Az újabb mért és származtatott hematológiai paraméterek klinikai értéke

Bekő Gabriella

SE, Laboratóriumi Medicina Intézet

2013.május 30.

  Analyte

Biological DesirableVariation specification

CVw CVg I(%) B(%) TE(%

B-Erythrocytes, count 3,2 6,1 1,6 1,7 4,4

B-Erythrocyte distribution wide 3,5 5,7 1,8 1,7 4,6

B- Hematocrit 2,8 6,4 1,4 1,7 4,1B- Hemoglobin 2,8 6,6 1,4 1,8 4,1B)Erythr-

Mean corpuscular hemoglobin (HCM) 1,6 5,2 0,8 1,4 2,7

(B)Erythr-

Mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) 1,7 2,8 0,9 0,8 2,2

(B)Erythr-

Mean corpuscular volume (MCV) 1,3 4,8 0,7 1,2 2,3

B- Platelets, count 9,1 21,9 4,6 5,9 13,4

B-Platelet distribution wide 2,8

-- 1,4

--

--

(B)Plat-Mean platelet volume (MPV) 4,3 8,1 2,2 2,3 5,8

B-Neutrophyles, count 16,1 32,8 8,1 9,1 22,4

B-Lymphocytes, count 10,4 27,8 5,2 7,4 16,0

B-Monocytes, count 17,8 49,8 8,9 13,2 27,9

B-Eosinophils, count 21,0 76,4 10,5 19,8 37,1

S- Basophile, count 28.0 54.8 14.0 15.4 38.5

www. Westgard.com

A hematológiai paraméterek intra-individuális biológiaivariabilitása

  Analyte

Biological DesirableVariation specification

CVw CVg I(%) B(%) TE(%

B-Erythrocytes, count 3,2 6,1 1,6 1,7 4,4

B-Erythrocyte distribution wide 3,5 5,7 1,8 1,7 4,6

B- Hematocrit 2,8 6,4 1,4 1,7 4,1B- Hemoglobin 2,8 6,6 1,4 1,8 4,1B)Erythr-

Mean corpuscular hemoglobin (HCM) 1,6 5,2 0,8 1,4 2,7

(B)Erythr-

Mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) 1,7 2,8 0,9 0,8 2,2

(B)Erythr-

Mean corpuscular volume (MCV) 1,3 4,8 0,7 1,2 2,3

B- Platelets, count 9,1 21,9 4,6 5,9 13,4

B-Platelet distribution wide 2,8

-- 1,4

--

--

(B)Plat-Mean platelet volume (MPV) 4,3 8,1 2,2 2,3 5,8

B-Neutrophyles, count 16,1 32,8 8,1 9,1 22,4

B-Lymphocytes, count 10,4 27,8 5,2 7,4 16,0

B- Monocytes, count 17,8 49,8 8,9 13,2 27,9B- Eosinophils, count 21,0 76,4 10,5 19,8 37,1S- Reticulocyte, count 11.0 29.0 5.5 7.8 16.8

www. Westgard.com

Az elvárt analitikaivariabilitás

Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés Advia

Hidrodinamikailag fókuszált sejtáramlás, megvilágító lézer fény és detektor

Kis szög (2-4o) alatti fényszórás a sejt mérettel, a nagyobb szög alatti (10-15o) fényszórása sejt tartalommal (pl. hemoglobin koncentráció, vagy sejtmag sûrûség) arányos A kis és a nagy szög alatt szórt fény intenzitásának komplex matematikai összefüggését a Mie teória írja le

- Volume (térfogat)- Conductivity (vezetőképesség)- Axial light loss (AL2)- Low angle light scatter (LALS)- Median angle light scatter (MALS)- Lower median angle light scatter (LMALS) - Upper median angle light scatter (UMALS)

Beckman CoulterDXH-800

Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés 7 lézer detektorral

sejt granularitás, sejtmembrán felszíne

fényáteresztő képesség (transparency)sejt komplexitás

Fluoreszcens áramlásos cytometria Sysmex

• MAPPS

((MMulti ulti AAngle ngle PPolarized olarized SScatter catter SSeparationeparation))

A fényszóródás méréseA fényszóródás mérése több szögből több szögből

sejt komplexitás

sejt granuláltságsejt lebenyezettség

MAPPS

CellDyn Saphire

sejt méret

Fluoreszcens festés

• A sejtek emelkedett nukleinsav (DNS vagy RNS) tartalmával arányos a fluoreszcens jel nagysága

