Bioraffinage de sous-produits de l’épinard (Spinacia ...€¦ · Using supercritical fluid extraction along with ethanol as modifier, the optimal extraction parameters allowed

Bioraffinage de sous-produits de l’épinard (Spinacia oleracea L.) : comparaison de

méthodes vertes pour l’extraction de composés phytochimiques bioactifs

Thèse

Maëlle Derrien

Doctorat en sciences et technologie des aliments

Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

© Maëlle Derrien, 2017

Bioraffinage de sous-produits de l’épinard (Spinacia oleracea L.) : comparaison de méthodes vertes pour l’extraction de composés phytochimiques bioactifs

Thèse

Maëlle Derrien

Sous la direction de :

Paul Angers, directeur de recherche

André Gosselin, codirecteur de recherche

Yacine Boumghar, codirecteur de recherche

III

Résumé

L’industrie maraichère génère une quantité importante de sous-produits pouvant

être valorisés pour leurs contenus en biomolécules. Les composés phytochimiques issus

des fruits et des légumes présentent des effets bénéfiques sur la santé humaine et animale,

comme le rapporte la littérature. Cependant, une des problématiques majeures actuelle est

que l’extraction des molécules naturelles utilisent des solvants pétrochimiques, issus de

sources fossiles non renouvelables et présentant une certaine toxicité pour

l’environnement, les consommateurs et aussi les opérateurs.

L’épinard est un légume feuillu riche en composés bioactifs tels que les

polyphénols, la lutéine et la chlorophylle. Ces deux derniers présentent des effets

antioxydants, anti-inflammatoire, anti-génotoxique majoritairement au niveau des yeux

pour la lutéine et du côlon pour la chlorophylle.

Le présent projet a donc pour objectif principal de développer un procédé

d'extraction et de séparation de deux biomolécules d’intérêts, la lutéine et la chlorophylle,

à partir de sous-produits d’épinard. L’efficacité d’extraction des différents procédés a été

comparée à l'extraction totale traditionnelle des molécules avec des solvants organiques

peu polaires. Trois procédés écologiques ont été optimisés : une extraction à l’eau et à

l’éthanol, un procédé utilisant une saponification pour permettre la séparation de la lutéine

et de la chlorophylle et une extraction au CO2 supercritique. Une modélisation permettant

la prédiction de la solubilité des molécules dans le solvant supercritique a également été

réalisée afin de limiter et de valider les essais expérimentaux. Aussi, le procédé montrant

les meilleurs résultats a fait l’objet d’une analyse technico-économique afin d’étudier sa

faisabilité à l’échelle industrielle.

Les résultats montrent que l’extraction à l’eau et à l’éthanol est efficace à 70% et à

96% pour extraire respectivement la lutéine et la chlorophylle en utilisant les paramètres

retenus par le modèle statistique avec un rendement en matière de 1,4%. Toutefois, ce

procédé nécessite de nombreuses étapes, de grands volumes de solvant et ne sépare pas la

lutéine et la chlorophylle. Le procédé utilisant la saponification permet une séparation

efficace de ces deux molécules, mais engendre d’importantes dégradations de la lutéine

IV

(récupération de 27% de lutéine avec un rendement en matière de 0,63%). Il utilise aussi

de grandes quantités de solvant, de nombreuses étapes et est en plus dangereux pour le

personnel (utilisation de NaOH). L’extraction par fluide supercritique permet quant à elle,

avec les paramètres retenus par le modèle statistique, un rendement de 70% en lutéine et

de 50% en chlorophylle avec un rendement en matière de presque 3%, sans inconvénient

majeur. La modélisation de la solubilité, utilisant la théorie de Charles Hansen adaptée aux

conditions supercritique, rejoint les résultats obtenus expérimentalement et de fait s’avère

efficace pour la prédiction de la solubilité des biomolécules dans le solvant supercritique.

L’extraction par fluide supercritique est donc une méthode de choix pour l’extraction de la

lutéine et de la chlorophylle et répond à tous les principes de la chimie verte. Dans notre

cas, l’addition d’un co-solvant est nécessaire pour augmenter la solubilité de nos molécules

dans le solvant supercritique. L'ajout de co-solvants est connu pour augmenter les coûts de

production et d’investissement du procédé supercritique. Ainsi, la simulation du procédé à

l’échelle industrielle et son analyse économique ont permis de conclure quant à sa

faisabilité et sa rentabilité à l’échelle industrielle. Les résultats ont montré un coût

d’investissement total de 5 555 000 USD, avec un prix fixe d’investissement de 4 721 240

USD. Le coût de production annuel a été estimé à 1 800 000 USD, correspondant à un coût

spécifique de 1700 USD par kg d’extrait produit.

