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ad Gentherapie
1. At this time, given the nature and number of unanswered scientific, ethical, and policy questions, it is inappropriate to perform
germline gene editing that culminates in human pregnancy.
2. Currently, there is no reason to prohibit in vitro germline genome editing on human embryos and gametes, with appropriate
oversight and consent from donors, to facilitate research on the possible future clinical applications of gene editing. There should
be no prohibition on making public funds available to support this research.
3. Future clinical application of human germline genome editing should not proceed unless, at a minimum, there is (a) a
compelling medical rationale, (b) an evidence base that supports its clinical use, (c) an ethical justification, and (d) a transparent
public process to solicit and incorporate stakeholder input.
Genom-Sequenzanalysen
• Mendelnde Erkrankungen
• Exom: nur Protein-kodierende Sequenzen
• Exom- vs. Genom-Sequenzanalyse
- höhere Wahrscheinlichkeit, pathogene Mutationen zu identifizieren
- effizientere Auswertung, da <3% des Gesamtgenoms
- weniger Variationen, kostengünstiger
Online Mendelian Inheritance in Man
OMIM-Statistik 2. 1. 2018
autosom. X Y mito.
Gene mit bekannter Sequenz 14987 727 49 35 15798
Gene mit bekannter Sequenz
und Phänotyp 75 0 0 2 77
Phänotyp-Beschreibungen,
molekul. Basis bekannt 4803 324 4 31 5162
mendelnde Phänotypen / Loci,
molekul. Basis unbekannt 1462 124 5 0 1591
Phänotypen mit vermuteter
mendelnder Basis 1665 106 2 0 1773
22992 1281 60 68 24401
Definition
Mutation: Vorgang, der eine vererbbare Veränderung der
Nukleotidsequenz bewirkt ( Abweichung von “Wildtyp”-Sequenz)
Nukleotidabweichungen mit oder ohne phänotypische Auswirkung
Polymorphismus / Variante / VUS variant of uncertain significance
Mutationen / Gene
Definition
Mutation: Vorgang, der eine vererbbare Veränderung der
Nukleotidsequenz bewirkt ( Abweichung von “Wildtyp”-Sequenz)
Nukleotidabweichungen mit oder ohne phänotypische Auswirkung
Polymorphismus / Variante / VUS variant of uncertain significance
Gen: Nukleotid-Abfolge, die in RNA-Information übersetzt wird
(Transkription), gemäß der Protein gebildet werden kann (Translation)
Transkription + Translation Expression (zeit- und gewebespezifisch)
Mutationen / Gene
Gen-Definition
• lokalisierbare Region genomischer Sequenz, die
einer Erb-Einheit entspricht, welche assoziiert
ist mit regulatorischen und transkribierten
Abschnitten sowie anderen funktionellen
Sequenzregionen
Genstruktur
• Exons + IntronsmRNA-Spleißen
• regulatorische ElementePromoterenhancer, silencer
• mRNAoffener Leserahmen5‘ UTR, 3‘ UTR
Standard genetischer Code
T C A G
T
TTT Phe, FTTC " TTA Leu, LTTG "
TCT Ser, STCC " TCA " TCG "
TAT Tyr, YTAC TAA Ter TAG Ter
TGT Cys, CTGC TGA Ter TGG Trp, W
C
CTT Leu, LCTC " CTA " CTG "
CCT Pro, PCCC " CCA " CCG "
CAT His, HCAC " CAA Gln, QCAG "
CGT Arg, RCGC " CGA " CGG "
A
ATT Ile, IATC " ATA "
ATG Met M
ACT Thr, TACC " ACA " ACG "
AAT Asn, NAAC " AAA Lys, KAAG "
AGT Ser, SAGC " AGA Arg, RAGG "
G
GTT Val, VGTC " GTA " GTG "
GCT Ala, AGCC " GCA " GCG "
GAT Asp, DGAC " GAA Glu, EGAG "
GGT Gly, GGGC " GGA " GGG "
AUG … … … …
ATG … … … …
MetStart…………Stop
offener Leserahmen (mRNA/cDNA-Sequenz)
TGATAATAG
UGAUAAUAG
alternatives Spleißen
>94% humaner Gene alternativ gespleißt
50% pathogener Mutationen beeinflussen Spleißen
Spleißen
Alternatives Spleißen
Protein-Isoformen A1 A2 A3
Spleißosomen: Spleiß-Code
Verzweigungs-stelle
3‘ Spleiß-stelle
5‘ Spleiß-stelle
ISEISSESE ESSISE
ESE/ESS Mutationen ISS/ISE Mutationen
Spleißstellen-MutationenSpleiß-Mutationen
Konsensussequenzen von 3‘ Spleißstellen verschiedener Intron/Exon-Grenzen
Buchstabenhöhe proportional zur Basenfrequenz in der jeweiligen Position
3‘ Spleißstelle5‘ Spleißstelle Verzweigungsstelle
3‘ Spleißstelle5‘ Spleißstelle
Verzweigungsstelle
Spleiß-Therapiemethoden
ASOs
SMaRT (Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing)
spinale Muskelatrophie
Trans-splicing
endogene mRNA
exogene RNA
Neumutationen + Elternalter
väterliches Alter in Jahren
An
zah
l Neu
mu
tati
on
en
Goldmann et al., Nature Genet 2016
An
zah
l Neu
mu
tati
on
en
mütterliches Alter in Jahren
homologe Fehl-Rekombination
Duplikation Deletion
Chromatinoffen
kontrahiert
Transkription
