- 1. Fundamentos de Engenharia Gentica Curso de Biomedicina Prof.
Dr. Eduardo Honda Porto Velho - RO 2008
2. Dogma Central da Biologia Molecular 3. O que Engenharia
Gentica?
- um conjunto de tecnologias que permitem a manipulao (modificao)
de material genticoin vitro
- Tambm conhecida comoTecnologia do DNA Recombinante
- Inclui o isolamento, cpia e multiplicao de genes, recombinao de
genes, ou DNA de diferentes espcies, e transferncia de genes de uma
espcie para outra, contornando o processo reprodutivo
4. Clonagem Molecular
- Para se estudar um determinado gene que codifica uma protena ou
RNA preciso isol-lo.
- Clonagem= fazer vrias cpias idnticas
- Clonagem de DNA isolar um fragmento especfico de DNA do
cromossomo, introduzi-lo num vetor capaz de replic-lo, e fazer
milhes de cpias idnticas
5. Clonagem Molecular Isolamento de Novos organismos que
produzem enzimas de interesse Biotecnolgico. 6. Clonagem Molecular-
Isolamento Gnico Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA. 7.
Isolamento do DNA- PCR Desnaturao do DNA Fita-Dupla 8. Isolamento
do DNA- PCR Aps vrios ciclos... Amplificao do Fragmento gnico
desejado !!! 9. Isolamento de DNA e Biblioteca de cDNA
- As bibliotecas de DNA representam, teoricamente, todo o
material gentico de um organismo clonado em umvetor
- A) Genmica: - clonado diretamente do genoma.
- B) cDNA:- feita a partir de mRNA .
10. 11. Isolamento de DNA- Biblioteca genmica
- Clivagem com enzimas de restrio;
- Ligao dos Fragmentos nos vetores;
12. Biblioteca de cDNA - mRNA de um tipo celular especfico;-
primer de oligo dT e transcriptase reversa; - DNA Polimerase I e
dNTPs;- Clonagem em um vetor de escolha 13. Clonagem Molecular-
Requerimentos
- Mtodo para clivar o DNA alvo;
- Mtodo para juntar 2 molculas de DNA covalentemente (inserto +
vetor)- LIGAO!
- Mtodo para introduzir molculas de DNA para dentro da clula
hospedeira que as possa duplicar;
- Mtodo para selecionar molculas de DNA quimrico ou
recombinantes;
- Mtodos para oscreeningda caracterstica procurada.
14. Gerao de molculas recombinantes - Clonagem Molecular - 15.
CLONAGEM 16. Ligao de extremidades compatveis 17. Stio Mltiplode
Clonagem (Polylinker) 18. As endonucleases de Restrio Clonagem
Orientada 19. As Ferramentas
20. ENZIMAS 21. Enzimas de Restrio
- So endonucleases que clivam o DNA em seqncias especficas
chamadas stio de restrio.
- Quebram a ligao fosfodister
- Os stios de restrio so, geralmente, seqncias palindrmicas
(mesma seqncia nos dois sentidos)
22. Enzymes for DNA manipulation restriction enzymes Source:
http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
23. Enzimas de Restrio
- Endonucleases stio-especficas isoladas de procariotos
- Protegem a bactria do ataque de vrus (fagos)
- Protegem seu prprio DNA metilando-o no stio de restrio
- Enzimas do tipo II so as mais utilizadas em Biologia
Molecular
Eco RI metilase 24. DNA Ligase
- Promover a unio de molculas de DNA pela formao de uma ligao
fosfodister entre uma extremidade 3-OH e outra 5-PO 4.
25. 26. DNA Polimerases
- Polimerizam a molcula de DNAapartir de uma extremidade 3-OH e
usando uma das fitas do DNA como molde.
27. Transcriptase reversa
- Polimeriza uma fita de DNA a partir de um molde de RNA
28. VETORES 29. Os Vetores
- So molculas de DNA que iro propagar o DNA clonado.
