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Cours de Bactriologie GnraleObjectifs : Connatre les principes de classification des organismes vivants et la place des procaryotes

DEFINITIONS, CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE DES BACTERIESPLACE DES BACTERIES DANS LE MONDE VIVANT En 1673, Antoni Van Leeuwenhoek (1632-1723) fut le premier observer les bactries quil appela animalcules. En plus de la premire description des globules rouges et des spermatozoides, ce drapier hollandais observa pour la premire fois les bactries et dcrivit leur diffrentes formes.

Ce nest que deux sicles plus tard que le rle des bactries dans les processus de fermentation et dans la transmission des bactries a t dcouvert et que leur tude a commenc. Les scientifiques les plus illustres de cette poque furent Louis Pasteur et Robert Koch.

Louis Pasteur

Robert Koch

Luniversalit du code gntique a montr que tous les organismes vivants, eucaryotes et procaryotes, descendent dun seul et mme anctre. Ltude de gnes existants chez tous les tres vivants, du fait de fonctions mtaboliques particulirement importantes, comme ceux codant pour les ARN ribosomiques, a montr que leurs squences ont peu vari au cours des ges et que la comparaison de ces squences permet de trouver les relations existant entre organismes. Les procaryotes, prsents lorigine de la vie, ont donn naissance aux Archaebactries et aux Eubactries donnant le classement suivant :

la branche des Eucarya (ou eucaryotes avec 4 rgnes : animal, vgtal, champignons, et protistes), la branche des Archaea (archaebactries vivant dans les milieux hostiles : mthanognes, halophiles, Sulfolobus), la branche des Eubacteria (bactries proprement dites).

Grce aux tudes comparatives, il est propos un autre classement, plus ou moins arbitraire, des formes de vie en 5 rgnes, tous issus directement dun anctre commun : les Monres (ensemble des procaryotes, cellules sans noyau), les Protistes (ensemble des procaryotes unicellulaires avec noyau), les Myctes (ou champignons, qui regroupent les organismes eucaryotes htrotrophes et possdant une paroi), les Vgtaux (organismes autotrophes avec paroi), les Animaux (organismes eucaryotes htrotrophes sans paroi).

La sparation entre les Monres et les autres rgnes est facile. Les limites entre les quatre autres rgnes sont plus floues. Dans aucune classification, les virus ne forment un rgne en tant que tel. Ils ne sont pas considrs comme des tres vivants. Les virus sont classs en ordre, famille, genre, et espce. De nombreuses thories existent sur la phylognie des tres vivants : larbre phylognique reprsent ici exprime lune des thories. Organisation des cellules eucaryotes et procaryotes Structure cellulaire Taille Noyau Nuclole Membrane nuclaire Mitochondrie Lysosome Appareil de Golgi Rticulum endoplasmique Ribosome eucaryote 2 - 20 mm prsence plusieurs chromosomes prsence prsence prsence prsence prsence prsence prsence association au RE rugueux procaryote 0,3 - 2,5 m absence un seul chromosome absence absence absence absence absence absence prsence

TAXONOMIE ET CLASSIFICATION DES BACTERIES Chaque fois que lhomme attribue un nom des objets, il fait un classement. La taxonomie est lensemble des principes et thories qui permettent de classer et de valider le classement des organismes. Les microorganismes sont classs en taxons, ou groupes, sur la base de leurs relations phntiques et/ou phylogntiques. La classification des bactries est maintenant tablie de manire phylogntique. Les mthodes molculaires utilises permettent de connatre les relations entre les bactries.

Les bactries peuvent tre divises en 12 groupes qui ont t dfinis partir de lanalyse de lARN ribosomal 16S et 23S. Lespce est lunit fondamentale de la classification. Elle regroupe les organismes qui possdent de nombreux caractres communs. Cependant lintrieur dune mme espce, il est possible de distinguer des souches et des clones. Une souche est la sous-division dune espce. Un clone est une population descendant dune mme souche. Les noms attribus aux bactries nont pas de sens taxonomique. Ils donnent cependant un nom une souche bactrienne isole dun produit pathologique sans aucune ambigut. La classification bactrienne nest pas forcment bien adapte la pathologie. En bactriologie mdicale, on peut classer les bactries selon une classification clinique : les bactries sont la cause de grands syndromes (mningites, endocardites) ou selon une classification pathognique : maladies dues une mme bactrie (staphylocoques, mycobactries) ou un mme mcanisme pathognique (toxi-infections). Les bactries peuvent tre classes selon leurs caractres : biochimiques (classification en biotypes ou biovars) antigniques (classification en srotypes ou srovars) pathogniques (classification en pathotypes ou pathovars) enzymatiques (classification en zymotypes ou zymovars) de sensibilit aux antibiotiques (classification en antibiotypes) de sensibilit aux bactriophages (classification en lysotypes ou lysovars) molculaires : identification de lADN par ribotypie, hybridation ADN-ADN, hybridation ADN-ARN,squenage de lARN ribosomique, etc

Les bactries peuvent aussi tre classes selon : la coloration de Gram la morphologie la mobilit la capacit sporuler la temprature de croissance les besoins nutritionnels le mode respiratoire

la capacit de photosynthse lutilisation des diffrentes sources de carbone ou dazote le G+C% du gnome.

NOMENCLATURE DES BACTERIES La nomenclature est lensemble des rgles qui rgissent lattribution dun nom chaque taxon distinct. Elle est universelle. Dune manire gnrale, la classification des tres vivants est hirarchise ainsi :

Les noms des bactries sont dsigns par deux noms latins : le nom de genre, crit avec une majuscule, est suivi du nom despce, crit en minuscule. Lensemble du nom est crit en italiques (Ex. : Escherichia coli).

Espace Etudiant Cours de Bactriologie Gnrale ANATOMIE - STRUCTUREObjectifs d'aujourd'hui Qu'est-ce qu'une bactrie ? Comment la voir ou la mettre en vidence ? Quelles sont ses principales caractristiques morphologiques et structurales ? Intrt mdical de connatre la morphologie et la disposition des bactries ? A - DECOUVERTE DES BACTERIES . Que penser d'un examen macroscopique d'urine ?

La premire mise en vidence des bactries a t possible avec un miscroscope simple fabriqu par Anthonie van Leeuwenhoeck, drapier hollandais (1632-1723). Pour en savoir plus. Ainsi il dcrit dans la salive de "Trs nombreux animalcules.....autant d'habitants que sur la plante"Un microscope de type Stiassine (dbut 1800)

B - METHODES D'ETUDE Compte tenu de leur taille (de l'ordre du micron), elles seront visualises par le microscope.

. microscopie lectronique (G x >10.000 fois)

. microscopie optique (G x 1000 -1500 fois) La prsence de bactries est habituellement recherche avec un microscope optique sans coloration (tat frais) ou aprs coloration (cf travaux pratiques).

. tat frais : voici un examen d'urine mettant en vidence des polynuclaires neutrophiles (G x 400)

. aprs coloration : voici un examen de pus urtral aprs avoir color la lame avec une solution de bleu de mthylne : il y a mise en vidence de polynuclaires neutrophiles ayant phagocyt des bactries de type diplocoque (G x 1000)

. Diverses techniques de coloration existent, mettant en vidence des affinits tinctoriales diffrentes telle la coloration de Gram, trs utilise en pratique courante ou encore celle de l'imprgnation argentique pour rvler les spirochtes ou encore celle rvlant le caractre acido-alcoolo-rsistant de certains bacilles (BAAR ou mycobactries).

C - DEFINITION D'UNE BACTRIE Etre unicellulaire de petite taille (microorganisme, micron) de morphologie diffrente qui prsente des caractristiques propres (Procaryote).

D - CARACTERISTIQUES DES PROCARYOTES

Tableau 1: Quelques caractres distinctifs des procaryotes et eucaryotes

Haut E - LES PRINCIPAUX ELEMENTS LES ENVELOPPES 1. La capsule Ce constituant inconstant est le plus superficiel. Sa mise en vidence s'effectue par coloration ngative (le colorant, encre de Chine ou Nigrosine est repouss par la capsule et apparat en clair sur fond noir). Exemple: Mningite Cryptococcus chez un siden Autre exemple de mise en vidence (par coloration) :

Constitu de polysaccharides acides (sucres sous forme d'acides uroniques tel l'acide galacturonique, l'acide glucuronique, mais aussi sous forme de sucres phosphors), ce composant est li certains pouvoirs pathognes, car il empche la phagocytose. Elle peut se trouver l'tat soluble dans les liquides de l'organisme (emploi dans le diagnostic = recherche d'antigne soluble). Elle intervient dans l'identification infra-spcifique. Ce typage est une des mthodes de reconnaissance des pidmies. Les polymres capsulaires purifis sont la base de certains vaccins(Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae). 2. Le glycocalyx Ce sont des fibres polysaccharidiques ou polymres extrmement frquents entourant la bactrie et difficiles visualiser en microscope lectronique. Le feutrage des fibres de glycocalyx est constant dans le cas de bactries vivant en biofilm dans les conditions naturelles.

Il est responsable de l'attachement des bactries aux cellules (cellules buccales, respiratoires......) ou des supports inertes (plaque dentaire sur l'mail dentaire, biofilms sur les cathters, ou encore les prothses dans le cas de bactries d'intrt mdical). Il protge les bactries du biofilm de la dessiccation, sert concentrer ou modifier les lments nutritifs exognes et rend les bactries rsistantes: antiseptiques, dsinfectants, antibiotiques. Certaines structures sont plus grosses, protiques, fibrillaires et rigides (fimbriae ou pili) qui permettent l'attachement spcifique des bactries sur les cellules, phase essentielle dans certains pouvoirs pathognes (Escherichia coli de certaines infections urinaires).

Des virus bactriens ou bactriophages peuvent infecter la bactrie aprs fixation sur certains pili, dits sexuels (cf gntique)

3. La paroi Un exemple de mise en vidence aprs un traitement antibiotique de type -lactamine

. Dfinition : enveloppe rigide assurant l'intgrit de la bactrie, donc responsable de la forme des cellules. Elle protge des variations de pression osmotique (mer). Elle est absente chez les Mollicutes (Mycoplasma). En dehors de bactries halophiles ou thermophiles, la partie commune toutes les parois bactriennes est le peptidoglycane, enveloppe la plus interne. Le peptidoglycane est un htropolymre compos de chanes glucidiques relies les unes aux autres par des chanons peptidiques (pentapeptide). La macromolcule rticule tridimensionnelle est ainsi constitue et sa solidit dpend de l'importance des interconnexions. La paroi de la bactrie est ainsi une unique macromolcule. . Composition : La chane polysaccharidique est forme de chanons N-Actyl Glucosamine - Acide N-Actyl Muramique. Les chanes peptidiques formes au minimum de quatre aminoacides (par exemple LAlanine - D-Glycine - L-Lysine D-Alanine) sont toujours fixes sur l'acide muramique. L'enchanement des aminoacides des sries D et L est une constante. Ces ttrapeptides sont relis directement entre eux ou par une courte chane peptidique (chane interpeptidique). La biosynthse du peptidoglycane s'effectue par sous-units dans le cytoplasme jusqu' l'assemblage du disaccharide-pentapeptid (N-Actyl Glucosamine-Acide N-Actyl Muramique- L-Alanine-D-Glycine-L-Lysine-D-Alanine-D-Alanine) qui traverse la membrane cytoplasmique fix sur un transporteur phospholipidique puis est attach la chane glucidique de la paroi pr-existante (raction de transglycosylation). Les chanes peuvent tre relies pour former la molcule rticule finale par liaison covalente entre les peptides (raction de transpeptidation). D'autres enzymes sont ncessaires: hydrolases permettant de couper les chanes glucidiques du peptidoglycane (rle essentiel lors de la division), D, D carboxypeptidases coupant le dipeptide D- Alanine-DAlanine et rduisant le nombre des interconnexions.

