne hydro-genbindinger, siden denne har mange OH-grupper som kan interagere med protonpå prøvestoffene.
Coulombkrefter er ioniske interaksjoner mellom ladede partikler. Disse er sværtnyttige i for eksempel ionebytterkromatografi, men kan skape problemer andresteder dersom bindingen blir for sterk.
9
2.2 Adsjorpsjonsmiddelet
Adsorpsjonsmiddelet forbindes ofte med stasjonærfase eller kolonner, i motsetningtil mobilfase eller elueringsmiddel. For polare adsorpsjonsmidler virker som regeldipol-dipolkrefter og hydrogenbindinger. For upolare adsorpsjonsmidler er det vander Waalskreftene som dominerer.
Adsorpsjonsisotermene beskriver hvordan adsorpsjonen av et stoff varierer medkonsentrasjonen av mobilfasen. Adsorpsjonsisotermen skal ideelt sett være lineær,da får man helt symmetriske topper, men er som regel konveks. For konvense ad-sorpsjonsisotermer får man tailing for toppene.
Tailing kan komme av at det er forskjellig styrke på setene hvor molekyler kanadsorbere. Noen av disse er sterke, og der vil adsorpsjonen være sterkest. Det erønskelig å ha så jevn adsorpsjons som mulig for å forhindre tailing, og derfor erdet lurt å prøve å deaktivere de særlig sterke adsorpsjonssetene. Stoffet som datilsettes kalles moderator , og kan være f.eks. vann på en tørket silikaplate.
Surheten av adsorpsjonsmiddelet vil også være viktig for hvilke stoffer som blirsterkt retardert. Dersom adsorpsjonsmiddelet er sterkt surt, vil basiske stoffer re-tarderes i særlig stor grad, og motsatt med basiske adsorpsjonsmidler.
2.2.1 Silikagel
Silikagel er et av de viktigste adorsjonsmidlene. Silikagel fremstilles ved å reagerekvartssand (SiO2) med Na2CO3 som gir natriumsilikat (Na2SiO3). Denne reageresmed en syre og vann til den gir kiselsyre (Si(OH)4). Kiselsyren polymeriserer segtil større partikler, og over tid blir den til en eneste stor gel. Denne vaskes, trøkesog knuses til den silikagelen man kjøper og pakker kolonner med.
I silikagelen vil det være tre typer adsorpsjonsseter, rangert etter styrke: isolertsilanol (Si-OH) > hydrogenbundet silanol (Si-OH-O-Si) > > siloksan (Si-O-Si).Vekselsvirkningene mellom silikagelen og analyttmolekylene skjer ved to proses-
10
ser. Sorpsjon er prosessen hvor analyttmolekylene adsorberes utenpå ett eller flerelag med løsningsmiddel. Fortrengning er prosessen hvor molekylene fortrenger deløsningsmiddelmolekylene som allerede er adsorbert, og tar plass direkte på ad-sorpsjonssetet.
I separasjoner med silikagel er det hovedsaklig hydrogenbindinger som står forretensjon og separasjon. Derfor er det tydelig at stoffer separeres på bakgrunnav deres evne til å danne hydrogenbindinger. Dersom man bruker sterk base ien silikagelkolonne, risikerer man at silanolgruppene deprotoneres slik at man fårsiliat anioner. Da vil coulombinteraksjoner ta over, og alt går i dass...
2.2.2 Aluminiumoksid
Det er γ-formen av alumina Al2O3 som er aktivt adsorpsjonssete. Eksponerte alu-miniumatomer er lewissyrer, og vil derfor adsorbere lewisbaser svært godt. Alumi-niumsoksid er mer stabil enn silika ved basiske betingelser, men har generelt littlavere adsorpsjonsstyrke. Separasjonen skjer hovedsaklig på grunn av funskjonellegrupper i molekylene som skal separeres.
2.2.3 Andre adsorpsjonsmidler
Eksempler på andre adsorpsjonsmidler er f.eks. Florisil som er syntetisk magnesi-umsilikat. Polyamid er mye brukt som polar stasjonærfase med upolare løsnings-midler for separasjon av naturstoffer, og polart aktivt kull kan også benyttes tilnoen separasjoner f.eks. i hjemmebrenning for å bli kvitt organiske illluktende for-urensinger.
Silikagel har mange silanolgrupper somd et er enkelt å derivatisere. Et vanlig trikser å derivatisere de med klorsilaner, som i praksis fester på store upolare gruppersom (Si(CH3)2R). Dette vil gjøre at man får en omvendt fase silikagel hvor upolarestoffer vil retarderes mest. R-gruppen er ofte en alkylgruppe, og når lenden pådenne økes, vil man bevege seg fra adsropsjon til absorpsjon. Det er også et problemat ikke alle silanolgruppene derivatiseres, slik at man vil oppleve noe tailing grunnetdette.
11
2.3 Tynnsjiktkromatografi (TLC)
Tynnsjiktkromatografi er en planar kromatografiteknikk, og finnes i to versjoner:TLC og HPTLC. TLC er raskt, effektivt, billig, kan gjennomføres både analytiskog preparativt og man kan eluere mange prøver samtidig. Metoden baserer seg påat en mobilfase eluerer flekker med analytt oppover et tynt sjikt av stasjonærfase.For å sikre seg gode elueringsforhold er det viktig å ha en mettet atmosfære ielueringskammeret hvor man kjører TLC. TLC har mange fordeler i forhold tilkolonnekromatografi, men det er visse ulemper også. Mobilfasen vil ikke ha enhomogen vandringshastoghet, da det vil være avdamping fra platen. Dersom enblanding av to mobilfase benyttes, vil det kunne skje en selektiv avdamping, slikat konsentrasjonen endrer seg langs platen.
2.3.1 Deteksjon
Deteksjon kan være en utfordring ved TLC. Det er i hovedsak fire forskjellige de-teksjonsteknikker som benyttes for TLC: i) Fluorescerende stoffer kan detekteresmed en UV-lampe i en mørk boks. Flekkene vil da lyse opp, og man kan tegnerundt med en blyant. ii) Dersom stoffene ikke er fluorescerende, kan man tilsette etflouescerende stoff i stasjonærfasen. Dette vil gjøre at alt lyser opp i UV-lys bort-sett fra der det er stoffer, som vises som mørke flekker. iii) Dersom man eluererorganiske stoffer på uorganiske sjikt vil man kunne bruke joddamp til å detekte-re stoffene. De vil da vises som brune flekker. iv) Man kan kjemisk derivatisereflekkene, ofte med syrer som reduserer alt organisk materiale. Fosformolybdensyremed oppvarming vil gjøre organisk stoff grønnbrunt og platen elles blir gul.
2.3.2 Preparativ bruk
TLC kan også gjennomføres for å preparativt separere to stoffer. Man bruker dagjerne selvlagde plater med et mye tykkere sjikt, gjerne på glassplater. En stormengde stoffblanding appliseres i en lang strekbortover platen, som deretter elu-eres, slik at streken splittes i to bånd. Når prøven skal hentes ut skraper manenkelt av området hvor båndet man er interessert i er, og ekstraherer stoffet fradenne stasjonærfasen. Stoffmengdene som kan separerers ligger på rundt 1 gram
12
per plate, og det er relativt enkelt å oppskalere antall plater ved å eluere mangesamtidig.
2.3.3 HPTLC
Gjennomføres ofte automatisk, på tynnere sjikt, med finere partikler, mindre prøve-volum og kortere vandringslengder. Det vil likevel være mye høyere effektivitet forHPTLC, og den anses å være på høyde med HPLC. Det er mange forskjelligemåter HPTLC faktisk gjennomføres på, men det meste er automatisert, og vel-dig avansert. HPTLC er ofte omvendt-fase (polare MF), og benytter seg ofte avoppkonsentreringssoner for å gjøre runde flekker til tynne bånd.
