BCTH DE TAI QG.07.24

®¹i häc quèc gia hµ néi

VIÖN VI SINH VËT Vµ C¤NG NGHÖ sinh häc

-----o0o-----

BÁO CÁO ĐỀ TÀI ĐẶC BIỆT CẤP ĐHQG

®Ò tµi nghiªn cøu khoa häc 2007-2008

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ CẢU MỘT SỐ CHỦNG Microcystis PHÂN LẬP Ở HỒ

HOÀN KIẾM, HÀ NỘI

Mã số: QG.07.24

Chñ tr× ®Ò tµi : NguyÔn ThÞ Hoµi Hµ

Hµ néi - 2008

BÁO CÁO TÓM TẮT

1. Tên đề tài

Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một

số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội

2. Các thành viên tham gia đề tài

Chủ trì đề tài

- Họ và tên: Nguyễn Thị Hoài Hà

Các thành viên:

Lƣu Thị Thùy Giang

Nguyễn Quang Huy

Lê Trung Thủy

Phạm Thị Bích Đào

Trần Thị Điệp

3. Tóm tắt tổng quan của đề tài

Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo

theo đó là sự ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận. Hồ Hoàn Kiếm

một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm. Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn

tới sự phát triển thƣờng xuyên và không bình thƣờng của vi khuẩn lam, làm biến đổi

cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc

hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở

hồ Hoàn Kiếm đã đƣợc cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trƣờng cho khu

hệ động thực vật sống trong hồ.

Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa

Kutzing là loài bị bắt gặp thƣờng xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố

thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vòng có tên gọi là

microcystin.. Microcystin là chất ức chế đối với enzyme protein phosphatases

(nhóm PP1 và PP2A) [30]. Độc tố cũng gây ảnh hƣởng xấu lên hai loại protein

serine và threonin phosphatases. Đã có một số bài báo chứng minh hiện tƣợng nƣớc

nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con ngƣời.

Microcystin thƣờng tích luỹ trong nội quan tế bào hoặc dƣới dạng tự do trong nƣớc.

Đã có không ít các công trình nghiên cứu hiện tƣợng nở hoa nƣớc và giảm thiểu tác

hại của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác

nhau. Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đặc

điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis

phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội.

4. Mục tiêu của đề tài

* Phân lập, định tên, nuôi cấy và lƣu giữ đƣợc các chủng vi khuẩn lam

Microcystis trong Bảo tang Vi tảo của Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi

trƣờng - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN.

* Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn.

5. Tóm tắt nội dung nghiên cứu của đề tài

- Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hoá của nƣớc hồ Hoàn Kiếm tại

thời điểm thu mẫu.

- Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp

của các chủng Microcystis.

- Phân loại đến loài các chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc.

- Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc

ký lỏng cao áp (HPLC).

- Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây

độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nƣớc).

6. Kết quả chính của đề tài

- Hồ Hoàn Kiếm đang ở tình trạng ô nhiễm, hàm lƣợng COD, BOD vƣợt

tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 4942- 1995 (loại B) 20 lần. Với giá trị NH4+ từ 0,129-

0,699 (mg/l), NO2- từ 0.012- 0,05 (mg/l), NO3

- từ 0,047- 0,129 (mg/l), PO4

3- từ

0,08- 0.64 (mg/l) chứng tỏ hồ có hàm lƣợng dinh dƣỡng N, P khá cao.

- Đã phân lập thuần khiết và nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam thuộc chi

Microcystis theo phƣơng pháp của Shirai có cải tiến. Môi trƣờng thạch agarose B12

với tỷ lệ 0,4% là môi trƣờng thích hợp nhất cho việc phân lập Microcystis.

- Các chủng Microcystis đều sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng Bold 3N với số

lƣợng tế bào đạt từ 32,94 – 68,6 ×106 tế bào/ml

sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Đặc

biệt chủng LT2 số lƣợng tế bào đạt cao nhất là 68,6 ×106 tế bào/ml sau ngày thứ 19.

Trên môi trƣờng J, các chủng Microcystis sinh trƣởng số lƣợng tế bào của các

chủng đạt từ 40,42 – 76,46 ×106 tế bào/ml

sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Trong đó

chủng LT2 vẫn phát triển với số lƣợng tế bào đạt cao nhất 76,46 × 106 tế bào/ml

sau

ngày thứ 19. Trên môi trƣờng B12, số lƣợng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78 ×106 tế

bào/ml sau 12 đến 15 ngày nuôi cấy. Ở môi trƣờng này chủng LT8 phát triển với

mật độ tế bào đạt cao nhất 54,78 ×106 tế bào/ml

sau ngày thứ 15.

- Có 7 loại axít béo không no dạng C15, C17 và C19 trong tế bào 2 chủng

Microcystis LT2 và LT8. trong đó thành phần axit palmitic (C16H32O2) chiếm lƣợng

lớn nhất với 1,302 μg/mg trọng lƣợng khô ở chủng LT2, chủng LT8 là 0,9683

μg/mg trọng lƣợng khô. Kết quả cho thấy có sự sai khác nhau về lƣợng của 7 loại

axit béo có ở trong tế bào 2 chủng LT2 và LT8.

- Dựa vào phƣơng pháp phân loại truyền thống theo phân loại hình thái học

và phƣơng pháp phân loại hiện đại dựa trên phân tích trình tự rADN 16S, 2 chủng

vi khuẩn LT 2, LT8 đƣợc xác định là Microcystis aeruginosa, 2 chủng vi khuẩn

nƣớc N4 và N7 đƣợc xác định thuộc các loài Sphingomonas mali và Sphingomonas

asaccharolytica

- Dựa vào kết quả phân tích trên HPLC, hàm lƣợng độc tố MC – RR đạt lớn

nhất là 512,8 ng/mg trọng lƣợng khô, độc tố MC – YR là 236,8 ng/mg và thấp nhất

là độc tố MC – LR: 114,25 ng/mg.

- Hai chủng vi khuẩn Sphingomonas tuyển chọn đƣợc có khả phân giải

microcystin khá nhanh. Ở nồng độ microcystin 3 µg/l thời gian bán phân giải là

1,34 giờ và với nồng độ 20µg/l, thời gian là 3,43 giờ.

- Nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của các chủng vi khuẩn

Sphingomonas mali N4 và Sphingomonas asaccharolytica N7 là 30°C. Sau 7 ngày

sự phân giải gần nhƣ hoàn toàn là 100%.

7. Các công trình công bố và sản phẩm đào tạo

Công trình công bố

- Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà

2008. Đánh giá sự biến động số lượng theo mùa và theo tầng nước của vi khuẩn

lam Microcystis aeruginosa ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội, Tạp chí Khoa học Đại học

Quốc gia Hà Nội. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 125 – 128.


2008. Tìm hiểu khả năng phân giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis trong hồ

Hoàn kiếm bằng vi khuẩn. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội. Khoa học

Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 119 – 122.

Đào tạo 4 Cử nhân

- Bƣớc đầu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân

giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội. 2007. Khoá

luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Đặng Thị Kim Anh.

- Bƣớc đầu đánh giá khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam

Microcystis aeruginosa bằng vi khuẩn Sphingomonas. 2008. Khoá luận tốt nghiệp

hệ đại học chính quy của Nguyễn Thị Hoài.

- Khảo sát sự biến động theo mùa của vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa ở

hồ Hoàn Kiếm và khả năng ức chế sinh trƣởng của chúng bằng dịch chiết vỏ chuối,

vỏ quýt. 2009. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Lê Thị Trang.

- Phân lập, nghiên cứu một số đặc tính của tảo độc Microcystis tách chiết độc

tố và thăm dò biện pháp xử lý.2009. Đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hữu Hiếu

Đào tạo 1 Thạc sỹ

Phân giải tế bào Microcystis và sự phân huỷ độc tố microcystin bằng vi

khuẩn nƣớc 2007 - 2009.

Những đóng góp của đề tài:

- Là công trình đầu tiên tách và lƣu giữ đƣợc chủng vi khuẩn lam

Microcystis.

- Phân lập đƣợc 2 chủng vi khuẩn thuộc chi mới Sphingomonas có khả năng

phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam Microcystis.

- Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết độc tố microcystin.

8. Tình hình sử dụng kinh phí của đề tài

- Kinh phí đƣợc cấp: 100 000 000 đồng

- Kinh phí thực hiện: 100 000 000 đồng

Hà Nội , ngày 18 tháng 10 năm 2008

Chủ trì đề tài Thủ trƣởng đơn vị

(ký tên, đóng dấu)

TS. Nguyễn Thị Hoài Hà

ABSTRACT OF PROJECT

1. Title of the project: “Study on biological characteristis and capacity of

biodegradation toxin of some Microcystis isolated from Hoan Kiem Lake, Hanoi”

2. Coodinator: Nguyen Thi Hoai Ha

Member: Luu Thuy Giang

Nguyen Quang Huy

Le Trung Thuy

Pham Thi Bich Dao

Tran Thi Diep

3. Introduce

Hoan Kiem Lake is a famous place because of its historical and cultural

value. This is the habitat of valuable and rare species with endemicity and is also

diversifying about the component of microalgae species. In recent years, the

socioeconomic developmental process caused a lot of influences on the lake

ecosystem especially on water quality. Mesotrophic situation of this lake resulted in

the bloom water reducing specific microalgae species and concurrently increasing

the species component and density of toxic algae. Among toxic cyanobacterial

genera, Microcystis accounts for highest population (approximately 80% of total

cyanobacterial strains that cause the bloom water). Microcystis aeruginosa Krutzing

is the most popular species. This is a species which produces hepatotoxin, a type of

liver toxin, composed from cyclic peptides called microcystin.

They have effect on both animals and plants in waters. microcystin usually

accumulates in cells or releases to surrounding waters. Thus the research on toxic

cyanobacteria Microcystis in Hoan Kiem lake, Hanoi and finding effective methods

to diminish their negative effects are essential. In this report, we describe the

isolation, selection and classification location as well as biological characters of

some Microcystis strains from Hoan Kiem lake, as a basic for the next researches.

4.The airm of project

- Isolation, identification, inoculation and maitainance of Microcystis strains

(blue-green, Cyanobacteria) at Microalgal Technology and Enviromental Biology

Lab, Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National of University,

Hanoi.

- Capacity of toxin degradation by aquatic bacteria.

5. Brief summary:

- Biophysical and biochemical analysis of freshwater in Hoankiem lake at

sampling time.

- Isolation, screening, study on characteristics of Microcystis isolated.

- Identification of Microcystis isolated.

- Determination microcystin of same Microcystis strains by HPLC.

- Capacity of toxin degradation by fresh bacteria

6. Results obtained

- Hoankiem lake is in pollution condition in the aspect of chemical

evacuation such as COD and BOD concentration is over the corresponding ones in

Vietnamese standard system, TCVN 4942-1995 (type B) 20 times. Concentration of

ammonium cation 0,129- 0,699 (mg/l), nitrite 0.012- 0,05 (mg/l), nitrate 0,047-

0,129 (mg/l), and phosphate 0,08- 0.64 (mg/l) that demonstrate concentration of

nitrogen and phosphorus are relatively high.

- Based on modified Shirai method, 10 pure strains of Microcystis were

isolated and cultured. B12 medium (0.4% agarose) was selected as the most suitable

for Microcystis isolation.

- All of Microcystis strains were grown well on the Bold 3N medium that the

numbers of cell from 68,6 ×106

cells/ml after 15-19 days of culture. Especially, the

maximal cell number of LT2 strain increased to 68,6 ×106

cells/ml after 19th

culture.

For J medium, the cell density was from 40,42 – 76,46 ×106 cells/ml after 15-19

days of culture in which LT2 was the best growth strain with the numbers of cell

76,46 ×106 cells/ml after 19

th culture.

- Analytical results of unsaturated fatty acid in Microcystis LT2 and LT8

strains showed different 7 types of C15, C17 and C19 in which Palmitic acid

occupied as major part with 1,302 μg/mg and 0,9683 μg/mg (in dry weight) in LT2

and LT8, respectively. The results indicated the diference in the concentration

between 7 types of fatty acid.

- Based on morphological and molecular taxonomy (for example

comparision the sequence of 16S rDNA), LT2 and LT8 cyanobacterial strains were

identified as M. aeruginosa; aquatic N4 and N7 bacterial strains were type of

Sphingomonas mali và Sphingomonas asaccharolytica.

- HPLC analysis showed the maximal concentration of MC-RR of 512,8

ng/mg in dry weight, 236,8 ng/mg of MC-YR and the lowest 114,25 ng/mg MC-

LR.

- Sphingomonas strain was demonstrated to degrade microcystin in relatively

good level. Time for degradation of a half of 3 µg/l and 20µg/l microcystin was

1,34 h and 3,43 h; respectively.

- The suitable temperature for microcystin degradation by Sphingomonas

mali N4, Sphingomonas asaccharolytica N7 strains was at 30°C. The degradation

was completely after 7 day.

7. Publications and training activity

Publications

- Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha.

Investigate water quality and the composition of algae in some lakes in Hanoi.

2008. Vietnam National University, Hanoi. Journal Natural Science. Vol 24, No 18,

pp 125 – 128.

- Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha.

Study on toxin lysis in blue green algae by some strains bacteria isolated in Hoan

Kiem lake. 2008. Vietnam National University, Hanoi. Journal Natural Science. Vol

24, No 18, pp 119 – 122.

Training activity

Master thesis completed in 2009

- Lysis of Microcystis and degradation of microcystin by aquatic bacteria.

2007-2009. Tran Thi Diep‟s official undergraduate thesis.

Bacheler thesis completed

- Isolation and screening of Microcystis toxin-degrading bacterial strains in

Hoankiem lake, Hanoi, 2007. Dang Thi Kim Anh‟s official undergraduate thesis.

- Investigation of Microcystis aeruginosa microcystin degradation by

Sphingomonas. 2008. Nguyen Thi Hoai ‟s official undergraduate thesis.

- Study on the seasonal fluctuation of cyanobacterial Microcystis aeruginosa

in Hoankiem lake and growth restriction by banana skin and mandarin peel

extracted solution, 2009. Le Thi Trang‟s official undergraduate thesis.

- Isolation and study on Microcystis toxic cyanobacterial characteristics:

toxin extraction and treatment investigation, 2009. Nguyen Huu Hieu‟s official

undergraduate thesis.

8. Contributions of project:

- Here is the first report that described isolation, maintaince and preservation

of Microcystis strain.

- Two Sphingomonas bacterial strains were isolated and proved as potent

microcystin-degrading agent.

- Establishment of toxin microcystin extraction procedure.

9. Research grant

- Supplied expenditute: 100 000 000 Vnd

- Used expenditute: 100 000 000 Vnd

The project is supported by Vietnam, National University, Hanoi

Hanoi, 18th

October 2008

Project Coodinator Institute of Microbiology and Biotechnology

Nguyen Thi Hoai Ha

Vietnam, National University, Hanoi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3

1.1. VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM ......................................................................... 3

1.2. VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC ....................................... 3

1.2.1. Vi khuẩn lam Microcystis ................................................................................... 6

1.2.2. Độc tố microcystin của Microcystis .................................................................. 6

1.2.3. Cơ chế gây độc của microcystin ......................................................................... 8

1.3. SỰ PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƢỚC

Sphingomonas ............................................................................................................. 9

1.3.1. Vi khuẩn Sphingomonas ...................................................................................... 9

1.3.2. Cơ chế phân giải độc tố microcystin của Sphingomonas .............................. 10

1.4. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘC TỐ TỚI NGƢỜI VÀ GIA SÚC ............................ 11

1.5. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LAM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT

NAM.......................................................................................................................... 13

1.5.1. Trên thế giới ........................................................................................................ 13

1.5.2. Ở Việt Nam ......................................................................................................... 14

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 16

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 16

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................ 16

2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................... 16

2.1.3. Máy móc, dụng cụ .............................................................................................. 17

2.1.4. Hóa chất ............................................................................................................... 17

2.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lam và vi khuẩn .............................................. 18

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 18

2.2.1. Phƣơng pháp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm và đánh giá

chất lƣợng nƣớc ............................................................................................................. 18

2.2.2. Phƣơng pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis ..................... 18

2.2.2.1. Làm giàu mẫu ....................................................................................... 18

2.2.2.2. Phƣơng pháp tách và thuần khiết trên thạch đĩa ................................... 18

2.2.3. Phân loại vi khuẩn lam Microcystis ................................................................. 19

2.2.3.1. Bằng phƣơng pháp hình thái ................................................................. 19

2.2.3.2 . Phƣơng pháp tách ADN ....................................................................... 19

2.2.3.3. Hóa phân loại phân tích thành phần acid béo ....................................... 20

2.2.4. Xác định mật độ tế bào ...................................................................................... 21

2.2.5. Phƣơng pháp tách chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis ....... 22

2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng trên máy quang phổ ................................ 22

2.2.7. Các phƣơng pháp sắc ký .................................................................................... 22

2.2.7.1. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) .................................................. 23

2.2.7.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ............................................ 23

2.2.8. Phƣơng pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas ................................. 24

2.2.9. Phƣơng pháp xác định khả năng phân giải microcystin ................................ 24

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 26

3.1. PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU THỦY LÝ, THỦY HÓA NƢỚC HỒ HOÀN

KIẾM ......................................................................................................................... 26

3.1.1. Nhiệt độ ............................................................................................................... 26

3.1.2. pH ......................................................................................................................... 26

3.1.3. Các chất lơ lửng SS ............................................................................................ 26

3.1.4. Hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc (DO- Dissolve oxygen) ........................ 27

3.1.5. Nhu cầu oxy hóa học (COD- Chemical oxygen demand) ............................. 27

3.1.6. Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD- Biochemical oxygen demand) ....................... 27

3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM THUỘC CHI Microcystis

PHÂN LẬP ĐƢỢC ................................................................................................... 27

3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy .............................................................................................. 27

3.2.2. Phân lập các khuẩn lạc của Microc ystis ......................................................... 29

3.2.3. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis LT1, LT2, LT3, LT4,

LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trên các môi trƣờng khác nhau ................. 32

3.2.4. Thành phần acid béo trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 ........................ 35

3.2.5. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S ...................................................... 36

3.3. TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ MICROCYSTIN .................................................... 38

3.3.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) .................................................................................... 38

3.3.2. Xác định hàm lƣợng microcystin trên máy quang phổ .................................. 38

3.3.3. Hàm lƣợng microcystin trên sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ............................. 39

3.4. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN NƢỚC CÓ KHẢ

NĂNG PHÂN GIẢI MICROCYSTIN ..................................................................... 44

3.4.1. Phân lập các chủng vi khuẩn nƣớc .................................................................. 44

3.4.2. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S 2 chủng N4 và N7 ..................... 47

3.5. KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA 2 CHỦNG

Sphingomonas N4 VÀ N7 ......................................................................................... 49

3.5.1. Hiệu quả phân giải microcystin của 2 chủng N4 và N7 ................................ 49

3.5.2. Xác định điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của

chủng Sphingomonas N4 và N7 .................................................................................. 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56

PHỤ LỤC 1 ............................................................................................................... 62

PHỤ LỤC 2 ............................................................................................................... 65

PHỤ LỤC 3 ............................................................................................................... 66

PHỤ LỤC 4 ............................................................................................................... 77

PHỤ LỤC 5 ............................................................................................................... 78

PHỤ LỤC 6 ................................................................................................................. 1

DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG

Danh mục hình

Hình 1.1. Hồ Hoàn Kiếm Hà Nội ................................................................................ 3

Hình 1.2. Microcystis flos-aquae [62] ........................................................................ 6

Hình 1.3. Microcystis aeruginosa [63] ....................................................................... 6

Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [54] .................................. 7

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [54] .................................. 7

Hình 1.6. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [54] .................................. 8

Hình 1.7. Hình dạng tế bào của Sphingomonas [57] ................................................. 9

Hình 1.8. Con đƣờng phân giải mycrocystin nhờ Sphingomonas [20] ..................... 11

Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu ................................................................................... 16

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng C ......................... 28

Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng Bold 3N ................ 28

Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng B12 ....................... 28

Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng J ........................... 28

Hình 3.5. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT1 .......................................... 29





Hình 3.10. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT6 ........................................ 30




Hình 3.14. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT10 ...................................... 31

Hình 3.15. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể Bold

3N .............................................................................................................................. 33

Hình 3.16. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể Bold 3N

................................................................................................................................... 33

Hình 3.17. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể J ..... 34

Hình 3.18. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể J .......... 34

Hình 3.19. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể B12 35

Hình 3.20. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể B12 ..... 35

Hình 3.21. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của 2 chủng LT2,

LT8 và các loài có quan hệ họ hàng gần ................................................................... 37

Hình 3.22. Kết quả chạy TLC trƣớc khi nhuộm nihyđrin ......................................... 38

Hình 3.23. Kết quả chạy TLC sau khi nhuộm nihyđrin ............................................ 38

Hình 3.24. Đồ thị đƣờng chuẩn microcystin ............................................................. 39

Hình 3.25a. Sắc ký đồ microcystin RR chuẩn ......................................................... 40

Hình 3.25b. Sắc ký đồ microcystin YR chuẩn ......................................................... 40

Hình 3.25c . Sắc ký đồ microcystin LR chuẩn .......................................................... 41

Hình 3.25d. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT2 ................................................. 41

Hình 3.25e. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT8 ................................................. 42

Hình 3.26. Nuôi cấy làm giàu các chủng vi khuẩn nƣớc trên môi trƣờng NA và M7

................................................................................................................................... 45

Hình 3.27. Cấy pha khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng NA ................................... 45

Hình 3.28. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N4 và

các loài có quan hệ họ hàng gần................................................................................ 48

Hình 3.29. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N7 với

các loài có quan hệ họ hàng gần................................................................................ 49

Hình 3.30. Thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau của 2

chủng N4, N7. ........................................................................................................... 50

Hình 3.31. Khả năng phân giải microcystin của vi khuẩn Sphingomonas N4 ở các

nhiệt độ khác nhau .................................................................................................... 52

Hình 3.32. Khả năng phân giải của vi khuẩn Sphingomonas N7 ở nhiệt độ khác

nhau ........................................................................................................................... 53

Danh mục bảng

Bảng 1.1. Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16] .............. 4

Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng Bold3N

................................................................................................................................... 32

Bảng 3.2. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng J ........ 33

Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng của các chủng Microcystis trên môi trƣờng B12 .. 34

Bảng 3.4. Thành phần acid béo có trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 .............. 36

Bảng 3.5. Hàm lƣợng microcystin của 2 chủng LT2 và LT8 ................................ 43

Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái của 2 chủng vi khuẩn nƣớc N4 và N7 ....................... 46

Bảng 3.7. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng N4 và N7 ................................... 46

Bảng 3.8. Hằng số tốc độ phân giải (K) và thời gian bán phân giải microcystin ở các

nồng độ khác nhau .................................................................................................... 50

Bảng 3.9. Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N4 ở

các nhiệt độ khác nhau .............................................................................................. 52


các nhiệt độ khác nhau .............................................................................................. 52

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Các chữ viết tắt Tên đầy đủ

Adda 3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-

dienoic acid

MC-LR Leucine and arginine in the positions of X and Z of

microcystin

MC-RR Arginine and arginine in the positions of X and Z of

microcystin

MC-YR Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of

microcystin

PCR Phản ứng trùng hợp (Polymerase chain reaction)

WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organisation)

TLC Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

HPLC Sắc ký lỏng cao áp (High permormance liquid

chromatography)

bp Cặp bazơ (Base pair)

tb Tế bào

1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo

theo đó là sự ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận. Hồ Hoàn Kiếm

một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm. Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn

tới sự phát triển thƣờng xuyên và không bình thƣờng của vi khuẩn lam, làm biến đổi

cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc

hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở

hồ Hoàn Kiếm đã đƣợc cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trƣờng cho khu

hệ động thực vật sống trong hồ [1, 2, 5, 9].

Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa

Kutzing là loài bị bắt gặp thƣờng xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố

thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vòng có tên gọi là

microcystin (MC) [14, 15, 19, 23, 29]. Microcystin là chất ức chế đối với enzyme

protein phosphatases (nhóm PP1 và PP2A) [30]. Độc tố cũng gây ảnh hƣởng xấu

lên hai loại protein serine và threonin phosphatases [15, 16, 17, 18, 22]. Đã có một

số bài báo chứng minh hiện tƣợng nƣớc nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh

vật thủy sinh, động vật và con ngƣời [16,17, 19, 20, 21]. Microcystin thƣờng tích

luỹ trong nội quan tế bào hoặc dƣới dạng tự do trong nƣớc [16, 18, 35, 36, 42]. Đã

có không ít các công trình nghiên cứu hiện tƣợng nở hoa nƣớc và giảm thiểu tác hại

của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác

nhau. Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc

điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng

Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội”.

Mục tiêu của đề tài

* Phân lập, định tên, nuôi cấy và lƣu giữ đƣợc các chủng vi khuẩn lam

Microcystis trong Bảo tàng Vi tảo của Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi

trƣờng - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN.

* Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn.

2

Nội dung của đề tài

- Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hoá của nƣớc hồ Hoàn Kiếm tại

thời điểm thu mẫu.

- Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp

của các chủng Microcystis.

- Phân loại đến loài các chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc.

- Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc

ký lỏng cao áp (HPLC).

- Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây

độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nƣớc).

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM

Hồ Hoàn Kiếm nằm ở trung tâm thủ đô Hà Nội, xƣa là một đoạn của dòng

sông hồng và còn có tên gọi khác là sông Nhị. Diện tích hồ ƣớc tính khoảng 12

hecta, chiều dài Nam - Bắc là 700m. Chiều rộng Đông – Tây là 200m.

Hình 1.1. Hồ Hoàn Kiếm Hà Nội

Trong vài thập kỷ gần đây song

song với quá trình phát triển kinh tế

xã hội của Hà Nội,do không có biện

pháp ngăn chặn những tác động gây ô

nhiễm làm biến đổi hệ sinh thái hồ,

ảnh hƣởng tới chất lƣợng nƣớc hồ,

hàm lƣợng N và P tăng lên đã dẫn tới

sự phát triển bùng nổ của vi khuẩn

lam. Hồ Hoàn Kiếm trở thành một

trong những hồ phú dƣỡng ở Hà Nội.

Trong hồ có sự phát triển mạnh mẽ của một số vi khuẩn lam thuộc chi

Microcystis, tạo thành những váng lớn nổi bồng bềnh che kín mặt một góc hồ. Kết

thúc sự nở hoa, vi khuẩn lam chết hàng loạt gây mùi hôi lan xung quanh khu vực hồ

[6].

1.2. VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC

Vi khuẩn lam là nhóm cơ thể cổ xƣa nhất và mang nhiều tên gọi khác nhau

trong quá trình nghiên cứu: thực vật phân cắt (Schizophyceae), tảo nhầy

(Myxophyceae), tảo lam (Cyanophyta), vi khuẩn lam (Cyanobacteria). Từ năm

1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh.

Trong phân loại hiện đại, sinh vật chƣa có cấu trúc nhân hoàn hảo (Procaryota) gồm

vi khuẩn lam và vi khuẩn, căn cứ vào đặc điểm cả hai đều không có nhân điển hình,

chỉ có chất nhân và nhiễm sắc thể. Vi khuẩn lam và vi khuẩn còn có những nét

giống nhau nhƣ: màng tế bào đều cấu tạo từ murein, một loại glucozaminopeptit;

4

trong tế bào chất có nhiều riboxom; nhiều loài vi khuẩn và vi khuẩn lam đều có khả

năng đồng hoá đƣợc N2 tự do; cả hai đều có thể hình thành các pha cyanophase và

bacteriophase. Vi khuẩn lam khác với các ngành tảo và thực vật bậc cao ở cấu trúc

rất cổ xƣa, tế bào không có cấu trúc nhân điển hình và không có các giai đoạn phân

chia nhân. Vi khuẩn lam phân bố khắp nơi trên trái đất, đa số sống trong nƣớc ngọt,

một số phân bố trong thuỷ vực nƣớc mặn giàu chất hữu cơ hoặc trong nƣớc lợ [7].

Độc tố vi khuẩn lam phổ biến nhất là độc tố gan (hepatotoxin) và độc tố thần

kinh (neurotoxin). Một số loài vi khuẩn lam có chứa cả hai loại độc tố trên. Các

quần thể nở hoa trong thuỷ vực nƣớc ngọt chủ yếu thuộc về chi Microcystis thƣờng

gây độc [8, 9], nhƣng cũng có các chủng thuộc chi này không gây độc [29]. Có ý

kiến cho rằng độc tính không phải là tính trạng đặc hiệu ở những loài nhất định nào

đó, nhƣ với microcystin (hepatotoxin) thì độc tính của một chủng phụ thuộc vào

điều kiện là chủng đó có mang gen mã hóa cho microcystin hay không [38, 39]. Thí

nghiệm nuôi cấy vi khuẩn lam cũng chỉ ra rằng sản sinh microcystin là tính trạng

không đổi của một số chủng nhất định, hiếm khi bị tác động bởi các yếu tố môi

trƣờng [16, 49]. Trong khi các điều kiện dẫn tới sự nở hoa của vi khuẩn lam đã

đƣợc sáng tỏ, thì các yếu tố dẫn tới sự bùng nổ của các chủng gây độc so với các

chủng không độc vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ [15, 20, 22, 34].

Bảng 1.1. Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16]

Loài Loại độc tố Nơi phát sinh

Anabaena spp. (flos-

aquae, lemmermannii,

circinalis)

Microcystins Anh

Anabaena circinalis Microcystins Pháp

Anabaena flos-aquae Microcystins Nauy

Microcystis aeruginosa Microcystins Worldwide

M. viridis Microcystins Nhật Bản

M. botrys Microcystins Đan Mạch

Planktothrix agardhii Microcystins Trung Quốc

P. agardhii Microcystins Nauy

Oscillatoria limosa Microcystins Thuỵ Sỹ

5

Loài Loại độc tố Nơi phát sinh

Nostoc sp. Microcystins Anh

Anabaenopsis millerii Microcystins Bỉ

Haphalosiphon

hibernicus (soil isolate)

Microcystins Mỹ

Nodularia spumigena Nodularins Úc

Aphanizomenon

Ovalisporum

Cylindrospermopsin Isaen

Cylindrospermopsis

raciborskii

Cylindrospermopsin Úc

Umezakia natans Cylindrospermopsin Nhật

Anabaena flos-aquae Anatoxin-a Canada

Anabaena blooms Anatoxin-a Đức

Anabaena sp. Anatoxin-a Nhật

Aphanizomenon sp. Anatoxin-a Phần Lan

Aphanizomenon blooms Anatoxin-a Đức

Cylindrospermum sp. Anatoxin-a Phần Lan

Microcystis sp. Anatoxin-a Nhật Bản

Planktothrix sp. Anatoxin-a Anh

Planktothrix Formosa Homoanatoxin-a Nauy

Anabaena flos-aquae Anatoxin-a(S) Canada

A. lemmermannii Anatoxin-a(S) Đan Mạch

Anabaena circinalis Sacidoxins Úc

Aphanizomenon flos-

aquae

Sacidoxins Mỹ

Cylindrospermopsis

raciborskii

Sacidoxins Braxin

Lyngbya wollei Sacidoxins Mỹ

Sự nghiên cứu vi khuẩn lam gây độc ở nhiều nƣớc trên thế giới cho thấy có

khoảng 60% các mẫu vi khuẩn lam đƣợc điều tra mang độc tố (bảng 1.1). Tuy

nhiên, độc tố của hiện tƣợng nở hoa nƣớc có thể thay đổi theo thời gian và không

gian. Nếu chứng minh đƣợc quần thể vi khuẩn lam trong một hồ nào đó có mang

độc tính nhƣng mật độ của chúng thấp thì không nhất thiết phải báo động cho cộng

6

đồng về những tác hại của chúng đối với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng [16, 22,

43, 48, 50].

1.2.1. Vi khuẩn lam Microcystis

Trong số các loài vi khuẩn lam đƣợc xác định gây độc cho con ngƣời thì

Microcystis aeruginosa đƣợc xem là thƣờng gặp nhất, là một trong những loài vi

khuẩn lam tham gia đáng kể hình thành hiện tƣợng nở hoa của nƣớc. Với đặc điểm

là tập đoàn bao gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ cỡ từ 2- 3 µm và mỗi tế bào đều

chứa một không bào khí. Chính sự tập hợp của hàng nghìn không bào khí định vị

trong vô số các tế bào này giúp chúng nổi trên mặt nƣớc và thu nhận đƣợc nguồn

ánh sáng mặt trời, thông qua quá trình quang hợp tổng hợp sắc tố diệp lục tạo nên

váng xanh trên mặt nƣớc [25].

Hình 1.2. Microcystis flos-aquae [62]

Hình 1.3. Microcystis aeruginosa [63]

1.2.2. Độc tố microcystin của Microcystis

Microcystin [16, 40] là những độc tố vi khuẩn lam gặp phổ biến và rộng rãi

nhất. Hợp chất này đƣợc tách ra đầu tiên từ loài vi khuẩn lam Microcystis

aeruginosa do vậy đƣợc gọi là microcystins. Chúng là các heptapeptide mạch vòng

do có chứa 1 amino acid đặc hiệu (ADDA) chuỗi bên [24]. Cho đến nay, đây là

những dạng cấu trúc chỉ gặp ở microcystins và nodularin (một loại pentapeptide

vòng của vi khuẩn lam ở trong nƣớc lợ). Ngƣời ta đã biết khoảng 70 loại độc tố

microcystins khác nhau. Chúng khác nhau ở các nhóm metyl và 2 amino acid. bên

trong chuỗi. Từ đó dẫn đến sự khác nhau về cấu trúc bậc 4, tính độc cũng nhƣ các

7

đặc tính ƣa nƣớc hoặc kỵ nƣớc. Microcystin gắn protein phosphataza 1 và 2 là

những loại protein quan trọng trong tế bào nhân thật bằng 1 liên kết đồng hóa trị

không thuận nghịch. Các kênh gắn acid mật đƣợc tìm thấy trong tế bào gan là con

đƣờng cho phép microcystin đi vào trong tế bào. Đối với động vật có xƣơng sống,

liều lƣợng gây chết của microcystin sẽ làm cho gan bị hoại tử trong thời gian vài

giờ hoặc vài ngày. Có lẽ rằng các cấu trúc kỵ nƣớc có thể đi xuyên qua 1 vài loại tế

bào mà thậm chí không theo kênh acid mật.

Ngoài ra, Fitzgeorge đã cung cấp bằng chứng cho rằng các MC-LR thƣờng

gặp có thể huỷ hoại cấu trúc của mô mũi. Trong khi đó, độc tính gây ra do hấp thụ

qua đƣờng miệng thƣờng ít gây ảnh hƣởng hơn nếu so với tiêm vào dƣới màng

bụng trong các thí nghiệm mà ngƣời ta tiêm sẽ khiến chúng có tác dụng phá huỷ

màng tế bào và làm gia tăng độc tính của anatoxin-a (một loại độc tố thần kinh)

[49].

Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [54]

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [54]

8

Hình 1.6. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [54]

Biến thể xảy ra chủ yếu tại các vị trí 1 và 2. Ví dụ, Microcystin-LR chứa

leucine amino acid (L) và arginine (R) tại các vị trí 1 và 2 tƣơng ứng. Microcystin-

RR có arginine ở cả hai vị trí. Các nghiên cứu cơ chế độc học tế bào đã cho biết

microcystins ảnh hƣởng đến các cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân và điều

này giúp giải thích khả năng kích thích gây ung thƣ của chúng.

1.2.3. Cơ chế gây độc của microcystin

Cơ chế gây độc của microcystin ở mức độ phân tử là ức chế các hepatocyte

protein phosphatases P 1 (PP1) và 2A (PP2A) – hai enzyme điều chỉnh nhiều quá

trình diễn ra trong tế bào động vật và thực vật. Sự kìm hãm này dẫn tới sự siêu

phosphoryl hóa của tế bào cytoskeratin. Trong tế bào gan của ngƣời và động vật,

điều này còn làm tăng sự phá vỡ các vi sợi hình thành nên khung tế bào. Khi các vi

sợi trở lên tách rời màng tế bào sẽ làm xuất hiện các bóng nƣớc trong màng, đồng

thời làm màng tế bào bị co lại, dịch tế bào thoát ra. Đây đƣợc xem là nguyên nhân

gây ra chảy máu gan, phá vỡ cấu trúc của gan thƣờng thấy ở động vật. Sự tiếp xúc

lâu dài với nồng độ microcystin thấp trong nƣớc uống là nhân tố gây ra ung thƣ gan

ở ngƣời [14]. Các nghiên cứu cơ chế động học tế bào đã cho biết microcystin ảnh

hƣởng lớn đến cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân, điều này giúp giải thích

khả năng kích thích gây ung thƣ của chúng. Độc tố này cũng gây ảnh hƣởng xấu

đến hai loại enzyme là serin – photphatase và threonin – photphatase liên quan tới

sự điều hòa phát triển các tế bào nhân thật (Eukaryote), điều khiển sự hoạt động của

tế bào động thực vật trong quá trình phân chia, sinh trƣởng, trao đổi chất, sao chép

9

ADN và sự biểu hiện các tính trạng có liên quan. Điều đó cho thấy microcystin có

thể ảnh hƣởng đến các chức năng của tế bào nhân thật ở mức độ phân tử và từ đó có

thể ảnh hƣởng tới các động vật thủy sinh sống trong môi trƣờng có sự tiếp xúc với

độc tố này. Microcystin thƣờng tích lũy trong các tế bào vi khuẩn lam, khi nƣớc nở

hoa, độc tố dạng tan hoặc theo phƣơng thức tự nhiên hoặc do sự điều khiển của tế

bào mà giải phóng vào nƣớc. Trong trƣờng hợp nở hoa bởi Microcystis thì

microcystin ở dạng không hòa tan, khá bền vững, sẽ có thể tồn tại vài tuần trƣớc khi

bị phân giải sinh học [10].

1.3. SỰ PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƢỚC

Sphingomonas

1.3.1. Vi khuẩn Sphingomonas

Hình 1.7. Hình dạng tế bào của

Sphingomonas [57]

Sphingomonas là một vi khuẩn Gram

âm, không bào tử, dị dƣỡng, hoàn toàn

hiếu khí và sinh sắc tố xanh hoặc vàng

nhạt.

Chúng có khả năng di động nhanh nhờ

các lông roi và đa số có khả năng phát

quang dƣới ánh sáng cực tím.

Sphingomonas là vi khuẩn hình que có kích thƣớc 0.3-0.8 x 1.0-2.7µm, chúng có

màu vàng hoặc màu trắng. Sphingomonas hoàn toàn không có lipopolysaccarid

(LPS) – chứa nội độc tố. Thay vào đó, nó có một màng tế bào bao gồm có protein,

photphoslipid, quinone để hô hấp và màng ngoài chứa glycosphingolipit (GSLs).

GSLs giữ một vị trí giống nhƣ LPS trong các vi khuẩn Gram âm khác và xuất hiện

với nhiều chức năng tƣơng tự, nhƣ là một trở ngại đối với các thực thể kháng khuẩn.

Cũng bởi phần hydrocarbon của một GSL ngắn hơn của LPS nên bề mặt tế bào của

Sphingomonas có nhiều hydrophobic hơn các vi khuẩn Gram âm khác. Đây có thể

là một lí do giải thích cho việc loài vi khuẩn này có khả năng làm giảm các

hydrocarbon thơm, đa hydrophobic và tính nhạy cảm của nó đối với việc ngăn các

10

kháng khuẩn hydrophobic. Sphingomonas đƣợc tìm thấy phổ biến trong môi trƣờng

tự nhiên bao gồm trong nƣớc (nƣớc ngọt và nƣớc mặn), trên cạn, trong rễ cây, trong

các mẫu xét nghiệm bệnh và nhiều nơi khác. Sự phân bố rộng rãi của chúng trong

môi trƣờng là do chúng có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ, có thể sinh

trƣởng và tồn tại dƣới các điều kiện dinh dƣỡng thấp. Nhiều loài Sphingomonas

cũng đƣợc tìm thấy ở các nơi có chứa các hợp chất độc nhƣ PCBs, creozot,

pentachlorophenoL, thuốc diệt cỏ…Các nghiên cứu cho thấy trong môi trƣờng bị ô

nhiễm, Sphingomonas có khả năng sử dụng chất gây ô nhiễm làm nguồn năng

lƣợng để có thể cạnh tranh đƣợc với các sinh vật khác trong các môi trƣờng khác

nhau [20].

1.3.2. Cơ chế phân giải độc tố microcystin của Sphingomonas

Sphingomonas đã đƣợc David G. Bourne chứng minh là chủng vi khuẩn có

chứa các enzyme tham gia vào con đƣờng phân giải độc tố microcystin. Sự phân

giải độc tố này đƣợc xúc tác bởi enzyme nội bào [20].

Việc sử dụng các chất ức chế protease kinh điển cho phép: (1) phân loại các

enzyme này thành các họ protease cơ bản và (2) tích lũy tức thời trong điều kiện

invitro các sản phẩm trung gian từ sự phân hủy MC - LR. Vị trí phân cắt ban đầu

trên phân tử MC - LR bởi enzyme đƣợc xác định là liên kết peptides 3 - amino - 9 -

methoxy - 2,6,8 - trimethyl - deca - 4,6 dienoic acid (Adda) - Arg.

Hai sản phẩm phân giải trung gian đƣợc tìm thấy là MC - LR mạch thẳng:

NH2 - Adda - Glu(iso) -methyldehydroalanine - Ala - Leu - ß - methylaspartate -

Arg - OH (chất A) và sản phẩm còn lại là tetrapeptide: NH2 - Adda – Glu (iso) -

methyldehydroalanine - Ala -OH (chất B) là kết quả của sự làm giảm MC - LR nhờ

hai enzyme trung gian.

Chính hiện tƣợng mở vòng độc tố MC - LR nhờ enzyme microcystinase của

vi khuẩn khiến chất này trở nên không độc do đó giảm đáng kể tƣơng tác với các

protein phosphatase.

Con đƣờng phân hủy MC - LR bởi Sphingomonas đƣợc đề xuất nhƣ sau:

11

Hình 1.8. Con đƣờng phân giải mycrocystin nhờ Sphingomonas [20]

1.4. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘC TỐ TỚI NGƢỜI VÀ GIA SÚC

Có rất nhiều nghiên cứu cho thấy động vật bị ngộ độc do uống nƣớc có chứa

vi khuẩn lam gây độc. Báo cáo đầu tiên vào năm 1800 về hiện trạng gia súc bị chết

do uống phải nƣớc có chứa vi khuẩn lam gây độc. Chất độc này gây hại lên đƣờng

bài tiết, gây dị ứng da, ảnh hƣởng tới màng nhầy ruột hoặc làm con vật bị ốm. Báo

cáo tiếp theo về các phản ứng dị ứng qua da hoặc kích thích da nổi ngứa do nƣớc

chứa các loài vi khuẩn lam khác nhau nhƣ Anabaena, Aphanizomerzon, Nodularia,

Oscillatoria, Gloeotrichia. Các vận động viên khi tiến hành bơi, lội, ngƣời đi bơi

mặc áo tắm hoặc áo lặn đã giữ lại các tế bào vi khuẩn lam, do cọ sát mà các tế bào

bị vỡ ra và giải phóng độc tố, từ đó chất độc tác động lên da [16].

12

Vào năm 1959, ở Canada mặc dù đã có gia súc bị chết và đƣợc cảnh báo về

nguồn nƣớc sử dụng song ngƣời ta vẫn bơi trong một hồ có chứa nhiều vi khuẩn

lam. Kết quả là có 13 ngƣời bị ốm, đau đầu, đau cơ, ỉa chảy nặng. Trong dịch tiết

của một bệnh nhân ngƣời ta đã phát hiện ra một số lƣợng lớn tế bào Microcystis

spp., và một số đoạn sợi tảo của Anabaena circinalis [19].

Năm 1979, ở Úc để ngăn chặn sự nở hoa của Cylindropermopsis raciborskii

trong nguồn nƣớc uống, ngƣời ta đã xử lý chúng bằng đồng sunfat. Điều này đã làm

cho độc tố trong tế bào đƣợc giải phóng gây ra ảnh hƣởng nghiêm trọng và làm 141

ngƣời phải nhập viện [34].