Certaines tapes peuvent tre entraves par certains antibiotiques: -lactamines, glycopeptides (cf antibiotiques) ou encore enzyme (lysozyme). La composition variant selon l'espce ou le groupe bactrien, il a t possible de distinguer des affinits tinctoriales diffrentes par la coloration: Gram + et Gram -. - Paroi des bactries Gram positif : Le peptidoglycane est le constituant majeur. La murine reprsente jusqu' 30 % du poids sec d'une cellule. Le peptidoglycane est trs solide, les liaisons croises entre chanes glucidiques sont nombreuses. - Paroi des bactries Gram ngatif : Beaucoup plus complexe Le peptidoglycane est en couche mince peu dense (< 15 % du poids sec). L'autre constituant essentiel est un lipide complexe (A) coupl la glucosamine et des rsidus phosphore qui est amphiphile, possdant une partie hydrophobe et une hydrophile. Il y a analogie entre les appellations endotoxine , lipide A et membrane externe (cf pouvoir pathogne). Sur les rsidus glucosamine, des polysaccharides complexes sont fixs et forment la partie la plus externe de la paroi. Ils sont essentiels pour la physiologie bactrienne dans les processus de pntration de nutriments ou de toxiques, ils sont spcifiques de sous-espces ou de types et comportent des sucres originaux : antignes O. On trouve l'intrieur, des phospholipides. La membrane est successivement hydrophile (polysaccharide complexe), hydrophobe (lipide A et lipides des phospholipides), hydrophile (ttes hydrophiles des phospholipides). Se trouvent enchsses des protines qui assurent la cohsion de la membrane, une liaison avec le peptidoglycane et des fonctions diverses de permabilit slective ou non. Ces porines, seules structures de transport des composs hydrophiles, sont essentielles la vie de la bactrie mais aussi l'action de certains antibiotiques. Enfin d'autres protines servent la captation d'ions (fer), ou de vitamines (facteurs de croissance). Notons les antignes protiques M des streptocoques. D'autres structures existent telle chez les mycobactries Haut Autres proprits de la paroi bactrienne Coloration de Gram : fonde sur l'action successive d'un colorant, le cristal violet, d'iode puis d'un mlange d'alcool et d'actone (cf TP 1). Gram(1853-1938), a t inventeur de la coloration en 1884. Son intrt est de donner une information rapide et mdicalement importante, car le pouvoir pathogne et la sensibilit aux antibiotiques sont radicalement diffrents. Les morphologies bactriennes sont varies. Les cellules peuvent tre courtes, pratiquement sphriques (cocci ou coques) ou allonges (bacilles).

Les bacilles sont essentiellement des cylindres extrmits hmisphriques mais on en connat aussi extrmits fines, pointues (formes en fuseau) ou au contraire planes (bacilles dits bouts carrs). Certains corps bacillaires sont incurvs (Vibrio, Campylobacter) ou spirals (Leptospira, Treponema). Dans un environnement adapt, les cellules des bactries peuvent tre associes en groupements qui sont caractristiques de l'espce. Quelques exemples partir de produits pathologiques (cf Internet, QCM sur la morphologie)

- L'absence de paroi est habituellement ltale pour les bactries (Mollicutes excepts). Les bactries dpourvues d'enveloppes extrieures sont les formes L et les protoplastes, suite l'action des antibiotiques (-lactamines) ne semblent pas avoir un intrt mdical. 4. La membrane plasmique

selon V. Jarlier C'est une membrane trilamellaire forme de phospholipides dont les ples hydrophobes sont face face, entourant des protines. Elle est l'interface entre cytoplasme et structures externes. Certaines protines, les permases, ont un rle important dans les changes. D'autres protines sont des enzymes respiratoires ou impliques dans la production d'nergie (ATPase). La membrane a ainsi un rle mtabolique majeur : on y trouve la plupart des activits associes aux mitochondries dans la cellule suprieure. Les flagelles bactriens y sont fixs, c'est l que se gnre leur mouvement tournant. Est est dtruite par des antibiotiques (polypeptides, antiseptiques).

LES CONSTITUANTS DU CYTOPLASME ct de diverses structures de stockage (mais jamais organises), appareil nuclaire et ribosomes sont prsents dans le cytoplasme bactrien. . Appareil nuclaire (chromosome) et plasmides (cf gntique bactrienne I)

. Ribosomes Constitus d'ARN et de protines, les ribosomes bactriens comportent deux sousunits (30 S, 50 S). Fonctionnellement, il y a deux sites essentiels pour la synthse des protines : le site aminoacyl qui accueille l'acyl-tARN et le site peptidyl qui accueille la chane d'aminoacides en cours de constitution. Ils sont particulirement prsents proximit de la membrane cytoplasmique, site de synthse de la paroi et des protines exportes. Ils n'ont pas la structure des ribosomes de cellules suprieures expliquant la spcificit propre au monde bactrien. Des antibiotiques perturbent la synthse des protines leur niveau (Ttracyclines) LA SPORE BACTRIENNE Certaines bactries, entre autres d'intrt mdical (genre Clostridium et Bacillus), ont la proprit de se diffrencier en formes de survie appeles spores. Elles se prsentent sous une forme vgtative mtaboliquement active et potentiellement pathogne ou mtaboliquement inactive et non pathogne (forme sporule). La transformation de la forme vgtative en spore est la sporulation : . Temps : 6 8 heures 37C pour Bacillus subtilis. . Conditions : dclenche par des modifications de l'environnement tel puisement en matires nutritives. . Etapes : dshydratation progressive du cytoplasme, par l'apparition de composs (dipicolinate de calcium), une densification des structures nuclaires et enfin la synthse d'une paroi sporale paisse et impermable, donc hautement rsistante (chaleur). La spore intra-bactrienne est libre dans le milieu extrieur et y survit des

annes. Dans des conditions favorables (nutritives, thermiques et chimiques), elle redonne une cellule vgtative (germination). Intrt mdical avec conserves familiales (Botulisme)(Clostridium botulinum) Intrt mdical avec des plaies souilles par de la terre (Ttanos)(Clostridium tetani) Chez l'animal : mange des chardons.........(Charbon)(Bacillus anthracis)Ce cours a t prpar par le Professeur A. PHILIPPON (Facult de Mdecine COCHIN-PORT-ROYAL, Universit PARIS V)

Espace Etudiant Cours de Bactriologie Gnrale PHYSIOLOGIE - CROISSANCEObjectifs : Connatre les principaux lments de la physiologie bactrienne : croissance bactrienne, mode respiratoire, et application l'identification bactrienne. A - DIVISION BACTERIENNE La bactrie se multiplie par fission binaire : la bactrie grandit puis se divise en deux cellules filles spares par un septum de division form par la paroi cellulaire. Durant la division, l'ADN se duplique ainsi que les autres constituants. Divers systmes enzymatiques de synthse et de dgradation participent la division cellulaire.

B - DYNAMIQUE DE LA CROISSANCE La croissance bactrienne est l'accroissement ordonn de tous les composants de la bactrie. Elle aboutit l'augmentation du nombre de bactries. Au cours de la croissance, il se produit, d'une part, un appauvrissement du milieu de culture en nutriments et, d'autre part, un enrichissement en sous-produits du mtabolisme, ventuellement toxiques. La croissance peut tre tudie en milieu liquide ou solide. 1 - Courbe de croissance : La croissance d'une bactrie s'tudie en milieu liquide. Il existe 6 phases dont l'ensemble constitue la courbe de croissance. . Phase de latence : le taux de croissance nul ( = 0). La dure de cette phase dpend de l'ge des bactries et de la composition du milieu. C'est le temps ncessaire la bactrie pour synthtiser les enzymes adaptes au nouveau substrat (pas de phase de latence si repiquage sur milieu identique au prcdent). . Phase d'acclration : il se produit une augmentation de la vitesse de croissance. . Croissance exponentielle : le taux de croissance atteint un maximum (=max). Cette phase dure tant que la vitesse de croissance est constante. Le temps de doublement des bactries est le plus court. La masse cellulaire est reprsente par des cellules viables (mortalit nulle). . Phase de ralentissement : la vitesse de croissance rgresse. Il y a un puisement du milieu de culture et une accumulation des dchets. Il existe un dbut d'autolyse des bactries. . Phase maximale stationnaire : le taux de croissance devient nu ( = 0). Les bactries qui se multiplient compensent celles qui meurent. . Phase de dclin : le taux de croissance est ngatif ( < 0). Toutes les ressources nutritives sont puises. Il y a accumulation de mtabolites toxiques. Il se produit une

diminution d'organismes viables et une lyse cellulaire sous l'action des enzymes protolytiques endognes. Cependant, il persiste une croissance par libration de substances libres lors de la lyse (croissance cryptique). Exemple d'une courbe de croissance 1 : phase de latence, 2 : phase de croissance exponentielle, 3 : phase de ralentissement, 4 : phase stationnaire, 5 : phase de dclin.

Courbe de croissance dans un automate d'hmoculture

Haut 2 - Croissance in vitro (milieux liquides et solides) Les bactries peuvent tre cultives en milieux liquide, solide et semi-liquide. Les milieux liquides sont utiliss pour la culture de bactries pures ou lors d'infection monomicrobienne (hmoculture).

Exemples : culture d'une bactrie dans un bouillon nutritif ou encore partir du sang d'un malade (hmoculture en flacon)

Les milieux solides ou semi-solides, base d'agar (glose), sont utiliss pour l'isolement de bactries. Dans ces milieux, ont t ajouts des nutriments favorisants la croissance des bactries tudies. Exemples : culture par isolement d'une bactrie la surface d'un milieu glos contenant du sang (mouton, cheval) montrant aprs 18 24 H 37C d'incubation des colonies hmolytiques.

3 - Croissance in vivo In vivo, la croissance bactrienne n'est pas similaire celle observe in vitro. Elle est beaucoup plus ralentie. La phase de latence est beaucoup plus longue. Les bactries n'ont pas toujours tous les nutriments leur disposition pour leur croissance. In vivo, les bactries peuvent tre phagocytes par les macrophages et les polynuclaires et tre inhibes par les produits antibactriens comme le lysozyme ou le complment.