Felhődiagram fluorescens festéssel Sysmex XN-2000 automatán

Sysmex XE-2100

Promyelocyta

Myelocyta

Metamyelocyta

Promyelocyta

Myelocyta

Metamyelocyta

IG

IG (Immature Granulocytes)

1 Zaj1 Zaj2 2 Magvas vörösvérsejtMagvas vörösvérsejt3 3 Összetapadt thrombocytákÖsszetapadt thrombocyták4 4 Lymfocyták és basophylekLymfocyták és basophylek5 Large Unstained Cells5 Large Unstained Cells (LUC) (LUC)6 6 MonocytákMonocyták7 7 NeutropylekNeutropylek8 8 EosinophylekEosinophylek

Morfológiai flag-ek:

ATYP (Atípusos lymphocyták)IG (Éretlen granulocyták) MPO index (Myeloperoxidase hiány) NRBC (Magvas vörösvérsejtek)PLT-CLM (Összetapadt thrombocyták)

Felhődiagram peroxidáz festéssel (ADVIA 120)

IG (Immature Granulocytes)

Emelkedhet:• Bakteriális infekció• Akut gyulladás• Tumor (csontvelő metastasis)• Szövet nekrózis• Akut transzplantátum rejekció• Sebészeti, ortopédiai trauma• Myeloproliferatív neoplasia• Steroid• Terhesség (harmadik trimeszter)

Nagyobb jelentőségű az emelkedés (IGs>2%):

• idősek, újszülöttek, koraszülöttek akut infekció

• myeloszupresszált betegek akut infekció

• neutropeniával járó szepsis

Bernard Fernandes, Yukio Hamaguchi:Automated Enumeration of Immature Granulocytes Hematopathology 2007

Felnőtt referenciatartomány (n=58)

Balamurugan Senthilnayagam at all.:Automated Measurement of Immature Granulocytes: Performance Characteristics and Utility in Routine Clinical Practice - Pathology Research International 2012

Éretlen granulocyták (IG%) optimalizált cutoff értéke infekció esetén

Balamurugan Senthilnayagam at all.:Automated Measurement of Immature Granulocytes: Performance Characteristics and Utility in Routine Clinical Practice - Pathology Research International 2012

Infekcióban szenvedő betegek fehérvérsejt és IG értékei szignifikánsan magasabbak pozitív hemokultúra esetén

v

Egészséges IG% ACS IG% Szepszis gyanus IG%

átlag 0,33 0,45 2,60

szórás 0,16 0,18 4,00

IG % alakulása különböző betegcsoportokban (Sysmex XN1000)

Ig%

Egészséges kontrol Akut coronaria szindróma Szepszis gyanú

N=45 N=80 N=48

NS

Az éretlen neutrofil granulocyták abszolút számának (#IG) alakulása különböző betegcsoportokban

N=45 N=80 N=48

Egészséges kontrol Akut coronaria szindróma Szepszis gyanú

Egészséges #IG ACS #IG Szepszis gyanus #IG

átlag 0,031 0,036 2,60

szórás 0,028 0,031 4,00

NS

D. P.né 81 éves, vastagbél rezekciót követően egy hónappal subileusos tünetek jelentkeznek, beteg belázasodik

IG=2,8%IG=4,7%

IG=24,4%IG%Immature Granulocytes

A blast flag klinikai értéke 4 különböző hematológia automatán mérve (n = 430)

S.-H. KANG at al: Comparison of four hematology analyzers, CELL-DYN Sapphire, ADVIA 120, Coulter LH 750, and Sysmex XE-2100, in terms of clinical usefulness INTERNATIONAL JOURNAL OF LABORATORY HEMATOLOGY 2008

1. Zaj2. Blasztok sejtmagja3. Monociták és limfociták sejtmagja4. Bazofil sejtek5. Bazofil gyanús sejtek6. Szaturáció7. Neutrofil és eosinofil sejtmagok

Morfológiai flag-ek:

BLASTS (Blasztok) LS (Nem szegmentált granulocyták)

Felhődiagram a bazofil csatornán (ADVIA)

Blasztok és abnormál lymphocyták elkülönítése a WPC csatornán (SYSMEX XN-1000)