RNA-Polymerase
mRNA
CpG-Dinukleotide
Mechanismen bei Neumutationen
junge Eltern alte Eltern
22 Mitosen23 Mitosen/Jahr
>600 Mitosenbei 40-jährig. ♂
23 Mitosen/Jahr
100-150 Mitosenbei 20-jährig. ♂
Neumutationen
Neumutationen40-80 SNV, 1-2 kodierend
3-9 indels; 0,015 CNV
22 Mitosen
parentalpostzygot.4%
Keimbahn89%
postzygot.7%
2 Neumutationen/zusätzl. Jahr bei Zeugung ♂0,2 Neumutationen/zusätzl. Jahr bei Zeugung ♀
↑ indels + CNVs
SchlußfolgerungenAutismus- + Schizophrenie-Erkrankungen
→ Spermien einfrieren in jungen Jahren ?
→ “Selektionsdruck erhöhen” ?
Spontan-Mutation
• Neu-Mutation (de novo)
• nicht Mutagen-induziert
• Fehler DNA-Replikation
unverändert mutiert
DNA-Replikation
Basenmismatch
elterl. DNA
neue DNA
Spontan-Mutationsrate• Rate variiert für verschiedene Gene, abhängig von
– Größe des Gens
– Sequenz
– Mutationen in hot spots
– Pseudogene
• Mutationsraten: 10-5-10-6 pro Locus und Generation
– 10-8 pro Nukleotid und Generation
– Neumutationsrate Duchenne Muskeldystrophie: 3x10-5
• jeder Mensch wird mit 60 Neumutationen geboren(und erwirbt somatisch zusätzliche Mutationen) -meist in nicht-kodierenden Genom-Abschnitten aber -
• durchschnittlich 1 Aminosäuresequenz-Änderung
Mutationsraten in Krankheitsgenen
Erkrankung
Mutationen / 106
Gameten Phänotyp
Duchenne Muskeldystrophie 40-105 chron. progr. Muskelerkrankung
Hämophilie A 30-60 Blutgerinnungsstörung
Hämophilie B 0,5-10 Blutgerinnungsstörung
Achondroplasie 10 Zwergwuchs
Aniridie 2,6 Iris-Fehlen, -Defekt
M. Huntington < 1 Bewegungsstörung, Psychosen etc.
Marfan-Syndrom 4-6 Hochwuchs, Aortenruptur etc.
Neurofibromatose Typ I 40-100 Gutartige ZNS-Tumoren/Haut
Osteogenesis imperfecta 10 Glasknochenkrankheit
Polyzyst. Nierenerkrankung 60-120 Zystennieren, Nierenversagen
Retinoblastom 5-12 Netzhauttumore
Mutationen: hot spots
• spezifische Basensequenzen– (z.B. GC-reiche Abschnitte, CpG-Nukleotide 5-Methylcytosin)
• kurze repetitive Sequenzen– Replikations- und/oder Reparaturenzyme verursachen Fehler
• palindromische Sequenzen– oft assoziiert mit Insertionen oder Deletionen
• Duplikationen größerer Regionen – Fehlpaarung in Meiose durch Pseudogene/ repetitive Sequenzen
Punktmutationen
Transitionen (Pu Pu; Py Py)
Transversionen (Pu ↔ Py)
spontane Depurinierung, Depyrimidierung, Desaminierung
stumme (kein AS-Austausch) DNA-Polymorphie
neutrale (keine Aktivitätsänderung des Proteins)
missense (geänderter AS-Rest/Leserahmen erhalten)
nonsense (vorzeitiger Translationsstop)
[Insertion/Deletion]
Punktmutation
C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA
G A A T C A C T G A T G C C A T T T
C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA
Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein
C T T A G C G A C T A C G G T A A ADNA
G A A T C G C T G A T G C C A T T T
C U U A G C G A C U A C G G U A A A RNA
Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Proteinstumm/still
Punktmutation
C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA
G A A T C A C T G A T G C C A T T T
C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA
Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein
C C T A G T G A C T A C G G T A A ADNA
G G A T C A C T G A T G C C A T T T
C C U A G U G A C U A C G G U A A A RNA
Pro Ser Asp Tyr Gly Lys Proteinmissense
Punktmutation
C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA
G A A T C A C T G A T G C C A T T T
C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA
Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein
C T T A G T G A C T A G G G T A A ADNA
G A A T C A C T G A T C C C A T T T
C U U A G U G A C U A G G G U A A A RNA
Leu Ser Asp Stop Proteinnonsense
Punktmutation: Insertion
C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA
G A A T C A C T G A T G C C A T T T
C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA
Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein
C T T A G T T G A C T A C G G T A A ADNA
G A A T C A A C T G A T G C C A T T T
C U U A G U U G A C U A C G G U A A A RNA
Leu Ser Stop Protein
Punktmutation: Deletion
C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA
G A A T C A C T G A T G C C A T T T
C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA
Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein
C T T A G G A C T A C G G T A A A...DNA
G A A T C C T G A T G C C A T T T...