2.4 Organiske polymere adrorpsjonsmidler
2.4.1 Cellulose
Cellulose er et tidligere mye brukt adsorpsjonsmiddel for fordelingskromatografi,papirkromatografi, papirelektroforese og kirale separasjoner. Det er et sterkt kje-misk og mekanisk materiale, og alle OH-gruppene gjør det mulig med omfattendederivatisering.
Figur 2.2: Celluloses polymerstruktur med mange OH-grupper
2.4.2 Agarose
Agarose har et ganske smalt bruksområde, rundt nøytrale pH (4-9). Den er brukt igelfiltreringer, gel-elektroforese, og sommatrix i ionebytter- og bio-affinitetskromatografi.
13
2.4.3 Polydekstran (Sephadex G)
Er et naturlig polysakkarid, hvor OH-gruppene kan brukes til derivatisering for åendre egenskapene til gelen. Brukes hovedsaklig til gelfiltrering. Er kjemisk sværtstabil, men ikke så mekanisk stabil.
2.4.4 Polystyren-gel
Syntetisk gel, som brukes hovedsaklig i gelpermeasjonskromatografi og som upolartadsorpsjonsmiddel i HPLC og GSC. Dersom fenylringene derivatiseres kan dennebrukes som matrix for ionebyttere og i omvendt fase HPLC.
2.4.5 Polyakrylat
Lages fra konjugerte estere. Vil lage en tredimensjonal gel med kryssbindingerdannet av en diester. Ved å variere hva R-gruppen i esterene er, vil man kunnemodifisere gelen. Hvis R=CH3 blir gelen upolar, hvis R=H blir den sur, og kanbrukes som kationbytter.
2.5 Elueringsmiddelet
Elueringsmiddelet er svært viktig, og ofte det som enklest å endre for å påvirkeseparasjonen. For polare adsorpsjonsmidler kan elueringsmidlene settes inn i eneluotropisk serie, etter elueringsstyrken:
Vann > AcOH > MeOH > EtOH > pyridin/acetonitril > AcOEt/aceton > EtO-Et/MeOtBu > CH3Cl/CH2Cl2 > benzen/toluen > CCl4/CS2 > alkaner > fluoral-kaner
For omvendt fase separasjonssystemer kan man generelt sett snu den eluotropiskerekken på hodet. For å kunne si noe kvantitativt om adsorpsjonen i LSC kan manbruke Snyders formel :
logKads,X = log Va(MF ) + α · (S◦X − AXε◦) (2.1)
14
hvor Kads,X er adsorpsjonskoeffisienten for analytten X (Cads/CMF ), Va er arealeatav adsorpsjonsmiddelet, α er adsorpsjonsmiddelaktivitetsparameter (proporsjonalmed overflateenergi), S◦X er adsorpsjonsenergi per overflateareal for analytten X,AX er molekylarealet til X og ε◦ er løsemiddelstyrken. Løsningsmiddelstyrken ε◦
er et mål på polariteten av løsningsmiddelet, og er definert lik null for n-pentan,og en stor ε◦ betyr god evne til å forflytte analytten fordi den okkuperer flereadsorpsjonsseter. For kombinasjoner av løsningmidler finnes det formler for å regenut ε◦, men det er 1000 ganger enklere å lese av i en tabell.
2.6 Analyttens innvirkning
Prøvemolekylene har stor påvirkning på adsorpsjonen gjennom deres molekylarealAX og deres adsorpsjonsenergi S◦. Arealet har en viss påvirkning, men ikke i likestor grad som adsorpsjonsenergien. Denne påvirkes hovedsaklig av hvilke funksjo-nelle grupper et molekyl har, og lar seg estimere fra tabellverdier for forskelligefunskjonelle grupper.
S◦X =∑
iQ◦i (2.2)
hvor Q◦i er gruppeadsorpsjonsenergien til de forskjellige funksjonelle gruppene imolekylet. Disse er additive, og kan derfor enkelt summeres for å gi molekylets to-tale adsorpsjonsenergi. Generelle trender i Q◦i er at karboksylsyrer, amider, aminerog hydroksylgrupper har høye Q◦i , mens metyl, halogener, tioler og etere har laveverdier for Q◦i .
2.7 Temperaturens innvirkning
I Snyders formel er det adsorpsjonsmiddelaktivitetsparameteren som påvirkes avøkt temperatur, og man har funnet en formel som korrigerer for dette:
αT = αRT ·297
T (i K)(2.3)
15
2.8 Tørrkolonnekromatografi
Er hovedsaklig en preparativ teknikk. Kolonnen pakkes tørt, og prøven appliserespå toppen av kolonnen. Deretter eluerer man med en mobilfase som er optimali-sert fra TLC, til denne når bunnen av kolonnen. Da stoppes elueringen, og manlokaliserer de områdene i kolonnen som inneholder stoffer av interesse og graverdisse ut. Dette kan gjennomføres i pølseskinn, som er lette å kutte opp i riktigeseksjoner etter eluering. Dette blir kolonneversjonen av preparativ TLC.
2.9 Lavttrykk og Flash kolonnekromatografi
Lavtrykkskolonnekromatografi gjøres som regel med tyngdekraften, og kolonnenekan være tørrpakkede elller oppslemmede med stasjonærfasen i elueringsmiddelet.Man velger et elueringssystem som gir RF -verdier på TLC mellom 0.15 og 0.35, dadette ofte gir god separasjon og retensjon for kolonnekromatografien. Deteksjonenkan gjøres enten ved kontinuerlig deteksjon, eller fraksjonsvis. Det er ofte UV/VIS-spektroskopi som brukes i deteksjonen. Partikkeldiameteren for pakkematerialet igravitasjonskolonner ligger i området over 50 µm, og er ikke-sfærisk.
Flashkromatografi er egentlig kun en gravitasjonskolonne med et lett overtrykk aven inert gass. Siden væskehastigheten er noe høyere, vil også partikkeldiameterenmåtte være noe mindre for å opprettholde effektiviteten.
3 Gasskromatografi (GC)
Baserer seg på å retarderer stoffer ut fra deres flyktighet. Mobilfasen er en gass,så når stoffene er i gassfase er de uretardert, men med en gang de kondenserervil de være retardert. Det finnes to typer gasskromatografi, gass-væske (GLC) oggass-fast stoff (GSC). GLC er en fordelingskromatografi, mens GSC er adsorp-sjonskromatografi. GLC er absolutt mest brukt. Det som påvirker separasjonen igasskromatografi er hovedsaklig temperaturen, siden den bestemmer damptrykkettil analytten.
16
Figur 3.1: Typisk gasskromatografiapparat med gassforsyning, injektor, kolonne, ovn,detektor. Til slutt får man laget et kromatogram.
3.1 GSC
Vanlige adsorbenter i GSC er aluminiumoksid, organiske polymerer, aktivt kull ogsilikagel. Det virker sterke mellommolekylære krefter mellom analytten og stasjo-nærfasen, og man må ofte bruke svært høy temperatur for å få eluert stoffer. Derforer GSC uegnet for prøver som er ustabile ved høye temperaturer, da det er fare forkatalytisk aktivitet fra stasjonærfasen og permanent adsorpsjon (kjemisorpsjon).Derfor brukes GSC oftest til å analysere gassblandinger eller løsningsmidler somhar lave kokepunkt. Siden det er så sterke interaksjoner mellom stasjonærfasen ogprøvemolekylene, vil man forsøke å holde forholdet VMF/VSF høyt, og dette gjøresofte med PLOT-kolonner (Porous Layer Open Tubular).
3.2 GLC
I GLC er stasjonærfasen en væske, og mobilfasen er en gass. For at GLC skalfungerer på en prøve må den være relativt flyktig, relativt stabil ved temperatureropp mot 300◦C og ha en viss løselighet i stasjonærfasevæsken. For å holde stasjo-nærfasen på plass er det nødvendig med noe fast stoff inne i kolonnen, og siden
17
væsken adsorberer til dette stoffet vil det også være fare for at prøvene kan gjøredet også. Likevel så håper man at denne effekten er så liten som mulig, og oftestgår det veldig bra!