Les résultats ont donc montré que tous les procédés développés répondaient aux

objectifs de départs en respectant les principes de la chimie verte appliquée à l’extraction

de composés phytochimiques. Toutefois, les meilleurs résultats ont été obtenus avec

l’extraction par fluide supercritique. Néanmoins, cette technologie s’avère très couteuse à

mettre en place dans une industrie. De fait, le procédé vert le plus applicable à l’échelle

industrielle et permettant une séparation de la lutéine et de la chlorophylle est le procédé

utilisant une étape de saponification.

V

Abstract

Industrial vegetable by-products contain high levels of valuable phytochemicals

that can be used as a rich source of biomolecules. Phytochemical compounds from fruits

and vegetables exhibit several benefits on human and animal health, as reported in the

literature. However, the extraction of these natural molecules is still carried out using

petrochemical harmful solvents, from non-renewables fossil sources exhibiting

environmental, and health toxicity. Spinach is a leafy vegetable highly concentrated in

bioactive compounds such as polyphenols, lutein and chlorophyll. The latter two exhibit

antioxidant, anti-inflammatory, anti-genotoxic effects.

The main objective of this project was to develop an extraction process technology

for the recovery of two highly valuables biomolecules, lutein and chlorophyll, using

spinach by-products and respecting the main principles of green chemistry. This work

focused on the development and optimization of 3 ecological extraction and separation

processes of these phytochemicals, using conventional green extraction methods with

green solvents (water and ethanol, NaOH) and innovative technologies, supercritical CO2.

The extraction efficiency has been compared to the total extraction of lutein and

chlorophyll obtained with petrochemical solvents. Solubility prediction of the studied

molecules in the supercritical solvent was also carried out in order to decrease the

experimental tests number and validate the results. Finally, a technical-economic analysis

was performed in order to evaluate the feasibility of an industrial scal-up of the most

promising developed process.

A green extraction method, using ethanol and water as extraction solvents was

developed in order to extract these plant compounds from spinach by-products. The

optimal extraction parameters predicted were 93% ethanol concentration, for 4.3 h at 43°C

and a solvent to raw material ratio of 1/66. These parameters gave a recovery of 96% of

chlorophyll and 70% of lutein, along with an extraction yield of 1.4%. However, this

process was not efficient for the separation of the two compounds and furthermore, used

high amount of extraction solvents. A saponification in an aqueous medium was carried

out to hydroxylate the ester bond of the aliphatic chain of chlorophyll. Through this

VI

process, using the Derringer’s desirability function, the optimal conditions for separation

were 16 h of saponification, at 60°C and with 3.9% of sodium hydroxide. The process can

be streamlined in a commercial extraction process for these compounds. However, the

saponification step resulted in a significant degradation of lutein (only 27% of lutein was

recovered, with an extraction yield of 0.63%). Using supercritical fluid extraction along

with ethanol as modifier, the optimal extraction parameters allowed the recovery of 70%

of the lutein and 50% of the chlorophyll, with a yield of almost 3% without major

drawback. The supercritical fluid extraction is therefore a valuable method for extracting

lutein and chlorophyll while complying to all green chemistry tenet. The addition of

modifier for the extraction of these phytochemicals was needed, known to increase the

capital and production cost of SC-CO2 process. Thus, process design and economic

analysis of the process was studied to conclude about the viability and the feasibility of the

eventual SC-CO2 proposed process for the replacement of conventional one for the

recovery of spinach extracts rich in lutein and chlorophyll. The results exhibited a total cost

of investment (TCI) of 5,555,000 USD, along with a fixed cost of investment (FCI) of

4,721,240 USD. The yearly production cost was estimated at 1,800,000 USD.

The optimization of the optimum extraction conditions requires a critical analysis.

The objective of this project was also to develop a predictive approach based on the Hansen

solubility theory to ascertain and optimize the solubility of solutes, in supercritical carbon

dioxide (SC-CO2). The predictive approach was then considered an efficient tool regarding

the solubility of solutes in SC-CO2 and can be used to estimate the condition for solutes-

SC-CO2 optimum miscibility in a wide range of pressure.

Finally, we showed that processes developed in this project respected all the green

chemistry principles applied to the extraction of phytochemicals and thus meet the

objective of the project. The best results are obtained with supercritical fluid extraction.

However, this technology necessitates high investment which can limit the profitability of

the technique. We thus recommend to adopt a process using a saponification step for the

separation of lutein and chlorophyll.