4 - Croissance en culture continue Il y a maintien d'une croissance exponentielle continue lorsque le milieu de culture est renouvel rgulirement et que les mtabolites sont limins en mme temps. La valeur est maximale et constante. 5 - Croissance en culture synchrone Les bactries se multiplient toutes au mme moment. La courbe de croissance montre des paliers successifs. Ce type de culture permet d'tudier la division cellulaire indpendamment de la croissance. 6 - Croissance en biofilm Les bactries peuvent s'attacher aux surfaces, s'associer entre elles et s'entourer d'un polymre organique pour constituer un biofilm. Leur organisation et leur mtabolisme dpendent de la nature de la surface et de l'environnement physico-chimique. Les biofilms intressent tous les domaines de la microbiologie et de la mdecine (matriels d'exploration, matriels implants, muqueuses lses). Les biofilms sont caractriss par une htrognit spatiale : il existe des variations mtaboliques importantes l'intrieur du biofilm et l'interface milieu liquide/milieu solide. Schma d'organisation d'un biofilm

7 - Effets de carence et de stress En situation de carence ou de stress, la bactrie peut adopter deux types de stratgie pour sa survie : 1 - la bactrie se diffrencie vers une forme de rsistance mtaboliquement inactive C'est le cas des Bacillus qui produisent une spore. 2 - la bactrie dveloppe des systmes de rgulation pour contrler cette priode de carence en adaptant son mtabolisme pour faire un maximum d'conomie. C'est le cas de Escherichia coli. Dans ce type de situation, la bactrie prsente les adaptations suivantes : . Dgradation de l'ARN cellulaire total, librant des nuclotides utilisables pour la synthse de nouveaux ARN ou comme source d'nergie. . Dgradation des protines : libration d'acides amins rutiliss ou dgrads pour la production d'nergie . Mise en uvre de systmes de transport et d'assimilation comme substituts aux lments manquants qui sont essentiellement les composs azots, phosphors, carbons et le fer. . Synthse de protines de stress qui protgent la bactrie de la privation de nutriments et d'autres stress (existence de gnes impliqus dans les phnomnes de carence ou de stress). Haut

C - CONDITIONS FAVORABLES A LA CROISSANCE 1 - Sources d'nergie Les bactries doivent trouver dans leur environnement les substances ncessaires leur nergie et leurs synthses cellulaires. Les bactries phototrophes utilisent l'nergie lumineuse pour la photosynthse (synthse d'ATP partir d'ADP et de phosphate inorganique). Les bactries chimiotrophes puisent leur nergie partir de composs minraux ou organiques. Elles utilisent des donneurs et des accepteurs d'lectrons (lment minral : bactrie chimiolithotrophe ; lment organique : bactrie chimioorganotrophe). La grande majorit des bactries d'intrt mdical sont chimioorganotrophes. 2 -Sources de carbone Le carbone est l'un des lments les plus abondants de la bactrie. Le plus simple des composs est l'anhydride carbonique ou CO2. Celui-ci peut tre utilis par la bactrie pour la synthse de certains mtabolites essentiels qui ferait intervenir une raction de carboxylation.

Le CO2 est la seule source de carbone pour les bactries autotrophes. Les bactries htrotrophes utilisent facultativement le CO2. Les bactries htrotrophes dgradent une grande quantit de substances hydrocarbones (alcool, acide actique, acide lactique, polysaccharides, sucres divers). 3 - Sources d'azote et besoins en soufre Les bactries ont besoin de substances azotes pour synthtiser leurs protines. La provenance de cet azote peut se faire par fixation directe de l'azote atmosphrique ou par incorporation de composs azots (ractions de dsamination, de transamination) Le soufre est incorpor par les bactries sous forme de sulfate ou de composs soufrs organiques. 4 - Besoins inorganiques Le phosphore fait partie des acides nucliques et de nombreuses ractions enzymatiques. Il permet la rcupration, l'accumulation et la distribution de l'nergie dans la bactrie. Il est incorpor sous forme de phosphate inorganique. 5 - Autres lments D'autres lments jouent un rle dans le mtabolisme bactrien (sodium, potassium, magnsium, chlore) et dans les ractions enzymatiques (calcium, fer, magnsium, manganse, nickel, slnium, cuivre, cobalt, vitamines) Exemple d'un milieu solide minimum pour tudier le transfert de marqueurs d'auxotrophie (cf dcouverte de la conjugaison) composition: SO4(NH2)2 1 g, PO4K2H 7g, PO4KH2 2g, citrate 0,5g, SO4Mg, 7H2O 1g, eau 500 ml

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D - CONDITIONS PHYSICO-CHIMIQUES DE LA CROISSANCE 1 - Effet de l'oxygne Il existe plusieurs classes de bactries en fonction de leurs rapports avec l'oxygne.

1 - Les bactries arobies strictes ne se dveloppent qu'en prsence d'air. Leur source principale d'nergie est la respiration. L'oxygne molculaire, ultime accepteur d'lectron, est rduit en eau (Pseudomonas, Acinetobacter, Neisseria). 2 - Les bactries microarophiles se dveloppent mieux ou exclusivement lorsque la pression partielle d'oxygne est infrieure celle de l'air (Campylobacter, Mycobacteriaceae). 3 - Les bactries aro-anarobies facultatives se dveloppent avec ou sans air. C'est le cas de la majorit des bactries rencontres en pathologie mdicale : les entrobactries (Escherichia, Salmonella), les streptocoques, les staphylocoques. L'nergie provient de l'oxydation des substrats et de la voie fermentaire. 4 - Les bactries anarobies strictes ne se dveloppent qu'en absence totale ou presque d'oxygne qui est le plus souvent toxique. Ces bactries doivent se cultiver sous atmosphre rductrice. La totalit de l'nergie est produite par fermentation.

C'est le cas des bactries intestinales (Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium) et de nombreuses bactries prsentes dans les flores normales de l'organisme. La toxicit de l'oxygne s'explique par la production de radicaux superoxydes que les bactries anarobies ne peuvent pas dtruire (absence de superoxyde dismutase) et/ou par l'absence d'une activit enzymatique type de catalases et de peroxydases. Mode d'action de la superoxide dismutase, de la catalase et de la peroxydase

Exemple : Etuve avec culture de bactries anarobies stricts en jarre

Autre exemple : culture de bactries anarobies stricts en sachet plastique et en atmosphre contrle

2 - Effet de la temprature Les bactries peuvent tre classes selon leur temprature optimale de croissance. - Bactries msophiles (Ex. : Escherichia coli) : temprature de croissance proche de celle du corps humain (37C) - Bactries thermophiles (Ex. : Thermus aquaticus) : tempratures de croissance comprises entre 45C et 70C . - Bactries hyperthermophiles (Ex. : Archaea) : tempratures de croissance suprieures 80C . - Bactries psychrophiles (Ex. : ) :Tempratures proches de 0C (optimum 10-15C). - Bactries psychrotrophes (Ex. : Pseudomonas) : tempratures de croissance proches de 0C avec optimum de croissance proche des bactries msophiles. Exemple : Dans un laboratoire d'analyse, tuve dont la temprature intrieure est rgle 37C

Autre exemple : tuve dont la temprature intrieure est rgle 37C avec une atmosphre de 5% de gaz carbonique (CO2)

Haut 3 - Effet du pH Le pH (concentration en ion hydrogne [H+]) de l'environnement varie entre 0,5 (sols acides) et 10,5 (eaux alcalines des lacs). Les bactries pathognes ou lies l'cosystme humain se dveloppent le plus souvent dans des milieux neutres ou lgrement alcalins. On distingue les bactries: - neutrophiles qui se dveloppent pour des pH sont compris entre 5,5 et 8,5 avec un optimum voisin de 7. La plupart des bactries mdicalement importantes sont ainsi. Exemple : isolement d'une souche de Escherichia coli sur un milieu usuel

- alcalophiles qui prfrent les pH alcalins: cas de Pseudomonas et Vibrio, donc milieux de culture particuliers - acidophiles qui se multiplient mieux dans des milieux acides : cas des Lactobacillus. 4 - Effet de la pression osmotique Les bactries sont assez tolrantes aux variations des concentrations ioniques. Certaines espces sont osmotolrantes (staphylocoques, Vibrio cholerae). 5 - Effet de l'eau libre La disponibilit de l'eau prsente dans l'atmosphre ou dans une substance intervient dans la croissance bactrienne. L'activit de l'eau (Aw) est inversement proportionnelle la pression osmotique d'un compos. Ainsi, elle est affecte par la prsence plus ou moins importante de sels ou de sucres dissous dans l'eau. - Prsence de sels : Les bactries halophiles ncessitent du sel (NaCl) pour leur croissance. Cette concentration peut varier de 1-6% pour les faiblement halophiles jusque 15-30% pour les bactries halophiles extrmes (Halobacterium). Les bactries halotolrantes acceptent des concentrations modres de sels mais non obligatoires pour leur croissance (Ex. : Staphylococcus aureus). - Prsence de sucres : Les bactries osmophiles ncessitent des sucres pour leur croissance. Celles osmotolrantes acceptent des concentrations modres de sucres mais non obligatoires pour leur croissance. Enfin les bactries xrophiles peuvent se multiplier en l'absence d'eau dans leur environnement. 6 - Mtabolisme nergtique On peut opposer les bactries ayant un mtabolisme fermentatif et celles ayant un mtabolisme de type respiratoire. Pour les bactries mtabolisme fermentatif, la dgradation du glucose est incomplte et aboutit la formation de divers composs organiques (acides organiques). Pour les bactries ayant un mtabolisme oxydatif , la dgradation se fait par le cycle de Krebs. L'accepteur final d'lectron est l'oxygne. Chez les bactries, le systme de transport d'lectrons est situ dans la membrane cytoplasmique.

Exemple : Mise en vidence du caractre fermentaire (A) ou oxydatif (B) avec un milieu dit de MEVAG contenant du glucose. Le tmoin (C) est le mme milieu sans sucre ensemenc de manire identique.

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E - APPLICATIONS 1 - Milieux de culture Un milieu de culture est compos d'un mlange de substrats nutritifs (acides amins, peptides, bases nucliques, sucres, etc), d'un systme tampon pour viter les variations importantes du pH, de sels minraux et de vitamines. Il est possible d'ajouter d'autres facteurs de croissance (sang, protines, hmoglobine, vitamines). Ils sont de nature solide, semi-solide ou liquide. Parmi les milieux de culture, on distingue les milieux : - d'isolement qui sont le plus souvent solides (gloss) et de composition variable pour permettre le dveloppement de plusieurs espces bactriennes: glose au sang frais, glose dite au sang cuit. Exemple : isolement d'une aspiration bronchique sur milieu glos au sang frais (A), au sang cuit (B) ou contenant des substrats chromogniques (C)

- slectifs qui favorisent artificiellement la croissance d'une espce au dtriment des autres tels le Milieu de Chapman (hypersal + mannitol + indicateur de pH), Drigalski

(sels biliaires + cristal violet + lactose + indicateur de pH) Exemple : culture d'une part sur le milieu de Chapman (gauche) de trois souches de Staphylococcus aureus et d'autre part sur celui de Drigalski (droite) de Escherichia coli et Proteus mirabilis

- identification permettent au cours de l'isolement ou non de mettre en vidence une ou plusieurs proprits biochimiques d'une bactrie pour commencer l'identifier

Haut 2 - Apparences des colonies L'aspect des colonies est le caractre primaire utilis pour orienter le diagnostic effectu par le bactriologiste. La forme des colonies dpend de : A) facteurs intrinsques la bactrie : mobilit, morphologie : taille, forme, contour, relief, surface production d'une capsule, production de matriel extracellulaire, pigmentation, prsence de fimbriae

B) facteurs extrinsques : gradients de soluts crs autour de la colonie prsence de colorants dans le milieu de culture. Exemple : Aspects de colonies bactriennes sur le milieu slectif dnomm Drigalski

Autre exemple : Aspects de colonies bactriennes sur le milieu enrichi au sang

3 - Recherche des caractres biochimiques L'identification des bactries est effectue en utilisant des milieux de culture dont la composition permet de mettre en vidence une enzymatique. Exemples : activits variables (souches A et B) de type -galactosidase (ONPG), lysine dcarboxylase (LDC), ornithine dcarboxylase (ODC), urase (URE) .........

