Beeinflußung der [³H]-Acetylcholin-Freisetzung im

Aus der Sektion Klinische Neuropharmakologie der Neurologischen Universitätsklinikder Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg im Breisgau

Beeinflußung der [³H]-Acetylcholin-Freisetzung im

Rattenhippocampus und menschlichen Neokortex

durch ß-Amyloid1-28 und durch Hemmung der

Cholinacetyltransferase

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Medizinischen Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

in Freiburg im Breisgau

Vorgelegt von

Jörg-Peter Sigle

geboren in Bräunlingen

Freiburg im Breisgau

im Juli 2001

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher

1. Gutachter: Prof. Dr. T.J. Feuerstein

2. Gutachter: Prof. Dr. D. Riemann

Jahr der Promotion: 2001

Die vorliegende Arbeit wurde in der Sektion Klinische Neuropharmakologie der Neu-rologischen Universitätsklinik der Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg im Breisgauangefertigt.

Meinen Eltern in Dankbarkeit gewidmet

An dieser Stelle möchte ich meinen besonderen Dank Herrn Prof. Dr. T.J. Feuersteinzum Ausdruck bringen für die Bereitstellung des Themas und seine ausgezeichneteBetreuung, ferner für seine Unterstützung und Zuspruch in weniger erfolgreichen ex-perimentellen Zeiten.Frau Dr. M. Darstein gilt ein herzliches Dankeschön für ihre ständige Bereitschaft, beiFragen und Problemen rund um die Superfusion jederzeit ansprechbar gewesen zusein.Herrn Dr. R. Knörle möchte ich danken für die fachliche Unterstützung bei der Auf-bereitung und Verarbeitung chemischer Substanzen sowie für seine Ratschläge imUmgang mit Computern.Herrn Prof. Dr. R. Jackisch spreche ich meinen herzlichen Dank aus für sein Entge-genkommen bei der Durchführung der ChAT-Assays, sowie seinen MitarbeiternHerrn A. Haaf und Herrn A. Ehret für ihre Mithilfe.Ferner sei Herrn C. Sigle und Herrn T. Jehle für ihren Einsatz bei der Korrekturdieser Dissertation gedankt.Abschließend ein Dank an alle Mitarbeiter der Abteilung für die harmonische underfreuliche Zusammenarbeit – es hat Spaß gemacht.

Abkürzungen

Aß ß-Amyloid

Aß1-28 synthetisches Aß, aus den Aminosäuren 1 bis 28 des Alzheimer-

typischen Aß bestehend

ACh Acetylcholin

AChE Acetylcholin-Esterase

ß-APP ß-Amyloid-Precursor-Protein

BG Background (Hintergrundrauschen)

Br-ACh Bromo-Acetylcholin

ChAT Cholinacetyltransferase

cChAT im Cytoplasma lokalisierte ChAT

CE Counting Efficiency

cpm counts per minute

CI95 95%-Konfidenzintervall

dpm desintegrations per minute

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGTA Ethylenbisoxyethylennitrilotetraessigsäure

GABA γ-Aminobuttersäure

HACU High-Affinity-Choline-Uptake

HEPES Hydroxyethylpiperazinoethansulfonsäure

Hz Hertz

mA Milliampere

MC menschlicher Neokortex

mChAT membranassoziierte ChAT

n Zahl der Versuche

PS Presenilin

RH Rattenhippocampus

sAPPs sezernierte lösliche Spaltprodukte des ß-APP

V Volt

ZNS Zentrales Nervensystem

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Problemstellung ............................................ 1

1.1 Vorbemerkung ............................................................................................1

1.2 Acetylcholin und cholinerge Systeme .........................................................3

1.2.1 Biosynthese, Freisetzung und Rezeptoren des Acetylcholins ....................3

1.2.2 Cholinerge Systeme ...................................................................................4

1.3 Struktur und Aufbau des Hippocampus ......................................................6

1.4 Struktur und Aufbau des Neokortex............................................................7

1.5 Fakten über M. Alzheimer...........................................................................9

1.5.1 Pathologie...................................................................................................9

1.5.2 Molekulare und strukturelle Eigenschaften des Aß...................................10

1.5.3 Veränderungen der Neurotransmission beim M. Alzheimer .....................12

1.5.4 Die „Amyloid Cascade Hypothesis“ ..........................................................12

1.6 Die Hypothese der depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung ...........14

1.7 Fragestellung............................................................................................15

2 Material und Methoden ..........................................................16

2.1 Reagenzien...............................................................................................16

2.2 Superfusionsexperimente .........................................................................17

2.2.1 Präparation des Gewebes ........................................................................172.2.1.1 Rattenhippocampus..................................................................................172.2.1.2 Menschlicher Neokortex ...........................................................................17

2.2.2 Inkubation .................................................................................................18

2.2.3 Vorperfusion .............................................................................................18

2.2.4 Superfusion ..............................................................................................20

2.2.5 Berechnung und Statistik..........................................................................222.2.5.1 Zählausbeute für Schnitte und Superfusate..............................................222.2.5.2 Prozentuale Radioaktivitätsabgabe ..........................................................222.2.5.3 Stimulationsbedingte Tritiumfreisetzung ...................................................23

2.2.5.4 Statistische Auswertung ...........................................................................23

2.3 Bestimmung der ChAT-Aktivität................................................................24

2.3.1 Superfusion ..............................................................................................24

2.3.2 ChAT-Assay..............................................................................................252.3.2.1 Durchführung............................................................................................252.3.2.2 Bestimmung des Proteingehaltes .............................................................262.3.2.3 Berechnung der spezifischen ChAT-Aktivität............................................26

3 Ergebnisse .............................................................................27

3.1. Superfusionsexperimente mit Aß1-28 .........................................................27

3.1.1 Einfluß von Aß1-28 auf die Kalium-evozierte [³H]-ACh-Freisetzung ...........273.1.1.1 Anwesenheit des Aß1-28 (0.1 nM) ab Stimulationsbeginn..........................273.1.1.2 Anwesenheit des Aß1-28 (0.1 nM) ab Inkubation .......................................283.1.1.3 Einfluß der Aß1-28-Konzentration auf seine Wirkung .................................293.1.1.4 Einfluß einer verlängerten Einwirkdauer des Aß1-28 ..................................303.1.1.5 Einfluß des zur Aß1-28-Vorinkubation verwendeten pH-Wertes.................31

3.1.2 Einfluß von Aß1-28 auf die [³H]-Cholin-Beladung .......................................323.1.2.1 Anwesenheit des Aß1-28 (0.1 nM) ab Inkubation .......................................323.1.2.2 Einfluß der Aß1-28-Konzentration auf die Schnittbeladung ........................333.1.2.3 Einfluß einer verlängerten Einwirkdauer des Aß1-28 ..................................343.1.2.4 Einfluß des zur Aß1-28-Vorinkubation verwendeten pH-Wertes.................35

3.2 Experimente zur depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung...............36

3.2.1 Superfusionsversuche mit ChAT-Inhibitoren ............................................363.2.1.1 Gabe von Okadasäure (50 nM) bei Kalium-Stimulation............................363.2.1.2 Gabe von Okadasäure (50 nM) bei elektrischer Stimulation.....................373.2.1.3 Gabe von Br-ACh (30 µM) bei Kalium-Stimulation ...................................38

3.2.2 Messung der ChAT-Aktivität .....................................................................39

4 Diskussion .............................................................................40

4.1 Wirkung von Aß1-28 auf die [³H]-ACh-Freisetzung .....................................40

4.2 Wirkung von Aß1-28 auf die [³H]-Cholin-Beladung .....................................44

4.3 Die depolarisationsabhängige ChAT-Aktivierung......................................48

5 Zusammenfassung ................................................................51

6 Literaturverzeichnis...............................................................52

Lebenslauf

Einleitung und Problemstellung 1

1 Einleitung und Problemstellung

1.1 Vorbemerkung

Auf der 37. Versammlung südwestdeutscher Irrenärzte in Tübingen am 3.11.1906berichtete Alois Alzheimer (1864-1915) erstmalig über „eine eigenartige Erkrankungder Hirnrinde“ bei einer 51jährigen Frau, die durch eine nur mikroskopisch feststell-bare Neurofibrillenveränderung gekennzeichnet war. Inzwischen ist dieses nach sei-nem Erstbeschreiber benannte Krankheitsbild die häufigste Demenzform in den In-dustrieländern und macht etwa die Hälfte aller Demenzen aus [Chui, 1989].Der M. Alzheimer ist eine Krankheit des Alters und tritt sporadisch nur selten vor dem60. Lebensjahr auf [Geldmacher und Whitehouse, 1996]. Erkrankungen in jüngerenJahren kommen im wesentlichen bei den autosomal-dominant vererbten Fällen vor.Das klinische Bild beider Formen unterscheidet sich nur unwesentlich [Coyle et al.,1983]. Typisch ist ein schleichender Beginn mit Gedächtnis- und Wortfindungsstörun-gen, zu denen sich im weiteren Verlauf Störungen der zeitlichen und räumlichenOrientierung gesellen. Während die Persönlichkeitsfassade im Frühstadium intaktbleibt, kommt es mit dem Fortschreiten der Krankheit zum Verlust der meisten kogni-tiven Fähigkeiten, Agitation und Unruhe. Schließlich treten im Spätstadium häufigMyoklonien und Krampfanfälle auf [Zilles et al., 1995].Die Diagnose der Alzheimer-Demenz erfolgt anhand des klinischen Bildes unter Be-rücksichtigung des Krankheitsverlaufes und des Alters des Patienten. Grundlage bil-den die Richtlinien zur Diagnose der Alzheimer-Erkrankung durch die Arbeitsgruppedes National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke –Alzheimer`s Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA). Zusätz-lich ist zur endgültigen Diagnosestellung eine neuropathologische Untersuchungzwingend erforderlich [Tierney et al., 1988]. Die wesentlichen makroskopischen Ver-änderungen sind eine kortikale Atrophie mit verringertem Hirngewicht, verschmäler-ten Gyri und verbreiterten Sulci sowie eine Erweiterung der inneren und äußerenLiquorräume [Tomlinson, 1992]. Histopathologisch imponieren vor allem ein Neuro-nenverlust mit dem Auftreten seniler, aus ß-Amyloid-Protein (Aß) bestehenderPlaques sowie neurofibrilläre Veränderungen und eine Amyloidangiopathie [Terry,1985].Die Symptomatik des M. Alzheimer wird mit einem cholinergen Defizit in Verbindunggebracht, welches durch einen Neuronenuntergang in den basalen Vorderhirnkernenmit konsekutiver Degeneration der cholinergen Projektionen zum Hippocampus undNeokortex verursacht wird [Coyle et al., 1993]. Es ist unbestritten, daß das choliner-ge System eine wichtige Rolle beim Schlaf-Wach-Rhythmus, bei der Aufmerksamkeitund bei Gedächtnis- und Lernvorgängen spielt [Bigl et Arendt, 1991]. So beein-trächtigt zum Beispiel Scopolamin, ein Muskarinrezeptor-Antagonist, sowohl beimMenschen als auch im Tierexperiment Gedächtnis und Lernverhalten [Decker etMcGaugh, 1990], wobei dieser Effekt durch Gabe von Acetylcholinesterase-Inhibitoren antagonisiert werden kann [Collerton, 1986].


Vor dem Hintergrund der bedeutenden Rolle des Acetylcholins (ACh) bei den ebengenannten Funktionen des menschlichen Nervensystems ist es sinnvoll und wichtig,den Mechanismen der cholinergen Transmission nähere Aufmerksamkeit zu schen-ken. Das Hauptaugenmerk dieser Dissertation richtete sich auf die Beeinflußung descholinergen Systems durch das synthetische Aß1-28, welches aus den Aminosäuren 1bis 28 des Alzheimer-typischen Aß besteht, und auf eine genauere Untersuchung derAktivität der in den cholinergen Terminalen lokalisierten Cholinacetyltransferase(ChAT).


1.2 Acetylcholin und cholinerge Systeme

1.2.1 Biosynthese, Freisetzung und Rezeptoren des Acetylcholins

Die Biosynthese von ACh erfolgt im Cytoplasma cholinerger Nervenendigungen unterKatalyse der ChAT aus Cholin und Acetyl-Coenzym A [Pieklik et Guynn, 1975].Letzteres entsteht im wesentlichen durch oxidative Decarboxylierung von Pyruvat[Browning et Schulman, 1968].Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Synthese ist die Verfügbarkeit vonCholin [Freeman et Jenden, 1976], das auf zwei Arten bereitgestellt werden kann.Zum einen wird es von den Neuronen selbst durch Methylierung von membranständi-gem Phosphatidylethanolamin zu Phosphatidylcholin mit anschließender hydro-lytischer Abspaltung des Cholins gebildet [Blusztajn et al., 1987]. Der bei weitemüberwiegende Anteil des Cholins wird jedoch aus dem Extrazellulärraum über Cholin-Carrier aufgenommen. Ein niedrigaffiner Cholintransporter findet sich auch bei nicht-cholinergen Nervenzellen, die Cholin zur Synthese cholinhaltiger Membranlipidebenötigen [Tucek, 1990]. Typisch für die cholinergen Terminalen ist der High-Affinity-Choline-Uptake (HACU), der über einen Natrium-Gradienten angetrieben [Kuhar etMurrin, 1978] und durch Hemicholinium-3 selektiv blockiert wird [Guyenet et al.,1973]. Das zur Verfügung stehende Cholin wird vor allem in der Leber und in denNieren gebildet und passiert die Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe spezieller Transporter[Conford et al., 1978].Einmal in die cholinerge Nervenzelle aufgenommen, kann das Cholin der Bildungvon ACh zur Neurotransmission oder von Phosphatidylcholin, das zum Aufbau derNervenzellmembran benötigt wird, dienen. Phosphatidylcholin steht dabei der Ner-venzelle auch als Cholin-Donor für die ACh-Synthese zur Verfügung [Köppen, 1997];außerdem kann die Bildung von Phosphatidylcholin zugunsten von ACh gedrosseltwerden [Ando et al., 1987]. Aus der Zellmembran freigesetztes Cholin wird in den Ex-trazellulärraum entlassen, so daß zunächst über den HACU die erneute Aufnahme indie cholinerge Nervenzelle erfolgt, bevor es zur Synthese von ACh verwendet wer-den kann [Wurtman, 1992]. Das im Cytoplasma gebildete ACh wird schließlich mitHilfe eines elektrochemischen Protonengradienten, der von einer vesikulärenProtonen-ATPase aufrecht erhalten wird [Toll et Howard, 1980], in die Speicher-vesikel der Nervenendigungen geschleust [De Robertis et al., 1963].Bei Eintreffen eines Aktionspotentials, das durch spannungsabhängige Natrium-Ka-näle getragen wird, öffnen sich, wie auch in menschlichem Hirngewebe gezeigtwurde, N-Typ-Kalzium-Kanäle im Bereich der cholinergen Nervenendigung [Feuer-stein et al., 1990]. Der konsekutive Kalzium-Einstrom ins Axoplasma leitet dieVerschmelzung der Vesikel- und Axoplasmamembran und damit die Exocytose desACh in den synaptischen Spalt ein [Llinas et al., 1976]. Während das freigesetzteACh zu seinen Rezeptoren diffundiert, schnüren sich die entleerten Vesikel vomAxolemm ab und stehen für einen neuen Zyklus der Transmitteraufnahme und –freisetzung bereit.


Das in den synaptischen Spalt entlassene ACh kann sowohl an präsynaptische alsauch an postsynaptische Rezeptoren binden. Dabei werden grundsätzlich nikotini-sche und muskarinische ACh-Rezeptoren unterschieden. Erstere sind liganden-gesteuerte Ionenkanäle, wobei man zwischen dem an der motorischen Endplatte derquergestreiften Muskulatur vorkommenden Muskeltyp und dem auf Neuronen lokali-sierten Nerventyp unterscheidet [Colquhoun et al., 1990]. Die muskarinischenRezeptoren sind mit G-Proteinen gekoppelt; von ihnen sind drei Subtypen bekannt:M1- und M3-Rezeptoren stimulieren über ein Gq-Protein die Phospholipase C,während M2-Rezeptoren über ein Gi-Protein die Adenylatcyclase hemmen oderKalium-Kanäle öffnen [Brown et al., 1990]. M2-Rezeptoren finden sich präsynaptischauf den cholinergen Terminalen. Sie verhindern durch Autoinhibition rückkoppelndeine überschießende Freisetzung von ACh [Feuerstein et al., 1992].Die Beendigung der Signalübertragung erfolgt durch die Spaltung des freigesetztenACh durch die Acetylcholinesterase (AChE). Sie ist sowohl prä- als auch postsynap-tisch in der Zellmembran verankert und zerlegt das ACh in seine AusgangssubstrateCholin und Acetat [Starke, 1996]. Durch Physostigmin kann die AChE blockiert wer-den [Jenden, 1990]. Das durch die Spaltung freigesetzte Cholin wird über den HACUwieder in die Nervenendigung aufgenommen und steht für die Synthese von ACherneut zur Verfügung [Yamamura et Snyder, 1973].

1.2.2 Cholinerge Systeme

ACh ist einer der prominentesten und am besten untersuchten Transmitter des Ner-vensystems. Periphere cholinerge Neurone finden sich im Darmnervensystem, impostganglionären Parasympathikus sowie postganglionär bei der Innervation derSchweißdrüsen, die durch den Sympathikus erfolgt. Alle präganglionären autonomenNeurone sowie die Motoneurone der quergestreiften Muskulatur sind ebenfalls cho-linerg [Butcher et Woolf, 1986]; beide Gruppen werden bereits zu den zentralencholinergen Systemen gerechnet. Weitere wichtige zentrale cholinerge Systeme sinddie Interneurone des Corpus Striatum [Bigl et Arendt, 1991], deren Enthemmung beider Parkinson-Krankheit von wesentlicher Bedeutung ist, ferner die cholinergenNeurone im Hirnstamm sowie die Projektionsneurone im basalen Vorderhirn [Mesu-lam, 1990]. Auf letztere soll in diesem Zusammenhang näher eingegangen werden,da sie an Lern- und Gedächtnisfunktionen beteiligt sind und beim M. Alzheimertypischerweise degenerieren [Decker et McGaugh, 1990].Die großzelligen basalen Vorderhirnkerne sind Bestandteil des limbischen Systemsund umfassen den Nucleus tractus diagonalis Broca (Pars verticalis et horizontalis),den medialen Septumkern sowie den Nucleus basalis Meynert [Heedren et al., 1984].Die Kerngebiete des Diagonalen Broca-Bandes versorgen den Bulbus olfactoriusund Mandelkern (Pars horizontalis), außerdem den Hippocampus einschließlich deslimbischen Kortex (Pars verticalis) [Nyakas et al., 1987]. Der mediale Septumkernliegt oberhalb der Pars verticalis des Diagonalen Bandes und projiziert ebenfalls zum


Hippocampus und limbischen Kortex [Gaykema et al., 1990]. Der Nucleus basalisMeynert umfaßt auch Zellen des Globus pallidus. Er entsendet Efferenzen unter an-derem zur isokortikalen Großhirnrinde und zu limbischen Kortexarealen [Luiten et al.,1987].

