Bases microbiologiques pour les cliniciensDr Joaquim MATEO

Département d’Anesthésie Réanimation SMUR

Hôpital Lariboisière, Paris

Joaquim.mateo@lrb.aphp.fr

Microbiologie clinique ORIENTATION DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE

– LIEN OBLIGATOIRE AVEC LE LABORATOIRE

– Compétence

– Alerte

– Equipement, médecins, recherche

– Responsabilité conjointe

– partenariat INTERET MAJEUR

– Structure de la bactérie / implications cliniques

– Diagnostic en microbiologie clinique

– Traitement antibiotique

– Résistance aux antibiotiques

– Dosage d’antibiotique ECOLOGIE ET EPIDEMIOLOGIE BACTERIENNE EN

REANIMATION

Pathologie infectieuse et anesthésie réanimation

Pathologie omniprésente– Chirurgie septique, choc septique– Complications chirurgicales postopératoires– Médical

Environnement– Antibioprophylaxie– Infection nosocomiale– hygiène

Qualité : paramètre d’évaluation

Antibiothérapie : contrôle et coûtÉcologie bactérienne à l’hôpitalTransmission des bactéries multirésistantesTaux d’infections nosocomiales« AAA »

Intérêt du diagnostic précis et du traitement précoce et adapté des

infections en réanimation

Pourquoi connaître la microbiologie ?

Diagnostic et orientation thérapeutique

Bases microbiologique : la bactérie

Plus de bactéries que de cellules dans l’organisme humains

Virus, champignons, parasites, prions

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

bactérie virus champignons parasites prions

%

Table 3–4. Known and Estimated Numbers of Biologic Species.1

 

Group Known Species

Estimated Total Species

Percentage of Known Species

Viruses 5,000 130,000 4%

Bacteria 4,760 40,000 12%

Fungi 69,000 1,500,000 5%

Algae 40,000 60,000 67%

Protozoa 30,800 100,000 31%

Structure des bactéries

La paroi

Toutes sauf mycoplasme structure constante la plus externe Intégrité indispensable a la survie 2 types

– Paroi épaisse et dense : peptidoglycane ( chaine glucidique reliées entre elles par des peptides)

– Paroi fine et lâche• Peptidoglycane• Membrane externe : lipides ( phospholipides et

lipopolysaccharide ) (Mb cellulaire)• Espace périplasmique (penicillinase)

Paroi fine

Paroi épaisse

Paroi externe

Paroi : implications cliniques

Identification GRAMAntigeneLPSMultiplication \ BactéricidieEffluxPorine

Fonction de la membranePermeabilité et Transport

– Diffusion – Binding Protein-Dependent Transport – Chemiosmotic-Driven Transport – Chemotactic Systems

Membrane externe– bilayered structure; – lipopolysaccharide (LPS)– antigénémie antigène O

Cible des antibiotiques

Mort si Mb altérée

porine

IDENTIFICATION

Coloration de GRAM

Distingue les bactéries à parois épaisse et fineFixation des bactéries sur lameColoration violet de gentianeMordance à la solution de LugolLavage à l’alcool

– Décoloration des parois fines

– Parois épaisses restent violette

Surcolore par de la Fushine

GRAM - GRAM +

Klebsiella pneumonia

BGN

CG+amas

Poils•Pili communs

•courts, cassants•Adhésion donc virulence•Protéines : la piline•Antigénémie•Déplacement \ mobilité

•Pili sexuels•Relient 2 bactéries •Échange de matériel génétique•Détermine le sexe

Les pili

La mobilité

Examen direct , état frais InvasivitéColonisation du materiel (KT,SU…)Certaines bactéries sont très mobilesLeur déplacement est caractéristique

ORIENTATION DIAGNOSTIQUE

Exemples

pyo coli

KP

Le matériel nucléaire

• Pas de noyau• Chromosome unique, circulaire• Un filament hélicoidal d’ADN bicaténaire• 4 bases A-T-G-C• Support des information transmises aux ribosomes pour les synthèses• Cible des quinolones

Eléments circulaires : • matériel génétique extra-chromosomique• ADN• Autonomes• Se réplique indépendamment du chromosome• Synthèse protéique• Utilisation de substrat• Résistance aux antibiotiques

Transmissibles à d’autres bactéries (BLSE)

Transmission horizontale

Les plasmides

la spore

• Conditions défavorables de survie (bacilles Gram + : Bacillus et

Clostridium) formation de spores Sporulation.• Conditions favorables bactéries végétatives

Germination.

