Hochschule Neubrandenburg Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften Studiengang Bioprodukttechnologie WS 2013/2014

Bachelorarbeit

Bewertung von künstlichen Verdauungssystemen in Hinblick auf die Eignung zur Prüfung der Stabilität von

Polyphenolen

Verfasser: Julia Peters

Erstprüfer: Prof. Dr. sc. agr. Gerhard Flick

Zweitprüfer: Dipl.-agr. biol. Sabine Heeren

URN: urn:nbn:de:gbv:519-thesis2013-0731-7

Abstract

The aim of this work is to compare in vitro digestion models in which polyphenols were exam-

ined. In the last years the interest in the research of polyphenols has increased significantly due

to their health benefits impacts. The positive effects of polyphenols depend on the reach of the

gastrointestinal tract and from their associated stability. Twelve in vitro models have been pre-

sented in this work. Ten of them are based on a source. These studies have only small variations

among themselves with regard to the used chemicals and enzymes as well as the experimental

time. Two of the experiments described in this work have larger variations in the experimental

period: Green et al., 2007 (3 hours) and Tarko et al., 2009 (6 hours). Other models have a test

period of four hours, on average. All models simulating the digestion was performed at a tem-

perature of 37 ° C. It has been found that the stomach digestion has no effect on the stability of

the polyphenols. This can be explained by the stability of polyphenols in acidic medium. n addi-

tion an increased stability of the polyphenols with a high fat content of the test sample could be

determined.

III

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis.............................................................................................................. V

1 Einleitung und Problemstellung....................................................................................... 6

1.1 Polyphenole .................................................................................................................... 7

1.2 Klassifizierung der Polyphenole ...................................................................................... 7

1.3 Biosynthese der Polyphenole ......................................................................................... 10

1.4 Ernährungsphysiologische Bedeutung der Polyphenole ................................................. 12

2 Grundlagen der in vivo Verdauung ................................................................................ 16

2.1 Das Verdauungssystem des Menschen .......................................................................... 16

2.2 Das Verdauungssystem des Schweins ........................................................................... 19

2.3 Intestinale Transportmechanismen ................................................................................ 20

2.4 Bioverfügbarkeit der Polyphenole ................................................................................. 20

2.4.1 Absorption .................................................................................................................... 21

2.4.2 Verteilung ..................................................................................................................... 22

2.4.3 Metabolismus ................................................................................................................ 23

2.4.3.1 Hydrolyse ..................................................................................................................... 24

2.4.3.2 Cytochrom-P450-abhängige Phase-1-Reaktionen .......................................................... 25

2.4.3.3 Konjugation .................................................................................................................. 25

2.4.4 Ausscheidung ................................................................................................................ 26

2.4.5 Mikrobielle Umsetzung der Polyphenole ....................................................................... 26

3 Grundlagen der in vitro Verdauung ............................................................................... 29

3.1 In vitro Modelle ............................................................................................................ 29

3.2 Zellkulturmodelle der intestinalen Absorption und Metabolismus ................................. 32

3.3 Enzyme der Verdauung ................................................................................................. 34

3.3.1 Lipasen ......................................................................................................................... 36

3.3.2 Proteasen....................................................................................................................... 36

IV

3.3.3 Amylase ........................................................................................................................ 37

3.4 Einfluss der Probenbestandteile auf die in vitro Verdauung ........................................... 37

3.5 Der Verdauungszeitraum ............................................................................................... 38

4 Modelle zur Verdauung und Stabilität von Polyphenolen .............................................. 39

5 Diskussion .................................................................................................................... 42

6 Zusammenfassung ......................................................................................................... 47

Literaturverzeichnis .................................................................................................................. 49

Tabellenverzeichnis .................................................................................................................. 58

Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................. 59

Eidesstattliche Erklärung .......................................................................................................... 60

V

Abkürzungsverzeichnis

AOP Antioxidatives Potential

CBG Cytosolische β-Glukosidase

CYPs Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen

CYP1A1 Cytochrom-P450-1A1

CYP3A4 Cytochrom-P450-3A4

COMT Catechol-O-Methyltransferase

DNA Desoxyribonukleinsäure

GIT Gastrointestinaltrakt

GLUT2 Glucosetransporter Typ 2

HCL Salzsäure

HPLC High-Performance-Liquid-Chromatography

KHK Herz-Kreislauf-Erkrankungen

LDL Low Density Lipoprotein

LPH Laktase-Phloridzin-Hydrolase

NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat

OCH3 Methoxygruppe

RNA Ribonukleinsäure

RNS Reaktive Stickstoffspezies

ROS Reaktive Sauerstoffspezies

SGLT1 Natrium/Glucose-Cotransporter 1

SHIME Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem

SULT Phenol-Sulfontransferase

TIM TNO Intestinal Models

TNO Institut für Angewandte Naturwissenschaftliche Forschung

UGT UDP-Glukuronyltransferase

UPLC Ultra-Performance-Liquid-Chromatography

UV/VIS Ultraviolett/visible

6

1 Einleitung und Problemstellung

Seit vielen Jahren existieren epidemiologische Studien wie die Women’s Health Study (2000),

die Adelaide Case-Control Study (1993) oder die Zutphen-Study (1996), in denen eine obst- und

gemüsereiche Ernährung mit der Prävention von Krebserkrankungen, kardiovaskulären und di-

versen chronischen Erkrankungen sowie einer antiinflammatorischen Wirkung in Verbindung

gebracht wird. Diese protektiven Effekte sind vor allem auf die antioxidativen Eigenschaften der

Polyphenole zurückzuführen. In einer Reihe von Untersuchungen (Wang et al., 1997; Pool-Zobel

et al., 1999) konnte bewiesen werden, dass Polyphenole, in diesem Fall Anthocyane, in der Lage

sind, freie Radikale, welche auf natürlichem Wege und durch äußere Einflüsse im Körper entste-

hen, abzufangen und zu neutralisieren. Des Weiteren konnten im Rahmen dieser Studien positive

Effekte auf verschiedene Tumorzellen nachgewiesen werden. Diese antikanzerogenen und antio-

xidativen Effekte wurden weiterhin anhand von Studien (Ramirez-Tortosa et al., 2001) an Ratten

nachgewiesen.

Trotz des Belegens der positiven Effekte der Polyphenole besteht noch Bedarf an weiteren Un-

tersuchungen zur Metabolisierung, Modifikation und zu den Wechselwirkungen im Körper der

aufgenommenen Polyphenole. Diese Mechanismen sind trotz zahlreicher Untersuchungen noch

nicht ausreichend geklärt, was unter anderem an der Komplexität der in vivo Verdauungsvorgän-

ge liegt. Des Weiteren mehren sich in den letzten Jahren Zweifel an der Vergleichbarkeit der in

vivo Untersuchungen, da verschiedene Methoden zur Probenahme, Lagerung und deren Analytik

verwendet werden (Mai & Draganov, 2009; Vacek et al., 2009). Da sich im Allgemeinen, aber

auch besonders bei polyphenolreichen Inhaltsstoffen, Humanstudien oder Tierversuche selbst

mit modernster Technik als sehr schwierig gestalten lassen, kam es in den letzten Jahren zu der

Entwicklung von einer Alternative- den in vitro Modellen.

„Ein Modell unternimmt den Versuch, die komplexe Wirklichkeit verständlich und anschaulich

darzustellen, ist also eine Abstraktion und Beschreibung der realen Welt oder eines Teiles davon

(…). Modelle können daher immer nur einen kleinen zielgerichteten und zweckgebundenen

Ausschnitt der komplexen Realität repräsentieren. Die Funktion eines Modells besteht darin, aus

den vorgegebenen Bedingungen Prognosen ableiten zu können.“ (Bill & Zehner, 2001)

Welche in vitro Modelle lassen sich aber unterscheiden und wie verhalten sich die Polyphenole

bei der Simulation des Verdauungsvorganges, besonders deren Stabilität? Das Ziel dieser Arbeit

ist es unter anderem, dies zu klären sowie sich mit der Übertragbarkeit der in vitro Ergebnisse

auf in vivo zu beschäftigen. Im Rahmen dieser Arbeit wird eine intensive Literaturrecherche zu

verschiedenen Autoren und deren in vitro Modellen durchgeführt. Diese Recherche führt zu ei-

7

ner Vielzahl von unterschiedlichen Modellen, von denen einige in der vorliegenden Arbeit dar-

gestellt werden.

1.1 Polyphenole

Polyphenole gehören zu den sekundären (nicht nutritiven) Pflanzeninhaltsstoffen, diese werden

je nach ihrer Funktion in primäre beziehungsweise sekundäre Stoffe eingeteilt. Während die pri-

mären Pflanzenstoffe als Nährstoffe vorwiegend am Energiestoffwechsel und am Aufbau der Pflanze

beteiligt sind, übernehmen die im sekundären Stoffwechsel gebildeten Substanzen der Pflanze keinerlei

lebensnotwendige, jedoch nützliche Funktionen für den Organismus. Beispielsweise bieten sie Schutz

vor UV-B-Strahlung, vor Schädlingsbefall, dienen als Wachstumsregulatoren oder sind an der

Reparatur von Zellschäden beteiligt (Stoll, 2008; Bellion, 2009).

1.2 Klassifizierung der Polyphenole

Zu den in der Natur vorkommenden Polyphenolen zählen mehrere tausend Verbindungen mit

meist mehr als zwei Phenol- oder Phenolethergruppen. Diese liegen in Pflanzen frei, als Ester

mit anderen Säuren, als Ester an Zucker gebunden, als Glycoside decarboxylierter Säuren oder

als Ester mit Alkoholen vor. Des Weiteren treten sie als Acylkomponente in Flavonoiden auf.

Die Polyphenole werden in vier Gruppen unterteilt: Phenolcarbonsäuren, Stilbene, Lignane und

Flavanoide. Zur Gruppe der Phenolcarbonsäuren gehören die Benzoesäure- und Zimtsäurederi-

vate, welche ein C6-C1- beziehungsweise ein C6-C3-Grundgerüst besitzen (Abbildung 1). Wich-

tige Vertreter der Benzoesäurederivate sind Protocatechusäure (R1=OH, R2=H), Gallussäure

(R1=OH, R2=OH), p-Hydroxybenzoesäure (R1/R2=H), Vanillinsäure (R1=OCH3, R2=H) oder

auch Syringasäure (R1/R2=OCH3), sie alle besitzen antioxidative, entzündungshemmende, anti-

mutagene und antikarzinogene Wirkungen. Hydroxybenzoesäuren liegen als Komponenten in

komplexeren Strukturen vor, wie beispielsweise hydrolysierbare Tannine (Gallotannine in Man-

gos, Erdbeeren, Himbeeren und Schwarzbeeren). Hydroxyzimtsäuren sind in der Natur verbreite-

ter als Hydroxybenzoesäuren, ihnen werden ebenfalls biologische Effekte wie antioxidative, an-

timikrobielle und entzündungshemmende Wirkungen zugeschrieben. Als Beispiele der Zimtsäu-

rederivate sind Zimtsäure (R1/R2=H), p-Coumarsäure (R1=H, R2=OH), Kaffeesäure

(R1/R2=OH) und Ferulasäure (R1=OCH3, R2=OH) zu nennen, welche sich lediglich im Hydro-

xyl- und Methoxy- Substitutionsmuster an Position vier und fünf des aromatischen Kohlenstoff-

rings unterscheiden. Meistens liegen sie gebunden, das heißt entweder glycosyliert oder in Form

von Estern mit Chinasäure, Shikimisäure oder Weinsäure vor. Als eine wichtige Verbindung ist

hier Chlorogensäure zu nennen, welche aus Kaffeesäure und Chinasäure besteht. Die höchsten

8

Gehalte an Chlorogensäure in Früchten erreichen Blaubeere, Kiwi, Pflaume, Kirsche und Apfel

(Deußer, 2010; Kraus, 2006).

Abbildung 1: Struktur der Benzoesäure- und Zimtsäurederivate

Als ein Beispiel für die Stilbene ist Resveratrol zu nennen, welches ein C6-C2-C6-Gerüst besitzt

und in Abbildung 2 dargestellt ist.

Abbildung 2: Struktur von Resveratrol

Resveratrol kommt in Weintrauben und in vielen daraus hergestellten Produkten vor und weist

anticanerogene, antiinflammatorische und anti-aging Effekte auf. Außerdem wird es mit dem

„French Paradox“ in Verbindung gebracht, welches das Ergebnis von epidemiologischen Studien

darstellt (Fleschhut, 2004).

Lignane bestehen aus zwei miteinander verknüpften Phenylpropan-Einheiten, woraus sich eine

C6-C3-C3-C6-Struktur ergibt. Durch zusätzliche Brücken über Sauerstoffatome oder C-C-

Bindungen entsteht die große strukturelle Vielfalt der Lignane. Die wichtigsten Vertreter sind

Secoisolaricirensinol (Abbildung 3) und Matairesinol. Neben den Isoflavonen und den Coum-

estanen gehören die Lignane zu den Phytoöstrogenen, wobei die Coumestane in der menschli-

chen Ernährung eine untergeordnete Bedeutung besitzen, da sie nur in wenigen pflanzlichen

Nahrungsmitteln vorkommen.

9

Abbildung 3: Struktur von Secoisolariciresinol

Lignane hingegen sind in pflanzlichen Lebensmitteln weit verbreitet, die höchsten Konzentratio-

nen sind bei Vollkorn und Ölsaaten zu finden (Kulling et al, 2003).

Die Flavonoide bilden den größten Anteil der in Lebensmitteln vorkommenden Polyphenole mit

mehr als derzeit 6500 bekannten Verbindungen. Das Grundgerüst der Flavonoide bildet das Fla-

van (2-Phenyl-benzo-dihydropyran), welches aus zwei aromatischen (A- und B-Ring) und einem

O-heterozyklischen Kohlenstoffring (C-Ring) besteht, wie in Abbildung 4 zu erkennen ist.

Abbildung 4: Flavangrundkörper

Aufgrund unterschiedlicher Oxidationsstufen an den Kohlenstoffatomen C-2, C-3 und C-4 er-

folgt eine Unterteilung der Flavonoide in sechs Untergruppen: Flavanone, Flavone, Flavonole,

Flavanole, Anthocyanidine und Isoflavone. Diese Verbindungen sind in Abbildung 5 dargestellt.

10

Abbildung 5: Klassifizierung der Flavonoide

Die Vielfalt der Flavonoide beruht auf der Anlagerung diverser Substituenten an den aromati-

schen Ringen, auf den Oxidationsgraden am O-heterozyklischen Kohlenstoffring sowie auf der

Anlagerung verschiedener Saccharide. Vorwiegend kommen die Flavonoide in der Natur nicht

frei (Aglykone) sondern als Flavonoidglykoside vor. Flavonoide sind Inhaltsstoffe vieler pflanz-

licher Nahrungsmittel wie Obst, Gemüse und daraus hergestellter Getränke wie beispielsweise

Kaffee, Tee oder Wein. Der Flavonoidgehalt in den einzelnen Pflanzen ist jeweils von der Sorte,

den Anbaubedingungen, dem Klima, insbesondere von der jahreszeitlich bedingten Lichtintensi-

tät und dem Reifegrad abhängig (Ackermann,2008; Habermehl et al., 2008; Leitzmann et al.,

2012).