Abb. 1: Übersicht der hauptsächlichen Verbindungswege der großzelligen basalen Vorderhirnkernezum Hippocampus und Kortex. Die cholinergen Neurone des medialen Septumkerns (MS) und desDiagonalen Broca-Bandes (DB) projizieren einerseits zum limbischen Kortex (z.B. Gyrus cinguli), an-dererseits via Fornix zum Hippocampus (HIP). Auch vom Nucleus basalis Meynert (NB) ausgehendziehen cholinerge Fasern zu limbischen Kortexarealen, außerdem über die Capsula externa zurisokortikalen Großhirnrinde [Saper, 1990].

Die Afferenzen zum zentralen cholinergen System der basalen Vorderhirnkernestammen aus dem Mandelkern, dem limbischen Kortex, dem Hypothalamus, demPallidum sowie aus gustatorischen und viszeralen Ponskernen. Diese breitgestreutenEinflüsse werden verarbeitet und letztendlich über den Nucleus basalis Meynert denkognitiven Bereichen der Großhirnrinde zugeleitet [Gaykema et al., 1991].

DB

Capsulaexterna

Gyruscinguli


1.3. Struktur und Aufbau des Hippocampus

Der Hippocampus bildet den inneren Ring des limbischen Kortex und ist am Bodendes Unterhorns der Seitenventrikel lokalisiert.An einem Frontalschnitt wird der s-förmige Hippocampus in den Gyrus dentatus, dasAmmonshorn und das Subiculum eingeteilt [Duvenoy, 1988]:

• Der Gyrus dentatus begleitet das Ammonshorn als randständige, leicht gezähn-te Windung [Braak, 1976]. Von den Körnerzellen des Gyrus dentatus geht dassogenannte Moosfasersystem aus, das an den Pyramidenzellen der SektorenCA3 und CA4 des Ammonshorns mündet [Gaarskjaer, 1978].

• Das Ammonshorn (Cornu ammonis) wird transversal in vier Sektoren eingeteilt,wobei die Sektoren CA1 und CA2 als Regio superior und die Sektoren CA3 undCA4 als Regio inferior bezeichnet werden [Lorente de No, 1934]. Beim Men-schen besonders stark entwickelt ist die CA1-Region [Stephan, 1975]. DieAxone der CA3-Pyramidenzellen geben die Schaffer-Kollateralen ab, welcheVerbindung zu CA1 aufnehmen [Ishizuka et al., 1990].

• Das Subiculum grenzt an den CA1-Sektor des Ammonshorns. Es ist eine derHauptquellen der Efferenzen des Hippocampus, die Verbindungen zu kortikalenund subkortikalen Gebieten herstellen [Swanson et Cowan, 1975].

Die wesentlichen Afferenzen des Hippocampus stammen aus der Area entorhinalis(via Tractus perforans), die vor allem im Gyrus dentatus münden [Andersen et al.,1966], und den medialen Septumkernen (via Fornix), welche für die starke cholinergeVersorgung des Hippocampus verantwortlich sind [Halliwell, 1990]. Beide Eingängevermitteln Informationen aus kortikalen und subkortikalen Regionen. Zusätzlich errei-chen den Hippocampus Afferenzen aus limbischen Gebieten, visuellem und präfron-talem Kortex , aus pontinen und thalamischen Regionen sowie olfaktorische, gustato-rische und viszerale Informationen [Wyss et al., 1979].Das Gros der hippocampalen Efferenzen stammt aus CA1 und Subiculum und proji-ziert via Fornix in die Septumregion und Area entorhinalis [Powell et al., 1957], diesekundäre Verbindungen zu zahlreichen subkortikalen und kortikal-kognitiven Gebie-ten schaffen [Kosel et al., 1982]. Daneben besitzt der Hippocampus auch direkte Ver-bindungen unter anderem zu limbischen und telencephalen Kerngebieten.Dem Hippocampus werden wesentliche Funktionen hinsichtlich der Verarbeitung undSpeicherung von Informationen zugeschrieben [O`Keefe et Nadel, 1978]. Die Schädi-gungen im Rahmen des M. Alzheimers, die vor allem die CA1-Region und Subiculumsowie den Tractus perforans betreffen [Van Hoesen et Hyman, 1990], führen durchAbtrennung wesentlicher Afferenzen und Efferenzen zur Isolierung des Hippocampusund somit zu den schweren Gedächtnisstörungen der Patienten.


1.4 Struktur und Aufbau des Neokortex

Der Neokortex besitzt eine sechsschichtige Grundstruktur und wird auch als Isokor-tex bezeichnet. Er unterscheidet sich somit von allokortikalen Bereichen, die keineneinheitlichen sechsschichtigen Aufbau aufweisen und denen zum Beispiel der Hippo-campus zugerechnet wird [Von Economo et Koskinas, 1925].Die circa 10-18 Milliarden Neurone des menschlichen Neokortex sind von der freienOberfläche Richtung Marklager wie folgt angeordnet:

• Lamina molecularis (I)

• Lamina granularis externa (II)

• Lamina pyramidalis externa (III)

• Lamina granularis interna (IV)

• Lamina pyramidalis interna (V)

• Lamina multiformis (VI)

Die wesentlichen Afferenzen des Neokortex sind aus dem Thalamus aufsteigendeProjektionen. Während die spezifischen thalamokortikalen Fasermassen topisch or-ganisiert sind und überwiegend zu den in der Lamina granularis interna (IV) liegen-den Neuronen Kontakt aufnehmen, reichen die Fasern der unspezifischen thalamo-kortikalen Verbindungen vorwiegend bis in die Laminae I und VI [Jones, 1985].Nicht-thalamische Afferenzen des Neokortex stammen unter anderem aus Hypo-thalamus, Locus coeruleus, Raphekernen, Basalganglien und limbischem System.Die Hauptmenge des im Neokortex freigesetzten ACh entstammt den Axonaufzwei-gungen des Basalkernkomplexes [Saper, 1990].Die neokortikalen Efferenzen können in drei Gruppen eingeteilt werden [Duus, 1989]:

• Die erste Gruppe bilden die Assoziationsfasern, die ipsilateral verschiedeneTeile eines Gyrus, verschiedene Gyri oder, im Falle der langen Assozia-tionsfasern, occipitale, temporale und parietale Assoziationsfelder mit denendes Frontallappens verbinden. Die Ursprungsneurone dieser Efferenzenliegen in den Schichten II-IV und VI des Neokortex [Rockland et Pandya,1981].

• Die Ursprungsneurone der Kommissurenfasern befinden sich überwiegendin der Lamina pyramidalis externa (III) und verbinden die Neokortizes beiderHemisphären [Heedren et Yin, 1981].

• Die Projektionsneurone bilden die dritte große Gruppe. Die relativ kurzenBahnen zur Amygdala, Claustrum und Thalamus entspringen von Neuronender Lamina multiformis (VI), während die Efferenzen zum Striatum, Hirn-stamm und Rückenmark in der Schicht V ihren Ursprung nehmen [Jones etWise, 1977].

Beim M. Alzheimer gehen vor allem die Ursprungsneurone der langen Assoziations-fasern zugrunde [Braak et al., 1994].


Unter funktionellen Gesichtspunkten wird der Neokortex in Kernfelder (Primärgebietemit stark ausgeprägten thalamischen Afferenzen), Gürtelfelder (Gebiete, die sich un-mittelbar an die primären Felder anschließen) und Assoziationsfelder gegliedert. Je-der Lappen des Endhirns enthält ein Kernfeld (visuell im Occipitallappen, auditorischim Temporallappen, somatosensorisch im Parietallappen und somatomotorisch imFrontallappen). In den sensorischen Kernfeldern erfolgt der erste Schritt der kortika-len Informationsverarbeitung, in den Gürtelfeldern ein weiterer, während in den Asso-ziationsfeldern schließlich Verarbeitungsschritte höherer Ordnung durchgeführt wer-den, wie zum Beispiel die Verknüpfung mit Eingängen aus anderen Sinnessystemenund die Übertragung der so strukturierten Daten auf den frontalen Assoziationskortex[Pandya et Yeterian, 1985]. Letzterer ist außerdem für höhere Funktionen desmenschlichen Gehirns wie Motivation, Initiative, Entschlußkraft und Konzentrations-fähigkeit von besonderer Bedeutung [Zilles, 1990].


1.5 Fakten über Morbus Alzheimer

1.5.1 Pathologie

Typisch beim M. Alzheimer ist die Degeneration des mittleren Temporallappens undtemporoparietalen Assoziationskortex [Arnold et al., 1991; Brun et Englund, 1981].Die ersten Veränderungen betreffen im mittleren Temporallappen den entorhinalenKortex, wobei zunächst Fasern des Tractus perforans degenerieren, der die haupt-sächlichen Afferenzen des Hippocampus enthält [Hyman et al., 1986]. Dies erklärtdie sich schon früh manifestierenden Gedächtnisstörungen. Die starke Beteiligungdes temporoparietalen Assoziationskortex bedingt die frühen Störungen der Spracheund der raumverarbeitenden Funktionen [Cummings et al., 1985]. Da das Frontalhirnim Frühstadium der Krankheit weniger stark betroffen ist, sind schwere Antriebs-störungen oder Enthemmung als Frühsymptome eher untypisch [Cummings etBenson, 1992]. Auch der Hippocampus per se zeigt anfangs noch keine patholo-gischen Veränderungen; diese finden sich erst im weiteren Krankheitsverlauf. Fernergehen subkortikale Kerngebiete zugrunde, insbesondere die cholinergen Kerne imbasalen Vorderhirn [Wilcock et al., 1988].Im Zuge der Erkrankung breitet sich der degenerative Prozeß auf sämtliche kortikaleAssoziationsareale aus. Schließlich kommt es im Endstadium zur Zerstörung vonmotorischen Gebieten wie zum Beispiel Striatum, Substantia nigra und motorischemKortex [Zilles et al., 1995].Die wichtigsten histopathologischen Veränderungen bestehen in einem Neuronen-verlust mit dem Auftreten seniler Plaques, neurofibrillären Veränderungen (Tangles)und einer Amyloidangiopathie [Terry, 1985]. Auf molekularer Ebene hervorstechendist Aß mit einer variablen Kettenlänge von 40 bis 43 Aminosäuren. Es ist wesent-licher Bestandteil der Plaques, von denen drei Arten unterschieden werden [Masliahet al., 1990]:

• Die unscharf begrenzten diffusen Plaques bestehen aus der löslichen Formdes Aß und enthalten keine Neuriten. Sie werden als Vorläufer der klas-sischen Alzheimer-Plaques betrachtet [Selkoe, 1994], sind aber auch bei äl-teren nicht-dementen Menschen im Kortex nachweisbar [Golde et al., 1993].

• Eine weitere Form sind die scharf begrenzten unreifen Plaques. Sie enthal-ten geschwollene Neuriten.

• Typisch für die Alzheimer-Demenz sind die senilen, reifen neuritischenPlaques, die aus einem Kern von Aß, degenerierten Neuriten und entzünd-lichen Zellen (Mikroglia, Astrocyten) bestehen [Mirra et al., 1991]. Sie kom-men vor allem im Assoziationskortex und Hippocampus vor [Giannakopou-los et al., 1995], sind allerdings nicht spezifisch für den M. Alzheimer. Aßder neuritischen Plaques ist im Gegensatz zu den diffusen Plaques unlös-lich.

Bei der Amyloidangiopathie lagert sich Aß in der Wand von kortikalen und leptome-ningealen Gefäßen entlang der Basalmembran ab [Schlote et al., 1995].


Die Tangles sind cytoplasmatische Einschlüsse, die überwiegend aus abnorm phos-phoryliertem tau-Protein bestehen, das eine wichtige strukturgebende Funktion fürdas Cytoskelett der Zellen hat [Goedert, 1995]. Auch sie sind nicht spezifisch für denM. Alzheimer und können darüber hinaus vor allem bei alten Patienten fehlen [Terry,1985].

1.5.2 Molekulare und strukturelle Eigenschaften des Aß

Aß ist als Bestandteil der Plaques und der Amyloidangiopathie ein wichtiges Korrelatdes M. Alzheimers. Vorläufer dieses Proteins ist das ß-Amyloid-Precursor-Protein (ß-APP), für welches ein Gen auf Chromosom 21 codiert [Goate et al., 1991]. ß-APP istein sekretorisches Glykoprotein mit einer transmembranären Domäne, N-terminalerEktodomäne und intrazellulär lokalisiertem C-Terminus [Hardy et Allsop, 1991]. Eskommt ubiquitär vor, wird jedoch vor allem im Gehirn exprimiert. Der Metabolismusdes ß-APP kann auf zwei verschiedenen Wegen, dem sekretorischen oderlysosomalen Weg, erfolgen (Abb. 2; S.13).Im Rahmen des sekretorischen Weges wird das in der Zellmembran lokalisierte ß-APP zwischen den Aminosäuren 687 und 688 durch die α-Secretase zerlegt, gefolgtvon einer weiteren proteolytischen Spaltung C-terminal der Aminosäure 712 durcheine γ-Secretase [Weidemann et al., 1989]. Da der Angriffspunkt der α-Secretaseinnerhalb der Sequenz des Aß liegt, ist die Bildung amyloidogener Metabolite aus ß-APP ausgeschlossen. Stattdessen entstehen sezernierte, lösliche Spaltprodukte desß-APP (sAPPs), die neurotrophisch und neuroprotektiv wirken. Bei drohenden neuro-nalen Schäden wird die ß-APP-Produktion hochreguliert, wobei die gebildeten sAPPsdurch die Stabilisierung der intrazellulären Kalzium-Konzentration eine neuroprotek-tive Funktion besitzen. Außerdem wird eine Rolle der sAPPs bei der synaptischenPlastizität vermutet [Mattson et al., 1993].Beim lysosomalen Weg wird das ß-APP durch die ß-Secretase zwischen den Amino-säuren 671 und 672 und anschließend durch eine γ-Secretase wiederum C-terminalvon Aminosäure 712 gespalten. Dabei entstehen Aß-Moleküle mit einer variablenLänge von 40, 42 oder 43 Aminosäuren [Golde et al., 1992]. Es ist zum gegenwärti-gen Zeitpunkt nicht geklärt, ob die Unterschiede hinsichtlich der Moleküllänge durchdie geringe Spezifität einer γ-Secretase bedingt sind, oder ob verschiedene Subtypender γ-Secretase mit unterschiedlichen Angriffspunkten existieren.Die Länge des entstehenden Aß ist von großer Bedeutung für dessen physikalisch-chemische Eigenschaften, da mit zunehmender Anzahl an Aminosäuren die Tendenzzur Bildung unlöslicher Fibrillen steigt [Jarrett et al., 1993]. Unter physiologischen Be-dingungen wird jedoch überwiegend Aß1-40 produziert [Haass et al., 1992]. Von Be-deutung ist in diesem Zusammenhang, daß das unlösliche Aß der senilen, reifenPlaques überwiegend aus 42 Aminosäuren besteht [Iwatsubo et al., 1994].


Doch welche Faktoren tragen zur Entstehung von unlöslichem Aß bei?Grundsätzlich bestehen zwei Möglichkeiten: Veränderungen im Metabolismus des ß-APP mit der bevorzugten Entstehung „langer“ Aß-Moleküle oder die Existenz einesMilieus, das die Polymerisation von Aß zu unlöslichen Fibrillen fördert.Bei den in der Regel autosomal-dominant vererbten Formen des familiären M. Alz-heimers sind mehrere Mutationen im ß-APP-Gen bekannt, die einen Einfluß auf dieAß-Produktion ausüben [Younkin, 1994]. Veränderungen des ß-APP im Bereich derAminosäuren 670/671 erhöhen die Potenz der ß-Secretase und führen zu einerMehrproduktion von Aß1-40 und Aß1-42; Mutationen der Aminosäuren 692 (Hemmungder α-Secretase), 716 und 717 (veränderter Angriffspunkt der γ-Secretase) steigerndie Bildungsrate von Aß1-42.Der Nachweis von Mutationen im ß-APP-Gen gelingt allerdings nur in etwa fünf Pro-zent der hereditären Fälle. Ein wesentlich größerer Prozentsatz wird mit Mutationender Präsenilin-Gene in Verbindung gebracht [Xia et al., 1997], die ebenfalls zu einergesteigerten Produktion von Aß1-42 führen [Scheuner et al., 1996]. Präsenilin-1 (PS-1)liegt auf Chromosom 14, das Präsenilin-2 (PS-2) befindet sich auf Chromosom 1[Haass, 1997]. Beide PS-Gene codieren für etwa 450 Aminosäuren lange Proteine,die bei der Kompartimentierung und Prozessierung des ß-APP von Bedeutung sind[Hardy, 1997].Auch veränderte extrazelluläre Bedingungen können zur Bildung unlöslicher Aß-Poly-mere führen. Die N-terminalen Aminosäuren 1-28 sind hinsichtlich ihrer Konformationvom pH-Wert des Lösungsmittels abhängig. Bei pH-Werten zwischen 1 und 4 sowiegrößer 7 besitzen sie eine intramolekulare α-helicale Struktur, die bei pH-Werten von4 bis 7 in eine intermolekulare ß-Faltblatt-Struktur übergeht. Dagegen liegt die C-ter-minale Domäne des Aß mit den Aminosäuren 29 bis 40(-43) unabhängig vom pH-Wert immer als intermolekulares ß-Faltblatt vor [Barrow et Zagorski, 1991]. DieStruktur des N-Terminus beeinflußt die Löslichkeit des gesamten Aß. Bei α-helicalerKonformation liegt Aß als lösliches Monomer vor oder lagert sich in Membranen zuDi- bis Tetrameren zusammen. Besitzen die Aminosäuren 1 bis 28 dagegen die ß-Faltblatt-Struktur, ist Aß unlöslich und formt oligomere Fibrillen, wie sie beim M.Alzheimer gefunden werden [Barrow et al., 1992]. Denkbar ist somit, daß lokaleVeränderungen des pH-Wertes die Bildung unlöslicher Fibrillen induzieren.Neben den bereits erwähnten Mutationen existieren weitere genetische Faktoren, diemit der Alzheimer-Demenz in Verbindung gebracht werden. Am besten untersucht istdie Rolle des Apolipoproteins E, das eine wichtige Funktion im Lipidstoffwechselerfüllt [Poirier et al., 1993] und in drei Isoformen (E2, E3, E4) existiert [Tsai et al.,1994]. Während das Allel E2 protektiv wirkt, erkranken Träger des E4-Allels mit einerhöheren Wahrscheinlichkeit und zu einem früheren Zeitpunkt an der Alzheimer-Demenz [Kurz et al., 1996]. Dabei fördert das Apolipoprotein E4 die Bildung vonunlöslichen Aß-Fibrillen und wird zudem in den entstehenden Plaques eingelagert[Strittmatter et al., 1993].