La spore contient, sous forme condensée, • le génome • une partie du cytoplasme déshydraté • autour d'une enveloppe très résistante.

forme de résistance des bactéries contaminations d'origine tellurique (tétanos, charbon, C difficile).

Sporulation

Très résistant– Sporicide– désinfection

ManuportéeeAéroportéeRésiste au solutions hydro-alccolique

•BactériostatiqueInhibition de la multiplication bactérienne

•Bactéricide Mort de la bactérie, dissolution, ne peut plus se reproduire, IRREVERSIBLE

•StérilisationProcessus physique ou chimique qui détruit complètement toute bactéries vivante SPORES inclues

•DésinfectantsProduits capables de tuer les microorganismes sur des objets ou des surfaces inertes. Les désinfectants sont sporostatiques mais pas obligatoirement sporicides.

•SepticCaractérise la présence de bactéries vivantes dans les tissus humains.

•AntisepticDestruction ou blocage de la multiplication des microorganismes dans des tissus vivants.

•Asepticabsence de microorganismes pathogènes.

•Preservation (conservateur)Prévenir la multiplication des microorganismes dans des produits pharmaceutiques ou l’alimentation.

.

Clostridium Difficile & Diarrheal DiseasePseudomembranous Colitis

« difficile »

Anaérobie, sporuléSpores : sols, hôpitaux…La forme active de la bactérie : intestinGerme G+, la spore G-COMMENSALTransmission féco-orale2 toxines A et B

– Enterotoxine : perméabilté– Cytotxine : ç épithéliale

• Temps transit• absorption

Diarrhée

Infections à anaérobies La majorité des bactéries de la flore humaine normale sont anaérobies. Leur présence en dehors des sites habituelles (tissus,espaces anatomiques)

entraine une infection. Caractéristiques

– (1) Toujours en continuité avec une muqueuse– (2) souvent plurimicrobienne. – (3) tendance a former des espaces clos comme des abcès

(poumons,cerveau,plèvre,péritoine,pelvis) et a creuser les couches de tissus.

– (4) Pus est extrèmement malodorant. – (5) Sensible à la penicilline sauf Bactéroides et prevotella. – (6) favoriser par la baisse du débit sanguin localement , tissu nécrotique,

pas de diffusion des ATB.– (7) Milieux de transport spéciaux, méthode de culture adaptées.

Diagnostic difficile et souvent pas de mise en évidence

PORINE Membrane externe

Permet la diffusion passive des composés hydrophyles de bas poids moléculaire– Sucres– Acides aminés– Ions

Pénétration lente des “gros” antibiotiques

Modification des porines \ résistance

PLP

Imperméabilité au Tienam chez Pseudomonas aeruginosa

Efflux

La multiplication bactérienne

The Meaning of Growth Table 4–2. Phases of Microbial Growth Curve. 

Section of Curve Phase Growth Rate

A Lag Zero

B Acceleration Increasing

C Exponential Constant

D Retardation Decreasing

E Maximum stationary Zero

F Decline Negative (death)

La paroi et la multiplication

PLP

PLP

2 ÉlongationPLPe

3 SeptalisationPLPs

bactérie

ÉlongationPLPe

Filament pas de PLPs

Sphéroblaste pas de PLPe

SeptalisationPLPs

Implication pour le clinicien

“Temps dépendance”– ATB bloque la synthèse du peptidoglycane

– n’agit que si la bactérie qui se multiplie

– Le taux efficace doit être constant

– Admisnistration répétées ou perfusion continue

“Dose dépendance”– Mècanisme de bactéricidie indépendant de la division

– Synthèse protéique (ribosome, ADN)

– Bolus , dose élevée

Lipopolysaccharides of Gram-Negative Bacteria

LPS, EndotoxineBase de la physiopathologie septiqueDéclenchement de la réaction

inflammatoireConstituant de la paroi externe de tous les

BGNLibération lors de la lyse de la bactérie

Le LPS : composant essentiel de la membrane Le LPS : composant essentiel de la membrane externe des BGNexterne des BGN

Alexander , J Endotox Res 2001

Paroi d’un BGN

1

1 0

1 0 0

1 0 0 0

1 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0

C U L T U R E

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

L P S (U /m l)

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

T N F (b io s s a y )

R a b b it m o d e l ; E co li 1 0 7 C F U IVH yp oten s ion occu rred in ab s en c eof an y resu sc ita tion .

Q u a n tita tiv e B C sh ow ed a rap idd ec rea se n u m b er o f b lo od [ b ac teria ] L P S w as rap id ly re lea sed w ith in m inan d rem a in ed a t low lev el th erea fte r. S IR S is a cco m p an ied b y T N F re lea seth a t p eak ed a t 6 0 m in .

