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BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM

2021

für Studierende der Humanmedizin und Zahnmedizin

der Universität des Saarlandes

Fachrichtung

MEDIZINISCHE BIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE

SKRIPT ZU DEN PRÄSENZPRAKTIKA 1 UND 2

Bitte drucken Sie dieses Skript aus und bringen Sie es zu den

jeweiligen Terminen mit. Bitte beantworten Sie vorab schriftlich die

jeweiligen Vorbereitungsfragen.

2

Liebe Studierende der Human- und Zahnmedizin!

Nachdem im Sommersemester 2020 coronabedingt kein Präsenzpraktikum stattfinden konnte,

freuen wir uns, Ihnen in diesem Sommersemester eine reduzierte Version anbieten zu können.

Unter Beachtung der derzeit gültigen Abstands- und Hygieneregeln haben wir für Sie eine

kleine Auswahl praktischer Übungen zusammengestellt, die einige wichtige Methoden im

biochemischen Labor abbilden. Maßgeblich für die Auswahl der angebotenen Präsenz-

Versuche waren folgende Punkte:

- Orientierung an dem bis zum Zeitpunkt des Praktikums präsentierten Vorlesungsstoff

- die im gesetzten zeitlichen Rahmen mögliche Durchführbarkeit durch einen einzelnen

Studenten (Vermeidung von Gruppenarbeit)

- Durchführbarkeit des Versuchs am Laborplatz (Vermeidung von Laufwegen)

Dieses Skript ist in 3 Blöcke eingeteilt:

I. Voraussetzung

Hier finden Sie Regeln zum experimentellen Arbeiten im Labor. Sie müssen diese vor

Beginn der praktischen Arbeiten lesen und mit Ihrer Unterschrift bestätigen, dass

Sie die darin enthaltene Sicherheitsunterweisung verstanden haben und sich daran

halten werden.

II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2

Im eigentlichen Praktikumsskript finden Sie immer folgende Kapitel:

➔ Theoretische Vorbereitung

Hier finden Sie Empfehlungen zur Vorbereitung und Fragen zur Theorie. Die

Beantwortung der Fragen sind ihre „Hausaufgaben“, die vor Beginn der

Veranstaltung gemacht werden müssen.

➔ Versuchsanleitung

Die Versuchsanleitung sollten sie vor Beginn der praktischen Arbeiten

vollständig durchlesen. Hier finden sie eine Schilderung des Versuchsprinzips, das

„Rezept“ für die Durchführung des Versuches und Vorgaben zur Auswertung der

im Experiment erhaltenen Rohdaten.

Blockpfeile an der linken Seite sollen Ihnen in diesem Teil helfen, die erforderlichen

Arbeitsaufträge zum jeweiligen Praktikum zu finden.

III. Anhang

Hier finden Sie eine Zusammenstellung von Einheiten, Gesetzmäßigkeiten und

Rechenwegen, die Sie zur erfolgreichen Durchführung des Praktikums benötigen und

die Ihnen die Auswertung erleichtern sollen. Dieses Kapitel enthält sowohl

Anleitungen für die Auswertung der Präsenzpraktika als auch der online –

Praktika.

3

Sie werden in diesem Praktikum Methoden durchführen, die für die Analytik von Proteinen

eingesetzt werden bzw. Proteine als Werkzeug für den Nachweis bestimmter Parameter

nutzen; die Auswahl der Versuche orientiert sich an der Relevanz für das medizinisch-

diagnostische Labor. Sie lernen einen Teil der Reaktionen kennen, die hinter den Werten eines

Laborberichts stehen und die mittlerweile in automatisierten Abläufen gewonnen werden. Wir

wollen Ihnen mit dieser Auswahl einen Eindruck vom Arbeiten im biochemischen Labor

vermitteln und darüber hinaus die dazugehörige Theorie etwas anschaulicher gestalten.

Konkret lernen sie eine Methode der Proteinbestimmung kennen wie sie für die Bestimmung

des Gesamtproteingehalts im Serum herangezogen werden kann und die Aussagen über eine

Dysproteinämie zulässt (Praktikum 1). Diese quantitative Bestimmung wird im Praktikum 2

ergänzt durch die Auftrennung des Gesamtserumproteins in seine verschiedenen

Untergruppen, eine gängige Labormethode, um z.B. Hinweise auf entzündliche Prozesse,

Funktionstüchtigkeit der Leber, Defekte im Immunsystem oder Tumoren zu erhalten. Eine

wichtige Gruppe der Proteine unseres Organismus sind die Enzyme, die katalytische Aktivität

entfalten und Stoffwechsel überhaupt erst ermöglichen. Im Praktikum 1 wird die alkalische

Phosphatase im Mittelpunkt stehen, ein Enzym, das bei Erkrankungen der Leber und der

Gallenwege sowie für Veränderungen des Knochenstoffwechsels als Marker dient. Sie lernen

mit diesem Enzym grundlegende Charakteristika einer enzymatischen Reaktion kennen.

Enzyme werden in der medizinischen Diagnostik auch zum sensitiven und spezifischen

Nachweis ihrer Substrate benutzt. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität erfolgt in

photometrischen Messungen, die unter geeigneten Bedingungen mit Hilfe des Lambert-

Beerschen Gesetzes eine Berechnung einer unbekannten Konzentration erlauben. Sie

werden solche enzymatischen Verfahren anhand der Bestimmung der Glucose- und

Cholesterinkonzentration des Serums im Praktikum 2 kennenlernen.

Wir freuen uns auf eine angenehme Zusammenarbeit und wünschen Ihnen viel Erfolg!

Die Dozent*innen der Medizinischen Biochemie und Molekularbiologie

4

INHALTSVERZEICHNIS

Seite

I. Voraussetzung 4

1. Experimentelles Arbeiten im biochemischen Labor 4

1.1. Sicherheitsunterweisung 4

1.2. Erforderliche Materialien 6

1.3. Weitere Regeln für das Arbeiten im Labor 6

1.4. Handhabungshinweise für Pipetten 7

1.5. Vor Beginn des Praktikums 8

II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2 9

1. Praktikum 1 9

1.1. Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode 10

1.2. Enzyme als Biokatalysatoren – Alkalische Phosphatase 18

2. Praktikum 2 25

2.1. Elektrophoretische Trennung der Serumproteine 26

2.2. Bestimmung von Cholesterin im Serum 33

2.3. Bestimmung von Glucose im Serum 38

III. Anhang 44

1. Rechnen im Biochemischem Praktikum 44

1.1. Physikalische Größen und Einheiten 44

1.2. Stoffmengen und Konzentrationen 46

1.3. Mischen von Lösungen, das Mischungskreuz 49

1.4. Grundlegende statistische Verfahren 51

1.5. Lineare Regression und Korrelationskoeffizient 53

1.6. Wichtige Gleichungen, Herleitungen und Umformung von

Gleichungen

57

1.6.1. Massenwirkungsgesetz und Henderson-Hasselbalch-Gleichung 57

1.6.2. Das Lambert-Beersche Gesetz 60

5

I. Voraussetzung

1. EXPERIMENTELLES ARBEITEN IM BIOCHEMISCHEN LABOR

Dieses Kapitel ist vor der Durchführung des ersten Praktikums zu lesen. Sie müssen

mit Ihrer Unterschrift bestätigen, dass Sie die Sicherheitsunterweisung verstanden

haben und sich daran halten werden.

1.1. Sicherheitsunterweisung (Laborordnung)

1. Den Anweisungen der Lehrkräfte ist unbedingt Folge zu leisten.

2. Während der praktischen Übungen sind Arbeitsmäntel und geschlossene Schuhe zu

tragen.

3. Während der praktischen Übung nicht getragene Kleidungsstücke sind außerhalb des

Praktikumssaals aufzubewahren.

4. Es ist verboten, im Praktikumssaal zu rauchen, zu essen und zu trinken.

5. Die Versuche sind so durchzuführen, dass niemand gefährdet wird.

6. Beim Arbeiten mit konzentrierten Säuren, konzentrierten Laugen und anderen

ätzenden Substanzen ist - auch von Brillenträgern - eine Schutzbrille zu tragen.

7. Vor der Benutzung von leicht brennbaren Flüssigkeiten sind - auch auf benachbarten

Arbeitsplätzen - die Flammen zu löschen.

8. Allgemein zugängliche Geräte wie Photometer, pH-Elektroden, O2-Elektroden,

Zentrifugen, Waagen, Elektrophoresegeräte, Homogenisatoren und Trockenschränke,

sind mit besonderer Sorgfalt zu benutzen.

9. Die Arbeitsplätze, die Arbeitsgeräte und die Ablaufbecken sind nach jeder praktischen

Übung zu reinigen. Benutzte Glaswaren sind in Spülkörbe einzuräumen.

10. Es ist darauf zu achten, dass Wasser, Gas und elektrischer Strom nicht verschwendet

werden.

6

11. Nicht mehr gebrauchte Chemikalien und Chemikaliengemische, die nicht in das

Abwasser gelangen dürfen, sind in bereitstehende Sammelgefäße zu bringen (siehe

Entsorgungshinweise).

12. Unfälle sind der zuständigen Lehrkraft sofort zu melden.

13. Praktikumsteilnehmer haften für die durch sie beschädigten oder zerstörten Geräte.

14. Den Maßnahmen des aktuellen Hygienekonzepts ist unbedingt Folge zu leisten.

Dieses wird in der Sicherheitsbelehrung vorgestellt und liegt in Schriftform im

Praktikumsraum aus.

15. Zuwiderhandlungen gegen diese Ordnung haben den Ausschluss aus der betreffenden

praktischen Übung zur Folge. Das entsprechende Testat wird in diesem Falle nicht

erteilt.

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1.2. Erforderliche Materialien

Zu den Präsenzpraktika sollten die Praktikumsteilnehmer mitbringen:

1. Schutzkleidung (Kittel)

2. Schutzbrille

3. Schreibzeug, Lineal

4. Taschenrechner

5. 1 wasserfester Folienschreiber

6. Schere und Pinzette

7. Klebestift

Ohne Schutzbrille und Schutzkleidung (Kittel) kann nicht an der Praktikumsveranstaltung

teilgenommen werden.

1.3. Weitere Regeln für das Arbeiten im Labor

Unter Berücksichtigung des Hygienekonzeptes sind alle Laufwege innerhalb des

Praktikumsraumes zu vermeiden. Sie finden alles, was sie für die Durchführung der

Versuche benötigen, an Ihrem zugewiesenen Arbeitsplatz. Sollte dies nicht der Fall sein,

melden sie sich bei Ihrem Betreuer.

- „Richtiges Pipettieren“ beachten (siehe folgende Seite).

- Infektiöse Materialien bitte direkt entsorgen!!!!!! Gelbe Behälter

- Anweisung zur Entsorgung von Chemikalien beachten!!!!

- Reaktionsgefäße (Eppendorfgefäße oder „Eppis“), Reagenzgläser immer beschriften.

- Beschriftung von Materialien, die gespült werden, bitte entfernen!!! An jedem Platz

stehen Behälter für die zu spülenden Waren.

- Abfallbeutel finden Sie an Ihrem Platz.

- Für Glasabfall steht ein gesonderter Sammelbehälter zur Verfügung.

8

1.4. Handhabungshinweise für Pipetten

Eine wichtige Voraussetzung für gutes Gelingen aller Versuche:

Richtiges Pipettieren

Sehr häufig müssen kleine Volumina im Bereich weniger Mikroliter (µl) abgemessen werden.

Dies gelingt am sichersten mit mechanischen Pipettierhilfen, z.B. sogenannten Gilson-

Pipetten, wie hier im Praktikum verwendet.

Beachten Sie die folgenden Regeln und üben Sie den Umgang mit den Pipetten vor dem

Versuch.

1. Niemals das Aufsetzen der Pipettenspitze vergessen!

Druckknopf außerhalb der Flüssigkeit bis zum ersten Druckpunkt niederdrücken.