1.5.3 Veränderungen der Neurotransmission beim M. Alzheimer

Beim Morbus Alzheimer treten Veränderungen in diversen cerebralen Transmitter-systemen auf.Das cholinerge System ist hierbei von besonderem Interesse, da die Demenz beimM. Alzheimer mit einem cholinergen Defizit in Verbindung gebracht wird [Bartus etal., 1982]. Es findet sich eine ausgeprägte Degeneration der cholinergen Neuronedes basalen Vorderhirns, welche zum Hippocampus und Neokortex projizieren[Price, 1986]. Die Aktivitäten der ChAT, des HACU und der AChE sowie die Mengedes endogenen ACh sind in diesen Regionen stark reduziert [Quirion, 1993]. Dabeikorreliert die Abnahme der kortikalen ChAT-Aktivität mit dem Schweregrad derDemenz. In den vergangenen Jahren wurde zudem ein funktioneller Zusammenhangzwischen Aß und dem cholinergen System aufgedeckt. Gaben von Aß induziertendie Degeneration cholinerger Neurone und sorgten sowohl bei Ratten als auch beiMäusen für Gedächtnisstörungen [Giovanelli et al., 1995; Nitta et al., 1994]. Kar et al.demonstrierten 1996 eine hemmende Wirkung von Aß-Molekülen unterschiedlicherLänge auf die Kalium-evozierte ACh-Freisetzung im Rattenhippocampus und –kortexsowie 1998 eine inhibitorische Wirkung von Aß1-40 auf den HACU.Außerdem betroffen sind das serotonerge System mit einer Reduktion der Neuroneund Dichte der S2-Rezeptoren im dorsalen Raphekern [Cross et al., 1986], sowieeiner Abnahme der Serotonin-Konzentration im Kortex und Hippocampus [Gottfries,1990]. Beim noradrenergen System, dessen Transmitterfreisetzung durch Aß redu-ziert wird [Li et Smith, 1996], imponieren zum Teil verringerte Neuronenzahlen imLocus coeruleus [Price et al., 1986]. Die Freisetzung von Glutamat und Aspartat wirddurch Aß gesteigert [Arias et al., 1995], obwohl deren Konzentrationen im Neokortexdes Alzheimer-Patienten deutlich vermindert sind [Lang, 1994]. Häufig sind in denBasalganglien die Dopamin-Spiegel vermindert [Allard et al., 1990]. Frühzeitig findetsich ein Schwund von Substanz P-Neuronen im Kortex und Gyrus dentatus [Kowallet al., 1993], während die überwiegend kortikale Abnahme der Immunoreaktivität fürSomatostatin, die mit dem Schweregrad der Demenz und den auftretenden Sprach-störungen korreliert, erst im späteren Verlauf auftritt [Rossor et al., 1980].

1.5.4 Die „Amyloid Cascade Hypothesis“

Die von Hardy et Higgins 1992 postulierte „Amyloid Cascade Hypothesis“ (Abb. 2;S.13) besagt, daß Aß bzw. Bruchstücke des ß-APP, die die Aß-Sequenz vollständigenthalten, neurotoxisch wirken und für den beim M. Alzheimer beobachteten Neuro-nenuntergang verantwortlich sind. Dabei ist offen, ob Aß per se neurotoxisch ist[Neve, 1990] oder die Zellen für neurotoxische Schäden lediglich vulnerabler macht[Mattson et al., 1992].Eine mögliche Wirkungsweise von Aß ist die Störung der Kalzium-Homöostase [Fu-kuyama et al., 1994]. Der Anstieg der intrazellulären Kalzium-Konzentration kann


zum einem direkt den Tod der Neurone herbeiführen [Kristian et Siesjoe, 1998], zumanderen die Entstehung der neurofibrillären Tangles begünstigen, da der Phosphory-lierungsgrad des tau-Proteins über den intrazellulären Kalzium-Spiegel reguliert wird[Baudier et Cole, 1987]. Die entstehenden Tangles bedingen eine Instabilität derMikrotubuli mit Störung des axonalen Transportes und führen sekundär zum Neuro-nenuntergang [Takashima et al., 1995]. Auch eine durch Aß induzierte Bildungreaktiver Sauerstoffmetabolite wird als neurotoxisches Prinzip diskutiert [Behl et al.,1994].

Kritiker der „Amyloid Cascade Hypothesis“ zweifeln an der Aß-Neurotoxizität undverweisen auf Studien an transgenen Mäusen, die trotz ausgeprägter Aß-Plaqueskeinen begleitenden Neuronenuntergang zeigten [Hsiao et al., 1996]. Iqbal etGrundke-Iqbal (1997) fanden keinen Zusammenhang zwischen den Aß-Ablagerun-gen und dem Auftreten der neurofibrillären Tangles, wobei diese zu Beginn derErkrankung im entorhinalen Kortex auch bei Abwesenheit von Aß-Plaques zu findensind [Bouras et al., 1994].Inwiefern die „Amyloid Cascade Hypothesis“ den tatsächlichen Verhältnissen genügt,ist unklar. Dennoch ist sie einer der anerkanntesten Erklärungsversuche hinsichtlichdes Zusammenhanges von Aß-Deposition und Neuronenuntergang beim M. Alzhei-mer und bildet die Grundlage zahlreicher Studien und Experimente.

ß-APP

N C

lysosomaler Weg sekretorischer Weg

671 712(-715) 687 712

Aß sAPPs

Cai2+ Cai

2+

tau-Phosphorylierung

neurofibrilläre Neuronenuntergang Tangles

Abb. 2: Amyloid Cascade Hypothesis [Hardy et Higgins, 1992] (modifiziert)

reaktiveO2-Metabolite


1.6 Die Hypothese der depolarisationsabhängigenChAT-Aktivierung

Die Superfusion dient unter anderem der evozierten Freisetzung radioaktiv markierterTransmitter aus unterschiedlichen anatomischen Strukturen des Gehirns. Sie ist einModell, das den Verhältnissen in vivo sehr nahekommt und die Erforschung der Ein-flüsse von Substanzen auf Neuronensysteme und deren Transmission erlaubt.Wesentlicher Bestandteil von Superfusionsexperimenten zur Untersuchung der cho-linergen Transmission ist die Inkubation der Gewebeschnitte mit radioaktivem [³H]-Cholin. Dieses wird über den HACU selektiv in die cholinergen Terminalen aufge-nommen [Jope, 1979] und unter Katalyse der ChAT mit Acetyl-Coenzym A zu [³H]-ACh verknüpft, das bei Depolarisation freigesetzt wird. Die stimulationsbedingteTritiumabgabe aus Gewebeschnitten, die zuvor mit [³H]-Cholin inkubiert wurden, ent-spricht dabei der Freisetzung von [³H]-ACh [Hadhazy et Szerb, 1977]. Feuerstein etal. belegten 1998 auch im menschlichen Neokortex, daß die elektrisch evozierte [³H]-ACh-Freisetzung nach [³H]-Cholin-Inkubation die Freisetzung von endogenem AChwiderspiegelt. Außerdem wurde die Kalzium-Abhängigkeit der elektrisch stimulierten[³H]-ACh-Freisetzung sowie deren Blockade durch Tetrodotoxin demonstriert [Feuer-stein et al., 1990], so daß davon ausgegangen werden kann, daß die durch Inkuba-tion mit [³H]-Cholin erzielte Freisetzung von [³H]-ACh quasi-physiologisch durchAktionspotentiale vermittelt wird und exocytotisch erfolgt.Bei der Durchführung eines Superfusionsexperimentes kann die Zahl der Stimula-tionen variiert werden. Bei Experimenten mit zwei Stimulationen S1 und S2 dient dieBildung des S2/S1-Quotienten der Analyse etwaiger Effekte von Substanzen, die vorS2 dem Superfusionspuffer zugesetzt wurden. Bei den parallel mitlaufenden Kontrol-len wird auf die Zugabe von Substanzen verzichtet. Unter der Annahme, daß bei S1

und S2 gleiche Mengen an radioaktiv markiertem Transmitter freigesetzt werden,sollte der S2/S1-Quotient der Kontrollen den Wert eins besitzen. Bei Experimentenmit elektrisch evozierter [³H]-ACh-Freisetzung (3 Hz, 90 Pulse, 2 ms, 68 mA) befindetsich dieser Quotient tatsächlich im erwarteten Bereich von eins. Erfolgt die [³H]-ACh-Freisetzung dagegen durch vierminütige Kalium-Depolarisation (20 mM), liegt dasS2/S1-Verhältnis der Kontrollen deutlich darunter.Ausgehend von diesem Sachverhalt stellten wir die Hypothese der depolarisations-abhängigen ChAT-Aktivierung auf. Sie geht davon aus, daß durch die langdauerndeKalium-Depolarisation, nicht aber durch die kurze elektrische Stimulation, die ChATder cholinergen Nervenzellen aktiviert wird. Da das erhöhte extrazelluläre Kaliumzusätzlich die Freisetzung von nicht radioaktiv markiertem Cholin aus den Membran-lipiden fördert [Nagata et al., 1973], wird somit zwischen S1 und S2 durch vermehrteNeusynthese von nicht radioaktiv markiertem ACh der bei S2 freigesetzte [³H]-ACh-Pool verdünnt. Das neusynthetisierte ACh wird vom Szintillationszähler nicht re-gistriert: das S2/S1-Verhältnis der Kontrollen bei Kalium-Depolarisation sollte somitweit unter dem erwarteten Wert von eins liegen.


1.7 Fragestellung

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Bereichen der cholinergen Trans-mission im ZNS:Vor dem Hintergrund der von Kar et al. (1996) demonstrierten hemmenden Eigen-schaften von Aß auf die Kalium-evozierte ACh-Freisetzung im Rattenhippocampuswurde im ersten Teil der Arbeit dieser Zusammenhang im Superfusionsexperimentim Rattenhippocampus und menschlichen Neokortex unter Verwendung von Aß1-28

untersucht. Daneben wurde ein Augenmerk auf Effekte des Aß1-28 auf die radioaktiveBeladung der Gewebeschnitte mit [³H]-Cholin gerichtet, da ein Einfluß von Aß aufden ACh-Gehalt von Nervenzellen [Ehrenstein et al., 1997] sowie auf den HACU dercholinergen Terminalen beschrieben wurde [Kar et al., 1998]. Im Detail wurdenfolgende Fragen bearbeitet:

1. Können die Ergebnisse von Kar et al. (1996) mit Aß1-28 nachvollzo-gen werden und ist eine Übertragung der Ergebnisse auf mensch-liches Neokortexgewebe möglich?

2. Ist die Wirkung auf die [³H]-ACh-Freisetzung im Rattenhippocampusund menschlichen Neokortex von der Konzentration und Einwirkdauerdes Aß1-28 abhängig? Welchen Effekt hat die Senkung des zur Aß1-28-Vorinkubation verwendeten pH-Wertes und die damit wahrscheinlichentstehende Alzheimer-typische ß-Faltblatt-Konformation des Aß1-28

auf die [³H]-ACh-Freisetzung im Rattenhippocampus?3. Hat Aß1-28 einen Einfluß auf den [³H]-Cholin-Gehalt der Hippocampus-

schnitte der Ratte und der menschlichen Neokortexschnitte?4. Inwiefern üben die unter 2. aufgeführten Parameter Konzentration,

Einwirkdauer und pH-Wert an den Schnitten der betreffenden Spezieseinen Effekt auf deren Beladung mit [³H]-Cholin aus?

Die Hypothese der depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung erklärt die niedrigenS2/S1-Quotienten der Kalium (20 mM, 4 min)-evozierten [³H]-ACh-Freisetzung miteiner Verdünnung des bei S2 freigesetzten [³H]-ACh-Pools durch nach S1 vermehrtneusynthetisiertes, nicht radioaktiv markiertes ACh. Dieser Sachverhalt wurde imzweiten Teil anhand folgender Fragestellungen überprüft:

1. Sorgen der indirekte ChAT-Inhibitor Okadasäure [Issa et al., 1996]und der direkte ChAT-Inhibitor Bromo-Acetylcholin (Br-ACh) [Roskos-ki, 1974] am menschlichen Neokortex für eine Anhebung des S2/S1-Quotienten der Kalium-evozierten [³H]-ACh-Freisetzung?

2. Hat die Okadasäure eine Wirkung auf den S2/S1-Quotienten der elek-trisch evozierten [³H]-ACh-Freisetzung am menschlichen Neokortex?

3. Kann mittels eines ChAT-Assays die Aktivitätssteigerung der hu-manen ChAT durch Kalium-Depolarisation direkt nachgewiesenwerden?

Material und Methoden 16

2 Material und Methoden

2.1 Reagenzien

Bei den in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimenten kamen folgendeSubstanzen zum Einsatz:

[³H]-Cholinchlorid Amersham, Braunschweig, Dtld.Hemicholinium-3 Sigma, Steinheim, Dtld.ß-Amyloid1-28 Calbiochem-Novabiochem,

Bad Soden, Dtld.Physostigmin-Sulfat Sigma, Steinheim, Dtld.Okadasäure RBI-Biotrend, Köln, Dtld.Bromo-Acetylcholin RBI-Biotrend, Köln, Dtld.Saccharose Sigma, Steinheim, Dtld.HEPES Sigma, Steinheim, Dtld.(Hydroxyethylpiperazinoethansulfonsäure)[14C]-Acetyl-Coenzym A Amersham, Braunschweig, Dtld.Acetyl-Coenzym A Sigma, Steinheim, Dtld.Cholin-Bromid Sigma, Steinheim, Dtld.Acetonitril Roth GmbH, Karlsruhe, Dtld.Ultima Gold XR Packard, Groningen, Ndl.Soluene 350 Packard, Groningen, Ndl.Rotiszint Roth GmbH, Karlsruhe, Dtld.

Nicht aufgeführte Chemikalien wurden von der Firma Merck, Darmstadt,Dtld. bezogen.

Die Substanzen wurden direkt vor den Versuchen in bidestilliertem Wasser (MilliporeReinstwasseranlage; Millipore, Eschborn, Dtld.) oder in Ethanol gelöst.Eine Ausnahme stellt in diesem Zusammenhang Aß1-28 dar, das in einem Natrium-Phosphat-Puffer für 48 Stunden bei 37°C und einem pH-Wert von 7.4 vorinkubiertwurde, bevor es bei den Superfusionsexperimenten zum Einsatz kam.


2.2 Superfusionsexperimente

Die Durchführung eines Superfusionsexperimentes beinhaltete die Schritte Präpara-tion, Inkubation, Vorperfusion und Superfusion sowie die anschließende Berechnungund Statistik.Der im Rahmen der Versuche verwendete Gebrauchs- und Inkubationspuffer war wiefolgt zusammengesetzt (Angaben in mM):

NaCl 121 KCl 1.8CaCl2 1.3 MgSO4 1.2NaHCO3 25 KH2PO4 1.2Glucose 11

Der 30-45 Minuten mit Carbogen (95% O2/5% CO2) begaste Puffer wurde mit NaOH(0.1 N) unter pH-Meter-Kontrolle (Metrohm, Herisau, Schweiz) auf einen pH-Wert von7.4 eingestellt.

2.2.1 Präparation des Gewebes

2.2.1.1 Rattenhippocampus

Ungefähr 250 g schwere, männliche Wistar-Ratten (Charles River, Dtld.) wurden miteiner Guillotine dekapitiert. Nach Eröffnung der Schädeldecke und Durchtrennungder harten Hirnhaut wurde das Gehirn aus der Schädelhöhle entnommen und in eis-gekühlten Gebrauchspuffer überführt. Auf einem Aluminiumblock erfolgte bei 0°C dieweitere Präparation: das Kleinhirn und die Medulla oblongata wurden mit einem Skal-pell abgetrennt und das Großhirn in der Medianebene halbiert. Nach Durchtrennungder Verbindung von Großhirnrinde und Fornix konnte der Hippocampus der jeweili-gen Hemisphäre freigelegt und herauspräpariert werden. Mit einem Mc-Illwain-Gewe-beschneider (Bachofer, Reutlingen, Dtld.) wurden die Hippocampi in 0.35 mm dickeSchnitte zerteilt, in ein Reagenzglas mit Gebrauchspuffer überführt und die Schnittemit Hilfe eines Vortex (Heidolph, Dtld.) voneinander getrennt. Die durchschnittlicheAusbeute lag bei etwa 20 Schnitten pro Hippocampus; 24 Schnitte wurden für dieanschließende Inkubation ausgewählt.