= = > r a p id c le a r a n ce o f b a cter ia w ith“ im m ed ia te” re lea se o f L P S , h a v in g a lsoa ra p id c lea ra n ce .

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

1 1 0

3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0

B P

2 0 0

2 2 0

2 4 0

2 6 0

2 8 0

3 0 0

3 2 0

3 4 0

3 6 0

3 8 0

4 0 0

H R

3 9

4 0

4 1

4 2

T °

m m H g B P M

°C

DOSAGE DU LPS

Endotoxin Activity Assay

Spectral diagnostics

Structure du LPS

Chaîne O-terminale

Jusqu’à 50 unités oligosaccharidiques répétées,

formées de 2 à 8 monosaccharides.

Haute variabilité donc spécifiques d’espèce et de de souche.

Donne lieu à la classification sérologique des bactéries

sauvages.

Lipide AStructure relativement

conservée entre les espèces.

Disaccharide central, 2 groupements phosphate, 6

groupements acyl.Responsable de l’activité

endotoxique du LPS.

Intérêt d’un dosage du LPS

Nombreux arguments impliquant le LPS dans la physiopathologie du sepsis:

– LPS est un des plus puissants immunostimulants connus parmi les composants de la paroi bactérienne

– LPS in vitro sur des cellules immunitaires induit la modification de l’expression de + de 300 gènes

– LPS in vitro sur des cellules immunitaires induit la production des cytokines impliquées dans la physiopathologie du sepsis

– LPS iv reproduit la plupart des manifestations observées au cours du sepsis (fièvre, frissons, hyperleucocytose, thrombopénie, coagulopathie,…)

– Absence de LBP, CD14 ouTLR4 chez l’animal, qui sont impliqués dans la reconnaissance du LPS, les protègent contre un choc septique par des BGN

Dosage du LPS par le LAL en clinique

Pathologies non septiques :– Cirrhose, transplantation hépatique, hépatite, pancréatite :

nombreuses études +, gradient porto-systémique en LPS– Choc hémorragique– Chirurgie cardiaque ou vasculaire – Coureurs de marathon nauséeux …

Translocation à partir du TD Pathologies septiques :

– LPS + dans 20-40% des cas de sepsis– LPS + dans 20-55% des sepsis à BGN qqsoit site– LPS + dans 53-79% des bactériémies à BGN– Mais LPS également + dans 10-50% des bactériémies à CGP– Se = 50-55% , VPP = 40-50% pour bactériémie à BGN (Hurley, J Clin

Microbiol 1994, Meta-analyse) Corrélation à l’outcome :

– OUI dans la méningococcémie ou bactériémies à BGN (OR 6.3)– PAS de corrélation sinon

Patients à investiguer

Sepsis qq soit germeEtat de choc non septique avec ischémie

reperfusion (cardiogénique, hémorragique) : translocation

Valider le diagnostic de choc septiqueHomogénéiser les patients dans les protocoles

! Prix d’un dosage = 25 euros

Les délais

Examen direct

TransportAcheminementTechnique

< 1 heure

Examen macro

5 min

Etat frais examen direct

PNN, cellulesBactéries, champignonsmobilité

GRAM

KP

CG+amas

Cg+chaînette

amas

Bg+clostridium

coryne

actinomycete

aspergillus

cholera

candida

acineto

ALA test Haemophilus influenzae \ H parainfluenzae

Bacitracin (A) disk group A β-hemolytic streptococci,

Bile solubility pneumococci (lysé par la bile)

Catalase staphylococci [catalase +], streptococci [catalase -]).

Coagulase Staphylococcus aureus C+, S. epidermidis C-

Indole Escherichia coli indol +

Optochin identification of Streptococcus pneumoniae.

OxidaseEnterobacteries : oxidase negativePseudomonas : oxidase positive

PYR hydrolysisStreptococcus pyogenes, Enterococcus sp.,

ECBU E. coli 2 heures

E. coli 24 heures

antibiogramme

GRAM

ATBgramme

48 heures

men

men

men

pyo

pyo

oxydase

ATBgramme pyo

pneumo

pneum

pneu

KPhc

kp

kp

staph

staph

staph

listeria

Pathogénécité

“agent pathogène”– Endotoxine– Exotoxine

Comment et pourquoi un germe de la flore normale (commensale) devient pathogène ?

