Upload
vanessa-veloso
View
277
Download
9
Embed Size (px)
DESCRIPTION
slide de aula
Citation preview
No sculo 17, o cientista Robert Hooke foi a primeira pessoa a usar a palavra clula para
identificar estruturas microscpicas em uma fatia de rolha:
" . . . Estes poros, ou clulas, no so muito profundos, mas constituem vrias pequenas caixas.
Imagem extrada do livro Micrographia.
Robert Hooke
Livro publicado pelo microscopista Ingls Robert Hooke, em 1665.
Em 1665, Robert Hooke publicou um livro intitulado Micrographia, contendo desenhos de
praticamente tudo que podia se ver com a mais nova inveno, o microscpio.
Microscpios:
O microscpio ilustrado na figura um microscpio composto
simples utilizado pelo microscopista ingls Robert Hooke em
1660.
produzem imagem ampliada de um espcime
(objeto)
separam detalhes de uma imagem
O microscpio simples era considerado o mais elevado estado de perfeio em 1600.
Como estudamos as clulas em Biologia Celular?
Microscopia: Microscopia de Luz (ptica)
Evoluo dos Microscpios
Microscopia ptica (microscopia de luz)
Microscpio de campo claro
Microscpio de campo escuro
Microscpio de contraste de fase
Microscpio de contraste de interferncia diferencial DIC (Nomarski)
Microscpio de fluorescncia
Microscpio confocal de varrredura a laser
Tipos de microscopia ptica
Microscpio ptico
Elodea - Microscopia de luz
Corantes podem ser usados para corar clulas e aumentar
contraste de maneira que elas possam ser mais facilmente
visualizadas e identificadas ao microscpio de campo claro.
Colorao
Clulas do sangue (microscpio de campo claro)
Trichinella spiralis
encistado em msulo
esqueltico - colorao HE
(hematoxilina-eosina)
Esporos de mofo
(Lycopodium) corados com
safranina
(microscpio de campo claro)
(microscpio de campo claro)
Microscpio de contraste de interferncia
diferencial DIC (Nomarski)
Microscpio de campo claro
Microscpio de campo escuro
Microscpio de contraste de fase
Cell Biology interactive
Fig. 23.8 Megacaricito - Contraste de fase Fig. 16.11 Clula muscular cardaca - Contraste de fase Fig. 23.9 Cicatrizao de feridas - Contraste de fase Fig. 24.4 Clula T citotxica - Contraste de fase Fig. 16.2 Caa e fagocitose de bactrias por neutrfilos - Contraste de fase Fig. 20.1 Clulas de cncer de mama - Contraste de fase Fig. 16.2 - Quimiotaxia de neutrfilos vs. bactrias - Contraste de fase
Fig. 15.2 Quimiotaxia de neutrfilos - DIC Fig. 19.2 Rolagem de linfcitos - Contraste de fase Fig. 23.10 Homing de linfcitos - DIC Fig. 21.5 Clulas precursoras de de neurnios do hipocampo do crebro de embrio de roedor - Contraste de fase + DIC
Fig. 1.1 Dana do queratcito - DIC
Microscpio de fluorescncia
Sondas de fluorescncia
Cell Biology interactive
Fig. 17.7 Fuso mittico / diviso de clula animal Fluorescncia
Tcnica de imunofluorescncia indireta (uso de anticorpos como ferramentas de estudo)
Anticorpos podem ser
acoplados a sondas
fluorescentes
Microscopia de fluorescncia
Microscpio de
contraste de
interferncia diferencial
DIC (Nomarski)
Microscpio confocal
de varrredura a laser
Microscpio de
fluorescncia
Microscpio de
fluorescncia (tcnica
de deconvoluo da
imagem)
Cell Biology interactive
Fig. 13.5 Fagocitose Fluorescncia Fig. 13.6 Exocitose Fluorescncia Fig. 15.1 Sinalizao de clcio / Gap junction Fluorescncia Fig. 17.4 Fuso mittico / diviso de clula animal DIC Fig. 17.6 Fuso mittico / diviso de clulas de embrio de mosca Fluorescncia Fig. 18.1 Apoptose / blebbing de membrana e fragmentao do ncleo - Contraste de fase e fluorescncia
Microscpio ptico confocal de varredura a laser
Microscpio de
fluorescncia
Microscpio confocal
de varrredura a laser
(a) Sperm triple-labeled with FITC-Pisum sativum lectin (acrosome - green); TOTO-3 iodide for
DNA (blue) and Nile red for membrane lipid (red). (b) Complete loss of the acrosome following
spermicidal treatment. Staining as in the image above. (c) Cultured epithelial cells triple
stained for the nucleus (blue), microtubules (green), and actin (red). Images were acquired
with a 20X objective (c) and a 100X objective (d).