1.3 Biosynthese der Polyphenole

Als Precursoren bei der Biosynthese von Polyphenolen wirken Phosphoenolpyruvat und Eryth-

rose-Phosphat, welche beide aus dem Kohlenhydrat-Stoffwechsel stammen. Aus der Shikimisäu-

re entstehen in mehreren Reaktionsschritten über den Shikimisäure-Weg die beiden aromati-

schen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin. Zunächst wird aus Phenylalanin Zimtsäure gebil-

det, woraus im nächsten Schritt p-Cumarsäure, welche das wichtigste Zwischenprodukt der Po-

lyphenol-Biosynthese ist, entsteht. Als nächstes sind zwei Reaktionsschritte möglich. Zum einem

wird durch weitere Hydroxylierung und Methylierung p-Coumarsäure zu Kaffeesäure und Feru-

lasäure umgesetzt. Analog zur β-Oxidation der Fettsäuren können diese Hydroxyzimtsäurederi-

vate zu Hydroxybenzoesäuren abgebaut werden, diese können allerdings auch aus Shikimisäure

entstehen. Die zweite Möglichkeit besteht darin, dass die an das Coenzym A gebundene p-

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Coumarsäure mit Malonyl-CoA zu einem Chalcon reagiert. Dieser Reaktionsschritt wird durch

die Chalcon-Synthase katalysiert und ist ein Schlüsselschritt des Synthesewegs. Durch die Chal-

con-Isomerase kann anschließend der Ringschluss zum Flavanon erfolgen. Aus dem Flavanon-

Grundgerüst entstehen durch verschiedene Oxidations-, Hydroxylierungs-, und Reduktionsvor-

gänge letzten Endes die verschiedenen Flavonoidunterklassen. In Abbildung 6 ist der gesamte

Verlauf der Biosynthese von Polyphenolen dargestellt (Hildebrand, 2004).

Abbildung 6: Biosyntheseweg der Polyphenole in Pflanzen

12

1.4 Ernährungsphysiologische Bedeutung der Polyphenole

Über die bereits erwähnten gesundheitsfördernden und protektiven Effekte der Polyphenole auf

den Menschen erfolgt auf den nächsten Seiten eine genauere Darstellung der einzelnen Wirkun-

gen.

Im menschlichen Organismus entstehen reaktive Sauerstoff- beziehungsweise Stickstoffspezies

(reactive oxygen/nitrogen species) während der normalen Zellaktivität, d.h. beispielsweise bei

der in den Mitochondrien ablaufenden Atmungskette, in Phagozyten bei immunologischen Vor-

gängen zur Abwehr von Mikroorganismen oder beim Abbau von DNA-Basen. Des Weiteren

kann durch äußere Faktoren wie UV-Strahlung, (kanzerogene) Chemikalien, Arzneimittel oder

Zigarettenrauch die Bildung von ROS und RNS gefördert werden. Zu den reaktiven Intermedia-

ten gehören freie Radikale wie das Hydroxylradikal (HO·), das Stickstoffdioxidradikal (NOO·)

oder das Superoxidradikalanion (·O2–). Allerdings zählen auch nichtradikalische Verbindungen

wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Singulettsauerstoff (1O2) oder Peroxynitrit (ONOO–), welche

zur Entstehung von Radikalen führen können, zu den reaktiven Intermediaten. Durch körpereig-

ne enzymatische (z.B. Superoxiddismutase) und nichtenzymatische, welche entweder im Körper

synthetisiert oder über die Nahrung aufgenommen werden, (z.B. Bildung von Glutathion) Ab-

wehrmechanismen wird ein Teil der ROS und RNS unschädlich gemacht. Kommt es zu einem

Übergewicht prooxidativer Prozesse, spricht man von oxidativen Stress, was zur oxidativem

Schädigung an DNA-Strängen, Proteinen und Zellmembranlipiden führen kann. Oxidativer

Stress wird mit einer Vielzahl von Stoffwechselstörungen beziehungsweise Krankheitskomple-

xen in Verbindung gebracht, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Parkinson und Alzhei-

mer. Mit der Nahrung aufgenommene Antioxidantien können bei oxidativem Stress zu weiteren

Schutzreaktionen beitragen. Die gesundheitsfördernden Wirkungen der Polyphenole werden da-

her mit ihrem antioxidativen Potential (AOP) in Verbindung gebracht. Sie fungieren als direkter

Radikalfänger, können Metallionen komplexieren oder lokale Sauerstoffkonzentrationen mini-

mieren. Anhand der Strukturformel von Quercetin (Flavonol) in Abbildung 7 lässt sich der anti-

oxidative Effekt erklären. Für die antioxidative Wirkung sind ortho-ständige Hydroxylgruppen

am B-Ring sowie die C2-C3-Doppelbindung und eine weitere Hydroxylgruppe am C-Ring ver-

antwortlich, durch die Flavonoide durch die Abgabe der Wasserstoffionen reaktive Sauer-

stoffspezies abfangen können.

13

Abbildung 7: Antioxidatives Potential von Quercetin

Das AOP der Polyphenole ist dabei von der jeweiligen Messmethode und dem Radikal, aller-

dings auch von der Struktur (Phenolklasse) und den vorhandenen Seitengruppen sowie deren

Position abhängig. Die meisten Studien zur Ermittlung des antioxidativen Potentials von Poly-

phenolen wurden zwar in vitro durchgeführt, allerdings konnte in einigen Studien auch eine

Wirksamkeit im menschlichen Organismus nachgewiesen werden. Serafini und Mitarbeiter

(1998) konnten nach der Aufnahme von alkoholfreien Rotwein eine Erhöhung des AOP im Blut-

plasma des Menschen nachweisen. Ähnliche Ergebnisse erzielten auch andere Gruppen (Matsu-

moto et al., 2001; Rosenblat et al., 2010) für ein Getränk mit Johannisbeersaft und Ant-

hocyankonzentraten aus Johannisbeere. Frühere epidemiologische Studien zeigen außerdem,

dass das Risiko an Krebs zu erkranken bei Personen mit einem hohen Konsum an Obst und Ge-

müse vergleichsweise geringer ist (Steinmetz & Potter, 1991; Block et al., 1992). Auf diesen

Ergebnissen basierend wurde die These aufgestellt, dass die nicht nutritiven Inhaltsstoffe in Le-

bensmitteln für diesen protektiven Effekt verantwortlich sind. In tierexperimentellen Versuchen

und in vitro konnten die antikanzerogenen Effekte der Polyphenole nachgewiesen werden

(Grimmer et al., 1992; Jacobasch et al., 2000; Yang et al., 2001). Aufgrund ihrer biologischen

Eigenschaften können sie in die Phasen der Krebsentstehung eingreifen und so möglicherweise

präventiv wirken, beispielsweise fungieren sie in der Initiationsphase der Krebsentstehung als

Hemmstoffe.

Weitere Studien haben sich mit einer negativen Korrelation zwischen der Aufnahme von

Flavonoiden und dem Risiko verschiedener Krankheiten, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen

(KHK), beschäftigt. Es konnte ermittelt werden, dass die Sterblichkeitsrate an KHK in Frank-

reich geringer als in anderen westlichen Industrieländern ist, obwohl die Aufnahme an gesättig-

ten Fettsäuren und die Serumcholesterinwerte in allen Ländern mit einander vergleichbar sind.

Dieses Phänomen, bekannt als French Paradoxon, wird auf den höheren Gemüse- und Obstver-

zehr und vor allem auf den Rotweinkonsum in Frankreich, und somit einer höheren Poly-

phenolaufnahme, begründet. Durch ihre Fähigkeit, ROS abzufangen und zu neutralisieren und

Lipoproteine, besonders Low Density Lipoprotein (LDL), vor der Oxidation zu schützen, kann

14

es zu einem verminderten Risiko von Herz-Kreislauf-Erkrankungen kommen (Watzl & Rech-

kammer, 2001). Weitere positive Effekte der Polyphenole sind antivirale Wirkungen gegenüber

unterschiedlichen Virustypen (Vlietinck et al., 1998; Middleton et al., 2000). In vitro zeigte

Quercetin Wirksamkeit gegen Herpes simplex Virus Typ 1, Tollwut, Parainfluenza Virus Typ 3

und den RS-Virus (Respiratory Synctial Virus), dabei wurde eine Verminderung der Infektiosität

sowie der intrazellulären Replikation der Viren beobachtet. Möglicherweise beruht dieser Effekt

auf der Fähigkeit, virale Proteine zu binden oder auf der Fähigkeit der Beeinflussung der viralen

Nukleinsäuresynthese. Für Methylquercetin konnte eine Blockade der Replikation des Poliovirus

auf RNA-Ebene nachgewiesen werden (Formica & Regelson, 1995).

Des Weiteren weisen Polyphenole entzündungshemmende Effekte auf und sind in der Lage, eine

Änderung der Zusammensetzung und der Stoffwechselaktivität der Darmmikrobiota hervorzuru-

fen. Beispielsweise konnten Clavel und Mitarbeiter (2005) bei postmenopausalen Frauen eine

signifikante Änderung in den Verhältnissen wichtiger Bakterienklassen nach der Aufnahme von

Isoflavon aufweisen.

Neben den schon dargestellten Wirkungen existieren viele in vitro und in vivo Studien, in denen

weitere gesundheitliche Wirkungen der Polyphenole untersucht wurden, einige davon sind in

Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Wirkung der Polyphenole auf die menschliche Gesundheit

Untersuchte Wirkung Beispielhafte Literatur

Nachweis in Hu-

manstudien

(nach Boing et al.

2012)

Herz-Kreislauf-

Erkrankungen

Antioxidativ Pascual-Teresa et al. 2010

Gesichert Verhinderung Aggregation

Blutplättchen

Vita 2005

Blutdruckregulierung Manach et al. 2005a

Krebs

Antioxidativ Pool-Zobel et al. 2000

Wahrscheinlich

Genregulation He et al. 2008

Inhibation Proliferation Mertens-Talcott et al. 2003

Induzierung Apoplose von

Krebszellen

Mertens-Talcott et al. 2003

15

Neurodegenerative

Störungen

Antioxidativ Basti et al. 2012

Hinweise in Ein-

zelstudien Regulierung Genexpressi-

on

(z.B. Gluthation)

Vauzour 2012

Übergewicht

Inhibierung Lipase La Garza et al.2011 Hinweise in Ein-

zelstudien Hemmung anabolischer

Fettstoffwechsel Meydani et al. 2010

Diabetes

Inhibierung α-Amylase und

α-Glucosidase

Akkarachiyasit et al. 2010

Boath et al. 2012

nicht nachgew-

iesen

Inhibierung Glucosetrans-

porter Hanhineva et al. 2010

Erhöhung Insulinausschüt-

tung Hanhineva et al. 2010

Allerdings wurden die meisten Studien nur in vitro durchgeführt, in denen meist unrealistische

Konzentrationen eingesetzt oder unrelevante Substanzen betrachtet wurden. Ob die Polyphenole

auch in vivo ihre gesundheitsfördernden Effekte aufweisen können, hängt von deren Bioverfüg-

barkeit und dem Erreichen des Zielortes im Körper, z.B. dem Dickdarm, ab. Bei einigen Poly-

phenolen ist je nach Struktur nur eine geringe Verfügbarkeit bekannt, außerdem kommt es nach

der Aufnahme zu einer starken Modifizierung der Substanzen durch Konjugation, die physiolo-

gischen Bedingungen im Verdauungstrakt oder durch intensive Metabolisierung durch die vor-

herrschende Mikrobiota im Dickdarm. Es wird davon ausgegangen, dass die meisten der ernäh-

rungsphysiologischen Effekte nicht durch die aufgenommenen Polyphenole selbst sondern durch

deren Abbauprodukte oder durch konjugierte Polyphenole herbeigeführt werden (Hageböck,

2013; Pohl, 2005).

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2 Grundlagen der in vivo Verdauung

Im folgenden Kapitel erfolgt eine Darstellung über das Verdauungssystem des Menschen sowie

das der Schweine. Die Physiologie der Menschen und die der Schweine weist große Gemein-

samkeiten auf, daher ist beispielsweise eine Verpflanzung bearbeiteter Schweineherzklappen

beim Menschen durchführbar (Xenotransplantation). Ferner besteht die Möglichkeit, für die Si-

mulation der menschlichen Verdauung Enzyme wie Pepsin und Pancreatin von Schweinen ein-

zusetzen, da diese sowohl bei dem Verdauungsvorgang der Schweine als auch bei dem der Men-

schen gebildet werden. Die Schweine sind wie wir Menschen nicht in der Lage, Cellulose durch

Enzyme zu spalten, sondern sind ebenfalls auf die Verdauung der Ballaststoffe durch die Mikro-

organismen im Dickdarm angewiesen (Monogastrier).

2.1 Das Verdauungssystem des Menschen

Als Verdauungssystem wird das Gesamtsystem der mit der Aufnahme und der Verdauung der

Nahrung involvierten Organe des Menschen definiert. Funktionell lässt sich das Verdauungssys-

tem in einen Kopf- und einen Rumpfteil gliedern. Das Kopfteil wird dabei durch die Mundhöhle

mit ihren Speicheldrüsen sowie durch den mittleren und unteren Teil des Rachens dargestellt. Zu

dem Rumpfteil, welches auch als Gastrointestinaltrakt beziehungsweise als Magen-Darm-Trakt

bezeichnet wird, zählen Magen, Dünn- und Dickdarm sowie die angeschlossenen Drüsen Le-

ber/Gallenblase und Bauchspeicheldrüse. Ein Überblick über das gesamte Verdauungssystem

des Menschen gibt Abbildung 8.