Les conditions de réanimation– Actes invasifs– Intervention, inflammation– ATB– Rupture des barrières– Altération de l’équilibre des flores

Habitat habituel des BGN

Tube digestif Peau Pli Muqueuses

E. coli normal ± ± +

KES normal — — +

Citrobacter sp. normal — — +

Proteus sp. normal — ± +

Salmonella sp. anormal — — —

Yersinia sp. anormal — — —

Acinetobacter sp. normal ± — ±

Ecologie hospitalière des bacillesà Gram négatif (présence possible) (1)

mains peau peau plis muqueuses saine lésée macération saines

E. coli — ± ± + +

KES — — ± ± +

Proteus sp. ± ± + + +

Acinetobacter sp. + + + + ±

Ecologie hospitalière des bacillesà Gram négatif (présence possible) (2)

muqueuse eau dispositifs surface désinfectants lésée médicaux paillasse savon

E. coli + ± + ± —

KES + + ± ± ++

Proteus sp. + — — ± —

Acinetobacter sp. + ± + — ++

Colonisation / infection

Seuil > 10 5 CFU/ g de tissus ou mL

De liquide normalement stérileChangement de flore cutanée

– Vêtements– Douche , toilettes …

EnvironnementFaute d’hygiène

Identifier la bactérie responsable de l’infection Symbiose

– La bactérie s’adapte à son envirronnement incluant les animaux et les humains ou elle réside et subsiste normallement.

– La bactérie assure sa survie et se reproduit assurant sa descendance.

Colonisation– micro-organismes “résident” sont en majorité inoffensifs– Essentiels pour l’homme

• photosynthesis, • production de vitamines dans l’intestin • decomposition de la matière organique. Les vrais “recycleurs” de notre planète

Pathogenicité

– infection accidentelle à partir de bactéries qui infectent les animaux Salmonelle et campylobacter sont transmis par la nourriture.

– Yersinia pestis, la peste– Bacillus anthracis (anthrax) viande crue et poils d’animal infecté.

– Clostridium species ubiquitaire de l’envirronnement transmis par ingestion ou contact, C perfringens gangrene gazeuse gastroenteritis and C botulinum [botulism]) C tetani

Pathogénicité Escherichia coli flore normale ,intestin de

l’homme mais aussi le germe responsable d’infections urinaires, diarrhée du touriste et d’autre infections.

Pourquoi cette souche est pathogène ?. – La virulence de cette souche est retrouvée chez l’animal– L’infection est reproductible in vitro– Génétiquement cette bactérie possède un marqueur

associé au déclenchement de l’infection.

pseudomonas species, Stenotrophomonas maltophilia, et la majorité des levures ne provoquent des infections que chez les patients immunodépprimés ou débilités Opportunistes

Processus Infectieux : le pneumocoque– Cultivé à partir du nasopharynx de 5 à 40 %

des sujets sains– Passage dans les poumons

• Coma

• Abolition des reflexes…

– Multiplication dans les alvéoles• Pas d’anticorps contre la capsule

polysaccharridique de cette souche

– Passage dans les lymphatiques et le sang• Pneumopathie

• Méningite

• Endocardite

• Arthrite….

Postulat de Koch

L’agent responsable d’une maladie doit répondre au postulat de Koch– agent présent chez tous les individus présentant la

pathologie– Agent pouvant être cultivé– Agent qui lorsqu’il est introduit chez l’hôte ou dans un

modèle s’en rapprochant induit le développement de la pathologie

– Possibilité de réisoler l’agent à partir d’un animal présentant la pathologie

ExotoxinesProduites par les G+ et les G-C. diphtheria

– Muqueuses ORL et plaies cutanés– Bactériophage– diphtérie

C tetani, C botulinum– Sol , eau, multiplication si anaérobiose– Toxine absorbé par l’intestin– Membrane pré synaptique des motoneurones des nerfs

périphériques et nerfs crâniens– Inhibe la libération de l’acetylcholine– paralysie

Exotoxines

C perfringens– Alpha toxin , lécithinase, collagénase, DNAse– Destruction des membranes

S aureus– TSST 1, toxic shock syndrom

Streptocoque β hémolytique A– Pyrogenic exotoxin A– Super antigène– scarlatine

Exotoxines associées aux diarhée et aux intoxications alimentaires V cholerae

– pénétration par voie digestive

– Se fixe aux microvillosités

– 2 sérotypes : O1 et O139

– Production de la toxine

S aureus

– enterotoxines déja présentes dans l’alimentation – 6 types d’enterotoxine de staphylocoque

Y enterocolitica

Vibrio parahaemolyticus

Aeromonas species,

C perfringens

Activité antimicrobienne in vitro

AntibiogrammeDosage des antibiotiques (sang,

tissus)