3.2.1 Bæregassen
Bæregassen har ingen annen funksjon enn å drive prøven gjennom stasjonærfaseni kolonnen. Vanlige bæregasser er hydrogen, nitrogen, helium og av og til argon.Valg av bæregass burde ikke ha noe å si, men de har litt forskjellig effektivitetavhengig av gasshastigheten. Dette kan vises i van Deemter-kurven:
Figur 3.2: Effektivitet vist i HETP mot gasshastighet for hydrogen, helium og nitrogen.
Fra Figur 3.2 er det tydelig at nitrogen har lavest HETP ved en lavere gasshas-tighet enn både hydrogen og helium. Dersom man skulle ønske å bruke en høyeregasshastighet er det derfor gunstigst å benytte seg av hydrogen som bæregass dadenne gir best effektivitet ved høye hastigheter. Hydrogen kan være eksplosjonsfar-lig, og vil med riktige betingelser kunne hydrogenere dobbelt- og trippeltbindinger.Valg av bæregass er dermed et valg mellom effektivitet, hastighet og fare for eks-plosjon/hydrogenering.
Det er viktig at gassen som skal inn i kolonnen er: i) Fri for oksygen, da dettekan oksidere stasjonærfasen ved høye temperaturer. ii) Fri for vann, da dette kanhydrolysere stasjonærfasen. iii) Fri for olje, fett og andre forurensninger som skal
18
skape spøkelsestopper eller endre egenskapene til kolonnen over tid. Løsningen erå kjøpe god gass, og rense den før den sendes inn i kolonnen.
3.2.2 Injektoren
Injektoren er en viktig komponent i ethvert GC-apparat, og det finnes mangeforskjellige versjoner av injektorer. Injektorens hovedoppgave er å få injisert engitt mengde prøve raskt , slik at løsningsmiddelet damper av, og prøven injiseresi kolonnen hvor den separeres. For injeksjon av gasser er det ikke nødvendig medet fordampningskammer, og en loopinjektor er heller foretrukket.
Figur 3.3: En splittinjektor til et gasskromatografiapparat. Sprøyten stikkes inn gjen-nom septumet øverst i figuren, og en gitt mengde injiseres.
3.2.3 Kolonnen
Det finnes mange typer kolonner for GC. Pakkede kolonner for GLC er ofte tynnemed en diameter på 0.1 - 0.25 mm. For GSC er kolonnene ofte av glass pakket messtasjonærfasen, og diameteren er 0.2 - 0.6 mm.
WCOT (Wall Coated Open Tubular) er kapillærrørkolonner med en indre diame-ter på 0.1 - 0.5 mm og med en lengde på 12 - 60 m. På innsiden av kolonneveggen
19
er det avsatt en tynn film med stasjonærfase. Disse kolonnene har svært høy effek-tivitet, men tåler ikke så høye prøvemengder.
PLOT (Porous Layer Open Tubular) er kolonner som er belagt med et porøstmateriale på innsiden av kolonneveggen. Disse kolonnene gir svært lave trykkfallog er derfor svært gunstige både for GLC og GSC. Kan ta større prøvemengderenn WCOT.
3.2.4 Stasjonærfaser i GLC
Væsken må ha et lavt damptrykk, som betyr et høyt kokepunkt. Det betyr atdet vil alltid være et tap av stasjonærfase i en GLC-kolonne. Stasjonærfasen børvære stabil i hele temperaturområdet hvor kolonnen skal brukes. Det er en MAOT(Maximum Allowable Operating Temperature) hvor tapet av stasjonærfase er uak-septabelt høyt, og en nedre grense hvor stasjonærfasen krystalliserer.
Den viktigste stasjonærfasen i gasskromatografi er polysiloksaner , for eksempelPDMS (PolyDiMetylSilikon) som består av lange kjeder som -(Si(CH3)2-O)n-. Deter gode muligheter for å endre strukturen av polysilioksaner, ved å bytte ut me-tylgruppene med andre funksjonelle grupper.
Figur 3.4: Strukturen til polydimetylsiloksan.
Andre stasjonærfaser omfatter polyetere (Carbowax), polyestere, cyanider/nitriler,polyaminer, dexsiler og flytende organiske salter. De vanligste sasjonærfasene ermetylsilikon, fenyl-metylsilikon, trifluoropropylmetylsilikon, cyanopropyl-fenyl-metylsilikon,PEG/Carbowax og DEGS.
20
4 Analyser ved hjelp av kromatografi
Analyser deles inn i kvalitative som bestemmer hva som finnes, og kvanititativesom bestemmer hvor mye som finnes.
4.1 Kvalitative analyser
For å kunne identifisere et molekyl må man må ha høy grad av reproduserbarhet(inter-lab-presisjon) og/eller repeterbarhet (intra-lab-presisjon). Det er også viktigat effektiviteten er høy for utstyret man benytter, slik at man får klare tynnetopper som er enkle å skille fra hverandre. For å identifisere et stoff trenger manen autentisk standard av det aktuelle stoffet for å gjøre en ko-injisering. Dersomko-injiseringen gir kun ett signal, kan man si at de to stoffene mest sannsynlig ersamme stoff, fordi man kan aldri være 100 % sikre.
4.2 Kvantitative analyser
For å bestemme mengden av en analytt trenger man en måte å sammenliknesignalet som analytten produserer, og menden analytt som var ansvarlig for detsignalet. Vanlige mål for signal er enten topphøyde eller toppareal. Dersom mankun sammenlikner topparealene til signaler vil det oppstå et problem. Forskjelligestoffer kan ha forskjellig detektorrespons , og derfor trenger man en kalibrering.Dersom detektorresponsen er lineær, vil det si at f.eks. en økning i stoffmengdengir en proporsjonal økning i detektorresponsen. Når mengde stoff kommer over enviss grense vil detektorresponsen bevege seg inn i det dynamiske området. Detteer illustrert i Figur 4.1.
21
Figur 4.1: Til venstre er det lineære og dynamiske området avmerket, og til høyre erfølsomheten til detektoren vist for tilsvarende regioner.
4.2.1 Normaliseringsmetoden
Normaliseringsmetoden går ut på at man ser på hvor stort signal en analytt pro-duserer relativt til alle andre signaler i kromatogrammet. Den forutsetter at de-tektoren gir et signal som er proporsjonalt til mengden analytt. Deretter kan manut fra andre topper som man kjenner mengden av, forutsi mengden av analyttenman er interessert i.
4.2.2 Ekstern standard (ESTD)
Ekstern standard metoden baserer seg på å lage en kalibreringskurve ut fra kjentekonsentrasjoner av analytt. Da vil topparealet bli plottet mot mengden analytt, ogman har en kalibreringskurve. Deretter vil man kromatograferer et identisk volummed den ukjente prøven, og sammenlikne signalet man får med kalibreringskurvenman allerede har. Ekstern standard kan også gjennomføres med en responsfaktor :
rf(X) =
∫(X)dx
m(X)(4.1)
Forutsatt at kalibreringskurven er lineær, vil man kunne finne den ukjente kon-sentrasjonen/mengden ved å dele signalet på responsfaktoren:
22
m(X) =
∫(X)dx
rf(X)(4.2)
Ekstern standard fungerer greit, også for ikke-lineære detektorrespons, men kreversvært nøyaktige analyser, særlig mhp. injisert volum.