Microscopia Confocal de Varredura a Laser
a b
c
d
Imagem Tridimensional
Microscopia Confocal de Varredura a Laser (reconstruo tridimensional de imagens confocais)
Hibridizao in situ de
RNA (Tcnica FISH
Fluorescent in situ
hybridization)
Microscopia de fluorescncia
Nanopartculas
fluorescentes
(quantum dots)
Microscopia de fluorescncia
Tcnica de
deconvoluo de
imagem (material
marcado com sonda
fluorescente que se liga
a DNA)
Microscopia de fluorescncia
Cell Biology interactive
Fig. 25.6 Sinapse imunolgica / apresentao de antgeno Fluorescncia e processamento de imagem
Estrutura de GFP
(protena com
cromforo
autofluorescente ativo)
Gene de GFP acoplado
ao gene ativo em
neurnios de mosca
(Tcnica de DNA
recombinante)
Cell Biology interactive
Fig. 24.3 Listeria nvadindo clula hospedeira Contraste de fase e fluorescncia com marcao de GFP
Fig. 16.5 Dinmica de microtbulos in vivo - Fluorescncia com marcao de GFP Fig. 23.14 Clulas-tronco embrionrias Contraste de fase e fluorescncia com marcao de GFP
Cell Biology interactive
Fig. 10.6 FRAP / marcao com GFP de protenas de membrana de retculo endoplasmtico e de protenas ancoradas na membrana nuclear interna
Cell Biology interactive
Fig. 21.3 Ondas de Ca2+ aps fertilizao de ovos de ourio do mar - Fluorescncia
Cell Biology interactive
Fig. 9.1 Laser tweezer Esquema Fig. 10.1 Laser tweezer / Fluidez de membrana Fig. 23.2 Laser tweezer / estereoclios
Uso de radioistopos como marcadores de clulas
Microscopia ptica de campo claro (Tcnica de autoradiografia pelo uso de radioistopos)
Microscpio eletrnico de transmisso
Microscpio eletrnico de varredura
Microscpio eletrnico de transmisso
Microscopia Eletrnica
Microscopia Eletrnica de Transmisso
Processamento de material para observao ao microscpio
Moldeira para
emblocamento
de material
biolgico em
resina
Agentes qumicos fixadores para processamento de material biolgico para microscopia eletrnica
Agente qumico fixador:
- mata e preserva as
clulas
- fixa estruturas em sua
posio original
- permeabiliza membranas
das clulas para entrada
de novos agentes
qumicos usados no
processamento do
material biolgico
ULTRAMICROTOMIA
CORTES SERIADOS (ultrafinos 50 a 80 nanmetros de espessura)
Grade de suporte para recolher cortes ultrafinos para observao ao MET
Microscopia Eletrnica
Hexagonal 75 mesh
Quadrada 200 mesh
Grades de suporte para recolher cortes ultrafinos
para observao ao MET
Contrastao
Acetato de uranila e citrato de chumbo
CONTRASTAO POSITIVA
Objetivo:
impregnar o material biolgico com metais pesados (Exs.: chumbo - afinidade por
DNA; uranila - afinidade por membrana) para aumentar o contraste da imagem.
Normalmente, a contrastao positiva feita aplicando os agentes contrastantes de
metal pesado diretamente sobre cortes ultrafinos recolhidos em grades de suporte
para MET
Imagem de uma bactria por microscopia eletrnica de transmisso
(contrastao positiva de corte ultrafino)
Mitocndria
Ncleo Complexo de Golgi
Imagem de uma clula eucaritica por microscopia eletrnica de
transmisso (contrastao positiva de corte ultrafino)
Imagem de uma clula
de fungo por
microscopia eletrnica
de transmisso
(contrastao positiva de
corte ultrafino)
Cell Biology interactive
Figs. 4.4 / 4.5 Estrutura do ncleo Microscopia eletrnica de transmisso Figs. 9.2 / 9.3 / 9.4 / 12.8 Clula do fgado Microscopia eletrnica de transmisso Figs. 13.7 / 13.8 Clulas do pncreas - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 12.9 Clula secretora pancretica - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 16.12 Tecido cardaco - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 16.13 Clula muscular cardaca- Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 19.3 Junes entre culas musculares - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 23.11 Epitlio da traquia - Microscopia eletrnica de transmisso Figs. 23.12 / 23.13 Clulas endoteliais do fgado - Microscopia eletrnica de transmisso Figs. 23.4 / 23.5 / 23.6 Epitlio do intestino - Microscopia eletrnica de transmisso Fig. 17.8 Cromossomos mitticos - Microscopia eletrnica de transmisso
Reconstruo tridimensional em microscopia eletrnica de transmisso
a partir de cortes seriados
Mtodos imunocitoqumicos em microscopia eletrnica de transmisso (MET) com a utilizao de
anticorpos acoplados a partculas de ouro coloidal (imunomarcao com ouro coloidal )
Mic
RA GD
GA
Anticorpos podem ser acoplados a esferas de ouro coloidal
(nano partculas eltron densas que variam de 5 a 40
nanmetros de dimetro)
MET
Imunomarcao de protenas por MET pelo uso anticorpos acoplados a esferas de ouro coloidal
Mtodo de preparao da rplica da
superfcie de um espcime (material
biolgico) por sombreamento com metal
Rplica sombreada com metal da
superfcie de um arranjo de protenas
filamentosas em um msculo de inseto
(rplica feita de material congelado
rapidamente em hlio lquido e submetido a
profundo descongelamento) e observada
em MET.