C U U A G G A C U A C G G U A A A... RNA
Leu Arg Thr Thr Val Lys ProteinLeseraster-Verschiebung
Induzierte Mutationen
• Chemikalien + Strahlung Mutationen
• Mutagene (mutagen wirkende Substanzen)
• Karzinogene (karzinogen wirkende Sustanzen)
• Alkylantien (entfernen Base)
• Akridine (Entfernung / Einfügung von Basen)
• Röntgenstrahlen (Chromosomenbrüche, Deletionen)
• UV-Strahlung (Thymidin-Dimere)
DNA-Reparatur
• Fehler in DNA-Replikation / -Schädigung
Mutationen
• allermeiste Fehler in Zellen repariert
• verschiedene Reparaturmechanismen
• Mutationen in DNA-Replikation 1 : 108 Basen
Mismatch Reparatur
• mismatch repair-Enzyme erkennen in ReplikationBasenfehlpaarungen im neusynthetisierten DNA-Strang
• fehlerhafte Base korrigiert
• mismatch proof reading
AC
P.Modrich
Excisions-Reparatur
• schadhafter DNA-Abschnitt/Base excidiert, mittels DNA-Polymerase ersetzt: Nukleotid-Excision
• Austausch <20 Nukleot./1 Base
• UVB-Schäden, Karzinogene
Einzelbasen-Excision
• 1-5 Basen ersetzt
• repariert oxidative Schäden
C=C
UV
C=C
C=C
T. LindahlA. Sancar
DNA-Reparatur
• Versagen DNA-Reparaturmechanismen Mutationen
• somatische Gewebe “altern”
• umfangreiche Schäden programmierter Zelltod (Apoptose) betroffener Zellen (p53-induziert)
• Mutationen in Genen für DNA-Reparatur-Enzyme Mutationen, vorzeitiges Altern
Erbl. Störungen der DNA-Replikation und -Reparatur
Erkrankung Frequenz Defekt
Ataxia telangiectasia 1/40,000 Kinase-Defekt in Zellzyklus-
Kontrolle
Bloom-Syndrom 100 Fälle
seit 1950
DNA-Ligase-Defekt
Fanconi-Anämie 1/22,000 best.
Populationen
defekte Excissionsreparatur
Hereditary nonpolyposis
colon cancer (HNPCC)
1/200 Mismatch Repair-Defekt
Werner-Syndrom 3/1,000,000 Helicase-Defekt
Xeroderma pigmentosum 1/250,000 defekte Excissionsreparatur
Trichothiodystrophie <100 Fälle defekte Excissionsreparatur
Hämoglobin
• 4 Globin-Proteineumgeben 4 Häm-Gruppen (Fe-Atom): je 2 - + -Ketten
• O2-TransportLunge PeripherieCO2 Lunge
β-Kette
α-KetteHäm
Basenaustausch im HBB-Gen Sichelzell-Anämie
Wildtyp mutiert. Allel
(HbS Glu6Val)
Normale Erythrozyten
Sichelzell-Form
…ACT CCT GAG GAG AAG…
…Thr Pro Glu Glu Lys…6
…ACT CCT GTG GAG AAG…
…Thr Pro Val Glu Lys…6
HBB-Genotyp Sichelzellanämie-Phänotyp
• Sichelzell-Anämie war 1. Erkrankung mit definiertermolekularer Ursache
• Phänotyp bei homozygoten Mutationsträgern:
– verändertes Hb präzipitiert im desoxygenierten Zustand Erythrozyten sicheln
– hämolytische Anämie, Infarkte, Skelettstörungen
• heterozygote Anlageträger häufiger in Malaria-Endemiegebieten: Resistenz
evolutionärer Selektionsvorteil