L'activit fermentaire est rvl avec un milieu type contenant un sucre, un indicateur color des changements de pH. La fermentation du sucre entrane un abaissement du pH et donc un changement de couleur de l'indicateur color. Exemples : activit fermentaire positive vis--vis de divers hydrates de carbone:

A l'heure actuelle, des systmes automatiss plus sensibles effectuent des mesures photomtriques en continu et peuvent identifier les principales bactries isoles en pratique mdicale en moins de 5 heures. Exemples : automates d'identification et de sensibilit aux antibiotiques

Espace Etudiant Cours de Bactriologie Gnrale Relations Hte-Pathogne

1. L'infection est une maladie provoque par des agents pathognes vivants. On distingue deux types de bactries responsables d'infections: 1.1 - Les bactries pathognes - Les bactries pathognes sont des bactries responsables d'une maladie mme chez le sujet " sain " (ex typhode, cholra, tuberculose, mningite...). - Le pouvoir pathogne conditionne le type de maladie et va dpendre de l'espce bactrienne responsable de l'infection. Par exemple, le cholra dont l'agent est Vibrio cholerae est une maladie compltement diffrente de la mningite mningocoque. Cette notion de pouvoir pathogne est distinguer de celle de virulence. - Ces bactries pathognes peuvent (pneumocoque, Haemophilus, mningocoque..) ou non (Mycobacterium tuberculosis, Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae..) appartenir la flore humaine commensale. Pour certaines bactries, comme le mningocoque (agent de la mningite crbrospinale), le portage sain dans le nasopharynx est la situation de loin la plus frquente, la maladie est l'exception puisqu'elle ne touche qu'un porteur sain sur 10 000. Ce point souligne que pour ces bactries qui en ralit appartiennent la flore commensale de l'homme bien que "pathognes", il existe une susceptibilit individuelle qui peut tre l'ge (plus frquentes chez les jeunes enfants) ou propre certains individus, de nature encore indtermine. - La virulence est une notion quantitative alors que le pouvoir pathogne est une notion qualitative. Ainsi pour un mme pouvoir pathogne, il peut y avoir des souches plus ou moins virulentes. Exemple : Shigella dysenteriae et Shigella flexneri sont toutes les deux responsables d'une dysenterie bacillaire, mais pas avec les mmes doses. Quelques bactries suffisent pour dvelopper une infection avec S.dysenteriae alors que plusieurs milliers sont ncessaires avec S. flexneri. Cette espce est donc considre comme moins virulente que S.dysenteriae. 1.2 - Les bactries opportunistes - Les bactries opportunistes ne donnent habituellement pas de maladie chez les sujets

sains. En revanche, elles peuvent devenir pathognes chez les sujets aux dfenses immunitaires altres. - Ces bactries sont souvent des bactries commensales qui vivent la surface de la peau et des muqueuses de l'homme Chez le sujet normal, elles ne donnent pas d'infections, mais la faveur d'une immunodpression ou d 'une antibiothrapie, elles vont tre contre-slectionnes et prolifrer leur donnant ainsi un avantage slectif.

- Le type de maladie (et donc le pouvoir pathogne) dont ces bactries sont responsables est, en gnral, monomorphe : colonisation de la porte d'entre avec dveloppement d'une inflammation non spcifique ce niveau (pneumonie, infection urinaire, infection sur cathter,.. ), ventuellement suivie d'unegnralisation, septicmie avec des localisations secondaires possibles (endocardite, abcs profond, ostites, mningites...) 2. Facteurs de dfense contre les bactries

2. 1 Facteurs non spcifiques 2.1.1 Les barrires A/ Les barrires qui s'opposent l'implantation des bactries correspondent : - aux flores saprophytes/commensales: la composition de cette flore varie en fonction de l'ge, de l'alimentation, de l'administration d'antibiotiques... - aux substances microbicides des revtements cutano-muqueux: dfensines, NaCl, acides gras, HCl, sels biliaires, mucus... - aux facteurs mcaniques : desquamation, pristaltisme intestinal, cellules cilies. B/Les barrires qui s'opposent la croissance bactrienne : - La disponibilit en nutriment pourrait tre le facteur limitant.

- Le seul rel nutriment qui fait dfaut in vivo est le Fe3+ . Sa concentration dans les tissus biologiques est de 10-18 M et ceci en raison de sa liaison la transferrine et la lactoferrine dans le secteur extra-cellulaire. - Cette faible concentration en Fe3+ impose tous les pathognes de possder des systmes de captation du Fe3+ afin de se procurer ce nutriment ncessaire leur mtabolisme. 2.2 Immunit inne L'immunit inne permet l'limination du microorganisme lorsqu'il se trouve dans un tissu habituellement strile. Il est ncessaire d'envisager 2.2.1. Les acteurs de l'immunit inne Le complment (voir cours correspondant) Les consquences de l'activation du complment sont la bactriolyse, l'opsonisation et le chimiotactisme (C3a, C5a) . Les cellules phagocytaires: 2 types de cellules phagocytaires : les polynuclaires les macrophages (voir cours immunologie correspondant la phagocytose)

Le but de l'immunit inne est de recruter ces lments au sige de l'effraction bactrienne, et ceci afin d'liminer l'agent pathogne. Une raction inflammatoire va alors se mettre en place. Elle associe diapdse - margination des leucocytes et extravasation des protines plasmatiques (complment et anticorps). 2.2.2. Les composants bactriens qui activent l'immunit inne - lipide A du lipopolysaccharide des bactries Gram-ngatif - peptidoglycane - acide lipotichoque des bactries Gram-positif - lipoarabinamananne des mycobactries - mannanes des levures (cf anatomie bactrienne) Haut 2.2.3. Les voies d'activation

- IL-1 produit par les macrophages et les cellules endothliales rle dans la fivre, stimule la production de prostaglandine, rle dans la margination et la diapdse leucocytaire - IL-6 produit par les macrophages, production induite par l'IL-1 - IL-8 produit par les macrophages et les cellules endothliales rle capital dans la margination leucocytaire. L'ensemble de ces cytokines a un effet bnfique en permettant le dveloppement d'une raction inflammatoire qui participe l'limination de l'agent bactrien. Si exagration de cette immunit inne, il y a sepsis (choc septique). 3 - Facteurs de virulence des bactries pathognes 3.1. En dehors des intoxinations, la premire tape du pouvoir pathogne est la colonisation de l'hte au niveau de la porte d'entre. En pratique, cel se traduit par : une adhsion aux cellules pithliales des muqueuses l'aide de pili ou d'adhsines non fimbrillaires. L'adhsine des pili est situe au sein de fimbriae. Cette adhsine est la molcule qui va interagir avec un rcepteur sur les cellules de l'hte. Dans le cas des adhsines non fimbrillaires, la protine est situe sur la membrane externe des bactries. Dans certains cas (Escherichia coli entropathogne), ce rcepteur est scrt par la bactrie l'intrieur du cytoplasme des cellules de l'hte.

une adhsion du matriel tranger (cathter, prothse..).

3. 2. Une fois la porte d'entre colonise, plusieurs types de pouvoir pathogne peuvent s'exprimer: 3.2.1. Le pouvoir pathogne est due la diffusion d'une toxine distance de la porte d'entre Dans ce cas, la bactrie adhre, colonise et se multiplie au niveau de la muqueuse de la porte d'entre et peut ventuellement provoquer une inflammation ce niveau. Mais l'essentiel du pouvoir pathogne est du la production d'une toxine dont les effets peuvent s'exercer distance de la porte d'entre: Vibrio cholerae (cholra). Dans ce cas, il y a colonisation de l'intestin et production de la toxine cholrique qui va tre responsable de la perte hydrolectrolytique (cf Bactriologie mdicale - Vibrio)

Escherichia coli entrotoxinogne (diarrhe des voyageurs), mme mcanisme que pour le cholra (cf Vibrio)

Bordetella pertussis (coqueluche). La muqueuse colonise est l'arbre trachobronchique. La production de la toxine va tre responsable de la toux et des signes gnraux et ventuellement cardio-vasculaires Staphylococcus aureus producteur de TSST (syndrome de choc toxique). Le staphylocoque colonise une muqueuse (vaginale par exemple) et la production de toxine qui diffusera sera responsable du choc. Corynebacterium diphtheriae (agent de la diphtrie). Le pathogne est responsable d'une angine, secondaire la multiplication bactrienne, mais seules les souches produisant la toxine diphtrique pourront donner le croup et les signes gnraux (cf Physiopathologie de la diphtrie ou Corynebacterium).

3.2.1.1. Les toxines bactriennes Les bactries pathognes produisent de nombreuses substances qui sont toxiques pour leur hte. Lorsqu'il s'agit de protines et qu'elles agissent faibles concentrations, il s'agit de toxines. Dans certains cas (ttanos et botulisme par exemple), seule la toxine est pathogne et la multiplication du microorganisme ne participe en rien aux symptomes observs. On distingue plusieurs types de toxines : A. Les toxines A-B

Ce type de toxines a deux composants, la sous-unit B qui est responsable de l'interaction avec les cellules de l'hte et la sous-unit A qui contient l'activit enzymatique (toxique). Cette activit varie d'une toxine l'autre et peut tre une activit ADP ribosylante (toxine cholrique, toxine pertussique et toxine diphtrique) ou une activit protolytique (toxine ttanique ou toxine botulinique). La sous-unit B varie d'une toxine l'autre et est responsable des spcificits tissulaires. Quant la sous-unit A, elle est conserve spcialement dans les rgions responsables de l'activit enzymatique.

B. Les toxines formant des pores Une famille de toxines est responsable de la formation de pores conduisant la lyse cellulaire. A titre d'exemple, il s'agit de l'hmolysine d'Escherichia coli, de la listriolysine (hmolysine) de Listeria monocytogenes. C. Les enzymes hydrolytiques Beaucoup de bactries pathognes produisent des protases, DNAses, collagnases qui vont participer la formation des lsions au sige de la multiplication bactrienne.

Exemple: Infection staphylocoque dor (S.aureus)

Haut

3.2.2. Le pouvoir pathogne rsulte d 'une inflammation au niveau de la porte d 'entre secondaire la multiplication bactrienne. Shigella responsable d'une dysenterie Neisseria gonorrhoeae responsable de la blennorhagie (cf Neisseria)

Salmonella typhimurium (diarrhe) Abcs cutans / furoncles dus une multiplication localise de Staphylococcus aureus Angines, sinusites, otites, bronchites le plus souvent dues des bactries de la flore commensale du nasopharynx qui deviennent pathognes (streptocoques, pneumocoques, Haemophilus, anarobies..). Infections urinaires, basses le plus souvent, ou encore atteinte du rein dues Escherichia coli

Les bactries en cause sont, en gnral, des pathognes multiplication extra-cellulaire dont la diffusion distance de la porte d'entre peut tre une complication redouter (surtout vrai pour les infections urinaires et les abcs sous-cutans). Pour certains de ces pathognes qui doivent franchir une muqueuse pour atteindre le secteur extra-cellulaire (Shigella, Salmonella, et Neisseria gonorrhoeae), cet envahissement ncessite une tape de multiplication l'intrieur des cellules pithliales.