45 leukémiás beteg „blaszt” értékeinek összehasonlítása Khí-négyzet próbával

Kappa: 0,4-0,8 között→ jó megfelelőségKappa: 0,8 fölött → kiváló megfelelőség

BLASTM → blaszt pozitivitás mikroszkóppalBLASTA → blaszt pozitivitás Advia2120BLASTXN → blaszt pozitivitás Sysmex XNBLASTZ → blaszt pozitivitás Celldyn Saphire

Az „ atyp flag „klinikai értéke 4 különböző hematológia automatán mérve (n = 430)

S.-H. KANG at al: Comparison of four hematology analyzers, CELL-DYN Sapphire, ADVIA 120, Coulter LH 750, and Sysmex XE-2100, in terms of clinical usefulness INTERNATIONAL JOURNAL OF LABORATORY HEMATOLOGY 2008

45 leukémiás beteg „Atyp” értékeinek összehasonlítása (Advia, Sysmex XN, CellDyn Saphire)

Khí-négyzet próbával

ATYP A → ATIP Ly pozitivitás Advia2120ATYP XN → ATIP Ly pozitivitás Sysmex XNATYP Z → ATIP Ly pozitivitás Celldyn Saphire

Kappa: 0,4-0,8 között→ jó megfelelőségKappa: 0,8 fölött → kiváló megfelelőség

Különböző érettségű erythroblastok

Magvas vörösvérsejtek az Advia 2120 automata esetén

UniCel DxH 800 Coulter

NRBC mérés:

1.Vérminta hígítás2.Nem magvas vvt lizálás3.Elkülönítve marad: - fehérvérsejt + magvas vvs - thrombocyta - sejttörmelék4.Minta a flowcell-be kerül5.Lézer analízis - sejtméret - sejt karakterisztika - sejtmag differenciálás AL2 fénynyalábbal

interferencia kiszűrése

Magvas vörösvérsejtek a Sysmex XN-1000 WNR csatornáján

Az FL3 (speciális DNS festékanyag) 630 nm középhullámhosszú vörös fluoreszcencia -NRBC-k azonosítására alkalmas

NRBC mérés CellDyn-Sapphire automatán

Leletkiadás magvas vörösvérsejt esetén

A magvas vörösvérsejtek megjelenése a periférián

• Újszülött korban: - újszülöttkori hemolitikus betegség - koraszülöttek és újszülöttek hypoxiás károsodása • Felnőttkorban: - thalassemia - myeloproliferatív neoplasia ( myelofibrosis) - szolid tumor csontvelői metasztázissal - extramedulláris hematopoiesis - hematopoietikus stressz ( szeptikémia, masszív hemorrhagia, súlyos

hypoxia)

Clin Chem Lab Med 2012;50(2):357–360

NRBC előfordulása hematológiai betegségekben

Clin Chem Lab Med 2012;50(2):357–360

Ajánlott klinikai alkalmazás

- hematológiai betegségek diagnózisa

- súlyos kardio-thorakális műtéten átesett, egyéb sebészet intenzív ellátást igénylő nem hematológiai betegségben prognosztikai faktor

- csontvelő transzplantáció után ( >0,2x 109/L fölött magas mortalitási ráta)

- thalasszémia szindromában transzfúziós terápia hatékonyságának monitorozása

Hig

h A

ngle

(5-

15 d

egre

es)

Oxazine 750 Absorbance

Reticulocyta cytogram - reticulocyta érés Advia

Reticulocyta mérés Beckman Coulter UniCel DxH 800 automatánMetilénkék festést használva

Reticulocyta mérés a Sysmex XN automatán

Reticulocyta cytogram Sysmex XN-2000 automatán

Put science on your side.

38

Reticulocyta mérés CellDyn- Saphire automatán• A készülék a FL1 RNA és 7o Light scatter-t használja • A ”retic-box” - ot egy hisztogramba transzformálja • Egy dinamikus küszöb felállításával választja el az RBC és a RETC populációt. • Második lépésben, újabb küszöb felállításával választja el az érett és az

éretlen reticulocytákat (IRF)

WBC

NS

P < 0,001P < 0,001

P < 0,001

Advia 2120, Beckman DXH 800. Sysmex XN-1000, CellDYN Saphire Reticulocyta % összehasonlítása 110 hemodializált beteg esetén

NS

Advia 2120, Beckman DXH 800, Sysmex XN-1000, CellDyn- Saphire Reticulocyta % összehasonlítása