Pipettenspitze einige Millimeter in die Flüssigkeit eintauchen.

Druckknopf immer langsam in die Ausgangsstellung zurückkommen lassen. Während

dieses „Ansaugens“ der Flüssigkeit die Pipettenspitze immer in der Flüssigkeit belassen.

– Bei größeren Volumina (z.B. 1 ml) muss die Pipettenspitze dem sinkenden

Flüssigkeitsspiegel nachgeführt werden.

Auf der Außenfläche der Pipettenspitze evtl. haftende Flüssigkeitstropfen abwischen!

2. Zum Entleeren der Pipette die Spitze an der Innenwand des Aufnahmegefäßes

Anlegen und den Druckknopf über den ersten Druckpunkt hinaus langsam bis zum

Anschlag niederdrücken.

Pipette nach vollständiger Entleerung zurückziehen und Druckknopf erst loslassen, wenn

sich die Pipettenspitze wieder in der Luft befindet!

3. Pipettenspitze abwerfen!

Achtung!! Neue Spitze für jedes Reagenz!!

Ebenso nach Berührung unterschiedlicher Lösungen mit der Spitze.

4. Niemals Pipetten mit gefüllter Spitze waagerecht halten oder hinlegen!

Pipetten nicht werfen oder fallen lassen, da das Innere aus Glas besteht und deshalb leicht

zerbrechlich ist

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1.5. Vor Beginn des Praktikums

Checkliste

Sicherheitsunterweisung gelesen und verstanden

Mitzubringende Materialien (siehe S. 6) eingepackt

Regeln für das Arbeiten im Labor und Handhabungsweise für Pipetten gelesen

Komplette Anleitung für das aktuelle Präsenzpraktikum durchgearbeitet

Theoretische Fragen zum aktuellen Praktikum schriftlich beantwortet

Notwendige Vorarbeiten für die Durchführung (z.B. Ausfüllen von Pipettierschemata) erledigt

10

II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2

1. PRAKTIKUM 1

09.04.2021 (Zahnmediziner); 12.04.2021-23.04.2021 (Humanmediziner)

1.1. PROTEINBESTIMMUNG NACH DER BIURET-METHODE

1.2. ENZYME ALS BIOKATALYSATOREN – ALKALISCHE PHOSPHATASE

Ablaufplan:

Inhalt Aufgaben

Vorbesprechung Sicherheitsbelehrung

Theorie des Versuchs

Einweisung zum

Gebrauch von Pipetten

und Photometer durch

die Assistenten

Einstellen von vorgegebenen Volumina durch die

Studenten; Kontrolle der Einstellung durch

Assistenten

Proteinbestimmung Pipettieren von Standards und bereitgestellten

Proben unbekannter Konzentration

Messung der Extinktion

Erstellen der Eichgerade

Enzymkinetik Pipettieren der Ansätze mit 5 zur Verfügung

gestellten Substratlösungen unterschiedlicher

Konzentration; Aufnahme der Enzymkinetik am

Photometer

Nachbesprechung Besprechung der Auswertung

Blockpfeile kennzeichnen Arbeitsaufträge. Die Fragen zu den theoretischen Grundlagen sind

vor Praktikumsbeginn zu beantworten.

11

1.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH DER BIURET-METHODE

Theoretische Vorbereitung

Löffler/Petrides/Heinrich 9. Auflage: Kapitel 1, 3, 4, 5

Vorlesung: Funktionelle Biochemie

Fragen zu den theoretischen Grundlagen:

1. Erklären Sie den Aufbau eines Proteins (Grundbausteine, Peptidbindung, Hierarchie

der Proteinstruktur).

2. Welche Aufgaben haben Proteine?

Wieso? - Weshalb? - Warum?

Im Praktikum 1.1. geht es darum einen wichtigen klinischen Laborparameter zu

bestimmen, die Protein- oder Eiweißkonzentration, wie sie z.B. im klinischen Labor

routinemäßig für Serum oder Plasma ermittelt wird und in Kombination mit der Serum- bzw.

Plasmaelektrophorese (Präsenzpraktikum 2) die Diagnose von Dysproteinämien

ermöglicht.

Im Rahmen dieses Versuches erhalten Sie eine Einführung in die Photometrie als eine

einfache, sehr empfindliche und sehr genaue Messmethode, die in allen klinischen und

biochemischen Laboratorien für zahlreiche Bestimmungen angewendet wird

12

3. Erläutern Sie den Begriff „optischer Test“

4. Nennen Sie das Lambert-Beersche Gesetz, definieren Sie die Größen und ordnen Sie

diesen die passenden Dimensionen (Einheiten) zu.

5. Erläutern Sie die Bedeutung der Protein- oder Eiweißbestimmung in der klinischen

Chemie. Wie hoch ist der Normwert für den Serumproteingehalt und durch welche

Erkrankungen kann er beeinflusst werden?

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Versuchsanleitung

Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!

Versuchsprinzip

Zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen wird die Biuret-Reaktion

verwendet. Sie hat ihren Namen von der Reaktion zwischen Biuret (bildet sich beim Erhitzen

von festem Harnstoff unter NH3-Abspaltung) und Cu

2+-Ionen in alkalischer Lösung. Dabei

entsteht eine anionische, violette Komplexverbindung. Entsprechende violette Cu2+-Komplexe

werden von allen Substanzen mit mindestens 2 Peptidbindungen gebildet (Abb. 1). Ammoniak,

Harnstoff, Harnsäure, Kreatinin, Aminosäuren und Dipeptide geben keine Biuret-Reaktion.

Abb.1: Cu(II)-Protein-Komplex

Die Farbintensität ist der Zahl der Peptid-Bindungen und damit auch der Proteinkonzentration

proportional. Das Lambert-Beersche Gesetz

E = .c.d

(E = Extinktion, = molarer Extinktionskoeffizient, c = Konzentration, d = Schichtdicke der

Küvette) ist somit anwendbar. Die Biuret - Methode ist wegen ihrer Einfachheit und hohen

Spezifität von besonderer Bedeutung für quantitative Bestimmungen von Proteinen. In diesem

Versuch bestimmen sie die Proteinkonzentration einer zur Verfügung gestellten Serumprobe

mit Hilfe von Eichlösungen bekannter Konzentration.

Zur Bedeutung und zum Umgang mit dem Lambert-Beerschen Gesetz lesen Sie bitte

den Absatz „Das Lambert-Beersche Gesetz“ im Anhang.

Cu2+

14

Vorbereitung:

Üben Sie das Pipettieren mit den am Platz stehenden Pipetten. Stellen Sie nach Vorgabe

unterschiedliche Volumina ein und pipettieren Sie unterschiedliche Mengen einer Flüssigkeit

(Wasser) in unterschiedliche Behältnisse („Eppis“, Reagenzgläser).

Vervollständigen Sie das Pipettierschema für die praktische Durchführung.

Proteinstandardlösung und NaCl Lösung sollen zusammen jeweils 1 ml ergeben!

Ansatz

Nr.

Proteinmenge

[mg]

Probe

[ml]

Proteinstandard

5 mg/ml

[ml]

NaCl

[ml]

Biuret-

Reagenz

[ml]

Extinktion

E546nm

Für die Eichwerte:

1

Leerwert

0 - 2.5

2 1 - 2.5

3 2 - 2.5

4 3 - 2.5

5 4 - 2.5

6 5 - 2.5

Für die Analyse der Serumprobe mit unbekannter Konzentration (Dreifachansatz):

7 ? 1 - - 2.5

8 ? 1 - - 2.5

9 ? 1 - - 2.5

Praktische Durchführung:

Die Proteinkonzentration einer Serumprobe mit unbekannter Konzentration soll bestimmt

werden. Die Serumprobe wurde vorab 20fach verdünnt. Bedenken Sie dies bei der

Berechnung der Konzentration.

1. Pipettieren Sie nach obigem Pipettierschema die Proteinstandardlösungen sowie den

Dreifachansatz der Probe unbekannter Konzentration in Plastikröhrchen zusammen.

Mischen Sie zunächst für alle Proben NaCl- und Proteinlösung. Zuletzt fügen Sie allen

15

Proben das Biuretreagenz mit Hilfe einer Stabpipette hinzu. Verschließen sie das

Röhrchen mit Parafilm und mischen Sie den Ansatz sorgfältig!!

2. Nach dem Pipettieren in Röhrchen und Mischen wird die Reaktionszeit von 15 min

abgewartet.

3. Pipettieren Sie 1 ml des gesamten Ansatzes in Küvetten

4. Mit der ersten (Leerwert)-Probe (Ansatz 1) wird am Photometer der Nullwert eingestellt.

Dann werden sukzessiv die Extinktionen der Ansätze bei 546 nm gemessen. Nicht

vergessen: Deckel des Photometers vor jedem Ablesen schließen!

5. Die genaue Anleitung zur Durchführung der photometrischen Messung befindet

sich an Ihrem Platz!

6. Die Extinktion (Absorption) wird im Display angezeigt. Ablesen und in die obige Tabelle

übertragen.

Entsorgung:

Die Küvetteninhalte sind in an Ihrem Platz bereitstehende Gefäße zu gießen, die

entleerten Küvetten in Abfallbeutel zu entsorgen.

Auswertung:

Tipps zur Auswertung und Beispiel im Anhang, S. 56 („Rechnen im

Biochemischen Praktikum“).

1. Erstellen Sie die Eichkurve für 0, 1, 2, 3, 4 und 5 mg Protein; nutzen Sie das unten

eingefügte Millimeterpapier (formatfüllende Auftragung!). Auf der X-Achse wird die

Konzentration der Lösungen abgetragen, auf der Y-Achse die Extinktion bei 546 nm.

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2. Legen Sie eine Bestgerade durch die Punkteschar; diese muss auf jeden Fall durch

den Nullpunkt gehen. Die Proteinkonzentration der Serumprobe soll einerseits aus der

Eichkurve abgelesen werden, andererseits mit Hilfe der Geradengleichung

rechnerisch bestimmt werden.

Vorgehensweise zum Erstellen eines aussagekräftigen Diagramms:

- Beschriftung der x-Achse und der y-Achse mit entsprechendem Achsentitel und

passenden Einheiten

- Bestimmen Sie den jeweils kleinsten und größten x- bzw. y-Wert.

- Nutzen sie zur Auftragung der Werte das gesamte Millimeterpapier (formatfüllende

Auftragung), d.h. Null liegt im Schnittpunkt von x- und y-Achse, der größte x- bzw. y-

Wert wird so weit entfernt wie möglich vom Nullpunkt an der entsprechenden Achse

abgetragen.

- Teilen sie die Werte dazwischen entsprechend ein.

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Die Geradengleichung zur Berechnung der Konzentration der unbekannten Probe lautet:

y = m ∙ x + b

y = E (Extinktion); x = c (Konzentration); b = 0;

m = Steigung =

12

12

cc

EE

x

y

-

-

D

D=

18

3. Wie hoch ist die Proteinkonzentration in mg/ml in der verdünnten Serumprobe? Geben

Sie den Wert in mg/ml und mmol/ml an.

(Legen Sie die Molmasse von Albumin (= 65 000 Dalton) zugrunde.)

abgelesen:

errechnet:

4. Stimmt der Wert mit der Normproteinkonzentration im Serum überein? Bedenken Sie

bei der Berechnung dieser Konzentration, dass die Serumprobe für die Messung

20fach verdünnt wurde.

5. Berechnen Sie, wie viel Gramm Albumin in einem ml einer 0,25 µM Lösung enthalten

sind (Molmasse von Albumin: 65 000 Dalton) (siehe auch: III. Anhang, 1.2.

Stoffmengen und Konzentrationen).