4.2.3 Intern standard (ISTD)
For intern standard må man først lage en kalibreringskurve, og da bruker man va-rierende konsentrasjon av analytten man skal undersøke, og en fast mengde internstandard (IS). Intern standard er et stoff som er realtivt likt det som analyseres,både kjemisk og i retensjonstid. Disse analyseres, og et plott lages av signalfor-holdet mellom analytten og den interne standarden mot konsentrasjonsforholdetmellom analytten og den interne standarden. Når man har kalibreringskurven kanman analysere prøven med en lik mengde intern standard. Signalforholdet man dafår plottes rett inn i kalibreringskurven, og konsentrasjonsforholdet kan leses av.Den relative responsfaktoren til signalene fra analytten og den interne standardener definert som:
rrf =Ax · Cis
Ais · Cx
(4.3)
23
Figur 4.2: Illustrasjon som viser en kalibreringskurve av signalforhold plottet mot masse-forhold. Deretter er det målte signalforholdet for den ukjente prøven plottet inn og masse-forholdet avlest.
Intern standard er en svært god metode for å bestemme konsentrasjoner, særlighvis man må injisere manuelt. Den fjerner usikkerheten rundt injisert mengde,siden den hele tiden sammenlikner relative verdier for signaler konsentrasjoner.Den tar også hensyn til at detektoren ikke alltid gir likt signal for like mengderstoff fra dag til dag.
4.2.4 Standard-tilsats
Gjennomføres ved å først analysere prøven uten tilsats. Deretter tilsetter man enkjent mengde ren standard til en del av prøveløsningen og analyserer den. Da harman signalene fra to prøvekonsentrasjoner
∫X(0) og
∫X(+), og kjenner mengden
som ble tilsatt mellom de to, mX(+). Mengden av analytt i den opprinnelige prøvenbestemmes deretter fra:
mX(=) = mX(+) ·∫X(0)∫
X(+)−∫X(0)
(4.4)
24
Standard-tilsats-metoden brukes når det ikke er mulighet for å bruke en internstandard, enten fordi det ikke er plass, eller at det ikke finnes noe stoff som kanbrukes som IS.
4.2.5 Usikkerhet
Presisjon og nøyaktighet er to forskjellige begrep som ofte blandes. Figur 4.3 viserforskjellen.
Figur 4.3: Forskjell på presisjon (precision) og nøyaktighet (accuracy).
Usikkerheten i forskjellige analysemålinger kan kategoriseres i systematiske feil ogtilfeldige (stokastiske) feil. De stokastiske feilene kommer av feil i presisjonen, ogbeskrives best ved standardavviket. De systematiske feilene kommer fra feil i nøy-aktigheten og er der man kan påvirke resultatet mest. Disse favner om personlige,instrumentelle og metodiske feil. For de systematiske feilene er det mange fleretiltak man kan sette i gang for å minske feilestimatene, som å jevnlig sjekke atstandardene man bruker har riktig konsentrasjon.
For sporanalyser vil det være en problemstilling om når et signal er detekterbarteller når det kun er bakgrunnsstøy. En generell regel sier at deteksjonsgrensen(LOD) er hvis signalet ligger over bakgrunnsstøyen sb pluss tre standardavvik σb.Grensen for kvantifisering (LOQ) ligger på bakgrunnsstøy pluss ti standardavvik.
LOD = sb + 3 · σb (4.5)
LOQ = sb + 10 · σb (4.6)
25
Som en tommelfingerregel brukes at topper som er 2 ganger høyere enn støybåndeter detekterbare mens de som er fem ganger høyere er kvantifiserbare.
5 Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC)
Er separasjon av analytter basert på deres molekylstørrelser alene. Det forutsettesat det ikke er noen andre former for retardasjon finner sted. Gelen som brukesi denne separasjonen er store partikler med små porer. Store prøvemolekyler vilha problemer med å komme inn i disse store partiklene med små åpninger, og vilderfor være svært lite retardert. Små molekyler vil ha tilgang til alle de små poreneog blir retardert på grunn av dette.
Figur 5.1: Størrelseseksklusjonskromatografi gjennomført på an blanding av store ogsmå proteiner. De største molekylene vil ikke ha tilgang til de minste porene og elueresut først.
26
Forskjellige geler vil ha forskjellige kalibreringskurver. Disse er som regel et plottav fordelingskoeffisienten (KD) mot logaritmen av molekylvekten (log Mr). Forde-lingskoeffisienten beskriver retensjon i eksklusjonskromatografi:
KD =VR − V0Vi
(5.1)
hvor VR er retensjonsvolumet av prøven, V0 er dødvolumet/retensjonstiden til løs-ningsmiddelet, Vi er VSF = VC −C0− Vgel, Vc er totalt kolonnepakningsvolum ogVgel er volumet av gelmatrisen.
Separasjonsevnen til en SEC-kolonne, som antall topper mulig å separere (z), vilkunne bestemmes fra platetallet N, fra formelen:
z ≤ 1 + 0.2 ·√N (5.2)
Dette betyr at dersom N er 100 kan 3 topper separeres og er N = 10000 kan 20topper separeres. Fraksjoneringsområdet til en gel er definert som det områdethvor verdiene for fordelingskoeffisienten til prøvemolekyler ligger mellom 0 og 1.Det er for molekyler med molekylvekter innenfor fraksjoneringsintervallet at kali-breringskurven gjelder, og som kan separeres med den kolonnen.
Mange bløte geler for SEC er svært skjøre. Særlig dekstraner, agaroser, polyakryla-mid og polystyrenderivater er spesielt myke, og kan ikke tåle trykket av løsnings-middelet i en gravitasjonskolonne. Dette løses med et slags hevertsystem, somkobler kolonnen til et reservoat for løsemiddel som sitter under toppen på kolon-nen. For HPLC med SEC-kolonner brukes noe sterke geler, men man må likevelvære svært forsiktig med trykket man setter på kolonnen.
5.0.6 Anvendelser
SEC er svært nyttig til fraksjonering, dvs. å fjerne molekyler av en viss størrelsesom man vet man ikke er interessert i. Man kan gjøre en avsaltning av løsningermed makromolekyler, noe som er mye raskere enn en dialyse. Bestemmelse avmolekylmasse er selvsagt også en anvendelse.
27
6 Ionebytterkromatografi (IEC)
En metode for å bytte ioner mellom en løsning og en ionebytter. En ionerbytter-kolonne består av en matriks med mange faste ioner som er kovalent bundet tilmatriksen. Til de faste ionene er det ionisk bundet motioner. På grunn av kravetom elektronøytralitet kan man ikke fjerne motionene, men man kan bytte de utmed andre ioner, og det er den prosessen som benyttes i IEC.
Det finnes svært mange forskjellige ionebyttere, men det er noen generelle trekk.Kationbyttere har anioner kovalent festet, og disse er som regel et sulfonar, karbok-sylat eller fosfonat. Anionbyttere har kationer kovalent bundet, og dette er stortsett alltid et amin.
Tabell 6.1: Lite utvalg av ionebyttere
Gruppe Fast ion Motion Type pH-områdeKationbyttereSulfonat R−SO–
3 H+ Sterkt sur 2-12Karboksylat R−CO–
2 H+ Sterkt sur 4-6 (6-12)(Fosfonat) R−PO3H
–/R−PO32− H+
AnionbyttereAmmonium ion R−N+(CH3)3 X– Sterkt basisk 2-12
Type1Ammonium ion R−N+(CH3)2−(CH2)2−OH X– Sterkt basisk 2-12
Type2Ammonium ion R−CH2−NH+(CH3)2 X– Svakt basisk 2-6Ammonium ion R−(CH2)n−NH
+3 X– Svakt basisk 2-6
bl.a. i HPLC
For avsaltning kan man bruke geler med både anion- og kationbyttere. Disse vilda binde til seg alle ionene i blandingen og la de ikke-ioniske molekylene kommerenset ut på andre siden.