2.2.1.2 Menschlicher Neokortex

Das für die Versuche verwendete menschliche Neokortexgewebe stammte von 14Patienten beiderlei Geschlechts, die in der Neurochirurgischen Abteilung derUniversitätsklinik Freiburg operativ versorgt wurden. Das Alter der Patienten lagzwischen 7 und 66 Jahren. In der Mehrzahl der Fälle waren die Patienten an subkor-


tikalen Tumoren erkrankt, zu deren neurochirurgischen Behandlung es operations-technisch erforderlich war, unter Umgehung funktionell wichtiger Regionen Kortex-gewebe teilweise zu entfernen. Zusätzlich erhielten wir menschlichen Neokortex vonepilepsiechirurgischen Patienten mit Hippocampussklerose in Form von temporalemZugangsgewebe sowie Anteile kortikaler epileptischer Foci. In allen Fällen wurde dieEntnahme von menschlichem Neokortexgewebe zu Versuchszwecken durch dieFreiburger Ethikkommission genehmigt.Zur präoperativen Vorbereitung wurde Flunitrazepam, zur Narkose Thiopental oderFentanyl, bei erhöhtem Hirndruck Dexamethason verabreicht. Als Muskelrelaxanskam Pancuronium zum Einsatz.Die Gewebestücke wurden sofort nach der Entnahme in eisgekühlten, carbogenge-sättigten Gebrauchspuffer transferiert und unmittelbar danach auf einem Aluminium-block bei 0°C präpariert. Makroskopisch erkennbare Anteile von Tumor, weißer Sub-stanz und Gefäßen wurden entfernt und das Gewebe mit einem Mc-Illwain-Gewebe-schneider in Schnitte von 0.35 mm Dicke zerteilt. Anschließend wurde das geschnit-tene Gewebe vorsichtig zurück in den Gebrauchspuffer überführt und die Schnitte mitHilfe des Vortex voneinander getrennt.

2.2.2 Inkubation

Nach Auswahl der Schnitte (Rattenhippocampus: 24 Schnitte; menschlicher Neokor-tex: je nach Verfügbarkeit 12 oder 24 Schnitte) wurden diese in 2 ml Gebrauchspuffermit 0.1 µM [³H]-Cholinchlorid (Aktivität: 85 Ci/mmol) unter Begasung mit Carbogenbei 37°C inkubiert (Inkubator: Heraeus Instruments, Leonberg, Dtld.). Die Inkuba-tionsdauer betrug bei den Versuchen mit Rattenhippocampus 30 min, bei Einsatzvon menschlichem Gewebe 40 min.Während der Inkubation nahmen die cholinergen Neurone das Tritium-markierteCholin auf und synthetisierten mit Hilfe der ChAT unter Verwendung von endogenemAcetyl-Coenzym A radioaktiv markiertes [³H]-ACh, das in den Vesikeln der Neuronegespeichert wurde.

2.2.3 Vorperfusion

Nach Abschluß der Inkubation wurden die radioaktiv markierten Schnitte mehrfachmit Gebrauchspuffer gespült und anschließend mit Hilfe einer Eppendorf-Pipette indie Superfusionskammern (siehe Abb. 3) eingelegt. Im Rahmen von Versuchen mitRattenhippocampus wurden die Kammern mit jeweils 2 Schnitten bestückt, währendbei Versuchen mit menschlichem Neokortex je nach Verfügbarkeit ein oder zweiSchnitte pro Kammer eingelegt wurden. Die Dauer der Vorperfusion war wiederumspeziesabhängig: 45 min bei Ratten-, 75 min bei menschlichem Gewebe.


Während der Vorperfusion wurden die Schnitte in den Superfusionskammern vonCarbogen-begastem Gebrauchspuffer mit einer Durchflußrate von 2 ml/5 min um-spült und so von extrazellulärem [³H]-Cholin befreit. Ab der Vorperfusion enthielt derGebrauchspuffer Hemicholinium-3 (10 µM), um durch Blockade des HACU die Wie-deraufnahme von einmal freigesetztem Tritium-Cholin in die Nervenzellen zu verhin-dern (Ausnahmen siehe „Ergebnisse“).

Abb. 3: Plexiglas-Superfusionskam
mer


2.2.4 Superfusion

Nach Abschluß der Vorperfusion wurde das Superfusat mit einem Fraktionssammler(ISCO-Retriever; ISCO, England) in Röhrchen (Vials; Packard, Groningen, Ndl.) ge-sammelt, wobei die einzelne Fraktionsdauer bei 5 min lag und die Flußgeschwindig-keit der Rollenquetschpumpe (Desaga, Heidelberg, Dtld.) wie schon in der Vorperfu-sion 2 ml/5 min betrug.

Abbildung 4 stellt den Aufbau der Superfusionsanlage schematisch dar:

Abb. 4: Schematische Darstellung der Versuchsan

1) Wasserbecken

2) Erlenmeyerkolben mit Superfusionsmedium (95%

3) 12 Superfusionskammern

4) Rollenquetschpumpe

5) Fraktionssammler mit Kunststoffvials als Samme

6) Stimulator

7) Oszilloskop

Während der Superfusion wurden die GewDepolarisation stimuliert. Bei der letzterentration des die Schnitte umspülenden Pufben, indem die Schläuche vom Gebrauc

10 Ω

+-

1)

2)

3)

6)

7)

4)

5)

1)

lage zur Superfus

O2/5% CO2 ges

lgefäße

ebeschnitte e Stimulationsafers von basahspuffer in de

Wasserbad 37°C

Wasserbad 37°C

ion von Hirnschnitten

ättigt)

lektrisch oder durch Kalium-rt wurde die Kalium-Konzen-l 3 mM auf 20 mM angeho-n Stimulationspuffer umge-


steckt wurden. Die Ionenstärke im Stimulationspuffer wurde durch Reduktion derNatrium-Konzentration konstant gehalten.Die elektrische Stimulation erfolgte mittels Platinelektroden, die in die Superfusions-kammern eingelassen sind (siehe Abb. 3) und mit einem Stimulator (Hugo Sachs,Hugstetten, Dtld.) in Verbindung stehen. Mit einem Oszilloskop (Hameg, Frankfurt/M,Dtld.) wurden die Rechteckimpulse überwacht. Die Reizfrequenz betrug 3 Hz, dieReizdauer 30 sec, so daß bei jeder Stimulation 90 Pulse mit einer Reizbreite von je-weils 2 ms abgegeben wurden. Die Spannung über den in Reihe geschalteten Kam-mern belief sich auf 140 V; die Stromstärke lag bei 68 mA pro Kammer.Anzahl, Art und Dauer der Stimulationen waren abhängig vom Gewebe und derFragestellung und werden im Kapitel „Ergebnisse“ im Einzelnen beschrieben. Die fol-genden Abbildungen 5 und 6 geben eine schematische Übersicht über die Versuchs-abläufe (RH= Rattenhippocampus; MC= menschlicher Neokortex):

Vorperfusion

S1

(Kalium od. elektrisch)
Inkubation mit [³H]-Cholin
Abb. 5: Superfusionsversuch mit zwei Stimulationen S1 (t1=15 min) und S2 (t2=60 min). Die Zugabe derTestsubstanz zum Superfusionspuffer erfolgte ab Vorperfusion. Bei den Kontrollen wurde auf dieZugabe der zu testenden Substanz verzichtet. Einzelheiten zu den durchgeführten Versuchen sieheim Kapitel „Ergebnisse“.

10 20 30 40 50 60 70 80 85 min40 min (MC) 75 min (MC)

Vorperfusion Kalium-Stimulation t=15 min t=75 min
Inkubation
mit [³H]-Cholin

Abb. 6: Superfusionsversuch mit einer 60-minütigen Kalium-Stimulatmin. Die Zugabe der Testsubstanz zum Superfusionspuffer erfolgte Stimulationsbeginn. Bei den Kontrollen wurde auf die Zugabe der zEinzelheiten zu den durchgeführten Versuchen siehe im Kapitel „Erg

Am Ende des Versuches wurden die Gewebeschnitte vherausgenommen und jeweils in ein Meßfläschchen (Pacführt, das 0.5 ml Soluene 350 enthielt. Dieses stark basieiner Stunde zur Auflösung der Schnitte. Sowohl die audas Superfusat in jedem Kunststoffvial wurden mit 10 bzcocktails (Ultima Gold XR) versetzt, so daß in einem Fl(Packard Tricarb 2100TR Szintillationszähler; Packard, GTritiumgehalt quantifiziert werden konnte.

30 min (RH)40 min (MC)

45 min (RH)75 min (MC)

10 20 30 40 50

S2

(Kalium od. elektrisch)

ion beginnend zum Zeitpunkt t=15entweder ab Vorperfusion oder abu testenden Substanz verzichtet.ebnisse“.

orsichtig aus den Kammernkard, Groningen, Ndl.) über-sche Agens führte innerhalbfgelösten Schnitte als auchw. 3 ml eines Szintillations-üssigkeitsszintillationszählerroningen, Ndl.) der jeweilige

60 70 80 90 100 min


2.2.5 Berechnung und Statistik

2.2.5.1 Zählausbeute für Schnitte und Superfusate

Der zur Quantifizierung des Tritium-Gehaltes der Superfusate und Schnitte einge-setzte Flüssigkeitsszintillationszähler zählte nur einen bestimmten Anteil der radio-aktiven Strahlung, so daß sowohl für die Superfusate als auch für die Schnitte dieZählausbeute (counting efficiency; C.E.) bestimmt werden mußte, um die tatsäch-lichen Zerfälle in jeder Probe zu erhalten.Für die Superfusate errechnete sich die Zählausbeute aus dem Quotienten dercounts per minute (cpm) eines Superfusat-Ultima-Gold-Standards mit [³H]-H2O be-kannter Aktivität minus dem Hintergrundrauschen (background; BG) des Superfusat-Ultima-Gold-Gemisches ohne Radioaktivität und den disintegrations per minute(dpm), d.h. den tatsächlichen Zerfällen des eingesetzten [³H]-H2O:

C.E. =

Für die Schnitte ergab sich die Zählausbeute aus dem Quotienten der cpm einesSchnitt-Soluene-350-Ultima-Gold-Standards nach Zugabe von [³H]-Toluol bekannterAktivität minus dem Background (BG) dieses Gemisches ohne Radioaktivität und dentatsächlichen Zerfällen (dpm) des [³H]-Toluols:

C.E. =

Mit den so ermitteltsächlichen Zerfälleindem die im Flüsentsprechende Zäh

2.2.5.2 Prozentu

Aufgrund der, vor lichen SchnittgrößeSchnitte mit [³H]-CProzent des Gesa

cpm (Superfusat-Standard + [³H]-H2O) – cpm (BG)

dpm ([³H]-H2O)

cpm (Schnitt-Standard + [³H]-Toluol) – cpm (BG)

en Zählausbeuten für Schnitte und Superfusate ließen sich die tat- (dpm) bzw. der absolute Tritium-Gehalt jeder Probe berechnen,sigkeitsszintillationszähler ermittelten cpm jeder Probe durch dielausbeute dividiert wurden.

ale Radioaktivitätsabgabe

allem bei Versuchen mit menschlichem Neokortex, unterschied- und der daraus resultierenden unterschiedlichen Beladung der

holin wurde der absolute Tritium-Gehalt jeder Superfusatprobe inmttritium-Gehaltes des entsprechenden Schnittes umgerechnet.

dpm ([³H]-Toluol)


Somit wurde ein Vergleich der Superfusatfraktionen zwischen verschiedenen Kam-mern bzw. Versuchen möglich. Diese prozentuale Radioaktivitätsabgabe (fractionalrate of [³H]-outflow) errechnete sich aus dem Quotienten des Tritium-Gehaltes einer5-min-Superfusatfraktion und dem Gesamttritium-Gehalt des Schnittes zu Beginndieser Fraktion.

2.2.5.3 Stimulationsbedingte Tritiumfreisetzung

Bei der Berechnung der stimulationsbedingten [³H]-ACh-Freisetzung in Versuchenmit zwei Stimulationen S1 und S2 wurde jeweils die Tritiumabgabe während derStimulationsfraktion und den drei darauffolgenden Fraktionen addiert (Stimulations-breite: 4 Fraktionen). Unter der Annahme einer linear abfallenden basalen Tritiumab-gabe während des Superfusionsversuches wurde dieser Basalwert von der stimula-tionsbedingt freigesetzten Tritiummenge abgezogen. Dabei errechnete sich derbasale Efflux als Mittelwert der Ausflußmengen der jeweiligen Fraktion direkt vor undnach den vier Stimulationsfraktionen. Der Quotient aus der so ermittelten Tritium-freisetzung und der zu Beginn der entsprechenden Stimulation im Schnitt enthal-tenen Tritiummenge lieferte die stimulationsbedingte Tritiumabgabe in Prozent undsomit den S1- bzw. S2-Wert. Durch die Bildung des S2/S1-Quotienten war es möglich,eine von Schnittgröße und Beladung unabhängige Größe zu erhalten, die eineQuantifizierung des Einflußes von Testsubstanzen auf die stimulationsbedingteTritiumabgabe erlaubte.Bei Versuchen mit einer 60-minütigen Kalium-Stimulation S ergab sich die Stimula-tionsbreite aus 12 Stimulationsfraktionen und den 3 darauffolgenden Fraktionen. ZurUntersuchung von Substanzeffekten wurden nach Abzug des basalen Efflux die je-weiligen S-Werte der Kammern – wiederum als stimulationsbedingte Tritiumabgabein Prozent bezogen auf den Gesamttritiumgehalt des Schnittes - verglichen.

2.2.5.4 Statistische Auswertung

Die Ergebnisse wurden als arithmetische Mittelwerte mit den zugehörigen 95%-Kon-fidenzintervallen (CI95) angegeben. Die Unterschiede zwischen den bei Einsatz derzu testenden Substanzen erhaltenen Mittelwerten und den entsprechenden Mittel-werten der Kontrollen wurden mit Hilfe der Einweg-Varianzanalyse ermittelt. Dabeiwies ein p-Wert unter 0.05 auf eine bestehende Signifikanz hin.Für Werte, die in Prozent der entsprechenden Kontrollwerte angegeben wurden,wurde das Fehlerfortpflanzungsgesetz berücksichtigt.


2.3 Bestimmung der ChAT-Aktivität

Die Versuche zur Bestimmung der Aktivität der ChAT bestanden aus einem modifi-zierten Superfusionsexperiment und dem sich daran anschließenden eigentlichenChAT-Assay.

2.3.1 Superfusion

Menschliches Neokortexgewebe wurde mit einem Mc-Illwain-Gewebeschneider inSchnitte von 0.35 mm Dicke zerteilt und nach Transfer in Gebrauchspuffer mit Hilfeeines Vortex getrennt. Anschließend wurden die Schnitte ohne radioaktive Mar-kierung sofort in die Superfusionskammern (2-3 Schnitte pro Kammer) überführt und30 min mit Gebrauchspuffer bei einer Flußrate von 2 ml/5 min vorperfundiert. ZumZeitpunkt t=0 min der eigentlichen Superfusion wurden die Schnitte in sechs derzwölf Superfusionskammern für 4 min mit einem 20 mM Kalium-Stimulationspufferdepolarisiert, während durch die übrigen sechs Kammern weiterhin Gebrauchspufferfloß (Flußrate: 2ml/5min). Während des Experimentes waren weder Testsubstanzennoch Hemicholinium-3 anwesend.Nach insgesamt 20-minütiger Superfusion wurden die Superfusionskammern ge-öffnet und die Schnitte in Eppendorf-Gefäße, die 500 µl eisgekühlten Homogenisa-tionspuffer (0.32 M Saccharose-Lösung gepuffert mit 2.5 mM HEPES; pH=7.4)enthielten, überführt. Bis zur Durchführung des ChAT-Assays wurden die Schnitte bei–80°C aufbewahrt.

Der Ablauf ist in Abb. 7 nochmals schematisch dargestellt:

Abb. 7: Schematische Darstellung deChAT-Aktivität. Zum Zeitpunkt t=0 mfür 4 min mit einem 20 mM Kalium-St

Präparation des Gewebes Vorperfusion

30 min 0 5 10 15 20 min

s Superfin wurdenimulation

Stimulation

usionsablaufes bei den Versuchen zur Bestimmung der die Schnitte in sechs der zwölf Superfusionskammern

spuffer depolarisiert.


2.3.2 ChAT-Assay

2.3.2.1 Durchführung

Die Durchführung des Assays erfolgte nach der Methode von Fonnum (1975) mitleichten Veränderungen nach Cassel et al. (1993) und Jackisch et al. (1995).Nach dem Auftauen wurden die Schnitte im Homogenisationspuffer per Ultraschall(Bachofer, Reutlingen, Dtld.) homogenisiert und je 100 µl des Rohhomogenates mit100 µl Inkubationsmedium versetzt. Das Inkubationsmedium setzte sich wie folgt zu-sammen:

Lösung A: 300 mM NaCl100 mM NaH2PO4 x H2O 1 mM EGTA

Lösung B: 20 mM Physostigmin-Sulfat

Lösung C: 5% Triton-X 100 in 10 mM EDTA-Lösung (pH=7.4)

Das Inkubationsmedium bestand aus 15 ml der Lösung A, 150 µl der Lösung B und1.5 ml der Lösung C.

Vom Rohhomogenat-Inkubationsmedium-Gemisch jeder Superfusionskammer wur-den anschließend je 10 µl („Assays“) auf 5 Eppendorf-Gefäße (3 Meßwerte und 2Eiswerte; s.u.) verteilt und mit 5 µl einer 32 mM Cholin-Bromid-Lösung versetzt. Da-nach begann der eigentliche Assay, indem im 20-Sekunden-Takt zu jedem Eppen-dorf-Röhrchen 5 µl eines [14C]-Acetyl-Coenzym A-Cocktails (0.8333 mM [14C]-Acetyl-Coenzym A [Aktivität: 60.0 Ci/mol], 2 mM Acetyl-Coenzym A, H2O bidest.) hinzupi-pettiert wurden. Die drei Meßwert-Eppendorf-Gefäße jeder Kammer wurden für 20min in einem 37°C warmen Heizblock (Unitek, HB-130 Block-Heizgerät, Luton, Eng-land) inkubiert, während die zwei Eiswert-Eppendorf-Gefäße für die entsprechendeZeitspanne auf Eis gehalten wurden. Während dieser Zeit synthetisierte die durchHomogenisation der Schnitte freigesetzte ChAT aus den vorhandenen Substraten[14C]-ACh und nicht radioaktiv markiertes ACh.Nach Ablauf der 20 Minuten wurden wiederum im 20-Sekunden-Takt die Spitzen derEppendorf-Gefäße mit einer Rasierklinge abgeschnitten und samt Inhalt jeweils in einMeßfläschchen überführt, das eine Mischung aus 5 ml 10 mM Natrium-Phosphat-Puffer (pH=7.4) und 2 ml Acetonitril-Kalignost-Lösung (500 mg Natrium-Tetraphenyl-borat (Kalignost) auf 100 ml Acetonitril) enthielt. Damit wurde die Synthese von AChbzw. [14C]-ACh gestoppt.Es folgte die Zugabe von 10 ml Toluolszintillationsflüssigkeit (Rotiszint) zu jeder Pro-be und nach gründlichem Schütteln ließ man die Proben mehrere Stunden zur Ex-traktion und Phasentrennung stehen. Der entstandene [14C]-ACh-Kalignost-Komplexlöste sich während dieser Zeit in der Toluol-Phase, während das nicht umgesetzte[14C]-Acetyl-Coenzym A in der wäßrigen Phase verblieb. In einem Flüssigkeits-

pH=7.4


szintillationszähler wurde schließlich der [14C]-Gehalt der [14C]-ACh-Kalignost-Toluol-Phase quantifiziert.Um die gebildete [14C]-ACh-Menge in nmol berechnen zu können, wurden zusätzlichfünf Standards mit je 5 µl des [14C]-Acetyl-Coenzym A-Cocktails und 10 ml Ultima-Gold XR-Szintillationscocktail gemessen.