Chemikalien und Lösungen:

1. Biuret-Reagenz: 0.3% (w/v) CuSO4, 0.9% (w/v) K-Na-Tartrat + 0.2% (w/v) KI in 0.2 M

NaOH

2. Standard-Proteinlösung: 5 mg Rinderserumalbumin/ml 0.9% (w/v) NaCl-Lösung

3. Serumprobe mit unbekannter Konzentration zur Proteinbestimmung

4. NaCl-Lösung 0.9% (w/v)

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1.2 ENZYME ALS BIOKATALYSATOREN – ALKALISCHE PHOSPHATASE


Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 7 - 9, S. 101 –

129



Was ist ein Enzym, wie ist es aufgebaut (typische funktionelle Einheiten) und welche Wirkung

hat es auf Stoffwechselreaktionen?

Wieso? – Weshalb? – Warum?

Enzyme sind wichtige Werkzeuge des Stoffwechsels. Ohne sie ist Leben – so wie wir es

kennen – nicht denkbar. Das teilweise oder vollständige Fehlen eines Enzyms führt häufig

zu mehr oder minder schweren Defekten, die sogar tödlich verlaufen können. Enzyme sind

ebenfalls wichtige Werkzeuge der Forschung und der medizinischen Diagnostik. Sie

sind dort selbst Gegenstand der Analytik (z.B. Nachweis von Enzymen bei der

Leberfunktions- oder Herzinfarktdiagnostik) oder ermöglichen den sensitiven und

spezifischen Nachweis von Stoffwechselmetaboliten (z.B. Nachweis von Glucose in Serum

und Urin, Nachweis von Cholesterin, siehe Praktikum 2). Um Enzyme sinnvoll und effizient

in der Diagnostik einsetzen zu können, müssen optimale Versuchsbedingungen (z.B.

optimaler pH-Wert, optimale Substratkonzentrationen) geschaffen werden. Dies soll

beispielhaft an der Bestimmung der Abhängigkeit der Umsatzgeschwindigkeit von der

Substratkonzentration (Kinetik) für die alkalische Phosphatase erarbeitet werden.

20

Was versteht man unter einer Enzymkinetik und beschreiben sie zwei Arten der Darstellung

(mathematische Formel, graphische Darstellungen). Was besagen die beiden Kenngrößen

vmax und km? Welche Einheiten haben diese und wo in der o.g. graphischen Darstellung kann

man sie ablesen?

Welche Arten der Hemmung eines Enzyms gibt es (nennen sie mindestens 2)? Wie verändern

sich vmax und km?

Nennen sie Hemmstoffe von Enzymen, die klinisch z.B. zur Krebsbehandlung oder

zur Schmerzbehandlung eingesetzt werden. (2 Beispiele)

21

In welche Hauptgruppe der Enzyme gehört die im Praktikum benutzte alkalische

Phosphatase? Warum spielt dieses Enzym in der medizinischen Diagnostik eine Rolle?

Versuchsanleitung


Versuchsprinzip

Proteinkinasen und ihre Gegenspieler die Phosphatasen sind an der Regulation zahlreicher

biochemischer Vorgänge beteiligt. Sie übertragen in aller Regel eine Phosphatgruppe von

einem ATP Molekül auf ein Substrat (Proteinkinasen) oder entfernen ein Phosphat von einem

Substrat (Phosphatasen). Die meisten Phosphatasen sind sehr unspezifische Enzyme, welche

die Hydrolyse von Phosphorsäureestern katalysieren (Gleichung (1)).

(1) R-O-PO3H2 + H2O R-OH + H3PO4

Die im Versuch benutzte alkalische Phosphatase ist ein Zink-haltiges Enzym. Sie katalysiert

die Übertragung der Phosphatgruppe des Substrats auf Wasser oder auch auf andere

Substrate. Im Versuch dient p-Nitrophenyl-phosphat (p-NPP) als synthetisches Substrat, das

entsprechend Gleichung (2) gespalten wird.

(2)

22

Das dabei entstehende p-Nitrophenol hat in alkalischer Lösung ein Absorptionsmaximum bei

405 nm, dessen Zunahme photometrisch verfolgt werden kann. Die Bildung des gelb

gefärbten Substrats ist zu Beginn der Reaktion proportional der Geschwindigkeit und damit

der Aktivität des Enzyms.

Da die Reaktionsgeschwindigkeit in der Regel nicht über längere Zeit konstant ist, extrapoliert

man die in den ersten Minuten nach dem Start der Reaktion gemessenen Werte auf die

Anfangs- oder Initialgeschwindigkeit. Nur in diesem Bereich ist eine Anwendung des

Lambert-Beerschen Gesetzes zulässig (siehe unten).

Der Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Lambert-Beerschen

Gesetz ist in Gleichungen (3) und (4) dargestellt:

(3) E = ∙ c ∙ d

(4)

𝒗 =𝜟𝑺

𝜟𝒕=

𝟏

𝜺 ⋅ 𝒅⋅𝜟𝑬

𝜟𝒕

Aus der Bestimmung von E/t (Extinktionsänderung pro Zeit) lässt sich daher über das

Lambert-Beersche Gesetz leicht der Umsatz/Zeit (S/t in [µmol/min]) und damit die

Geschwindigkeit v oder Aktivität des Enzyms berechnen.( und d sind feste Größen).

Als Substrat für die alkalische Phosphatase wird p-Nitrophenylphosphat (NPP) verwendet, bei

dessen Hydrolyse p-Nitrophenol entsteht. Zur Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit wird

die photometrische Messung des entstehenden p-Nitrophenolat-Anions bei 405 nm

herangezogen. Zur Aufnahme der Kinetik werden Messungen mit Substratlösungen mit 5

unterschiedlichen Konzentrationen an NPP durchgeführt.

Vorbereitung:

Pipettierschema zur Herstellung der unterschiedlich konzentrierten Enzym-Substratlösungen:

Vervollständigen Sie das untenstehende Pipettierschema. Gehen Sie bei der Herstellung der

unterschiedlich konzentrierten Substrat-Puffer-Gemische von 1 ml Gesamtvolumen aus! Die

Substratstammlösung ist 0,05 mM.

0,005 mM 0,01 mM 0,015 mM 0,03 mM 0,05 mM

NPP-

Substratlsg.

[ml]

Pufferlsg.

[ml]

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Praktische Durchführung - Aufnahme einer Enzymkinetik

1. Setzen Sie nach dem obigen Pipettierschema die jeweilige Substrat-Puffer-

Gemische (1 ml) in Reaktionsgefäßen an.

2. Überführen Sie davon 990 µl in Halbmikroküvetten.

3. Stellen Sie mit Hilfe der ausgelegten Bedienungsanleitung für das Photometer das

passende Kinetikprogramm für die Messung ein.

4. Führen sie die Messung durch wie in der ausgelegten Anleitung beschrieben.

5. Führen Sie die Messung mit allen Ansätzen durch. Die Umsatzgeschwindigkeiten

werden ausgehend von der niedrigsten bis zur höchsten Substratkonzentration

bestimmt.

6. Tragen sie die Extinktionsänderung/Zeit (E/min) in die untenstehende Tabelle ein

Tragen sie hier die gemessenen Extinktionsänderungen ein:

[NPP] 0,005 mM 0,01 mM 0,015 mM 0,03 mM 0,05 mM

E/min

24

Auswertung

Berechnen Sie aus den gefundenen Extinktionsänderungen die Aktivität bzw. Geschwindigkeit

des Enzyms. Berechnen Sie 1/v und 1/[S] (mM

für p-Nitrophenol bei 405 nm: 18.5 µmol-1

∙cm2).

(Formel ist im Tabellenkopf angegeben.)

Rechnen Sie die jeweiligen Substratkonzentrationen für die graphische Darstellung in

µM um.

[S]

[µM]

1/[S]

[1/µM]

E/min

Aktivität v

E/min

18.5 x 1

[µmol/min]

1/v

[min/µmol]

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Bestimmen Sie den vmax und den KM-Wert durch Auftragung der errechneten Werte nach

Lineweaver-Burk.

Denken sie bei der Darstellung des Diagramms an die Tipps von Seite 15!


1. Pufferlösung pH 8

2. Substratlösung 0,05 mM

3. Alkalische Phosphatase

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PRAKTIKUM 2

10.05.2021 (Zahnmediziner); 15.04.2021-07.05.2021 (Humanmediziner)

2.1. ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG DER SERUMPROTEINE

2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM SERUM

2.3. BESTIMMUNG VON GLUCOSE IM SERUM

Ablaufplan:

Inhalt Aufgaben

Vorbesprechung Theorie des Versuchs

Serumelektrophorese 1 Vorbereitung der Elektrophorese; Überführung

bereitgestellter Seren auf die

Celluloseacetatfolie; Starten der Elektrophorese

durch die Assistenten

Cholesterinbestimmung

im Serum

Pipettieren von Standards und bereitgestellten

Serumproben


Berechnen der unbekannten Konzentration

Serumelektrophorese 2 Entnahme der Celluloseacetatfolie aus der

Elektrophoresekammer; Anfärbung der

getrennten Proteine; Elution des an die Proteine

gebundenen Farbstoffs und Bestimmung der

Konzentration durch photometrische Messung

Glucosebestimmung im

Serum

Pipettieren von Standards und bereitgestellten

Serumproben


Berechnen der unbekannten Konzentration

Nachbesprechung Besprechung der Auswertung

Blockpfeile kennzeichnen Arbeitsaufträge. Die Fragen zu den theoretischen Grundlagen sind

vor Praktikumsbeginn zu beantworten.

27

2.1. ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG DER SERUMPROTEINE


Das Blutplasma (das ist der nicht korpuskuläre Anteil des Blutes) enthält 7 bis 8.5 Gewicht%

Eiweiß, das ein Gemisch von ca. 90 verschiedenen Proteinen von unterschiedlicher

Konzentration und Funktion darstellt. Einige wichtige Proteine oder Proteingruppen und einige

wichtige Funktionen sind: Albumin (Transport, Osmose), Immunglobuline (Abwehr),

Lipoproteine (Transport), Fibrinogen (Vorstufe eines Gerüstproteins für die Blutgerinnung),

Transferrin (Transport), Antitrypsin (Protease-Hemmstoff), Enzyme und Vorstufen für Enzyme

(Katalyse), Hormone (Regulation). Für die Diagnostik ist die Bestimmung der Konzentration

einzelner Proteine oder Proteingruppen von Bedeutung. Die Konzentration der Serum- und

Plasmaproteine gibt einen ersten Hinweis auf vorliegende Erkrankungen. Bei der Vielzahl

und der Ähnlichkeit der physikalischen und chemischen Eigenschaften verbietet sich wegen

des großen Aufwands die Reindarstellung (Isolierung) und meist auch der spezifische

Nachweis. In solchen Fällen wird ein Trennverfahren (hier die Elektrophorese) mit einem

Gruppennachweis (hier ein Färbereagenz für alle Proteine) kombiniert.


Löffler/Petrides/Heinrich 9. Auflage: Kapitel 67


Video zur Serumelektrophorese: https://www.youtube.com/watch?v=z2D7ZkT3aOo


Erläutern Sie das Prinzip der Elektrophorese. Welche Faktoren beeinflussen die

Auftrennung von Proteinen?

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Welche Aufgaben haben die Plasmaproteine? Nennen sie von jeder Fraktion mindestens

2 Vertreter mit ihren Funktionen. Wie unterscheiden sich Serum und Plasma?

Erläutern Sie die Begriffe „Dysproteinämie, Hyperproteinämie, Hypoproteinämie,

Paraproteinämie“. Welchen Parameter benötigt die Ärztin/der Arzt zusätzlich zum Ergebnis

der Plasma- bzw. Serumelektrophorese zwingend für die Diagnose einer Dysproteinämie?

29

Wie ändert sich die Zusammensetzung der Plasmaproteine bei

1. akuter Entzündung, 2. chronischer Entzündung, 3. Leberzirrhose?

Skizzieren Sie schematisch die zu erwartenden Elektropherogramme im Vergleich zum Serum

eines gesunden Menschen.