Abbildung 8: Schematische Darstellung des menschlichen Verdauungssystems

17

Die Verdauung beginnt im Mund mit der mechanischen Zerkleinerung der Nahrung, durch die-

sen Vorgang wird die Angriffsfläche der Speise für die Verdauungsenzyme vergrößert. Des Wei-

teren wird die Nahrung mit dem gebildeten Sekret der Speicheldrüsen vermischt und so gleitfä-

hig gemacht. Durch die im Speichel enthaltene α-Amylase Ptyalin wird eine erste Hydrolyse der

glykosidischen Bindungen herbeigeführt, welche aufgrund der kurzen Transitzeit für die Ver-

dauung nur eine untergeordnete Bedeutung darstellt. Allerdings verringert sich schon mit einer

Spaltung von 0,1 % aller glykosidischen Bindungen in Stärke deren Molekülgröße um den Fak-

tor 100 (Rehner & Daniel, 2002). Über die Speiseröhre gelangt der mit Ptyalin gemischte Nah-

rungsbrei in den Magen. Hier kommt es zu einer chemischen und physikalischen Veränderung

und einer Desinfizierung (durch Magensäure) der Nahrung. Durch den sauren Magensaft erfolgt

eine Denaturiering der Proteine, was zu einer Verbesserung der Angreifbarkeit für die Enzyme

führt. Pepsin führt bereits hier im Magen zu einer Spaltung der Proteine. Das Pepsin wird in den

Hauptzellen des Magens zunächst in einer inaktiven Vorstufe -dem Pepsinogen- gebildet, damit

es nicht die zelleignen Proteine zersetzt. Die Aktivierung erfolgt erst im Lumen des Magens

durch den dort vorherrschenden niedrigen pH-Wert. Ein optimaler pH-Wert für die Aktivierung

liegt zwischen 1,8 und 3,2 (Jensen-Jarolim, 2006).

Anschließend wird der Chymus (Speisebrei) portionsweise zur weiteren Verdauung in den

Dünndarm abgegeben, wo diesem Pankreassekret und Galle zugeführt wird. Der Dünndarm wird

in drei Abschnitte untergliedert: Duodenum (Zwölffingerdarm), Jejunum (Leerdarm) und Ileum

(Krummdarm) und besitzt eine Gesamtlänge von ca. 3 m bis 5 m. Der Speisebrei wird durch

Bicarbonate, welche im Pankreassekret enthalten sind, neutralisiert. Des Weiterem befinden sich

in diesem Sekret Enzyme, welche Kohlenhydrate, Proteine und Lipide spalten können. Die Neut-

ralisation des Chymus ist für diese Enzyme eine wichtige Voraussetzung. Die im Dünndarm

vorhandene Pankreasamylase spaltet die kurzkettigen Saccharide. Diese Disaccharide werden

durch die in der Dündarmschleimhaut gebildeten und dort anhaftenden Disaccharidasen in Mo-

nosaccharide (Glukose, Fruktose) zerlegt. Durch diesen Vorgang wird die Kohlenhydratverdau-

ung beendet. Trypsin und Chymotrypsin, dessen Vorstufen beide aus Produkten des Pankreas

entstammen, bauen die noch relativ langkettigen Proteine weiter ab. Das an das Darmepithel

gebundene Darmenzym Entereopeptidase aktiviert Trypsinogen zu Trypsin und wandelt Chy-

motrypsinogen zu Chymotrypsin um. Die durch Trypsin und Chymotrypsin von den Enden der

Peptidketten abgeschnittenen Tri- und Dipeptide werden von Amino-, Carboxy- und Dipep-

tidasen (befinden sich in der Dünndarmschleimhaut) zu resorbierbaren freien Aminosäuren hyd-

rolysiert. Einige Di- und Tripeptide werden aber auch als gesamtes Molekül resorbiert (Beck,

2011). Die Fettverdauung beginnt bereits im Magen, dort erfolgt eine mechanische Emulgierung

18

der Fette zu Fetttröpfchen. Außerdem wird bereits ein geringer Teil der Fette durch die Magenli-

pase gespalten. Im Dünndarm wird der fetthaltige Speisebrei mit Gallensalzen, welche als Emul-

gatoren wirken, vermischt. Dadurch entsteht eine noch feinere Emulsion und die Fette können in

noch kleinere Bestandteile durch die Pankreaslipase aufgespalten werden, da die Oberfläche, an

der die Lipase angreifen kann, vergrößert wurde. Durch die Vermischung der Spaltprodukte und

der Gallensäure entstehen Mizellen, mittels diesen werden weitere Substanzen wie beispielswei-

se Cholesterin, fettlösliche Vitamine, Lipide, freie Fettsäuren und Glycerine resorbiert. Aufgrund

ihrer geringen Größe (20-50 nm) können die Mizellen leicht zwischen die Mikrovilli des Bürs-

tensaums und durch ihre Lipophilie anschließend über die Zellmembran in die Darmzellen über-

treten

Schleimhautfalten (Kerckringsche Falten), Zotten und Mikrovilli führen zu einer ca. 600-fachen

Oberfächenvergrößerung der Dünndarmschleimhaut. Die Kerckringschen Falten kommen im

Duodenum und Jejunum, wo sie aus Verwölbungen der Mukosa entstanden sind, am häufigsten

vor und sind mit einer Höhe von bis zu 8 mm dort am höchsten. Auf den Kerckringschen Falten

befinden sich die Zotten, welche ca. 1 mm hoch sind. Das Epithel der Zotten besteht vorwiegend

aus Enterocyten (Saumzellen). An der lumenständigen (apikalen) Seite der Enterocyten befinden

sich die Mikrovilli, welche sehr eng nebeneinander angeordnet sind. Zwischen den Zotten befin-

den sich die sogenannten Krypten, diese ragen unterschiedlich tief in das Schleimhautgewebe

hinein und enthalten hormonproduzierende Zellen, sowie Zellen, die der Immunabwehr dienen

(Mutschler et al., 2008; Rehner & Daniel, 2002).

Der Darminhalt wird anschließend über die Ileozökalklappe, welche sich am Ende des Dünn-

darms befindet, portionsweise in den Dickdarm abgegeben. Der Dickdarm wird in mehrere Ab-

schnitte eingeteilt: Caecum (Blinddarm) mit dem Appendix vermiformis (Wurmfortsatz), Kolon

(Grimmdarm) und Rektum (Enddarm). Auch der Grimmdarm wird nochmal in vier Abschnitte

untergliedert: aufsteigender (ascendens), querverlaufender (transversum), absteigender (descen-

dens) und S-förmiger (sigmoideum) Abschnitt. Die Gesamtlänge des Dickdarms beträgt zwi-

schen 1,5 m und 1,8 m (Deußer, 2010). Im Dickdarm erfolgt eine Konzentrierung des Speise-

breis, welcher in diesem Stadium als Fäzes bezeichnet wird, durch die Resorption von Wasser

und Elektrolyten. Ferner werden schwer verdauliche Nahrungsbestandteile, deren Verdauung

und Aufnahme im Dünndarm nicht stattgefunden hat, fermentiert (Tuohy et al., 2009).

Da der Dickdarm keine Zotten beziehungsweise Mikrovilli besitzt, ist die Oberfläche der

Schleimhaut des Dickdarms auch nicht sehr groß. Allerdings sind die Krypten zahlreich in der

Dickdarmmukosa vertreten, diese sind mit schleimbildenden Becherzellen ausgekleidet, um das

19

Epithel vor einer mechanischen Schädigung des Fäzes zu schützen. Des Weiteren dient ein Teil

dieser Zellen der Absoprtion (Hillgren et al., 1995; Silbernagl & Despopoulos, 2003).

Der Dickdarm ist dicht mit Bakterien besiedelt, etwa 109 bis 1012 Kolonie formende Einheiten

pro ml Darminhalt, dagegen sind es beim Dünndarm nur 103 bis 108 Kolonie formende Einheiten

pro ml Darminhalt (Blaut & Clavel, 2007). Es konnten etwa 300 bis 400 Spezies unterschieden

werden, wobei es sich bei 90 % der Bakterien um Anaerobier handelt.

2.2 Das Verdauungssystem des Schweins

Der Verdauungsvorgang der Schweine verläuft analog dem der Menschen. Wie auch beim Men-

schen wird die Verdauung in drei Abschnitte unterteilt: die mechanische Aufbereitung, die che-

mische und enzymatische Verdauung im Magen und Dünndarm und die mikrobielle Verdauung

von speziellen Kohlenhydraten wie Zellwandbestandteilen im Dickdarm.

Der Verdauungstrakt beim Schwein (Abbildung 9) setzt sich aus der Maulhöhle, der Speiseröhre,

dem einhöhligen Magen und Dünn- und Dickdarm zusammen. Dabei wird der Dünndarm in drei

Abschnitte untergliedert: Zwölffinger-, Leer- und Hüftdarm. Der Dickdarm setzt sich aus dem

Blind-, Grimm- und Mastdarm zusammen.

Abbildung 9: Schematische Darstellung des Verdauungstraktes der Schweine

Der Dünndarm der Schweine ist ca. 15 m bis 20 m lang, der Dickdarm dagegen nur 3 m bis 5 m.

Insgesamt beträgt die Darmlänge beim Schwein ca. das 14 fache der Körperlänge, somit ist der

Darmtrakt der Schweine wesentlich länger als der der Menschen, welcher im Durchschnitt ca. 7

m beträgt (Brade & Flachowsky, 2006).

20

2.3 Intestinale Transportmechanismen

Es sind vier verschiedene Varianten zur intestinalen Aufnahme der im Darm angekommenen

Stoffe möglich. Diese sind in Abbildung 10 schematisch dargestellt.

Abbildung 10: Möglichkeiten der intestinalen Absorption

Die passive Diffusion (a) ermöglicht die Aufnahme von hydrophoben Substanzen wie beispiels-

weise fettlöslichen Vitaminen. Durch ein Konzentrationsgefälle der Substanzen zwischen den

beiden Seiten der Membran kann die passive Diffusion erfolgen. Bei der zweiten Transportmög-

lichkeit handelt es sich um die transzelluläre Diffusion (b) durch Bindungsproteine, diese wird

auch als erleichterte Diffusion bezeichnet. Zwischen dem Transport-Carrier und der meistens

hydrophilen Substanz erfolgt die Bildung eines Komplexes, somit ist der Transport der Substanz

möglich. Die Carrier-Proteine werden in drei Arten unterteilt: die Uniporter transportieren nur

einen bestimmten Stoff (sie besitzen nur eine Bindungsstelle), die Symporter transportieren zeit-

gleich zwei gebundene Substanzen, die in dieselbe Richtung transportiert werden und der Ant i-

porter befördert ebenfalls zwei Stoffe, allerdings in entgegengesetzte Richtungen. Bei der dritten

Variante handelt es sich um den aktiven Transport (c). Dieser Transport läuft unter Energiever-

bauch und gegen ein Konzentrationsgefälle ab. Die vierte Möglichkeit ist die parazelluläre Dif-

fusion (d), welche durch die Tight junctions (Membranproteine, durch die Epithelzellen verbun-

den werden) reguliert wird. Mittels dieser Variante können wasserlösliche Substanzen transpor-

tiert werden (Deußer, 2010).

2.4 Bioverfügbarkeit der Polyphenole

Aufgrund ihres Vorkommens in vielen pflanzlichen Lebensmitteln werden Polyphenole täglich

über die Nahrung aufgenommen. Dabei machen die Phenolsäuren etwa ein Drittel und die

Flavonoide zwei Drittel der täglichen Aufnahme an Polyphenolen aus. Die am häufigsten in der

Nahrung vorkommenden Flavonoide sind Catechine, Proanthocyanidine sowie Anthocyane und

deren Oxidationsprodukte. Kaffeesäure, Ferulasäure und die Clorogensäure sind die häufigsten

Vertreter der in den Nahrungsmitteln vorkommenden Phenolsäuren (Scalbert & Williamson,

21

2000). Aufgrund des breiten Spektrums an sekundären Pflanzeninhaltsstoffen und der großen

Mengen an Kaffee, die weltweit verzehrt werden, stellt Kaffee eine der Hauptquellen an Poly-

phenolen aus der Nahrung dar (Clifford, 2000).

Als Voraussetzung für die gesundheitlichen Effekte in vivo ist neben der zugeführten Menge die

ausreichende Verfügbarkeit der Verbindungen im menschlichen Organismus von großer Bedeu-

tung. Die Bioverfügbarkeit wird in der modernen Ernährungsphysiologie als die Konzentration

und die Geschwindigkeit, mit der Lebensmittelinhaltsstoffe nach der Aufnahme mit der Nahrung

über den Gastrointestinaltrakt und nach der Resorption an ihren Wirkort gelangen, definiert (Gu-

geler & Klotz, 2000). Vor allem Eigenschaften wie Löslichkeit, Hydrophobizität und Mole-

külgröße aber auch die Struktur (Konjugationen, Glykosillierungen) bestimmen die Verfügbar-

keit einer Substanz. Ferner beeinflussen Faktoren wie das Alter, das Geschlecht, die Ernährungs-

bedingungen und die Wechselwirkungen mit Lebensmittelinhaltsstoffen bzw. bestimmten Arz-

neimitteln die Resorption (D’Archivio et al., 2010; Palafox-Carlos et al., 2011). Prinzipiell wer-

den vielen Polyphenolen und vor allem den Anthocyanen nur eine geringe Bioverfügbarkeit zu-

gesprochen (Shivashankara & Acharya, 2011). Im Blut und im Urin lässt sich so also nur eine

geringe Menge der an ursprünglich eingesetzten Anthocyanen wiederfinden (Stalmach et al.,

2012; McGhie & Walton, 2007). Allerdings muss beachtet werden, dass die Polyphenole im

Laufe der Verdauung einer Reihe von Modifizierungen, Wechselwirkungen und damit verbun-

denen eventuellen Änderungen der Eigenschaften unterzogen werden. Wie bei anderen Xenobio-

tika können alle Prozesse, denen die Polyphenole im Körper unterliegen, pharmakokinetisch

durch das ADME-Konzept (absorption, distribution, metabolism, excretion) beschrieben werden.

Die Verfügbarkeit der Verbindungen wird im Wesentlichen durch ihre Absorption, der Metabo-

lisierung sowie ihrer Elimination bestimmt (Kahle, 2008; Oehme, 2010).

2.4.1 Absorption

Zunächst gelangen die mit der Nahrung aufgenommenen Polyphenole in den Mund, in dem es

im Fall von Quercetinglykoside zu einer Hydrolyse der Zuckerreste kommen kann (Walle et al,

2005). Durch Wiese et al. (2009) konnte eine Wechselwirkung zwischen der im Speichel enthal-

tenen Amylase und Anthocyanen nachgewiesen werden, welcher aufgrund der kurzen Transitzeit

nur ein geringer Einfluss auf die Substanzen zugeordnet wurde.

Im Darm (Dünn- und Dickdarm) findet vorwiegend die Absorption der Polyphenole statt. Es ist

wahrscheinlich, dass das saure Milieu des Magens (pH-Wert 1,0-1,5) keinen Einfluss auf die

Flavonoid-Glykoside hat, da diese bei einem sauren pH-Wert (pH 1,0-3,0) am stabilsten sind und

so in der Natur am häufigsten vorkommen. Diese können so unverändert ins Duodenum gelan-

22

gen. Einige Aglyka wie beispielsweise Anthocyanidine können bereits im Magen resorbiert wer-

den, was in Versuchen mit Nagern gezeigt werden konnte (D’Archivio et al, 2007). Die Meisten

Aglyka werden im Dünndarm problemlos aufgenommen. Vermutlich erfolgt der Vorgang der

Absorption durch den Natrium-abhängigen Glucosetransporter SGLT1 und GLUT2 (aktiver

Transport), welche sowohl Flavonoid-Glykoside als auch deren Aglyka durch die apikale Memb-

ran der Zelle transportieren (Chen et al., 2007). Die so aufgenommenen Glykoside werden durch

sich in der Zelle befindende β-Glukosidasen gespalten (Day et al., 2000). Polyphenole, die als

Ester oder Polymere vorliegen, können somit nicht oder nur begrenzt aufgenommen werden und

müssen zunächst gespalten werden. Diese Aufspaltung erfolgt entweder durch die intestinale

Mikroflora des Darms oder durch Enzyme wie beispielsweise Laktase-Phloridzin-Hydrolase

(LPH).