2.3.2.2 Bestimmung des Proteingehaltes

20 µl des Rohhomogenates der Schnitte jeder Kammer wurden mit 180 µl 0.1 MNaOH gemischt und der Proteingehalt von jeweils drei Proben nach der Methode vonLowry et al. (1951) bestimmt.In einer Mikrotiterplatte wurden 25 µl Probe mit 250 µl Lowry-D-Lösung folgender Zu-sammensetzung versetzt:

Lowry A: 0.188 mM Na2CO3 in 0.1 N NaOH-Lösung

Lowry B: 2% Kalium-Natrium-Tartrat-Lösung

Lowry C: 1% CuSO4 x 5H2O-Lösung

Lowry D ist die gebrauchsfertige Mischung aus 100 Teilen Lowry A und jeweils einemTeil Lowry B und Lowry C.

Nach 15 Minuten erfolgte die Zugabe von 25 µl Folin-Ciocalteus-Phenolreagens (1:1mit H2O bidest. verdünnt) und nach weiteren 30 Minuten wurde in einem DynatechMRX Microplate Reader (Dynex Technologies, Guernsey, England) bei einer Wellen-länge von 750 nm die Extinktion der entstandenen Kupferkomplexe bestimmt. Mittelseiner Eichkurve mit Standardverdünnungen von bovinem Serumalbumin (0.625µg/25 µl bis 6.25 µg/25µl) und unter Berücksichtigung der bei der ChAT-Messungund Proteinbestimmung eingesetzten Verdünnungen und Volumina konnte die durch-schnittliche Proteinmenge (mg Protein) der Assays jeder Kammer ermittelt werden.

2.3.2.3 Berechnung der spezifischen ChAT-Aktivität

Die spezifische ChAT-Aktivität (nmol/mg Protein/min) des Rohhomogenates jederSuperfusionskammer errechnete sich aus der Differenz der gebildeten [14C]-ACh-Menge der Assays bei 37°C und auf Eis (nmol) dividiert durch den Proteingehalt derAssays (mg Protein) und die Dauer der ChAT-Messung (20 min).Die statistische Auswertung erfolgte wie in Kapitel 2.2.5.4 beschrieben.

Ergebnisse 27

3 Ergebnisse

3.1 Superfusionsexperimente mit Aß1-28

Wie in der Einleitung dieser Dissertation schon erwähnt, ist Aß ein wesentliches Kor-relat des M. Alzheimers. Die Ergebnisse der durchgeführten Superfusionsexperimen-te mit Aß1-28, einem synthetisch hergestellten Abkömmling des charakteristischenAlzheimer-Proteins mit dessen 28 N-terminalen Aminosäuren, sind nachfolgend de-tailliert dargestellt.

3.1.1 Einfluß von Aß1-28 auf die Kalium-evozierte [³H]-ACh-Freisetzung

Kar et al. demonstrierten 1996 die hemmenden Eigenschaften von Aß1-28 auf die Ka-lium-evozierte ACh-Freisetzung im Rattenhippocampus. Im Rattenhippocampus bzw.im menschlichen Neokortex wurde dieser Zusammenhang unter Variation diverserParameter genauer untersucht.

3.1.1.1 Anwesenheit des Aß1-28 (0.1 nM) ab Stimulationsbeginn

Um für die geplanten Experimente ein geeignetes Modell zu finden, wurden in einemorientierenden Versuch (niedrige n-Zahlen) Hippocampusschnitte der Ratte mit Aß1-28

(0.1 nM) ab Stimulationsbeginn bis zum Versuchsende superfundiert. Die Schnittewurden, wie bei sämtlichen Versuchen mit Aß1-28, ab dem Zeitpunkt t=15 min derSuperfusion mit 20 mM Kalium-Stimulationspuffer für 60 Minuten depolarisiert.

Abb. 8: Einfluß von Aß1-28 (0.1setzung im RattenhippocampuHemicholinium-3.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

S n

orm

3 n=3

CI95

n=

nM) ab Stimulationsbeginn auf die Kalium-evozierte [³H]-ACh-Frei-s. Ab der Vorperfusion enthielt das Superfusionsmedium 10 µM

Kontrolle Aß1-28 (0.1 nM)

Ergebnisse 28

Der genormte S-Wert der Kontrollen lag bei 1.00 [0.68; 1.32], unter Aß1-28 (0.1 nM)betrug dieser Wert 0.90 [0.64; 1.15] (p>0.05).Somit hatte die Gabe von Aß1-28 ab Stimulationsbeginn keine signifikante Wirkungauf die Kalium-evozierte [³H]-ACh-Freisetzung im Hippocampus der Ratte.

3.1.1.2 Anwesenheit des Aß1-28 (0.1 nM) ab Inkubation

Im nächsten Schritt wurde Aß1-28 bereits bei der Inkubation der Schnitte mit [³H]-Cho-lin zugesetzt. Auf die Zugabe des Cholin-Wiederaufnahmehemmers Hemicholinium-3wurde verzichtet, da ferner ein möglicher Effekt des Aß1-28 auf die Beladung der Hirn-schnitte mit [³H]-Cholin untersucht werden sollte (Ergebnisse siehe 3.1.2).

= RH = MC

Abb. 9: Einfluß von Aß1-28 (0.1 nM) ab Inkubation auf die KaliuRattenhippocampus (RH) und menschlichen Neokortex (MC). setzt. Die Gewebeschnitte wurden ab dem Zeitpunkt t=15 min Stimulationspuffer für 60 min depolarisiert.

Im Rattenhippocampus betrug der genormte S-Wert din Gegenwart von Aß1-28 (0.1 nM) 0.89 [0.83; 0.96] signifikanten Abnahme der [³H]-ACh-Freisetzung um eIm menschlichen Neokortex lag der genormte S-Wer1.09], unter Aß1-28 (0.1 nM) bei 0.87 [0.73; 1.02] (p>0nahm im letzteren Fall nicht signifikant um 13 Prozent Anhand dieses Modells wurde anschließend untersKonzentration und Einwirkdauer des Aß1-28 sowie desinkubation verwendeten Natrium-Phosphat-Puffers ACh-Freisetzung auswirken.

Kontrolle Aß1-28 K(0.1 nM)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

S n

orm

CI95

n=27 n=17 n=10
n=32
m-evozierte [³H]-ACh-Freisetzung imHemicholinium-3 wurde nicht einge-der Superfusion mit 20 mM Kalium-

er Kontrollen 1.00 [0.96; 1.04],(p<0.05). Dies entsprach einerlf Prozent.t der Kontrollen bei 1.00 [0.91;.05). Die [³H]-ACh-Freisetzungab.ucht, wie sich Variationen der pH-Wertes des zur Aß1-28-Vor-auf die Kalium-evozierte [³H]-

ontrolle Aß1-28

(0.1 nM)

Ergebnisse 29

3.1.1.3 Einfluß der Aß1-28-Konzentration auf seine Wirkung

Im Folgenden wurde Aß1-28 in einer Konzentration von 1 nM eingesetzt, um konzen-trationsabhängige Effekte zu untersuchen.

= RH= MC

Abb. 10: Einfluß von AACh-Freisetzung im Rtration. Hemicholiniummin der Superfusion m

Der genormte S-Wbei Einsatz von AßBei den Versuchen1.00 [0.91; 1.09], uSomit führte der Etenhippocampus nder Kalium-evozier

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

S n

orm

CI95

n=20
n=27
ß1-28 ab Inkubation attenhippocampus (R-3 wurde nicht eingeit 20 mM Kalium-Stim

ert der Kontrollen

1-28 (1 nM) 0.99 [0 im menschlichennter Aß1-28 (1 nM)insatz von Aß1-28

och im menschlicten [³H]-ACh-Frei

n=6

der Schnitte mit [³H]-H) und menschliche

setzt. Die Gewebesculationspuffer für 60

betrug im Ratten.68; 1.30] (p>0.05 Neokortex lag di bei 0.91 [0.77; 1. in einer Konzenthen Neokortex z

setzung.

n=32

)
Kontrolle Aß1-28 Kontrolle Aß1-28
(1 nM) (1 nM

Cholin auf die Kalium-evozierte [³H]-n Neokortex (MC) in 1 nM Konzen-

hnitte wurden ab dem Zeitpunkt t=15min depolarisiert.

hippocampus 1.00 [0.96; 1.04],).eser Wert für die Kontrollen bei04] (p>0.05).ration von 1 nM weder im Rat-u einer signifikanten Abnahme

Ergebnisse 30

3.1.1.4 Einfluß einer verlängerten Einwirkdauer des Aß1-28

Das Augenmerk galt einem möglichen Zusammenhang zwischen der Einwirkdauerdes Aß1-28 und dem Ausmaß der Hemmung der [³H]-ACh-Freisetzung. Dazu wurdebei 0°C den Gewebeschnitten Aß1-28 (0.1 nM) bereits 230 Minuten vor Beginn der In-kubation mit [³H]-Cholin zugesetzt. Anschließend wurde das Experiment wie obenbeschrieben durchgeführt.

= RH = MC

Abb. 11: Einfluß von Aßschnitten der Ratte (RHlinium-3 wurde nicht einsion mit 20 mM Kalium-S

Bei Zusatz von Aß1-

trug im Rattenhippolen 1.00 [0.77; 1.23]Die entsprechenden[0.45; 1.27] bzw. 1.0Die [³H]-ACh-Freiseder Ratte und um 14

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

S n

orm

CI95

K 23

n=6

1-28 (0.1 nM) auf die Kalium-evozierte [³H]-ACh-Freisetzung ) und menschlichem Neokortex (MC) bei verlängerter Einwirkgesetzt. Die Gewebeschnitte wurden ab dem Zeitpunkt t=15 timulationspuffer für 60 min depolarisiert.

28 (0.1 nM) 230 min vor Beginn der Inkubation mit [campus der genormte S-Wert 0.79 [0.63; 0.95], de (p>0.05). Werte für das menschliche Neokortexgewebe la0 [0.76; 1.24] (p>0.05).tzung war somit nicht signifikant um 21 Prozent im Prozent im Neokortex des Menschen verringert.

ontrolle Aß1-28 (0.1 nM) Kontrolle Aß1

0` bei 0°C 230` vor Inkubation 230` bei 0°C 230` vo

n=6
n=5 n=5
in Hippocampus-dauer. Hemicho-min der Superfu-

³H]-Cholin be-r der Kontrol-

gen bei 0.86

Hippocampus

-28 (0.1 nM)r Inkubation

Ergebnisse 31

3.1.1.5 Einfluß des zur Aß1-28-Vorinkubation verwendeten pH-Wertes

Der Konformationszustand des Aß1-28 ist vom pH-Wert des Mediums abhängig. Diefür die Plaques beim M. Alzheimer charakteristische ß-Faltblatt-Konformation liegt impH-Bereich von 4 bis 7 vor. Durch die 24-stündige Vorinkubation des Aß1-28 beieinem pH-Wert von 6, statt wie in den anderen Versuchen von 7.4, sollte der Anteilder ß-Faltblätter erhöht werden. Anschließend wurde der Effekt des Aß1-28 in der Alz-heimer-typischen Konformation auf die [³H]-ACh-Freisetzung im Rattenhippocampusuntersucht.

Abb. 12: Einfluß des bei pH=6 vorinum-evozierte [³H]-ACh-Freisetzungeingesetzt. Die Gewebeschnitte wKalium-Stimulationspuffer für 60 m

Der genormte S-Wert der Kvorinkubierten Aß1-28 (0.1 nMACh-Freisetzung im Rattenhi

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

S n

orm

CI95

n=27

kubierten Aß1-28 (0.1 nM) ab Inkubation mit [³H in Hippocampusschnitten der Ratte. Hemichurden ab dem Zeitpunkt t=15 min der Sup

in depolarisiert.

ontrollen betrug 1.00 [0.96; 1.04], unt) lag dieser Wert bei 0.87 [0.76; 0.99] (ppocampus nahm signifikant um 13 Pr

Kontrolle Aß1-28

pH=6

n=6

]-Cholin auf die Kali-olinium-3 wurde nichterfusion mit 20 mM

er dem bei pH=6p<0.05). Die [³H]-ozent ab.

(0.1 nM) bei vorinkubiert

Ergebnisse 32

3.1.2 Einfluß von Aß1-28 auf die [³H]-Cholin-Beladung

Von Interesse waren neben der Wirkung auf die [³H]-ACh-Freisetzung auch Effektedes Aß1-28 auf die radioaktive Beladung der Gewebeschnitte mit [³H]-Cholin, da einEinfluß von Aß auf den ACh-Gehalt von Nervenzellen [Ehrenstein et al., 1997] bzw.eine Hemmung des HACU der cholinergen Terminalen beschrieben wurden [Kar etal., 1998].

3.1.2.1 Anwesenheit des Aß1-28 (0.1 nM) ab Inkubation

Nach Beendigung der Superfusion wurde der Tritium-Gehalt der Schnitte bestimmtund die Wirkung des Aß1-28 bei Gabe ab Inkubation auf die Beladung der Schnitteanalysiert.

= RH = MC

Abb. 13: Einfluß von Aß1

Hippocampusschnitten dwurde nicht eingesetzt.

Der genormte Wert bei 1.00 [0.95; 1.05], Dies entsprach einer Im menschlichen Neo[0.97; 1.03], der mit Aführte Aß1-28 (0.1 nMVeränderung der SchUm einen möglichender [³H]-ACh-Freiset

1.4

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Sch

nitt

bela

dung n

orm

CI95

n=32 n=10
n=27
-28 (0.1 nM) ab Inker Ratte (RH) und m

der Beladung dein Gegenwart vosignifikanten Zukortex betrug diß1-28 superfund

) bei Gabe ab Innittbeladung. Zusammenhangzung und dem

n=17

)
(0.1 nM) (0.1 nM

ubation mit [³H]-Cholin auf die radioaktive Beladung vonenschlichen Neokortexschnitten (MC). Hemicholinium-3

r Hippocampusschnitte lag bei den Kontrollenn Aß1-28 (0.1 nM) bei 1.18 [1.11; 1.25] (p<0.05).

nahme der Schnittbeladung um 18 Prozent.e genormte Schnittbeladung der Kontrollen 1.00ierten Schnitte 1.02 [0.93; 1.11] (p>0.05). Somitkubation im menschlichen Neokortex zu keiner

zwischen der in 3.1.1.2 erwähnten HemmungAnstieg der Schnittbeladung zu untersuchen,

Ergebnisse 33

wurde exemplarisch für den eben angeführten Versuch im Rattenhippocampus diegenormte Beladung der Schnitte zu Beginn der Depolarisation statistisch ausgewer-tet. Sie belief sich bei den Kontrollen auf 1.00 [0.96; 1.04], unter Aß1-28 (0.1 nM) auf1.17 [1.10; 1.24] (p<0.05). Somit bestand schon zu Beginn der Depolarisation einsignifikanter Unterschied hinsichtlich der Schnittbeladung zugunsten der mit Aß1-28

behandelten Rattenhippocampusschnitte.

3.1.2.2 Einfluß der Aß1-28-Konzentration auf die Schnittbeladung

Ferner wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen der Aß1-28-Konzentration undder radioaktiven Beladung der Rattenhippocampus- und menschlichen Neokortex-schnitte untersucht.

= RH = MC

Abb. 14: Einfluß von 1 nM Aß1-28 ab Inkubation mit [³H]-Cholin auf die Schnittbeladung von Rattenhip-pocampus (RH) und menschlichem Neokortex (MC). Hemicholinium-3 wurde nicht eingesetzt.

Im Rattenhippocampus lag die genormte Schnittbeladung bei den Kontrollen bei 1.00[0.95; 1.05]. Unter Aß1-28 (1 nM) lag dieser Wert bei 0.95 [0.65; 1.25] (p>0.05), sodaß Aß1-28 die Beladung der Schnitte nicht beeinflußte.Die entsprechenden Werte im menschlichen Neokortex betrugen für die Kontrollen1.00 [0.97; 1.03], für Aß1-28 (1 nM) 1.11 [1.05; 1.17] (p<0.05). Dies entsprach einersignifikanten Zunahme der Beladung um 11 Prozent.

0

1.4

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Sch

nitt

bela

dung n

orm

CI95

n=27 n=6 n=32 n=20


(1 nM) (1 nM)

Ergebnisse 34

3.1.2.3 Einfluß einer verlängerten Einwirkdauer des Aß1-28

Um den Einfluß der Einwirkdauer von Aß1-28 auf die Beladung der Gewebeschnittemit [³H]-Cholin zu bewerten, wurde Aß1-28 (0.1 nM) den Gewebeschnitten bei 0°C be-reits 230 Minuten vor Beginn der Inkubation der Schnitte mit [³H]-Cholin zugesetzt.

= RH = MC

Abb. 15: Einfluß einer verpusschnitten der Ratte (Rde nicht eingesetzt.

Bei Gabe des Aß1-28 Cholin betrug im Ra[0.89; 1.11], die der mentsprach einer nicht Die genormte Beladu1.08] bei den Kontro(p>0.05). Aß1-28 230 nahme der Beladung

K 230

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Sch

nitt

bela

dung n

orm

n=6

CI95

n=6

längerten EinwirkdaH) und Schnitten d

(0.1 nM) 230 Mttenhippocampuit Aß1-28 behand

signifikanten Zunng der menschllen auf 1.10 [

min vor Inkubatum 10 Prozent.

ontrolle Aß1

` bei 0°C 230` v

n=5

uer des Aß1-28 (0.1 nes menschlichen Ne

inuten vor der Ins die genormte Belten Schnitte 1ahme der Belad

lichen Neokortex0.97; 1.24] in Gion sorgte somit

-28 (0.1 nM) Kor Inkubation 230

n=5

M) auf die Beladung von Hippocam-okortex (MC). Hemicholinium-3 wur-

kubation der Schnitte mit [³H]-eladung der Kontrollen 1.00

.12 [0.95; 1.29] (p>0.05). Diesung um 12 Prozent.schnitte stieg von 1.00 [0.92;egenwart von 0.1 nM Aß1-28

für eine nicht signifikante Zu-

ontrolle Aß1-28 (0.1 nM)` bei 0°C 230` vor Inkubation

Ergebnisse 35

3.1.2.4 Einfluß des zur Aß1-28-Vorinkubation verwendeten pH-Wertes

Außerdem wurde die Wirkung von Aß1-28 in der Alzheimer-typischen ß-Faltblatt-Kon-formation auf die radioaktive Beladung von Rattenhippocampusschnitten untersucht.Um die gewünschte Struktur des Aß1-28 zu erhalten, wurde Aß1-28 bei einem pH-Wertvon 6 vorinkubiert.