30

Versuchsanleitung


Versuchsprinzip:

Die elektrophoretische Auftrennung der Serum- bzw. Plasmaproteine wird routinemäßig für

diagnostische Zwecke herangezogen.

Die Tatsache, dass sich geladene Teilchen in einem elektrischen Feld in Richtung auf die

entgegengesetzt geladene Elektrode bewegen (Elektrophorese), wird zur Charakterisierung

und Trennung von Proteinen verwendet. Wanderungsrichtung und -geschwindigkeit hängen

von der elektrischen Ladung, der Größe der Proteinteilchen sowie von äußeren Bedingungen

wie pH-Wert, Ionenstärke, Art des Puffers und Temperatur ab.

Die hier durchgeführte Elektrophorese auf Celluloseacetatfolie wird auch im Kliniklaboratorium

bei der Untersuchung der Protein-Muster von Plasma, Serum, Liquor und Biopsieproben

eingesetzt. Sie ist vielseitig anwendbar und kann in Kombination mit enzymatischen

Untersuchungen auch zur Erfassung des Isoenzymmusters verwendet werden. Die

routinemäßig durchgeführte elektrophoretische Auftrennung des Blutserums Gesunder ergibt

mindestens 5 Fraktionen: Albumine, 1-Globuline,

2-Globuline, ß-Globuline und -Globuline

(siehe untenstehende Abbildung).

Zur Sichtbarmachung der getrennten Proteinfraktionen (Proteinbanden) mit proteinfärbenden

Farbstoffen dienen in der Regel Amidoschwarz, Bromphenolblau, Coomassie-Blau oder

Ponceaurot. Für die quantitative Auswertung müssen die Farbstoffgehalte proportional dem

Proteingehalt einer Bande sein. Die quantitative Auswertung der angefärbten Proteinbanden

erfolgt meistens durch eine direkte photometrische Analyse. Man erhält dann die relativen

Konzentrationen. Man kann auch, wie in unserem Fall, die relativen Konzentrationen der

angefärbten Proteinfraktionen durch separate Extinktionsmessungen der aus den einzelnen

Proteinbanden erhaltenen Eluate ermitteln.

31

Abb.: Elektrophoretische Trennung der Serumproteine

In diesem Praktikum sollen die elektrophoretische Auftrennung in Proteingruppen und deren

prozentualer Anteil am Gesamtserumprotein eines gesunden oder kranken Probanden

bestimmt werden. Das Gesamtprotein wurde im Praktikum 1 quantitativ mit der Biuretmethode

bestimmt und ist integraler Bestandteil der klinischen Bewertung der Plasma- bzw.

Serumelektrophorese.

Praktische Durchführung:

1. Die Celluloseacetatfolie finden sie im Pufferbad. Bitte nehmen sie diese mit Hilfe einer

Pinzette aus dem Puffer und legen Sie den Streifen auf ein Papierhandtuch; streifen

sie die überschüssige Flüssigkeit leicht mit einem Papierhandtuch ab (Achtung: matte

Seite des Streifens muss sichtbar sein (=Trägermaterial), d.h. die abgeschnittene

Ecke rechts oben positionieren (siehe Abbildung unten)). Beschriften Sie den Streifen

mit einem Bleistift (Initialen ihres Namens) am rechten Rand.

Die Streifen dürfen nicht austrocknen!

2. Mit einer Pipette bringt man einen Tropfen (ca. 10 µl) des bereit gestellten Serums

(Bezeichnung notieren!) auf ein Stück Parafilm (Wachsfolie). Nun wird die Doppel-

Lamelle eines Auftragstempels vorsichtig in das Serum eingetaucht und dann zwischen

den Ausstanzungen/Faltkanten (nahe der Ausstanzung/Faltkante auf der rechten

Seite) der Folie leicht aufgedrückt (siehe Abbildung).

Auftragstelle →

32

3. Die Folie wird jetzt mit der Auftragstelle des Serums zum Minuspol in die

Trennkammer eingelegt, beide Enden der Folie müssen im Pufferbad liegen.

Den Deckel der Kammer auflegen und anschließend die Elektroden mit der

Stromquelle (200 V Gleichstrom) verbinden. (60 min Laufzeit).

Unfallverhütungsvorschrift: Das Ein- und Ausschalten des Stroms darf nur von

der Lehrkraft vorgenommen werden.

4. Während der Laufzeit der Elektrophorese führen Sie den Versuch zur

Cholesterinbestimmung (2.2) durch.

5. Bereiten Sie die Röhrchen für die Elution vor (siehe Schritt 8.)

6. Nach 60 min wird der Strom ausgeschaltet, die Folie aus der Kammer

herausgenommen und 3 min in der Färbelösung langsam hin und her bewegt.

7. Dann wird die Folie 3 min im Entfärbebad langsam hin und her bewegt bis nur noch die

rote Farbe der Protein-Fraktionen zu sehen ist.

8. Die angefärbten Protein-Fraktionen werden von dem am besten auswertbaren Streifen

(diese Folie darf nicht austrocknen) direkt sorgfältig ausgeschnitten und jeweils

getrennt in ein vorher beschriftetes Röhrchen gebracht.

9. Man gibt 3 ml Elutionslösung zu.

10. Nach 10minütigem gelegentlichem Schwenken misst man nach Überführen von 1 ml

Eluat in eine Halbmikroküvette die Extinktion der Eluate bei 546 nm gegen die

Elutionslösung (Leerwert). Bitte darauf achten, dass die Folienreste nicht in die Küvette

gelangen.

Richten sie sich bei der photometrischen Messung nach der an ihrem

Platz ausliegenden Anleitung!

33

Auswertung

Ermitteln Sie die Anzahl, die Wanderungsrichtung und die relativen prozentualen Anteile der

elektrophoretisch aufgetrennten Plasma-Proteinfraktionen. Ordnen Sie die getrennten

Proteinbanden nach fallenden Wanderungsgeschwindigkeiten den aus der Literatur

bekannten Fraktionen zu. Bewerten Sie das Ergebnis. Handelt es sich um das Serum einer

gesunden oder kranken Person? Woran könnte diese Person gegebenenfalls leiden?


1. Spezialfolie für Elektrophorese

2. Pufferbad

3. Färbelösung: Ponceaurot in 3% (w/v) Trichloressigsäure (TCA)

4. Entfärbelösung: 5% (v/v) Essigsäure

5. Elutionslösung (NaOH)

6. bereitgestelltes Serum eines gesunden oder kranken Probanden

(es handelt sich nicht um das Serum aus Versuch 1!)

34

2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM SERUM


Cholesterin gehört chemisch gesehen zu den Isoprenlipiden und wird in allen Zellen unseres

Körpers benötigt; es spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung von Gehirnzellen, Nervenzellen

und bestimmten Hormonen. Ein zu hoher Cholesteringehalt im Blut (Hypercholesterinämie) ist

einer der Hauptrisikofaktoren für Erkrankungen der Herzkranzgefäße, in deren Folge es zu

einem Herzinfarkt oder einem Schlaganfall kommen kann. Zusammen stellen diese

Krankheiten die Haupttodesursache in Europa dar. Die Bestimmung des Cholesteringehalts

im Serum, entweder als Gesamtcholesterin wie im folgenden Versuch oder differenziert nach

dem an die Trägerlipoproteine LDL und HDL gebundenen Cholesterin, stellt ein

Standardverfahren im medizinisch-diagnostischen Labor dar.


Vorlesung: Energiestoffwechsel Lipide

Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage, Kapitel 23


Wie hoch sind die Normwerte für den Cholesteringehalt des Serums? Ab welchem Wert spricht

man von einer Hypercholesterinämie?

Schildern Sie die Biosynthese des Cholesterins bis zum aktiven Isopren (danach nur noch

Prinzipien erläutern). Welches ist das regulatorische Enzym der Cholesterinbiosynthese? Wie

erfolgt die Regulation?

35

Wie wird Cholesterin im Blut transportiert? Welche Bedeutung hat in diesem Zusammenhang

das Enzym Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT).

Versuchsanleitung


Versuchsprinzip

Etwa 70% des Cholesterins liegen im Serum als Ester höherer Fettsäuren (überwiegend

Linolsäure) vor. Die Bestimmung des Cholesterins erfolgt mit Hilfe der Cholesterinoxidase (Gl.

(2)) nach Freisetzung des Cholesterins aus seinen Estern mittels der Cholesterinesterase (Gl.

(1)). Wasserstoffperoxid bildet mit Phenol und 4-Amino-phenazon einen roten Farbstoff (Gl.

(3)), der photometrisch erfasst wird.

36

Cholesterinesterase

(1) Cholesterinester + H2O Cholesterin + Fettsäure

z.B.:

Palmitoyl-Cholesterin Cholesterin Palmitinsäure

Cholesterinoxidase

(2) Cholesterin + O2 4-Cholestenon + H2O2

Peroxidase

(3) 2 H2O2 + 4-Aminophenazon + Phenol 4-(p-Benzochinon-

monoimino)-phenazon + 4 H2O

Praktische Durchführung

Das Gesamtcholesterin des Serums wird mit Hilfe nachfolgender Vorschrift bestimmt:

1. Verwenden Sie die Serumproben (A, B), die für Sie am Arbeitsplatz bereitstehen.

2. Pipettieren sie die Proben nach folgendem Schema. Vergessen Sie nicht die Ansätze

gut zu durchmischen!

37

Angaben pro Reaktion; insgesamt 4 Reaktionen (1 Leerwert, 2 Serumproben,

1 Standard) ansetzen:

Leerwert

Probe

Standard

Serumprobe (A, B) − 0,01 ml −

Reagenzlösung zur

Cholesterinbestimmung 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml

Standard − − 0,01 ml

3. Gut mischen; die Ansätze 20 min bei 25°C (Raumtemperatur) inkubieren. Direkt nach

der Inkubation oder spätestens nach 40 min Extinktion der Analyse und des Standards

gegen den Leerwert bei 546 nm messen.

4. Lesen sie die Extinktion ab, nachdem sie mit Hilfe des Leerwerts den Nullabgleich

durchgeführt haben.

Richten sie sich bei der photometrischen Messung nach der an ihrem Platz

ausliegenden Anleitung!

Extinktion Standard:

Probe A:

Probe B:

Auswertung

Die Bildung des roten Farbstoffs ist direkt proportional zur eingesetzten

Cholesterinkonzentration. Die Konzentration könnte daher mit Kenntnis des

Extinktionskoeffizienten für den gebildeten Farbstoff mit Hilfe des Lambert-Beerschen

Gesetzes berechnet werden. Zur einfacheren Auswertung im Laboralltag wird bei dieser

Messung jedoch die Extinktion eines Standards mit bekannter Konzentration gemessen und

dieser ins Verhältnis zur Extinktion der unbekannten Probe gesetzt. Zur Berücksichtigung der

eingesetzten Verdünnung und Umrechnung in die jeweiligen Einheiten mg/dl bzw. mmol/l wird

der Wert noch mit einem Faktor F multipliziert (siehe Formel in der untenstehenden Tabelle)

(weitere Erklärung zum Faktor F siehe auch III. Anhang, 1.6.2. Das Lambert-Beersche

Gesetz).

38

Die Konzentration des Cholesterins in den Proben wird wie folgt berechnet:

mg / 100 ml mmol / l

Cholesterin-Konzentration 200 x Ext. Probe /

Ext. Standard

Standard

5,3 x Ext. Probe /

Ext. Standard

Standard

Wie hoch sind die Cholesterinwerte (mg / 100 ml und mmol / l) in den beiden Proben?

Probe A:

Probe B:

Wie beurteilen Sie die gemessenen Werte? Welche sind als pathologisch zu betrachten?


1. Reagenzien zur Cholesterinbestimmung

2. Cholesterinstandard

3. 2 verschiedene Seren zur Analyse (A, B)

39

2.3. BESTIMMUNG VON GLUCOSE IM SERUM

Wieso? – Weshalb? – Warum?