Définition de la résistanceCA - SFM

Sensible (S) : probabilité acceptable de succès thérapeutique si traitement par voie générale à dose habituelle (CMI<<<C° sérique

Résistant (R) : forte probabilité d’échec thérapeutique quel que soit le type de traitement (CMI >>> C° sérique)

Intermédiaire (I) : succès imprévisible (CMI proche C° sérique)

Résistance naturelle

Caractéristique propre à une espèce bactérienne

Partagée par toutes les souches normales de cette espèce

Définit le phénotype sauvage ou sensible de cette espèce

Référence pour établir le spectre d’activité des ATB (espèces habituellement sensible)

Résistance acquise

Caractéristique de certaines souches au sein d’une espèce bactérienne

Résulte d’une modification génétique– Mutation– Acquisition de matériel génétique étranger

Définit des phénotypes résistantsFréquence prise en compte dans la nouvelle

nomenclature du CA-SFM (espèces inconstamment sensibles)

Comité de l’antibiogramme

Antibiogramme : méthodes, doses …Données pharmacocinétiquesDiamètre en fonction

– Milieu de culture– Conditions de culture– Disque et C°– espèce

Supports de la résistance

Chromosomique– Stable

– Transmission verticale (descendance)

– Épidémie de souches

Plasmidique– Instable(cure si pas de pression de sélection)

– Transmission verticale

– Transmission horizontale

– Épidémie de souches ou du support lui-même

La résitance bactérienne pour les cliniciens

Il suffit de le savoir !!!!!!!!!Orientation diagnostiqueTerrain Infections hospitalièresAntibiothérapie préalable

L’antibiothérapie initiale doit tenir compte d’une potentielle résistance bactèrienne

Adapter au bout de 48 heures

Acquisition de résistance

mutants résistants– Mutant : augmentation de la CMI

– Apparition d’un mécanisme de résistance

– Modification de la séquence nucléotidique du gène responsable

La sélection– Mutant présent dans la population sensible

– L’antibiotique permet la sélection de ces mutants

Facteurs favorisant la sélection

La bactérie– Nombre d’étape mutationnelle– Proportion élevée de mutants– Bas niveau de résistance naturelle ou acquise

L’antibiotique– Concentration locale comprise entre CMI/S et CMI / R– Bactéricidie sur les bactéries sensibles

Foyer infectieux– Inoculum bactérien important– Site – Corps étranger

Prévention de la sélection

Identifier les situations « à risque »(bactérie,ATB,foyer)

Diminuer l’inoculum bactérien– Drainage– Premier antibiotique peu sélectionnant

(oxacilline ou glycopeptide sur SAPosologie élevéeAssociation d’antibiotiques

Activité antimicrobienne in vivoDiffusion, distribution, métabolisme, et

toxicitéRelations drogue-pathogène

– Diffusion au site de l’infection• Intra-cellulaire

– Quinolones, tetracyvlines– Aminosides

• Anaérobie, tissus nécrotique, ischémie– Aminosides, quinolones– liposolubilité chloramphenicol, rifampin, trimethoprim,

isoniazid imidazole • Inoculum. • pH du milieu• Pus et tissus nécrotiques

– Aminosides polymixines • hémoglobine. Penicillins and tetracyclines

Le choix du “bon” antibiotique Identification de l’agent infectant

– GRAM, examen direct, PNN, …– Antigene, latex, PCR– bacteriologic statistics and epidemiology

antibiogramme Facteurs liés à l’hôte

– allergie – Age – acidité gastrique

• reduit l’absorption des peni, • absorption du ketoconazole diminuée par les antiacides

– tetracyclines . Fixation sur l’émail dentaire– quinolone . Toxique pour les cartilages et ligaments – Anomalies Genetiques ou Metabolique (ISONIAZIDE acetyleur)– grossesse– Renal and Hepatic Function

Corps étranger glycocalyx or biofilm,

glycocalyx

Mécanisme de bactéricidie

Paroi bactérienne – Beta lactamines, glycopeptides

Membrane cytoplasmique– Polymyxines

Synthèse protéique– Aminosides, cyclines, macrolides, lincosamides,

streptogramines, rifampicine, chloramphenicol, acide fusidique, triméthoprime-sulfaméthoxazole

Réplication de l’ADN– Fluoroquinolones

Inhibiteurs de beta-lactamases

OGM

Le microbe n'est rien. Le terrain est tout. »

Conclusion

Apport majeur de l’examen directIdentification rapide et traitement adaptéConfirmer le choc septiqueEssayer de limiter la diffusion de la

résistance bactérienneControle de l’antibiothérapie

Merci de votre attention….

Et lavez vous bien les mains…