28
6.0.7 Ionebytting
Selve prosessen med ionebytting starter når gelen svelles. Da solvatiseres motione-ne, men de vil ikke forlate de kovalente bundede ionene så lenge de befinner seg iionefrie væsker vil de ikke forlate gelen. Når gelen elueres med en ionisk løsning, vildet kunne skje ionebytting. Graden av utbytning avhenger av stabilitetskonstante-ne til komplekset fast ion - motion og de respektive konsentrasjonene av motionerog fremmedioner. Ionebytting skjer via likevekten:
R−A+X− + B+ + Y− ⇀↽ R−A+Y− + B+ + X− (6.1)
6.0.8 Ionebytterkromatografi
For å kunne separere stoffer med ionebytting må man ha minst to konkurrerendemotioner, som tilsettes som f.eks. BY og BZ. Dersom BY og BZ elueres på enionebytterkolonne med BX, vil det være ionene X, Y og Z som konkurrerer om defaste plassene på A. Forutsatt at selektivitetskoeffisienten for Y og Z er forskjelligvil de ha forskjellig grad av retensjon, og vil dermed kunne bli separert i forskjelligefraksjoner.
29
Figur 6.1: Ionebytterkromatografi med en blanding av ladede proteiner i en kationbyt-terkolonne fylt med negativt ladede grupper. Kationer vil retarderes i kolonnen, mensanioner fyker gjennom.
Affiniteten for de faste bundede ionene varierer. For kationer er det de med størstladning og størst størrelse som viser sterkest affinitet. For anioner er det de sammeprinsippene som gjelder, men det er mye større forskjelle renn for kationene.
I ionebytterkromatografi er det visse elueringsbetingelser man bør følge. Påsattprøvemengde bør ikke overskride 1 % av teoretisk kapasitet dersom det er enanalytisk separasjon som skal gjennomføres. Er separasjonen preparativ går detan å påsette prøver med 5-10 % av kapasiteten (opp til 25 %). Det er viktigat prøven pH er slik at de påsatte komponentene foreligger i ionisert form. Denmobile fasens pH må justeres slik at ionebytterens funksjonelle grupper ikke mistersin funksjon. Ionestyrken µ til mobilfasen er også en viktig variabel, og den kanbestemmes fra:
µ =1
2
∑i
ci · z2i (6.2)
hvor ci er de enkelte ionenes konsentrasjon og zi er deres respektive ladninger. Enstørre ionestyrke betyr en større elueringsstyrke.
30
7 Elektroforese (EF)
Elektroforese er flytting av ladede partikler på grunn av et elektrisk felt. EF brukesoftest på ioner i elektrisk ledende væsker. Det er to komponenter som bygger opp etelektroforesesystem: væskefasen, og et bæremateriale. Væskefasen er ofte en buffer,og i denne står elektrodene som lager det elektriske feltet. Bærematerialet kan væreen kolonne, plate eller en gel.
7.1 Teori
Når det settes spenning over de to elektrodene, vil det også skje to halv-reaksjoner,en på anoden (7.1) og en på katoden (7.2). Disse har ikke så mye å si for separa-sjonen, men de vil etter hvert endre sammensetningen til bufferen.
6H2O→ O2 + 4H3O+ + 4e− (7.1)
4H2O + 4e− → 2H2 + 4OH− (7.2)
I elektriske felt vil ladede partikler trekkes mot den motsatt ladede pol. Kraftensom virker på de ladede partiklene Fe er avhengig av ladningen av partikkelen qog stryken til det elektriske feltet E.
Fe = q · E = q · VL
(7.3)
Ionet vil bremses av den fysiske motstanden Ff det møter i bufferen, og dette kanbeskrives ved
Ff = 6πηru (7.4)
hvor η er viskositeten til bufferen, r er ioneradius og u er vandringshastighet. Vedå balansere de to kreftene mot hverandre, vil man kunne finne et uttrykk forvandringshastigheten ved likevekt.
u =qE
6πηr(7.5)
For reelle ioner vil det også være vekselsvirkninger med de motsatt ladede ioner
31
som skal motsatt veg. Dette løses ved at i Ligning (7.5) byttes r ut med (1− κr),hvor κ er en konstant som er avhengig av temperatur, bufferens ionestyrke og di-elektrisitetskonstanten.
Elektroforetisk mobilitet µef er i elektroforese et mål på vandringshastighet perfeltstyrke:
µef =uefE
=q
6πηr(7.6)
7.2 Varmeutvikling
Siden det settes et svært høyt elektrisk potensial over bufferen i elektroforese vildet utvikles varme. Denne varmen kalles Joule heating W , og kan kvantifiseres fra
W = R · i2 · t =V · iA · L
=E · iA
(7.7)
hvor A er tverrsnittsareal for bufferløsningen og t er tid. Denne varmeutviklingener det viktig å kunne kontrollere, og derfor er det nødvendig med aktiv kjølingnår man gjør elektroforese. Dersom det skjer endringer i temperaturen til bufferenvil denne endre viskositet som igjen påvirker mobiliteten til ionene. Fordampingfra åpne systemer og dannelse av gassbobler i lukkede systemer vil også væreproblemer som oppstår ved å ikke kontrollere temperaturen.
7.3 Elektroosmose
Massetransport i et elektroforetisk system kan også skje på grunn av elektroosmose.Dette skjer dersom overlfaten av bærematerialet er ikkeledende, men ladet. Det vilda bygges opp et lag av motioner på bærematerialet som imobiliseres der. Dette vilgjøre at bufferen nå har en skjev ladningsfordeling i de frie ionene, og som helhetvil bufferløsninegn bevege seg i den reteningen som ionene i overskudd vil. Er detnegative ladninger på bærematerialet vil positive ioner imobiliseres. Dette fører tilat det er overskudd av negative ioner i løsningen og den vil i hovedsak bevege segmot den positive elektroden. Strømningsprofilen for elektroosmotisk strømning erikke parabolsk, men har en plan fordeling siden det ikke er noen bremsende in-teraksjoner mot veggene. Dette fører til at sonespredning fra massetransfertermen
32
i van Deemter-ligningen faller nesten helt bort. Elektrokromatografi benytter segkun av elektroosmose som drivkraft for mobilfasen, og kan oppnå trykk og væske-strømmer på linje med HPLC.
Størrelsen på den elektroosmotiske stømmen kan beskrived ved hjelp av dens mo-bilitet µEOF , som vist i Ligning (7.8) eller som hastighet som vist i Ligning (7.9).
µEOF =ε · ζη
(7.8)
uEOF = µEOF · E =µEOF · V
L(7.9)
hvor ζ er zetapotensialet som beskriver hvordan ladningene ved veddflaten er for-delt og avhenger stort sett av ladningen som er fast på veggen og ε er dielektri-sitetskonstanten. Dersom µEOF større om motsatt rettet fra µef , vil det føre tilat separasjonen går i motsatt retning. Da vil positive ioner går mot den positiveelektroden... snodig!
For elektroforese er den hastigheten man observerer for væskestrømmen den elek-troosmotiske hastigheten addert med den elektroforetiske.
uobs = uef + uEOF (7.10)
Man kan bruke et uladet molekyl for å bestemme uEOF . Dette vil ikke ha noentiltrekning til hverken av elektrodenene, og vil derfor følge med dit den elektroos-motiske strømmen drar det. Ved å vite hastigheten til det molekylet har mandermed også uEOF . Da er det lett å ordne på Ligning (7.10), slik at man får etuttrykk for uef .
7.4 Effektivitet og oppløsning
Platetall for elektroforese kan regens ut fra elektroferogrammet helt analogt tilandre kromatogram med formelen N = 16(tm/wb)
2. Man kan også beregne et
33
teoretisk maksimalt platetall for elektroforese fra formelen:
N =(uef + uEOF ) · L · E
2D=V · (µef + µEOF )
2D(7.11)
hvor D er diffusjonskonstanten av analyttionet i elektrolytten.
Oppløsningen mellom to topper i et elektroferogram kan beregnes ved:
RS = N1/2 · ∆u
4 · (uef + uEOF )= 0.177 ·∆u ·
[V
(uef + uEOF ) ·Dm
]1/2(7.12)
hvor ∆u er forskjellene i migrasjonshastighet mellom de to toppene man ser på.