Autre exemple : Shigella

3.2.3. Le pouvoir pathogne rsulte d'une dissmination du microorganisme partir de la porte d'entre: On distingue deux types de pathognes selon que la multiplication bactrienne ait lieu

l'intrieur ou l'extrieur d 'un compartiment cellulaire A/ Les bactries multiplication intra-cellulaire Le plus souvent le compartiment dans lequel la multiplication prend place sont les macrophages Mycobacterium tuberculosis (tuberculose) Salmonella typhi (typhode)

Listeria monocytogenes (listriose) Brucella (brucellose) Legionella (Maladie des lgionnaires) Coxiella burnetti (Fivre Q)

Pour certaines bactries, le type cellulaire dans lequel la multiplication a lieu sont les cellules endothliales Rickettsia (fivre boutonneuse)

Pour les bactries multiplication intra-cellulaires, le plus important est d'viter d'tre dgrades par les macrophages: soit elles inhibent la fusion phagolysosomale et se rpliquent dans la vacuole (Salmonella), soit elles sortent de la vacuole de phagocytose et se rpliquent dans le cytosol,(Listeria, Rickettsia) soit elles ne sont pas dgrades dans le phagolysosome.

B/Les bactries multiplication extra-cellulaire Il s 'agit du pouvoir pathogne le plus frquent. Les bactries se multiplient dans le secteur extra-cellulaire et sont quipes pour rsister l'activit bactricide du complment et la phagocytose par les polynuclaires Septicmies (Escherichia coli, Staphylococcus aureus)

Pneumonies (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae...) Pylonphrites (Escherichia coli, Proteus mirabilis..) Mningites (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae) Endocardites (Streptococcus, Enterococcus...)

Ces bactries multiplication extra-cellulaires ont un tronc commun de facteurs de virulence qui sont : la capsule polysaccharidique qui est essentielle dans la rsistance la bactricidie srique et/ou la phagocytose la chaine latrale du lipopolysaccharide ou la sialyaltion du core les systmes de captation du fer afin de se procurer le fer ferrique la production, inconstante, de certaines toxines

Ce cours a t prpar par les Professeurs X. Nassif (Facult de Mdecine Necker-Enfants-Malades, Paris V) et A. Philippon (Facult de Mdecine Cochin-Port-Royal, Paris V).

Espace Etudiant Cours de Bactriologie Gnrale GENETIQUE BACTERIENNE IUne histoire rcente survenue New-York en octobre a montr la psychose lie aux manipulations gntiques chez les microorganismes et montrer les potentialits de la gntique.

Heureusement, il ne s'agissait de moustiques infects par le virus de la West Nile

Fever. Objectifs d'aujourd'hui : Dfinition de la gntique Pourquoi les bactries constituent un matriel gntique de choix ? Quel est le mode de reproduction habituel des bactries ? Quelles sont les principales caractristiques du chromosome bactrien ? Quelles sont les applications actuelles quotidiennes ? Quelles sont les principales caractristiques de la variation gnotypique ? A - DEFINITION DE LA GENETIQUE Science de la variation et de l'hrdit, ne de l'tude chez les organismes dous de reproduction sexue, du croisement ou hybridation entre races ou varits de la mme espce. B - HISTORIQUE Premires lois fondamentales de la gntique formelle (transmission des caractres hrditaires) ont t dgages vers 1865 par G. Mendel, lors l'tude de la transmission des caractres anatomiques, cytologiques et fonctionnels de certaines plantes, le pois par exemple. Ces lois ont t redcouvertes vers 1900 chez la mouche.

Pour en savoir plus : http://www.netspace.org/MendelWeb/home.html http://www.mendelu.cz/index.eng.html

1 re phase : Bactries peu favorables l'analyse gntique. Pourquoi ? Il y avait une absence visible de diffrences morphologiques cause de la taille () ou encore de l'absence de spcialisation de la cellule (germe, soma).

2 me phase : Les bactries sont devenues, par la suite, un matriel de choix cause de leur division rapide : Escherichia coli (20 min) ou encore de leur encombrement "limit" (dans un tube de 22 mm), contrairement aux mammifres comme l'lphant.

Rsultat :

Dernire question ????

Conclusions : Apport de la gntique bactrienne considrable en biologie molculaire.Elle a particip la naissance de cette nouvelle et importante discipline. Pour en savoir plus : http://www.genethon.fr/projets/HistoireBM/HistoireBM.html La gntique bactriennne est devenue d'application banale par son usage quotidien : tests de mutagnse induite (agro-alimentaire) mutagnse par insertion techniques de clonage de gnes transfert de gnes squenage.......

C - REPRODUCTION ASEXUEE Lors de la croissance bactrienne, il y a donc reproduction asexue par scission binaire ou de scissiparit en l'absence de toute recombinaison gntique (pas de zygote). La bactrie est gnralement haplode (1 chromosome).

Haut D - PROPRIETES DU CHROMOSOME : ADN BACTERIEN Le chromosome bactrien est constitu d'acide dsoxyribonuclique (ADN) dont les caractristiques structurales sont bien connues. Pour en savoir plus : http://www.asmusa.org/mbrsrc/

Parmi les autres caractristiques, il convient de connaitre les suivantes :

- Formes topologiques : L'ADN bactrien qui est circulaire peut exister sous trois formes topologiques (superenroule, relache, linaire) objectives par plusieurs techniques telle l'ultracentrifugation, la microscopie lectronique ou tout simplement l'lectrophorse en gel d'agarose (technique d'usage courant).

La forme linaire est obtenue par coupure, par exemple enzymatique (enzymes de restriction). - Sparation ou dnaturation : Les deux chaines ou alpha hlices sont maintenues entre elles (A-T, C-G) par les deux ou trois liaisons "hydrogne". Le chauffage permet leur sparation en brins monocatnaires = fusion ou dnaturation. Cette sparation est rversible (renaturation ou hybridation) selon le principe de la complmentarit des bases (A-T, C-G). Pour en savoir plus : http://www.ac-versailles.fr/ Lors de la sparation, il y a augmentation de la DO 260 m (effet hyperchromique), et celle-ci est fonction du nombre de paires GC. Il est possible de calculer un paramtre quantitatif (Tm). Ainsi la dtermination du GC% est un critre taxonomique ou de classification des bactries qui peut tre calcul selon l'espce bactrienne. Il peut varier largement selon les groupes bactriens.

- Hydrolyse ou restriction : L'ADN double brin peut tre coup par des enzymes de restriction, dnommes endonuclases.

On a pu rduire de manire reproductible, le gnome bactrien une srie de fragments caractristiques isolables et mesurables (kb=kilobases), par exemple par une lectrophorse en gel d'agarose.

Le mode d'action trs spcifique des endonuclases permet d'tablir des profils de restriction, d'o leur intrt en pidmiologie pour tracer dans un service ou plusieurs services d'un hpital, une pidmie hospitalire. L'intrt de telles enzymes est essentiel dans l'obtention d'ADN hybride ou programme (cf gnie gntique) E - CONCLUSIONS La bactrie possde, gnralement, un seul chromosome circulaire de taille trs variable. Plusieurs espces bactriennes ont leur gnome squenc, mme Mycobacterium leprae. Il est possible de chercher de nouveaux gnes de virulence, de nouvelles cibles pour les antibiotiques : Naissance de la gnomique

Pour en savoir plus : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ Nouvelles mthodes de diagnostic telles FISH comme la recherche d'espces telles E. coli dans les aliments ou sur des cellules (cystites).......

clichs P.Grimont LES VARIATIONS BACTERIENNES Les progrs de l'analyse bactriologique et biochimique dmontrrent dans les annes 1920-1950, l'existence de variations chez les bactries:

aspect de la colonie dpigmentation de la culture perte de la capsule (virulence) chez le pneumocoque caractre de fermentation (lactose) croissance sur milieu minimum : mutant rverse his+ acquisition de la rsistance un antibiotique.......... clichs P.Grimont

L'analyse des caractres des variations bactriennes a permis leur individualisation en deux types: gnotypique et phnotypique

Haut DEFINITION DE LA VARIATION GENOTYPIQUE Il s'agit d'une modification spontane ou induite, discontinue, stable, rare, spcifique et enfin lie une modification du gnome bactrien (ADN). Ceci dfinit, en fait la mutation bactrienne dont les caractres spcifiques sont identiques ceux observs dans le rgne animal ou vgtal. C'est tort que l'opinion fut longtemps rpandue de l'existence d'une diffrence de nature entre les bactries (procaryote) et les autres organismes (eucaryote). CARACTERES * Spontane : l'antibiotique, par exemple, slectionne les rares formes variantes prexistantes dans une population bactrienne comme dans une tuberculose pulmonaire. * Induite : le caractre induit de la mutation bactrienne est bien connu lors de l'utilisation de rayonnements de type UV ou de substances chimiques comme des analogues de la guanine. Ces produits mutagnes sont dits gnotoxiques. * Discontinue ou brusque : elle apparait selon la loi du tout ou rien comme l'illustrent les exemples de variation ci-dessus illustrs. * Stable : le caractre acquis est alors transmissible la descendance, donc hrditaire.

* Rare : elle est mesurable par le taux de mutation qui est la probabilit pour une bactrie de muter pendant une unit de temps dfinie (souvent le temps de gnration). Il est caractristique d'un caractre donn, de l'ordre de 10-5 10-10, le taux moyen tant de l'ordre de 10-6. Il convient de savoir qu'il y a une corrlation avec la frquence de mutants ou proportion de mutants qui existe un moment donn dans une culture. Celle-ci est de dtermination aise. * Spcificit - Indpendance : la probabilit pour une bactrie de subir simultanment deux mutations distinctes est le produit des probabilits individuelles de ces mutations. Cette notion est d'importance, afin d'viter la slection d'un mutant rsistant, dans l'antibiothrapie, antituberculeuse par exemple. L'instauration d'une monothrapie est suivie de la slection d'une souche rsistante. En effet, une caverne volutive de 2 cm de diamtre peut contenir une population bacillaire de l'ordre de 108 bacilles tuberculeux. Si le taux mutation est de 10-5 pour l'isoniazide (INH) et de 10-7 pour la rifampicine (RIF), la probabilit d'isoler un double mutant rsistant INH-RIF est de 10-12. Une telle mergence sera vite par une antibiothrapie associant, au-moins deux antituberculeux. * modification de la structure du gne : unit de transmission hrditaire, entrainant quelquefois une modification de la structure primaire de la chaine polypeptidique correspondante. La mutation est une modification de l'ADN, donc de la squence dsoxyribonuclotidique. Divers types de mutation sont connues telles la modification d'une paire de nuclotides ou plus. Leurs effets sont variables: silencieux ou lthal. Certains aspects modernes de la modification de l'ADN sont lis des insertions de squence de type IS ou transposon (cf applications). CONCLUSIONS Il s'agit d'un mcanisme mineur d'volution bactrienne, car la probabilit d'obtention de mutants spontans est faible souvent sans avantage slectif pour la forme variante, l'exception de la rsistance aux antibiotiques, par exemple. La mutation peut tre associe un autre mcanisme (transformation) pour expliquer l'volution vers la rsistance du pneumocoque ou du mningocoque (cf transformation). En fait cette stabilit apparente des espces ne rsulte nullement d'une invulnrabilit du chromosome aux lsions mais de l'existence de dispositifs enzymatiques de maintenance par excision - rparation (systme SOS dont divers gnes dont recA et lexA.......).