Die Aufnahme von Hydroxyzimtsäuren kann über zwei verschiedene Mechanismen erfolgen,

zum einem die Aufnahme durch passive Diffusion der protonierten Säure im Magen oder durch

die Beteiligung aktiver Transporter im Dünndarm. Studien an Ileostomiepatienten zeigen, dass

veresterte Zimtsäuren, wie Chlorogensäure, wahrscheinlich zu einem Teil in Magen oder Darm

absorbiert werden (Olthof et al., 2001). Ein Großteil der Ester erreicht vermutlich unmetaboli-

siert den Dickdarm, in dem sie durch die intestinale Mikroflora gespalten und anschließend ab-

sorbiert werden (D’Archivio et al., 2007).

Sämtliche Polyphenole, die nicht im Dünndarm absorbiert wurden, gelangen in den Dickdarm,

wo sie nach Metabolisierungs- und weiteren Abbaureaktionen durch die Mikroflora aufgenom-

men werden können. Welcher Anteil der Polyphenole im Kolon ankommt, ist nicht genau be-

stimmt, allerdings wurden bei Ileostomiepatienten, die Polyphenole entweder als Reinstoffe oder

als Bestandteil der Nahrung aufgenommen haben, Werte zwischen 0 % bis 66 % ermittelt (Kahle

et al., 2005b; Olthof et al., 2001).

2.4.2 Verteilung

Polyphenole werden im Gegensatz zu Pharmaka nur in geringen Mengen aufgenommen. Phar-

maka sind in der Lage, eine Sättigung der am Fremdstoffmetabolismus beteiligten Enzyme zu

erreichen und kommen in unkonjugierter Form in Leber und Blut vor. Polyphenole werden da-

gegen zum größten Teil im Dünndarm metabolisiert und gelangen vorwiegend als Glucuronide

über die Pfortader in die Leber. Dort kommt es zu weiteren Metabolisierungsschritten, bevor sie

über die Galle (biliär) durch den enterohepatischen Kreislauf als Aglyka oder als methylier-

te/sulfatierte/glukuronidierte Konjugate wieder in das Kolon gelangen können (Scalbert & Willi-

23

amson, 2000). Wie in Abbildung 11 allerdings erkennbar ist, kann auch die Verteilung der Poly-

phenole über die Leber in den Blutkreislauf erfolgen.

Abbildung 11: Mögliche Verteilungswege von Polyphenolen im Menschen

2.4.3 Metabolismus

Vor der Resorption der phenolischen Substanzen aus dem Dünndarm in das Blut unterliegen

diese schon in den Enterozyten einer Reihe von metabolischen Phase 1- (Hydrolyse) und Phase

2-Reaktionen (Konjugation). In Abbildung 12 ist ein Schema zum möglichen Metabolismus im

Dünndarm dargestellt.

24

Abbildung 12: Vereinfachtes Schema zum Metabolismus in Dünndarm; CBG: cytosolische β-Glukosidase; COMT: Catechol-O-Methyltransferase; UGT: UDP-Glukuronyltransferase; SULT: Phenol-Sulfontransferase

2.4.3.1 Hydrolyse

Durch intestinale β-Glukosidasen werden Glykoside je nach Art des Zuckers und des Bin-

dungsortes hydrolysiert (Day et al., 2001). Im Menschen konnten zwei β-Glukosidasen nachge-

wiesen werden, die bei der Hydrolyse von Glykosiden von Bedeutung sind:

Laktase-Phloridzin-Hydrolase (LPH, EC 3.2.1.108) ist ein membrangebundenes Enzym im Bürs-

tensaum des Dünndarms. Es hydrolysiert hauptsächlich Laktose und Laktosylceramide aus der

Milch. Zusätzlich ist es in der Lage, durch eine zweite hydrophobe Domäne Phloridzin in Phlo-

retin und Glukose zu spalten. Quercetin-Glykoside sind Substrate für die LPH, wobei die Umset-

zung nicht an der Phloridzin- sondern an der Laktase-Hydrolase-Domäne erfolgt.

β-Glukosidase (CBG) ist ein zytosolisches Enzym, welches eine breite Substratspezifität auf-

weist und vor allem in Leber, Niere und Dünndarm von Säugern lokalisiert werden konnte. Es

wird mit der Detoxifizierung von Xenobiotika in Verbindung gebracht, um eine Bindungsstelle

von Konjugationsreaktionen zu schaffen und somit eine schnelle Ausscheidung zu ermöglichen.

β-Glukosidase spaltet Glykoside, wobei Quercetin-3-glukosid und Rutin keine Substrate für die-

ses Enzym sind (Nemeth et al., 2003).

25

2.4.3.2 Cytochrom-P450-abhängige Phase-1-Reaktionen

Die Metaboliserung von Flavonoiden erfolgt unter Beteiligung der Cytochrom-P450-

Oxidoreduktasen (CYPs), diese können Hydroxylierungen und Demethylierungen katalysieren.

Vor allem sind die beiden Isoenzyme CYP1A1 und CYP3A4 in dem Metabolismus von

Flavonoiden im Darm involviert. Das Substitutionsmuster der Flavonoide bestimmt im Wesent-

lichen den Grad und den Ort der Reaktionen: Bei Flavonoiden mit keiner oder nur einer Hydro-

xylgruppe am B-Ring findet eine Hydroxylierung statt, dagegen wurden bei der Anwesenheit

von zwei oder mehr Hydroxylgruppen keine Hydroxylierungen beobachtet. Demethylierungen

finden bei Substanzen mit einer 4‘-Methoxygruppe, wie beispielsweise Tamarixetin, statt. Aller-

dings aber nicht bei ihren 3’-O-methylierten Derivaten, wie Isorhamnetin (Breinholt et al., 2002;

Nielsen et al., 1998).

2.4.3.3 Konjugation

Nach ihrer Hydrolyse verbleiben die Polyphenole nicht lange in ihrer Aglycon-Form, sondern

werden schnell konjugiert.

Catechol-O-Methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.6) ist ein Enzym, welches im Dopamin-

Metabolismus involviert ist. Es unterliegt einem funktionellen genetischen Polymorphismus

(Vielgestaltigkeit) und kommt in verschiedenen Geweben vor. Des Weiteren ist sie verantwort-

lich für die Methylierung von Polyphenolen, wobei die Art des Polyphenols den Ort der Methyl-

ierung bestimmt. Durch CYP-450-Enzyme kann an 4‘-Position eine Demethylierung stattfinden,

allerdings nicht an 3‘-Position, da dies die bevorzugte Angriffsstelle der COMT ist (Scalbert &

Williamson, 2000).

UDP-Glukuronyltransferasen (UGT, EC 2.4.1.17) katalysieren mittels Glukuronsäure die Kon-

jugation der Polyphenole. Diese Enzyme sind im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Die

Glukuronidierung von Polyphenolen wird vor allem durch die im Darm, Leber und Niere vor-

kommende UGT 1A-Familie katalysiert. Die Aktivität der UGT wird durch Alkohol, Rauchen,

Drogen oder durch die Ernährung erhöht, was zu großen interindividuellen Unterschieden führt

(Scalbert & Williamson, 2000).

Sulfotransferasen (SULT, EC 2.8.2.1) sind zytosolische Enzyme, die weit verbreitet sind. Ver-

schiedene Isoformen sind bekannt, wobei SULT1A1 und SULT1A3 die für die Sulfatierung der

Polyphenole entscheidenden Isoenzyme sind. Durch Nahrung, Xenobiotika und Umwelteinflüsse

wird diese Enzymfamilie nicht induziert, einige werden hingegen durch die Polyphenole ge-

hemmt (Substrat-Inhibierung). Das Ausmaß der Sulfatierung und der Inhibierung ist von der

Struktur des C-Ringes der Flavonoide abhängig (Huang et al, 2009; Scalbert & Williamson,

26

2000). Die Sulfatierung der Hydroxyzimtsäuren verläuft bevorzugt an den aromatischen OH-

Gruppen, wie bei der Glukuronidierung (Kern et al., 2003).

Weitere Phase-2-Enzyme wie N-Acetyltransferase, Glutathion-S-Transferasen und Epoxidhydro-

lasen besitzen für den Polyphenol-Metabolismus eine untergeordnete Rolle (Bellion, 2009).

Durch die Konjugation wird die Wasserlöslichkeit der Polyphenole erhöht und leitet somit ihre

Ausscheidung über den Urin oder die Galle ein. Mit der Gallenflüssigkeit in den Darm sezernier-

te Polyphenolkonjugate können nach ihrer Hydrolyse erneut absorbiert (enterohepatischer Kreis-

lauf) und damit ihre Verweildauer im Körper verlängert werden (Manach et al., 2004).

2.4.4 Ausscheidung

Die Polyphenole werden sowohl renal als auch biliär ausgeschieden, dabei schwankt die Aus-

scheidungsrate zwischen 0,3 % und 19 % der an Polyphenolen aufgenommenen Menge. Zwi-

schen den einzelnen Stoffklassen, aber auch innerhalb einer Gruppe kommt es zu deutlichen

Substanzunterschieden: die Ausscheidung über den Urin für Chlorogensäure beträgt im Schnitt

0,3 %, für Kaffeesäure 11 %, für Quercetin-Glykoside 2,5 % und für (Epi)Catechin 19 %

(Manach et al., 2005). Des Weiteren befinden sich im Urin noch zahlreiche Metabolite der Aus-

gangssubstanzen. In Fäzes und vor allem in Fäzeswasser befinden sich die Polypheno-

le/Abbauprodukte, die im Darm nicht resorbiert werden konnten oder die durch den enterohepa-

tischen Kreislauf wieder in den Darm sezerniert wurden. Durch die Bestimmung dieser Substan-

zen ist eine Abschätzung der Polyphenol-Gehalte im Darmlumen möglich. Außerdem lassen sich

Schlüsse über die metabolische Aktivität von Darmbakterien und Leber ziehen (Jenner et al.,

2005).

2.4.5 Mikrobielle Umsetzung der Polyphenole

Durch die im Dickdarm vorhandenen Mikroorganismen kommt es zu einer Vielzahl von Meta-

bolisierungen. Vor allem die Phase-2-Konjugate wie die Glukuronide und die Glykoside werden

dabei hydrolisiert. Des Weiteren kommt es zur Reduktion der Doppelbindungen und zur der

Aufspaltung des C-Ringes (Winter et al., 1989; Schneider & Blaut, 2000; Das & Rosazza, 2006;

van Duynhoven et al., 2011). Bei einem Teil der Darmbakterien konnte eine enzymatische Ab-

spaltung der Zucker festgestellt werden, es wurden β-Glukosidase-Aktivitäten unter anderem bei

Enterococcus (Scalbert & Williamson, 2000), Bifidobakterien und Lactobacillen (Ávila et al.,

2009) festgestellt. Neben den β-Glukosidasen konnten bei einigen Bacteroides-Stämmen auch α-

Rhamnosidasen identifiziert werden (Bokkenheuser et al., 1987). Die Konzentration an Gluko-

27

sidasen ist höher als die der Rhamnosidasen im Darm, daher werden beispielsweise Anthocyan-

Rutinoside im Darm langsamer metabolisiert (Aura et al., 2005). Durch physiologische Bedin-

gungen, vor allem aber durch die Darmmikroorganismen werden die entstehenden Aglycone zu

kleineren phenolischen Substanzen degradiert, dabei kommt es zur stufenweisen Aufspaltung der

C-Ringstruktur. Zuerst wird eine Doppelbindung am C-Ring reduziert (z.B. C2-C3 bei Quercetin

und Naringenin), daraus erfolgt bei den meisten Flavonoiden die Entstehung eines Chalkon-

Intermediates. Anschließend wird durch die Chalkon-Isomerase das Dihydrochalcon gebildet

und die ursprüngliche Polyphenol-Ringstruktur durch Phloretin-Hydrolase zerlegt. Als Endpro-

dukte wurden Phloroglukinolaldehyd (aus dem A-Ring) und je nach Hydroxylierungsmuster des

Ausgangsphenols eine entsprechende phenolische Säure (aus dem B-Ring) ermittelt (Fleschhut

et al., 2006; Ávila et al., 2009). Diese Stoffwechselvorgänge der Ringöffnung verschiedener

Flavonoide konnten für einige Clostridien wie Clostridium orbiscendens und Eubacterien wie

Eubacterium ramulus nachvollzogen werden (Winter et al., 1989; Schneider & Blaut, 2000;

Braune et al., 2001; Schoefer et al., 2003; Herles et al., 2004; Schoefer et al., 2004). Den Groß-

teil der entstehenden phenolischen Säuren machen hydroxilierte Phenylessigsäuren oder Phenol-

propionsäuren aus (Moco et al., 2012). Letzen Endes werden die gebildeten Phenolsäuren absor-

biert oder weiter zu kurzkettigen Fettsäuren und Kohlendioxid abgebaut (Moco et al., 2012; van

Duynhoven et al., 2011).

Mittels Humanstudien konnte nachgewiesen werden, dass die entstehenden Metabolite und deren

Konzentration zwischen unterschiedlichen Probanden variabel sind, wobei ein direkter Zusam-

menhang zum Metabolismus der jeweiligen individuellen Mikrobiota aufgezeigt wurde (Gross et

al., 2010; van Duynhoven et al., 2011). Weiterhin zeigten in vitro Studien große Unterschiede in

der Aktivität der am Polyphenolabbau beteiligten Mikrobiota und den daraus resultierenden Me-

taboliten durch die unterschiedlichen vorherrschenden physiologischen Bedingungen im Dick-

darm (van Dorsten et al., 2012).

Die entstandenen Metabolite können andere ernährungsphysiologische Eigenschaften und Bioak-

tivitäten als die ursprünglichen Ausgangsprodukte aufweisen. Wahrscheinlich führt die Abspal-

tung der Zuckerreste von Polyphenolen zu einer Änderung des antioxidativen Potentials. Aller-

dings besitzen die Aglycone je nach angewandter Methode mal eine höhere antioxidative Wir-

kung (Kähkönen & Heinonen, 2003), auf der anderen Seite eine geringere antioxidative Wirkung

(Matsumoto et al., 2002). In einem in vitro eukaryontischen Zellkulturmodell konnte nachgewie-

sen werden, dass die bei der intestinalen Metabolisierung von Anthocyanen entstehenden Ab-

bauprodukte Gallussäure und Protocatechusäure über effektivere antikanzerogene Wirkungen als

das Anthocyan an sich verfügen (Forester & Waterhouse, 2010). Aufgrund dessen, dass die Po-

28

lyphenole einer intensiven Metabolisierung unterliegen, wird immer mehr davon ausgegangen,

dass viele der gebildeten Metabolite einen großen Anteil an den nachgewiesenen gesundheitsför-

dernden Effekte der Polyphenole haben (Kay et al., 2009; Forester & Waterhouse, 2009; Mona-

gas et al., 2010; Williamson et al., 2010; Stockley et al., 2012).