Năm 1988, ở Brazil tiếp sau trận lụt do vỡ con đập Itaparica thuộc bang

Bahia, khoảng 2000 ca bệnh về đƣờng tiêu hoá đã đƣợc báo cáo sau 42 ngày và có

88 ngƣời đã chết. Các điều tra nguyên nhân sau đó cho biết có hàm lƣợng độc tố vi

khuẩn lam rất cao [16].

Năm 1989, ở Anh có 10 trong số 20 lính đã bị ốm sau khi bơi tập trong nƣớc

bị ô nhiễm bởi vi khuẩn lam Microcystis spp., đã phải nhập viện [17].

Năm 1993, ở Trung Quốc một số ca bệnh ung thƣ gan đƣợc chẩn đoán là có

liên quan đến việc sử dụng nƣớc uống trên bề mặt bị nhiễm nhiều vi khuẩn lam [16,

18].

Năm 1994, ở Thuỵ Điển do quản lý không tốt nguồn nƣớc chƣa đƣợc xử lý

nhà máy đƣờng, nên khi chảy ra nó hoà lẫn vào nƣớc sông. Điều này khiến loài vi

khuẩn lam Planktothrix agardhii đã phát triển mạnh tạo nên hiện tƣợng nở hoa

nƣớc. Kết quả phân tích cho thấy rằng loài này chứa độc tố microcystin. Trong tổng

số 304 nông dân sử dụng nguồn nƣớc này thì có 121 ngƣời, kể cả động vật nuôi của

họ đã bị tiêu chảy, viêm cơ [16, 18].

Năm 1995, ở Úc, kết quả điều tra với 852 bệnh nhân tiếp xúc với nƣớc có

chứa vi khuẩn lam cho thấy rằng sau 2 –7 ngày nhiều bệnh nhân bị mắc tiêu chảy,

sốt dị ứng da…. Ở Monte Hermosa (Achentina) vào tháng 11/1995 đã có 45 triệu

con ngao Mesoderma marcoides đã bị chết do sự nở hoa của tảo gây hại. Cũng vào

năm này ở Việt Nam, loài Noctiluca scintilans nở hoa ở khu vực vịnh Vân Phong –

13

Khánh Hoà vào tháng 5 và 6 đã làm chết 20 tấn tôm hùm với thiệt hại lên đến 6 tỷ

đồng [5].

1.5. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LAM TRÊN THẾ GIỚI VÀ

VIỆT NAM

1.5.1. Trên thế giới

Những quan sát và phát hiện sớm nhất về vi tảo (trong đó có vi khuẩn lam)

đã đƣợc các nhà thực vật học mô tả. Các nhà nghiên cứu cho rằng nhận thức của

con ngƣời về sự nở hoa gây độc của vi khuẩn lam đƣợc biết đến từ thế kỷ 12 và thời

gian gần đây họ đã cảnh báo các cƣ dân ở nhiều quốc gia nhƣ Trung quốc, Bắc Phi,

Nam Phi về việc sử dụng nguồn nƣớc tại các thủy vực có váng tảo màu xanh [2, 47,

48].

Các biện pháp phân giải độc tố microcystin đã đƣợc nghiên cứu bởi Harada,

ông đã đƣa ra các biện pháp làm giảm hàm lƣợng microcystin trong nƣớc từ kết quả

của các quá trình pha loãng, hấp thụ các hạt vật chất, sự phân giải phụ thuộc nhiệt

độ, pH, sự quang phân và sự phân giải sinh học [13]. Năm 1997, Takenaka và

Watanabe đã kiểm tra các loài vi khuẩn phân lập từ một hồ ở Nhật Bản và phát hiện

ra rằng thông qua hoạt động của enzyme alkalil protease, Pseudomunas aeruginosa

(Sphingomonas) có khả năng làm giảm MC – LR. Đó là các loài có khả năng mở

vòng độc tố và tạo ra dạng mạch thẳng dẫn tới lƣợng độc tố giảm 160 lần. Nhiều

nghiên cứu về việc sử dụng ozon để giảm bớt hiện tƣợng nở hoa của vi khuẩn lam

đã chỉ ra: với tốc độ bơm ozon vào trong nƣớc là 1gm O3 /m3 nƣớc/giờ, hầu hết các

tế bào vi khuẩn có thể bị tiêu diệt trong 15 phút [8]. Tƣơng tự nhƣ vậy các nghiên

cứu về tính ổn định của microcystin dƣới tác động của tia UV cho thấy độc tố bị

phân giải nhanh bởi tia UV ở bƣớc sóng dài tƣơng ứng với sự hấp thụ tối đa lƣợng

độc tố [14].

Trong điều kiện tự nhiên, các vi sinh vật, đặc biệt là các vi khuẩn nƣớc đóng

vai trò quan trong trong việc phân giải độc tố không hòa tan mà đƣợc giải phóng

vào nƣớc. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng microcystin có thể bị phân giải bởi

các vi sinh vật có trong hệ sinh thái thủy vực tự nhiên [12]. Đặc biệt, sự phân giải

14

sinh học microcystin còn xảy ra nhanh hơn ở các thủy vực có sự nở hoa bởi vi

khuẩn lam. Thực tế cho thấy các biện pháp cơ học nhằm lọc, vớt bỏ tảo tiêu tốn

nhiều thời gian, công sức lại không cho hiệu quả cao hoặc các biện pháp lý học, hóa

học (dùng CuSO4, vôi, Al2(SO4)3, ferric chlorit…) thƣờng không khả thi khi áp

dụng đối với các thủy vực sử dụng cho mục đích sinh hoạt bởi một lƣợng hóa chất

tồn dƣ [8]. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định tro của lúa mạch, gỗ mục và một số loại

lá đặc biệt là lá sồi có tác dụng ức chế một cách đáng kể sự sinh trƣởng của vi

khuẩn lam gây độc [15]. Dịch chiết từ vỏ quýt và vỏ chuối lùn cũng có khả năng ức

chế hiện tƣợng nƣớc nở hoa bởi vi khuẩn lam [3].

1.5.2. Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu về tảo độc mới chỉ tiến hành trong 1-2 thập niên

vừa qua. Năm 1987, khi một lô ngao Việt Nam xuất sang Cộng đồng chung Châu

Âu (EU) bị phát hiện nhiễm độc tố tảo đã gây chú ý trong dƣ luận. Nghiên cứu thuỷ

triều đỏ do thực vật phù du biển gây ra mới đƣợc bắt đầu từ năm 1993 với những

kết quả ban đầu về thành phần loài và sự phân bố tảo độc hại ở một số vùng biển

của Việt Nam, trong đó đáng chú ý là công bố về “Thực vật phù du độc hại ở biển

Việt Nam” của 2 tác giả Nguyễn Ngọc Lâm và Đoàn Nhƣ Hải tại Hội nghị Quốc tế

lần thứ 7 về Tảo độc tổ chức tại Nhật Bản. Tiếp đó là công bố của Nguyễn Ngọc

Lâm và cộng sự năm 1996 tại Hội nghị Khoa học Biển Asean-Canada về sự bùng

nổ của loài Noctiluca scintilans liên quan đến hiện tƣợng phú dƣỡng ở vịnh Văn

Phong – Khánh Hoà. Nguyễn Thị Minh Huyền (1996) có những ghi nhận đầu tiên

về một số lòai tảo độc ở vùng biển Bạch Long Vĩ. Chu Văn Thuộc (1998) nghiên

cứu tảo biển độc hại ở vùng cửa sông ven biển miền bắc Việt Nam [2, 3, 4, 5, 6, 9].

Năm 1996-1999, đề tài quốc gia do Đặng Ngọc Thanh làm chủ trì đã đƣợc

thực hiện với nội dung nghiên cứu về thành phần loài ở biển Việt Nam và một số

vấn đề liên quan đến sinh thái tảo độc [6]. Theo Trịnh Thị Thanh và Đặng Thị Sy tại

một số đầm ao nuôi thả cá ở Thanh Trì, mặc dù ngành vi khuẩn lam (cyanobacteria)

có thành phần loài không lớn (khoảng 24 loài, chiếm khoảng 13%) nhƣng thƣờng

đạt sinh khối cao vào tháng 6 và 7, đặc biệt tại các ao có sử dụng phân bắc làm

nguồn thức ăn cho cá [6, 9]. Kết quả điều tra nghiên cứu các hồ chứa và một số thuỷ

15

vực thuộc các tỉnh phía Bắc đƣợc tiến hành bởi Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng

Phƣớc Hiền (2006) cho thâý những loài tảo có tiềm năng độc gây nở hoa nƣớc

thuộc về các chi Microcystis, Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria và

Gomphospheria [4]. Theo Dƣơng Đức Tiến (2001-2005) đã xác định trong hồ Hoàn

Kiếm và một số thuỷ vực miền Nam Việt Nam có các chi Microcystis,

Cylindrospermopsis, Anabaena, Oscillatoria, Lyngbya thuộc ngành vi khuẩn lam

(Cyanobacteria) chiếm đa số về thành phần loài gây nở hoa nƣớc. Trong đó có các

loài có khả năng gây độc nhƣ Microcystis aeruginosa, M. viridis, M. botrys, M.

wesenbergii và Cylindrospermopsis raciborskii [9].

16

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu bao gồm:

- Vi khuẩn lam Microcystis đƣợc phân lập từ hồ Hoàn Kiếm

- Vi khuẩn Sphingomonas đƣợc phân lập từ hồ Hoàn Kiếm

2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm thu mẫu: Hồ Hoàn Kiếm

Thời gian tiến hành nghiên cứu: Từ tháng 1/2007 đến tháng 12/2008 tại

phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi trƣờng, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh

học, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Thời điểm thu mẫu: Thu mẫu vào hai đợt. Đợt 1: 6/3/2007, Đợt 2: 8/5/2007

Vị trí các điểm thu mẫu: thu mẫu tại 6 điểm nhƣ trong hình sau.

Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu

D1: Cửa cống hàng Khay

D2: Đối diện ngân hàng

Incombank – Lê Thái Tổ

D3: Ngân hàng ANZ

D4: Nhà hàng thủy tạ

D5: Cửa cống đối diện tổng công

ty điện lực Việt Nam

D6: Đền Ngọc Sơn

17

2.1.3. Máy móc, dụng cụ

Sử dụng máy móc và dụng cụ có tại phòng Công nghệ Tảo và Sinh học môi

trƣờng, các phòng thí nghiệm thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại

học Quốc Gia.

Trung tâm Công nghệ Môi trƣờng và Phát triển bền vững- Đại học Khoa học

Tự nhiên.

Kính hiển vi quang học (Olympus, Nhật Bản)

Kính lúp quan sát khuẩn lạc (Olympus, Nhật Bản)

Máy đo pH (Osi, Pháp)

Máy sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography, HPLC

1100, Đức)

2.1.4. Hóa chất

Hóa chất dùng cho phân tích và thử nghiệm khi tiến hành đề tài gồm:

Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ

CH3COONa Merk, Đức Nihyđrin Merk, Đức

Methanol Merk, Đức n- butanol Merk, Đức

Isopropanol Merk, Đức Ethyl axetat Merk, Đức

Hoá chất dùng trong phản ứng PCR:

Trình tự các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu :

27f 5‟ - TTGATCCTGGCAG - 3‟

780f 5‟ - GATTAGATACCCTGGTAG - 3‟

920r 5‟ - GTCAATTCCTTTGAGTTT - 3‟

1525r 5‟ - AAAGGAGGTGATCCAGCC - 3‟

10 Taq buffer dNTP mix 2.5mM

Taq polymeraza (5U).

18

2.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lam và vi khuẩn

Nuôi vi khuẩn lam Microcystis trên 6 loại môi trƣờng là Bold 3N, B12, J,

BG11, C, MA (Phụ lục 1)

Nuôi cấy vi khuẩn Sphingomonas trên 2 môi trƣờng NA và M7 (Phụ lục 2).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phƣơng pháp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm và đánh

giá chất lƣợng nƣớc

- Điều tra thu mẫu theo quy phạm của Bộ Tài nguyên và Môi trƣờng.

- Các chỉ tiêu đƣợc phân tích dựa theo „Standard methods for the

examination of water and waste water‟ của tổ chức Y tế Mỹ (Phụ lục 3).

2.2.2. Phƣơng pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis

2.2.2.1. Làm giàu mẫu

Phƣơng pháp phân lập Microcystis bƣớc 1 làm giàu mẫu [31].

Quan sát nƣớc nở hoa ở hồ Hoàn Kiếm ở thời điểm thu mẫu cho thấy loài

chủ yếu trong quần xã là Microcystis aeruginosa chiếm trên 80%. Hút 1000 µl mẫu

nƣớc hồ có các loài vi khuẩn lam khác nhau, cho vào ống Eppendorf, ly tâm

7000vòng/phút trong 10 phút và rửa 2 lần với dung dịch muối sinh lý 0,05% nhằm

mục đích loại bỏ bớt các loài tảo khác.

Lớp dịch nổi bên trên là vi khuẩn lam, sau đó hút 100 µl dịch nổi bên trên

cho vào nuôi cấy trong các bình tam giác dung tích 500 ml chứa 200 ml môi trƣờng

B12. Nuôi giữ trong điều kiện nhiệt độ 30oC dƣới ánh sáng đèn neon với cƣờng độ

ánh sáng là 1500lux theo quang chu kỳ là 12 giờ chiếu sáng và 12 giờ tối. Sau thời

gian 3 tuần nuôi cấy, quan sát khả năng sinh trƣởng của mẫu vi khuẩn lam đã đƣợc

làm giàu bằng kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần.

2.2.2.2. Phương pháp tách và thuần khiết trên thạch đĩa

Quy trình phân lập đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Shirai có cải tiến

[31]. Các tập đoàn vi khuẩn lam sau khi làm giàu đƣợc xác định dƣới kính hiển vi là

19

các chủng thuộc chi Microcystis trong mẫu nƣớc đƣợc ly tâm 10.000 vòng/phút

trong 15 phút nhằm tiếp tục loại bỏ các loài tảo khác. Tập đoàn vi khuẩn lam nổi

phía trên đƣợc hút ra, đặt vào đĩa petri và tách riêng rẽ từng tập đoàn ra dƣới kính

lúp Olympus. Các tập đoàn đó đƣợc hút riêng vào từng ống Eppendorf, sau đó tiếp

tục sử dụng máy vortex mẫu nhằm mục đích phân tách tập đoàn thành các tế bào

riêng rẽ. Pha loãng mẫu theo phƣơng pháp của Bold và cấy trang trên các môi

trƣờng dinh dƣỡng agaroza có nhiệt độ tạo gel cực thấp (type IX, Sigma) với nồng

độ 0,4%, các hộp đĩa thạch đƣợc quấn kín bằng paraphin và đặt dƣới đèn neon với

cƣờng độ ánh sáng 1000 – 1500 lux ở nhiệt độ 30oC. Sau thời gian từ 07 – 30

ngày, quan sát khuẩn lạc bằng kính lúp Olympus. Những khuẩn lạc sạch sau khi

mọc trên môi trƣờng thạch agaroza đƣợc tách sang các lọ Penicillin chứa 5ml môi

trƣờng dịch thể. Theo dõi sự phát triển của tế bào vi khuẩn lam, quy trình đƣợc tiến

hành lặp đi lặp lại cho đến khi thu đƣợc các chủng thuần khiết.

2.2.3. Phân loại vi khuẩn lam Microcystis

2.2.3.1. Bằng phương pháp hình thái

Các chủng Microcystis sau khi đã phân lập thuần khiết đƣợc quan sát dƣới

kính hiển vi quang học Olympus có độ phóng đại 400-1000 lần để quan sát các đặc

điểm hình thái và kích thƣớc tế bào của chúng. Để định loại, chúng tôi sử dụng các

tài liệu chính sau:

- Phân loại thực vật học bậc thấp .

- Phân loại Vi khuẩn lam ở Việt Nam [07].

- The on-line database of Cyanobacterial genera [27].

2.2.3.2 . Phương pháp tách ADN

ADN đƣợc chiết xuất và tách từ sinh khối ƣớt theo phƣơng pháp [44]. Lấy 3

vòng que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuôi, ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 8000

vòng trong15 phút và rửa 2 lần bằng 300µl dung dịch muối EDTA pH 8,0 (0,5M

Na2EDTA, 0,15M NaCl). Sau đó tạo dịch huyền phù trở lại trong 200µl đệm 10 x

TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu:đệm, 1: 2). Bổ sung 10µl của

20

lyzozym (Sigma, 1mg/ml Lysozym), giữ ở 37oC trong nồi cách thuỷ trong 15 phút.

Bổ sung dung dịch Tris-SDS (0,1M Tris-HCl pH 9,0 và 1% SDS) với thể tích bằng

thể tích mẫu. Dịch mẫu đƣợc giữ ở 60oC trong nồi cách thuỷ khoảng 10-30 phút.

Sự tan tế bào đƣợc xác định bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự tăng độ

nhớt tƣơng ứng. Dịch tan tế bào đƣợc làm lạnh trong đá trong 10 phút, bổ sung

150µl cloroform-isoamyl alcohol, 24:1, v/v (giữ ở 4oC) với thể tích bằng 1/3thể tích

mẫu. Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 10.000 vòng trong 20 phút để phân lớp. Sau đó

chuyển phần nhớt ở phần đầu sang Eppendorf (Cỡ. 1,5ml) mới và ADN đƣợc tách

ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95,5% giữ ở-22oC) với thể tích gấp đôi thể tích

mẫu và 2µl của 3M Na acetate (pH=4,5).

Ngâm ADN trong 100µl ethanol 70% trong 30 phút và sau đó ngâm liên tiếp

trong ethnol 80, 90, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phút. Sợi ADN làm khô bằng

nhiệt độ phòng trong 10 phút và đƣợc làm tan trở lại trong 20µl đệm 0,1 x TE (10 x

TE) ở 4oC qua đêm.

Dịch đem phân tích bằng máy quang phổ kế ở các bƣớc sóng 230, 260 và

280nm. ADN hấp thụ rất nhanh ở bƣớc sóng 260nm. ở bƣớc sóng 280 chứng tỏ sự

có mặt của protêin. Bƣớc sóng 230nm biểu hiện sự có mặt của chất đệm, các muối

nhƣ EDTA và của ARN. Các tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở các bƣớc sóng 230

: 260 : 280 là 1,0 : 0,45 : 0,515. Hàm lƣợng ADN đƣợc tính nhƣ sau: 1 đơn vị OD

(mật độ quang, Optical Durity) ở 260nm tƣơng đƣơng với 50µg/ml ADN.

Cách tính: Đơn vị mẫu x độ loãng x chỉ số/1000 = ADN µg/µl.

Nếu ADN chƣa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và

RNazaA

2.2.3.3. Hóa phân loại phân tích thành phần acid béo

Lấy 50mg mẫu cho vào ống thủy tinh nút vặn (cỡ 13mm x 100mm) [32].

Alkal hóa bằng 1.0ml chất phản ứng I (reagent I, gồm 15g sodium hydroxide

(NaOH), 50ml methanol và 50ml Milli- Q). Tế bào đƣợc thủy phân ở 1000C tại nồi

nhiệt khô trong 5 phút. Sau đó làm huyền phù bằng máy Vortex trong 5 giây rồi tiếp

tục cho thủy phân trong 25 phút. Dịch thủy phân đƣợc làm lạnh ở nhiệt độ phòng.

21

Methyl hóa dung dịch Alkal với 0.2ml chất phản ứng 2 (65ml 6N hydrochloric acid

và 55ml methanol). Sau khi metyl hóa, giữ ở 800C trong nồi cách thủy khoảng 10

phút. Dung dịch methyl hóa đƣợc bổ sung 1.25ml của chất thử 3 (gồm 50ml n-

hexane-methyl tert butyl ether, 1:1, v/v) và đƣợc trộn đều bằng máy lắc 2000rpm

trong 10 phút. Dịch nhớt phía trên đƣợc loại bỏ. Dung dịch đƣợc bổ sung 3ml thuốc

thử 4 (1.2g sodium hydroxide trong 100ml Milli-Q) và đƣợc trộn đều bằng tay trong

5 phút. Ly tâm ở 2500rpm trong 10 phút. Dịch trên cùng đƣợc chuyển sang ống

thủy tinh mới có nút vặn và cho bay hơi bằng khí nitrogen thông thƣờng tới khi khô.

Cuối cùng, toàn bộ dịch mẫu đƣợc làm tan với 50µl của diethyl ether 300 (hoặc

acetone – 300, n-hexane). Toàn bộ mẫu đƣợc chấm vào sắc ký bản mỏng (TCL) rồi

đƣợc đặt trong bồn thủy tinh chứa 100ml n-hexane-diethyl ether (4:1,v/v) trong 30 –

45 phút. Thành phần acid béo đƣợc hiên vệt bằng iot trong 30 – 45 phút. Acid béo

có cực và không cực xuất hiện nhƣ những vệt xanh. Những vệt đƣợc cạo và rửa

giải hai lần bằng diethyl ether 300. Trộn đều dung dịch silicagel trên máy lắc

2000rpm trong 10 phút và ly tâm 2500rpm trong 5 hoặc 10 phút. Dung dịch đƣợc

bay hơi bằng khí nitrogen thông thƣờng tới khi khô mẫu. Mẫu đƣợc hòa tan trở lại

với 50µl chất phản ứng 3. Dùng pipet nhỏ vào lọ nhỏ GC có nút đậy. Sau đó, đem

phân tích trên máy sắc ký khí (gas chromatography).

2.2.4. Xác định mật độ tế bào

Số lƣợng tế bào vi khuẩn lam trong một thể tích nƣớc đƣợc xác định bằng

cách đếm số tế bào trên 400 ô nhỏ thuộc 25 ô lớn của buồng đếm Goriaev.

Một ô lớn của buồng Goriaev có diện tích 1/25 mm2 và chiều cao 1/10 mm.

Nhƣ vậy thể tích của 1 ô là 1/25 × 1/10 (mm3), thể tích của 25 ô lớn là:

1/25 × 1/10 x 25 (mm3)

Nếu a là số lƣợng tế bào vi khuẩn lam đếm đƣợc trên buồng đếm thì số lƣợng

tế bào tảo trong 1 ml là:

X = a × 104 (tế bào).