Die Einhaltung einer Glucosehomöostase - also das Einstellen eines in engen Grenzen

schwankenden Blutzuckerwertes - ist wichtig für das Überleben obligat Glucose-abhängiger

Gewebe auch in Zeiten der Nahrungskarenz. Durch konzertierte Aktion des

blutzuckersenkenden Hormons Insulin und seiner blutzuckersteigernden Antagonisten

(Glucagon, Adrenalin, Cortisol) wird im gesunden Menschen ein konstanter Blutzuckerwert

von ca. 5 mM Glucose (90 mg/dl) erreicht. Für den Nachweis von Glucose in Serum oder Urin

werden enzymatische Verfahren angewendet, die einen höchst sensitiven und spezifischen

Nachweis erlauben. Sie lernen als Beispiel in diesem Praktikum den Nachweis von Glucose

mit Hilfe der Glucose-Dehydrogenase-Methode kennen. Im online-Praktikum wird Ihnen dieser

Test im Zusammenhang mit dem oralen Glucosetoleranztest wieder begegnen. Der orale

Glucosetoleranztest (Zuckerbelastungstest, kurz auch oGTT) dient dem Nachweis einer

gestörten Glucoseverwertung wie sie z.B. im Diabetes mellitus vorliegt.


Vorlesung: Energiestoffwechsel Kohlenhydrate


Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 7, Kapitel 9

Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 14 + 15


Glucose ist ein für den Menschen wichtiges Kohlenhydrat. Charakterisieren Sie dieses

wichtige Kohlenhydrat (funktionelle Gruppen, systematische Einordnung, mögliche

Reaktionen). Nennen Sie die Summenformel und schreiben die Strukturformel der -D-

Glucose in der Fischer-Projektion und der Haworth-Schreibweise auf.

40

Erklären Sie den Begriff „Glucosehomöostase“. In welchem Bereich sollten sich in einem

gesunden Menschen die Blutzuckerwerte (mg/dl und mmol/l) einpendeln? Warum ist

Glucosehomöostase wichtig?

Welche 2 weiteren (neben der hier verwendeten: Glucose-Dehydrogenase-Bestimmung)

Bestimmungsmethoden der Glucose im Serum/Urin kennen Sie?

41

Versuchsanleitung


Versuchsprinzip

In zur Verfügung gestelltem Serum wird der Glucosegehalt mit Hilfe der Glucose-

Dehydrogenase-Methode bestimmt.

Glucosedehydrogenase (Glc-DH.) katalysiert die Oxidation von Glucose:

Glc-DH

β-D-Glucose + NAD+ D-Gluconolacton + NADH + H+

Sie führen damit einen sog. optischen Test nach Warburg durch. Der Nachweis stützt sich auf

die Enzymaktivität NAD+/NADH oder NADP+/NADPH-abhängiger Oxidoreduktasen. Im Verlauf

der Reaktion bilden oder verbrauchen sich die reduzierten Reduktionsäquivalente NADH oder

NADPH. Im vorliegenden Fall ist sicher gestellt, dass die Reaktion vollständig von links nach

rechts, also zugunsten des D-Gluconolacton und NADH abläuft. Da sich die optischen

Eigenschaften von NADH und NADPH durch eine spezifische Lichtabsorption bei einer

Wellenlänge von 340 nm (Absorptionsmaximum) von denen des NAD+ und NADP+

unterscheiden, lassen sich Änderungen der Konzentrationen der oxidierten bzw. reduzierten

Formen dieser Cosubstrate photometrisch leicht ermitteln. Die Abnahme bzw. Zunahme der

Extinktion ist dem Verbrauch bzw. der Bildung von NADH proportional und spiegelt damit den

zeitlichen Verlauf oder die Kinetik der enzymkatalysierten Reaktion wider. Das Messprinzip

wird daher auch als kinetisch-optischer Test bezeichnet. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen

Gesetzes und Kenntnis des Extinktionskoeffizienten für NADH lässt sich nach Messung der

Extinktion auch auf eine unbekannte Konzentration (hier: Glucose) rückrechnen. Da pro Mol

oxidierter Glucose 1 Mol reduziertes NADH gebildet werden, entspricht die Konzentration an

NADH derjenigen von Glucose. Wie im Versuch 2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM

SERUM wird auch hier ein Referenzwert (Standard) mitgeführt, mit dessen Hilfe über

Dreisatzrechnung die unbekannte Konzentration in der Serumprobe ermittelt werden kann.

42

Praktische Durchführung

Wichtig:

Nicht alle Proben gleichzeitig ansetzen, da die Reaktion direkt startet!

Sondern: Einen Ansatz zusammen pipettieren (nach dem Schema in der

untenstehenden Tabelle), Inkubationszeit abwarten, messen und dann mit der nächsten

Probe beginnen!!!

1. Pipettieren Sie nach folgendem Pipettierschema unmittelbar vor der Messung die

Reaktionsansätze in einer Halbmikroküvette zusammen. Gut mischen! Beginnen

Sie mit dem Standard!

Probe Standard

Reagenzlösung 1000 µl 1000 µl

Serum 10µl -

Standardlösung 100mg/dl - 10 µl

2. Gemessen wird bei 340 nm. Stellen sie eine Stoppuhr auf 4 Minuten ein. Stellen Sie

die Küvette ins Photometer. Warten Sie 2 Minuten Inkubationszeit ab und lesen

Sie die Extinktion ab, ebenso nach jeder weiteren Minute bis die 4 Minuten beendet

sind. Mit dieser Vorgehensweise erhalten Sie mehrere Werte aus dem Bereich der

Initialgeschwindigkeit dieser enzymatischen Reaktion. Nur in diesem Bereich

ermöglicht die Anwendung des Lambert-Beerschen Gesetzes, das der vereinfachten

Auswertung (siehe „Auswertung“) zugrunde liegt, die zuverlässige Bestimmung der

Glucosekonzentration.

3. Tragen sie die jeweiligen Extinktionen in die untenstehende Tabelle ein.

E340 nm

nach 2 min

E340 nm

nach 3 min

E340 nm

nach 4 min

Standard

Probe A

Probe B

43

Auswertung

Bilden Sie die Differenz der Extinktionen zwischen 3 und 2 Minuten und die Differenz zwischen

4 und 3 Minuten. Aus diesen 2 Differenzen bilden sie bitte den Mittelwert, dies ist ihr ΔE

(genauer: E/min). Tragen Sie die Werte in die folgende Tabelle ein:

Differenz 1

Extinktion

nach 3 min –

Extinktion

nach 2 min

Differenz 2

Extinktion

nach 4 min –

Extinktion

nach 3 min

Mittelwert

aus Differenz 1

und Differenz 2

E

Standard

Probe A

Probe B

Die Glucosekonzentration in der Blutprobe ergibt sich aus folgendem Dreisatz, der die

gemessene Extinktionsdifferenz einer Probe mit bekannter Konzentration ins Verhältnis setzt

zur gemessenen Extinktionsdifferenz der unbekannten Konzentration der Blutprobe.

Glucose-Konzentration (Blutprobe): Standardkonzentration x ΔE Probe [mg/dl]

ΔE Standard

Tragen Sie die Extinktionsdifferenzen und die daraus berechneten Glucosekonzentrationen

[mg/dl] ein.

Glucosekonzentration

[mg/dl]

Probe A

Probe B

44

Bewerten Sie die gemessenen Glucosekonzentrationen in den verschiedenen Seren.


1. Reagenz zur Glucosebestimmung

2. Glucose-Standard 100 mg/dl

3. verschiedene Seren zur Analyse (A, B)

45

III. Anhang

Im Folgenden finden Sie eine Zusammenstellung von Einheiten, Gesetzmäßigkeiten und

Rechenwegen, die Sie zur erfolgreichen Durchführung des Praktikums benötigen und die

Ihnen die Auswertung erleichtern sollen. Dieses Kapitel enthält sowohl Anleitungen für die

Auswertung der Präsenzpraktika als auch der online – Praktika.

1. RECHNEN IM BIOCHEMISCHEN PRAKTIKUM

Im Verlauf des Praktikums werden oftmals Konzentrationen von Massen (z.B. in µg Protein

pro ml) oder Molaritäten (z.B. in mmol einer Säure pro Liter) experimentell bestimmt. Die

tatsächlich gesuchte Größe ist dann aber nicht das primäre Ergebnis selbst, sondern bei einem

Protein z.B. die Serumkonzentration, so dass die gefundene Masse noch in Bezug zum

jeweiligen Volumen gesetzt werden muss. Da die Einheiten in der Regel vorgegeben sind, um

sinnvolle Vergleichswerte zu erhalten, müssen die zunächst erhaltenen Einheiten noch

umgerechnet oder Verdünnungsfaktoren berücksichtigt werden. Hierzu ist es notwendig zu

wissen, wie man verschiedene Einheiten ineinander überführen kann. In manchen Versuchen

werden auch grundlegende statistische Verfahren wie die Bildung von Mittelwerten und

Standardabweichungen oder die lineare Regression benötigt. Das Ziel dieses Praktikums ist

es, die Zusammenhänge zwischen verschiedenen physikalischen Größen zu erklären und das

für das Praktikum notwendige "Rechenrüstzeug" mit auf den Weg zu geben.

1.1 Physikalische Größen und Einheiten

In der Physik gelten zur Beschreibung unterschiedlicher Basisgrößen wie Länge, Masse etc.

Internationale Einheiten (Systeme International d'Unites, abgek.: SI) mit standardisierten

Symbolen und Basiseinheiten. Die wichtigsten SI-Einheiten sind in Tabelle 1

zusammengefasst.

Basisgrößen Symbole Basiseinheiten (Zeichen)

Länge l Meter (m)

Masse M Kilogramm (kg)

Zeit t Sekunde (s)

Elektr. Stromstärke I Ampere (A)

Stoffmenge n Mol (mol)

Tabelle 1: SI-Einheiten (aus Hellenthal, Physik für Mediziner, 5. Auflage 1997)

46

Um Bruchteile oder Vielfache dieser Basisgrößen anzugeben, werden Vorsilben verwendet

und der jeweiligen Basiseinheit eine Kurzbezeichnung vorangestellt.

Vorsilbe Kurzbezeichnung Zehnerpotenz Beispiele

Piko p 10-12 Pikofarad

Nano n 10-9 Nanometer

Mikro µ 10-6 Mikromol

Milli m 10-3 Milligramm

Zenti c 10-2 Zentimeter

Dezi d 10-1 Deziliter

Hekto h 102 Hektopascal

Kilo k 103 Kilometer

Mega M 106 Megahertz

Giga G 109 Gigahertz

Tabelle 2: Bruchteile und Vielfache von Einheiten

Von den Grundeinheiten werden abgeleitete Größen und Einheiten gebildet. So wird das

Volumen in m3 angegeben, also von der SI-Einheit m abgeleitet, die Geschwindigkeit wird in

m*s-1 angegeben, also von den SI-Einheiten m und s abgeleitet. Umgangssprachlich werden

aber oft auch andere Einheiten wie km*h-1 statt m*s-1 verwendet, da diese Größen schon lange

in Verwendung sind und somit besser mit anderen Angaben verglichen werden können. Dies

trifft insbesondere auch auf die medizinische Labordiagnostik zu, wo Angaben z.B. in g*dl-1

statt in kg*m-3 gemacht werden. Durch die Verwendung solcher nicht-SI-Einheiten wird oft

auch der Umgang mit besonders großen oder besonders kleinen Zahlen vermieden. Um die

unterschiedlichen Einheiten ineinander umzurechnen, reicht in der Regel die Kenntnis der in

Tabelle 1 und 2 aufgeführten Größen und Vorsilben aus.