29

3 Grundlagen der in vitro Verdauung

3.1 In vitro Modelle

Der Begriff in vitro leitet sich von lateinisch „vitrum“ ab und bedeutet „im Glas“. Bei in vitro

Untersuchungen wird der Organismus und dessen Struktur nicht in seinem natürlichen Zusam-

menhang, sondern unter experimentellen Bedingungen untersucht. Der Begriff in vitro ist durch

die in vitro Fertilisation, die künstliche Befruchtung von Eizellen im Reagenzglas, bekannt ge-

worden. In vivo, leitet sich von lateinisch „vivum“ für „Leben“ ab, bedeutet dagegen, dass im

lebenden Organismus beziehungsweise unter natürlichen Bedingungen ein Vorgang stattfindet

(Bundesministerium für Bildung und Forschung, 2014).

Es gibt zahlreiche Modelle, welche sich allerdings stark in ihrer Komplexität und in ihren ver-

wendeten kontrollierten Parametern unterscheiden. Der Großteil der Modelle nutzt zur Simulati-

on der physiologischen und enzymatischen Bedingungen von Mund, Magen und Duodenum syn-

thetische Verdauungssäfte in statischen Modellen (van de Wiele et al., 2007). Anschließend,

teilweise auch unabhängig davon, werden verschiedene bakterielle Bedingungen im Darmbe-

reich von einigen Modellen simuliert.

Einfache in vitro Modelle basieren auf einer meist 24-stündigen Fermentation der Testsubstan-

zen mit einer Fäzessuspension, bestehend aus humanen Fäzesproben und einem Salzpuffer. Die-

se Fermentation wird unter anaeroben Bedingungen, bei einer Temperatur von 37 °C in einem

einzelnen Reaktionsgefäß (Batch) durchgeführt. Barry et al. publizierte 1995 als Erster diese

Methode, welche die am schnellsten durchführbare in vitro Fermentation darstellt und auch als

„one-Batch-Kultur“ beziehungsweise „one-Batch-in-vitro-Fermentation“ bezeichnet wird.

Durch diverse Zentrifugationsschritte im Anschluss an die Fermentation können die so erhalte-

nen Substrate z.B. auf ihre Zusammensetzung oder ihr toxisches/präventives Potential untersucht

werden (Beyer-Sehlmeier et al., 2003).

Durch andere Arbeitsgruppen wurden kontinuierlich mehrstufig aufgebaute Systeme entwickelt,

welche über einen Zeitraum von bis zu mehreren Wochen verwendet wurden. (Allison et al.,

1989). Macfarlane et al. entwickelten dieses Modell 1998 durch Variation der Bedingungen in

den einzelnen Reaktionsgefäßen weiter. So dient dieses Modell der Simulation von verschiede-

nen miteinander verbundenen Dickdarmbereichen. Durch die zusätzlichen Gefäße können pro-

ximale und distale Regionen des Kolons simuliert und dadurch von den Prozessen und Reaktio-

nen in diesen Bereichen eine getrennte Analyse ermöglicht werden. Dieses Fermentationssystem

wird kontinuierlich (in bestimmten zeitlichen Abständen) mit einem Nährmedium gespeist und

mittels Pumpen über die mit Fäzes angereicherten Gefäße weitergeleitet. Das Milieu der einzel-

nen Reaktionsgefäße wird an das des Darms durch die Abnahme des fermentierbaren Substrats

30

von Gefäß zu Gefäß und durch die Einstellung der entsprechenden physiologischen pH-Werte

(proximal: ca. 5,5; distal: 7,0) angepasst. Mittels dieser mehrstufigen in vitro Fermentation wer-

den Untersuchungen zum Wachstum und Aktivität (Bildung von Enzymen und Metaboliten)

bestimmter Mikroorganismen in den simulierten Bereiches des Dickdarms in Abhängigkeit von

den zu fermentierenden Testsubstanzen durchgeführt.

Von Molly et al. wurde 1993 ein weitaus komplexeres Modell entwickelt, welches den gesamten

Gastrointestinaltrakt (GIT) simuliert. In diesem Simulator of the Human Intestinal Microbial

Ecosystem (SHIME) werden durch fünf oder sechs aufeinanderfolgende Reaktionsgefäße die

einzelnen Orte der Verdauung repräsentiert. Eine Simulation des Magens erfolgt im ersten Ge-

fäß, die anschließende Verdauung im Dünndarm wird mittels einem oder zwei Gefäßen (Teilung

in Duodenum/Jejunum und Ileum) nachgestellt. Mit der Simulation des Dickdarms schließt sich

die eigentliche Fermentation, basierend auf der von Macfarlane et al. entwickelten Methode, in

den letzten drei Gefäßen an. Ein spezielles Nährmedium, welches Komponenten des Darmlu-

mens (z.B. Mineralien, Polysaccharide, Mucin) und mikrobiologisch stabilisierende Substanzen

auf Proteinbasis (z.B. Trypton, was für die Herstellung von Nährböden und –lösungen eingesetzt

wird) enthält, wird genutzt, um das System an die Bedingungen des GIT anzupassen, wobei die

Zusammensetzung dieser Nährsubstanz in verschiedenen Methoden variiert (De Boever et al.,

2000a; Macfarlane et al., 1998a; Kontula et al., 1998). Dieses kontinuierliche Fermentationsmo-

dell wird in einigen Fällen über mehrere Wochen betrieben, dabei werden Medium und Testsub-

stanz (zu Beginn nur das Medium, um die fäkale Flora zu stabilisieren) in bestimmten zeitlichen

Abständen verabreicht und vom ersten Reaktionsgefäß ausgehend über Pumpen weitergeleitet.

Dabei wird die Verweildauer der Substanz in den einzelnen Reaktionsgefäßen der der Verweil-

dauer der Nahrung in den einzelnen Verdauungsorganen angepasst. Zeitgleich mit der Füllung

des Duodenum-repräsentierenden Gefäßes wird ein aus Gallensäure und Pankreasenzymen be-

stehendes basisches Verdauungssekret („intestinales Extrakt“) appliziert, um den Verdauungs-

prozess des Dünndarms zu simulieren. Die Regelung des pH-Wertes, der Temperatur sowie der

Sauerstoffatmosphäre in den jeweiligen Reaktionsgefäßen wie auch die Gewährleistung einer

konstanten Durchmischung führt zur weiteren Anpassung an die Bedingungen des GIT (Decross

et al., 2006; Meddah et al., 2001; Van de Wiele et al., 2004 & 2007). Veränderungen der fäkalen

Mikroflora hinsichtlich ihrer Zusammensetzung (Wachstum bestimmter Mikroorganismen) und

Aktivität (Enzymaktivität, Produktion von Metaboliten) in Abhängigkeit von den Testsubstanzen

lassen sich mittels des SHIME-Modells ermitteln.

Mit der Entwicklung des TIM-Modells (TNO Intestinal Models) schuf das holländische Institut

für Angewandte Naturwissenschaftliche Forschung (TNO) ein weltweit einzigartig, technisch

31

ausgereiftes und repräsentierbares in vitro System, um die gastrointestinale Verdauung zu simu-

lieren (Minekus et al., 1995 & 1999). Zunächst wurde 1995 das TIM 1 Modell, in welchem die

Magen- und Dünndarmbedingungen dargestellt wurden, entwickelt. Anschließend erfolgte 1999

die Entwicklung des TIM 2 Modells, mittels dem die Simulation des Dickdarms erfolgt. Durch

die Kombination der beiden Modelle mit eukaryontischen Zellkulturen wurde die Voraussetzung

für eine realistischere Verfolgung der Bioverfügbarkeit geschaffen. Diese Simulation ist kom-

plett computergesteuert und erfolgt in einem röhrenförmigen System, welches die sich in einem

Nährmedium befindenden Testsubstanzen passieren. Die im Magen und Darm vorherrschenden

Bedingungen werden phasenweise durch die Einstellung des pH-Wertes, die Beimpfung mit

Mikroorganismen und die Zufuhr von Enzymen und Verdauungssekreten erzeugt. Durch einen

flexiblen Silikonschlauch, der von einem starren Glasmantel umgeben ist, durchlaufen die

Testsubstanzen das System. Zwischen dem Glasmantel und dem Silikonschlauch fließt Wasser,

welches eine Temperatur von 37 °C aufweist. Das Durchmischen und die Beförderung der Sub-

stanzen erfolgt durch die Darmperistaltik, in diesem Modell wird dies durch erzeugte hydrauli-

sche Druckveränderungen (durch Pumpen) nachgestellt. Diese Druckveränderungen ermöglichen

ein Zusammendrücken und Weiten des Silikonschlauchs (Weber, 2007). In Tabelle 2 sind die

vier beschriebenen Fermentationsmodelle inklusive ihrer Anwendungsbereiche tabellarisch dar-

gestellt.

Tabelle 2: in vitro Modelle und ihre Anwendungsbereiche in vitro Fermentationsmethoden Methodenanwendung mit Beispielen aus der Literatur

one-batch-in vitro Fermentation nach Barry et al. 1995

(Kolonsimulation in einzelnen Reaktionsgefäßen)

Chemisch, biologische Charakterisierung gewonnener Fermen-tationsüberstände Messung von Fermentationsprodukten & Metaboliten als

Maß der Fermentierbarkeit unverdaulicher Nahrungsbestand-teile [Barry et al., 1995; Beyer-Sehlmeier et al., 2003; Sayer et al., 2007]

Zellwachstumsuntersuchungen [Beyer-Sehlmeier et al., 2003]

Expressionsanalytik [Beyer-Sehlmeier et al., 2003] Modifikation genotoxischer Schadwirkungen [Beyer-Sehlmeier

et al., 2003] Veränderungen der Mikroorganismenzusammensetzung

[Manderson et al., 2005]

kontinuierliche Fermentationssys-teme nach Gibson & Macfarlane

1988 (Kolonsimulation in 2-3 aufeinan-derfolgenden Reaktionsgefäßen)

testsubstanzabhängige Veränderungen des Wachstums und der Aktivität faecaler Flora nach mehrtägigen Applikationsphasen Messung von Fermentationsprodukten & Metaboliten (z.B.

SCFA, Degradationsprodukte, bestimmte Gase) [Macfarlane et al., 1998a, 1998b & 2005]

Veränderungen der Mikroorganismenzusammensetzung [Macfarlane et al., 1998a, 1998b & 2005]

bakterielle Enzymaktivitätsassays [Macfarlane et al., 1998a, 1998b & 2005]

32

kontinuierliche Fermentationssys-teme nach Molly et al. 1993 –

SHIME-Modell (Simulation des gesamten GIT in 5-6 aufeinanderfolgenden Reakti-

onsgefäßen)

testsubstanzabhängige Veränderungen des Wachstums und der Aktivität faecaler Flora nach mehrtägigen Applikationsphasen Messung von Fermentationsprodukten & Metaboliten (z.B.

SCFA, Degradationsprodukte, bestimmte Gase) [De Boever et al., 2000a & 2000b; Decross et al., 2006; Meddah et al., 2001; Van de Wiele et al., 2004 & 2007]

Veränderungen der Mikroorganismenzusammensetzung [De Boever et al., 2000a; Kontula et al., 1998; Meddah et al., 2001; Van de Wiele et al., 2004 & 2007]

bakterielle Enzymaktivitätsassays [Van de Wiele et al., 2004]

TIM-Modell von TNO-Holland (Simulation des gesamten GIT in einem Röhrensystem möglich)

für die Analyse von Reaktionen & Effekten komplexer Le-bensmittel, einzelner Inhaltsstoffe (Schadstoffe oder protektive Stoffe) sowie bestimmter Pharmaka im GIT Messung von Fermentationsprodukten & Metaboliten (z.B.

SCFA, Degradationsprodukte, bestimmte Gase) [Krul et al., 2002]

Veränderungen der Mikroorganismenzusammensetzung [Krul et al., 2002; Masteau et al., 1997]

Resorption von Spaltprodukten und Metaboliten – Biover-fügbarkeit [Minekus et al., 1999; Salovaara et al., 2003; Verwei et al., 2003]

Bildung (anti-)genotoxischer oder (anti-)oxidativer Potentia-le [Krul et al., 2001]

3.2 Zellkulturmodelle der intestinalen Absorption und Metabolismus

Humane intestinale Zelllinien werden bei in vitro Studien eingesetzt, um bei der Untersuchung

der intestinalen Absorption und dem Metabolismus von Fremdstoffen die funktionale und mor-

phologische Organisation des intestinalen Epitheliums zu simulieren. Die am häufigsten verwen-

dete Zelllinie ist Caco-2-Kalonkarzinomzelllinie, welche eine adhärent wachsende (d.h. als Mo-

nolayer zu kultivierende Zelllinie) ist. Eine weitere oft verwendete Kolonkarzinomzelllinie ist

die Zelllinie T84, welche in Studien über die Untersuchung von funktionalen und molekularen

Eigenschaften von intestinalen Epithelien Anwendung findet (Sambruy et al., 2001).

Es existieren zwei verschiedene Versuchsaufbauten, die geeignet sind, um in vitro Untersuchun-

gen durchzuführen. Bei der ersten Methode wird ein statisches System verwendet, bei dem die

permeablen Filter (auf denen die Zellmonolayer angewachsen sind) auf einer Well-Platte befes-

tigt sind. Durch diesen Aufbau werden der apikale (oben) und der basale (unten) Bereich gebil-

det, wie in Abbildung 13 zu sehen ist. Die Wellplatten werden bei 37 °C inkubiert.

33

Abbildung 13: Darstellung des statischen Systems zur Untersuchung der transepithelialen Ad-sorption mittels Zellmonolayern

Bei dem zweiten Versuchsaufbau handelt es sich um die Ussing-Kammer, anhand der Versuche

zu Barrierefunktion und der Transport von Ionen und anderen Molekülen mit biologischen

Membranen oder Zelllayern durchgeführt werden können (Ussing & Zerahn, 1951). In Abbil-

dung 14 ist der schematische Aufbau der Ussing-Kammer dargestellt.