Advia DxH800 Sapphire Sysmex

Származtatott reticulocyta paraméterek

• MCVr (vagy MRV)a reticulocyta populáció átlagos sejtmérete• CHr vagy RetHe a reticulocyta populációban egy sejt átlagos

hemoglobin tartalma• CHCMr a reticulocyta populáció átlagos hemoglobin tartalma• M-RTC% a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-

ban• M-RTC# a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya

abszolút értékben• H-RTC% a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban• H-RTC# a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút

értékben• IRF-M+H a közepes és nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták

aránya %-ban

• A reticulocyta hemoglobin content (CHr vagy Ret-He) → jelzi a vörösvérsejtek termelődéséhez, a megelőző 3- 4 napban funkcionálisan rendelkezésre álló vaskészletet

Klinikai jelentősége:

• Vashiányos anémia diagnózisa felnőttekben(Mast et al., Blood 2002;99:1489–1491) és gyermekekben(Brugnara et al., JAMA 1999;281:2225–2230; Ullrich et al., JAMA 2005;294:924–930; Bakr and Sarette, Eur J Pediatr 2006;165:442–445).

• Intravénás és orális vasterápia hatékonyságát már 2-3 nap múlva jelzi (Brugnara et al., Blood 1994;83:3100–3101).

• Korai indikátor az erithropoein terápia monitorozásakor(Fishbane et al., Kidney Int 1997;52:217–222; Fishbane et al., Kidney Int 2001;60:2406–2411; Mittman et al., Am J Kidney Dis 1997;30:912–922; Tsuchiya et al., Clin Nephrol 2003;59:115–123; Chuang et al., Nephrol Dial Transplant 2003;18:370–377).

• Vashiányos anémia elkülönítése más anémiáktól Reticulocyte hemoglobin content is a recent addition to an expanding list of biomarkers that can be used to differentiate iron deficiency from other causes of anemia. Am. J. Hematol., 2008.

CHr vagy Ret-He klinikai jelentősége

y = 0,8599x + 3,884R² = 0,8924

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0

110 hemodializált beteg CHr (Advia) és RetHe (Sysmex XN) értékének összehasonlításaCHr (pg)

RetHe (pg)

R= 0.93

y = 1,2329x + 64,715R² = 0,1742

80

90

100

110

120

130

140

25,0 30,0 35,0 40,0 45,0

RS

f (fl

)

RetHe (pg)

110 hemodializált beteg RSf (Beckman DxH-800) és RetHe (Sysmex XN-1000) paraméterek összehasonlítása

R=0,42

RSf→Red blood cell size factor

IRF(Immature reticulocyte fraction) használata

• Anémiák differenciálása

• Táplálkozással kapcsolatos anémiák terápiájának monitorozása

• Csontvelő regeneráció korai monitorozás (csontvelő transzplantáció vagy kemoterápia után)

• Aplasztikus anémia verifikálása

• Csontvelő sejtek gyűjtésének időzítése

y = 1,2113x + 2,8255R² = 0,5921

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

- 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0

110 hemodializált beteg AIRF(%) (Advia 2120) és SIRF(%) Sysmex XN-1000 értékeinek összehasonlításaAIRF%

SIRF %

R=0.77

y = 1,1256x + 14,08R² = 0,7219

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

- 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0

110 hemodializált beteg CellDyn Saphire (ZIRF%) és Sysmex XN-1000 (SIRF%) értékeinek összehasonlítása

ZIRF%

SIRF%

R=0.85

y = 0,5714x + 36,251R² = 0,1802

0

10

20

30

40

50

60

70

- 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0

BIR

F%

SIRF%

110 hemodializált beteg Beckman DxH-800 (BIRF%) ésSysmex XN-1000(SIRF%) értékeinek összehasonlítása

R= 0,42

RBC fragmentocyták a Sysmex XE 2000 felhődiagramon

RBC

Fragmentált vörösvérsejtek Sysmex XE 2000 automatán

Klinikai alkalmazás:Microangiopathiák diagnózisa ésMonitorozásaa, DICb, thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) c, hemolytic-uremic syndrome (HUS)Thrombotic microangiopathic anemia (TMA)Csontvelőtranszplantáció utáni monitorozás HELLP syndromeVvt-k fizikai ártalma kóros felszínen (műbillentyű, artériás graft)

Thrombocyta cytogram (Advia 120)

1

2

3

4

5

1 Thrombocyták2 Nagy thrombocyák3 Vörösvérsejtek4 Vvs fragmentumok5 Üres vvs-ek

Té

rfog

at

Refraktív index (Thr törésmutató)

Lesesve JF, Salignac S, Alla F, et al. Comparative evaluation of schistocyte counting by an automated methodand by microscopic determination. Am J Clin Pathol.2007;121:739-745.