Abb. 16: Einfluß von bei pH=6 voricampusschnitten der Ratte. Hemic

Die genormte Beladung der H1.00 [0.95; 1.05] und für die fundierten Schnitte 1.16 [0.9um 16 Prozent zu.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Sch

nitt

bela

dung n

orm

CI95

n=27

nkubiertem Aß1-28 (0.1 nM) auf die [³H]-Cholinholinium-3 wurde nicht eingesetzt.

ippocampusschnitte der Ratte betrugmit dem bei pH=6 vorinkubierten Aß1

7; 1.35] (p<0.05). Somit nahm die Be

Kontrolle Aß1-2

pH=6

n=6

-Beladung von Hippo-

für die Kontrollen

-28 (0.1 nM) super-ladung signifikant

8 (0.1 nM) bei vorinkubiert

Ergebnisse 36

3.2 Experimente zur depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung

Mit den folgenden Experimenten im menschlichen Neokortexgewebe wurde die Hy-pothese der depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung überprüft. Nach ihr führteine langdauernde Kalium-Depolarisation zur Aktivierung der ChAT in den choliner-gen Nervenzellen.Zum Einsatz kamen der indirekte ChAT-Inhibitor Okadasäure [Issa et al., 1996] undder direkte ChAT-Inhibitor Br-ACh [Roskoski, 1974]. Zusätzlich wurde mittels einesChAT-Assays auch die Aktivität der ChAT untersucht.

3.2.1 Superfusionsversuche mit ChAT-Inhibitoren

Durch die Gabe spezifischer Inhibitoren sollte die Aktivierung der ChAT durch dieerste Stimulation S1 und die konsekutive Verdünnung des [³H]-ACh-Pools der choli-nergen Neurone vor der zweiten Stimulation S2 durch neusynthetisiertes, nicht-ra-dioaktiv markiertes ACh verhindert werden. Als Resultat wurde ein erhöhter S2/S1-Quotient der Kalium-evozierten [³H]-ACh-Freisetzung erwartet.

3.2.1.1 Gabe von Okadasäure (50 nM) bei Kalium-Stimulation

Zur Hemmung der ChAT wurde der indirekte ChAT-Inhibitor Okadasäure (50 nM) abder Vorperfusion eingesetzt. Die menschlichen Neokortexschnitte wurden zum Zeit-punkt t1=15 min (S1) und t2=60 min (S2) der Superfusion mit 20 mM Kalium-Stimula-tionspuffer für jeweils 4 min depolarisiert.

Abb. 17: Effekt von Okadasäure (50 nM) ab Vorperfusion auf die Kalium-esetzung im menschlichen Neokortex. Hemicholinium-3 (10 µM) war ab der Vorp

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

S2/

S1-Q

uotie

nt

CI95

Kontrolle Okada

n=6
n=11
vozierte [³H]-ACh-Frei-erfusion anwesend.

säure (50 nM)

Ergebnisse 37

Der S2/S1-Quotient der Kontrollen lag bei 0.49 [0.35; 0.62], mit Okadasäure (50 nM)betrug dieser Wert 0.79 [0.53; 1.06] (p<0.05). Durch Okadasäure (50 nM) wurde derS2/S1-Quotient der Kalium-evozierten [³H]-ACh-Freisetzung im menschlichen Neo-kortex signifikant um 61 Prozent gesteigert.Die bei S1 freigesetzte Tritiummenge (in Prozent bezogen auf den Gesamttritiumge-halt der Schnitte zu Beginn der Stimulation) der ab der Vorperfusion mit Okadasäuresuperfundierten Kammern betrug 0.29 [0.16; 0.42], der entsprechende Wert derKontrollkammern 0.38 [0.19; 0.57] (p>0.05).

3.2.1.2 Gabe von Okadasäure (50 nM) bei elektrischer Stimulation

Nach der Hypothese der depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung ist bei einerkurzen elektrischen Stimulation keine Aktivierung der ChAT zu erwarten. Somit sollteder S2/S1-Quotient der Kontrollen im Bereich von eins liegen und durch die Anwesen-heit eines ChAT-Inhibitors nicht wesentlich verändert werden. Zur Überprüfung die-ses Sachverhaltes wurde der unter 3.2.1.1 beschriebene Versuch unter elektrischenStimulationsbedingungen (3Hz, 90 Pulse, 2 ms, 68 mA) durchgeführt.

Abb. 18: Einfluß von Okadasäure setzung im menschlichen Neokorte

Der S2/S1-Quotient der Kont1.26] nur unwesentlich von dmern, deren Wert sich auf 1.sich der S2/S1-Quotient der setzung im menschlichen Netor Okadasäure (50 nM) bee[³H]-ACh-Freisetzung nicht.

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

S2/

S1-Q

uotie

nt

CI95

60

n=6

(50 nM) ab Vorperfusion auf die elektrisch x. Hemicholinium-3 (10 µM) war ab der Vor

rollen unterschied sich mit einem Wem der mit Okadasäure (50 nM) su

08 [0.96; 1.20] belief (p>0.05). ErwarKontrollen bei der elektrisch evozieokortex im Bereich von eins. Der indinflußte den S2/S1-Quotienten der e

Kontrolle Okada

n=

evozierte [³H]-ACh-Frei-perfusion anwesend.

ert von 1.09 [0.92;perfundierten Kam-tungsgemäß befandrten [³H]-ACh-Frei-irekte ChAT-Inhibi-

lektrisch evozierten

säure (50 nM)

Ergebnisse 38

3.2.1.3 Gabe von Br-ACh (30 µM) bei Kalium-Stimulation

Der direkte ChAT-Inhibitor Br-ACh (30 µM) wurde ab der Vorperfusion zugesetzt unddie menschlichen Neokortexschnitte zum Zeitpunkt t1=15 min (S1) und t2=60 min (S2)der Superfusion mit 20 mM Kalium-Stimulationspuffer für jeweils 4 min depolarisiert.In den Superfusionspuffern war ab der Vorperfusion Physostigmin (10 µM) anwe-send, um durch Inhibition der AChE die Spaltung von Br-ACh und des freigesetzten[³H]-ACh zu verhindern.

Abb. 19: Effekt von Br-ACh (30 µM) auf die Kalium-evozierte [³H]-ACh-FreisetzNeokortex bei Gabe ab Vorperfusion. Anstelle von Hemicholinium-3 war ab destigmin (10 µM) anwesend.

Bei den Kontrollen betrug der S2/S1-Quotient 0.41 [0.12; 0.70], b(30 µM) superfundierten Schnitten 0.73 [0.54; 0.91] (p<0.05). Der Kalium-evozierten [³H]-ACh-Freisetzung im menschlichen NeokorGegenwart von Br-ACh (30 µM) signifikant um 78 Prozent zu.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

S2/

S1-Q

uotie

nt

CI95

Kontrolle Br-A

n=9
n=7
ung im menschlichenr Vorperfusion Physo-

ei den mit Br-AChS2/S1-Quotient dertex nahm somit in

Ch (30 µM)

Ergebnisse 39

3.2.2 Messung der ChAT-Aktivität

Nachdem es mit Hilfe eines direkten und indirekten ChAT-Inhibitors im Superfusions-experiment gelang, den S2/S1-Quotienten der Kalium-evozierten [³H]-ACh-Frei-setzung im menschlichen Neokortex zu erhöhen und somit die depolarisationsabhän-gige Aktivierung der ChAT indirekt zu belegen, wurde zusätzlich eine direkte Bestim-mung der ChAT-Aktivität durchgeführt.Superfundierte menschliche Neokortexschnitte wurden zum Zeitpunkt t=0 min mit 20mM Kalium-Stimulationspuffer für 4 min depolarisiert und nach insgesamt 20-minüti-ger Superfusion in 500 µl eisgekühlten Homogenisationspuffer (pH=7.4) überführt.Anschließend wurde die ChAT-Aktivität (nmol/mg Protein/min) im Homogenat mittelsChAT-Assay bestimmt.

Abb. 20: Einfluß einer Kalium-StiNeokortex.

Die genormte ChAT-Aktivitä[1.04; 1.95] bei den für 4 miChAT-Aktivität im menschlicsignifikant um 49 Prozent zu

0

0.5

1.0

1.5

2.0

g

en

orm

te C

hA

T-A

ktiv

ität

CI95

n=12

mulation (20 mM, 4 min) auf die ChAT-A

t betrug 1.00 [0.74; 1.26] bei den n mit 20 mM Kalium stimulierten Schen Neokortex nahm infolge der K.

Kontrolle Kali

n=9

ktivität im menschlichen

Kontrollen und 1.49hnitten (p<0.05). Diealium-Depolarisation

um-Stimulation

Diskussion 40

4 Diskussion

4.1 Wirkung von Aß1-28 auf die [³H]-ACh-Freisetzung

Nachdem in den vergangenen Jahren die Zusammenhänge sowohl zwischen Merk-fähigkeit und dem cholinergen System [Bigl et Arendt, 1991] als auch zwischenGedächtnisstörungen und Aß [Giovanelli et al., 1995] offensichtlich wurden, galt einSchwerpunkt dieser Arbeit einer möglichen Wirkung von Aß auf die [³H]-ACh-Frei-setzung in Hippocampusschnitten der Ratte und menschlichem Neokortexgewebe.Dabei kam mit Aß1-28 ein synthetisches Derivat zum Einsatz, das aus den Amino-säuren 1 bis 28 des in vivo in den Alzheimer-Plaques nachweisbaren Aß besteht.Aß1-28 bildet in vitro trotz des fehlenden C-Terminus Fibrillen, deren Struktur den Aß-Fibrillen in vivo entspricht [Kirschner et al., 1987], und nimmt zwischen den pH-Werten 4 und 7 die für die unlöslichen Alzheimer-Fibrillen typische oligomere ß-Falt-blatt-Struktur an [Zagorski et Barrow, 1992]. Ferner ist Aß1-28 ein potenter Inhibitorder ACh-Freisetzung in Hippocampusschnitten der Ratte [Kar et al., 1996].Letzterer Sachverhalt konnte bei Versuchen im Rattenhippocampus auf die Kalium(20 mM, 60 min)-evozierte [³H]-ACh-Freisetzung übertragen werden, wobei Aß1-28

(0.1 nM) ab der Inkubation der Gewebeschnitte mit [³H]-Cholin verabreicht wurde. InVersuchen im menschlichen Neokortex wurde ein entsprechender Effekt beobachtet,der jedoch nicht signifikant war. Allerdings gelang es weder im Hippocampus derRatte noch im Neokortex des Menschen, durch eine Erhöhung der Aß1-28-Konzen-tration auf 1 nM die Inhibition zu verstärken, wie es bei Kar et al. (1996) möglich war.Nach Ausschluß technischer oder methodischer Mängel bleibt die Ursache dieserBeobachtung letztlich unklar. Vielleicht kam es zu einer Zerlegung des Aß1-28 durchaus den Gewebeschnitten freigesetzte, unspezifische Peptidasen in kleinere Bruch-stücke. Meßbare Effekte des Aß1-28 wären in diesem Fall aber dennoch denkbar, danur die Aminosäuren 25-28 des Aß für die hemmende Wirkung auf die ACh-Frei-setzung entscheidend sind [Auld et al., 1998]. Vor dem Hintergrund, daß einePeptidasenwirkung für sämtliche Versuche mit Aß1-28 in Anbetracht gezogen werdenkann, bleibt die Frage unbeantwortet, warum ausgerechnet bei der 10-fach höherenAß1-28-Konzentration keine wirksamen Bruchstücke entstanden. Bei der Beurteilungdieser Ergebnisse ist ferner einschränkend zu bemerken, daß insbesondere bei denVersuchen am Rattenhippocampus eine deutliche Differenz hinsichtlich der in dieStatistik einbezogenen Versuche (Kontrollen vs. Aß1-28-superfundierte Kammern)besteht, so daß eine definitive statistische Aussage allenfalls bedingt möglich ist.Außerdem wurde der Einfluß einer verlängerten Einwirkdauer von Aß1-28 untersucht.Durch Aß1-28-Gabe bereits 230 Minuten vor der Inkubation konnte sowohl im Ratten-hippocampus als auch im menschlichen Neokortex eine verstärkte Hemmung der[³H]-ACh-Freisetzung erzielt werden, die jedoch in beiden Fällen wiederum nicht sig-nifikant war und aufgrund der geringen Versuchszahlen nur eine limitierte Aussage-kraft besitzt. Kar et al. (1996) zeigten, daß im Rattenhippocampus bei einer 60-minütigen Kalium-Stimulation mit Gabe des Aß1-28 ab Stimulation das Ausmaß derHemmung der ACh-Freisetzung in den letzten 20 Minuten der Stimulation am aus-

Diskussion 41

geprägtesten ist. Es ist davon auszugehen, daß sowohl der bei Kar et al. als auch beidiesen Experimenten zumindest tendentiell beobachtete Zusammenhang zwischenEinwirkdauer und dem Ausmaß der Hemmung durch die langsame Penetration desAß1-28 in das Hippocampus- bzw. Kortexgewebe bedingt war.

Die inhibitorische Wirkung des Aß1-28 auf die cholinerge Transmission beruht nichtauf dessen Neurotoxizität [Auld et al., 1998]. So ist zum Beispiel die Reduktion desACh-Gehaltes septaler Neurone von Mäusen nicht von einem Neuronenuntergangbegleitet [Pedersen et Blusztajn, 1997], und Aß1-28 hemmt die [³H]-ACh-Freisetzung,obgleich die für die Neurotoxizität verantwortlichen Aminosäuren 29 bis 35 [Pike etal., 1993] fehlen. Ferner bilden Zellen während des normalen Metabolismus löslichesAß [Haass et al., 1992], so daß nicht von einer primär neurotoxischen Wirkung desAß ausgegangen werden kann. Anscheinend besitzt Aß neben seinen in der„Amyloid Cascade Hypothesis“ beschriebenen neurotoxischen Eigenschaften auchdie Fähigkeit zur Neuromodulation.Hinsichtlich des Mechanismus der Neuromodulation gibt es mehrere Alternativen:Aß1-40 erhöht die Cholinleitfähigkeit von Phäochromocytom-Klonen, woraus ein Ver-lust des intrazellulären Cholins resultiert [Galdzicki et al., 1994]. Aß-Moleküle unter-schiedlicher Länge hemmen den HACU cholinerger Terminalen [Kar et al., 1998].Somit kann die Inhibition der cholinergen Transmission durch einen akuten Mangelan Cholin für die ACh-Synthese verursacht werden. Bezüglich der Wirkung von Aßauf die ChAT-Aktivität existieren widersprüchliche Ergebnisse. Während Kar et al.(1998) keinen Effekt von Aß1-28 auf die ChAT im Rattenhippocampus nachweisenkonnten, beobachteten Pedersen et al. (1996) eine Verringerung der ChAT-Aktivität,die mit der Abnahme des ACh-Gehaltes in basalen Vorderhirnzellen von Mäuseneinherging. Eine solche Hemmung des ACh-synthetisierenden Enzyms wäre einweiterer potentieller Mechanismus, über den Aß1-28 neuromodulatorisch wirkt. Außer-dem bewirkt Aß1-42 in septalen Kulturen der Ratte neben der Reduktion des ACh-Gehaltes auch eine Aktivitätsminderung der Pyruvat-Dehydrogenase [Hoshi et al.,1997]. Dieses Enzym katalysiert die Bildung von Acetyl-Coenzym A aus Pyruvat, sodaß dessen Hemmung durch Aß die Synthese von ACh aufgrund der mangelndenVerfügbarkeit von Acetyl-Coenzym A behindern könnte.Über welche Strukturen das extrazellulär lokalisierte Aß auf die umgebenden Zellenneuromodulatorisch wirkt, ist bis heute unklar. Denkbar ist die direkte Interaktion mittransmembranär lokalisierten Enzymen (z.B. HACU); ebenfalls diskutiert wird dieBindung des Aß an den „Receptor for advanced glycosylation end products“ (RAGE),der auf kortikalen Neuronen lokalisiert ist [Yan et al., 1996]. Da Aß mit seinem mem-branassoziierten Vorläufer interagiert [Strittmatter et al., 1993] und ß-APP funktio-nelle Eigenschaften eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors besitzt [Okamoto et al.,1995], scheint eine Vermittlung neuromodulatorischer Aß-Effekte auf diesem Wegebenfalls möglich. Etcheberrygaray et al. (1993) demonstrierten den Einfluß von Aßauf Kalium-Kanäle. Diese Kanäle sind bei der Regulation der Zellfunktionen vongroßer Bedeutung, so daß Aß seine neuromodulatorischen Effekte auch über dieModulation von Kalium-Kanälen ausüben könnte.