Abbildung 14: Aufbau der Ussing-Kammer

Die Teilung der Kammer in eine apikale (A) und in eine basale (B) Seite erfolgt durch das Ein-

spannen eines Zellmonolayers, welcher beispielsweise auf einem Gewebsstück gewachsen ist

(D). Anschließend werden die entstandenen Kammern mit einem Inkubationsmedium befüllt,

welches bei der Inkubation auf 37 °C temperiert wird. Es wird eine kontinuierliche Bewegung

des Inkubationsmediums durch die Begasung der beiden Kammern mit Carbongas (95 % O2, 5

% CO2) hervorgerufen (C). Durch Elektroden (E), welche gewebefern sind, werden in regelmä-

ßigen Zeitabständen Stromimpulse ΔI ausgelöst. Daraus resultieren Änderungen der Potentialdif-

ferenz ΔPD, jene werden von gewebenahen Elektroden (F) erfasst. Aus diesen Daten wird letz-

34

ten Endes der Widerstand des Gewebes (transepithelialer Widerstand, TER) erfasst mittels der

Formel TER=ΔPD/ΔI (Deußer, 2010).

3.3 Enzyme der Verdauung

Der in vivo Verdauungsvorgang wird von zahlreichen Faktoren bestimmt, auch die Ergebnisse

eines in vitro Versuchs werden von Faktoren wie der Enzymaktivität, der Eigenschaften der

Testsubstanz, der Aufbau der Moleküle oder auch der Zeit stark beeinflusst. Boisen und Eggum

veröffentlichen 1991 eine Studie, in der sie die Beziehungen zwischen eines in vitro Verdau-

ungsvorgangs und der Enzymaktivität festlegen. Darin beschrieben sie, dass die Charakteristik

eines Enzyms der wichtigste Faktor bei der Simulation der Verdauung ist. Die Enzymaktivität

wird unter anderem von der Temperatur, dem pH-Wert, der Stabilität des Enzyms, von den Akti-

vatoren und Inhibitoren sowie von der Inkubationszeit bestimmt. Die Auswahl der jeweiligen

Enzyme und der Bedingungen der Inkubation hängt dabei von dem jeweiligen Ziel einer Studie

ab. Soll in einer Studie die Verdaulichkeit eines einzelnen Stoffes dargestellt werden, so ist es

sinnvoll, nur ein Enzym in dieser Methode zu verwenden, wie beispielsweise Pepsin für Protei-

ne, Amylase für Stärke oder Lipasen für Fette (Boisen & Eggum, 1991). Coles et al. berichteten

2005 in ihrer Abhandlung, dass es von großem Vorteil sei, ein einzelnes gereinigtes Enzym als

ein komplexes Gemisch von mehreren Enzymen zu verwenden, da dadurch die Standardisierung

einer in vitro Methode erleichtert wird. Demzufolge ist so ein Vergleich von Labor zu Labor

möglich. Allerdings ist es realistischer, ein Gemisch von mehreren Enzymen als ein einzelnes

Enzym zu verwenden, da die Verdauung eines Stoffes oft mit der Verdauung eines anderen Stof-

fes verbunden ist (Boisen & Eggum, 1991).

In einigen in vitro Versuchen, wie von Almaas et al. (2006) und Chattertona et al. (2004) wurden

Enzyme benutzt, die von menschlichen Testpersonen stammen. Zangenberg et al. (2001) weist

jedoch darauf hin, dass man die menschliche Pankreaslipase und das Kofaktor Protein Co-Lipase

generell gegen die Pankreaslipase und die Co-Lipase des Schweins austauschen könnte. Diese

Behauptung führt allerdings dazu, dass weitere Forschungen betrieben werden müssen, um zu

ermitteln, welche Vor- und Nachteile die Nutzung von menschlichen Enzymen gegenüber den

tierischen Enzymen bietet und somit festzulegen, welche Enzyme sich besser für die in vitro

Verdauungsmodelle eignen.

Ein Großteil der entwickelten in vitro Modelle wurde für die Prognose von Verdaubarkeit und

physiologischen Veränderungen von Lebensmitteln entworfen. Es gestaltet sich jedoch als sehr

schwierig, eine Aussage über die Bioverfügbarkeit und die Digestion von Lebensmitteln zu

prognostizieren, da viele Faktoren sowie die Probenzusammensetzung einen Einfluss darauf

35

nehmen. Gewöhnlich basiert eine Simulation des Verdauungsvorganges auf den Abbau der Stär-

ke durch α-Amylase, die Spaltung von Fetten durch Lipasen und oder dem Abbau von Proteinen

durch Pepsin oder Trypsin (Tabelle 3). Der pH-Wert nimmt dabei eine wichtige Bedeutung an.

Für die Magenverdauung wird Pepsin bei einem pH-Wert von ca. 2,0 eingesetzt. Eine Erhöhung

des pH-Wertes würde nach Jensen-Jarolim zu einer Einschränkung der Zerlegung von Proteinen

führen. Der pH-Wert im Magen und im Darm wird im Wesentlichen durch den anfänglich vor-

herrschenden pH-Wert und durch die Menge der eingesetzten Probesubstanz bestimmt.

Um den Verdau von Substanzen zu simulieren, ist es von großer Bedeutung, die Eigenschaften

der eingesetzten Enzyme, wie Konzentration, Zusammensetzung und pH-Optimum auf die Ei-

genschaften der zu untersuchenden Probe abzustimmen (Hur et al., 2011).

Tabelle 3: Darstellung der Enzyme und Sekrete der Verdauung

Abschnitt des Ver-dauungssystems

Sekretorisches Organ

Enzyme und Sekrete Vorgang

Mund 3 Paar Speicheldrüsen

Speichel-α-Amylase Stärke → Maltose

Magen Magenwand Pepsin HCl-Säure Kathepsin Schleim Gastrin

Eiweiß → Polypeptide

Dünndarm Bauchspeicheldrüse Trypsin Erepsin Chymotrypsin Pankreas-α-Amylase Lipase Maltase NaHCO3 zur Neutrali-sation

Eiweiß → Polypeptide Polypeptide → Amino-säuren Eiweiß → Polypeptide Stärke → Maltose Fett → Glycerinsäuren Maltose → Glucose

Leber Gallensaft zur Emul-gierung von Fetten

Darmwand Maltase Lactase Erepsin Enterokinase aktiviert Trypsin

Maltose → Glucose Lactose → Glucose + Galactose Polypeptide → Ami-nosäuren

36

3.3.1 Lipasen

Lipasen spalten die Fette aus der Nahrung, damit der Körper sie aufnehmen kann. Lipasen kom-

men im Magen oder in der Bauchspeicheldrüse vor, wobei die Pankreaslipase die für die Fett-

verdauung wichtigste Lipase ist. Die Pankreaslipase wird in den Drüsenzellen der Bauchspei-

cheldrüse synthetisiert und gelangt anschließend in das Duodenum.

Die Aktivität der Pankreaslipase wird stark von dem Vorhandensein von Co-Lipasen, Gallensalz

und Calcium beeinflusst (Kimura et al., 1982; Zangenberg et al., 2001). Calcium-Ionen sind für

die Pankreaslipase von großer Bedeutung, da über diese eine Bindung des Substrates mit der

Lipase erfolgt (Carey et al., 1983). Fatouros & Mullertz (2008) beschreiben in ihrer Abhandlung,

dass freie Fettsäuren über Ionenbindungen an das Calcium gebunden werden. Durch diesen Vor-

gang kann eine Blockierung der Lipase durch die freien Fettsäuren verhindert werden. Wird Cal-

cium gleich zu Beginn der Lipolyse hinzugegeben, verläuft diese zunächst mit einer hohen An-

fangsgeschwindigkeit, welche im Verlauf jedoch sinkt und anschließend gleichbleibend verläuft.

Dies wird auf die Bindung des Calciums mit den freien Fettsäuren und einer eventuellen Ausfäl-

lung der Gallensalze durch Calcium zurückgehführt. Daher wird es empfohlen, das Calcium in

regelmäßigen Abständen während der Durchführung der in vitro Verdauung hinzuzufügen an-

statt gleich die gesamte Menge am Anfang des Prozesses.

Gallensalze und Phospholipide lagern sich an der Oberfläche der Lipidtröpfchen ab und verdrän-

gen so andere Stoffe, somit auch die Pankreaslipase. Die Co-Lipase bewirkt allerdings eine Ver-

ankerung der Pankreaslipase an der Oberfläche der Gallensalze und führt so letzten Endes zu

einer Bindung der Lipase an die emulgierten Fetttröpfchen.

Aufgrund der beschriebenen Wirkungen ist es wichtig, für die Simulation der Fettverdauung eine

jeweils geeignete Menge an Pankreaslipasen, Co-Lipasen, Gallensalzen, Calcium und Phos-

pholipiden einzusetzen (Hur et al., 2011).

3.3.2 Proteasen

Proteasen werden in der Magenwand (Pepsin) oder in der Bauchspeicheldrüse

(Trypsin/Chymotrypsin) gebildet. Im Magen beziehungsweise im Dünndarm sind sie für die

Spaltung von Peptiden zu kleineren Peptiden und Aminosäuren verantwortlich, dabei katalysie-

ren sie die Hydrolyse der Peptidbindungen. Abdel-Aal (2008) berichtet von einer beträchtlichen

Auswirkung auf die Verdauung der Proteine durch die Auswahl der proteinspaltenden Enzyme

sowie der Auswahl der bei der Simulation des Verdauungsvorganges herrschenden Bedingun-

gen. Im Rahmen dieser Studie konnte bei der Verwendung von drei Enzymen (Trypsin, Chy-

motrypsin und Peptidase) in einem Verdauungsschritt eine 39 - 66 % höhere Verdaubarkeit der

37

Proteine, abhängig von der Testsubstanz, als bei dem Einsatz von Pepsin und Pankreatin in zwei

Verdauungsschritten festgestellt werden. Abdel-Aal deutet an, dass durch die Verwendung der

Methode mit drei Enzymen eine exaktere Simulation der in vivo Verdauung möglich ist. Hur et

al. (2011) schlussfolgern daraus, dass vermutlich die Methoden, in denen ein komplexes Ge-

misch aus Enzymen (Magensaft, Speichelgemisch, Gallensaft) verwendet wird, eine bessere Re-

produzierbarkeit der Verdauung als die Methoden, in denen einzelne Enzyme verwendet werden,

aufweisen.

3.3.3 Amylase

α-Amylase wird in der Bauchspeicheldrüse (Pankreas-Amylase) oder in den Speicheldrüsen der

Mundhöhle (Speichel-Amylase) gebildet. Amylase spaltet die Glykosidbindungen der Polysac-

charide und baut diese dadurch zu Oligosaccharide und Monosaccharide ab. Sie wird vorwie-

gend für in vitro Modelle benutzt, in denen die Verdauung von pflanzlichen Materialien unter-

sucht wird. Beispielsweise verwendeten Koh et al. (2009), Zhang et al. (1998) und Evans &

Thompson (2004) in ihren Studien über die Verdauung der Stärke α-Amylase. Nunes et al.

(2004) dagegen setzten in ihrer Abhandlung, in der es um die Verdauung von Hirse ging, Pepsin

ein. Je nach dem in einer Studie zu untersuchendem Substrat ist es notwendig, eine geeignete

Mischung und Konzentration aus Enzymen zu verwenden.

3.4 Einfluss der Probenbestandteile auf die in vitro Verdauung

Der Verlauf einer in vitro Verdauung wird wesentlich durch die Eigenschaften der Probe, den

eingesetzten Enzymen sowie der Enzymkonzentration bestimmt. In seiner Abhandlung aus dem

Jahr 2008 beschreibt Abdel-Aal, dass die Unterschiede der Verdaubarkeit durch den Einsatz von

proteolytischen Enzymen, den Bedingungen der in vitro Verdauung sowie von der Herkunft der

Proteine (Original oder synthetisch hergestellt) hervorgehen. Die Erhöhung der Zufuhr von Pro-

teinen führt zu einer Erhöhung der Sekretion von proteinspaltenden Enzymen im Pankreas, ent-

sprechend führt eine erhöhte Zufuhr von Stärke oder Lipide zu einem Anstieg der Bildung von

Amylasen beziehungsweise Lipasen (Boisen & Eggum, 1991). Somit wird die Auswahl der

Menge und Zusammensetzung der Enzyme sowie der Versuchszeit je nach den Bestandteilen der

zu untersuchenden Probe ausgewählt. Enthält die Testsubstanz also einen erhöhten Anteil an

Kohlenhydraten, Proteinen oder Lipiden, so muss dementsprechend die Zufuhr der Enzyme oder

die Zeit der Versuchsdurchführung erhöht werden. Dennoch berichteten Green et al. (2007), dass

ein Gemisch aus mehreren Verdauungsenzymen zu keiner bedeutsamen Veränderung der Menge

aus Grünem Tee gewonnenen Catechine während einer Simulation der Verdauung führte. Die in

38

ihrem Versuch ermittelte Menge an Catechinen ist ähnlich der eines anderen Versuches, in dem

keine Verdauungsenzyme verwendet wurden (Record & Lane, 2001). Diese Tatsache lässt sich

damit erklären, dass Menschen nicht in der Lage sind, pflanzliche Nahrungsmittel (Ballaststoffe)

zu verdauen. Somit hat das Vorhanden- oder Nichtvorhandensein der Verdauungsenzyme nur

eine sehr geringe Auswirkung auf den Abbau von Catechinen (Hur et al., 2011).

3.5 Der Verdauungszeitraum

Ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung eines in vitro Verdauungsmodells ist die Festlegung

der Dauer des jeweiligen Verdauungsschrittes (Mund, Magen, Dünndarm). Die Verdauungszeit

von Lebensmitteln hängt im menschlichen Organismus von dem Alter, dem Geschlecht, dem

Gesundheitsstatus, der Tageszeit sowie von den Eigenschaften des Nahrungsmittels (Zusammen-

setzung, Menge) ab (McClements et al., 2009). Eine geringe Zeitspanne während der Dünn-

darmverdauung könnte zu einer Verminderung der Absorption bioaktiver lipophiler Komponen-

ten und so zu einer Verringerung ihrer Bioverfügbarkeit führen (Dahan & Hoffman, 2008). Van

Citers & Lin (1999) beschrieben in ihrer Studie, dass die Anwesenheit von Lipiden im Gastroin-

testinaltrakt zu einer Verzögerung der Leerung des Darmes führt und somit ein Ansteigen der

Verdauungszeit herbeigeführt wird. Daher sollte bei einem in vitro Versuch, in dem das Testsub-

strat einen hohen Fettgehalt aufweist, der Gehalt an Enzymen (Lipase, Pankreatin), Gallensalzen

und Phospholipiden sowie die Versuchszeit erhöht werden. Bei in vitro Modellen wird die Ver-

dauung im Dickdarm meistens nicht simuliert, da die Absorption der Komponenten vor allem im

Dünndarm stattfindet. Daher schildern Brandon et al. (2006), dass die Bioverfügbarkeit, welche

durch den Speisebrei des Dünndarms bestimmt wird, für die Gefahrenanalyse von wesentlicher

Bedeutung ist.