VARIATION PHENOTYPIQUE Elle se dfinit comme l'adaptation rapide de l'ensemble de la population bactrienne ayant le mme gnotype diverses conditions extrieures, induite, rversible, non transmissible la descendance mais spcifique. Le mcanisme est en relation avec l'activit ou l'expression des gnes et la dcouverte de systmes de rgulation : . ngative avec les oprons inductibles (opron lactose). . positive avec les oprons rpressibles (opron tryptophane). Pour en savoir plus : http://www.blc.arizona.edu/courses/181gh/ Son intrt historique est considrable avec l'individualisation de divers gnes: rgulateur, promoteur, de structure, en particulier suite aux travaux de J. Monod.

Ce cours a t prpar par le Professeur A. PHILIPPON (Facult de Mdecine COCHIN-PORT-ROYAL, Universit PARIS V)(Janvier 2000)

Espace Etudiant Cours de Bactriologie Gnrale GENETIQUE BACTERIENNE IIDonc les bactries varient comme sur l'aspect des colonies, l'aptitude utiliser un substrat..........

La gntique bactrienne est ainsi la science de la variation. Est-elle aussi celle de l'hrdit, ne de croisement ou hybridation entre varits ou espces diffrentes ? Or les bactries sont haplodes............Nanmoins des possibilits existent TRANSFERTS DE MATERIEL GENETIQUE Objectifs d'aujourd'hui : Combien de types de transfert d'ADN existe-t-il chez les bactries ? Donner la dfinition de la transformation Donner la dfinition de la conjugaison Donner la dfinition de la transduction Pouvez-vous prciser leurs principales caractristiques ? Quelles ont t les consquences scientifiques de ces transferts ? Quelles sont les consquences mdicales de ces transferts ? A - INTRODUCTION La reproduction par scissiparit est bien monotome, mme pour une bactrie. Pourquoi ne pas envisager que les bactries aient leurs transports (cf dictionnaire Robert par exemple) !!!!!! Ceux-ci ont t initialement impliqus dans le processus d'adaptation des bactries leur environnement, en faisant intervenir des transferts d'ADN bactrien (1920-1965). Combien et quels sont-ils ? * la transformation * la conjugaison * la transduction

Ces transferts d'acide dsoxyribonuclique (ADN) bactrien doivent tre suivis de recombinaison gntique dite lgitime (s'il provient d'une mme espce ou d'une espce voisine). Dans d'autres circonstances, l'ADN peut ne pas se recombiner (cf plasmide). Ces transferts sont unidirectionnels, le plus souvent partiels (1 2 % du gnome transfr) et d'efficacit faible (frquence de recombinaison de l'ordre de 10-6). Pour en savoir plus : http://penguin.d.umn.edu/lectures/Hawley/genetrans/Gene.htm B - LA TRANSFORMATION BACTERIENNE Dfinition La transformation "naturelle" ou physiologique est le premier modle connu de transfert de matriel gntique lui-mme (ADN), qui est fix et absorb par des bactries rceptrices, dites en tat de comptence. Ce modle a permis de dmontrer que l'ADN tait le support chimique de l'hrdit en 1944. Historique

Pour en savoir plus : http://www.scisoc.org/opae/forty.htm

Pour en savoir plus : http://tidepool.st.usm.edu/crswr/transformation.html Les essais de transformation des pneumocoques R (colonie rough) en S (colonie Smooth) ont t finalement possibles en 1944 avec l'quipe d'Avery du Rockefeller Institute New York. Pour en savoir plus : http://www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Avery.html http://www.genethon.fr/projets/HistoireBM/HistoireBM.html#griffith.

Caractristiques D'une part, il doit y avoir de l'ADN libr d'une bactrie (exognote). D'autre part celui-ci doit tre fix sur une bactrie rceptrice en phase de comptence

Cette absorption d'ADN polymris est suivie d'une recombinaison gntique lgitime avec acquisition de nouveaux caractres gntiques stables, donc transmissibles la descendance dnomms recombinants ou transformants. Voulez-vous voir une animation: http://www.fda.gov/cvm/antiresistvideo.htm Ce transfert naturel d'ADN bactrien est limit quelques espces telles Streptococcus dont S. pneumoniae, Neisseria, Haemophilus..... Il est partiel : une partie de l'exognote (1-2% du gnome) pntre et se recombine (si homologie suffisante). Applications scientifiques * Ce mode de transfert a un grand intrt historique : L'ADN est bien le support chimique de l'hridit, et non les protines. * Il a permis l'tablissement des premires cartes gntiques partielles chez les bactries, et donc des tudes plus prcises sur la virulence, la rsistance aux antibiotiques........ * C'est une technique de base du gnie gntique, utilise quotidiennement dans les laboratoires lors de clonage. * Le concept de transfrer de l'ADN par simple contact a t dvelopp avec des ADN viraux dans les annes 65, d'o le terme de transfection. * La dcouverte ultrieure de la transformation "artificielle" a permis alors de transfrer divers ADN sous forme de chimre ou hydride comme un plasmide sur lequel sont clons des gnes bactriens, animaux ou humains des bactries non transformables naturellement comme E. coli. * Pour les espces non transformables, la technique d'lectroporation lie la "cration de pores" dans la paroi bactrienne lorsque des impulsions lectriques haute tension sont appliques lors de la culture a t propose par la suite. La dure et l'intensit de l'impulsion sont dfinir pour chaque espce. En bactriologie mdicale, son intrt est li l'mergence d'espces rsistantes aux antibiotiques comme le pneumocoque ou rcemment, le mningocoque. Cette mergence de la rsistance, la pnicilline G par exemple, a t lente depuis l'introduction des antibiotiques. En fait ce phnonme n'a t possible qu'aprs slection de mutants rsistants (streptocoques buccaux) lors d'antibiothrapie puis de transfert du ou des gnes de cette

rsistance par transformation naturelle l'espce pathogne potentielle en situation de portage.

Haut C - CONJUGAISON OU SEXUALITE BACTERIENNE Dfinition Processus sexuel strict qui ncessite un contact pralable et un appariemment entre bactries de sexe diffrent (htrothalliques) avec la formation d'un pont cytoplasmique permettant les changes bactriens dont celui du chromosome. Le facteur de sexualit ou de fertilit (F) permet la synthse de pilis sexuels chez la bactrie donatrice ou mle et donne la polarit au chomosome. Le transfert d'ADN chromosomique est sens unique, orient, progressif et quelquefois total (2 h). Historique

Pour en savoir plus : http://www.profiles.nlm.nih.gov/BB/Views/Exhibit/

J. LEDERBERG et E. TATUM en 1946 mlangrent dans un milieu liquide, 2 mutants polyauxotrophes d'E. coli K12: 108 T-L-M+B+ et 108 T+L+M-B(exigence en thronine, T- ; leucine, L- ; mthionine, M- et biotine B-). Aprs plusieurs heures de contact, l'talement de 108 bactries sur un milieu synthtique sans T, L, M et B est suivi, aprs incubation, de la croissance d'une centaine de colonies la surface du milieu. Ces clnes ainsi que leur descendance sont T+ L+ M+ B+. Il ne pouvait s'agir de mutants doublement rverses (probabilit de l'ordre de 10-14) mais de recombinants.

Caractristiques - Spcificit - Frquence : Le transfert d'ADN chromosomique suivi de recombinaison est spcifique (intra espces), mais limit, en particulier aux espces Gram ngatif telles E. coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa et aussi chez les Streptococcus. Par contre, ce mode de transfert d'information gntique est trs largement rencontr dans le monde bactrien lorsqu'il s'agit de transfert de plasmides conjugatifs (Tra+) porteurs ou non de transposons. La spcificit est, dans ce cas, variable selon le type de plasmides, certains ayant un large spectre (Inc P-1, par exemple). - Diffrenciation sexuelle : Le transfert d'ADN qui est sens unique ou orient (croisements fertiles (F) que dans un sens), met en vidence la diffrenciation sexuelle entre le donneur et le receveur. Elle porte sur la prsence du facteur sexuel, appel encore facteur de fertilit (F), donnant la polarit la bactrie donatrice ou mle (F+). Il s'agit du premier plasmide connu. Son potentiel d'information gntique (de l'ordre de 2 % de celui du chromosome bactrien) code pour la biosynthse d'appendices ou pili sexuels, pour son insertion possible au chromosome bactrien, pour la mobilisation ou le transfert partiel ou non de ce dernier dans la bactrie rceptrice (F-). La conjugaison est ainsi dnomme sexualit des bactries. - Contact ou appariement : Cette phase individualise ce mode de transfert. En effet, le transfert de gnes du donneur au receveur n'est possible qu'aprs la formation de paires ou couples de bactries donatrice-rceptrice. Le rle des pilis sexuels, flexibles ou non (2 3 par donneur) est essentiel, bien qu'incompltement lucid. Leurs extrmits spcifiques, repres par des bactriophages, reconnaissent des zones de contact la surface cellulaire des bactries rceptrices, s'y fixent et se rtractent. Cette rtraction des pilis sexuels a pour effet de rapprocher les deux bactries de sexe diffrent permettant un contact cellulaire troit (pont cytoplasmique de 100 300 m).

-Transfert de l'ADN chromosomique : La mobilisation du chromosome de la bactrie donatrice peut alors dbuter travers le pont cytoplasmique sous la forme monocatnaire (un des deux brins transmis). Ce transfert est sens unique, orient et progressif, quelquefois total, durant alors une centaine de minutes 37 C. Son interruption artificielle par agitation mcanique a permis l'analyse cintique. Un processus de rplication asymtrique restaure le brin monocatnaire non transfr du donneur au niveau d'un site rplicateur spcifique proche du pont cytoplasmique ou du pilus. Le processus ultrieur de recombinaison entre certaines rgions du brin monocatnaire exogne et celles de l'ADN receveur est mal connu. Voulez-vous voir une animation: http://www.fda.gov/cvm/antiresistvideo.htm - Caractres transfrs - frquence : N'importe quel gne bactrien peut tre transfr comme l'aptitude biosynthtiser un acide amin (thronine, leucine, srine)............ La frquence de recombinaison est faible, de l'ordre de 10-6. La slection de certains clones (HfrC, par exemple) montra la possibilit d'augmenter notoirement la frquence de recombinaison de certaines marqueurs jusqu' 10 -1. Conclusions : * Seul le mode de transfert d'ADN bactrien d'une cellule l'autre aprs contact (conjugaison) a permis : l'tablissement de cartes gntiques du chromosome bactrien (E. coli, P. aeruginosa) la circularit du chromosome

bactrien

la caractrisation des proprits remarquables du facteur F (plasmide = insertion au chromosome en des stes limits ou autonome). Le passage de l'tat intgr l'autre par excision peut entrainer la formation d'un plasmide F' (unit autonome de rplication et porteuse de gnes bactriens).