22

2.2.5. Phƣơng pháp tách chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis

Trong thí nghiệm của chúng tôi, microcystin của Microcystis đƣợc tách chiết

theo phƣơng pháp đông tan [44]. Thu sinh khối bằng cách ly tâm với tốc độ 7000

vòng/20 phút sau đó lọc dịch nổi bằng thiết bị lọc GF/C (Whatman). Dịch nổi đƣợc

lọc qua màng lọc kích thƣớc 0,2 μm (Milipore). Sinh khối thu đƣợc đông khô ở

nhiệt độ – 83oC, chiết rút độc tố bằng Methanol : nƣớc cất (80:20) và bằng

Methanol : n.Hexan (85:15). Lọc qua cột C18 để loại bỏ sắc tố chiết từ tế bào

Microcystis. Dịch chiết lỏng đƣợc giữ trong catrid Sep-Pak (Water) và rửa bằng

dung dịch methanol 20%. Dịch chiết đƣợc chạy qua sắc ký bản mỏng (TLC) để làm

sạch độc tố, cạo phần độc tố trên bản TLC. Microcystin sau đó đƣợc tách ra nhờ xử

lý với 3 ml methanol 90%, đem sấy khô qua dòng khí nitrogen và hoà tan trong một

lƣợng nhỏ hỗn hợp nƣớc- ethanol 20%. Thành phần và nồng độ của dịch chiết đƣợc

xác định bằng máy HPLC (Hewlett Packard model 1100 LC) qua cột ODS II (4,6

mm; 150 mm) với methanol chứa 0,05 M phosphatase, pH 3 (tỷ lệ 6:4 theo thể

tích), tách trong pha động.

2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng trên máy quang phổ

Độc tố microcystin đƣợc phân tích trên máy quang phổ theo phƣơng pháp

[28 ]. Hàm lƣợng microcystin đƣợc tính toán theo phƣơng trình đƣờng chuẩn thu

đƣợc của microcystin chuẩn. Dựa vào đồ thị chuẩn của microcystin theo mật độ

quang, xác định hàm lƣợng microcystin có trong dịch chiết.

Phương pháp xây dựng đường chuẩn hàm lượng microcystin theo mật độ

quang: Dịch chiết MC - LR chuẩn có nồng độ 10ng/ml đƣợc pha loãng gấp 1000,

3000, 5000, 7000, 9000, 11000 lần với hỗn hợp dung môi methanon : nƣớc theo tỷ

lệ 80 : 20. Tiến hành đo ở bƣớc sóng 242 nm trên máy quang phổ ERMA 11

TOKYO. Căn cứ vào các giá trị mật độ quang đo ta lập đƣợc đồ thị biểu thị mối

quan hệ với nồng độ dịch chiết microcystin.

2.2.7. Các phƣơng pháp sắc ký

Là phƣơng pháp hiệu quả cho việc định tính, định lƣợng và tinh sạch các hợp

chất hữu cơ. Nguyên tắc chung của phƣơng pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các

23

chất giữa hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha động có thể là chất khí hoặc lỏng để

đẩy mẫu qua vùng chứa pha tĩnh. Pha tĩnh chứa chất rắn hoặc lỏng gọi là các hợp

chất phụ có khả năng chứa các chất hòa tan. Mẫu phân tích chứa một hay nhiều cấu

tử, khi tiếp xúc với pha tĩnh và pha động các cấu tử khác nhau tách nhau ra do

chúng có áp lực khác nhau với cả hai pha.

2.2.7.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

Việc tách các chất trong sắc ký bản mỏng [49] dựa trên sự phân tách các chất

giữa hai pha:

- Pha cố định là chất hấp phụ đƣợc trải rộng trên một phiến kính tạo thành

lớp mỏng.

- Pha động là dung môi thích hợp đựng trong bình có nắp đậy kín.

Trong quá trình sắc ký dung môi di chuyển làm dịch chuyển các thành phần

trong mẫu (đã đƣợc chấm thành từng vết trên phiến kính trải chất hấp phụ)

Tiến hành thí nghiệm:

- Pha mẫu sau cô quay thành 1ml bằng hỗn hợp dung môi methanol: nƣớc

(80:20), chấm toàn bộ mẫu lên trên bản silicagel. Đặt bản mỏng trong bồn thủy tinh

chứa 50ml hỗn hợp dung môi ethyl acetat: isopropanol: nƣớc = 8:5:3 (v/v), trong

45-60 phút. Sau khi làm khô tới nhiệt độ phòng, nhuộm TLC bằng nihydrin 2%

trong butanol bão hòa. Sấy khô, quan sát các vết xuất hiện trên nền TLC. Sau đó

đánh dấu, cạo các vết lên cùng với microcystin chuẩn. Tái chiết rút độc tố này bằng

hỗn hợp dung môi methanol : nƣớc (80:20). Đem dịch này ly tâm ở tốc độ 8000

vòng/ phút, trong 15 phút. Sau đó, lọc dịch qua cột C18.

2.2.7.2. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Sắc ký lỏng cao áp [27 ] là phƣơng pháp chia hỗn hợp các chất trong cột sắc

ký trong đó pha động ở trang thái lỏng nhờ một áp lực lớn đƣợc đẩy qua pha tĩnh

Trong HPLC, mẫu phân tích đƣợc bơm vào cột sắc ký qua một van bơm sáu chiều,

sau đó nhờ bơm cao áp mà pha động đƣợc đẩy qua cột với tốc độ dòng không đổi

trong suốt thời gian chạy sắc ký. Ở đây pha động vừa đóng vai trò là chất mang,

24

mang mẫu phân tích vào cột tách, vừa là chất rửa giải trong suốt quá trình chạy sắc

ký. Pha động có thể là một dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp nhiều dung môi hữu cơ

khác nhau. Thiết kế hệ thống HPLC gồm:

Tiến hành thí nghiệm

Máy HPLC trên cột ODS II 4.6mm x 150mm, đƣờng kính hạt 5 μm. Bộ lọc

dung môi và bộ lọc mẫu đƣờng kính lỗ màng 100Ao. Detector UV-VIS, λ = 242

nm, máy vi tính ghi tín hiệu nối với máy in.

Pha tĩnh: Supelcosil LC –18

Pha động : Methanol chứa 0,5M phosphate = 6:4 (v/v)

Các mẫu đƣợc hòa tan trong hệ dung môi của pha động, tiến hành chạy MC

chuẩn và mẫu nghiên cứu. Tốc độ dòng là 1ml/ phút, pH = 3.

2.2.8. Phƣơng pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas

Chủng vi khuẩn Sphingomonas [22] đƣợc phân lập từ mẫu nƣớc hồ. Lấy 1

ml nƣớc hồ pha loãng ở các nồng độ pha loãng thích hợp. Nhỏ 1ml dịch pha loãng

trên môi trƣờng dịch thể NA và M7. Sau 24 giờ nhỏ 100µl dịch cấy trang đều trên

mặt thạch quan sát thấy các khuẩn lạc, tách và cấy ria nhóm khuẩn lạc cho tách

nhau riêng rẽ. Tách và cấy một khuẩn lạc trên môi trƣờng tƣơng ứng. Quá trình lặp

lại nhiều lần cho đến khi thu đƣợc các chủng thuần khiết.

Nuôi giữ chủng vi khuẩn này trên môi trƣờng thạch nghiêng, bảo quản ở

nhiệt độ 4°C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.9. Phƣơng pháp xác định khả năng phân giải microcystin

Sự phân giải đƣợc bắt đầu bằng cách bổ sung dịch chiết microcystin thô vào

các mẫu nƣớc vô trùng để thu đƣợc các nồng độ microcystin khác nhau. Các chủng

vi khuẩn phân giải vi khuẩn lam đƣợc đƣa vào với mật độ 2.5 × 106 tế bào/ml. Sau

20 phút kiểm tra mẫu một lần bằng cách lấy 50ml dịch đem lọc qua màng lọc kích

thƣớc 0,22µm, sau đó đem đo ở bƣớc sóng 242nm để xác định nồng độ độc tố còn

lại. Mẫu đối chứng (không có vi khuẩn) đƣợc tiến hành song song. Các thí nghiệm

25

đƣợc lặp lại 3 lần. Hiệu quả phân giải microcystin đƣợc xác đinh nhờ phƣơng pháp

bán thời gian nhƣ mô tả của Kenefick [28]:

Ct = Co.e(-kt)

Trong đó: Ct – nồng độ microcystin tại thời điểm đo (µg/ml)

Co – nồng độ microcystin trƣớc phân hủy (µg/ml)

k – hằng số phân hủy bậc đầu tiên (ngày -1

)

t – thời gian bán phân hủy (ngày)

26

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU THỦY LÝ, THỦY HÓA NƢỚC HỒ HOÀN

KIẾM

Đặc điểm của các mùa có ảnh hƣởng tới các quần thể vi tảo và vi khuẩn lam.

nhƣ vi tảo silic kết hợp với việc phát triển nhanh roi trong mùa đông và mùa xuân,

tiếp theo là tảo lục vào cuối mùa xuân và đầu hè. Tại nơi phú dƣỡng và thuỷ vực

lớn, vi khuẩn lam thƣờng chiếm ƣu thế trong các loài thực vật nổi vào cuối xuân

đầu hè. Sự thay đổi về mùa là các nhân tố môi trƣờng thƣờng không đủ để gây ra sự

thay thế vi khuẩn lam bằng các loài thực vật nổi. Vi khuẩn lam là hiện hữu chiếm

ƣu thế hầu hết trong năm. Do vậy, để đánh giá chất lƣợng nƣớc hồ, chúng tôi đã tiến

hành phân tích tổng hợp các thành phần và các điều kiện ảnh hƣởng đến nƣớc.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành hai đợt thu mẫu vào tháng 03 và 05 năm

2007.

Kết quả phân tích chi tiết đƣợc trình bày ở phụ lục 5.

3.1.1. Nhiệt độ

Nhiệt độ ở một đợt thu mẫu trong cùng một hồ lại khác nhau tùy thuộc vào

thời gian và địa điểm thu mẫu. Tại các cống dẫn nƣớc thải vào hồ, nhiệt độ nƣớc

luôn cao hơn các điểm xa bờ và giữa hồ từ 1- 2°C.

3.1.2. pH

Trong thời gian chúng tôi thu mẫu, pH của hồ khá cao. Giá trị pH tại các

điểm lấy mẫu dao động từ 9,57- 9,84 vào đợt thu mẫu tháng 06/03/2007 và từ 9,77-

10,37 vào đợt thu mẫu tháng 08/05/2007.

3.1.3. Các chất lơ lửng SS

Hàm lƣợng các chất lơ lửng trong hồ tƣơng đối cao, dao động từ 230-

450mg/l trong hai đợt thu mẫu.

27

3.1.4. Hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc (DO- Dissolve oxygen)

Từ số liệu nghiên cứu cho thấy hàm lƣơng oxy hòa tan trong nƣớc cao, dao

động từ 9,42mg/l- 22,4mg/l.

Điều này phù hợp với thực tế là vào thời điểm chúng tôi tiến hành thu mẫu,

trong hồ có sự nở hoa rất nhiều của vi khuẩn lam Microcystis, chính sự quang hợp

của những váng nở hoa và các loài vi tảo khác dẫn tới hàm lƣợng oxy hòa tan trong

hồ tăng đáng kể.

3.1.5. Nhu cầu oxy hóa học (COD- Chemical oxygen demand)

Sự dao động giá trị COD trong hồ từ 80,85mg/l- 767,20mg/l. Giá trị COD

cao nhất gấp 20 lần so với tiêu chuẩn Việt Nam loại B về chất lƣợng nƣớc mặt.

3.1.6. Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD- Biochemical oxygen demand)

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hàm lƣợng BOD trong hồ dao

động thấp nhất là 55 mg/l, cao nhất là 260 mg/l vào tháng 3, ở tháng 5 thấp nhất là

100 mg/l, cao nhất là 548 mg/l. Hàm lƣợng BOD5 cao gấp 20 lần so với tiêu chuẩn

Việt Nam loại B về chất lƣợng nƣớc mặt.

Những nhận xét chung về nước ở hồ Hoàn Kiếm:

Từ các số liệu phân tích đƣợc trong bảng kết quả, có thể nhận xét hồ đang

trong tình trạng ô nhiễm. Với giá trị hàm lƣợng NH4+ dao động 0,129mg/l –

0,699mg/l, NO2- ở khoảng 0.012mg/l – 0,05mg/l, NO3

- từ 0,047mg/l – 0,129mg/l và

PO43-

là 0,08mg/l – 0.64mg/l chứng tỏ nƣớc hồ có hàm lƣợng dinh dƣỡng khá cao.

Sự phát triển của vi khuẩn lam là quanh năm nhƣng tháng 5 phát triển nhiều hơn

tháng 3 bởi thời tiết thƣờng ấm áp hơn. Vi khuẩn lam phát triển dày đặc trên mặt hồ

và đặc biệt tập trung ở khu vực cuối hƣớng gió.

3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM THUỘC CHI

Microcystis PHÂN LẬP ĐƢỢC

3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy

Lấy 1 lƣợng mẫu từ các lọ đựng mẫu trong môi trƣờng nuôi cấy làm giàu,

cho vào Eppendorf sạch, ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/15 phút. Sau đó, tiến hành pha

28

loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp (10-2; 10-3), nhỏ 100µl mẫu và trang đều trên

6 loại môi trƣờng thạch Bold 3N, B12, BG11, C, MA và J. Do M. aeruginosa có

không bào khí (gas vacuoles) nên chúng không tạo thành khuẩn lạc trên các loại

agar hoặc agarose thông thƣờng. Tuy nhiên, điều này có thể đƣợc khắc phục nhờ kỹ

thuật cải tiến của Watanabe [11, 49]. Dịch thể có chứa M. aeruginosa với môi

trƣờng sử dụng loại agarose có nhiệt độ tạo gel cực thấp nồng độ 0,4% (type IX,

Sigma) đƣợc sử dụng làm giá thể. Các đĩa thạch sau khi cấy đƣợc quấn paraphin,

đặt dƣới cƣờng độ ánh sáng 1500 Lux.

Sau 10 ngày quan sát khuẩn lạc.

Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.1 ; 3.2 ; 3.3 ; 3.4

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của

Microcystis trên môi trƣờng C


Microcystis trên môi trƣờng Bold 3N


Microcystis trên môi trƣờng B12


Microcystis trên môi trƣờng J

29

Kết quả thử nghiệm cho thấy trên 3 môi trƣờng Bold 3N, B12 và J khuẩn lạc

của Microcystis có khả năng mọc tốt hơn so với các môi trƣờng BG11, C, MA. Ở 3

môi trƣờng sau, khuẩn lạc Microcystis sau 2 - 4 tuần nuôi mới thấy xuất hiện khuẩn

lạc. Điều này cho thấy trên các môi trƣờng cơ chất khác nhau, dẫn đến khả năng

sinh trƣởng của chúng cũng khác nhau.

3.2.2. Phân lập các khuẩn lạc của Microc ystis

Phân lập các khuẩn lạc Microcystis trên các môi trƣờng nuôi cấy, bƣớc đầu

chúng tôi thu đƣợc 10 chủng. Các chủng này có những đặc điểm hình thái tế bào

đƣợc nghiên cứu dƣới kính hiển vi quang học và đƣợc phát triển nuôi cấy trên các

loại môi trƣờng khác nhau. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9;

3.10; 3.11; 3.12; 3.13; 3.14

Hình 3.5. Hình dạng tế bào chủng

Microcystis sp., LT1

Tập đoàn với tế bào hình cầu, tế bào có

màu xanh lam với nhiều không bào khí,

đƣờng kính tế bào 3-7 μm. Bao nhầy

không màu, mờ bao quanh tế bào.



Tập đoàn với tế bào hình cầu,tế bào có

màu xanh nhạt, đƣờng kính tế bào 2-5 μm,

tập đoàn hình dáng không ổn định, các

khối nhỏ hình cầu hoặc thấu kính hơi dẹt.

30




màu xanh nhạt, đƣờng kính tế bào 2-5

μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ.





đƣờng kính tế bào 5-7 μm, bao nhầy

không màu.





đƣờng kính tế bào 3-7 μm, bao nhầy

không màu.




màu xanh nhạt, đƣờng kính tế bào 4-7 μm,

tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ.

31



Tế bào hình cầu,tế bào có màu xanh

nhạt, đƣờng kính tế bào 3-6 μm, tập

hợp thành từng tập đoàn nhỏ.





đƣờng kính tế bào 5-7 μm, thƣờng sắp xếp

dày đặc.




màu xanh nhạt, các khối nhỏ hình cầu

đƣờng kính tế bào 2-4 μm.




màu xanh lam, có đƣờng kính tế bào 2-4

μm, chứa không bào khí

Kết quả ở hình 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9; 3.10; 3.11; 3.12; 3.13; 3.14 cho

thấy đặc điểm hình thái của 10 chủng trên có nhiều điểm tƣơng đồng, ở chủng LT2

32

và LT8 đều thấy tập đoàn với tế bào hình cầu, tế bào có màu xanh lam với nhiều

không bào khí bên trong, đƣờng kính tế bào 5-7 µm. Điều này có thể là do tính

thích ứng của từng chủng trong điều kiện môi trƣờng nuôi cấy. Miêu tả trên phù

hợp với những miêu tả của Watanabe [9, 49].

Tiếp theo chúng tôi lựa chọn đƣợc những chủng Microcystis mọc nhanh, tốt

trên các môi trƣờng dịch thể và tìm đƣợc thời gian nuôi cấy thích hợp cho các

chủng nhằm thu đƣợc lƣợng sinh khối đủ cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.3. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis LT1, LT2, LT3, LT4,

LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trên các môi trƣờng khác nhau

Các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa thạch, đƣợc tách và kiểm tra độ thuần

khiết dƣới kính hiển vi. Quá trình đƣợc lặp đi lặp lại cho đến khi thu đƣợc chủng

thuần khiết.

Các chủng vi khuẩn lam đƣợc tiến hành nuôi trên 3 môi trƣờng dịch thể đƣợc

chọn lọc đó là Bold3N, J và B12. Tỷ lệ giống ban đầu đƣa vào là 4 × 105

tb/ml. Cứ

4 ngày lấy mẫu, kiểm tra khả năng sinh trƣởng cho tới khi kết thúc thời gian sau 23

ngày nuôi cấy.

Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng Bold3N

Thời

gian

(ngày)

Ký hiệu chủng giống (Số lƣợng tế bào ×106/ml)

LT1 LT2 LT3 LT4 LT5 LT6 LT7 LT8 LT9 LT10

3 1,47 3,09 2,63 3,78 2,32 3,86 1,14 4,46 2,12 3,20

7 4,63 7,66 6,24 8,38 4,98 8,95 3,9 9,16 4,98 6,38

11 15,6 18,9 19,59 21,69 14,06 26,75 16,08 29,84 15,18 20,76

15 36.46 39,8 42,4 41,68 40,82 42,67 32,94 45,62 33,34 48,96

19 32,9 68,6 56,06 60,48 36,7 62,24 26,78 66,46 30,54 45,54

23 28,78 54,8 52,42 53,59 31,86 57,42 22,82 58,74 27,86 40,24

33

Hình 3.15. Sinh trƣởng của các chủng

Microcystis trong môi trƣờng dịch thể

Bold 3N

Hình 3.16. Các chủng Microcystis phát

triển tốt trong môi trƣờng dịch thể

Bold 3N

Bảng 3.2. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng J

Thời

gian

(ngày)



3 2,27 4,08 3,56 3,98 2,32 3,92 1,84 4,58 2,32 4,28

7 5,36 8,42 7,42 8,26 5,18 9,25 4,92 9,46 5,76 8,88

11 16,68 21,39 19,98 20,16 15,36 24,56 15,28 25,24 17,20 23,62

15 43,64 43,86 41,48 40,68 39,82 45,79 40,42 46,48 43,56 50,69

19 40,29 76,46 66,36 68,48 48,7 72,69 36,28 74,76 38,78 69,79

23 36,87 64,54 62,75 63,69 43,62 67,84 32,86 68,36 34,56 64,44

34


Microcystis trong môi trƣờng dịch thể J


triển tốt trong môi trƣờng dịch thể J

Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng của các chủng Microcystis trên môi trƣờng B12

Thời

gian

(ngày)



3 5,26 6,88 5,69 4,98 4,82 5,46 3,89 6,63 3,82 4,36

7 19,64 22,48 21,12 25,26 15,96 19,72 14,32 18,46 15,57 12,44

11 38,82 42,69 39,88 52,44 35,36 44,12 35,98 35,56 37,28 33,49

15 35,56 49,66 46,48 48,32 33,26 50,29 30,52 54,78 33,54 43,48

19 33,22 36,45 42,46 43,46 28,72 41,36 26,28 44,96 28,26 37,89

23 21,4 28,6 27,0 32,8 22,0 34,2 18,6 33,4 18,2 22,4

35


Microcystis trong môi trƣờng dịch thể

B12


triển tốt trong môi trƣờng dịch thể B12

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy các chủng Microcystis sinh trƣởng trên môi

trƣờng Bold 3N, mật độ tế bào của các chủng đạt từ 32,94 – 68,6 × 106 sau 15 đến

19 ngày nuôi cấy. Đặc biệt chủng LT2 mật độ tế bào đạt cao nhất 68,6 × 106 /ml

sau ngày thứ 19.

Ở bảng 3.2 cho thấy các chủng Microcystis sinh trƣởng trên môi trƣờng J,

mật độ tế bào của các chủng đạt từ 40,42 – 76,46 × 106 /ml sau 15 đến 19 ngày nuôi

cấy. Trong đó chủng LT2 vẫn phát triển với mật độ tế bào đạt cao nhất 76,46 ×

106 /ml sau ngày thứ 19.

Ở bảng 3.3 cho thấy các chủng Microcystis sinh trƣởng trên môi trƣờng

B12, mật độ tế bào của các chủng đạt từ 35,36 – 54,78 × 106/ml sau 12 đến 15

ngày nuôi cấy. ở môi trƣờng này chủng LT8 phát triển với mật độ tế bào đạt cao

nhất 54,78 × 106/ml sau ngày thứ 15.

Từ những kết quả trên, chúng tôi nhận thấy khả năng sinh trƣởng của các

chủng khác nhau là khác nhau. Hai chủng LT2 và LT8 đều phát triển tốt nhất trên

các môi trƣờng dịch thể và thời gian sinh trƣởng của chúng chỉ trong 15 ngày, do

đó, chúng tôi lựa chọn 2 chủng này để tiếp tục nuôi thu sinh khối cho những nghiên

cứu tiếp theo.