Agente qumico contrastante:
PTA-CIDO FOSFOTUNGSTICO
CONTRASTAO NEGATIVA
- Consiste no envolvimento
de partculas por metais
pesados e de fina
granulao, fornecendo
imagens de fundo escuro e
objeto claro
- Ideal para anlise de
suspenso viral, bactrias
e pureza de fracionamento
celular
Bacterifago
CONTRASTAO NEGATIVA em MET
Vrus da batata;
Vrus da influena Adenovrus
Adenovrus
(estudo de
forma e de
estrutura de
superfcie)
Ultraestrutura de macromolculas
- Macromolculas podem ser
observadas por microscopia
eletrnica de transmisso
atravs da tcnica de
contrastao negativa,
depositadas diretamente nas
grades.
- Sua visualizao depende
da preparao de grades
recobertas com uma fina
camada de carbono para
posterior adsoro das
molculas a serem
analisadas.
Adsoro das macromolculas superfcie das
grades revestidas por material colide,
contrastao negativa e observao ao
Microscpio Eletrnico de Transmisso
Molculas de 2M (nativa, quimiotripsina, plasmina e metilamina. Contrastao por
acetato de uranila. Aumentos - 200.000-600.000x. Delain et al. 1989.
Anlise por MET - Contrastao negativa de protenas
Anlise por MET - Contrastao negativa de filamentos de actina
Bactria endocitada por um macrfago
Bacterifago T4 Msculo estriado de gua-viva
MET
Contrastao
negativa
Contrastao positiva de cortes
ultrafinos
Microscpio eletrnico de varredura - MEV
PROCESSAMENTO DE MATERIAL BIOLGICO PARA
MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA - MERV
Imagem de uma bactria por
microscopia
eletrnica de
varredura (MEV)
Imagens (micrografias)
de estereoclios
de clula do
ouvido interno
Microscopia eletrnica
de varredura - MEV
Microscopia eletrnica
de transmisso - MET
Microscopia ptica DIC
Microscopia Eletrnica de Varredura
Formiga de fogo Lorryia formosa
Embrio de camundongo Diatomcea Pata de Centopia
Microscopia Eletrnica de Varredura
Bactrias aderidas ao arenito por estruturas semelhantes
a pednculos (a) e envolvidas por substncia amorfa -
possivelmente matriz extracelular (a e b, setas).
a
b
Bactria
Pednculo
Matriz extracelular Testemunho 02 (arenito)
TCNICA PARA PROCESASMENTO DE RPLICAS DE
CRIOFRATURA PARA ANLISE AO MICROSCPIO
ELETRNICO
TCNICA PARA
PROCESASMENTO
DE RPLICAS DE
CRIOFRATURA
PARA ANLISE AO
MICROSCPIO
ELETRNICO
Cell Biology interactive
Fig. 12.7 Criofratura de fungo - Microscopia eletrnica de transmisso
CRIOFRATURA
CRIOFRATURA
CRIOFRATURA:
FACE E
(EXTRACELULAR voltada para o meio
Extracelular aps a
fratura)
FACE P
(PROTOPLASMTICA voltada para o
citoplasma/Protoplasma
aps a fratura)
CRIOFRATURA:
MET (tcnica
de
contrastao
positiva) -
corte ultrafino
marcado com
esferas de
ouro coloidal
TOMOGRAFIA EM
MICROSCOPIA
ELETRNICA
Cell Biology interactive
Fig. 12.1 - Tomograma a partir de imagens de microscpio eletrnico de alta voltagem -
Compartimentos celulares / reconstruo tridimensional
Fig. 13.9 Vescula sinptica Tomograma de imagens de microscopia eletrnica de transmisso
Fig. 14.1 Mitocdria Tomograma de imagens de microscopia eletrnica de transmisso
RECONSTRUO DE PARTCULAS POR
TOMOGRAFIA EM MICROSCOPIA
ELETRNICADE MATERIAL CONGELADO