7.5 Viktige elektroforesemetoder
Sone-elektroforese er en samlebetegnelse på teknikker hvor analyttene separeres isoner eller bånd, stabilisert i et solid porøst materiale. Dette kan være for eksempelfilterpapir, agarose-gel, polyakrylamid. SDS-PAGE er et mye brukt eksempel, somstår for Sodium Dodecyl Suphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.
Moving Boundary elektroforese er en gammel metode som separerer ioner i enstillstående væskefase ved å påføre et elektrisk felt gjennom en saltbro fylt medelektrolytt. Endringer i refraksjonsindeksene detekterer på hver side av broen.
Isotachoforese gjennomføres ved at en ufortynnet prøveløsning appliseres mellomen buffer med høyere elektroforetisk mobilitet enn prøvekomponentene, og en medlavere. Metoden separerer etter forskjellige elektroforetiske mobiliteter i soner somfølger hverandre som perler på en snor.
Isoelektrisk fokusering er en metode som er mye brukt sammen med PAGE. Engel med en pHgradient benyttes, og molekylene elueres til de kommer til den pHhvor de har sitt pI (isoelektriske punkt). Der stopper de, og blandingen er separertmhp. pI. Denne gelen kan deretter legges inntil en annen gel og man kan separeremolekyler med lik pI etter f.eks. molekylstørrelse.
34
Immunoelektroforese er en kombinasjon av elektroforese og antigen-antistoff-reaksjoner.
Deteksjon av gelelektroforese kan gjøres med radioaktiv merking, overføring avanalyttene til en egen membran også kalt blotting eller så kan man farge/derivatiserede forskjellige analyttene som sitter i gelen.
8 Superkritisk fluid kromatografi (SFC)
Et fluid er superkritisk når dets trykk og temperatur er over det kritiske punktethhv. pc og Tc. Da vil fluidet være i en mellomtilstand mellom gass og væske. Etfasediagram for CO2 er vist i Figur 8.1. Dersom et superkritisk fluid brukes sommobilfase vil det være relativt høy grad av diffusjon, men tilsvarende liten sone-spredning som følge av massetransfer mot kolonneveggene. SFC gir derfor omtrentlik effektivitet som HPLC, men ved høyere strømningshastigheter. Det er gunstigsiden man kan gjøre separasjonene raskere.
Figur 8.1: Fasediagram for karbondioksid. Den superkritiske regionen er merket av idiagrammet.
35
På grunn av at fluidet må være superkritisk under hele separasjonen er det et kravom at ved utgangen må trykket være over pc. Dette er som regel ganske høyt, ogdet totale relative trykktapet i kolonnen er derfor lavt. Dette gjør det enkelt å set-te mange kolonner i serie, og vil også bidra til kortere analysetider. Superkritiskefluider kan også brukes til ekstraksjon, superkritisk fluid ekstraksjon, fordi de harhøy grad av diffusjon, lav tetthet og høy grad av solvatisering. Dette gjøres blantannet for å ekstrahere koffein fra kaffe for å produsere koffeinfri kaffe.
Et SFC-apparat likner endel på oppsettet for HPLC. Mobilfasen kommer på entrykktank med trykk langt over pc. Denne varmes deretter opp til over Tc før densendes inn i kolonnen, fortsatt med høyt trykk. Kolonnene som benyttes må tåledet høye trykket, men eller er de svært like de som benyttes i HPLC og GC. Fordeteksjon så kan man bruke UV dersom væsken er under trykk og i væskefase,eventuelt en GC-detektor om den er i gassfase. Da kan FID være et godt valg. Demest brukte mobilfasene er CO2, N2O og xenon.
I utgangspunktet er de fleste mobilfasene som benyttes i SFC ganske upolare. Forå kunne analysere polare molekyler kan man tilsette modifikatorer i små mengder.Disse er organiske polare molekyler, som vil hjelpe med løsligheten av polare stof-fer, justering av elueringsstyrken til mobilfasen og kan redusere tailing. Metanoler den mest brukte modifikatoren i SFC.
Temperaturen, mengde modifikator og trykket/tettheten kan alle justeres i et gra-dientprogram for å kunne optimalisere separasjonen av komponentene i SFC. I detsiste er SFC mye brukt inne legemiddelanalyser, særlig med kirale kolonner. Deter også mulighet for mikropreparative analyser med SFC.
9 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC er en videreutvikling av den klassiske væskekromatografien, og gir sværtraske analyser, høy oppløsning, god kvantifisering og et bredt spekter av stofferkan analyseres. Noen ulemper har metoder, blant annet at det er en dyr metodeog har ingen enkel, universell og følsom detektor. Man bruker svært små partikler
36
i kolonnene, og derfor må man bruke høyt trykk for å overkomme trykkfalletgjennom kolonnene. Vanlig diameter for de porøse partiklene i en HPLC-kolonneer 3-10 µm.
9.1 Elueringsmiddelet
For normalfase-HPLC er vanlige løsningsmidler heksan, diklormetan, metyl-tert-butyleter, THF. For reversfase-HPLC er metanol, acetonitril, vann og THF myebrukt. For HPLC er det vanlig å blande to løsningsmidler for å få optimal se-parasjon. Man må passe på at man ikke får for høy viskositet, da det er viktigfor å minske trykkfallet. Det er viktig at løsningsmidlene er avgasset, da manikke ønsker bobler i systemet. Selv om et løsningsmiddel er mettet med luft, kandet bli overmettet ved blanding med et annet løsningsmiddel, og bobler dannes.Bobler i systemet vil påvirke både pumpen, kolonnen/separasjonen og detekto-ren. Elueringen kan foregå isokratisk , som vil si at ingen parametre endre i løpetav elueringen. Gradientmetoder er også populære, enten ved gradvis endring avMF-sammensetning eller satsvis. Dette vil kunne få ut sent eluerte stoffer tidligeresamtidig som man får god separasjon for de tidligere eluerte stoffene. Temperatu-ren kan også varieres, men det er ikke så vanlig.
Optimering av løsningsmiddelet må gjøres på bakgrunn av hvilke stoffer som skalsepareres, og det er to egenskaper man generelt ønsker å variere: polariteten ogselektiviteten. Som et mål på polariteten kan elueringsstyrken til løsningsmiddeletbrukes, men Snyders løsningsmiddelstyrke ST er også vanlig å bruke. For normal-fase kan man bruke en alternativ polaritetsskala, P’. Det gjør det enkelt å finnepolariteten til blandinger, fordi for en blanding med 3 løsningsmidler (a, b og c)med hhv. volumfraksjoner xi, vil blandingen ha polariteten P ′(a, b, c):
P ′(a, b, c) = xa · P ′(a) + xb · P ′(b) + xc · P ′(c) (9.1)
Selektivitetsoptimering av en blanding av løsningsmidler baserer seg på tre egenska-per: protonakseptor-evne (xe), protondonor-evne (xd) og sterk dipol stabilisering(xn). e, d og n står for hhv. etanol, dioksan og nitrometan. Trekantmetoden gårut på å teste tre løsningsmidler, i forskjellige konsentrasjoner tynnet ut med et
37
fjerde. Dette gir 7 forskjellige muligheter plassert i hjørnene, midten og midt påsidestykkene i en trekant mellom de tre opprinnelige løsninsgmidlene. Dette er enautomatisert metode, og er vanskelig å gjennomføre manuelt.
Pumping of blanding av løsningsmidler til HPLC gjøres i apparatet, og det er toløsninger. Man kan ha en Høytrykksblander som har én pumpe per løsningsmiddel.Dette kan være en litt dyr løsning siden man trenger to pumper, men faren forbobledannelse er liten. En lavtrykksblander har én pumpe som kobles til mangereservoarer av løsningsmidler. Ventiler styrer hvilket løsningsmiddel som suges opp,og de går pluggvis til en mikser. Dette systemet har en reell fare for bobledannelse,siden det er løsninsgmidler under lavt trykk. Derfor trengs det her en avgasser forå fjerne eventuelle gassbobler.
