15

BAB II

PELAKSANAAN PENELITIANII.1Alat dan Bahan yang digunakanII.1.1Alat

Alat-alat yang digunakan adalah alat uji difusi, blender, cawan porselin, gelas arloji, gelas piala, gelas ukur, homogenizer, lemari pendingin, mikropipet, labu erlenmeyer, labu tentukur, lemari pendingin, mortir dan stamfer, panci infus, penangas air, pH meter, pipet tetes, rotavapor, spektrofotometer UV-VIS, termometer, timbangan analitik, dan viskometer.II.1.2Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah aquadestilata, asam stearat, asam oleat, -tokoferol, biji kasumba turate (Carthamus tinctorius L.), membran kulit ular, dapar pH 7,4 , DPPH, DMSO, etanol absolut, ekstrak biji kasumba turate (Carthamus tinctorius L.), Isopropyl miristat, kertas Whatman, kertas saring, metil paraben, minyak melati, novomer,phospat buffer saline (PBS), propilen glikol, propil paraben, setil akohol, dan stearil alcohol.II.2Prosedur Penelitian

II.2.1 Pengambilan Biji Kasumba Turate

Sampel biji kasumba turate (Carthamus tinctorius L.) diambil dari Desa Waempubbu, Kecamatan Amali, Kabupaten Bone, Sulawesi Selatan.

II.2.2Penyiapan Biji Kasumba Turate

Biji kasumba turate yang diperoleh sudah dalam bentuk kering.Biji ditumbuk atau diblender hingga diperoleh serbuk kasar.

II.2.3Ekstraksi Biji Kasumba Turate

Sebanyak 50 g biji kasumba turate dimasukkan ke dalam panci infus, ditambahkan air sebanyak 500 ml. Biji kemudian dipanaskan selama 15 menit terhitung sejak suhu mencapai 90C sambil sekali-sekali diaduk. Infus diserkai sewaktu masih panas menggunakan kain flanel.Untuk mencukupi kekurangan volume, ditambahkan air panas melalui ampasnya hingga diperoleh volume 500 ml. Ekstrak kemudian diliofilisasi untuk memperoleh ekstrak kering.II.2.4Formulasi Krim

Dibuat formula krim dengan tipe krim M/A yang mengandung ekstrak biji kasumba turate (Carthamus tinctorius L) sebagai zat aktif dengan menggunakan variasi 3 enhancer, yakni isopropyl miristat, dimethyl solfoxide (DMSO), dan asam oleat. Tabel 1. Rancangan Formula Krim AntioksidanNo.Nama BahanFormula (g)

A1A2A3A4

1.Ekstrak biji kasumba turate3333

2.Asam stearat 5555

3.Setil akohol 1,51,51,51,5

4.Stearil alcohol1111

5.Propilen glikol 15151515

6.Metil paraben0,20,20,20,2

7.Propil paraben 0,020,020,020,02

8.Novomer2222

9.- tokoferol0,050,050,050,05

10.Minyak wijen0,00050,00050,00050,0005

11.Isopropyl Miristat-3--

DMSO--2-

Asam Oleat---2

12.Aquadest72,2369,2370,2370,23

Keterangan :

A1 : standar

A2 : penetrasi isopropyl miristat

A3 : penetrasi DMSO

A4 : penetrasi asam oleatII.2.5Pembuatan Krim

Bahan-bahan ditimbang sesuai rancangan formula pada tabel 1. Fase minyak dibuat dengan cara melebur stearil alkohol, asam stearat, setil alkohol, bahan penetrasi dan propil paraben secara berturut-turut berdasarkan titik lebur bahan dalam cawan porselen di atas penangas air hingga suhu 70C sambil diaduk hingga homogen. Fase air dibuat dengan cara memanaskan air hingga 70C, ditambahkan metil paraben sambil diaduk hingga melarut sempurna. Setelah itu, ditambahkan propilen glikol kemudian diaduk hingga homogen, lalu ditimbang emulgator sesuai formula. Selanjutnya fase minyak dituang ke dalam fase air, diaduk dengan homogenizer dengan kecepatan 4000 rpm masukkan emulgator yang akan digunakan dan diaduk lagi hingga homogen. Krim didiamkan hingga suhu 40-45C kemudian ditambahkan ekstrak biji kasumba turate, -tokoferol dan pengaroma minyak wijen, diaduk hingga homogen.II.2.6 Evaluasi Tipe Emulsi II.2.6.1Metode Pengenceran

Krim yang telah dibuat dimasukkan dalam vial, kemudian diencerkan dengan ditambahkan air. Jika emulsi dapat diencerkan maka tipe emulsinya M/A.II.2.6.2 Metode Dispersi Zat Warna

Krim yang telah dibuat dimasukkan ke dalam gelas piala, kemudian ditetesi beberapa tetes larutan metilen biru di atasnya. Jika warna biru segera terdispersi keseluruh emulsi maka tipe emulsinya M/A.