3.2.4. Thành phần acid béo trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8

Bản chất hóa học của các chất dự trữ và thành tế bào của vi tảo đóng vai trò

quan trọng trong việc phân biệt các nhóm vi tảo khác nhau. Trong nghiên cứu này

36

chúng tôi tiến hành phân tích thành phần acid béo của 2 chủng LT2 và LT8 trên

máy sắc ký khí.

Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4. Thành phần acid béo có trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8

STT

Thành phần các acid béo

Lƣợng acid béo có trong tế bào

(µg/mg mẫu)

LT2 LT8

1 Myristic acid ( C14H28O2) 0,01572 0,01566

2 Palmitoleic acid (C16H30O2) 0,0133 0,272

3 Palmitic acid (C16H32O2) 1,302 0,9683

4 6,9,12- Octadecatrienoic acid (γ -

Linolenic, GLA) (C18H30O2)

0,0906 0,1458

5 9,12- Octadecadienoic acid (Linoleic)

(C18H32O2)

0,1926 0,1787

6 12- Octadecenoic acid (Oleic)

(C18H34O2)

0, 0822 0,0718

7 Octadecanoic acid (Stearic)

(C18H36O2)

0,1574 0,0577

Bảng 3.4 cho thấy kết quả phân tích thành phần acid béo của 2 chủng

Microcystis LT2 và LT8 có 7 loại acid béo no và không no từ C14 đến C18, trong

đó thành phần acid palmitic (C16H32O2) chiếm lƣợng lớn nhất với 1,302 µg/mg

trọng lƣợng khô ở chủng LT2 (74% tổng số acid béo) và 0,9683 μg/mg ở chủng

LT8 (56%). Các acid béo không no chỉ chiếm tỉ lệ thấp. Đây có thể là đặc điểm của

chi Microcystis. Nhìn chung hai chủng LT2 và LT8 có hàm lƣợng acid béo tƣơng

đối giống nhau, chỉ khác nhau cơ bản ở hàm lƣợng acid palmitoleic và acid stearic.

3.2.5. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S

Ở đây ngoài việc phân loại 2 chủng LT2 và LT8 bằng phƣơng pháp truyền

thống dựa trên các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, cả hai chủng LT2

và LT8 này đều thuộc chi Microcystis. Để xác định rõ 2 chủng thuộc loài nào của

chi Microcystis chúng tôi tiến hành phân loại theo phƣơng pháp sinh học phân tử

dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S. Đây không phải là một công việc đơn

giản và máy tính sẽ giúp ta hoàn toàn các tính toán cần thiết để tối thiểu hoá số

khoảng trống và các lỗi bắt cặp sai của các trật tự đƣợc so sánh. Sự phân loại dựa

vào quá trình phân tích mối quan hệ dựa trên ADN trong tiến hoá của phân loại

37

chủng loại phát sinh hoặc dựa vào những đặc điểm tƣơng tự nhau trong phân loại

hình thái đều đƣợc thể hiện ở những sơ đồ dạng cây gọi là cây phả hệ. Cây phả hệ

cho phép nhận biết mối quan hệ di truyền giữa các loài và giữa các chủng cùng

loài. Sử dụng Cluxtal 18.1 và chƣơng trình điện toán MEGA 2.1 cùng các thông số

tiến hoá cần thiết cho thấy mối quan hệ đã đƣợc thiết lập trên cơ sở phân tích phân

đoạn, so sánh giữa các vùng bảo toàn của những đoạn gen rADN 16S.

Hình 3.21. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của 2 chủng LT2,

LT8 và các loài có quan hệ họ hàng gần

Cây phả hệ (hình 3.21) cho thấy mối quan hệ gần giữa chủng LT2 (đoạn gen

456bp) và LT8 (đoạn gen 457bp) với 13 trật tự nucleotit của các chủng thuộc

Cyanobacteria trong ngân hàng dữ liệu gen. Chúng nằm trên cùng một nhánh và

cùng nhóm với loài Microcystis aeruginosa EU078503 với độ tƣơng đồng là 100%

(chủng LT2) và 99% (chủng LT8).

Cây phả hệ vẽ theo phƣơng pháp neighbour joining thƣớc đo = 0,05 Knor

trong trình tự nucleotid. Các giá trị hiển thị tại các nhánh cây là kết quả phân tích

boostrap với độ lập lại 1000 (với những giá trị >50% mới đƣợc thể hiển trên cây).

Sự khác biệt giữa 2 chủng là không đáng kể và nằm trong phạm vi khác biệt

cùng loài (conspecific variation). Dựa vào các kết quả phân tích đặc điểm sinh lý,

Lyngbya majuscula AF510964

Lyngbya majuscula AF510965

Anabaena circinalis EU780160

Anabaena circinalis EU780161

Anabaena circinalis EU078518 88

100

100

Microcystis aeruginosa AB023261

96

Microcystis ichthyoblabe AB012338

Microcystis viridis AY121357

Microcystis viridis AY065976

100

Microcystis wesenbergii AB038538

100

LT8

LT2

Microcystis aeruginosa EU078503

100

Microcystis aeruginosa EU078504

100

100

87

73

0.005

100 Microcystis aeruginosa EU078505

38

hoá và cây phả hệ cho thấy chúng có nhiều đặc điểm chung vì vậy 2 chủng LT2 và

LT8 đều thuộc loài Microcystis aeruginosa.

3.3. TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ MICROCYSTIN

Chúng tôi tiến hành tách chiết độc tố microcystin theo phƣơng pháp nhƣ đã

miêu tả ở phần phƣơng pháp (mục 2.2.5).

3.3.1. Sắc ký bản mỏng (TLC)

Hình 3.22. Kết quả chạy TLC

trƣớc khi nhuộm nihyđrin

Hình 3.23. Kết quả chạy TLC sau khi nhuộm

nihyđrin

Từ kết quả ở hình 3.22 và 3.23 ta thấy trên bản silicagel chạy mẫu tách chiết

microcystin xuất hiện các băng tƣơng đồng với băng MC chuẩn. Điều đó chứng tỏ

sự có mặt của độc tố trong mẫu chiết. Dựa vào kết quả này, chúng tôi tiến hành

phân tích và xác định hàm lƣợng microcystin trong dịch chiết trên máy quang phổ

và sắc ký lỏng cao áo HPLC.

3.3.2. Xác định hàm lƣợng microcystin trên máy quang phổ

Các băng chứa microcystin của dịch chiết chạy trên sắc ký bản mỏng đƣợc

cạo và tái chiết rút bằng methanol 80%. Sau đó lọc qua cột C18, lấy 1ml dịch lọc,

pha loãng 7000, 8000, 9000 lần. Đem các dung dịch đó đo trên máy quang phổ ở

bƣớc sóng 242 nm.

Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.24

Microcystin

chuẩn

39

y = 117.17x

R ² = 0.967

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

Nồng độ mic roc ystin

Giá

trị

OD

(2

42

nm

)

Hình 3.24. Đồ thị đƣờng chuẩn microcystin

Dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn microcystins y = 117,17x và giá trị mật

độ quang đo đƣợc của dịch pha loãng trên máy quang phổ, xác định đƣợc hàm

lƣợng microcystin trong dịch chiết chủng LT2 là 102,4ng/ml và chủng LT8 là

108,8ng/ml.

3.3.3. Hàm lƣợng microcystin trên sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Dung dịch sau khi lọc qua cột C18, tiếp tục đƣợc lọc qua màng lọc. Sau đó,

cho bay hơi bằng dòng khí nitrogen tới 50µl. Mẫu đƣợc phân tích trên máy sắc ký

lỏng cao áp tại bƣớc sóng 242 nm. Dùng microcystin của hãng Sigma, làm chất

chuẩn.

Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.25. a, b, c, d, e

40

Hình 3.25a. Sắc ký đồ microcystin RR chuẩn

Hình 3.25b. Sắc ký đồ microcystin YR chuẩn

41

Hình 3.25c . Sắc ký đồ microcystin LR chuẩn

Hình 3.25d. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT2

42

Hình 3.25e. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT8

Nhìn vào kết quả sắc ký đồ của dịch chiết trên HPLC, trên sắc ký đồ thấy

xuất hiện các cột biểu hiện đặc trƣng của độc tố microcystin. Trong biểu đồ, có sự

xuất hiện của các cột với thời gian lƣu là 4,776 phút, 7,409 phút, 10,422 phút gần

tƣơng ứng với thời gian lƣu của MC - RR, YR, LR chuẩn, chứng tỏ trong dịch chiết

có chứa cả ba loại độc tố. Ngoài các cột đặc trƣng này còn xuất hiện các đƣờng cột

khác là các cột của dung môi. Dựa vào diện tích cột xác định đƣợc hàm lƣợng của

các thành phần độc tố nhƣ sau

43

Bảng 3.5. Hàm lƣợng microcystin của 2 chủng LT2 và LT8

Ký hiệu

chủng

Lƣợng MC- RR Lƣợng MC – YR Lƣợng MC - LR

Thời

gian

Vùng xuất

hiện cột

Thời gian Vùng xuất

hiện cột

Thời gian Vùng xuất

hiện cột

LT2 4‟715 29,705 7

‟378 26,570 10

‟27 30,460

Lƣợng MC

(ng/mg

trọng lƣợng

khô)

474,3

132,6

114,1

LT8 4‟76 31,450 7

‟488 27,140 10

‟422 30,450

Lƣợng MC

(ng/mg

trọng lƣợng

khô)

512,8

236,8

114,25

Bảng 3.5 cho thấy kết quả sắc ký đồ trên HPLC cho ra các cột biểu hiện đặc

trƣng độc tố từ mẫu vi khuẩn lam, microcystin đƣợc thăm dò với nhiễu giới hạn.

Tuy nhiên, trong biểu đồ có sự xuất hiện của các cột không mong muốn đó là các

cột của dung môi.

Kết quả phân tích cho thấy cả 2 chủng LT2 và LT8 tế bào đều chứa độc tố

với các loại microcystin trong tế bào nhƣ MC - LR, -YR và -RR. Hàm lƣợng MC-

LR trong chủng LT2 là 114,1 ng, LT8 là 114,25 ng/mg trọng lƣợng khô. Hàm lƣợng

MC-YR trong chủng LT2 là 132,6 ng, LT8 là 236,8 ng/mg trọng lƣợng khô. Hàm

lƣợng MC - RR trong chủng LT2 là 474,3 ng, LT8 là 512,8 ng/mg trọng lƣợng khô.

Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy trong dịch chiết microcystin từ tế bào khô

Microcystis, hàm lƣợng độc tố MC – RR đạt lớn nhất 512,8 ng/mg trọng lƣợng khô

so với lƣợng độc tố MC - LR.

Trong khi đó, hàm lƣợng MC - LR cho phép trong nƣớc uống của WHO là 1

µg/L [48]. Nhƣ vậy nồng độ MC - LR trong hai chủng này 1,141µg/L với LT2 và

1,1425 µg/L với LT8 đã vƣợt quá ngƣỡng cho phép của WHO, sẽ là nguy cơ đe dọa

cho nguồn nƣớc nếu sau khi tế bào phân giải, toàn bộ lƣợng độc tố nội bào giải

phóng vào trong nƣớc.

44

3.4. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN NƢỚC CÓ

KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MICROCYSTIN

3.4.1. Phân lập các chủng vi khuẩn nƣớc

Do tầm quan trọng và mức độ gây độc của các vi khuẩn lam nở hoa trong các

thuỷ vực ngày càng gia tăng nên các nghiên cứu về độ bền vững và phân giải độc tố

của chúng trở nên rất cần thiết. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sinh vật, đặc biệt

các vi khuẩn nƣớc đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải độc tố không hoà

tan đƣợc giải phóng vào trong nƣớc.

Ngƣời ta đã chứng minh rằng microcystin có thể bị phân giải bởi các vi sinh

vật có trong hệ sinh thái thuỷ vực tự nhiên [28]. Ngoài ra có các bằng chứng cho

rằng sự phân giải sinh học microcystin xảy ra nhanh hơn ở các thuỷ vực thƣờng bị

tảo lam độc nở hoa [49, 51]. Ngày nay khi hiện tƣợng nở hoa của tảo lam độc trong

các thuỷ vực trở nên nghiêm trọng thì các nghiên cứu tập trung vào vấn đề vi khuẩn

nƣớc là cách để giảm thiểu tác hại của vi khuẩn lam và độc tố của chúng. Do vậy,

các chủng vi khuẩn nƣớc đƣợc tuyển chọn và phân lập từ 6 địa điểm với sự xuất

hiện Microcystis theo tỷ lệ 1:1 (tính theo ml) đƣợc nuôi cấy làm giàu trong các ống

nghiệm dung tích 10 ml chứa 3 ml môi trƣờng NA, M7 [44].

Sau đó đem nuôi giữ trong điều kiện nhiệt độ 30oC dƣới ánh sáng đèn neon

yếu với cƣờng độ ánh sáng là 1000 lux theo quang chu kỳ là 12 giờ chiếu sáng : 12

giờ tối. Sau 24 nuôi cấy, đem ly tâm dịch thể với tốc độ 7000 vòng/10 phút thu sinh

khối. Rửa sinh khối 3 lần bằng dung dịch NA, M7 vô trùng. Sau đó đem nuôi cấy

lại trong thời gian 24 giờ dƣới các điều kiện đã mô tả ở trên (để kích thích các

chủng vi khuẩn thích ứng với sự phân giải tế bào M. aeruginosa và phân giải độc tố

microcystin).

45

Hình 3.26. Nuôi cấy làm giàu các chủng vi

khuẩn nƣớc trên môi trƣờng NA và M7

Hình 3.27. Cấy pha khuẩn lạc vi

khuẩn trên môi trƣờng NA

Hình 3.26 và 3.27 cho thấy sau 24 giờ nuôi cấy làm giàu trên 2 môi trƣờng.

Chúng tôi nhận thấy màu của dịch nuôi cấy xanh trên môi trƣờng MA và còn trên

môi trƣờng M7 không thấy xuẩt hiện màu xanh. Điều này cho thấy môi trƣờng.

MA thích hợp cho việc phân lập và nuôi cấy các chủng vi khuẩn nƣớc. Các mẫu

tiếp tục đƣợc cấy ria trên môi trƣờng thạch NA. Sau 12 giờ quan sát sự xuất hiện

các khuẩn lạc có tiết sắc tố xanh vào trong môi trƣờng. Tách các khuẩn lạc đơn cấy

ria trên môi trƣờng thạch nhiều lần cho đến khi tách đƣợc chủng thuần khiết. Trong

thí nghiệm này chúng tôi chọn đƣợc 2 chủng vi khuẩn có ký hiệu N4 và N7 có khả

năng sinh trƣởng tốt chỉ sau 12 giờ đã tiết sắc tố xanh vào môi trƣờng.

Nuôi giữ giống gốc vi khuẩn trên môi trƣờng thạch nghiêng (môi trƣờng

NA) và bảo quản ở nhiệt độ 4oC, dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.

46

Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái của 2 chủng vi khuẩn nƣớc N4 và N7

Đặc điểm Ký hiệu chủng

N4 N7

Hình thái khuẩn lạc

sau 30 giờ

Khuẩn lạc tiết sắc tố xanh

vào trong môi trƣờng, bề mặt

ƣớt và nhẵn.

Khuẩn lạc tiết sắc tố xanh

vào trong môi trƣờng, bề

mặt ƣớt và nhẵn.

Hình dạng tế bào Tế bào hình que nhỏ, có roi Tế bào hình que nhỏ, có roi

Nhuộm Gram - -

Menaquinon

Q10 Q10

Khả năng di động Có khả năng di động nhanh Có khả năng di động nhanh

Phản ứng lòng đỏ

trứng

- -

Oxygen Kỵ khí không bắt buộc Kỵ khí không bắt buộc

Khả năng phát

quang dƣới đền UV Có khả năng phát quang Có khả năng phát quang

Ghi chú : - (không có phản ứng)

Bảng 3.6 cho thấy cả 2 chủng đều có khả năng di động và có khả năng phát

quang dƣới tia cực tím và là vi khuẩn Gram âm. Đặc biệt cả 2 chủng đều chứa Q10

đặc trung của các vi khuẩn nƣớc Sphingomonas.

Bảng 3.7. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng N4 và N7

Đặc điểm

Ký hiệu chủng Khả năng

đồng hóa

Ký hiệu chủng

N4 N7 N4 N7

Khả

năng

thủy

phân

Tinh bột - - Fructose ++ ++

Rgamnose ++ ++

Protenase + + Ribose ++ ++

Sucrose + +

Catalase ++ + Glucose ++ ++

Lên men glucose ++ ++ Cellulose + +

Phản ứng VP + - Dextrin ++ ++

Khả

năng

chịu

muối

0,5% ++ ++ Mantose ++ ++

1% ++ ++ Xylose ++ ++

1,5% ++ ++ Galactose ++ ++

2% ++ ++ Trehalose ++ ++

3% ++ ++ Lactose ++ ++

5% ++ ++

Ghi chú: + Có phản ứng - Không xẩy ra phản ứng

47

Bảng 3.7 cho thấy 2 chủng vi khuẩn N4 và N7 đều không khả năng phân giải

tinh bột. Cả 2 chủng đều có khả năng phân hủy protein, nghĩa là có hoạt tính

protease. Ngoài ra cả 2 chủng này đều cho hoạt tính catalase rất mạnh. Chúng cũng

có khả năng chịu muối tốt từ 0,5- 5% và đồng hóa đƣợc hầu hết các loại đƣờng.

Điều này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của David mô tả các chủng vi khuẩn

Sphingomonas phân giải độc tố MLR [20].

3.4.2. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S 2 chủng N4 và N7

Để có đƣợc nhiều hơn nữa thông tin xác định về vị trí phân loại và phát sinh

chủng loại của 2 chủng N4, N7. ADN genom của 2 chủng N4 và N7 đƣợc dùng làm

khuôn để khuyếch đại đoạn ADN bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi 27f và

1252r. Chúng tôi đã xác định trình tự rADN 16S của nó và so sánh với trình tự có

sẵn trong Ribosomal Data Project. Tìm kiếm trình tự tƣơng đồng trực tuyến chỉ ra

rằng, trong số các loài đã công bố, trình tự rADN 16S (đoạn 700bp) của N4 giống

trình tự của Sphingomonas mali Y09638 (99%), Sphingomonas asaccharolytica

Y09639 (99%). Với chủng N7 (đoạn 564bp) giống Sphingomonas asaccharolytica

Y09639 (100%) và Sphingomonas mali Y09638 (99%).

Khoảng cách tiến hóa đƣợc tính toán để thiết lập cơ sở dữ liệu bao gồm trình

tự của chủng N4, N7 và 27 trình tự khác của nhóm Sphingomonas phân lớp alpha

của Proteobacteria với Rhodospirillum rubrum là outgroup (ngoài nhóm).

Cây phát sinh chủng loại đã đƣợc xây dựng lại trên cơ sở các số liệu ma trận

về khoảng cách thu đƣợc nhƣ (hình 3.28, 3.29). Chủng N4, N7 phân nhánh sâu từ 1

nhóm chính, nhóm này bao gồm một số thành viên của chi Sphingomonas. Các loài

đã công bố của chi Sphingomonas khác nhau về phát sinh chủng loại

Hai cây phả hệ vẽ theo phƣơng pháp neighbour joining thƣớc đo = 0,02 Knor

trong trình tự nucleotid. Các giá trị hiển thị tại các nhánh cây là kết quả phân tích

boostrap với độ lập lại 1000 (với những giá trị >50% mới đƣợc thể hiện trên cây

phả hệ).

48

Hình 3.28. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N4 và

các loài có quan hệ họ hàng gần

Rhodospirillum rubrum D30778

Sphingomonas sibiricus Y10678

Sphingomonas parapaucimobilis D13724

Sphingomonas sanguinis D13726

Sphingomonas paucimobilis D13725

62

Sphingomonas trueperi X97776

98

Sphingomonas asaccharolytica Y09639

Sphingomonas mali Y09638

N4

100

Sphingomonas adhaesiva D13722

Sphingomonas terrae D13727

Sphingomonas macrogoltabida D13728

88

Sphingomonas natatoria AB024288

Erythr ursincola AB024289

Novosphingobium aromaticivorans U20756 Sphingomonas subterraneae U20773 Novosphingobium capsulatum D16147

99

Sphingomonas subarctica X94102

99

100

86

Porphyrobacter tepidarius D84429

Porphyrobacter neustonensis L0

Erythrobacter longus M59062

Erythrobacter litoralis AB013354

67

91

Erythromicrobium ramosum AB013

78

67

100

92

55

Sphingomonas agrestis Y12803

Sphingomonas flava

X87164

Sphingomonas chlorophenolica X87162

68

Sphingomonas yanoikuyae SPP16SRR7

100

Sphingomonas suberifaciens D13737

50

71

56

86

58

0.02

49

Hình 3.29. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N7 với

các loài có quan hệ họ hàng gần

3.5. KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA 2 CHỦNG

Sphingomonas N4 VÀ N7

3.5.1. Hiệu quả phân giải microcystin của 2 chủng N4 và N7

Hàm lƣợng microcystin trong dịch chiết chủng LT2 là 102,4ng/ml và chủng

LT8 là 108,8ng/ml. Sự phân hủy đƣợc bắt đầu bằng cách bổ sung dịch chiết

microcystin thô vào các mẫu nƣớc vô trùng (dùng bình có thể tích 1000ml bổ sung

600 ml) để thu đƣợc nồng độ microcystin tổng số là 10 µg/l. Các chủng vi khuẩn

phân giải vi khuẩn lam đƣợc đƣa vào bình với mật độ tế bào nuôi cấy là 2,5 × 106 tế

bào/ml. Các bình sau đó đƣợc nuôi tĩnh trong điều kiện phòng thí nghiệm (30oC).