9.2 Systemets oppbygging
De viktigste komponentene i et HPLC-system er: pumpe, injektor, filter, for-kolonne, hovedkolonne, temperaturregulator, detektor.
38
Figur 9.1: HPLC-systemets grunnkomponenter.
9.2.1 Pumper
Pumpene i HPLC må være svært solide, da se må kunne jobbe ved høye mottrykkfra kolonnen. De må også være jevne i hvordan de leverer trykk, slik at ikke pul-sering oppstår. Det finnes mange pumpedesign, men det viktiste er at de har enmetode for å fjerne pulsering. Pulsdempere kan være mekaniske, pneumatiske ellerstyrt ved sensorer som endrer pumpehastigheten ved stemplenes vendepunkter.
39
9.2.2 Injektor
I starten med HPLC ble injeksjon utført som på GC, rett inn i kolonnen gjennomet septum. Dette har etter hvert blitt vanskelig da trykkene har blitt høyere ogkjemikaliene mer varierte. Derfor brukes det i dag stort sett alltid ventilinjeksjon.En loopinjektor er en måte å gjennomføre manuell injeksjon av en fast mengde forHPLC hver gang. Prøven injiseres først i en loop, og deretter kobles loopen rastinn i kretsen mellom pumpen og kolonnen. På denne måten blir prøven introdu-sert til systemet. Dersom man overfyller loopen med prøveløsning (full loop), villoopens volum bestemme injisert volum. Dette er enkelt og svært reproduserbart.Alternativet er å injisere en mengde som gjør at ingenting av prøven forsvinner utav loopen (partiell loop). Da er det mengden injisert i loopen, målt fra sprøyten,som er volum injisert i kolonnen.
Figur 9.2: En enkel loopinjektor.
9.3 Kolonnen
Kolonnene må kunne tåle trykk over 350 bar, så kolonneveggen må være sværtsterk, og er ofte laget av rustfritt stål. For UHPLC kan trykkene komme opp iflere tusen bar. Forkolonnen skal beskytte den ofte svært kostbare hovedkolonnenfra store partikler som har kommet inn i systemet, eller annet rusk som ville haødelagt den store kolonnen. Det vil i tillegg være filtere, men om en del av det sistefilteret skulle falle av, vil den påfølgende kolonnen bli ødelagt. Ved seriekobling avkolonner vil det med to like kolonner bli dobbelt så stor effektivitet. Dersom to
40
veldig forskjellige kolonner kobles sammen, vil man i verste fall ende med reduserteffektivitet, som vist i Tabell 9.1.
Tabell 9.1: Total effektivitet fra to kolonner i serie.
N1 N2 Ntot4000 4000 80004000 2000 53304000 1000 32004000 100 400
Andre kolonner som brukes for HPLC omfatter high speed -kolonner, Micro-Bore,Infinity diameter og kapillærkolonner.
9.3.1 Normal fase
For normalfase HPLC er silika den vanligste stasjonærfasen med vannholdige mo-bilfaser, og små organiske molekyler som moderatorer. Siden kolonnene er lange,kan det være vanskelig å re-aktivere en kolonne (i forhold til TLC). Derfor kan detvære vanskelig å få gode repeterbare resultater fra gradientprogrammer. Silikaen ikolonnene kan modifiseres med polare grupper som f.eks. cyanopropyl-, diol- elleraminosubstituenter. Det er noen få organiske polymerer som kan være alternativertil silikagel, som f.eks. polystryen-divinylbenzen kopolymerer, polyakrylater ellerpolyvinylalkoholer.
Det er funnet en ny måte å lage silika på som minsker innhold av metall betrak-telig, som kommer med i prosessen i dannelse av type A silika. Type B silika lagesfra organo-silikon-forbindelser (tetraalkoksysilaner), som polymeriseres til et tredi-mensjonalt porøst silisiumoksid. Disse stasjonærfasene har en mye jevnere strukturenn type A har, og har derfor mye mindre tailing og uønskede effekter. En annenfordel med type B silika er at det er lett å feste på organiske substituenter før manpolymeriserer materialet, slik at disse blir jevnt fordelt i hele strukturen.
41
9.3.2 Omvendt fase
Hovedsaklig brukes aktivt kull, polymerer og derivatisert silika i omvendt faseHPLC. Derivatisert silika er den mest brukte stasjonærfasen, og oktadekyl-silika eren mye brukt variant selv om C8, C2 og c-C6H11 også brukes. Oktadekyl-gruppenebestår av −n− C18H37, som festes på silanolgruppene i silikaen. Dette gir struk-turen Silika - O - Si(R)2 - n - C18H37, hvor R som regel er en metylgruppe. Selvetter derivatisering er det endel silanolgrupper som ikke er derivatisert. For at dis-se ikke skal ødelegge separasjonen blir disse end-capped . Da derivatiseres de flesteav de gjenværende silanolgruppene til trimetylsilylgrupper. Dette hindrer tailingav polare komponenter på grunn av polare silanolgrupper. Det er ulike måter åderivatisere silikagel på avhengig av om det er monomere, oligomere eller polymerefaser. Forskjellen ligger i graden av forgrening man oppnår i reaksjonene hvor manderivatiserer silikaen. Karakteriseringen av derivatisert silika gjøres ved å oppgimengde carbon per overflateareal (gC/m2).
Når en stor andel av silanolgruppene er derivatidert med C18, vil det i praksis væreet lag som er C18 dypt av en egen fase på utsiden av silikagelen. Dette kan ses påsom en kovalent bundet væskefase, og da vil separasjonen minner med om LLCenn LSC.
Figur 9.3: Illustrasjon av 1) hvordan n−C18H37 festes på silanolskjelettet, og 2) hvordanendcapping gjøres.
9.4 Detektorer for HPLC
De viktigste detektorene for HPLC er UV/VIS, flourescens, RI, ELSD, elektiskledningsevne, elektrokjemisk og massespektroskopi. Mindre brukte er IR, polari-metri, radioaktivitet, NMR, laserspredning, kjemiluminescens og Charged Aerosol
42
Detector (CAD).
9.4.1 UV/VIS
Det finnes tre typer UV/VIS-detektorer: filterfotometrisk, monokromator og Dio-de Array . Som lyskilder kan man bruke et bredt spekter av pærer, og det er oftevanlig å bruke en kombinasjon av to lamper for å dekke hele frekvensregionen.For å gjøre jevne kontinuerlige målinger er det viktig at lengden på fotocellen erkonstant. Dette kan løses med en z-celle, hvor det er to 90◦ bøyer i kolonnen, og foret kort stykke går væskestrømmen parallelt med lyset fra lampen frem til sensoren.
De tre forskjellige apparatene gjør det samme (måler optisk absorpsjon), men påforskjellige måter. Filterfotometrisk detektor bruker et fast filter som konvertererlyset til én bølgelengde (f.eks. 254 nm). Variabel bølgelende detektor (monokroma-tor) benytter et roterende monokromerende speil (grating) for å endre bølgelengdenpå lyset som sendes gjennom prøven. En Diode Array-detektor lar polykromatisklys passere gjennom prøven før en diffraksjonsgrating splitter lysstrålen i varieren-de bølgelengder som treffer diodearrayen. Jo enklere oppsett man velger, jo mindreog billigere blir detektoren.
9.4.2 Fluorescens
Er en konsentrasjonsfølsom detektor, og siden de færreste stoffer viser fluorescensvil den være svært nyttig når man jobber med et stoff som faktisk er aktivt. Dermedhar slike detektorer høy selektivitet og følsomhet.
9.4.3 Brytningsindeks detektor (RI)
En universell konsentrasjonsfølsom detektor som ikke er avhengig av spesielle kje-miske egenskaper ved analytten. Den måler endringer i brytningsindeksen til væs-ken som strømmer gjennom prøvecellen. Den er ubrukelig ved endringer i tempe-ratur, trykk og MF-sammensetning, siden de alle påvirker brytningsindeksen.