Beispiele:

(1) 50 km*h-1 = 50 000 m*h-1 = 50 000 m * (3600 s)-1 = 13.89 m*s-1

(2) 50 m*s-1 = 0.05 km*s-1 = 0.05 km * (0.000278 h)-1 = 180 km*h-1

(3) 180 g*dl-1 = 0.180 kg*dl-1 = 0.180 kg*(0.1 l)-1 = 0.180 kg*(0.1 dm3)-1 =

0.180 kg * (0.0001 m3)-1 = 0.180 kg * 0.0001 m-3 = 1 800 kg*m-3 (oder 1 800 g/l)

47

1.2. Stoffmengen und Konzentrationen

Weiter ist es oft notwendig, aus Konzentrationsangaben Stoffmengen zu berechnen oder

umgekehrt aus Stoffmengen und Volumen eine Konzentration zu ermitteln. Die

Konzentrationen werden in der Regel in "molar" angegeben und mit "M" abgekürzt, wobei eine

1 molare Lösung einer Substanz 1 mol*l-1 enthält.

Beispiele:

(1) Wie viel mol (mmol, µmol) NaOH sind in 100 ml einer 0.05 molaren Lösung enthalten?

0.05 molar = 0.05 mol*l-1

100 ml = 0.1 l

0.05 mol*l-1 * 0.1 l = (0.05*0.1) mol*l-1 * l = 0.005 mol (= 5 mmol = 5 000 µmol)

In 100 ml einer 0.05 molaren NaOH-Lösung sind 0.005 mol (5 mmol, 5 000 µmol)

NaOH enthalten.

(2) Wieviel g NaCl muss man in 300 ml Wasser lösen, um eine 0.5 M Lösung zu erhalten,

wenn 1 mol NaCl eine Masse von 58.44 g haben (58.44 g*mol-1)?

eine 0.5 M Lösung NaCl enthält 0.5 mol*l-1

300 ml = 0.3 l

0.5 mol*l-1 * 0.3 l = (0.5*0.3) mol*l-1 * l = 0.15 mol

→ 300 ml einer 0.5 M NaCl-Lösung enthalten 0.15 mol NaCl

58.44 g*mol-1 * 0.15 mol = (58.44*0.15) g*mol-1*mol = 8.766 g

Man muss 8.766 g NaCl einwiegen und auf 300 ml mit Wasser auffüllen, um eine 0.5 M

Lösung zu erhalten.

In der zweiten Aufgabe ist die Angabe aufgetaucht, welche Masse 1 mol einer Substanz hat.

Diese Angabe wird als molare Masse bezeichnet und mit Mr abgekürzt. Die Einheit für die

molare Masse ist Dalton (Da), dabei gilt 1 Dalton = 1 g*mol-1. Die molare Masse eines

Moleküls setzt sich aus den molaren Massen der im Molekül vertretenen Atome zusammen.

48

Beispiel:

(1) Wie ist die molare Masse von MgCl2?

Atomgewicht Mg: 24.305 g*mol-1, Atomgewicht Cl: 35.453 g*mol-1

molare Masse von MgCl2 = 24.305 + (2*35.453) = 95.211 g*mol-1

Kennt man die molare Masse einer Substanz und ihre molare Konzentration, so kann man von

der molaren Konzentration (= Stoffmengenkonzentration) in eine Massenkonzentration

umrechnen.

Beispiel:

(1) Wieviel mg*dl-1 Creatinin enthält eine 80 µM Lösung (Mr Creatinin = 113 Da)?

eine 80 µM Lösung Creatinin enthält 80 µmol*l-1 = 0.08 mmol*l-1 = 0.00008 mol*l-1

0.00008 mol*l-1 * 113 Da (g*mol-1) = (0.00008 * 113) mol*l-1*g*mol-1

= 0.00904 g*l-1

0.00904 g*l-1 = 9.04 mg*l-1

→ in einem Liter der Lösung sind 9.04 mg Creatinin enthalten

1dl = 0.1 l

→ in einem dl der Lösung sind 0.904 mg Creatinin enthalten.

Die Massenkonzentration der Lösung beträgt 0.904 mg*dl-1.

Neben Stoffmengenkonzentrationen und Massenkonzentrationen wird die Konzentration -

insbesondere, aber nicht ausschließlich von Flüssigkeiten in Flüssigkeiten - oft auch in Prozent

angegeben. Dabei muss zwischen Volumenprozent und Massenprozenten unterschieden

werden. So besagt die Angabe "Dieser Wein beinhaltet 10 Vol-% Alkohol", dass in 100 ml des

Weines 10 ml reiner Alkohol enthalten sind, was aber nicht gleichbedeutend ist mit 10 g reinen

Alkohols. Die Angabe Vol-% und Gew-% stimmt nur dann überein, wenn die gelöste Substanz

und das Lösungsmittel die gleiche Dichte haben. Die Dichte einer Substanz gibt das Verhältnis

zwischen Masse und Volumen an.

Dichte = Masse * Volumen-1 [kg*m-3]

49

Neben der Dichte wird oft auch die relative Dichte im Bezug auf die Dichte von Wasser im

Normalzustand (bei 3.98°C) angegeben. Die relative Dichte stellt daher ein Verhältnis zweier

Größen der gleichen Einheit dar und ist somit selbst ohne Einheit. Die Dichte einiger

Flüssigkeiten ist in der folgenden Tabelle exemplarisch dargestellt.

Tabelle 3: Dichte und relative Dichte einiger Flüssigkeiten

Material Dichte

[kg*m-3]

Formel rel. Dichte

[bez. auf Wasser bei

3.98°C]

Ethanol 789 C2H5OH 0.789

Aceton 791 C3H6O 0.791

Methanol 793 CH3OH 0.793

Wasser (3.98°C) 999.975 H2O 1.000

Meerwasser 1025 - 1.025

Milch 1030 - 1.030

Essigsäure 1049 C2H4O2 1.049

Schwefelsäure 1834 H2SO4 1.834

Quecksilber 13546 Hg 13.546

Bei Kenntnis der Dichte oder der relativen Dichte können nun Volumen- in Gewichtsprozente

umgerechnet werden bzw. der absolute Massengehalt aus der Angabe der Volumenprozente

berechnet werden.

Beispiele:

(1) Wie viel Gramm reiner Alkohol sind in 330 ml einer alkoholischen Lösung mit 4.7 Vol%

Alkohol (Ethanol) enthalten?

330 ml * 4.7 % = 330 ml * 0.047 = 15.51 ml

15.51 ml = 15.51 cm3 (= 0.01551 dm3 = 0.00001551 m3)

789 kg*m-3 = 789 g*dm-3 = 0.789 g*cm-3 = 0.789 g*ml-1

15.51 ml * 0.789 g*ml-1 = 12.237

In 330 ml einer alkoholischen Lösung mit 4.7 Vol-% sind 12.237 g reiner Alkohol enthalten.

50

Exkurs: Blutalkoholkonzentration (BAK)

Zur Bestimmung der Blutalkoholkonzentration gibt es verschiedene Formeln. Die einfachste

ist wohl die Formel von Widmark, mit der die theoretische maximale Blutalkoholkonzentration

berechnet werden kann. Die Formel lautet:

c = A * (m*r)-1

Dabei ist c die Blutalkoholkonzentration, A die aufgenommene Masse des Alkohols in g, m die

Masse der Person in g und r ein Verteilungsfaktor, der für Männer 0.68 bis 0.70, für Frauen

0.55 bis 0.60 und für Säuglinge/Kleinkinder 0.75 bis 0.80 beträgt. Die maximale

Blutalkoholkonzentration (BAK) nach dem Genuss von 12.237 g Ethanol beträgt demnach

(1) bei einem 75 kg schweren Mann: 12.237 g * (75 000 g * 0.68)-1 = 0.24‰

(2) bei einer 50 kg schweren Frau: 12.237 g * (50 000 g * 0.55)-1 = 0.44‰

(3) bei einem 15 kg schweren Kleinkind: 12.237 g * (15 000 g * 0.75)-1 = 1.09‰

Neben der genannten Formel gibt es noch weitere wesentlich genauere

Berechnungsmethoden, die neben der Verteilung des Alkohols im Körper auch noch die

Resorption und den Abbau berücksichtigen. Die hier gezeigte Berechnung gibt daher nicht den

tatsächlichen Blutalkoholgehalt an, sondern einen Richtwert für die maximal erreichbare BAK

mit einer bestimmten Masse Alkohol.

1.3. Mischen von Lösungen, das Mischungskreuz

Ein häufig vorkommendes Problem beim Umgang mit Lösungen unterschiedlicher

Konzentration ist das Mischen vorhandener Lösungen, um eine Lösung mit einer gewünschten

Zielkonzentration zu erhalten. Zur Bestimmung des Verhältnisses, in dem solche Lösungen

gemischt werden müssen, kann das sogenannte Mischungskreuz verwendet werden. Dieses

ist wie folgt aufgebaut:

51

Abbildung: Mischungskreuz, beachte: Konzentration a < Konzentration c

a und c sind die Ausgangskonzentrationen, b ist die Zielkonzentration, weiter

ist die Differenz c-a der Ausgangskonzentrationen auf der linken Seite gleich

der Summe der Anteile (c-b) + (b-a) auf der rechten Seite!

Beispiele:

(1)Sie sollen 500 ml einer 10 Vol-%igen EtOH-Lösung herstellen. Wieviel ml 50 Vol-%ige

Lösung müssen Sie mit wieviel ml 5 Vol-%iger Lösung mischen?

Schritt 1: Ermitteln des Mischungsverhältnisses von a und c

Konz. a = 5 Vol-%; Konz. c = 50 Vol-%; Konz. b = 10 Vol-%

c - b = 50 - 10 = 40 => 40 Anteile Lösung mit Konz. a

b - a = 10 - 5 = 5 => 5 Anteile Lösung mit Konz. c

Schritt 2: Ermitteln der Volumenanteile von a und c

Gesamtvolumen = 500 ml; Gesamtanteile = 45

500 ml * 45-1 = 11.11 ml pro Anteil

5 Anteile entsprechen 5 * 11.11 ml = 55.55 ml

40 Anteile entsprechen 40 * 11.11 ml = 444.45 ml

Es müssen 444.45 ml 5 Vol-%ige Lösung mit 55.55 ml 50 Vol-%iger Lösung gemischt

werden, um 500 ml 10 Vol-%ige Lösung zu erhalten.

(2) Sie mischen 5 Teile einer 50 mM NaCl-Lösung mit 3 Teilen einer 500 mM NaCl-

Lösung. Welche Konzentration erhalten Sie?

Schritt 1: Ermitteln der Differenz der beiden gegebenen Konzentrationen a und c

c-a = 500 mM - 50 mM = 450 mM

52

Schritt 2: Aufteilen von 450 im Verhältnis 5:3

450 : 8 = 56.25

56.25* 5 = 281.25 = Anteile Lösung 1 = c - b Anteile

56.25* 3 = 168.75 = Anteile Lösung 2 = b - a Anteile

Schritt 3: Ermitteln der Zielkonzentration

c - b = 500 - b = 281.25 <=> b = 500 – 281.25 = 218.75 oder

b - a = b - 50 = 168.75 <=> b = 168.75 + 50 = 218.75

Man erhält eine Lösung mit einer NaCl-Konzentration von 218.75 mM.

1.4 Grundlegende statistische Verfahren (Mittelwert, Varianz, Signifikanztest)

Wissenschaftliche Taschenrechner bieten in der Regel diese Funktionen; das folgende Kapitel

soll Ihnen die Hintergründe und Grundlagen zu den verschiedenen statistischen

Berechnungen erklären (und sie in die Lage versetzen, diese Rechnungen notfalls auch von

„Hand zu Fuß“ durchzuführen 😊).

Um eine Aussage über die Verteilung einer Messgröße innerhalb einer Population zu erhalten

oder um verschiedene Populationen bezüglich einer Messgröße miteinander zu vergleichen,

sind die Parameter Standardabweichung und Mittelwert wichtige Hilfsmittel. Mit der

allgemeinen Bezeichnung Mittelwert wird oft - auch im biochemischen Praktikum -

stillschweigend impliziert, dass es sich um das arithmetische Mittel handelt. Der Vollständigkeit

halber sei aber auch das gewichtete arithmetische Mittel, der Median und der Modalwert

erwähnt.