Kiểm tra mẫu sau 1 giờ bằng cách lấy 50 ml dịch đem lọc qua màng lọc kích thƣớc

Rhodospirillum rubrum D30778

Sphingomonas sibiricus Y10678 Sphingomonas parapaucimobilis D13724

Sphingomonas sanguinis D13726 Sphingomonas paucimobilis D13725

67

Sphingomonas trueperi X97776

94

Sphingomonas mali Y09638 Sphingomonas asaccharolytica Y09639

N7

61

80

58

Porphyrobacter tepidarius D844 Erythromicrobium ramosum AB013

Porphyrobacter neustonensis L0 68 Erythrobacter longus M59062

Erythrobacter litoralis AB0133

99

56 Novosph aromaticivorans U20756

Sphingomonas subterraneae U20773 Novosphi capsulatum D16147

87

Sphingomonas subarctica X94102

96

Sphingomonas agrestis Y12803 Sphingomonas chlorophenolica X87162 Sphingomonas flava X87164

96

Sphingomonas yanoikuyae D13728

93

Sphingomonas natatoria AB024288 Erythr ursincola AB024289

Sphingomonas suberifaciens D13737

100

Sphingomonas adhaesiva D13722 Sphingomonas terrae D13727 Sphingomonas macrogoltabida SPP16SRR

54

99

100

78

100

75

96

69

0.02

50

0,2 µm. Dịch thu đƣợc bảo quản trong catrit Sep-Pak ODS trƣớc khi tiến hành phân

tích. Thí nghiệm đối chứng (không có vi khuẩn) đƣợc tiến hành song song. Hai

chủng vi khuẩn N4, N7 đƣợc tuyển chọn dùng làm phân giải microcystin cho các thí

nghiệm có nồng độ microcystin cao từ 2, 5 và 10 µg/l theo nhƣ phƣơng pháp đã

trình bày. Hiệu quả phân giải microcystin đƣợc xác định nhờ phƣơng pháp bán thời

gian nhƣ mô tả của Kenefick.

Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.30.

Bảng 3.8. Hằng số tốc độ phân giải (K) và thời gian bán phân giải microcystin ở các

nồng độ khác nhau

Chủng

vi

khuẩn

Nồng độ microcystin ban đầu

2 µg/l 5 µg/l 10 µg/l

(1) (2) (3)

K(1/ngày) t0,5(ngày) K(1/ngày) t0,5(ngày) K(1/ngày) t0,5(ngày)

N4 0,076 0,074 0,045 0,102 0,043 0,140

N7 0,094 0,092 0,052 0,156 0,056 0,153

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Hàm

lƣ

ợng M

C p

hân

giả

i

2 5 10

Nồng độ microcystin ban đầu

N4

N7

Hình 3.30. Thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau của 2

chủng N4, N7.

51

Khả năng phân giải độc tố của chúng khá nhanh, đặc biệt ở nồng độ độc tố

thấp 2 µg/l, thời gian bán phân giải microcystin tƣơng đối ngắn, đối với chủng LT2

là 0,074 ngày (1 giờ 47 phút), đối với LT8 là 0,092 ngày (2 giờ 12 phút). Với nồng

độ microcystin cao gấp 5 lần (2 µg/l), thời gian bán phân giải của 2 chủng LT2, LT8

lần lƣợt là 0,14 ngày (3 giờ 21 phút) và 0,153 ngày (3 giờ 40 phút). Hằng số tốc độ

ban đầu trong các nghiên cứu của chúng tôi là từ 0,43-0,56 /ngày, so sánh với hằng

số tốc độ trong báo cáo của Jones [28] từ 0,05-0,3/ngày, Jones đã đo mức độ phân

giải microcystin bằng các thể tích khác nhau của tế bào còn lại không bị tách chiết

từ môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn phân giải microcystin. Hằng số tốc độ theo

Kenefick [28 ] là 0,25/ngày cũng phản ánh sự phân giải chậm hơn. Các kết quả trên

cho phép chúng tôi sơ bộ kết luận 2 chủng vi khuẩn Sphingomonas N4, N7 phân

lập từ nƣớc hồ có hoạt tính phân giải độc tố microcystin. Khả năng phân giải đối

với từng loại độc tố microcystin cụ thể sẽ đƣợc tiến hành trong các nghiên cứu tiếp

theo.

3.5.2. Xác định điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của

chủng Sphingomonas N4 và N7

Một trong các yếu tố gây ảnh hƣởng nhiều nhất tới tốc độ phân giải độc tố

microcystin của vi khuẩn Sphingomonas đƣợc xác định là nhiệt độ. Chính vì vậy,

trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành các thử nghiệm khả năng phân giải độc tố

microcystin bởi vi khuẩn Sphingomonas ở các nhiệt độ khác nhau là 20, 25, 30°C,

dải nhiệt độ này cho phù hợp với điều kiện tự nhiên của hồ với nồng độ microcystin

ban đầu là 40 μg/l. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.9, 3.10 và hình 3.31, 3.32.

52


các nhiệt độ khác nhau

Nhiệt

độ

(°C)

Tỷ lệ % microcystin khôngbị phân giải

sau các khoảng thời gian (ngày)

0 1 2 3 4 5 6 7

20 100 82 80 75 68 56 49 33

25 100 74 52 46 38 31 23 0

30 100 56 28 16 6 0

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian (ngày)

Tỷ

lệ

ph

ân %

mic

rocy

stin

kh

ôn

g b

ị p

hân

giả

i

20

25

30

Hình 3.31. Khả năng phân giải microcystin của vi khuẩn Sphingomonas N4 ở các

nhiệt độ khác nhau


các nhiệt độ khác nhau

Nhiệt

độ

(°C)

Tỷ lệ % microcystin bị phân giải sau các khoảng thời gian

(ngày)

0 1 2 3 4 5 6 7

20 100 88 79 70 65 58 47 31

25 100 81 63 46 35 28 22 0

30 100 58 43 31 19 11 0

53

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian (ngày)

Tỷ

lệ

% m

icro

cyst

in k

hô

ng

bị

ph

ân g

iải

20

25

30

Hình 3.32. Khả năng phân giải của vi khuẩn Sphingomonas N7 ở nhiệt độ khác

nhau

Hình 3.31 và 3.32 cho thấy tốc độ phân giải microcystin của hai chủng vi

khuẩn Sphingomonas N4 và N7 phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Tốc độ phân giải có

sự khác biệt rõ ràng ở các nhiệt độ từ 20-30oC. Trong khoảng nhiệt độ thử nghiệm

này, tốc độ phân giải tỷ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ. Tại nhiệt độ 20°C tỷ lệ

phân giải đạt 44% và 42% sau 5 ngày, lần lƣợt với N4 và N7. Tốc độ phân giải lớn

nhất đạt đƣợc khi tiến hành khảo sát ở 30°C, sau 5 ngày (N4) và 6 ngày (N7), hàm

lƣợng độc tố microcystin còn lại trong dịch chiết nằm dƣới ngƣỡng phát hiện.

Sự phân giải microcystin đã bắt đầu trong vòng 1 ngày khi ở nhiệt độ nằm

trong khoảng 20 - 30oC. Trong thực tế, thời gian nở hoa cực đại ở hồ Hoàn kiếm

rơi vào khoảng cuối tháng 3, đầu tháng 5, khi mà các váng xanh dày nổi trên bề mặt

hồ nhƣ một lớp sơn, dạt vào bóng râm các tán lá rủ trên mặt hồ. Lúc này ngƣỡng

nhiệt độ dao động trong khoảng 25 - 30oC, tối thích cho sự phát triển của

Microcystis. Mối quan hệ dinh dƣỡng mật thiết giữa Microcystis và Sphingomonas

kéo theo hoạt động mạnh mẽ của loại vi khuẩn này vào cùng thời điểm.

Thí nghiệm này là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về điều kiện tuyển

chọn và phân lập thêm các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải các loại độc tố

microcystin.

54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Hồ Hoàn Kiếm đang ở tình trạng ô nhiễm, hàm lƣợng COD, BOD vƣợt

tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 4942- 1995 (loại B) 20 lần. Với giá trị NH4+ từ 0,129-

0,699 (mg/l), NO2- từ 0.012- 0,05 (mg/l), NO3

- từ 0,047- 0,129 (mg/l), PO4

3- từ

0,08- 0.64 (mg/l) chứng tỏ hồ có hàm lƣợng dinh dƣỡng N, P khá cao.

2. Đã phân lập thuần khiết và nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam thuộc chi



3. Các chủng Microcystis đều sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng Bold 3N với số

lƣợng tế bào đạt từ 32,94 – 68,6 ×106 tb/ml sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Đặc biệt

chủng LT2 số lƣợng tế bào đạt cao nhất là 68,6 ×106 tb/ml sau ngày thứ 19. Trên

môi trƣờng J, các chủng Microcystis sinh trƣởng số lƣợng tế bào của các chủng đạt

từ 40,42 – 76,46 ×106 tb/ml sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Trong đó chủng LT2 vẫn

phát triển với số lƣợng tế bào đạt cao nhất 76,46 ×106 tb/ml sau ngày thứ 19. Trên

môi trƣờng B12, số lƣợng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78 ×106 tb/ml sau 12 đến 15


nhất 54,78 ×106 tb/ml sau ngày thứ 15.

4. Có 7 loại axít béo không no dạng C15, C17 và C19 trong tế bào 2 chủng

Microcystis LT2 và LT8. trong đó thành phần acid palmitic (C16H32O2) chiếm

lƣợng lớn nhất với 1,302 μg/mg trọng lƣợng khô ở chủng LT2, chủng LT8 là

0,9683 μg/mg trọng lƣợng khô. Kết quả cho thấy có sự sai khác nhau về lƣợng của

7 loại acid béo có ở trong tế bào 2 chủng LT2 và LT8.

5. Dựa vào phƣơng pháp phân loại truyền thống theo phân loại hình thái học



nƣớc N4 và N7 đƣợc xác định thuộc các loài Sphingomonas mali và Sphingomonas

asaccharolytica.

55

6. Phân tách trên TLC cho thấy dịch chiết từ sinh khối Microcystis khô có

chứa độc tố, hàm lƣợng microcystin thô phân tích trên quang phổ với chủng LT2 là

102,4ng/ml và chủng LT8 là 108,8ng/ml

7. Dựa vào kết quả phân tích trên HPLC, hàm lƣợng độc tố MC – RR đạt lớn



8. Nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của các 2 chủng vi khuẩn

Sphingomonas sp., N4, N7 là 30°C. Sau 7 ngày sự phân giải gần nhƣ hoàn toàn là

100%.

.Kiến nghị

- Cần tiếp tục giám sát sự nở hoa của các chủng vi khuẩn lam gây độc ở hồ

Hoàn Kiếm - Hà Nội và mối liên quan của chúng với các điều kiện môi trƣờng.

- Cần tiếp tục tiến hành những nghiên cứu về các biện pháp giảm thiểu và

ngăn ngừa tác hại do vi khuẩn lam gây độc gây ra, trong đó chú ý đến các biện pháp

sinh học vừa cho chi phí rẻ mà lại thân thiện với môi trƣờng.

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phƣớc Hiền (2006), Điều tra phát hiện tảo

độc tại các thuỷ vực trọng điểm của Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc làm cơ sở cho

việc xây dựng chỉ tiêu quan trắc sinh học trong giám sát chất lượng nguồn nước,

Báo cáo Tổng kết nhiệm vụ khoa học công nghệ phục vụ quản lý nhà nƣớc và bảo

vệ môi trƣờng, Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2. Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phƣớc Hiền (1999), Công nghệ Sinh học vi

tảo. Nhà xuất bản Nông nghiệp.Tr 120 – 134.

3. Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phƣớc Hiền, Dƣơng Thị Thuỷ, Dƣơng Đức

Tiến (1997), Phát hiện được một số vi tảo độc trong các ao hồ Hà Nội. Kỷ yếu Viện

Công nghệ Sinh học, tr.408-412.

4. Chu Văn Thuộc & cs (1998), “Bước đầu nghiên cứu về tảo biển độc hại ở

vùng cửa sông ven biển miền bắc Việt Nam”, Tài nguyên và Môi trƣờng biển, tập 5,

tr. 155-163, Nhà xuất bản Khao học và Kỹ thuật.

5. Dƣơng Đức Tiến & cs (2002), Bảo vệ nguồn gen vi tảo (microalgae) đặc

hữu quý hiếm ở hồ Hoàn Kiếm – Hà Nội, Báo cáo khoa học trong chƣơng trình tài

trợ bảo vệ môi trƣờng và gìn giữ di sản văn hoá - Công ty Ford Motor.

6. Dƣơng Đức Tiến (1995), Phân loại Vi khuẩn lam ở Việt Nam. Nhà xuất

bản Nông nghiệp.

7. Dƣơng Đức Tiến, Võ Văn Chi (1978), “Phân loại Thực vật học bậc

thấp”. Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp.Tr 87-95.

8. Trịnh Thị Thanh (2000), Độc học Môi trường và Sức khoẻ con người. Nhà

xuất bản Đại Học Quốc gia Hà Nội. tr 39-45.

9. Doãn Đoan Trinh (2003), Hà Nội- địa chỉ du lịch văn hoá. Nhà xuất bản

Văn hoá thông tin.tr 36-40.

Tài liệu tiếng Anh

57

10. A.Munkhong, A.Mahakhant, P.Thavipoke, V.Arunpairojana (2005), Lysis

of Microcystis cells and degration of microcystins by soil bacteria, Algal Culture

Collection and the Environment, pp. 109-119.

11. American public health association. (1975), Standard methods for the

examination of water and wastewater, 4th

edition.

12. Ball As, Williams M, Vincent D and Robinson J (2001), Algal growth

control by a barley straw extract. Bioresour. Technol. 77, pp.177-181.

13. Barrett PRF, Curnow J and Little John JW (1996), The control of diatom

and cyanobacterial blooms in reservoirs using barley straw. Hydrobiol. 340, pp.

307-311.

14. Carmichael W (1995), Toxic Microcystis and the environment. In:

Watanabe M, Harada K.pp. 230-234.

15. Carmichael, W.W. (1992), A Status Report on Planktonic Cyanobacteria

(Blue-Green Algae) and their Toxins. EPA/600/R-92/079, United States

Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio.

16. Chorus I, Bartram J, ed. (1999), Toxic cyanobacteria in water. A guide to

their public health consequences, monitoring and management. Published by E &

FN Spon on behalf of the World Health Organization.

17. Codd, G.A, Ward, C.J. and Bell, S.G. (1997), Cyanobacterial toxins:

occurrence, modes of action, health effects and exposure routes. In: J.P. Seiler and

E. Vilanova [Eds], Applied Toxicology: Approaches through Basic Science.

Archives of Toxicology Supplement 19, Springer-Verlag, Berlin, pp. 399-410.

18. Codd, G.A. (1983), Cyanobacterial poisoning hazard in British

freshwaters. Vet. Rec., 113. pp. 223-224.

19. Dillenberg HO, Dehnel MK (1960), Toxic waterbloom in Saskatchewan,

Canadian Medical Association Journal, 83: pp. 1151–1154.

20. Dvid G. Bourne (1996), Enzymatic pathway for the bacteria degradation

of the Cyanobacteria cyclic peptide toxin Microcystin LR. Pp.1086-4094

21. Falconer I (1996), Potential impact on human health of toxic

cyanobacteria. Phycologia, 35(Suppl. 6): pp. 6–11.

58

22. Falconer I, Buckley TH (1989), Tumor promotion by Microcystis sp., a

blue-green algae occurring in water supplies. Medical Journal of Australia, 150:

pp. 351–352.

23. Falconer I, ed. (1993), Algal toxins in seafood and drinking water. New

York, NY, Academic Press, pp. 224.

24. Fastner J, Neumann U, Wirsing B, Weckesser J, Wiedner C, Nixdorf B,

Chorus I (1999), Microcystins (heptapeptides) in German fresh water bodies.

Environmental Toxicology, 14(1):pp. 13–22.

25. Gibson MT, Welch IM, Barrett PRF and Ridge I (1990), Barley straw as

an inhibitor of algal growth II: Laboratory studies. J. Appl. Phycol. 2. pp. 241-248.

26. Jianzhong Chen, Zhili Liu, Guanju Ren, Pengfu Li and Yiwen Jiang

(2004), Control of Microcystis aeruginosa TH01109 with batangas mandarin skin

and dwarf banana peel, Technical note in School of Life Sciences, Nanjing

University, Nanjing 210093, China.pp. 1200 – 1211.

27. Jones, G. J., and P. T. Orr. (1994), Release and degradation of

microcystin following algicide treatment of a Microcystis aeruginosa bloom in a

recre- ational lake, as determined by HPLC and protein phosphatase inhibition

assay. Water Res. 28:pp. 871–876.

28. Kenefick, S.L., S.E. Hrudey, H.G. Peterson and E.E. Prepas. (1993) Toxin

release from Microcystis aeruginosa after chemical treatment. Water Sci. Tech. 27:pp.

433-440.

29. L.R. Song, N.Q.Gan, H.Pan (2005), Toxic Microcystis blooms and

microcystin composition in eutrophic lakes in China, Algal Culture Collection and

the Environment, pp. 89-108.

30. MacKintosh C, Beattie KA, Klumpp S, Cohen P, Codd GA (1990),

Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1

and 2a from both mammals and higher plants. Federation of the European Biochemical

Society Letters, 264:pp. 187–192.

31. Makoto Shirai, Katsumi Matumaru, Akio Ohotake, Yoshichika

Takamura, Tokujiro Aida and Masayasu Nakano (1989), Development of a Solid

59

Medium for Growth and Isolation of Axenic Microcystis Strains (Cyanobacteria), Appl

Environ Microbiol. 1989 October; 55(10): pp. 2569-2571.

32. Miller L.T (1982), Single derivatization method for routine analysis of

bacterial whole-cell fatty acid methyl esters, including hydroxy acids. J.Clin.

Microbiol.,16. pp. 584 – 586.

33. Nakagawa, M., Y. Takamura, and 0. Yagi. (1987), Isolation of the

slime from a cyanobacterium, Microcystis aeruginosa K-3A. Agric. Biol. Chem.

51:pp. 329-337.

34. Padisork J (1997), Cylindrospermopsis raciborskii (Woloszynska)

Seenayya et Subba Raju, an expanding, highly adaptive blue-green algal species:

worldwide distribution and review of its ecology. Archiv für Hydrobiologie, Suppl.,

107:pp. 563–593.

35. Pillinger JM, Cooper JA and Ridge I (1994), Role of phenolic

compounds in the antialgal activity of barley straw. J. Chem. Ecol. 20, pp. 1557-

1569.

36. Ridge I, Pillinger JM and Walters J (1995), Alleviating the problems of

excessive algal growth. In: DM Harper and AJD Ferguson (eds.) The Ecological

Basis for River Management. John Wiley. Chichester,pp. 211-218.

37. Ridge I, Walters J and Street M (1999), Algal growth control by

terrestrial leaf litter: a realistic tool, Hydrobiol. 395/396,pp. 173-180.

38. Rinehart KL, Namikoshi M, Choi BW (1994), Structure and biosynthesis

of toxins from bluegreen algae (cyanobacteria). Journal of Applied Phycology, 6:

pp. 159–176.

39. Rouhiainen L, Buikema W, Paulin L, Haselkorn R (1995), Cloning and

characterization of peptide synthetase genes from a hepatotoxic Anabaena strain.

40.Oral presentation at the 1st International Congress on Toxic Cyanobacteria,

Bornholm. pp. 127 -130..

40. Sivonen K, Jones J (1999), Cyanobacterial toxins. In: Chorus I, Bartram

J, ed. Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public health on sequences,

60

monitoring and management. Published by E & FN Spon on behalf of the World

Health Organization, pp. 41–112.

41. Staley, J.T., Bryant, M.P., Pfennig, N. and Holt, J.G. [Eds] 1989 Bergey's

Manual of Systematic Bacteriology. Volume 3, Williams & Wilkins,

Baltimore.pp.58-62.

42. Tisdale ES (1931), Epidemic of intestinal disorders in Charleston, W.

Va., occurring simultaneously with unprecedented water supply conditions.

American Journal of Public Health, 21: pp. 198–200.

43. Turner PC, Gammie AJ, Hollinrake K, Codd GA (1990), Pneumonic

associated with cyanobacteria. British Medical Journal, 300: pp. 1440–1441.

44. Tzong-Huei Lee (2000), Isolation and identification of seven

microcystins from a culture M.TN-2 strain of Microcystis aeruginosa,

Bot.Bull.Acad.Sin., 41: pp. 197-202.

45. Vollenweider, R.A. (1968), Scientific Fundamentals of the

Eutrophication of Lakes and Flowing Waters with Particular Reference to Nitrogen

and Phosphorus as Factors in Eutrophication. Organisation for Economic

Cooperation and Development, Paris. pp. 120 -123.

46. WHO (1993), Guidelines for Drinking-water Quality, Second edition.

Volume 1, Recommendations. World Health Organization, Geneva. Pp. 46- 59.

47. WHO (1996), Guidelines for Drinking-water Quality, Second edition.

Volume 2, Health Criteria and Other Supporting Information. World Health

Organization, Geneva.pp. 267 – 268.

48. WHO (1998), Guidelines for Drinking-water Quality. Second edition,

Addendum to Volume 2, Health Criteria and Other Supporting Information. World

Health Organization, Geneva.pp. 245 -249.

49. Watanabe, M. M., and F. Kasai. (1985), NIES-collection list of strains,

1st ed., The National Institute for Environmental Studies, The Environmental

Agency, Tsukuba, Japan. pp. 97.

61

50. WRc (1996), The Fate of Intracellular Microcystin-LR During Water

Treatment. Report Ref. 96/DW/07/4, UK Water Industry Research Ltd., London.pp

135- 168.

51. Yoo S, Carmichael W, Hoehn R, Hrudey S (1995), Cyanobacterial (blue-

green algal) toxins: A resource guide. Denver, CO, American Water Works

Association Research Foundation, pp. 229.

52. Yu SZ (1995), Primary prevention of hepatocellular carcinoma. Journal

of Gastroenterology and Hepatology, 10: pp. 674–682.