Diskussion 42

Einige der genannten Mechanismen und Strukturen dienen eventuell nicht (nur) derVermittlung neuromodulatorischer, sondern auch neurotoxischer Wirkungen von Aß.Bedeutend ist in diesem Zusammenhang, daß die potentiell neuromodulatorischenEigenschaften des Aß bereits bei pico- und nanomolaren Konzentrationen auftreten,während die neurotoxischen Wirkungen millimolarer Aß-Konzentrationen bedürfen[Auld et al., 1998]. Da im millimolaren Bereich die Rate der ß-Faltblatt-Formationdeutlich erhöht ist [Barrow et al., 1992], hängt die neuromodulatorische oder neuro-toxische Wirkung vom Konformationszustand des Aß ab. Für Aß1-40 wurde gezeigt,daß ausschließlich die oligomere ß-Faltblatt-Struktur neurotoxisch wirkt, wobei dieMenge der gebildeten Faltblattstrukturen das Ausmaß der Toxizität bestimmt [Sim-mons et al., 1993]. Wird aggregiertes, neurotoxisches Aß1-42 in vitro durch Lösungs-mittel in die α-helicale Form überführt, geht die Neurotoxizität verloren [Pike et al.,1993]. Talafous et al. (1994) gehen davon aus, daß die lösliche, monomere α-helica-le Konformation des Aß die neuromodulatorische Zustandsform darstellt, währenddie unlösliche, oligomere ß-Faltblatt-Struktur neurotoxisch wirkt. Bisher konnte jedochnoch nicht gezeigt werden, ob die neuromodulatorischen Eigenschaften des Aßausschließlich auf der α-helicalen Konformation beruhen.Aß1-28 nimmt bei pH=6 die Alzheimer-typische ß-Faltblatt-Struktur ein. Mit der Über-legung, daß eine Anpassung der Versuchsbedingungen an die in vivo vorgefundenenpathologischen Verhältnisse einen ausgeprägteren Effekt auf die [³H]-ACh-Frei-setzung haben könnte, wurde der pH-Wert des zur Vorinkubation des Aß1-28 verwen-deten Natrium-Phosphat-Puffers von 7.4 auf 6 gesenkt. Im Rattenhippocampusreduzierte das bei pH=6 vorinkubierte Aß1-28 die [³H]-ACh-Freisetzung, ohne daß sichdie Größenordnung der Hemmung deutlich von der des bei pH=7.4 vorinkubiertenAß1-28 unterschied. Jedoch ist auch hier aufgrund des großen Unterschiedes in derZahl der Versuche zwischen Kontrollen und den mit Aß1-28–superfundierten Kam-mern die statistische Auswertung nur begrenzt aussagekräftig. Möglicherweise löstesich beim Transfer des bei pH=6 vorinkubierten Aß1-28 in die auf pH=7.4 eingestelltenSuperfusionspuffer die während der Vorinkubation angenommene ß-Faltblatt-Strukturauf. Allerdings vermuten Zagorski et Barrow (1992), daß in vivo eine einmal begon-nene Ablagerung von Aß nicht mehr reversibel ist. Falls bei den durchgeführtenExperimenten die ß-Faltblatt-Struktur des Aß tatsächlich noch während der Super-fusion Bestand hatte, so könnte dies ein Hinweis darauf sein, daß nicht nur die α-helicale Aß-Konformation neuromodulatorische Eigenschaften besitzt. Pedersen etal. (1996) gehen jedoch davon aus, daß die neuromodulierenden in vitro-Effekte desAß1-28 unabhängig vom Konformations- und Aggregationszustand sind, da dieentstehenden Aggregate aufgrund der „fehlenden“ Aminosäuren 29-42 nicht aus-reichend stabil sind. Vor diesem Hintergrund und aufgrund der Ergebnisse im Ratten-hippocampus wurde auf die Durchführung von [³H]-ACh-Freisetzungsexperimentenmit dem bei pH=6 vorinkubierten Aß1-28 im menschlichen Neokortexgewebe ver-zichtet.Denkbar ist, daß der pH-Wert im Gewebe indirekt über den Konformationszustanddie neuromodulierenden bzw. -toxischen Eigenschaften des Aß bestimmt. Passenddazu ist der pH-Wert in Gehirnen von Patienten, die an M. Alzheimer starben, mit 6.6

Diskussion 43

wesentlich niedriger als der von Verstorbenen, die an keinerlei Erkrankung desGehirns litten (pH=7.1) [Yates et al., 1990]. Bei der Pathogenese des M. Alzheimerskönnten lokale cerebrale Erniedrigungen des pH-Wertes durch eine „Aussaat“ vonunlöslichen Aß-Fibrillen eine entscheidende Rolle spielen [Kirshenbaum et Daggett,1995]. Diese lokalen pH-Wert-Erniedrigungen, die zum Beispiel bei Ischämie be-obachtet werden, führen zur Konversion des physiologisch produzierten α-helicalenAß [Shoji et al., 1992] in die unlösliche und potentiell neurotoxische ß-Faltblatt-Struktur mit nachfolgender Entstehung von Aß-Plaques. Da eine einmal durch einetemporäre pH-Senkung begonnene Ablagerung von Aß in vivo auch bei Normali-sierung des pH-Wertes möglicherweise nicht mehr reversibel ist und gleichzeitig einekontinuierlich fortschreitende Aß-Fibrillen-Ablagerung in diesem Bereich fördert[Zagorski et Barrow, 1992], könnten rezidivierende cerebrale Ischämien folglich alsWegbereiter für die Entstehung der Alzheimer-Demenz fungieren.

Diskussion 44

4.2 Wirkung von Aß1-28 auf die [³H]-Cholin-Beladung

Ein wesentliches Augenmerk galt neben der Wirkung auf die [³H]-ACh-Freisetzungauch einem möglichen Einfluß von Aß1-28 auf die Beladung der Gewebeschnitte mit[³H]-Cholin.Im Rattenhippocampus zeigte sich bei einer Aß1-28-Konzentration von 0.1 nM ab In-kubation eine Zunahme der [³H]-Cholin-Beladung, ein Effekt, der bei einer zehnfachhöheren Aß1-28-Konzentration ausblieb. Wie schon bei der fehlenden Wirkung der 1nM Aß1-28-Konzentration auf die [³H]-ACh-Freisetzung im Rattenhippocampus bleibtdie Ursache auch in diesem Fall letztlich unklar, wobei die geringe Versuchszahl derAß1-28–superfundierten Kammern die statistische Aussagekraft wiederum ein-schränkt. Im menschlichen Neokortexgewebe bewirkte Aß1-28 (0.1 nM) keinerleiVeränderung der [³H]-Cholin-Beladung, bei einer Konzentration von 1 nM nahm dieBeladung dagegen signifikant zu.Die Steigerung der radioaktiven Beladung der Schnitte sowohl im Rattenhippocam-pus als auch im menschlichen Neokortex ist nicht mit einer verminderten [³H]-ACh-Freisetzung unter Aß1-28 in Zusammenhang zu bringen. Möglicherweise ist sie jedochdurch die funktionell-strukturellen Eigenschaften des Aß bedingt . In α-helicaler Formist Aß in der Lage, sich zu Di- und Tetrameren zusammenzulagern, wobei letztere inPhospholipiddoppelschichten Kation-selektive Ionenkanäle bilden [Pollard et al.,1993]. Durch diese membrandurchspannenden Tetramere kann auch Cholin entlangdes Konzentrationsgefälles transportiert werden. So beschrieben Galdzicki et al.(1994) eine erhöhte Cholin-Leitfähigkeit von Phäochromocytom-Klonen unter Aß1-40.Jedoch schlossen sie eine direkte Aß-Kanalbildung aus und vermuteten stattdesseneine Modifikation vorhandener Kanäle oder Transporter durch Aß. Vermutlich kam esbei den Superfusionsexperimenten während der Inkubation der Gewebeschnitteunter Aß1-28 zu einem im Vergleich zu den Kontrollen vermehrten Einstrom von [³H]-Cholin in die Nerven- bzw. umgebenden Gliazellen, der die erhöhte Beladung der mitAß1-28 inkubierten und superfundierten Schnitte bedingte. In vivo führt die Gegenwartvon Aß zu einem Cholin-Verlust aus den cholinergen Neuronen, da infolge desaktiven Cholin-Transportes durch das HACU-System ein Konzentrationsgefälle vonintra- nach extrazellulär besteht [Tucek, 1985]. Passend dazu finden sich in denGehirnen von an M. Alzheimer verstorbenen Personen erniedrigte Cholin-Konzen-trationen [Nitsch et al., 1992]. Ferner ist die Cholin-Konzentration in der cerebrospi-nalen Flüssigkeit von Alzheimer-Patienten erhöht [Elble et al., 1989], sowie dasHACU-System kompensatorisch hochreguliert [Slotkin et al., 1990].Der Verlust von intrazellulärem Cholin kann die Ursache für die verminderte Frei-setzung von endogenem ACh unter Aß, wie sie von Kar et al. (1996) im Rattenhippo-campus demonstriert wurde, sein. Auch die vom gleichen Autor demonstrierte Hem-mung des HACU der cholinergen Terminalen (1998) dient als mögliche Erklärung.Jedoch ist die bei der vorliegenden Arbeit beobachtete Hemmung der [³H]-ACh-Frei-setzung nicht durch einen intrazellulären Cholin-Verlust bzw. –Mangel erklärbar, dadie Inkubation der Gewebeschnitte mit [³H]-Cholin unter Aß eine Erhöhung des intra-zellulären [³H]-Cholin-Gehaltes zur Folge hatte.

Diskussion 45

Mit der Verlängerung der Einwirkdauer bewirkte Aß1-28 im menschlichen Neokortex-gewebe bereits in einer Konzentration von 0.1 nM eine Zunahme der radioaktivenBeladung der Schnitte, die jedoch nicht signifikant war. Auch das entsprechendeErgebnis im Rattenhippocampus war nicht signifikant, wobei die Beladungszunahmebei der verlängerten Einwirkdauer deutlich geringer ausfiel als bei Anwesenheit desAß1-28 ab Inkubation. Dabei ist die statistische Auswertung durch zu geringe Ver-suchszahlen wiederum erschwert. Möglicherweise wurde Aß1-28 während der verlän-gerten Präsenz bei den Gewebeschnitten durch unspezifische Peptidasen, die beider Präparation des Hippocampus freigesetzt wurden, abgebaut. Die so entstan-denen Aß1-28-Bruchstücke waren nicht mehr in der Lage, die für den [³H]-Cholin-Einstrom notwendige Kanalbildung vorzunehmen, so daß der Anstieg der Beladungentsprechend geringer ausfiel. Die entstehenden Bruchstücke können aber durchausnoch neuromodulatorische Potenz besitzen [Auld et al., 1998], so daß diese Er-klärung nicht im Widerspruch steht mit der oben geschilderten verstärkten Wirkungdes Aß1-28 auf die [³H]-ACh-Freisetzung im Rattenhippocampus bei verlängerterEinwirkdauer.Da die Kanalbildung auf der α-helicalen Form des Aß1-28 beruht, sollte ein erhöhterAnteil der ß-Faltblatt-Struktur zu einer verringerten Zunahme der [³H]-Cholin-Bela-dung der Schnitte führen. Dies konnte jedoch bei Versuchen im Rattenhippocampus,bei denen der pH-Wert des zur Aß-Vorinkubation verwendeten Natrium-Phosphat-Puffers auf 6 erniedrigt wurde, nicht beobachtet werden. Die Beladungszunahme lagim Bereich des bei pH=7.4 vorinkubierten Aß1-28. Wiederum ist eine mögliche Er-klärung, daß sich mit dem Transfer des Aß1-28 in den auf pH=7.4 eingestellten Super-fusionspuffer die ß-Faltblätter in die α-helicale Form umlagerten und somit zur Kanal-bildung in der Lage waren. Allerdings limitieren auch in diesem Fall die im Vergleichzu den Kontrollen zu geringen Versuchszahlen der Aß1-28–superfundierten Kammerndie statistische Aussagekraft.Betrachtet man die Verhältnisse in vivo, so wirken die Aß-Tetramere durch den Ver-lust an intrazellulärem Cholin und die konsekutiv verminderte ACh-Freisetzung nichtnur neuromodulatorisch, sondern durch eine selektive Schädigung cholinerger Neu-rone auch neurotoxisch [Wurtman, 1992]. Das von den cholinergen Zellen aufgenom-mene Cholin dient nicht nur der Synthese des Neurotransmitters ACh, sondern alsBestandteil von Phosphatidylcholin auch zum Aufbau der Phospholipiddoppelschichtder zellulären Membranen [Blusztajn et al., 1987]. Die Verwendung des Cholins auchzur Neurotransmission ist Ursache für den enormen Cholin-Bedarf cholinerger Neu-rone, der durch den HACU gedeckt wird [Kuhar et Murrin, 1978]. Bei einem durch Aßinduzierten Mangel an Cholin, sei es durch Blockade des HACU oder Ausstrom desCholins in den Extrazellulärraum über Aß-Tetramere, wird das in den Membranen„gespeicherte“ Cholin für die Synthese von ACh verwendet [Köppen, 1997]. So ist inpostmortem Gehirnen von Alzheimer-Patienten der Phosphatidylcholin-Umsatzerhöht und von einem Anstieg des Phosphatidylcholin-Metaboliten Glycerophospho-cholin, das in einem weiteren Abbauschritt Cholin liefert, begleitet [Blusztajn et al.,1990]. Der Abbau von Phosphatidylcholin zur Aufrechterhaltung der Neurotrans-mission führt zu Veränderungen der Membraneigenschaften [Ginsberg et al., 1993]

Diskussion 46

und letztendlich zum Untergang der cholinergen Neurone durch Autokannibalismus[Wurtman, 1992]. Diese Abhängigkeit der cholinergen Neurone von Cholin sowohl fürstrukturelle Zwecke als auch für die Neurotransmission ist eine potentielle Ursachefür ihre selektive Vulnerabilität beim M. Alzheimer.Die strukturellen Auswirkungen dieses Autokannibalismus nehmen möglicherweiseauch Einfluß auf die Prozessierung des transmembranär lokalisierten ß-APP. Durchdie Veränderung der Membraneigenschaften und -zusammensetzung werden Berei-che des ß-APP freigelegt, die bei normalen Verhältnissen für die das ß-APP zerle-genden Secretasen nicht oder nur schwer zugänglich sind [Wurtman, 1992]. Zumeinen ist denkbar, daß unter diesen Bedingungen die ß-Secretase vermehrt amyloi-dogene Bruchstücke des ß-APP generieren kann, zum anderen kann die γ-Secretasedurch veränderte Angriffsmöglichkeiten zunehmend Aß-Moleküle mit 42 bzw. 43 Ami-nosäuren bilden. Somit ist α-helicales, lösliches Aß in der Lage, über den Cholin-Verlust und Autokannibalismus der cholinergen Neurone eine unkontrollierte Frei-setzung amyloidogener ß-APP-Bruchstücke zu begünstigen, die aufgrund ihrer Län-ge eine hohe Tendenz zur Bildung unlöslicher Aß-Fibrillen besitzen.Die α-helicale Form von Aß besitzt aufgrund ihrer Fähigkeit zur Bildung Kation-selek-tiver Kanäle auch in anderer Hinsicht neurotoxisches Potential: Die in der „AmyloidCascade Hypothesis“ beschriebene Störung der Kalzium-Homöostase [Fukuyama etal., 1994] kann auch durch einen Kalzium-Einstrom in die Neurone durch eben dieseAß-Tetramere verursacht sein.Allerdings besteht ein Widerspruch zwischen dem durch die α-helicale Zustandsformvia Cholin-Verlust und Autokannibalismus bzw. Kalzium-Einstrom verursachten Zell-tod und der Aussage von Simmons et al. (1993), daß ausschließlich die ß-Faltblatt-Struktur des Aß neurotoxisch wirkt. Wahrscheinlich ist letztere Beobachtung an invitro-Zellkulturen nicht ohne weiteres auf die physiologischen Bedingungen in vivoübertragbar, von denen bei dem Konzept des Autokannibalismus und der „AmyloidCascade Hypothesis“ [Hardy et Higgins, 1992] ausgegangen wird. Ferner ist esdenkbar, daß α-helicales Aß konzentrationsabhängig sowohl neuromodulierend alsauch neurotoxisch wirken kann, während die ß-Faltblatt-Struktur bereits in Konzen-trationen toxisch wirkt, bei denen die α-Helices keine oder lediglich modulierendeWirkung entfalten.Aufgrund dieser Annahme und der Beobachtung, daß Aß in α-helicaler Form physio-logischerweise vorkommt und auch im Liquor gesunder Patienten nachgewiesenwerden kann [Shoji et al., 1992], müssen für die Entstehung der Aß-Tetramere bzw.für die Beeinflußung von Transportern und Kanälen durch Aß weitere Voraussetzun-gen erfüllt werden. In Frage kommen zum Beispiel eine primär gesteigerte Produk-tion des Aß bei genetischer Prädisposition oder ein Defekt von zellulären Mechanis-men, die unter normalen Bedingungen die Produktion des Aß wirksam steuern bzw.eine Kanalbildung durch Aß unterbinden. Die physiologische Aß-Produktion wird un-ter anderem durch ACh beeinflußt. Die Inhibition der kortikalen ACh-Freisetzung stei-gert die Bildung von ß-APP [Iverfeldt et al., 1993] und fördert die Entstehung amyloi-dogener ß-APP-Metabolite [Buxbaum et al., 1994]. Dagegen führt die Aktivierung vonM1- und M3-Rezeptoren zur bevorzugten Verarbeitung des ß-APP auf dem sekretori-

Diskussion 47

schen Weg mit der Entstehung von sAPPs [Nitsch et al., 1992]. Durch gleichzeitigeAktivierung des M2-Rezeptors kann dieser Effekt aufgehoben werden [Farber et al.,1995]. Das cholinerge System begünstigt somit die nicht amyloidogene Prozes-sierung des ß-APP, während umgekehrt die amyloidogenen Spaltprodukte die choli-nerge Transmission beeinflussen. Da einmal generiertes Aß über eine Hemmung derACh-Freisetzung seine eigene Produktion fördern kann, bedarf es weiterer zellulärerKontrollmechanismen, um eine Entgleisung der physiologischen Aß-Entstehung[Haass et al., 1993] zu verhindern.Solche Kontrollfunktionen können durch Substanzen übernommen werden, vondenen bekannt ist, daß sie Einfluß auf den ß-APP-Stoffwechsel nehmen. So steigertThrombin die Bildung von sAPPs [Smith et al., 1990]; Bradykinin führt ebenfalls zueiner gesteigerten sAPPs-Sekretion [Nitsch et al., 1993]. Auch die Aktivierung derPhospholipase A2 fördert den Metabolismus des ß-APP auf dem sekretorischen Weg[Pittel et al., 1996]. Phosphatasen und Proteinkinasen modulieren über den Phos-phorylierungszustand das ß-APP oder die das ß-APP verarbeitenden Secretasen.Die Aktivierung der Proteinkinase C, die als Folge der M1- und M3-vermittelten Phos-pholipase C-Aktivierung stimuliert wird, bewirkt eine beschleunigte sekretorische Ver-arbeitung des ß-APP und eine vermehrte Bildung von sAPPs [Nitsch et al., 1993].Der entsprechende Effekt kann auch durch die Hemmung von Protein-Phosphatasenerzielt werden [Buxbaum et al., 1993], so daß ein erhöhter Phosphorylierungsgraddes ß-APP oder der Secretasen den sekretorischen, nicht amyloidogenen ß-APP-Metabolismus begünstigt. Buxbaum et al. beobachteten (1993), daß eine vermehrteBildung von sAPPs mit einer konsekutiven Abnahme der Aß-Produktion einherging.Sie schlossen daraus, daß der sekretorische und lysosomale Weg kompetitiveProzessierungswege des ß-APP sind, so daß die Verfügbarkeit an ß-APP derlimitierende Faktor für die Aß-Synthese ist.Die potentielle Kontrollfunktion der angeführten Substanzen und Mediatoren liegt so-mit in der Begrenzung der verfügbaren ß-APP-Menge für den lysosomalen, amyloi-dogenen Weg. Umgekehrt entzieht eine pathologisch gesteigerte Produktion von ß-APP diesem Kontrollmechanismus die Grundlage und sorgt so für eine über das nor-male Maß hinausgehende und durch den Organismus nicht mehr kontrollierbare Aß-Produktion. Dies hat letztendlich fatale Folgen für die Funktion und strukturelle Inte-grität des zentralen cholinergen Systems.