Definitionen:

arithmetisches Mittel: =

=n

i

ixn

x1

1, d.h. man addiert alle Werte und teilt sie durch die Anzahl

der Werte;

gewichtetes arithmetisches Mittel:

=

==n

i

i

n

i

ii

w

xw

x

1

1, d.h. man multipliziert alle Werte mit einem

Gewichtungsfaktor und teilt die Summe der Produkte durch die Summe der

Gewichtungsfaktoren;

53

Median: derjenige Wert, der in der Mitte steht, wenn alle Werte nach der Größe sortiert

aufgeschrieben werden;

Modalwert: diejenige Merkmalsausprägung, die am häufigsten vorkommt.

Das gewichtete arithmetische Mittel wird verwendet, wenn ein Mittelwert aus unterschiedlich

stark zu bewertenden Einzelwerten gebildet werden soll (z.B. Schulnoten), den Median kann

man wählen, wenn Ausreißerwerte den Mittelwert nicht beeinflussen sollen und den Modalwert

wählt man, wenn keine numerische Größe erfasst wird (z.B. Haarfarbe). Im Praktikum werden

aber numerische Größen gleicher Gewichtung erfasst, so dass hier die Betrachtung des

arithmetischen Mittels am sinnvollsten ist.

Zur Beurteilung, wie aussagekräftig ein solcher Mittelwert ist, ist es notwendig zu wissen, wie

stark die Messwerte um den Mittelwert streuen. Ein Maß für diese Streuung ist die Varianz

bzw. die Standardabweichung. Um die Varianz zu erhalten, muss man die Differenz jedes

einzelnen Wertes vom Mittelwert ermitteln, diese Differenzen werden dann quadriert und über

die quadrierten Differenzen wird wieder ein Mittelwert gebildet. Die Standardabweichung ist

schließlich die Wurzel aus der Varianz.

Definitionen:

Varianz: 2

1

2 )(1

=

−=n

i

ixxn

s

Standardabweichung: 2ss =

Beispiel:

Für zwei Gruppen von je zehn Männern und Frauen wird jeweils die Körpergröße in cm

bestimmt. Für die Gruppe der Männer werden folgende Werte ermittelt: (167, 170, 172,

178, 180, 181, 184, 190, 198, 205), für die Gruppe der Frauen werden folgende Werte

ermittelt: (152, 155, 158, 160, 161, 165, 170, 175, 181, 184). Berechnen Sie jeweils die

Mittelwerte und Standardabweichungen und beurteilen Sie, ob sich die Gruppen bezüglich

der Messgröße signifikant unterscheiden.

Mittelwert Männer = (167+170+172+178+180+181+184+190+198+205) : 10 = 182.5

Mittelwert Frauen = (152+155+158+160+161+165+170+175+181+184) : 10 = 166.1

Varianz Männer = ((167-182.5)2+(170-182.5)2+.......+(205-182.5)2) :10 =

54

= ((-15.5)2+(-12.5)2+(-10.5)2+(-4.5)2+(-2.5)2+(1.5)2+1.52+

+7.52+15.52+22.52) : 10 = 134.05

Varianz Frauen = ((152-166.1)2+(155-166.1)2+.......+(184-166.1)2) :10 =

= ((-14.1)2+(-11.1)2+(-8.1)2+(-6.1)2+(-5.1)2+(-1.1)2+3.92+

+8.92+14.92+17.92) : 10 = 108.89

Standardabweichung Männer = 05,134 = 11.58

Standardabweichung Frauen = 89,108 = 10.43

1.5 Lineare Regression und Korrelationskoeffizient

Wissenschaftliche Taschenrechner bieten in der Regel diese Funktionen; das folgende Kapitel

soll Ihnen die Hintergründe und die Grundlagen zu den verschiedenen statistischen

Berechnungen erklären (und sie in die Lage versetzen, diese Rechnungen notfalls auch von

Hand zu Fuß durchzuführen 😊).

Zur Bestimmung von Messgrößen wird in der Laborpraxis häufig ein Vergleich mit bekannten

Werten herangezogen. So wird man zur Konzentrationsbestimmung i.d.R. ein Verfahren

heranziehen, bei dem ein Messwert in linearer Abhängigkeit vom gegebenen Wert - also z. B.

der Konzentration - steht. Hier ist nun zunächst die Frage zu beantworten, was bedeutet

lineare Abhängigkeit? Der Messwert ist linear abhängig vom gegebenen Wert, wenn die

Messwerte auf einer Geraden liegen.

Im Praktikum bedeutet dies einfach: Wenn eine lineare Abhängigkeit vorliegt, können wir die

Messwerte in ein Koordinatensystem eintragen und dann eine Bestgerade so ermitteln, dass

die Messwerte möglichst wenig um diese Gerade streuen. Das Problem reduziert sich dann

auf die Frage: Wie kommt man zu dieser Gerade? Hierzu gibt es mehrere Möglichkeiten:

1. Die graphische Methode: Hier legt man "nach Augenmaß" eine Bestgerade in die zuvor in

ein Koordinatensystem eingetragenen Punkte. Die Geradengleichung kann man dann über

den y-Achsenabschnitt und die Steigung der Gerade ermitteln. Diese Methode ist sehr schnell

anwendbar und führt vor allem dann zum gewünschten Erfolg, wenn man sicher ist, dass die

Messgröße linear abhängig von der gegebenen Größe ist, denn ein Maß für die Güte der

Bestgeraden erhält man hier nicht.

55

2. Die rechnerische Methode: Um die Bestgerade "von Hand" zu berechnen, bedarf es einer

aufwendigeren Berechnung, bei der eine Gerade ermittelt wird, für die die Summe der

Quadrate der Abweichungen der Messwerte von dieser Gerade minimal ist (i. d. R. nach der

Gauß'schen Methode der kleinsten Fehlerquadrate). Vereinfacht dargestellt erhält man die

Geradengleichung wie folgt:

allgemeine Form: y = m*x + b, zu bestimmen sind somit die Koeffizienten a und b wobei man

a und b erhält aus

=

=

−

−−

=n

i

i

n

i

ii

xxn

yyxxn

m

1

2

1

)(1

))((1

und xmyb −=

Die Gleichungen sehen dabei wesentlich unangenehmer aus, als sie tatsächlich sind, wie man

am nächsten Beispiel gut sehen kann.

Beispiel:

Bei der photometrischen Messung von Proteinproben bekannter Konzentration erhalten Sie

die in der folgenden Tabelle dargestellten Absorptionswerte. Bestimmen Sie die

Geradengleichung der Bestgeraden.

Protein [µg] 0 1 2 3 4 5

Extinktion

(Absorption) 0 0.070 0.130 0.193 0.253 0.318

Berechnung von x und y für die 6 Messwerte (n=6):

5,2)543210(6

1=+++++=x

161,0)318,0253,0193,013,007,00(6

1=+++++=y

Nun müssen nur noch die Werte in obige Gleichung eingesetzt werden und man erhält:

56

222222 )5,25()5,24()5,23()5,22()5,21()5,20(6

1

))161,0318,0(*)5,25()161,0253,0(*)5,24()161,0193,0(*)5,23()161,0130,0(*)5,22()161,007,0(*)5,21()161,00(*)5,20((6

1

−+−+−+−+−+−

−−+−−+−−+−−+−−+−−

=m

ausgerechnet ergibt dies: m = 0.0629 woraus sich a berechnet zu

b = 0.161 – 0.0629*2.5 = 0.00375 und die gesuchte Geradengleichung lautet dann

y = m * x + b = 0.0629 * x + 0.00375.

Man kann nun auch einen Korrelationskoeffizienten r (oder r2) berechnen, der ein Maß für die

tatsächliche Linearität darstellt und damit für die Qualität der errechneten Bestgeraden. Die

Formel hierzu sieht wieder schlimmer aus, als sie tatsächlich ist:

==

=

−−

−−

−−−

=n

i

i

n

i

i

n

i

ii

yyn

xxn

yyxxn

r

1

2

1

2

1

)(1

1*)(

1

1

))((1

1

denn setzt man wieder die Werte aus obigem Beispiel ein, so erhält man r = 0.999777, also

einen Wert, der sehr nahe an 1 liegt. Man kann grob sagen, dass je näher der Wert für r an

+1(oder -1) herankommt, desto weniger weichen die Messwerte von der Geraden ab und desto

besser ist somit das Modell eines positiven (oder negativen) linearen Zusammenhangs. r2 ist

dann das Quadrat des Korrelationskoeffizienten und wird als Determinationskoeffizient

bezeichnet (oftmals wird aber auch r2 zur allgemeinen Verwirrung als Korrelationskoeffizient

bezeichnet) und ist nur noch ein Bestimmtheitsmaß für die Qualität der linearen Abhängigkeit

ohne Angabe ob der Zusammenhang positiv oder negativ ist. Trägt man die Werte aus dem

Beispiel in ein Koordinatensystem ein und ermittelt die Gerade durch die graphische Methode,

so ergibt sich folgendes Bild:

57

Die Steigung m errechnet sich dabei aus 0625,06,1

1,0==

=

x

ym , den y-Achsenabschnitt

würde man hier mit 0 ablesen. Natürlich kann ein beliebiges Δy verwendet und das zugehörige

Δx abgelesen werden, ohne dass sich der Wert verändert. Die Geradengleichung lautet

demnach nach dieser Methode:

y = 0.0625 * x + 0, was den oben errechneten Werten sehr nahe kommt.

Das Beispiel zeigt, dass die kompliziert aussehenden Formeln sich bei näherer Betrachtung

schnell in einfache Subtraktionen, Additionen und Multiplikationen auflösen, sobald man Werte

einsetzt. Was übrig bleibt ist - zugegebenermaßen recht mühsames - Eintippen in den

Taschenrechner. Dies vereinfacht sich natürlich wesentlich, wenn der Rechner direkt über eine

Statistikfunktion verfügt. Trotzdem ist es sinnvoll, die Berechnungen einmal zu hinterfragen

und die Formeln anzusehen, damit man ein besseres Gefühl dafür bekommt, welche

Berechnungen im Hintergrund ablaufen und wie die Ergebnisse zu bewerten sind.

Wozu braucht man nun überhaupt eine solche Geradengleichung, denn im biochemischen

Praktikum wie auch im medizinischen Labor sollen ja Kenngrößen ermittelt werden, die eine

Aussage über biochemische Parameter erlauben und dadurch zu einer Diagnose führen. Wie

eingangs erwähnt, ist es zur Bestimmung solcher Parameter oft notwendig, bekannte Größen

als Vergleichswerte zu bestimmen. So kann man z.B. die Proteinkonzentration einer

unbekannten Probe dadurch bestimmen, dass man - wie im gezeigten Beispiel dargestellt -

verschiedene bekannte Proben vermisst und dann aus dem Absorptionswert der unbekannten

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

Protein [µg]

Ab

so

rpti

on

[A

U]

y = 0,2 - 0,1 = 0,1

x = 3,1 - 1,5 = 1,6

58

Probe über die Geradengleichung die Konzentration der gesuchten Probe ermittelt. Das kann

natürlich auch wieder graphisch oder rechnerisch durchgeführt werden. Also zurück zum

Beispiel:

Anhand der oben angegebenen Eichwerte soll die Proteinmasse in einer identisch

angesetzten unbekannten Probe errechnet werden, für die eine Absorption von 0.158

gemessen wurde.

Die Absorptionswerte wurden als y-Werte aufgetragen, somit ergibt sich durch Einsetzten in

die oben errechnete Geradengleichung:

0.158 = 0.0629 * x + 0.00375, wobei x die gesuchte Proteinmasse ist. Durch Umformen der

Gleichung erhält man:

x = (0.158 – 0.00375):0.0629 = 2.45

Die Proteinmasse in der unbekannten Probe entspricht demnach 2.45 µg.