Trang web tham khảo

53. http://en.wikipedia.org/wiki/Microcystin

54. http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/cyanotox/toxins/microcystins.html

55. http://www.glerl.noaa.gov/pubs/brochures/mcystisflyer/mcystis.html

56. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1287722

57. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Sphingomonas

58. http://elearning.hueuni.edu.vn/file.php/81/phanloaithuvat/htm/c2.htm

59. http://www.rimf.org.vn/bantin/tapchinewsdetail.asp?TapChiID=1&news

60. http://www.vnn.vn/khoahoc/2003/4/8715/

61. http://dnr.metrokc.gov/wlr/waterres/lakes/ToxicAlgae.htm

62. http://who.int/water_sanitation_health/resourcesquality/toxcyanchap1

63. http://etd.lib.ttu.edu/theses/available/etd-04272006-122817

http://www.rimf.org.vn/bantin/tapchinewsdetail.asp?TapChiID=1&news

http://who.int/water_sanitation_health/resourcesquality/toxcyanchap1

http://etd.lib.ttu.edu/theses/available/etd-04272006-122817

62

PHỤ LỤC 1

1. Các môi trƣờng nuôi cấy dùng trong nghiên cứu

1.1. Môi trƣờng Bold3N*

ml/l Dung dịch

gốc

g/400ml

H2O

30 NaNO3 10.0

10 CaCl2.2H2O 1.0

10 MgSO4.7H2O 3.0

10 K2HPO4 3.0

10 KH2PO4 7.0

10 NaCl 1.0

1 Vitamin B12 60.0 x 10-6

6 PIV metal

40 Nƣớc chiết

đất

Vi lƣợng PIV của B3N

Hoá chất Khối lƣợng

(mg/l)

FeCl3.6H2O 97

MnCl2.4H2O 41

ZnCl2 5

CoCl2.6H2O 2

Na2MoO4.2H2O 4

Na2EDTA 750

1.2. Môi trƣờng B12 (pH=9,0)*


NaNO3 100 mg

K2HPO4 10 mg

MgSO4.7H2O 75 mg

CaCl2.2H2O 40 mg

Na2CO3 20 mg

Ferric citrate 6 mg

Disodium EDTA. 2H2O 1 mg

Vitamin B12 0,1 ml

63

1.3. Môi trƣờng C (pH=7,5) *


Ca(NO3)2.4H2O 15 mg

KNO3 10 mg

-Na2glycerophosphate.5 H2O 5 mg

MgSO4.7H2O 4 mg

Vitamin B12 0.01g

Biotin 0.01g

Thiamine HCl 1g

PIV metals 0,3 ml

Tris (hydroxymethyl)

aminomethane

50mg

Nƣớc cất 99,7ml

1.4. Môi trƣờng J*

Đƣợc tạo ra bởi sự phối trộn 3 loại dung dịch gốc C, D và G9 metal.

Dung dịch gốc C, D và G9 metal đƣợc chuẩn bị riêng trong 1000ml nƣớc cất 2

lần với các thành phần nhƣ trong bảng dƣới và bảo quản trong lạnh 4oC

Dung dịch gốc C, pH=9.0


(g/l)

NaNO3 67.0

Na2HPO4 0.67

K2HPO4 3.8

Tricine

buffer

25.0

Dung dịch gốc D, không điều chỉnh

pH


(g/l)

MgSO4.7H2O 10.0 g/l

MgCl2.6H2O 5.0 g/l

FeCl3.6H2O 0.5 g/l

CaCl2.2H2O 4.2 g/l

Na2EDTA 4.4 g/l

64

Sau khi làm lạnh, phối trộn 2 dung dịch trên theo tỷ lệ 1:1 để tạo thành môi

trƣờng J.

Dung dịch gốc G9 metal

Hoá chất Khối lƣợng (g/l)

H3BO3 3.25

MnSO4.H2O 1.5

ZnSO4.7H2O 0.3

(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.08

CuSO4.5H2O 0.05

Co(NO3)2.6H2O 0.15

KI 0.01

(*) Nies Collection List of strains seventh edition 2004 microalgae and protozoa

65

PHỤ LỤC 2

Các môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn [39]

2.1. Môi trƣờng NA

Hóa chất Khối lƣợng (g)

Pepton 10,0

Cao thịt 1,0

NaCl 1,5

Thạch 15,0

Nƣớc cất 1 lít

Khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH=7

2.2. Môi trƣờng M7

Hóa chất Khối lƣợng (g)

Peptone 1,0

Yeast extract 1,0

Agar 15,0

Glucose 1,0

Nƣớc cất 1 lít

Khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH=7

66

PHỤ LỤC 3

Phƣơng pháp phân tích một số thông số thuỷ hoá

3.1. Xác định hàm lƣợng oxy hoà tan (DO) bằng phƣơng pháp Winkler

Nguyên tắc: phƣơng pháp xác định DO dựa vào khả năng của oxy hoà tan

oxy hoá Mn2+

thành Mn4+

trong môi trƣờng kiềm. Mn4+

lại có khả năng oxy hoá I-

thành I2 trong môi trƣờng axít. Do vậy lƣợng I2 đƣợc tạo ra có quan hệ định lƣợng

với DO và đƣợc xác định bằng Thiosulfat Natri.

Phương trình phản ứng:

Hoá chất cần dùng:

1) Dung dịch MnSO4: cân 480g MnSO4.4H2O không chứa sắt, dùng nƣớc

cất pha thành 1 lít

2) Dung dịch i-ô-dua kali kiềm: cân 350g KOH và 75g KI, dùng nƣớc cất

pha thành 500ml

3) Acid HCl đặc

4) Dung dịch Thiosulfat Natri 0,025N: Hoà tan 0,2g Na2S2O3.5H2O trong

1 lít nƣớc cất đã đun sôi để nguội. Dung dịch đƣợc đựng trong bình màu nâu, cho

thêm 0,2g Na2CO3

5) Dung dịch tinh bột

Cách tiến hành:

Lấy mẫu và cố định mẫu: dùng bình sạch lấy đầy mẫu nƣớc. Mẫu cần phải cố

định ngay, hút 1ml MnSO4, để đầu pipet dúng vào trong mặt nƣớc xong, rồi từ từ

cho thuốc thử vào bình. Sau đó hút 1ml dung dịch kiềm i-o-dua kali. Sau khi cố định

xong, đậy nút, lắc đều mẫu nƣớc đến khi thấy sinh ra kết tủa vàng nâu. Mẫu nƣớc đã

cố định nhƣ thế có thể giữ đƣợc vài giờ không thay đổi, đem về phòng thí nghiệm

rồi tiến hành công tác phân tích.

MnSO4 + 2KOH = Mn(OH)2 + K2SO4

2Mn(OH)2 + O2 = MnO2 + H2O

MnO2 + 2KI + 4H+

= Mn2+

+ 2K+ + I2 + 2H2O

2Na2S2O3 + I2 = Na2S4O6 + 2NaI (chuẩn độ)

67

Phân tích: trong mẫu nƣớc mà oxy hoà tan đã bị cố định và kết tủa hoàn toàn

lắng xuống, dùng pipet hút cho vào 1ml acid H2SO4 đậm đặc. Sau đó đậy nút lại, lắc

đều bình cho kết tủa vàng nâu hoà tan hết. Lấy 100ml dung dịch này vào bình tam

giác 250ml. Dùng dung dịch Na2S2O3 chuẩn độ cho đến màu vàng rất nhạt, cho

thêm 3 giọt dung dịch tinh bột, dung dịch có màu xanh lam. Tiếp tục dùng dung dịch

Na2S2O3 chuẩn độ cho tới khi màu lam vừa vặn biến mất. Ghi lƣợng Na2S2O3 đã

dùng.

Công thức tính toán kết quả:

8.W.N

DO / = 1000V

mg l

Trong đó: N - nồng độ dung dịch Na2S2O3 (N)

V - thể tích mẫu dùng chuẩn độ (ml)

W - thể tích dung dịch chuẩn Na2S2O3 (ml)

3.2. Xác định nhu cầu oxy sinh học BOD (Biology Oxygen Demand)

BOD là lƣợng oxy cần thiết để oxi hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ

có trong nƣớc bằng vi sinh vật.

Nguyên tắc xác định: Định lƣợng nhu cầu oxi sinh hóa (BOD) bằng

thiết bị Oxitop (có gắn sensor BOD) dựa trên sự giảm áp do khí CO2 sinh ra trong

quá trình oxi hóa, đƣợc hấp thụ lại bởi các hạt kiềm mạnh . Sự giảm áp suất đƣợc bộ

vi xử lý trong sensor chuyển thành giá trị BOD tƣơng ứng.

Dụng cụ và hóa chất:

- Dung dịch đệm phốt phát pH = 7,2 gồm:

+ KH2PO4 : 8,5 g/l + K2HPO4 : 21,75 g/l

+ Na2HPO4.7H2O : 33,4 g/l + NH4Cl : 1,7 g/l

- Dung dịch MgSO4.7H2O : 22,5 g/l

- Dung dịch CaCl2 : 27,5 g/l

- Dung dịch FeCl3.6H2O : 0,25 g/l

- Dung dịch H2SO4 0,1N

- Dung dịch NaOH 0,1 N

- Dung dịch Na2SO3 0,025 N

68

- Nƣớc cất đã đƣợc cất với kalipemanganat

- KOH tinh thể

Xử lý mẫu:

- Loại bỏ các chất tẩy rửa bằng dung dịch Na2SO3 0,025N.

- Loại bỏ kim loại độc bằng cách điều chỉnh pH của mẫu đến 8,5 khi đó

hầu hết các kim loại sẽ kết tủa ở dạng oxit và hydroxit. Đem lọc bỏ kết tủa

- Trung hòa mẫu: Điều chỉnh pH của mẫu từ 6,5 – 7,5 bằng dung dịch

NaOH hoặc H2SO4.

- Bổ sung vi sinh vật nếu lƣợng vi sinh vật trong mẫu không đủ bằng

cách lấy nƣớc cống trên bề mặt, để lắng từ 1- 2 giờ. Nƣớc thu đƣợc có hàm lƣợng vi

sinh vật trong nƣớc khoảng 103 – 106 vi khuẩn/ ml . Thể tích nƣớc bổ sung có thể

dao động từ 3 – 30% thể tích mẫu, thông thƣờng bằng 10% thể tích mẫu.

- Nếu mẫu nƣớc không đủ dinh dƣỡng cần bổ sung thêm 1ml các dung

dịch đệm photphat, dung dịch MgSO4.7H2O, dung dịch CaCl2, dung dịch

FeCl3.6H2O vào một lít nƣớc pha loãng.

- Chuẩn bị nƣớc pha loãng cấy vi sinh vật: Nƣớc cất đã bổ sung chất

dinh dƣỡng, đƣợc sục đến bão hòa oxi pha với nƣớc có chứa vi sinh vật theo tỷ lệ

10/1.

Các bước tiến hành:

- Mẫu đƣợc ủ trong các điều kiện tiêu chuẩn: nhiệt độ là 200C, không có

ánh sáng, pH mẫu khoảng 6,5 – 7,5.

- Cho mẫu đã pha loãng, phù hợp với thang đo đã lựa chọn trong bảng

dƣới đây vào chai thí nghiệm.

Thể tích mẫu (ml) Khoảng BOD

(mg/l)

Hệ số pha loãng (f)

432 0 – 40 1

365 0-80 2

250 0-200 5

69

- Cho con từ vào mỗi chai ủ, đặt lẵng cao su vào miệng chai và cho hóa

chất hấp thụ CO2 (KOH hạt hoặc Soda hạt) vào lẵng cao su.

- Đặt và vặn chặt sensor BOD vào mỗi chai, cài đặt và bắt đầu quá trình

đo.

- Tiến hành làm với mẫu trắng bằng nƣớc pha loãng cấy vi sinh vật theo

trình tự tƣơng tự

- Xếp chai vào giá khuấy từ và đặt thiết bị khuấy từ vào tủ điều nhiệt và

nối với nguồn điện trong tủ

Tính toán kết quả:

5BOD = D- D´ f

Trong đó: BOD5 là giá trị BOD của mẫu cần xác định sau 5 ngày.

D là giá trị hiện trên sensor BOD sau 5 ngày lấy mẫu cần xác

định.

D‟ là giá trị hiện trên sensor BOD sau 5 ngày của mẫu trắng.

f là hệ số phụ thuộc vào thể tích mẫu.

3.3. Nhu cầu oxy hoá học ( COD) (Chemical Oxygen Demand)

COD la lƣơng oxy cân thiêt dung cho qua trinh oxy hoa hoan to àn các hợp

chât hƣu cơ co trong nguôn nƣơc băng cac chât oxy hoa manh nhƣ K 2Cr2O7 hay

KMnO4. Xác định bằng phƣơng pháp bicromat

Nguyên tắc: Khi cho dung dịch bicromat vào mẫu nƣớc, dƣới tác dụng của

nhiệt độ và H2SO4 đặc thì phần lớn các chất hữu cơ và vô cơ trong nƣớc bị oxy hoá.

Để phản ứng Oxy hoá xảy ra hoàn toàn ta cho thêm xúc tác Ag2SO4. Sau khi oxy

hoá, lƣợng Bicromat dƣ sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ với dung

dịch muối Morh. Lƣợng chất hữu cơ bị oxy hoá sẽ tính ra bằng lƣợng oxy tƣơng

đƣơng qua Cr2O72-

bị khử, lƣợng oxy tƣơng đƣơng này chính là COD.

Phản ứng oxy của Bicromat đƣợc diễn ra theo phƣơng trình sau:

Cr2O72-

+ 14 H+

+ 6e = 2 Cr3+

+ 7 H2O

164 0-400 10

43.5 0-2000 50

70

Dụng cụ và hoá chất:

- Bình nón 50ml sạch và khô

- Pipet, nút bông sạch

- Dung dịch :

+ K2Cr2O7 đã sấy khô ở nhiệt độ 1050C trong 2 giờ, hoà tan trong

nƣớc cất, đƣa thể tích đến 1 lít;

+ Dung dịch H2SO4 đậm đặc;

+ Tinh thể Ag2SO4;

+ Vụn thuỷ tinh;

+ Chỉ thị màu Diphenylamin: 1g Diphenylamin trong 100ml H2SO4;

+ Dung dịch muối Morh 0,25N : Hoà tan 98g muối Fe (NH4)2(SO4)2 .6 H2O

trong nƣớc cất. Thêm 20ml H2SO4 đậm đặc, để nguội thêm nƣớc cất đến 1 lít.

Mỗi lần dùng muối Morh phải kiểm tra lại nồng độ bằng cách hút 25ml dung

dịch K2Cr2O7 0,25N cho vào bình tam giác, thêm nƣớc cất đến thể tích 200ml, thêm

15ml dung dịch H2SO4 1:1, thêm 5 giọt chỉ thị diphenylamin.

Dùng dung dịch muối Morh để chuẩn độ đến khi màu dung dịch chuyển sang

xanh lá cây. Ghi thể tích dung dịch muối Morh đã tiêu tốn (V ml). Nồng độ của

muối Morh đƣợc xác định theo công thức sau:

N =V

x 25,025

Cách tiến hành :

- Lấy 10ml nƣớc mẫu cho vào bình nón;

- Thêm 5ml K2Cr2O7 0,25N + 1ml H2SO4 đậm đặc + 200mg Ag2SO4

- Một ít vụn thuỷ tinh

- Lắc đều, đậy nút bông

- Làm tƣơng tự với mẫu nƣớc cất

- Đun hồi lƣu trong 2 giờ, sau 4 giờ đem ra làm lạnh

- Thêm 50ml nƣớc cất

71

- Thêm 2 giọt chỉ thị màu Diphenylamin, chuẩn độ bằng dung dịch muối

Morh 0,25N đến khi có màu xanh lá cây. Ghi lại lƣợng muối Morh đã dùng.

o Công thức tính lượng COD:

COD = V

xxNxVV 10008)21(

Trong đó :

V1 - là thể tích dung dịch muối Morh chuẩn mẫu trắng (m);

V2 - là thể tích dung dịch muối Morh chuẩn mẫu nƣớc cần xác định (ml);

N - là đƣơng lƣợng gam muối Morh (N).

3.4. Xác định hàm lƣợng NH4+ bằng phƣơng pháp so màu với thuốc thử Nessler

Nguyên tắc:

Ion NH4+ trong nƣớc tác dụng với thuốc thử Nessler cho hợp chất vàng nâu.

NH4+ + 2K2Hg2I4 + 3KOH NH2Hg2OI + 7KI + 2H2O.

Cƣờng độ màu của dung dịch chứa NH2Hg2OI tỷ lệ với hàm lƣợng NH4+

tham gia tạo thành hợp chất này.

Các yếu tố ảnh hưởng: các amin, cloramin, axeton, cồn và một số chất hữu

cơ hoà tan gây cản trở phép đo do chúng tác dụng với thuốc thử Nessler. Ngoài ra,

các chất gây nên độ cứng, sắt sunfua, độ đục ảnh hƣởng đến quá trình xác định. Loại

ảnh hƣởng cản trở bằng cách thêm muối Seignet.


- Bình định mức 1 lít, 500 ml (1 cái), 50 ml (12 cái).

- Pipet các loại.

- Dung dịch muối Seignet 50%: hoà tan 50 g muối seignet trong 100 ml nƣớc

cất 2 lần.

- Dung dịch thuốc thử Nessler: cân 15 g HgI2 và 10 g KI hoà vào 500 ml

nƣớc cất, cho vào 40 g NaOH khuấy đều cho tan, để lắng vài ngày, gạn dung dịch

vào bình nâu.

Phương pháp lập đường chuẩn:

72

Dung dịch NH4Cl tiêu chuẩn: cân 0,382 g NH4Cl tinh khiết đã sấy khô ở

105oC trong 2 giờ, pha vào bình định mức 1 lít. Dung dịch có nồng độ là 0,1 mg N-

NH4+ trong 1 ml. Lấy 10 bình định mức có số thứ tự từ 1- 10. Dùng pipet hút dung

dịch chuẩn cho vào bình định mức với các thể tích là: 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6

ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml sau đó cho thêm 1 ml dung dịch seignet và 1 ml dung

dịch nessler, thêm nƣớc cất đến vạch định mức. Tiến hành so màu ở bƣớc sóng 420

nm trên máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO. Căn cứ vào các giá trị mật độ

quang đo đƣợc ta lập đƣờng chuẩn.

Cách tiến hành:

Lấy 5 ml nƣớc mẫu cần phân tích cho vào bình định mức 50 ml, pha loãng

bằng nƣớc cất tới 25 ml. Cho vào bình 1 ml muối seignet, tiếp tục cho vào 1 ml

thuốc thử nessler, thêm nƣớc cất đến vạch định mức. Làm tƣơng tự đối với mẫu

trắng và so màu ở bƣớc sóng 420 nm. Tra đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng N- NH-

4+ trong mẫu.

Công thức tính kết quả:

N-NH4+ = 1000

1,0

V

W

Trong đó: W- thể tích NH4Cl tiêu chuẩn tra trên đƣờng chuẩn.

V- thể tích mẫu nƣớc dùng phân tích (5 ml).

3.5. Xác định hàm lƣợng NO3- bằng acid phenoldisunfonic

Nguyên tắc:

Ion NO3- phản ứng với acid phenoldisunfonic tạo ra acid

nitrophenoldisunfonic. Acid này tác dụng với dung dịch kiềm cho muối màu vàng,

cƣờng độ màu tỷ lệ với hàm lƣợng NO3- trong dung dịch.

C6H3OH(SO3H)2 + HNO3 + 3NH4OH C6H2ONH4(SO3NH4)2NO2 + 4H2O.

(acid phenoldisunfonic) (màu vàng)

Dụng cụ, hoá chất:

- Bát sứ - Pipet các loại.

- Bình định mức 50 ml. - Dung dịch NH4OH 25%.

- Dung dịch NaOH 20%.

73

- Acid phenoldisunfonic: cân 3 g phenol nguyên chất kết tinh màu trắng cho

vào bình tam giác, thêm 20 ml H2SO4 đặc (d=1,84). Đậy bình bằng nút có ống thủy

tinh làm lạnh bằng không khí. Đun sôi cách thuỷ trong 6 giờ đƣợc dung dịch màu

vàng nhạt. Bảo quản trong bình sẫm màu.

Phương pháp lập đường chuẩn:

Cân 0,7216 g KNO3 đã sấy khô ở 105oC trong 2h, cho vào bình định mức 1

lit, dung nƣớc cất 2 lần hoà tan và thêm đến vạch định mức. 1 ml dung dịch này

chứa 0,1 mg N-NO3-. Lấy 50 ml dung dịch này cho vào bát sứ cô cạn, để nguội rồi

thêm 1 ml thuốc thử disunfonic, dùng đũa thuỷ tinh cạo nhẹ thành bát để trộn đều

thuốc thử, để yên trong 10 phút để thuốc thử ngấm đều. Sau đó thêm 15 ml nƣớc

cất, trung hoà bằng NaOH 20% đến pH kiềm, cho toàn bộ dung dịch màu vàng này

vào bình định mức 200 ml (dung dịch A).

Lấy 10 bình định mức 50 ml, cho dung dịch A vào bình định mức lần lƣợt

với các thể tích 1 ml, 3 ml, 5 ml, 7 ml, 9 ml rồi định mức đến vạch. So màu ở bƣớc

sóng 420 nm trên máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO, xây dựng đƣờng

chuẩn.

Cách tiến hành:

Lấy 50 ml nƣớc mẫu cần phân tích cho vào bát sứ, chƣng cạn, để nguội, cho

vào 1 ml dung dịch acid phenoldisunfonic, dùng đũa thuỷ tinh cạo thành bát để hoà

tan hết cặn, để yên trong 10 phút để acid ngấm đều. Cho thêm một ít nƣớc cất, cho

vào 7 ml dung dịch NH4OH 25%, đổ tất cả sang bình định mức 50 ml, tráng bát sứ

bằng nƣớc cất rồi đổ sang bình định mức. Dùng nƣớc cất định mức đến vạch. So

màu ở bƣớc sóng 420 nm trên máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO. Căn cứ

vào mật độ quang đo đƣợc và đƣờng chuẩn tính hàm lƣợng NO3- trong mẫu cần

phân tích.


N-NO3- (mg/l) = 1000

025,0

V

W

Trong đó: W- thể tích tra trên đƣờng chuẩn.

V- thể tích mẫu dùng phân tích (50 ml).

3.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng NO2-

Nguyên tắc:

74

Phƣơng pháp này dựa vào phản ứng Diajo hóa của nitrit trong môi trƣờng

acid với acid sunphanilamide tạo thành muối aro có màu đỏ hồng. Phƣơng pháp này

thích hợp với việc xác định NO2- có hàm lƣợng 1 mg/l N dạng NO2

- trở xuống.