Diskussion 48

4.3 Die depolarisationsabhängige ChAT-Aktivierung

Die Hypothese der depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung wurde durch die imRahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente im menschlichen Neokortexverifiziert. Sie besagt, daß durch eine mehrminütige Kalium-Stimulation die ChAT inden menschlichen Neokortexneuronen stimuliert wird. In [³H]-ACh-Freisetzungsex-perimenten mit zwei vierminütigen Kalium-Stimulationen S1 und S2 ist daher dieAktivität der ChAT zwischen S1 und S2 erhöht, so daß es infolge einer vermehrtenNeusynthese von nicht radioaktiv markiertem ACh, das durch den Szintillationszählernicht registriert wird, zu einer Verdünnung des bei S2 freigesetzten [³H]-ACh-Poolskommt. Dies äußert sich in S2/S1-Quotienten der Kontrollen, die weit unter dem zuerwartenden Wert von eins liegen.Zunächst gelang es im Superfusionsexperiment im menschlichen Neokortex, durchGabe der indirekten bzw. direkten ChAT-Inhibitoren Okadasäure (50 nM) und Br-ACh(30 µM) ab der Vorperfusion den S2/S1-Quotienten der Kalium (20 mM, 4 min)-evo-zierten [³H]-ACh-Freisetzung um 61 bzw. 78 Prozent zu steigern. Damit konnte dieChAT-Aktivierung indirekt belegt werden. Ein entsprechender Sachverhalt wurde imSuperfusionsexperiment auch bei der [³H]-γ−Aminobuttersäure (GABA)-Freisetzungaus neokortikalen Schnitten des Kaninchens beobachtet. Die Gabe eines Glutamat-decarboxylase-Inhibitors sorgte für einen deutlichen Anstieg des S2/S1-Quotientender Kontrollen, so daß in jenem Fall von einer stimulationsbedingten Aktivierung desGABA-synthetisierenden Enzyms mit einer konsekutiven Verdünnung des [³H]-GABA-Pools durch neusynthetisiertes, nicht radioaktiv markiertes GABA auszugehenwar [Feuerstein et al., 1996].Unter elektrischen Stimulationsbedingungen (3 Hz, 90 Pulse, 2 ms, 68 mA) dagegenlag der S2/S1-Quotient der [³H]-ACh-Freisetzung im Bereich von eins und wurdedurch die Zugabe von Okadasäure (50 nM) ab Vorperfusion nicht verändert. Darausläßt sich schließen, daß eine Aktivierung der ChAT nur bei mehrminütiger Stimulationder Gewebeschnitte bzw. nur unter Bedingungen erhöhter neuronaler Entladung mitgesteigerter [³H]-ACh-Freisetzung stattfindet. Schließlich wurde mit Hilfe eines ChAT-Assays die Aktivierung der ChAT durch eine vierminütige Kalium-Stimulation demon-striert. Die ChAT-Aktivität in den mit Kalium (20 mM) depolarisierten humanen Neo-kortexschnitten war gegenüber den nicht stimulierten Kontrollen um 49 Prozenterhöht. Damit wurde der direkte Beweis für die Richtigkeit der Hypothese der depola-risationsabhängigen ChAT-Aktivierung im menschlichen Neokortex erbracht. Einenähnlichen Zusammenhang zwischen einer mehrminütigen Kalium-Depolarisation undder ChAT-Aktivität zeigten Ando et al. (1987) an sympathischen Ganglienzellen derRatte.Während Br-ACh den S2/S1-Quotienten durch eine direkte Inhibition der aktiviertenChAT in den Hirnschnitten erhöht [Speth et al., 1976], bedarf es bei der Beurteilungder Effekte der Okadasäure einer genaueren Betrachtung. Die Okadasäure ist primärein Inhibitor der Serin/Threonin-Phosphatasen-1 und –2A [Haystead et al., 1989] undkann als solcher die ACh-Freisetzung auf mehreren Ebenen beeinflussen. Ein An-griffspunkt ist der HACU, der durch Okadasäure in seiner Aktivität stark gemindert

Diskussion 49

wird [Issa et al., 1996]. Da die Superfusionspuffer bei den Versuchen mit Okadasäurejedoch Hemicholinium-3 enthielten, das die [³H]-Cholin-Aufnahme schon primär blok-kiert [Guyenet et al., 1973], spielt diese Wirkung der Okadasäure bei meinenBeobachtungen keine Rolle.Außerdem ist ein Einfluß der Okadasäure auf die ACh-Freisetzung per se beschrie-ben, allerdings mit widersprüchlichen Angaben. Bei der stimulationsbedingten Frei-setzung von ACh aus der neuromuskulären Endplatte des Frosches werden sowohlsteigernde [Abdul-Ghani et al., 1991] als auch hemmende Effekte [Van der Kloot etMolgo, 1993] der Okadasäure genannt. Die stimulationsbedingte [³H]-ACh-Frei-setzung in Synaptosomen des Rattenhippocampus wird durch Okadasäure gehemmt[Vickroy et al., 1995]. Letzteres wurde durch die Experimente dieser Arbeit immenschlichen Neokortex allenfalls ansatzweise bestätigt: Die bei S1 freigesetzteTritiummenge der Kammern, deren Schnitte ab der Vorperfusion mit Okadasäuresuperfundiert wurden, lag unter dem entsprechenden Wert der Kontrollkammern,jedoch ohne signifikanten Unterschied.Ferner hemmt Okadasäure die ChAT. Allerdings beruht diese Wirkung nicht auf einerdirekten Interaktion zwischen Enzym und Okadasäure, weshalb Okadasäure auchals indirekter ChAT-Inhibitor bezeichnet wird [Issa et al., 1996]. In Anbetracht dereben angeführten Überlegungen und der Ergebnisse der durchgeführten Super-fusionsexperimente ist die Steigerung des S2/S1-Quotienten durch Okadasäure amWahrscheinlichsten der indirekten Inhibition der ChAT zuzuschreiben.Die Aktivität der ChAT wird auf mannigfaltige Weise beeinflußt. Auf Transkriptions-ebene wird die Expression unter anderem durch Nerve Growth Factor [Mobley et al.,1986], Östradiol [Luine, 1985] und Thyreotropin-Releasing Hormone [Schmidt-Achertet al., 1984] moduliert. Dabei spielen die Proteinkinase A II [Tanaka et al., 1998] so-wie der Acetylierungszustand von Histonen [Espinos et al., 1999] eine wichtige Rolle.Außerdem existieren kurzfristige Regulationsmechanismen. Das Vasoactive Intesti-nale Peptid (VIP) steigert ebenso wie Retinoinsäure die ChAT-Aktivität [Luine et al.,1984; Casper et Davies, 1989]. Über eine negative Rückkopplung hemmt ACh imSinne einer Produkthemmung die ChAT [Rossier et al., 1977]. Für die ChAT-Aktivierung durch eine langdauernde Kalium-Depolarisation sind aufgrund derWirksamkeit des Serin/Threonin-Phosphatasen-1 und –2A-Inhibitors Okadasäuremöglicherweise Phosphorylierungsschritte entscheidend. Grundsätzlich stellt diekovalente Modifikation durch Phosphorylierung einen häufigen posttranslationalenRegulationsmechanismus für Proteine im ZNS dar [Browning et al., 1985]. So wirddie Aktivität der Tyrosin-Hydroxylase, die das geschwindigkeitsbestimmende Enzymder Katecholamin-Synthese ist, über deren Phosphorylierungszustand reguliert [Hay-cock, 1987]. Die Kinetik der Tryptophan-Hydroxylase wird ebenfalls über Phosphory-lierungen beeinflußt [Ehret et al., 1989]. Auch für die ChAT sind phosphorylierte Zu-standsformen beschrieben [Bruce et Hersh, 1989] und entsprechende Untersuchun-gen durchgeführt worden. In Synaptosomen des Rattenhippocampus entdecktenSchmidt et Rylett (1993), daß die membranassoziierte Form der ChAT (mChAT), imGegensatz zur cytosolischen ChAT (cChAT), durch eine mehrminütige Veratridin-Depolarisation aktiviert wird. Allerdings stellten die Autoren in diesem Zusammen-

Diskussion 50

hang keinerlei Veränderung der Phosphorylierung der mChAT fest und schlossendaher einen Einfluß des Phosphorylierungszustandes auf die ChAT-Aktivität aus.Okadasäure hemmt sowohl die cChAT als auch die mChAT im Rattenhippocampusund führt gleichzeitig zu einer quantitativen Abnahme der entsprechenden Enzyme[Issa et al., 1999]. Auch beim Menschen liegen etwa 10 bis 20% der Gesamt-ChATals mChAT vor [Peng et al., 1986], so daß die in meinen Versuchen im menschlichenNeokortex beobachtete Steigerung der ChAT-Aktivität entsprechend auch von dermChAT getragen worden sein könnte. Da eine Änderung des Phosphorylierungszu-standes als Ursache der Aktivitätssteigerung der mChAT eher unwahrscheinlich ist,könnte eine Freisetzung von mChAT aus intrazellulären Speichern durch die Kalium-Depolarisation eine mögliche Erklärung sein. Dies wurde durch die Anwesenheit vonOkadasäure im Superfusionsmedium verhindert, so daß eine Aktivitätssteigerung derChAT und die Neusynthese von nicht radioaktiv markiertem ACh ausblieb. In diesemFall ist der Angriffsort der Okadasäure möglicherweise nicht mChAT an sich, sondernProteine, die für die Kompartimentierung und Speicherung von mChAT verantwortlichsind.Ein weiterer potentieller Weg der ChAT-Aktivierung steht in Zusammenhang mit derWirkung von Kalium auf den Phospholipidmetabolismus. Erhöhte extrazelluläreKalium-Konzentrationen steigern den Phospholipidstoffwechsel und somit dasintrazelluläre Cholin-Angebot durch Freisetzung von Cholin aus Membranlipiden[Nagata et al., 1973]. Gleichzeitig hemmt eine mehrminütige Kalium-Depolarisationdie Cholin-Kinase [Ando et al., 1987], die bei der Bildung der zellulären Membran-lipide die Phosphorylierung von Cholin zu Phosphocholin katalysiert [Kennedy etWeiss, 1956]. Der daraus resultierende Anstieg des freien, zur Transmittersynthesezur Verfügung stehenden Cholins erhöht seinerseits die ChAT-Aktivität [Ando et al.,1987]. Denkbar ist, daß durch den Einsatz des Phosphatase-Inhibitors Okadasäuredie Blockade der Cholin-Kinase kompensiert und/oder die Freisetzung von Cholinaus Membranlipiden verhindert wurde. Folglich blieb der Anstieg des freien intrazel-lulären Cholins und die damit verbundene Aktivierung der ChAT aus bzw. war zumin-dest deutlich verringert.

Mit den Experimenten zur depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung wurde in die-ser Arbeit gezeigt, daß im menschlichen Neokortex die Anpassung der ACh-Synthe-serate bei gesteigerter ACh-Freisetzung über eine Modulation der ChAT-Aktivität er-folgt. Jedoch ist bis heute nicht exakt geklärt, welche Mechanismen daran beteiligtsind.

Zusammenfassung 51

5 Zusammenfassung

Zentrales Thema der vorliegenden Arbeit war die Beeinflußung der cholinergenTransmission im Rattenhippocampus und menschlichen Neokortex. Während imersten Teil die Effekte des synthetischen Aß1-28 auf die [³H]-ACh-Freisetzung und[³H]-Cholin-Beladung im Superfusionsexperiment untersucht wurden, beschäftigtesich der zweite Abschnitt mit der Hypothese der depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung.Die Kalium (20 mM, 60 min)-evozierte [³H]-ACh-Freisetzung wurde sowohl im Hippo-campus der Ratte als auch im menschlichen Neokortex durch Aß1-28 (0.1 nM) abInkubation gehemmt, wobei die zehnfach höhere Aß1-28-Konzentration aus unklarenGründen keinerlei Effekt hatte. Dagegen sorgte die Verlängerung der Einwirkzeit desAß1-28 (0.1 nM) bei beiden Spezies für eine verstärkte Inhibition der [³H]-ACh-Frei-setzung, vermutlich bedingt durch die langsame Penetration des Aß1-28. Keine ver-stärkte Hemmung der [³H]-ACh-Freisetzung im Rattenhippocampus bewirkte dieVorinkubation von Aß1-28 bei einem pH-Wert von 6. Damit sollte der Effekt des Aß1-28

(0.1 nM) in der Alzheimer-typischen ß-Faltblatt-Struktur untersucht werden, dochging diese möglicherweise beim Transfer des Aß1-28 in den auf pH=7.4 eingestelltenSuperfusionspuffer zugunsten der α-helicalen Form verloren.Schon in 0.1 nM Konzentration steigerte Aß1-28 ab Inkubation im Rattenhippocampusdie [³H]-Cholin-Beladung, während dies in den menschlichen Neokortexschnitten erstbei 1 nM der Fall war. Jedoch blieb eine Wirkung von 1 nM Aß1-28 auf die Beladungim Rattenhippocampus aus, ohne daß dafür eine Erklärung gefunden werden konnte.Bei verlängerter Einwirkdauer nahm die radioaktive Beladung im menschlichen Neo-kortex im Vergleich zur Gabe des Aß1-28 (0.1 nM) ab Inkubation zu, im Rattenhippo-campus dagegen fiel die Zunahme geringer aus. Möglicherweise sorgten bei derPräparation des Hippocampus freigesetzte Peptidasen für eine Zerlegung des Aß1-28

und verhinderten so die Kanalbildung durch die α-helicalen Aß-Tetramere. Den [³H]-ACh-Freisetzungsexperimenten entsprechend blieb die Vorinkubation des Aß1-28 (0.1nM) bei pH=6 ohne zusätzlichen Effekt auf die [³H]-Cholin-Beladung im Rattenhippo-campus.Im zweiten Teil wurde die Aktivierung der ChAT in menschlichen Neokortexschnitteninfolge mehrminütiger Kalium-Depolarisation demonstriert. Der S2/S1-Quotient derKalium (20 mM, 4 min)-evozierten [³H]-ACh-Freisetzung wurde durch Gabe desindirekten bzw. direkten ChAT-Inhibitors Okadasäure (50 nM) und Br-ACh (30 µM)ab der Vorperfusion deutlich angehoben. Die unter elektrischen Stimulationsbedin-gungen (3 Hz, 90 Pulse, 2 ms, 68 mA) ausbleibende Wirkung der Okadasäure (50nM) auf den S2/S1-Quotienten zeigte zudem, daß eine Aktivierung der ChAT nur beimehrminütiger Depolarisation der Gewebeschnitte stattfindet. Mittels ChAT-Assayskonnte schließlich die Aktivierung der ChAT durch eine vierminütige Kalium-Stimula-tion direkt demonstriert und der endgültige Beweis für die Richtigkeit der Hypotheseder depolarisationsabhängigen ChAT-Aktivierung erbracht werden.

Literaturverzeichnis 52

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Lebenslauf

Name: Jörg-Peter SigleGeburtsdatum: 29.11.72Geburtsort: BräunlingenKonfession: evangelischFamilienstand: ledigEltern: Hans Sigle, geb. am 8.10.42; Beruf: Apotheker

Eike Sigle, geb. am 29.10.41; Beruf: ApothekerinGeschwister: Christian Sigle, geb. am 5.2.70; Beruf: Apotheker

Schulbildung8/1979 bis 7/1983 Grundschule in der Lucian-Reich-Schule Hüfingen8/1983 bis 5/1993 Fürstenberg-Gymnasium Donaueschingen

Schuljahr 90/91: Besuch der Hanover-High-School, PA, USA

Ersatzdienst6/1993 bis 8/1994 Zivildienst im Städt. Krankenhaus Bräunlingen

Studium10/1994 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-

Ludwigs-Universität in Freiburg im Breisgau9/1996 Ärztliche Vorprüfung9/1997 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung3/2000 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung4/2000 bis 2/2001 Praktisches Jahr am Diakonie-Krankenhaus Freiburg5/2001 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Promotion11/1997 bis 7/2001 Dissertation bei Prof. Dr. T.J. Feuerstein in der Sektion Klinische

Neuropharmakologie im Neurozentrum der NeurologischenUniversitätsklinik Freiburg

VeröffentlichungenAlbrecht, C.F., Sigle, J.-P., v.Velthoven, V., Jackisch, R., Feuerstein, T.J. (1998)Modulation of acetylcholine release in human neocortex by δ1-opioid receptors onsomatostatin interneurons. Naunyn-Schmiedeberg`s Arch Pharmacol 358:Suppl 3

Sigle, J.-P., Ehret, A., Freiman, T., Jackisch, R., Feuerstein, T.J. (2001) Evidence fordepolarisation-induced activation of choline-acetyltransferase in human neocortex. BrJ Pharmacol (in press)

Sigle, J.-P., Freiman, T., Borremans, J., Feuerstein, T.J. (1999) Evidence for activa-tion of choline-acetyltransferase (ChAT) by K+-depolarization in human neocortex:

prevention of this effect by ocadaic acid. Naunyn-Schmiedeberg`s Arch Pharmacol359:Suppl 3

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Beeinflußung der [³H]-Acetylcholin-Freisetzung im