* La Sex-duction ou F-duction se dfinit par le transfert de F' une nouvelle cellule rceptrice (F-), suivi ou non de recombinaison lgitime (chromosomique). En l'absence de recombinaison, l'obtention de mrozygotes stables (diplodes partiels) aboutit la notion du gne, unit de fonction (gne rgulateur, promoteur, oprateur et structure) (JACOB et MONOD, 1961). * Ce mode de transfert d'information gntique est rencontr lors d'change d'ADN non chromosomique comme l'ADN plasmidique (plasmides conjugatifs). Il s'agit du principal facteur d'volution des bactries, en particulier pour l'acquisition de la rsistance aux antibiotiques. D - TRANSDUCTION Dfinition Il s'agit d'un transfert d'ADN bactrien partiel, par l'intermdiaire de bactriophages dont le rle est passif (vecteur). Il est dans ce cas, virulent donc se multiplier dans la bactrie. Lors de la phase d'encapsidation, il incorpore de l'ADN bactrien fragment. Historique

Pour en savoir plus : http://www.asmusa.org/mbrsrc/archive/SIGNIFICANT.htm#1956 En 1952, N. ZINDER et J. LEDERBERG tentent d'obtenir des recombinants aprs croisement de mutants auxotrophes de souches de Salmonella typhimurium (LA22, LA2) responsables de toxi-infections d'origine alimentaire. La frquence des recombinants histidine+ tryptophane+, de l'ordre de 10-6, n'est pas modifie lorsque les souches parentales, spares par un filtre en verre fritt, ne sont plus en contact (cf exprience de Davis). L'existence d'un agent filtrable, vecteur de l'information gntique est dmontre (bactriophage tempr produit par la souche parentale lysogne, LA 22).

Pour en savoir plus : http://www.zo.utexas.edu/faculty/sjasper/images/so23_02a.gif http://www.phage.org/tphage2.gif Caractristiques . INCIDENCE : Ce phnomne est en relation avec l'existence de nombreuses souches lysognes. Il est dcrit aussi bien chez les espces bactriennes Gram positif (Staphylocoques, Bacillus) qu' Gram ngatif (Entrobactries, Pseudomonas). . TYPES : Trois variantes conditionnent les autres caractres tels spcificit du ou des caractres transduits, frquence de transduction, recombinaison gntique ou non.

Ce transfert partiel de gnes bactriens peut s'accompagner d'une recombinaison lgitime (transduction gnralise) ou non (tr. abortive et quelquefois tr. spcialise). Pour en savoir plus : http://www.uark.edu/campus-resources/mivey/m4233/lyso.html

Voulez-vous voir une animation: http://www.fda.gov/cvm/antiresistvideo.htm Conclusions: * mode de transfert ayant un intrt historique (phage lambda et E. coli dans la transduction restreinte ou spcifique) * transfert en ADN bactrien ou plasmidique limit (taille du phage)( 90%, catgorie htroclite dont les espces naturellement rsistantes ou espces habituellement sensibles maisle pourcentage de rsistance est suprieur 90% ou encore l'espce est sensible in vitro mais rsistante cliniquement.

Haut Voici un exemple de SCA : rythromycine, antibiotique de la famille des macrolides

. espce habituellement sensible : S. pyogenes : CMI modale de 0,03 mg/l . espce modrment sensibles : H. influenzae : CMI modale de 4 mg/l) . espce insconstamment sensible : S. pneumoniae : CMI modale de 0,03 mg/l mais 30-40% de souches rsistantes en 2000 . espce rsistante : E. coli : CMI modale de 32 64 mg/l : rsistance naturelle incompatible avec un traitement D - CONCLUSIONS Demander un examen cyto-bactriologique avec antibiogramme est un acte quotidien, banalis, donc la prescription n'est pas toujours ncessaire, compte tenu de la quasi-certitude d'avoir une souche sensible aux antibiotiques. La corrlation clinique n'est pas toujours facile tablir entre les rsultats d'activit in vitro (CMI) et ceux obtenus in vivo (chez le patient). Malheureusement l'antibiogramme n'explore que partiellement l'activit in vitro d'un antibiotique (effet bactriostatique mesur par la CMI). Les autres caractristiques d'un antibiotique sont l'effet bactricide, l'effet postantibiotique (PAE) ou encore le phnomne de tolrance (cf polycopi).

Ce cours a t prpar par le Professeur A. PHILIPPON (Facult de Mdecine COCHIN-PORT-ROYAL, Universit PARIS V)

Espace Etudiant Cours de Bactriologie Gnrale ANTIBIOTIQUES III : RESISTANCE BACTERIENNEA - INTRODUCTION

http://www.frm.org/informez/info_ressources_dossiers_article_sommaire.php?id=7&type=10 La rsistance, en particulier acquise aux antibiotiques, bien qu'observe ds la dcouverte de la pnicilline G avec le staphylocoque dor est devenue un sujet de proccupation entrainant depuis trop peu de temps, une relle prise de conscience au plan national ou international. La mise en place de rseaux de surveillance comme en France l'ONERBA (http://www.onerba.org/) ou encore le rseau europen EARSS (http://www.earss.rivm.nl/) atteste de cette proccupation d'autant que la mise sur le march (AMM) de nouveaux antibiotiques est devenue parcimonieuse depuis plusieurs annes.

D'un point de vue clinique, seule est rellement essentielle, la rsistance clinique qui signifie chec du traitement. Si le terme de souche "rsistante" a dj t voqu dans les dfinitions de catgorie clinique et classe thrapeutique d'autres types de rsistance peuvent

voqus comme ci-dessous : naturelle (spectre troit des antibiotiques), acquise (mutation), chromosomique, plasmidique, croise, associe............. Objectifs d'aujourd'hui Quelles sont les principales caractristiques de la rsistance bactrienne ? Quelles dfinitions de la rsistance bactrienne pourriez-vous donner ? Quels sont les principaux mcanismes biochimiques que vous connaissez ? Quels sont les principaux mcanismes gntiques connus ? Pouvez-vous en donner des exemples ? B - PRINCIPALES CARACTRISTIQUES DE LA RSISTANCE BACTRIENNE : La rsistance bactrienne aux antibiotiques a souvent t rapporte ds l'usage d'un nouvel antibiotique en clinique comme indiqu ci-dessous pour les -lactamines, principale famille. La rsistance bactrienne est donc une fatalit mais d'importance variable selon le pays, l'espce bactrienne et l'antibiotique, victime de son succs. La rsistance bactrienne dite acquise prsente certaines caractristiques ci-dessous voques: - Emergence rapide de quelques souches rsistantes aprs l'introduction d'un antibiotique

- Frquence de ce nouveau mcanisme rapidement en augmentation mais variable selon l'antibiotique. L'mergence de la rsistance des pneumocoques la pnicilline G constitue une exception, puisqu'elle est apparue en France en 1984, alors que la pnicilline G a t utilise ds les annes 45. Ce dcalage, peu habituel, est en relation avec un dterminisme gntique plus complexe qu' l'accoutume (cf dterminisme gntique).

- Rsistance transfrable, car lie la prsence de gnes transfrables comme ceux intgrs dans un plasmide, un intgron ou plus rcemment avec l'individualisation de gnes cassettes (cf gntique IV). - Ces gnes transfrables peuvent avoir une diffusion pidmique au sein du monde bactrien comme celui-ci codant la -lactamase TEM identifie dans des souches de E. coli et de P. mirabilis, deux ans aprs l'introduction de la premire pnicilline large spectre, l'ampicilline.

- L'addition de mcanismes de rsistance est devenue monnaie courante dans le monde bactrien, aussi les bactries deviennent de plus en plus rsistantes, d'o l'appellation de BMR pour Bactrie MultiRsistante.

- Enfin diverses observations illustrent le potentiel volutif d'un gne de rsistance bactrien avec, comme exemple, la dcouverte dans les annes 85, des -lactamases spectre largi ou tendu (BLSE) et, quelques annes aprs, celles TRI/IRT, rsultats de mutations dans des positions diffrentes du gne codant pour l'enzyme prcdemment cite TEM-1 ou TEM-2

La rsistance acquise peut tre donc, modulable permettant au monde bactrien, une adaptation possible aux thrapeutiques, mmes les plus rcentes.

C - DEFINITIONS DE LA RESISTANCE * naturelle : Existence d'un ou plusieurs mcanismes de rsistance inns, donc propres l'espce. Elle permet de dfinir le spectre clinique d'un antibiotique. Exemple: rsistance en cocarde la colistine de Serratia marcescens

* acquise : acquisition d'un mcanisme de rsistance pour une souche d'une espce habituellement sensible

Exemple: rsistance acquise aux pnicillines (amoxicilline ou AMX) et ticarcilline ou TIC) chez E. coli ( droite souche sauvage)

* clinique : expression de la rsistance in vivo par l'chec thrapeutique Exemple: rsistance clinique la pipracilline (PIP) lors de pneumopathie Klebsiella pneumoniae de phnotype "pnicillinase de bas niveau", rsistante l'amoxicilline (AMX) et la ticarcilline (TIC)

* croise : fait rfrence au spectre d'inactivation li un mme mcanisme de rsistance vis--vis de divers antibiotiques appartenant la mme famille ou sousgroupe. Cette notion est utilise lors de lecture interprtative de l'antibiograme. Exemple: consulter le communiqu du CA-SFM (http://www.sfm.asso.fr/nouv/general.php?pa=2)

* chromosomique : rsistance lie au chromosome. Il s'agit aussi d'expliquer le dterminisme gntique d'une rsistance naturelle ou acquise dont le ou les gnes est ou sont lis au chromosome (mutation)

* gntique : modification du patrimoine gntique entranant des augmentations limites de CMI (X 3-5), souvent peu apparente De lgres modifications du patrimoine gntique d'une bactrie peuvent entraner une moindre sensibilit un antibiotique ou plusieurs de la mme famille ou de plusieurs selon le mcanisme. Celles-ci sont rvles lors de la dtermination de CMI ou par une diminution des diamtres d'inhibition dans un antibiogramme par diffusion (mthode des disques)(cf antibiotique IV). L'chec clinique n'est pas rapport pour de telles souches de sensibilit diminue.

Exemple: E. coli et impermabilit par rapport aux quinolones (NA, acide nalidixique)

* extrachromosomique : La rsistance est lie la prsence d'un fragment d'ADN, le plus souvent en position cytoplasmique tel un ADN plasmidique rvl aprs une lectrophorre sur gel (cf plasmide ci-dessous):

* associe : rsistance mdie par un plasmide des antibiotiques de familles diffrentes (cf rsistance plasmidique transposable)(cf gntique IV) Exemple : Chez P. aeruginosa, le plasmide (montr ci-dessous) est responsable de plusieurs marqueurs de rsistance aux antibiotiques mais aussi aux antiseptiques (mercure) ou encore au tellurite.

* plasmidique: support gntique de la rsistance (cf extrachromosomique ci-dessus et cours Gntique III). Exemple: Contenu plasmidique d 'une souche de P. aeruginosa ( gauche) et de E. coli rceptrice avant ( droite) et aprs transfert (au milieu) par conjugaison. Le plasmide de plus de 150 kD confre la rsistance plusieurs familles d'antibiotiques ou encore aux antiseptiques..........

* transposable : localise sur des transposons (Tn) ou lments gntiques mobiles, situs soit dans le chromosome, soit sur un plasmide. Exemple: Mobilisation d'un transposon (Tn) d'une bactrie donatrice gauche une rceptrice par conjugaison (schma selon Poyart C.) .