Các yếu tố ảnh hưởng:

Các ion sau đây có thể gây cản trở: Fe3+

, Pb2+

, Hg2+

, Ag+, các ion có màu, khi

chúng có mặt trong dung dịch làm thay đổi màu của hệ. Các chất rắn cũng ảnh

hƣởng đến việc xác định NO2-.


- Pipet các loại - Bình định mức 50 ml.

- Thuốc thử sunphanilamide: hoà tan 5g sunphanilamide trong hỗn hợp 50 ml

acid HCl đặc và 300 ml nƣớc cất. Pha loãng đến 500 ml bằng nƣớc cất.

- Dung dịch NED dihydroclorua: hoà tan 500 mg NED dihydroclorua trong

500 ml nƣớc, đựng trong chai tối màu, pha chế lại hàng tháng hoặc ngay tức khắc

khi thấy dung dịch chuyển sang màu nâu.

Các lập đường chuẩn:

Dung dịch NO2- tiêu chuẩn: cân 0,4927 g NaNO2 khan vào trong bình định

mức 1 lít, thêm nƣớc cất đến vạch, dung dịch này chứa 0,1 mg N-NO2- trong 1 ml.

Lấy 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 1 lít, thêm nƣớc cất đến vạch, dung

dịch này là dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ 0,001 mg N-NO2- trong 1 ml. Cho vào

bình định mức 50 ml có thứ tự từ 1- 10 dung dịch chuẩn với các thể tích 1 ml, 2ml,

3ml, 4ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml. Sau đó thêm nƣớc cất đến vạch, so

màu ở bƣớc sóng 530 nm trên máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO. Căn cứ

vào giá trị mật độ quang lập đƣờng chuẩn.

Cách tiến hành:

- Lấy 5 ml nƣớc mẫu cần phân tích cho vào bình định mức 50 ml, đối với

nƣớc thải thì pha loãng thành 25 ml.

- Dùng pipet cho vào bình 1ml dung dịch sunphanilamide, lắc trong 2 phút,

cho thêm 1ml dung dịch NED dihydroclorua, lắc trong 10 phút.

- Làm tƣơng tự với mẫu trắng. Tiến hành so màu trên máy so màu quang điện

ERMA 11 TOKYO ở bƣớc sóng 530 nm.


75

Hàm lƣợng N-NO2- đƣợc tính theo công thức:

N-NO2- (mg/l) = 1000

001,0

V

W

Trong đó: W- thể tích dung dịch N-NO2- tra trên đƣờng chuẩn.

V- thể tích mẫu nƣớc lấy phân tích (5 ml).

3.7. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng photphat PO43-

Nguyên tắc:

Khi đun nóng dung dịch PO43-

với molipdat amon có mặt H2SO4 đặc sẽ tạo

thành acid photpho molipdat, acid này tác dụng với acid ascorbic trong môi trƣờng

pH= 4 sẽ cho hợp chất photpho molipdat màu xanh lam. Căn cứ vào cƣờng độ màu

đo đƣợc và đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng PO43-

trong dung dịch cần phân tích.

Hoá chất và dụng cụ:

- Pipet các loại - Bình định mức 50 ml.

- Dung dịch (NH4)6Mo7O24.4H2O 2,5%: cân 25 g molipdat amon, hoà tan

trong bình định mức 1000 ml. Thận trọng cho thêm 175ml dung dịch H2SO4 đặc, để

nguội dung dịch rồi thêm nƣớc cất đến vạch định mức.

- Dung dịch acid ascorbic 1%: 1g acid ascorbic hoà tan trong 100ml dung

dịch CuSO4 0,05M (dung dịch này chỉ chuẩn bị trƣớc khi dùng).

Cách lập đường chuẩn:

- Dung dịch chuẩn photphat: cân 0,22131 g KH2PO4 đã sấy khô ở nhiệt độ

105oC trong 2h, hoà tan đến 1 lít bằng nƣớc cất 2 lần ta đƣợc dung dịch chuẩn có

hàm lƣợng 0,05 mg P-PO43-

trong 1 ml.

- Cho vào 6 bình định mức 50 ml lần lƣợt các thể tích dung dịch chuẩn

photphat nhƣ sau: 0,1 ml; 0,3 ml; 0,5 ml; 0,7 ml; 0,9 ml; 1,1 ml. Thêm 2 ml dung

dịch molipdat amon; 0,5 ml dung dịch acid ascorbic, thêm nƣớc cất đến vạch định

mức. Đun cách thuỷ ở nhiệt độ 30oC trong 10 phút. So màu trên máy so màu quang

điện ERMA 11 TOKYO ở bƣớc sóng 660 nm. Từ kết quả đo mật độ quang lập

đƣờng chuẩn.

Cách tiến hành phân tích:

Lấy 10 ml nƣớc mẫu cho vào bình định mức 50 ml, dùng pipet cho 2 ml dung

dịch thuốc thử molipdat amon và 0,5 ml dung dịch acid ascorbic, thêm nƣớc cất đến

76

vạch định mức. Đun cách thuỷ ở nhiệt độ 30oC trong 10 phút. So màu ở bƣớc sóng

660 nm trên máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO. Căn cứ vào giá trị mật độ

quang đo đƣợc và đƣờng chuẩn ta xác định đƣợc hàm lƣợng PO43-

trong mẫu.


P- PO43-

= 100005,0

V

W

Trong đó: W- thể tích tƣơng ứng với mật độ quang đo đƣợc.

V- thể tích mẫu đã dùng để phân tích (10 ml).

3.8. Xác định hàm lƣợng cặn lơ lửng SS

Nguyên tắc: Nƣớc mẫu đƣợc lắc đều đem lọc qua giấy lọc đã đƣợc biết trƣớc

khối lƣợng. Cặn còn lại trên giấy lọc đƣợc sấy đến trọng lƣợng không đổi ở nhiệt độ

1050C trong 2 giờ. Khối lƣợng chênh lệch trƣớc và sau khi sấy chính là cặn lơ lửng

SS hay còn gọi là chất rắn huyền phù

Các bước tiến hành:

Giấy lọc đƣợc sấy khô tới trọng lƣợng không đổi ở 1050C trong 2 giờ, để

nguội trong bình hút ẩm sau đó cân chính xác trọng lƣợng của giấy lọc. Lấy 100 ml

nƣớc mẫu lọc qua giấy lọc. Đem sấy giấy lọc và lớp cặn bên trên, để nguội trong

bình hút ẩm và cân chính xác trọng lƣợng giấy sau khi lọc.


A - B

SS / = 1000V

mg l

Trong đó: A là trọng lƣợng của giấy lọc và lớp cặn sau khi sấy (mg)

B là trọng lƣợng của giấy lọc ban đầu (mg)

V là thể tích mẫu nƣớc lọc qua giấy lọc (ml)

77

PHỤ LỤC 4

4.1. Phƣơng pháp nhuộn Gram

Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc

phân loại vi khuẩn. Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bƣớc đầu đƣợc xử lý với

tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh – iot bên trong tế bào.

Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính

thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất

màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này (Đỏ vàng với Safranin

hay đỏ tía với Fuchsin) . ở vi khuẩn Gram dƣơng, cồn làm cho các lỗ trong

peptidoglycan co lại do đó phức chất tim – iot bị giữ lại bên trong tế bào.

Cách tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy dịch huyền phù tế bào vi khuẩn

đặt lên phiến kính. Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa rồi nhuộn thuốc đầu bằng dung

dịch tím kết tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút. Rửa bằng nƣớc. Nhuộm tiếp

bằng dung dịch iốt (dung dịch Lugol) trong 1 phút. Rửa bằng nƣớc. Phủ lên vết bôi

dung dịch etanol 95%:axeton (1:1) trong khoảng 1 phút. Lại rửa bằng nƣớc. Sau đó

nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm màu đỏ (nhƣ Safranin hay Fuchsin Ziehl). Rửa qua

nƣớc, để khô, soi kính.

4.2. Oxidaza

Thử bằng kit (strip), chủng dƣơng tính cho màu tím, chủng âm tính không

màu.

4.3. Xác định khả năng di động (Motility test)

Phần lớn các vi khuẩn Bacillus và sphingomonas đều có khả năng di động,

chỉ 1 số ít loài là không có khả năng này.

Nguyên tắc: Tiên mao (lông roi) là những sợi lông dài, uốn khúc, mọc ở mặt

ngoài một số vi khuẩn và có tác dụng giúp chúng có thể chuyển động. Khả năng này

có thể đƣợc quan sát dựa vào sự sinh trƣởng và di dộng của vi khuẩn vào bên trong

môi trƣờng thạch mềm.

Môi trƣờng: Sử dụng môi trƣờng MRS bán lỏng (0,15 - 0,4% thạch). Mỗi

ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng. Khử trùng ở 121oC/15 phút. Làm nguội ở trạng

thái thẳng đứng.

78

Cách tiến hành: Đâm sâu đầu que cấy thẳng có chứa tế bào vi khuẩn lactic

xuyên vào giữa môi trƣờng trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2ml. Chú ý đƣa

que cấy vào chính giữa ống nghiệm. Nuôi cấy ở nhiệt độ 30 - 370C trong 48 - 56

giờ. Quan sát vị trí sinh trƣởng của vi khuẩn trong ống nghiệm. Nếu tế bào mọc

thẳng theo vạch que cấy thì không có khả năng di động, ngƣợc lại nếu tế bào mọc

loang xung quanh vạch que cấy thì có khả năng di động.

4.4. Xác định khả năng phân giải tinh bột

Cấy chấm hoặc cấy vạch vi khuẩn trên môi trƣờng thạch thƣờng có bổ sung

1% tinh bột tan, để ở 370C trong 2 ngày. Đổ thuốc nhuộm Lugol. Chủng nào có hoạt

tính sẽ tạo vòng trong xung quanh hoặc ngay dƣới chân khuẩn lạc.

4.5. Phát hiện vi khuẩn Sphingomonas

Ngoài khả năng phát hiện vi khuẩn Sphingomonas dựa vào khả năng di động rất

nhanh của chúng khi soi dƣới kính hiển vi còn có thể phân biệt đƣợc chúng khi cấy

trên môi trƣờng King‟s B: Proteose peptone - 20g; Glycerol - 10ml; K2HPO4 -

1,5g; MgSO4 -1,5g; thạch - 18g; nƣớc - 1000ml. Trên môi trƣờng này, đa số các

chủng vi khuẩn Sphingomonas đều phát quang dƣới đèn cực tím (tuy nhiên vẫn có 1

số chủng không phát quang).

79

PHỤ LỤC 5

Kết quả phân tích thủy lý, thủy hóa

TT ChØ tiªu §ît thu mÉu lÇn 1 (6/3/2007) §ît thu mÉu lÇn 2 (8/ 5/2007) TCVN

5942-1995

D1 D2 D3 D4 D5 D6 D1 D2 D3 D4 D5 D6 A B

1. Mµu níc

Xanh lôc

Xanh lôc

Xanh ®en

Xanh ®en

Xanh lam

Xanh lam

Xanh lôc

Xanh lôc

Xanh ®en

Xanh ®en

Xanh lam

Xanh lam

2. Mïi níc H«i nhÑ H«i nhÑ RÊt thèi RÊt thèi Tanh Tanh H«i nhÑ H«i nhÑ RÊt thèi RÊt thèi Tanh Tanh

3. T0 níc 16.6 16.6 16.7 16.9 16.7 16.7 29.8 30.8 31.8 31.3 29.4 29.3

5. §é trong 29 28 12 14 19 21 27 25 13 17 22 25

6. pH 9.80 9.82 9.77 9.79 9.57 9.48 10.52 10.50 10.48 10.47 9.95 10.37 6-8.5 5.5-9

7. SS 250 320 480 440 380 390 230 290 510 420 360 380 20 80

8. BOD5 120 65 520 310 460 440 220 150 270 260 180 90 <4 <25

9. COD 160 80 960 520 932 932 360 240 500 400 300 160 <10 <35

10. DO 9.42 80.80 9.65 9.30 7.75 7.67 22.0 23.4 17.4 18.8 19.6 13.4 > 6 > 2

11. NH4- 0.24 0.36 1.24 1.57 0.50 0.20 1.22 1.70 1.26 1.82 1.30 2.00 0.05 1.00

12. NO2- 0.012 0.080 0.090 0.070 0.075 0.014 0.008 0.050 0.050 0.025 0.025 0.007 0.01 0.05

13. NO3- 0.170 0.130 0.060 0.140 0.150 0.030 0.035 0.020 0.012 0.012 0.090 0.019 10 15

14 PO43- 0.60 0.50 1.00 0.43 0.82 0.82 0.87 0.15 0.14 0.16 0.07 0.14

PHỤ LỤC 6

Quy trình tách chiết độc tố

Xác định hàm lƣợng trên máy quang phổ

Phân tích trên HPLC

Lọc qua cột C18

Tái chiết rút độc tố bằng methanol:nƣớc (80:20)

Cạo phần màu trên TLC sang ống Eppendorf

Nhuộm TLC bằng nihyđrin (2% trong n-butanol bão hoà)

Chạy TLC (ethyl acetat:isopropanol:nƣớc-8:5:3)

Cô quay mẫu

Lọc qua giấy lọc

Chiết rút bằng methanol:nƣớc (80:20)

Sinh khối đông khô ở nhiệt độ -830C

Sinh khối đông khô ở nhiệt độ -83ºC

PhiÕu ®¨ng ký

kÕt qu¶ nghiªn cøu çc ®Ò tµi khcn

Tªn ®Ò tµi: “Nghiªn cøu ®Æc ®iÓm sinh häc vµ th¨m dß kh¶ n¨ng ph©n gi¶i

sinh häc ®éc tè cña mét sè chñng Microcystis ph©n lËp ë hå Hoµn KiÕm, Hµ Néi”.

M· sè: QG 07 - 24

C¬ quan qu¶n lý ®Ò tµi: §¹i häc Quèc gia Hµ Néi

§Þa chØ: 144 Xu©n Thuû, CÇu GiÊy, Hµ Néi

§iÖn tho¹i: 7548664

C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi: ViÖn vi sinh vËt vµ C«ng nghÖ Sinh häc

§Þa chØ: 144 Xu©n Thuû, CÇu GiÊy, Hµ Néi

§iÖn tho¹i: 7547907

Tæng kinh phÝ thùc chi: 100.000.000 ®

Trong ®ã: - Tõ ng©n s¸ch Nhµ níc: 100.000.000 ®

- Nguån kh¸c: 0

Thêi gian nghiªn cøu:

Thêi gian b¾t ®Çu: 05/2007

Thêi gian kÕt thóc: 05/ 2009

Tªn çc çn bé phèi hîp nghiªn cøu:

- Chñ tr× ®Ò tµi: TS. NguyÔn ThÞ Hoµi Hµ

- Nh÷ng ngêi tham gia: CN. Lu ThÞ Thuú Giang, CN. NguyÔn Quang Huy, CN.

Lª Trung Thuû, CN. Ph¹m ThÞ BÝch §µo, Th¹c sü. TrÇn ThÞ §iÖp

Sè ®¨ng ký ®Ò tµi :

Ngµy

Sè chøng nh©n ®¨ng ký

KQNC

Ngµy

B¶o mËt:

A. Phæ biÕn réng r·i

B. Phæ biÕn h¹n chÕ

C. B¶o mËt

Tãm t¾t ý nghÜa, kÕt qu¶ nghiªn cøu (kÓ c¶ kÕt qu¶ ®µo t¹o):

ý nghÜa:

Th«ng qua çc ho¹t ®éng cña ®Ò tµi sÏ gióp cho ngêi d©n xung quanh hå nãi

riªng vµ ngêi d©n Hµ Néi nãi chung nhËn thøc ®îc r»ng m«i trêng cña hå cÇn

®îc b¶o vÖ, tríc hÕt lµ v× lîi Ých cña chÝnh hä, cña Thñ ®« ngh×n n¨m v¨n hiÕn,

®ång thêi còng chÝnh lµ tµi s¶n chung mµ ai còng ph¶i cã tr¸ch nhiÖm cÇn ph¶i b¶o

vÖ vµ gi÷ g×n. Çc loµi vi khuÈn lam ®îc ph©n lËp, víi lý lÞch cô thÓ sÏ lµm tiÒn ®Ò

quan träng cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo, nh»m gãp phÇn x©y dùng m«i trêng hå

s¹ch, an toµn vµ bÒn v÷ng.

MÆt kh¸c sÏ bæ sung vµo danh môc çc loµi vi khuÈn lam g©y ®éc níc ngät

cho ViÖt Nam. §Ò tµi ®îc thùc hiÖn sÏ gióp nhãm çn bé nghiªn cøu hiÓu s©u h¬n

vÒ ®Æc ®iÓm sinh häc cña vi khuÈn lam g©y ®éc Microcystis, tõ ®ã t×m çc kh¶ n¨ng

cã thÓ øng dông ®Ó h¹n chÕ t¸c ®éng xÊu g©y ra bëi Microcystis vµ ®éc tè

microcystin cña chóng trong çc hå, thuû vùc nuíc ngät trªn ®Þa bµn Hµ Néi vµ çc

tØnh miÒn B¾c nãi chung.

KÕt qu¶:

- Hồ Hoàn Kiếm đang ở tình trạng ô nhiễm, hàm lƣợng COD, BOD

vƣợt tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 4942- 1995 (loại B) 20 lần. Với giá trị NH4+ từ

0,129- 0,699 (mg/l), NO2- từ 0.012- 0,05 (mg/l), NO3

- từ 0,047- 0,129 (mg/l), PO4

3-

từ 0,08- 0.64 (mg/l) chứng tỏ hồ có hàm lƣợng dinh dƣỡng N, P khá cao.

- Đã phân lập thuần khiết và nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam thuộc chi



- Các chủng Microcystis đều sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng Bold 3N với số

lƣợng tế bào đạt từ 32,94 – 68,6 ×106 tb/ml

sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Đặc biệt

chủng LT2 số lƣợng tế bào đạt cao nhất là 68,6 ×106

tb/ml sau ngày thứ 19. Trên

môi trƣờng J, các chủng Microcystis sinh trƣởng số lƣợng tế bào của các chủng đạt

từ 40,42 – 76,46 ×106 tb/ml

sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Trong đó chủng LT2 vẫn

phát triển với số lƣợng tế bào đạt cao nhất 76,46 ×106 tb/ml

sau ngày thứ 19. Trên

môi trƣờng B12, số lƣợng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78 ×106 tb/ml

sau 12 đến 15


nhất 54,78 ×106 tb/ml

sau ngày thứ 15.

- Có 7 loại axít béo không no dạng C15, C17 và C19 trong tế bào 2 chủng

Microcystis LT2 và LT8. trong đó thành phần axit Palmitic acid (C17H34O2) chiếm

lƣợng lớn nhất với 1,302 μg/mg trọng lƣợng khô ở chủng LT2, chủng LT8 là

0,9683 μg/mg trọng lƣợng khô. Kết quả cho thấy có sự sai khác nhau về lƣợng của

7 loại axit béo có ở trong tế bào 2 chủng LT2 và LT8.

- Dựa vào phƣơng pháp phân loại truyền thống theo phân loại hình thái học



nƣớc N4 và N7 đƣợc xác định thuộc loài Sphin Sphingomonas mali và

Sphingomonas asaccharolytica

- Dựa vào kết quả phân tích trên HPLC, hàm lƣợng độc tố MC – RR đạt lớn



- Chủng vi khuẩn Sphingomonas tuyển chọn đƣợc có khả phân giải

microcystin khá nhanh. Ở nồng độ microcystin 3 µg/l thời gian bán phân giải là

1,34 giờ và với nồng độ 20µg/l, thời gian là 3,43 giờ.

- Nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của các chủng vi khuẩn

Sphingomonas mali N4 và Sphingomonas asaccharolytica N7. Sau 7 giờ sự phân

giải gần nhƣ hoàn toàn là 100%.

Các công trình công bố và sản phẩm đào tạo

Công trình công bố


2008. Đánh giá sự biến động số lượng theo mùa và theo tầng nước của vi khuẩn

lam Microcystis aeruginosa ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội, Tạp chí Khoa học Đại học

Quốc gia Hà Nội. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15. Tr 125 – 128.


2008. Tìm hiểu khả năng phân giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis trong hồ

Hoàn kiếm bằng vi khuẩn. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội. Khoa học

Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15. Tr 119 – 122.

Đào tạo 4 Cử nhân

- Bƣớc đầu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân

giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội. 2007. Khoá

luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Đặng Thị Kim Anh.

- Bƣớc đầu đánh giá khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam

Microcystis aeruginosa bằng vi khuẩn Sphingomonas. 2008. Khoá luận tốt nghiệp

hệ đại học chính quy của Nguyễn Thị Hoài.

- Khảo sát sự biến động theo mùa của vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa ở

hồ Hoàn Kiếm và khả năng ức chế sinh trƣởng của chúng bằng dịch chiết vỏ chuối,

vỏ quýt. 2009. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Lê Thị Trang.

- Phân lập, nghiên cứu một số đặc tính của tảo độc Microcystis tách chiết độc

tố và thăm dò biện pháp xử lý.2009. Đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hữu Hiếu

Đào tạo 1 Thạc sỹ

Phân giải tế bào Microcystis và sự phân huỷ độc tố microcystin bằng vi

khuẩn nƣớc. 2007 - 2009.

Những đóng góp của đề tài:

- Là công trình đầu tiên tách và lƣu giữ đƣợc chủng vi khuẩn lam

Microcystis.

- Phân lập đƣợc 2 chủng vi khuẩn thuộc chi mới Sphingomonas có khả năng

phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam Microcystis.

- Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết độc tố microcystin.

KiÕn nghÞ vÒ quy m« vµ ®èi tîng ¸p dông kÕt qu¶ nghiªn cøu:

Chøc vô Chñ nhiÖm ®Ò

tµi

Thñ trëng c¬

quan chñ tr× ®Ò tµi

Chñ tÞch héi

®ång ®¸nh gi¸

chÝnh thøc

Thñ trëng c¬ quan

qu¶n lý ®Ò tµi

Hä vµ tªn

NguyÔn ThÞ

Hoµi Hµ

Häc vÞ

TiÕn sü

Ký tªn

§ãng

dÊu

Documents

BCTH DE TAI QG.07.24