II.2.6.3 Metode Konduktivitas

Sampel krim yang telah dibuat dimasukkan sebanyak 25 ml ke dalam gelas piala, kemudian dihubungkan dengan rangkaian arus listrik. Tes ini didasarkan prinsip bahwa air menghantarkan aliran listrik sedangkan minyak tidak. Apabila lampu menyala maka tipe emulsinya adalah M/A. Jika sistem tidak menghantarkan aliran listrik atau lampu tidak menyala maka emulsi tersebut bertipe A/M.II.2.6.4 Kondisi Penyimpanan Dipercepat

Salah satu cara mempercepat evaluasi kestabilan adalah dengan penyimpanan selama beberapa periode (waktu) pada suhu yang lebih tinggi dari normal. Cara khusus ini berguna untuk mengevaluasi shelf life emulsi dengan siklus antara 2 suhu, yaitu 50C dan 350C dalam 12 jam digunakan selama 10 siklus.

II.2.7 Evaluasi Kestabilan Fisik Krim

II.2.7.1 Pemeriksaan Organoleptis

Pengamatan organoleptis yang dilakukan terhadap sediaan krim yang telah dibuat meliputi pengamatan perubahan warna dan bau.

II.2.7.2 Pengukuran Volume Kriming

Krim sebanyak 25 ml dimasukkan ke dalam gelas ukur dan disimpan secara bergantian pada suhu 5oC dan 35oC (satu siklus) masing-masing selama 12 jam. Siklus ini diulangi selama sepuluh kali dan pengamatan volume kriming dilakukan setelah tiap satu siklus penyimpanan. Hasil pengamatan volume kriming dihitung dalam % dengan rumus :

Dimana : Vu = volume emulsi yang kriming

Vo = volume total krim

II.2.7.3 Pengukuran Viskositas

Pengukuran viskositas dilakukan pada sediaan krim sebelum dan sesudah diberi stress condition. Krim yang telah dibuat disimpan secara bergantian pada suhu 5oC dan 35oC (satu siklus) masing-masing selama 12 jam. Siklus ini diulangi sebanyak sepuluh kali. Pengukuran viskositas dilakukan setelah sepuluh siklus penyimpanan dengan menggunakan viskometer Brookfield pada 60 rpm dengan menggunakan spindle no.7 .

II.2.7.4 Pengukuran Tetes Terdispersi

Sediaan krim yang telah jadi dimasukkan dalam vial kemudian dilakukan pengukuran tetes terdispersi sebelum dan setelah kondisi penyimpanan dipercepat yaitu penyimpanan pada 5oC dan 35oC secara bergantian masing-masing selama 12 jam sebanyak 10 siklus. Pengamatan ukuran tetes terdispersi dilakukan dengan menggunakan mikroskop mikrometer. Caranya dengan menggoreskan cream pada objek gelas kemudian ditutup dengan dek gelas dan setelah diperoleh perbesaran dan perbandingan skala mikrometer okuler dan mikrometer objektif yang sesuai maka diamati rentang ukuran partikel tetes terdispersi.

II.2.7.5 Inversi Fase

Sediaan krim yang telah jadi diberi perlakuan kondisi penyimpanan dipercepat yaitu pada penyimpanan 5oC dan 35oC. Masing-masing selama 12 jam sebanyak 10 siklus kemudian diuji kembali tipe emulsinya dengan metode pengenceran dan metode dispersi zat warna metilen biru.

II.2.7.6 Pengukuran pH

Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH meter meliputi : pH basis, pH basis yang telah dicampurkan dengan ekstrak, dan pH krim setelah dilakukan stress condition. II.2.8Uji Difusi dengan Menggunakan Metode Difusi Franz

II.2.8.1 Pembuatan Dapar Fosfat pH 7,4Sebanyak 50 ml larutan Kalium monofosfat 0,2 M dimasukkan kedalam labu ukur 200 ml, kemudian ditambahkan kira-kira 39,1 ml larutan NaOH 0,2 M dan dilakukan pengujian pH menggunakan pH meter hingga pH= 7,4. Selanjutnya ditambahkan air sampai tanda batas, kemudian labu ukur dikocokdan disimpan dalam wadah tertutup rapat, dibungkus dengan alumunium foil.