- Caractersticas desejadas:
- Habilidade de se duplicar na clula hospedeira;
- Marca gentica para selecionar a clula contendo o vetor
(resistncia a drogas ou marcas auxotrficas);
30. Tipos de vetores
- Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
- Vetores especiais para plantas, clulas de insetos e
mamferos
31. Plasmdios
- Molculas de DNA fita dupla circulares e de replicao autnoma
(ORI);
- Tm marcas de seleo para resistncia a antibiticos ou
complementao auxotrfica.
32. 33. 34. Sequncias de DNA de um vetor de expresso deE. coli
35. Vetores de expresso 36. Transformao Bacteriana Source:
http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Clulas podem ser selecionados em placas com antibitico. Alguns
plasmdios utilizam o gene da B-galactosidase. 37. O gene da
beta-galactosidase interrompido quando um fragmento de DNA clonado.
O substrato "X-gal fica azul se o gene da beta-gal permanece
intacto, isto a enzima est ativa. As colnias brancas na presena de
X-gal significa a presena de DNA recombinante no plasmidio. 38. 39.
Clonagem de um fragmento de DNA exgeno emE. coliusando o pBR322
como vetor 40. Clonagem de um fragmento de DNA exgeno emE.
coliusando o pBR322 como vetor 41. Bacterifagos
- Infectam clulas deE. colie o DNA se duplica na clula
hospedeira.
42. O Ciclo de vida de um bacterifago 43. Vetores baseados no
fago
- Foram retirados 20 Kb do genoma do fago necessrios para
integrao/exciso para serem substitudos por DNA exgeno e formar um
genoma de 50 Kb que empacotadoin vitro .
- Genomas maiores ou menores no so empacotados.
44. Clonando no Fago 45. Cosmdios
- So plasmdios contendo as extremidas cosdo fago
- Capacidade de clonagem: 40 Kb
46. 47. 48. Cromossomos artificiais 49. CLULAS HOSPEDEIRAS 50.
Clulas hospedeiras
- Permitir a duplicao do vetor;
- Permitir a seleo do vetor (sensibilidade a drogas ou
auxotrofia);
- No pode representar perigo ao meio ambiente;
- No deve modificar o DNA exgeno;
- Podem ser procariotos ( E. coli ) ou eucariotos (leveduras,
clulas vegetais, cultura de clulas de insetos e mamferos).
51. Mtodos de introduo do DNA na clula hospedeira
- Transformao com cloreto de clcio (bactrias);
- Transduo (fagos empacotadosin vitro );
- Transfeco (clulas de mamferos);
- Eletroporao (leveduras e bactrias);
- Biolstica ou bombardeamento (plantas);
- Microinjeo (ovos e ocitos).
52.
- O canho gnico uma nova forma de transformao celular.
- Esta arma usa uma particula de bombardeamento - Biolstica
Inserindo genes nas clulas 53. Adapted from Human Genetics,
Ricki Lewis Microinjeo 54. Transformao Bacteriana Source:
http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Clulas podem ser selecionados em placas com antibitico. Alguns
plasmdios utilizam o gene da B-galactosidase. 55. Clonando no Fago
56. Seleo de clones recombinantes
-
- resistncia e sensibilidade a antibiticos;
-
- requerimentos nutricionais (auxotrofia);
57. Screening Identificao de um clone de interesse - hibridao
com sonda radioativa - anticorpo especfico 58. Aplicaes
daEngenharia Gentica 59.
- Anlise da estrutura/funo de genes
- Produo de protenas de interesse industrial e teraputico
- Criao de organismos transgnicos
- Diagnstico molecular (doenas parasitrias e genticas)
- Teste de paternidade / medicina forense
- Arqueologia molecular / evoluo
60. Plantas Transgnicas 61. 62. Animais Transgnicos 63. 64.
Microinjeo de DNA no ncleo de ovo fertilizado de camundongo - gene
do fator de crescimento humano 65. Biofrmacos Recombinantes 66. 67.
68. Terapia Gnica 69. Adio do geneteraputico Substituio do
geneteraputico 70. Uso de vrus 71.