43
9.4.4 Fordampnings-lyssprednings-detektor (ELSD)
Baserer seg på å måle lysspredningen fra prøvepartikler. Disse frigjøres fra løsnings-middelet ved spraying og fordampning. Deretter lyses de på av en laser/lysstråleog graden av spredning måles. Fungerer godt for lite til semi-flyktige analytter, ogvil kunne detektere analytter som ikker er UV-aktive eller fluorescerende.
9.4.5 Elektriske detektorer
Elektrisk ledningsevne-detektor måler ledningsevnen av væsken i en celle på bak-grunn av tilstedeværende ioner. Elektrokjemiske detektorer måler reduksjonspo-tensialet fra en redoksreaksjon som kontinuerlig skjer i prøvecellen.
9.5 Solvofobe interaksjoner
I polare løsningsmidler er det sterke interaksjoner mellom molekylene i form avhovedsaklig hydrogenbindinger og permanent dipol-interaksjoner. Dette gjør at dehar relativt høyt kokepunkt, og mye energi kreves for å bryte bindingene. Mellomupolare løsningsmidler er det svakere intermolekylære bindinger, som består hoved-saklig av induserte dipol-interksjoner og dispersjonskrefter. Dersom man blanderpolare løsningsmidler i vandige mobilfaser vil man derfor øke løseligheten av merupolare analytter.
9.6 Spesielle kolonnetyper
Hydrofobisk interaksjonskromatogrfi (HIC) er en omvendt fase teknikk med en sta-sjonærfase med korte upolare grupper festet på f.eks. silika. Dette gjør at gradenav retensjon er noe redusert. Dette virker litt rart, men når man bruker sværtpolare mobilfaser gir det mening. Da vil de upolare analyttene mye heller dannesvake hydrofobe interaksjoner med stasjonærfasen enn å være i mobilfasen. Denneteknikken benyttes mye for følsomme proteiner og andre biopolymerer.
Hydrofilisk interaksjonskromatografi (HILIC) Brukes for polare organiske analyt-ter, typisk for legemidler. Kolonnen er ofte derivatisert silika med polare gruppersom gjerne er ioniske eller zwitter-ioniske. Eluering skjer med vandige mobilfaser
44
med høyt organisk innhold.
Bioaffinitetskromatografi brukes ofte preparativt på biologiske molekyler. Det er ensvært spesifikk metode for å fjerne/hente ut et spesifikk molekyl basert på spesifik-ke interaksjoner. Slike interaksjoner kan være f.eks. enzym-substrat/inhibitor/kofaktor,antigen - antistoff, hormon - reseptor, lectin - glykoprotein, nukleinsyrer - komple-mentære sekvenser. Det er kun det stoffet som kolonnen er designet for som blirretardert, resten av stoffene i prøveblandingen blir ikke retardert i særlig grad. Nårstoffet man er interessert i sitter bundet i kolonnen, kan man få dette ut med etannet stoff som viser affinitet for enten ligandene i kolonnen, eller analyttmoleky-lene.
10 Kobling med MS
I massespektrometri er det tre hoveddeler: ionisering, masseanalysator og en ione-teller. Ioniseringen kan skje på utrolig mange måte, men et utvalg nevned her.Electron impact er em metode hvor analyttmolekylene under vakuum bombarde-res med en elektronstråle på rundt 70 eV. Dette gjør at man slår bort et elektronfra molekylene, og karakteriserende fragmenteringsmønstere kan finnes. Chemicalionization er en metode for molekyler som som ikke tåler så sterke forhold somEI utsetter de for. Først blir et annet stoff ionisert med EI, før analyttnolekyleneblandes med dette ioniserte stoffer. Ladningen overføres til analytten, og den ernå mulig å analysere med MS. For lite flyktige stoffer kan det være vanskelig medionisering, me da brukes teknikker som electronspray ionization eller oppvarmetforstøver. Dette er gode teknikker for å forhindre fragmentering.
Masseanalysatoren er delen av appratet som separerer ionene etter deres indivi-duelle m/z-fohold. Vanlige masseanalysatorer er magnetsektor -analysator og timeog flight-analysator. Ionetellere som brukes mye i dag er elektronmultiplikatorer,hvor en ladning som treffer en plate slår ut 1-3 elektroner som treffer neste plate.Der slås flere elektroner av, og til slutt er eletronmengden stor nok til å detekteres.En annen mulighet for kobling av kromatogrfi med MS er å hoppe over sortere io-nene etter mass, og detektere alle ionene som dannes. Dette vil gjøre at man miste
45
spesifisiteten om hvilket ion man får gjennom, men man vil få et mengdespesifiktkromatogram.
46
11 Forkortelser i KJ2053
Forkortelse Fullt navn Kort forklaringAFID Alkali Flame Ionization Detector Brukes i GCESI-MS Electron Spray Ionization - MSFWHM Full Width at Half Maximum Bredde ved halv topphøydeIEF IsoElectric FocusingPLOT Porous Layer Open Tubular KolonneSPME Solid-Phase MicroExtractionWCOT Wall Coated Open Tubular KolonneLPLC Low Pressure Liquid ChromatographyHPLC High Performance Liquid ChromatographyLSC Liquid Solid ChromatographyNPD Nitrogen-Phosphorus Detector Brukes med GCRP Reverse PhaseNP Normal PhaseSEC Size Exclusion ChromatographyCZE Capillary Zone ElectrophoresisIEC Ion Exchange ChromatographyGLC Gas Liquid ChromatographyGSC Gas Solid ChromatographyHIC Hydrophobic Interaction ChromatographyHILIC Hydrophilic Interaction Chromatography
Hydrophilic Interaction Liquid ChromatographyBAC BioAffinity Chromatography Brukes i LCHETP Hight Equivalent to a Theoretical Plate EffektivitetECD Electron Capture Detector I GC for spormengderMAOT Maximum Allowable Operation TemperatureSCOT Support Coated Open TubularTFAA TriFluorAcetic Acid AnhydrideTCD Thermal Conductivity Detector Brukes i GC
47
Register
Adsorpsjonsisoterm, 10Asymmetrifaktor, 6
Bioaffinitetskromatografi, 45Blotting, 35
Deteksjonsgrense LOD, 25Detektor (HPLC), 42Detektorrespons, 21Diode Array, 43
Elektroferogram, 33Elektroforetisk mobilitet, 32Elektrokromatografi, 33Elektroosmose, 32Eluotropisk serie, 14Endcapping, 42
Flashkromatografi, 16Fordelingskoeffisient, 4, 27Forkolonne, 40Fortrengning, 11Fraksjoneringsområde, 27
Gjennomstrømningsmedia, 8Gradientmetode, 37
Høytrykksblander, 38HIC, 44HILIC, 44
Immunoelektroforese, 35Injektor (HPLC), 40Isoelektrisk fokusering, 34
Isokratisk, 37Isotachoforese, 34
Joule heating, 32
Kvalitativ analyse, 21Kvanititativ analyse, 21Kvantifiseringsgrense LOQ, 25
Lavtrykksblander, 38Loopinjektor, 40
Moderator, 10Motstand mot massetransport, 7Moving Boundary elektroforese, 34MS, 45
Neff og Heff , 5
Oktadekyl-silika, 42Oppkonsentreringssone, 13Oppløsningen RS, 5
Platehøyde, 5Platetall, 5Polysiloksan, 20Pulsdemper, 39Pumpe (HPLC), 39
Responsfaktor, 22Retarderingsfaktor R, 4Retensjon, 4Retensjonsfaktor k, 4
Selektivitetsoptimering, 37
48
Separasjonsevne SEC, 27Separasjonsfaktor α, 4Seriekobling av kolonner, 40Snyders formel, 14Snyders løsningsmiddelstyrke ST , 37Sone-elektroforese, 34Sorpsjon, 11Superkritisk fluid ekstraksjon, 36
Trekantmetoden, 37Typa A silika, 41Type B silika, 41
Ventilinjeksjon, 40
Z-celle, 43
49