Fragmentált vörösvérsejtek (schistocyták) mérésének összehasonlítása Advia 120 automatán és manuális módszerrel

On the basis of the published scientific studies and personal experience of the Group members and expert reviewers, the ICSH Schistocyte Working Group recognizes the utility of the automated FRC count as a screening method in the routine laboratory. All samples with a positive automated FRC count at diagnosis as well as macrocytic samples with a negative automated FRC count need to be confirmed by microscopy. One major advantage of the automated FRC count is the possibility of easily obtaining an accurate and precise follow-up of true-positive samples.

G. ZINI1, G. d’ONOFRIO2, C. BRIGGS3, W. ERBER4, J. M. JOU5, S. H. LEE6, S.McFADDEN7, J. L. VIVES-CORRONS5, N. YUTAKA8, J. F. LESESVEICSH recommendations for identification, diagnostic value, and quantitation of schistocytes International Journal of Laboratory HematologyVolume 34, Issue 2, pages 107–116, April 2012

ICSH =International council for standardization in haematology

High angle detector(5o - 15o)

Low angle detector (2o-3o)

670nmLaserDiode

Thrombocyták Flow-cytometriás analízise

High angle detector(5o - 15o)

Low angle detector (2o-3o)

670nmLaserDiode

Előny: specificitás↑ és szenzitivitás↑

ThrombocytopeniaImpedanciával mérve

ThrombocytopeniaOptikai mérés a reticulocyta csatornán

Óriás thrombocyták jelenléte

Thrombocyta mérés Fluorocell fluoreszcens festéssel Sysmex XN2000 automatával

M. Schoorl Haematology & Immunology 2012

ReproducibilityAt a level of 20x109/LPLTs, reproducibility for PLT-I, PLT-O and PLT-F on the XN2000 demonstrated coefficients of variation of 9.3%, 8.5% and 3.0% respectively.

r=0.988r=0.956

Thrombocytákról kapott információk

• PLT Thrombocyta szám

• (PLT Count x RBC Cal Factor x PLT Cal Factor)

• MPV Átlagos thrombocyta térfogat

• PDW Thrombocyta eloszlási görbe szélesség

• Large LPLT nagy thrombocyta térfogat (nagyobb mint 20 fl)

• IPF% (Immature platelet Fraction) reticulált thrombocyták

MPV M

A: Acute coronary events C: Controls J Clin Pathol. 2009

MPV signifikánsan nagyobb akut koronária betegségben

Átlagos thrombocyta térfogat (MPV) alakulása különböző betegcsoportokban

Kontrol Hemodializált ACS Szepszis gyanú

P<0,001MPV fl P<0,01

P<0,01

N=46N=80N=110N=40

IPF% (Immature Platelet Fraction) retikulált thrombocyták

IPF

Sysmex XE-5000 Sysmex XN 2000

Éretlen thrombocyta frakció (IPF)alakulása különböző betegcsoportokban

Kontrol Hemodializált ACS Szepszis gyanú

P<0,001P<0,001

P<0,001

IPF %

N=40 N=110N=46

N=80

•Fiatal, mRNS tartalmú thrombocyta•Élettartam: 1 nap

•Referencia tartomány: 1.1-6.1%

•Érett thrombocytánál nagyobb•Denzitása is nagyobb, mint az érettebb alakoké

Emelkedett vagy normál IPF: ITP

Alacsony IPF: CsV elégtelenség

Retikulált thrombocyta

J.Lab.Med. 2008

IPF értékek különböző klinikai állapotokban:

1. Kemoterápia utáni thrombopoesis megítéléseIPF% korábban emelkedik, mint a thrombocyta szám

2. Thrombocyta transzfúzió után: IPF% 24 órán keresztül csökken ok: hígulás, TPO gátlás

3. Sepsisben az IPF% emelkedett thrombocyta szám emelkedés nélkülok: IL-6→ TPO-szerű aktivitás perifériás thrombocyta destrukció

4. Súlyos thrombocytopéniában emelkedett IPF% esetén, a thrombocytaszám emelkedés 24-48 óra múlva várható

Köszönöm a megtisztelő figyelmet!

NRBC

IG% IRF

CHr v.RetHe

IPFMPV

#IG

fragmentocyta