39

4 Modelle zur Verdauung und Stabilität von Polyphenolen

In den letzten Jahren wurden zahlreiche in vitro Studien, in denen die Verdaubarkeit von Nah-

rungsmitteln untersucht wurden, entwickelt. Hur et al. (2011) berichten, dass es sich bei den da-

bei untersuchten Proben meist um pflanzliche Nahrungsmittel wie Tee, Reis, oder Brot handelt

(45 %). Mit 18 % handelt es sich bei den am zweithäufigsten untersuchten Substanzen um

Fleisch. Proben auf Milchbasis, aus Fisch oder Emulsionen werden mit einer Häufigkeit von 9 %

in Verdauungsmodellen untersucht. Je nach zu untersuchendem Substrat und dem Ziel einer Stu-

die müssen somit entsprechende Vorgehensweisen entwickelt und Parameter angepasst werden.

In Tabelle 4 sind einige der Studien zusammengefasst, in denen Polyphenole untersucht wurden.

Die Inkubation bei allen Studien erfolgte bei einer Temperatur von 37 °C, entsprechend der

menschlichen Körpertemperatur. Bei den Durchführungszeiten der beiden Verdauungsschritte,

der Magen- und Dünndarmverdauung, und den dabei eingesetzten Chemikalien traten bei den

meisten der dargestellten Modelle keine wesentlichen Unterschiede auf.

Tabelle 4: Studien zur Untersuchung von Polyphenolen

Untersuchte Sub-

stanz/Methode

Gemessene Parameter Enzyme und

Chemikalien

Durchführungszeit

Polyphenolgehalt in Früchten (Tarko et al., 2009)

Antioxidative Kapazität Phenolgehalt Polyphenolprofil

Pepsin HCl Pankreatin NaHCO3

2 h 4 h

Polyphenolgehalt in Orangensaft, Erdbeeren und Erdbeermarmelade (Gil-Izquierdo et al., 2003)

Polyphenolprofil Pepsin HCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2 h 2,5 h

Stabilität der Polyphenole in der Vogelbeere (Aro-nia meta nocarpa) (Bermúdez-Soto et al., 2007)

Polyphenolprofil Stabilität der Poly-phenole

Pepsin HCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2 h 2 h

Stabilität der Catechine im Grünen Tee (Green et al., 2007)

Flavanolprofil Flavanolgehalte Flavanolstabilität

Pepsin HCL Lipase Pankreatin Gallensalz NaHCO3 NaOH

1 h 2 h

40

Polyphenole in der Süß-kirsche (Prunus avium L.) (Fazzari et al., 2008)

Polyphenolprofil Polyphenolgehalt

Pepsin HCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2 h 2 h

Reduzierung der antioxi-dativen Kapazität in Rot-wein (Argyri et al., 2006)

Polyphenolgehalt Eisengehalt Antioxidative Kapazität

Pepsin HCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2 h 2 h

Bioverfügbarkeit und antioxidative Kapazität der Polyphenole aus der Weintraube (Tagliazucchi et al., 2010)

Polyphenolstabilität Antioxidative Kapazität

Pepsin HCl NaCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2 h 2 h

Stabilität der Antocyane aus dem Rotkohl (McDougall et al., 2007)

Polyphenolprofil Polyphenolstabilität

Pepsin HCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2 h 2 h

Gehalt an Polyphenolen, Antocyanen und Vitamin C in Granatapfelsaft (Pérez-Vicente et al., 2002)

Polyphenolprofil Pepsin HCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2 h 2,5 h

Bioverfügbarkeit der An-tocyane aus der Himbeere (McDougall et al., 2005)

Polyphenolgehalt Polyphenolstabilität

Pepsin HCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2 h 2 h

Verdaubarkeit und Bioverfügbarkeit der Po-lyphenole aus der Kakao-bohne (Ortega et al., 2009)

Polyphenolgehalt Polyphenolstabilität

α-Amylase NaCl CaCl2 Pepsin HCl Pankreatin Gallensalz NaHCO3

5 min 2 h 2 h

Polyphenole, Glucosi-nolate und Vitamin C im Broccoli

Polyphenolstabilität Glucosinolatstabilität Vitamin C-Stabilität

Pepsin HCl

2 h

41

(Vallejo et al., 2004) Pankreatin Gallensalz NaHCO3

2,5 h

Die von Pérez-Vicente et al., McDougall et al. (2005/2007), Argyri et al. und Gil-Izquierdo et al.

durchgeführten Verdauungsmodelle beruhen auf dem von Miller et al. (1981) entwickelten in

vitro Modell zur Untersuchung der Verfügbarkeit von Eisen in der Nahrung. Fazzari et al., Or-

tega et al., Vallejo et al. und Bermúdez-Soto et al. verwendeten dagegen die Methode von Gil-

Izquierdo als Basis ihrer Untersuchungen wobei das Modell von Tagliazucchi et al. wiederum

auf dem von Bermúdez-Soto et al. aufbaut. Diese zehn in vitro Verdauungsmodelle basieren

demzufolge alle auf dem von Miller et al. entwickelten Verfahren, wobei sie teilweise etwas mo-

difiziert wurden. Die Studie von Ortega et al., in der die Verdaubarkeit und die Bioverfügbarkeit

der Polyphenole aus der Kakaobohne untersucht wurden, ist hierbei hervorzuheben, da ein zu-

sätzlicher Verdauungsschritt, die Mundhöhlenverdauung, hinzugefügt wurde. Dieser Schritt wird

bei den meisten Modellen nicht simuliert, da die Transitzeit der Nahrung im Mund nur sehr ge-

ring ist und die α-Amylase keine großen Veränderungen auf die Struktur der Probe ausübt. Die

Versuchszeiten der Magen- und Dünndarmverdauung unterlagen in all diesen Studien keiner

großen Veränderung, da die Simulation die Magenverdauung bei allen Versuchen innerhalb von

2 h durchgeführt wurde und die Durchführungszeit der Dünndarmverdauung bei einigen Metho-

den um 30 min von 2 h auf 2,5 h erhöht wurde.

Einzig zwei Modelle unterscheiden sich von den anderen hinsichtlich der Zeiten. Tarko et al.

haben als Grundlage ihrer in vitro Verdauung die von Żyƚa et al. (1995) entwickelte Vorgehens-

weise verwendet, der Zeitraum der Dünndarmverdauung war bei dieser Methode mit 4 h doppelt

so hoch wie bei den anderen Verdauungsmodellen. Eine Halbierung der Versuchszeit der Ma-

genverdauung von 2 h auf 1 h fand dagegen bei der Publikation von Green et al. statt, welche

sich mit geringen Veränderungen auf Ferruzzi et al. (2001) beziehen.

Salzsäure und Natriumhydrogencarbonat wurden in allen Studien zur Simulation des pH-Wertes

im Magen (pH = ca. 2,0) und im Dünndarm (pH = ca. 7,0) genutzt. Um ein saures Milieu wie das

des Magens zu erschaffen, wurde nach der Anreicherung der jeweiligen zu untersuchenden Pro-

be mit Pepsin Salzsäure hinzugefügt. Nach der Inkubation bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad

erfolgte eine Neutralisation mittels Natriumhydrogencarbonat und der sich anschließenden Zu-

gabe von Pankreatin und Gallensalz.

Je nach Ziel einer Studie wurden im Anschluss verschiedene Messungen und Versuche wie die

HPLC/UPLC zur Identifizierung und Quantifizierung von phenolischen Verbindungen oder die

UV/VIS-Spektroskopie durchgeführt.

42

5 Diskussion

Es gibt zahlreiche Autoren, die sich mit der Simulation des Verdauungsprozesses beschäftigt

haben, insbesondere auch mit der Verdauung und der Stabilität von Polyphenolen. Aufgrund

ihrer gesundheitsfördernden Effekte wie die Prävention von Krebserkrankungen, kardiovaskulä-

ren und diversen chronischen Erkrankungen ist das Interesse an der Erforschung der Polyphenole

in den letzten Jahren stark gestiegen. Trotz der vielen Experimente, in welchen die Polyphenole

untersucht wurden, besteht noch Bedarf an weiteren Untersuchungen, beispielsweise zu den

Wechselwirkungen und den während des Verdauungsprozesses gebildeten Metaboliten der Poly-

phenole.

Mittels in vitro Modellen ist eine Nachstellung der natürlichen Bedingungen mit wenig finanziel-

lem, materiellem und versuchstechnischen Aufwand möglich, außerdem sind sie im Gegensatz

zu Humanstudien und Tierversuchen ethnisch völlig unbedenklich. Ferner stellt es sich als

schwierig dar, polyphenolreiche Inhaltsstoffe mittels in vivo Modellen zu untersuchen, da die

einzelnen Zusammenhänge während der Verdauung sehr komplex sind, besonders eventuelle

Einwirkungen einer individuellen Ernährung und Lebensweise auf die mikrobielle Zusammen-

setzung des Darms. Allerdings ist es sehr schwierig, die natürlichen Bedingungen in einem Mo-

dell nachzustellen. Es gibt zahlreiche Parameter, die dabei beachtet werden müssen, weiterhin

kommt es im Körper zu Wechselwirkungen, welche in vitro noch nicht nachgestellt werden kön-

nen. Die in den Modellen ermittelten Ergebnisse sind oft nicht mit denen von in vivo Studien zu

vergleichen, da oft höhere, unrealistische Konzentration an Polyphenolen und Aglykone, in der

Natur kommen Polyphenole häufig nicht frei, sondern gebunden (Glykoside) vor, eingesetzt

werden.

In dieser Arbeit wurden zwölf Studien dargestellt, in denen die Verdauung und Stabilität der

Polyphenole untersucht wurden. Davon beruhten zehn auf dem von Miller et al. (1981) entwi-

ckelten Modell, während zwei Abhandlungen sich auf andere Quellen stützten und sich somit

hinsichtlich der Durchführungszeit von den anderen unterschieden. In allen Studien wurde die

mikrobielle Umsetzung im Dickdarm nicht betrachtet und nur bei einem Versuch wurde eine

Simulation der Mundhöhlenverdauung durchgeführt.

Ortega et al. (2009) untersuchten den Einfluss von Fetten auf die Verdauung und Verfügbarkeit

von Polyphenolen aus der Kakaopflanze (Flavone, Phenolsäuren und Procyanidine), da dem Ka-

kao, besonders der schwarzen Schokolade, gesundheitsfördernde Effekte zugeschrieben werden.

Im Rahmen dieses Projektes wurden zwei Proben untersucht: ein Flüssigextrakt mit einem Fett-

gehalt von ca. 50 % und ein Kakaopulver mit einem Fettgehalt von ca. 15 %. In dem Experiment

wurden die Mundhöhlen-, Magen- und Dickdarmverdauung simuliert, allerdings wurden der

43

Phenolgehalt, die Verdaulichkeit und die Verfügbarkeit nur im Ausgangsmaterial, nach der Ma-

gen- und nach der Dünndarmverdauung bestimmt. Direkt nach der Mundhöhlenverdauung wur-

den keine weiteren Untersuchungen durchgeführt, danach erfolgte die Simulation der Magenver-

dauung.

Es wurde ermittelt, dass der Gehalt an Procyanidinen im Flüssigextrakt nach der Dünndarmver-

dauung 1,8 mal höher als der nach der Magenverdauung war. Dieses Ergebnis konnte bei dem

Kakaopulver nicht eindeutig ermittelt werden. Daher gingen Ortega et al. davon aus, dass die

bessere Stabilität der Procyanidine in der flüssigen Probe sich auf den höheren Fettgehalt zurück-

führen lässt. Die bei der Fettverdauung entstehenden Mizellen sollen eine protektive Wirkung

auf die Procyanidine während der enzymatischen Verdauung ausüben. Der Gehalt an Epicate-

chinen im Flüssigextrakt war nach den Verdauungsvorgängen wesentlich höher als jener bei dem

Trockenextrakt, deshalb vermuten Ortega et al., dass einige Epicatechine in die Fettphase der

Emulsion aufgenommen und so geschützt werden konnten. Bei der Betrachtung der Ergebnisse

dieser Studie scheint es, dass ein höherer Fettgehalt während des Verdauungsvorganges und so-

mit die individuelle Lebensmittelmatrix die Bildung der Fetttröpfchen fördert und somit die Stof-

fe in die Fettphase aufgenommen werden können. Dieser Effekt konnte allerdings nicht bei der

Betrachtung des Gehalts an Phenolsäuren beobachtet werden. Nach der Magen- und Dünndarm-

verdauung konnte ein Ansteigen der Hydroxybenzoesäure, Vanillinsäure und der Chlorogensäu-

re bei beiden Proben beobachtet werden. Ferner konnte ein Verlust der Menge an Ferulasäure

ermittelt werden. In beiden Proben konnte nach der Magenverdauung ein Ansteigen der Flavo-

naglykone nachgewiesen werden, was durch den Abbau der Glykoside zu Aglykonen erklärbar

ist. Bei der flüssigen Kakaoprobe konnte nach der Dünndarmverdauung ein Anstieg des Flavon-

gehaltes und somit der Aglykone und der Glykoside festgestellt werden, allerdings wurde bei

dem Kakaopulver keine Veränderung ermittelt. So könnte ein höherer Fettgehalt auch bei den

Flavonen zu einer protektiven Wirkung geführt haben.

Bei allen Stoffen konnte nach der Simulation der Magen- und Dünndarmverdauung ein Anstieg

der Verdaubarkeit identifiziert werden. Die größte Verdaulichkeit nach dem gesamten Verdau-

ungsprozess wurde bei den Phenolsäuren, gefolgt von den Flavonen festgestellt. Die Procyanidi-

ne wiesen die geringste Verdaulichkeit auf. Nach der Simulation der Magenverdauung wurde bei

den Phenolsäuren sowie bei den Procyanidinen eine deutliche Erhöhung der Verdaulichkeit er-

mittelt, während bei den Flavonglykosiden keine deutliche Veränderung beobachtet werden

konnte. Dass bei den Stoffen im Flüssigextrakt nach den Verdauungsvorgängen eine höhere

Verdaulichkeit beobachtet werden konnte als bei dem Pulver, lässt wieder auf eine protektive

Wirkung der Lipide hindeuten. Im Gegensatz zur Verdaulichkeit wurde die Bioverfügbarkeit der

44

Stoffe nicht von dem Fettgehalt der Proben beeinflusst. Die Phenolsäuren besaßen die höchste

Löslichkeit in der Wasserphase, gefolgt von den Procyanidinen. Die Flavone weisen eine sehr

niedrige Löslichkeit auf, was eventuell mit dem Zuckerrest in ihrer Struktur zusammen hängen

könnte.

Die zweite Studie, die sich von den anderen unterscheidet, wurde von Tarko et al. (2009) durch-

geführt. Das Ziel dieser Studie war es, die phenolischen Bestandteile von ausgewählten Früchten

sowie deren antioxidative Eigenschaften vor und nach der in vitro Verdauung zu ermitteln. In

diesem Modell wurde im Gegensatz zu den anderen kein Gallensalz eingesetzt, da der Lipidan-

teil in Früchten nur sehr gering ist und somit das Hinzufügen keinen wichtigen Beitrag zum Ex-

periment geleistet hätte.