ACHTUNG: Da im Beispiel die Absorption in Abhängigkeit von der Proteinmasse dargestellt

wurde, erhält man als Ergebnis natürlich auch eine Proteinmasse in µg und keine

Konzentrationsangabe. Um zur Konzentration zu kommen, muss man die Masse noch durch

ein Volumen teilen. Weiter ist es wichtig, dass die unbekannte Probe und die Eichproben für

die photometrische Messung gleich angesetzt wurden. Wenn es notwendig ist, die unbekannte

Probe z.B. verdünnt einzusetzen, dann ist ein solcher Verdünnungsfaktor auch am Ende zu

berücksichtigen! Wäre in obigem Beispiel die unbekannte Probe 1:3 verdünnt eingesetzt

worden, so würde sich ihr Proteingehalt aus 2.45 µg * 3 = 7.35 µg berechnen.

1.6 Wichtige Gleichungen, Herleitungen und Umformung von Gleichungen

1.6.1 Massenwirkungsgesetz und Henderson-Hasselbalch-Gleichung

Während der pH-Wert einer starken Säure direkt von der Konzentration der Säure abhängt

(da eine starke Säure annähernd zu 100% dissoziiert), kann man diese vereinfachende

Annahme für eine schwache Säure nicht machen. Hier ist der pH-Wert im Wesentlichen davon

abhängig, wie stark diese Säure dissoziiert, was durch die Gleichgewichtskonstante der

Dissoziationsgleichung ausgedrückt wird.

59

HA <=> H+ + A- (Dissoziationsgleichung), nach dem Massenwirkungsgesetz gilt:

sKHA

AH=

−+ *

Ks ist die Gleichgewichtskonstante der Dissoziation.

Löst man diese Gleichung nach [H+] auf (durch Multiplikation mit [HA] und Division durch [A-]),

so erhält man:

−

+ =A

HAKH s *

Da i. d. R. jedoch nicht [H+], sondern der pH-Wert, also der negative dekadische Logarithmus

von [H+] interessiert, logarithmiert man beide Seiten und multipliziert die Gleichung noch mit (-

1):

))log(()log(log−

+ −+−=−A

HAKH s

oder vereinfacht geschrieben:

−

−=A

HApKpH s log

(Henderson-Hasselbalch-Gleichung)

Hier wurde nun quasi nebenbei die Henderson-Hasselbalch-Gleichung hergeleitet, die es

einem nicht nur ermöglicht, den pH-Wert der Lösung einer schwachen Säure zu berechnen,

sondern auch im umgekehrten Fall, wenn man den pH-Wert experimentell bestimmt, die

dazugehörige Konzentration der schwachen Säure zu berechnen.

Beispiel:

Gesucht ist zunächst der pH-Wert einer 50 mM Essigsäurelösung (pKs = 4.75), wie ändert

sich dieser pH-Wert, wenn man zu 1 l einer solchen Lösung 100 ml 10 mM HCl gibt?

60

Aus dem Massenwirkungsgesetz folgt:

pKs = 4,75 => Ks = 10-4,75 =

HA

AH −+ *, [HA] = c0 - [H+] ≈ c0 (da eine schwache Säure nur

sehr wenig dissoziiert), da weiter Essigsäure eine einprotonige Säure ist, also CH3COOH <=>

CH3COO- + H+, ist [H+] = [A-] und somit:

)lg(2

1lg2* 000

2

0

2

cpKpHcpKpHcKHc

HK ssss −=−=== +

+

der pH-Wert ist demnach pH = 3.02

HCl ist eine starke Säure, die zu 100% dissoziiert, daher gilt nach Zugabe der HCl:

[H+]ges. = [H+]CH3COOH + [H+]HCl = (0.000942942 mo*l-1)*1l+ (0.01 mol*l-1)*0.1l

= 0.001942942 mol in 1.1 l => 0.00176631 mo*l-1

der pH-Wert ist dann - log (0.00176631) = 2.75

Das Beispiel zeigt, dass der pH-Wert sich bei Zugabe von 100 ml 0.01 M HCl zu 1 l 50 mM

Essigsäure nur um 0.27 Einheiten ändert, während er bei Zugabe der gleichen Menge HCl zu

1 l reinem Wasser von pH 7 auf pH 3 um 4 Einheiten sinken würde. Dies zeigt die

logarithmische Natur des pH-Wertes. Eine Erhöhung der H+-Konzentration um den Faktor

1.8731 bei Zugabe der HCl zur Essigsäure führt zu einer Änderung des pH-Wertes um den

Faktor lg(1.8731) = 0.27. Die gleiche HCl-Zugabe zu Wasser mit pH 7 würde eine Erhöhung

der H+-Konzentration um den Faktor 10 000 von 10-7 auf 10-3 bedeuten und somit eine pH-

Wert Änderung um 4 Einheiten.

Im nächsten Beispiel soll nun bei gegebenen [HX] und pH der Ks-Wert von HX bestimmt

werden.

Beispiel:

Die Lösung einer schwachen Säure HX mit c0[HX] = 0.26 mol*l-1 hat einen pH-Wert von 2.86.

Wie groß ist die Säuredissoziationskonstante Ks?

aus dem pH-Wert kann zunächst [H+] berechnen:

61

pH = - log [H+] => [H+] = 10-pH = 10-2.86 = 0.001380384

nun kann man folgende Annahmen machen:

1. Da [HA] <=> [H+] + [A-] gilt, folgt direkt [H+] = [A-]

2. Da eine schwache Säure nur sehr wenig dissoziiert gilt (näherungsweise) [HA] = c0

nach der Henderson-Hasselbalch-Gleichung gilt nun:

−

−=A

HApKpH s log hier also

001380384,0

26,0log86,2 −= spK <=> 2.86 = pKs – 2.275

oder pKs = 5.135 und Ks = 7.3*10-6.

Wenn mit der Henderson-Hasselbalch-Gleichung gerechnet wird, muß auch mit Logarithmen

umgegangen werden. Daher hier noch einmal eine kurze Übersicht über die Rechenregeln mit

Logarithmen zur Erinnerung:

- Multiplikation: log (u*v) = log u + log v

- Division: log (u/v) = log u - log v

- Sonderfälle: log (1/v) = -log v

log (u/v) = -log (v/u)

- Potenzieren: log (un) = n*log u

- Radizieren: log n u = log (u1/n) = 1/n log u

Aus diesen Gesetzen folgt dann auch, dass die folgenden Darstellungen der Henderson-

Hasselbalch-Gleichung, die beide gebräuchlich sind, identisch sind:

−

−=A

HApKpH s log ist das gleiche wie

HA

ApKpH s

−

+= log

1.6.2. Das Lambert-Beersche Gesetz

Ein sehr wichtiges Analyseinstrument im Praktikum ist das Photometer. Im Photometer wird

die Absorption von Licht durch Lösungen gemessen. Als Transmission wird der Anteil an Licht

bezeichnet, der durch die Probe durchtritt, die Transmission ist daher der Quotient I/I0. Die

Durchlässigkeit einer Probe für Licht hängt von den folgenden Parametern ab:

- Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes

- Schichtdicke der Lösung d

62

- Konzentration der Lösung c

- chemische Eigenschaften der gelösten Substanz, Extinktionskoeffizient

Für nicht zu große Konzentrationen ist die Absorption proportional zur Konzentration des

gelösten Stoffes, woraus das Lambert-Beersche Gesetz folgt:

Transmission: dc

I

I **

0

10 −=

Absorption: dcI

IA **lg 0 ==

Da die Absorption bzw. Transmission selbst keine Einheit hat, müssen sich auf der rechten

Seite der Gleichung alle Einheiten wegkürzen. Die Konzentration wird i.d.R. in mol*l-1

angegeben, die Schichtdicke in cm woraus sich für folgende Einheit ergibt:

mmol

cm

mmol

cm

cmmol

cm

cmmol

dm

cmmol

l 2233

1000

1000

*

1000

**====

Natürlich ist es auch möglich, z.B. eine Massenkonzentration zugrunde zu legen, was dann in

der Rechnung entsprechend zu berücksichtigen ist. Allgemein gilt: Man muss sich die Einheit

des Extinktionskoeffizienten genau ansehen, denn diese bestimmt letztendlich, welche Einheit

das berechnete Ergebnis hat!

Beispiele:

Zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes geben Sie 20 µl Blut in 5 ml Reagenz. Anschließend

messen Sie die Absorption der Lösung in einer Küvette (Dicke 1 cm) und bestimmen einen

Wert von 0,415. Der Extinktionskoeffizient von Hämoglobin (eine Untereinheit) bei der

verwendeten Wellenlänge ist =11000 cm2*mmol-1, das Molekulargewicht ist MW=16144

g*mol-1. Berechnen Sie die Konzentration des Hämoglobins im Blut und geben Sie diese in

g*100 ml-1 und in g*mol-1 an.

Es gilt: A = * c * d

=

=

==== −

l

µmol

l

mol

l

mol

cm

mmol

cmcm

mmol

d

AcKüvette 7,3710*77,3

*1*000.11

415,0

*

5

32

63

Die Konzentration in der gemessenen Probe ist demnach 37.7 µmol*l-1. Zum Messen wurden

jedoch 20 µl Blut in 5 ml = 5 000 µl Reagenz verdünnt, d.h. die Konzentration im Blut ist

demnach:

=

==

l

mmol

l

µmolcBlut 4627,97,9462

20

5020*7,37

Die Massenkonzentration berechnet sich schließlich

=

=

=

=

=

=

ml

g

l

g

l

mg

l

mg

mmoll

mgmmol

moll

gmmolc

1003,157,15283,152765

*

*

*

*16144*4627,9

Während des Praktikums wird gelegentlich zur Vereinfachung der Versuchsauswertung

verlangt, dass bereits vorab ein Faktor F errechnet wird, mit dem man einen im Praktikum

erhaltenen Messwert unmittelbar in das gewünschte Ergebnis überführen soll. Manchmal

handelt es sich dabei lediglich um einen Verdünnungsfaktor, in anderen Fällen müssen aber

auch die im Skript angegebenen Formeln benutzt und umgeformt werden. Einen

Verdünnungsfaktor kann man sehr einfach berechnen. Wenn z.B. für eine photometrische

Messung 1 ml eines Reaktionsgemisches vorgelegt werden und dann 100 µl Probe zugegeben

werden, so ergibt sich ein Endvolumen von 1.1 ml. Diese Verdünnung ist dann zu

berücksichtigen, wenn aus dem Messwert auf die Konzentration einer Substanz in der

zugesetzten Probe rückgerechnet werden soll. Im genannten Fall muss die aus dem Messwert

errechnete Konzentration noch mit dem Faktor 11 multipliziert werden, um die Konzentration

der Probe zu erhalten.

ACHTUNG: Bezieht man sich bei der Messung auf einen Referenzwert, ermittelt man also

eine Konzentration durch Vergleich mit bekannten Konzentrationen und werden diese

Referenzlösung im gleichen Maße verdünnt wie die zu bestimmende Probe, so braucht man

keine Verdünnungsfaktoren zu berücksichtigen!

Wenn man für das oben berechnete Beispiel den Verdünnungsfaktor VF und die Umrechnung

von molarer Konzentration in Massenkonzentration vorab mit dem Extinktionskoeffizienten

zusammenfasst, dann erhält dann:

64

=

=

=

=

==

=

====

==

ml

g

ml

gFV

ml

g

l

g

l

g

moll

gmol

mol

g

l

mol

ml

mmol

cmcm

mmolM

dF

V

F

W

F

10077,36

100110

114,16*251*

100110

114,16

110

14,161

*

*

11000

16144

16144**1*11000

1*

*

1

;25120

5020

2

Die Hb-Konzentration im Blut in g*100 ml-1 berechnet sich dann einfach aus

cHb = VF * F * Absorption = 36.77 * 0.416 = 15.3 g*100 ml-1

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