II.2.8.2 Pembuatan Kurva Baku Asam Galat dengan Reagen Folin-Ciocalteau

Sebanyak 300 l larutan asam galat konsentrasi 10, 15, 20, 25, 30, 35 dan 40 g/ml masing-masing dimasukkan dalam tabung, kemudian ditambah 1,5 ml reagen Folin Ciocalteau (1:10) dan digojog. Setelah didiamkan selama 3 menit, masing-masing larutan ditambah 1,2 ml larutan Na2CO3 7,5% digojog homogen, dan didiamkan pada range operating time pada suhu kamar. Semua larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang absorbansi maksimum, kemudian dibuat kurva kalibrasi hubungan antara konsentrasi asam galat (g/ml) dengan absorbansi.II.2.8.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Krim Ekstrak Biji Kasumba Turate

Ekstrak biji kasumba turate ditimbang seksama sebanyak 100 mg, dilarutkan dengan dapar fosfat pH 7,4 dalam labu ukur ad 100 ml. didapatkan larutan dengan konsentrasi 1000 ppm. Dari larutan tersebut dipepet 10 ml, larutkan dengan dapar fosfat pH 7,4 dalam labu ukur ad 100 ml. didapatkan larutan induk 100 ppm, dipipet dan diencerkan dengan dapar fosfat pH 7,4 hingga didapat konsentrasi 5, 7, 10, 12, dan 15 ppm. Ukur serapannya pada panjang gelombang () maksimum dengan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang () maksimum ekstrak bungan kasumba turate dalam dapar fosfat pH 7,4 ditentukan dengan melakukan scanning pada panjang gelombang antara 200-400 nm. Kemudian dibuat kurva kalibrasi dan persamaan regresinya.II.2.8.4 Penyiapan Membran Kulit Ular

Kulit ular bagian dorsal dicuci dengan aquades dan direndam dengan aquades selama 24 jam. Membran diangkat dan dikeringkan pada suhu kamar dengan cara diletakkan di atas kertas saring untuk mempercepat pengeringan. Membran dipotong dengan diameter 2,5 cm dan direndam dalam larutan dapar fosfat selama 1 jam sebelum digunakan. II.2.8.5 Uji daya penetrasi menggunakan sel difusi Franz

Uji permeasi dilakukan dengan menggunakan alat Franz Diffusion Cell yang terdiri dari sel permeasi, pompa peristaltik, pengaduk, beaker glass, penangas air, penampung reseptor, temometer dan selang silikon dengan diameter 4 mm. Formula sediaan uji ditimbang sebanyak 1 g dan diratakan di atas membran. Suhu sistem dijaga 37 0,5 C dengan cairan reseptor yang berisi 100 mL dapar fosfat pH 7,4. Pompa peristaltik menghisap cairan reseptor dari beaker glass kemudian dipompa ke dalam sel permeasi perkutan sehingga terjadi aliran secara hidrodinamis. Kemudian cairan dialirkan lagi ke reseptor. Proses dilakukan selama 6 jam. Setiap selang waktu 30 menit, 1 jam, 1 jam 30 menit dan seterusnya dilakukan pengambilan sampel dari cairan reseptor sebanyak 5 mL dan setiap pengambilan selalu diganti dengan dapar fosfat pH 7,4 sebanyak 5 mL. Konsentrasi senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan yang terdifusi diukur dengan spektrofotometer UV visibel.II.2.9 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Penangkap Radikal Bebas DPPH

II.2.9.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM

Larutan DPPH 0,4 mM dibuat dengan cara menimbang 0,0079 g DPPH dan dilarutkan dengan etanol absolut hingga 50 ml dalam labu tentukur.

II.2.9.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (maks) DPPH

Larutan blanko dibuat dengan cara memipet 900 l larutan DPPH kemudian dicukupkan volumenya hingga 5 ml dengan etanol absolut. Dibuat 3 replikasi blanko kemudian diukur panjang gelombang maksimumnya.II.2.9.3 Pengukuran Aktivitas Blanko

Larutan DPPH 0,4 mM dipipet sebanyak 900 (l kemudian dicukupkan volumenya hingga 5 ml dengan etanol absolut, didiamkan selama 30 menit, dan diukur serapannya pada panjang gelombang 516 nm.II.2.9.4 Pengujian Aktivitas Antioksidan

Krim ekstrak biji kasumba turate ditimbang masing-masing sebanyak 10 g dan dilarutkan dengan etanol absolut hingga 100 ml sehingga diperoleh konsentrasi 100.000 g/ml sebagai larutan stok. Dari larutan stok krim ekstrak biji kasumba turate dibuat seri konsentrasi 10.000; 15.000; 20.000 g/ml dengan memipet sampel berturut-turut 500; 750; 1000; 1250 l, Kemudian larutan DPPH ditambahkan sebanyak 900 l dan dicukupkan volumenya hingga 5 ml dengan etanol absolut.Campuran tersebut dikocok dan didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar dan pada ruangan yang terlindung dari cahaya.Serapannya diukur pada panjang gelombang 516 nm. Selanjutnya dihitung persentase penangkapan radikal bebas dan nilai IC50 (50% Inhibitory Concentration).

II.3Pengumpulan dan Analisis Data

Data dari hasil penelitian dikumpulkan dan dilakukan analisis data.II.4Pembahasan Hasil

Pembahasan dilakukan berdasarkan hasil penelitianII.5Pengambilan Kesimpulan

Kesimpulan diambil berdasarkan hasil pembahasanVolume kriming =

6

_1419936282.unknown