Der Gehalt an Polyphenolen war bei allen Früchten, außer der Melone, nach dem Verdauungs-

vorgang gesunken, wobei die Magenverdauung (Stabilität der Polyphenole im sauren Milieu)

geringere Auswirkungen als die Dünndarmverdauung auf die Polyphenole hatte. Mit 16.031 mg

Catechin pro 100 g Substanz war der Polyphenolgehalt in der Vogelbeere deutlich höher als bei

den anderen Früchten. Von den drei untersuchten Apfelsorten wiesen Malinowka und Golden

Delicious die beiden höchsten Mengen an Polyphenolen auf. Die Pflaumen, Birnen und Bananen

besaßen einen geringeren Polyphenolgehalt als die anderen untersuchten Früchte, nach dem Ver-

dauungsprozess enthielten sie allerdings mehr Polyphenole als Golden Delicious und Šampion,

was sich mit den zahlreichen Modifikationen der Polyphenole während der Verdauung erklären

lässt. Die Werte der antioxidativen Kapazität der frischen Früchte waren sehr unterschiedlich.

Mit 13.587 mg Trolox pro 100 g Substanz (Trolox dient als Referenz) zeichnete sich die Apfel-

beere deutlich von den anderen Früchten ab. Allerdings sank ihr antioxidatives Potential auffal-

lend nach dem Verdauungsvorgang, ebenso bei den Birnen und Bananen, während bei den Me-

lonen keinerlei Einfluss auf die antioxidativen Eigenschaften erkennbar war. Im Gegensatz dazu

war bei den Äpfeln und den Pflaumen eine eindeutige Erhöhung zu verzeichnen. Dieses Ergeb-

nis unterstützt damit die bereits erwähnte These, dass nicht nur die Polyphenole selbst sondern

vor allem auch deren Stoffwechselprodukte die gesundheitsfördernden Wirkungen besitzen. Des

Weiteren konnte in dieser Studie ermittelt werden, dass die Polyphenole, vor allem Quercetin-

und Cyanidinglykoside, während der Verdauung hydrolysiert werden. Cyanidine, Procyanidine

und Phenolsäuren wiesen eine geringe Verfügbarkeit für die Absorption nach der Verdauung auf,

dagegen war die Verfügbarkeit der Catechine und Quercetine im Dünndarm mit über 80 % recht

hoch. Tagliazucchi et al. (2010) beschrieben ebenfalls in ihrer Publikation über die Verfügbar-

keit und dem antioxidativen Potential von Trauben, dass die Phenolsäuren und Resveratrol wäh-

rend der Dünndarmverdauung abgebaut wurden, während die Catechine und Quercetin dagegen

45

stabil waren. Die Verdauung im Magen führte bei dem Gesamtpolyphenol-, dem Flavonoid- und

dem Anthocyangehalt zu einem geringen Anstieg. McDougall et al. (2005), Bermúdez-Soto et al.

(2007) und Vallejo et al. (2004) berichteten ebenfalls von den geringen Auswirkungen der Ma-

genverdauung auf die Stabilität der Polyphenole. Die Überführung der Polyphenole von dem

sauren in den neutralen Bereich führte zu einer Verringerung des gesamten Gehalts an Poly-

phenolen. Während der Dünndarmverdauung stieg die Menge der Polyphenole allgemein an so-

wie die der Flavonide, bei den Anthocyanen war allerdings ein weiterer Verlust zu verzeichnen.

Dieser Verlust wurde auch in den Abhandlungen von Bermúdez-Soto et al. (2007), McDougall et

al. (2005) und Pérez-Vicente et al. (2002) beschrieben. Bei einem sauren pH-Wert liegen Ant-

hocyane als das rotgefärbte Flavyliumkation vor, bei einer Erhöhung des pH-Wertes auf 7,0 bis

8,0 geht das Flavyliumkation in das gelbe Chalkon über. Die Tatsache, dass der Gesamtgehalt

der Flavonoide nach der Dünndarmverdauung anstieg und der Anthocyangehalt abnahm, bestä-

tigt die Vermutung, dass die Flavonoide allgemein im Gegensatz zu den Anthocyanen im neutra-

len beziehungsweise leicht basischen Bereich stabil sind. Diese Überlegung entstand bei der Be-

trachtung der Ergebnisse von Studien, in denen nur ein geringer Abbau von reinen Catechinen

(Flavanol) und Quercetin (Flavonol) während der Dünndarmverdauung ermittelt wurde. Ber-

múdez-Soto et al. (2007) stellten dagegen in ihrer Publikation über die Stabilität der Polyphenole

in der Apfelbeere einen Verlust von 58 % der Catechine nach dem Verdauungsvorgang fest. Eine

Abnahme des Catechingehaltes stellten ebenfalls Green et al. (2007) in ihrer Abhandlung über

Catechine im Grünen Tee fest, allerdings war dort ein Verlust von ca. 80 % der Catechine zu

verzeichnen. Diese großen Unterschiede könnten durch die Wechselwirkungen der Verdauungs-

enzyme mit den Catechinen mit einer daraus resultierenden „Tarnung“ erklärt werden. Somit

wären die Catechine mittels der HPLC nicht feststellbar. Allerdings berichten Green et al., dass

in einem vereinfachten Verdauungsmodell ohne dem Einsatz von Verdauungsenzymen ein ähn-

lich großer Verlust festgestellt wurde. Sie haben vermutet, dass der neutrale bis leicht basische

pH-Wert, der gelöste Sauerstoff und die Anwesenheit von ROS wahrscheinlich zu Abbaureakti-

onen der Catechine geführt haben. Ferner haben Green et al. herausgefunden, dass Epicatechine

und Epicatechin-Gallate aufgrund ihrer Struktur nicht so anfällig wie Epigallocatechin und Epi-

gallocatechin-Gallate (≤ 10 % der eingesetzten Menge an Catechinen wurden wiedergefunden)

für diese Abbaureaktionen waren. Außerdem wurde in dieser Studie festgestellt, dass unter Zu-

gabe von Kuhmilch, Sojamilch und Reismilch der Gesamtgehalt an Catechinen auf 52 %, 55 %

und 69 % erhöht werden konnte. Die Zugabe von 30 ml Ascorbinsäure in ein Teegetränk (250

ml) führte sogar zu einer Erhöhung der Mengen der einzelnen Catechingruppen: Epigallocate-

chin (74 %), Epigallocatechin-gallate (54 %), Epicatechin (82 %) und Epicatechingallate (45 %).

46

Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass Lebensmittelzusatzstoffe und die Art der Zuberei-

tung des Tees wahrscheinlich den Catechingehalt nach der Verdauung beeinflusst.

Allein die Auswahl der vorgestellten Ergebnisse verdeutlicht, dass die Ergebnisse der verschie-

denen in vitro Modelle sehr unterschiedlich ausfallen können, selbst wenn die Auswahl der

Chemikalien und die Durchführungszeit identisch sind. Daher ist eine Übertragbarkeit der Er-

gebnisse auf in vivo kaum möglich. In den dargestellten Studien wurden unterschiedliche Le-

bensmittel untersucht, d.h. diese besitzen jeweils eine unterschiedliche Lebensmittelmatrix und

unterschiedlichen Mengen an Inhaltsstoffen (welche die Verdauung beeinflussen), daher ist ein

direkter Vergleich der Ergebnisse untereinander nicht möglich.

Den geringsten Zeitaufwand weist die Studie von Green et al. auf, da im Gegensatz zu den ande-

ren Modellen die Durchführungszeit der Magenverdauung nur 1 h beträgt. Da in dem meisten

Studien beschrieben wird, dass die Magenverdauung keinen bedeutenden Einfluss auf die Poly-

phenole hat, wäre eine eventuelle Herabsetzung der Verdauungszeit von 2 h auf 1 h eine Mög-

lichkeit, um Kosten und Zeit zu minimieren. Obwohl Ortega et al. einen zusätzlichen Verdau-

ungsschritt simuliert haben, ist dies nicht die Studie mit der längsten Durchführungszeit. Bei

einigen Modellen wurde die Versuchszeit der Dünndarmverdauung von 2 h auf 2,5 h erhöht. Die

mit Abstand längste Durchführungszeit hat das Modell von Tarko et al. mit insgesamt 6 h. Die

Dünndarmverdauung wurde in dieser Methode 4 h lang simuliert, danach war der Polyphenolge-

halt in allen Früchten gesunken. Bei Tagliazucchi et al. war nach der Dünndarmverdauung ein

Ansteigen der Polyphenole zu beobachten. Eventuell hängt dies mit der jeweiligen Durchfüh-

rungszeit der Dünndarmverdauung zusammen, wobei auch hier die unterschiedlichen Inhaltsstof-

fe der Probe zu beachten ist. Die Durchführung der unterschiedlichen Modelle mit einer identi-

schen Probe würde wahrscheinlich zu einer besseren Vergleichbarkeit hinsichtlich des Kosten-

und Zeitaufwandes sowie der Stabilität der Polyphenole führen.

47

6 Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit war es, nach Publikationen, in denen die in vitro Verdauung von Poly-

phenolen untersucht wurde, zu suchen und diese miteinander zu vergleichen. Eine obst- und ge-

müsereiche Ernährung wird mit der Prävention von Krebserkrankungen, kardiovaskulären und

diversen chronischen Erkrankungen sowie einer antiinflammatorischen und antiviralen Wirkung

in Verbindung gebracht wird. Diese protektiven und gesundheitsfördernden Effekte werden auf

die Polyphenole zurückgeführt, welche zu den sekundären Pflanzeninhaltsstoffen zählen.

Voraussetzung für die Wirksamkeit der Polyphenole ist deren Erreichen des Gastrointestinaltrak-

tes und deren damit verbundenen Stabilität. Es gibt zahlreiche Studien, in denen die in vitro Ver-

dauung der Polyphenole und auch die Stabilität dieser Verbindungen während der einzelnen

Verdauungsschritte untersucht wurden. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Darstellung von

zwölf verschiedenen in vitro Modellen, wobei zehn dieser Modelle auf der Publikation von Mil-

ler et al. (1981) beruhen. Diese Studien weisen untereinander nur geringe Abweichungen hin-

sichtlich der eingesetzten Chemikalien und Enzyme sowie der Zeit der Versuchsdurchführung

auf. Nur in dem von Ortega et al. (2009) entwickelten Modell wurde die Simulation der Mund-

höhlenverdauung durchgeführt. Dieser Verdauungsschritt wird bei dem Großteil der in vitro

Modelle nicht simuliert, da diesem Abschnitt der Verdauung aufgrund der kurzen Transitzeit

keine wesentliche Bedeutung zugeordnet wird. Zwei der in dieser Arbeit beschriebenen Versu-

che weisen größere Abweichungen hinsichtlich der Versuchszeit auf: Bei der Abhandlung von

Green et al. (2007) beträgt die gesamte Versuchszeit 3 h, die Zeit der Magenverdauung beträgt 1

h und die der Dünndarmverdauung 2 h. Die von Tarko et al. (2009) entwickelte Methode er-

streckt sich über einen Zeitraum von insgesamt 6 h, wobei die Dauer der Magenverdauung 2 h

und die der Dünndarmverdauung 4 h beträgt. Des Weiteren ist diese Studie die einzige, in der

kein Gallensalz eingesetzt wurde. Die anderen Studien besitzen im Durchschnitt eine Versuchs-

zeit von 4 h (Magenverdauung 2 h, Dünndarmverdauung 2 h). In allen Publikationen wurde die

mikrobielle Umsetzung der Substanzen im Dickdarm nicht betrachtet. Bei allen Modellen erfolgt

die Simulation der Verdauung bei einer Temperatur von 37 °C, entsprechend der Körpertempera-

tur des Menschen.

In einigen Studien wurde beschrieben, dass die Magenverdauung keine Auswirkungen auf den

Polyphenolgehalt hatte, da diese im sauren Milieu am stabilsten sind. Bei der Überführung der

Polyphenole in den neutralen beziehungsweise leicht basischen Bereich konnte allerdings eine

geringe Abnahme des Polyphenolgehaltes nachgewiesen werden.

Ferner haben Ortega et al. eine erhöhte Stabilität der Polyphenole durch einen hohen Fettgehalt

der zu untersuchenden Substanz feststellen können. Sie gehen davon aus, dass die bei der Fett-

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verdauung gebildeten Mizellen eine protektive Wirkung auf die Polyphenole ausüben. Einzelne

Studien konnten die erhöhte Stabilität von Catechinen und Quercetin während der Dünndarm-

verdauung ermitteln, was sie auf die Stabilität von Flavanolen und Flavonolen bei einem neutra-

lem beziehungsweise basischen pH-Wert zurückführten.

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Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Wirkung der Polyphenole auf die menschliche Gesundheit....................................... 14

Tabelle 2: in vitro Modelle und ihre Anwendungsbereiche ....................................................... 31

Tabelle 3: Darstellung der Enzyme und Sekrete der Verdauung ................................................ 35

Tabelle 4: Studien zur Untersuchung von Polyphenolen ........................................................... 39

59

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Struktur der Benzoesäure- und Zimtsäurederivate .............................................. 8

Abbildung 2: Struktur von Resveratrol .................................................................................... 8

Abbildung 3: Struktur von Secoisolariciresinol........................................................................ 9

Abbildung 4: Flavangrundkörper ............................................................................................. 9

Abbildung 5: Klassifizierung der Flavonoide......................................................................... 10

Abbildung 6: Biosyntheseweg der Polyphenole in Pflanzen................................................... 11

Abbildung 7: Antioxidatives Potential von Quercetin ............................................................ 13

Abbildung 8: Schematische Darstellung des menschlichen Verdauungssystems .................... 16

Abbildung 9: Schematische Darstellung des Verdauungstraktes der Schweine ...................... 19

Abbildung 10: Möglichkeiten der intestinalen Absorption ....................................................... 20

Abbildung 11: Mögliche Verteilungswege von Polyphenolen im Menschen............................ 23

Abbildung 12: Vereinfachtes Schema zum Metabolismus in Dünndarm; CBG: cytosolische β-

Glukosidase; COMT: Catechol-O-Methyltransferase; UGT: UDP-

Glukuronyltransferase; SULT: Phenol-Sulfontransferase ................................. 24

Abbildung 13: Darstellung des statischen Systems zur Untersuchung der transepithelialen

Adsorption mittels Zellmonolayern .................................................................. 33

Abbildung 14: Aufbau der Ussing-Kammer ............................................................................ 33

60

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne Benut-

zung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus fremden Quellen direkt

oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Die Arbeit wurde

bisher in gleicher oder ähnlicher Form keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Neubrandenburg, der 11.02.2014

…………………………………