D - MECHANISMES BIOCHIMIQUES : Prciser le dterminisme biochimique de la rsistance amne comprendre la rsistance croise entre antibiotiques de la mme famille ou encore imaginer de nouvelles molcules plus actives, car plus hydrophiles, donc ayant une meilleure diffusion travers les porines chez une bactrie Gram-ngatif ou une meilleure affinit sur ses cibles telles certaines protines du ribosome (macrolides). A l'inverse, le mode d'action des antibiotiques peut permettre une meilleure comprhension des mcanismes de rsistance possibles. Depuis quelques annes, cinq mcanismes peuvent tre envisags pour expliquer la rsistance naturelle ou surtout acquise des bactries aux antibiotiques.

Prenons l'exemple des -lactamines chez un bacille Gram-ngatif, qui pour agir, doivent traverser la membrane externe ou la paroi au niveau des porines (motif en bleu), puis traverser l'espace cytoplasmique et enfin se fixer sur des cibles ou protines liant la pnicilline (PLP ou PBPs en marron) qui sont situes principalement au niveau de la membrane cytoplasmique. Cette fixation amne une inhibition de celles-ci (transpeptidase, transglycosylase....) entranant des modifications morphologiques de type filaments (cf ci-dessous) ou au contraire formes sphrodes. Le rsultat final est une inhibition de la synthse du peptidoglycane (couche interne de la paroi en rose ici) avec quelquefois, une lyse finale.

Exemple: modification morphologique ( droite) d'une souche de E. coli urinaire lors d'un traitement par une pnicillline large spectre.

Les mcanismes de rsistance individualiss l'heure actuelle, en prenant comme exemple les -lactamines, sont donc, les suivants:

* Interfrence avec le mcanisme de transport de type impermabilit Les porines (Omp ou Opr) sont des canaux aqueux ou hydrophiles constitus de trois molcules de protines qui laissent diffuser diverses molcules de faible masse molculaire comme des substrats ou encore des antibiotiques. Le dysfonctionnement ou la perte de l'une d'entre elles peut entrainer une augmentation de CMI d'un facteur 4 8 de divers antibiotiques comme lactamines, acide nalidixique (NA), trimthoprime (TMP), fosfomycine, ttracycline (TE) ou encore chloramphnicol (C) (Exemple ci-dessous). Chez d'autres entrobactries telle Enterobacter cloacae ou E. aerogenes, la perte d'une porine (38 kD) associe une hyperproduction de la -lactamase chromosomique de type cphalosporinase permet l'acquisition de la rsistance aux carbapnmes tel imipnme. Exemple d'une souche de E. coli impermable

* Interfrence avec le mcanisme de transport de type efflux

Les mcanismes d'efflux observs chez les bactries Grampositif ou Gram-ngatif, en particulier P. aeruginosa sont de nature diffrente ( famille MFS, SNR, RDN....), en particulier l'origine chez cette dernire espce o ont t individualiss les systmes ayant des rpercutions variables en termes de CMI vis--vis de divers antibiotiques dont les -lactamines avec les protines MexA-B/OprM, MexCD/OprJ, MexE-F/OprN.................. Voulez-vous voir une animation: http://www.fda.gov/cvm/antiresistvideo.htm

Exemple d'activation du systme d'efflux MexA-B/OprM chez P.aeruginosa avec la sensibilit diminue la ticarcilline (TIC) associe ou non l'acide clavulanique (TCC) compare celle de la pipracilline (PIP)

* Inactivation ou dtoxification enzymatique Le mcanisme de rsistance naturelle ou acquise par inactivation ou dtoxification enzymatique est important et trs vari ainsi qu'en tmoignent tout particulirement, les lactamases, au moins 350 enzymes maintenant identifies. La rsistance par ce type de mcanisme d'autres familles d'antibiotiques est bien connue comme pour les aminoglycosides avec les enzymes de AAC, ANT et APH (cf tableau ci-dessous). Voulez-vous voir une animation: http://www.fda.gov/cvm/antiresistvideo.htm Exemple de phnotype" cphalosporinase inductible" chez une souche d'entrobactrie

Le caractre "inductible" est rprable par un antagonisme ou perte d'activit lie l'hyperproduction de la -lactamase entre CF (cfalotine) et FOX (cfoxitine) mais surtout entre IPM (imipnme) et CTX (cfotaxime) ou ATM (aztronam).

* Modification d'affinit de la cible Ce mcanisme est en relation avec une modification d'affinit d'une ou plusieurs cibles de type PLP ou PBP (Penicillin Binding Protein) comme chez Streptococcus pneumoniae dfinissant une rsistance de niveau variable : BNR (bas niveau de rsistance) et HNR (haut niveau de rsistance). La rsistance des entrocoques aux pnicillines telle l'ampicilline peut tre en relation avec une hyperproduction de PLP d'affinit mdiocre telle PLP5. La rsistance d'autres familles d'antibiotiques est indique dans un tableau de synthse rapport ci-dessous. Exemple de diminution de CMI de la pnicilline G (PG) et du cfotaxime (TX) mesures par le E-test chez une souche de S. pneumoniae BNR

* Substitution de cible

Ce mcanisme est de moindre importance dans le monde bactrien. Cependant, l'exemple majeur est la rsistance intrinsque ou mticillino-rsistance de Staphylococcus aureus qui est lie d'une part, la prsence d'une nouvelle PLP de faible affinit, dnomme PLP2a et d'autre part son hyperproduction. La consquence clinique est importante, car il y aura rsistance croise entre -lactamines.

Le tableau ci-dessous rsume divers exemples de rsistance naturelle ou acquise diverses familles d'antibiotiques : Mcanismes Famille d'antibiotique Protines impliques Omp, Opr telle OprD2 Mex, Mar, AcrAB-TolC MFS (MefA), MsrA, ABC LsA TET(A)-(L) -Lactamases (> 350) Phosphotransfrases (APH) Nuclotidyltransfrases (ANT) Actyltransfrases (AAC) Phosphotransfrases (mphA-C) Nuclotidyltransfrases (linA, lnuA, linB....) Actyltransfrases (vatA-E), lyases (vgbA) Actyltransfrases (CAT) Protines L22........... Mthylases (Erm) Topoisomrases: ADNgyraseA/B, ParC/E TET(M)-(T) PLP2a Van DHFR (dihydrofolate rductase) DHPS (dihydroptroate synthtase)

Impermabilit B-lactamines, macrolides, ttracy-clines, quinolones, fosfomycine, chloramphnicol......... Efflux -Lactamines Macrolides Lincosamides Ttracyclines -Lactamines Aminoglycosides Aminoglycosides Aminoglycosides Macrolides Lincosamides Streptogramines Chloramphnicol Affinit Aminoglycosides Macrolides QuinolonesFluoroquinolones Ttracyclines -Lactamines Glycopeptides Sulfamides Trimthoprime

Inactivation

Substitution

E - MECANISMES GENETIQUES (cf Gntique I et III) :

Le dterminisme gntique de la rsistance naturelle et acquise est de mieux en mieux connu mais il prsente de nombreux aspects comme dj voqu par les dfinitions de la rsistance : chromosomique, extra-chromosomique ou plasmidique mais aussi transposable..... Pour plus de dtails, consulter les cours de Gntique I, II, III, IV et V. - Si la mutation (cours de Gntique I) peut affecter n'importe quel ADN (chromosomique ou plasmidique), elle peut tre individualise soit au niveau du gne de rgulation ou un quivalent (promoteur) soit au niveau du gne de structure par exemple codant pour une -lactamase (voir ci-dessous les enzymes de type BLSE et TRI/IRT).La modification de l'ADN peut tre soit un simple changement de base (mutation ponctuelle) soit de plusieurs (dletion, insertion comme d'une courte squence ou IS). Voulez-vous voir une animation: http://www.fda.gov/cvm/antiresistvideo.htm - L'acquisition d'ADN donc d'ventuels gnes de rsistance s'effectue, le plus souvent par conjugaison ou sexualit bactrienne (cours de Gntique II). Ces gnes sont ports sur diverses structures de type plasmide, intgron et gne cassette (cours de Gntique III et IV). Les analyses de squences actuelles conduisent la dcouverte de nouveaux aspects gntiques sur la rsistance avec les CR et leurs probables recombinases. Le tableau ci-dessous illustre par quelques exemples :

- Il est classique de dire que la rsistance chromosomique est d'incidence faible, de l'ordre de 10 20% alors que la rsistance plasmidique est beaucoup plus importante, de l'ordre de incidence de 80%

F - CONCLUSIONS A partir des annes 1945, les antibiotiques ont rvolutionn nos pratiques mdicales, mais ils sont aujourd'hui en danger suite une utilisation excessive et trop frquente, mme en dehors du domaine purement mdical. Les bactries changent divers gnes dont ceux de la rsistance et chappent l'action des antibiotiques. Comme la dcouverte de nouveaux antibiotiques est devenue trs hypothtique, il convient de mettre en oeuvre au plan plantaire, diverses stratgies comme la surveillance de la rsistance avec en France, l'ONERBA et au plan europen, l'EARSS. Il conviendra de resteindre l'usage des antibiotiques leur strict ncessaire. Des campagnes de sensibilisation auprs des patients seront entreprises comme maintenant en France ou dans d'autres pays.

Parmi les autres mesures, il conviendra au niveau de l'hpital, de surveiller l'mergence de souches multirsistances (BMR)(cration des CLIN, comit de lutte contre l'infection nosocomiale), mesures d'isolement des malades......... Il conviendra aussi de respecter rigoureusement les rgles d'hygine comme l'application de protocoles concernant la pose de cathter ou la dsinfection des endoscopes............

Resteindre leur usage comme activateurs de la croissance dans l'alimentation animale.

Espace Etudiant Cours de Bactriologie Gnrale ANTIBIOTIQUES IV : ETUDES IN VITRO, L'ANTIBIOGRAMMEA - INTRODUCTION Il n'est pas toujours ncessaire de rechercher la sensibilit d'une bactrie un antibiotique. Car ce type de traitement est bien standardis dans certaines infections et les espces bactriennes impliques sont restes toujours sensibles cet ou ces antibiotiques: classe thrapeutique "habituellement sensible" et "modrment sensible". Malheureusement certaines espces bactriennes peuvent s'adapter plus rapidement aux antibiotiques (rsistance acquise) et donc, tre classes en "inconstamment sensible" tel ou tel antibiotique, ce qui ncessitera d'effectuer au laboratoire, un antibiogramme. La rsistance acquise des bactries a toujours t proccupante et a justifi de prciser des rgles de prescription. Objectifs d'aujourd'hui Est-il toujours ncessaire de demander un antibiogramme ? Quelle dfinition de l'antibiogramme pourriez-vous donner ? Etes-vous capable de dfinir la CMI ? Pouvez-vous dcrire succintement les diverses mthodes de dtermination de la CMI ? Comment partant d'un diamtre d'inhibition autour d'un disque d'antibiotique, peut-on obtenir la CMI ? Comment partir de la CMI, peut-on catgoriser en S, I, ou R ? B - DFINITION DE L'ANTIBIOGRAMME : C'est la dtermination de la sensibilit d'une bactrie aux antibiotiques. Terme contract par analogie avec l'hmogramme. Examen quotidien de laboratoire, en particulier hospitalier pas toujours ncessaire (cf classes thrapeutiques) C - INTRT DE L'ANTIBIOGRAMME Cet examen de routine va permettre de comparer la valeur de