VII

Table des matières

Résumé .....................................................................................................................III

Abstract ..................................................................................................................... V

Table des matières ................................................................................................... VII

Liste des figures ..................................................................................................... XII

Liste des tableaux................................................................................................. XIV

Remerciements ....................................................................................................... XVI

Avant-propos ........................................................................................................ XVIII

Introduction ............................................................................................................... 1

1 État de l’art ......................................................................................................... 3

1.1 Valorisation de sous-produits issus de l’agriculture : Choix de l’épinard. ..................4

1.1.1 Valorisation des déchets et chimie verte : Principes ................................................. 4

1.1.2 L’épinard : Botanique et production mondiale ......................................................... 4

1.2 Intérêt santé de l’épinard .......................................................................................6

1.3 Les composés majeurs d’intérêt dans l’épinard .......................................................8

1.3.1 La chlorophylle ........................................................................................................... 8

1.3.2 La lutéine ................................................................................................................. 11

1.4 Purification et extraction des molécules à l’étude ................................................. 14

1.4.1 Techniques d’extractions conventionnelles ............................................................ 14

1.4.2 Techniques d’extraction innovantes ....................................................................... 15

1.4.3 Méthodes de purification ........................................................................................ 17

1.5 La sélection de solvants et la chimie verte ............................................................ 18

1.6 Les fluides supercritiques ..................................................................................... 21

1.6.1 Introduction ............................................................................................................. 21

1.6.2 L’état supercritique : définition ............................................................................... 22

1.6.3 Choix du solvant supercritique ................................................................................ 23

1.6.4 Propriétés de transport ........................................................................................... 24

1.6.5 Effet des conditions opératoires sur la solubilité du SC-CO2 ................................... 25

1.6.6 Cinétique et transfert de masse de l’extraction par SC-CO2 .................................... 26

VIII

1.6.7 Prétraitement de la matière de départ ................................................................... 27

1.6.8 Équipement ............................................................................................................. 28

1.6.9 Extraction de la lutéine et de la chlorophylle par le CO2 supercritique .................. 29

1.7 Applications industrielles et analyse technico-économique ................................... 30

1.7.1 Mise à l’échelle industrielle : étude des paramètres opérationnels ....................... 30

1.7.2 Estimation des coûts de production ........................................................................ 30

1.7.3 Comparaison économique des procédés conventionnels et supercritiques .......... 32

1.8 Prédiction de la solubilité des composés phytochimiques dans un solvant :

Application de la théorie de Hansen à la lutéine et chlorophylle dans un solvant

supercritique. .................................................................................................................. 33

2 Problématique, hypothèse de recherche, objectif principal et objectifs spécifiques

40

2.1 Problématique ..................................................................................................... 41

2.2 Hypothèse de recherche....................................................................................... 41

2.3 Objectif principal ................................................................................................. 41

2.4 Objectifs spécifiques ............................................................................................ 42

3 Optimization of a green process for the extraction of lutein and chlorophyll from

spinach by-products using response surface methodology (RSM) .............................. 43

3.1 Transition contextuelle ........................................................................................ 44

3.2 Résumé ............................................................................................................... 45

3.3 Abstract ............................................................................................................... 46

3.4 Introduction ........................................................................................................ 47

3.5 Materials and methods ........................................................................................ 49

3.5.1 Chemicals ................................................................................................................. 49

3.5.2 Methods ................................................................................................................... 49

3.6 Results ................................................................................................................. 53

3.6.1 Quantification of lutein and chlorophyll in spinach ................................................ 53

3.6.2 Accuracy and variance analysis of the regression model ........................................ 57

3.6.3 Analysis the effects of extraction parameters on lutein and chlorophyll

extractability ......................................................................................................................... 63

3.6.4 Optimization of the extraction parameters ............................................................. 64

IX

3.7 Discussion ............................................................................................................ 64

3.8 Conclusion ........................................................................................................... 66

3.9 Acknowledgements.............................................................................................. 67

4 Optimization of a sustainable purification of lutein and chlorophyll from spinach

by-products by a saponification procedure using Box Behnken design and desirability

function. ................................................................................................................... 68


4.2 Résumé ............................................................................................................... 70

4.3 Abstract ............................................................................................................... 71

4.4 Introduction ........................................................................................................ 72

4.5 Material and methods .......................................................................................... 74

4.5.1 Plant material .......................................................................................................... 74

4.5.2 Chemicals ................................................................................................................. 74

4.5.3 Methods ................................................................................................................... 74

4.6 Results and discussion .......................................................................................... 78

4.6.1 Observation and analysis of the preliminary results ............................................... 78

4.6.2 Effects of saponification parameters on lutein and chlorophyll recovery in the

ethanolic extract: analysis of the statistical data ................................................................. 81

4.6.3 Analysis of variance of the model ............................................................................ 86

4.6.4 Quantification of chlorophyllin in the first aqueous medium ................................. 87

4.6.5 Optimization saponification parameters ................................................................. 87

4.7 Conclusion ........................................................................................................... 89

4.8 Acknowledgements.............................................................................................. 90

5 Optimization of a sustainable SC-CO2 extraction of lutein and chlorophyll from

spinach by-products using response surface methodology ......................................... 91


5.2 Résumé ............................................................................................................... 93

5.3 Abstract ............................................................................................................... 94

5.4 Introduction ........................................................................................................ 95

5.5 Material and methods .......................................................................................... 97

5.5.1 Plant material .......................................................................................................... 97

X

5.5.2 Chemicals ................................................................................................................. 97

5.5.3 Experimental method .............................................................................................. 98

5.5.4 HPLC analysis ......................................................................................................... 101

5.6 Results and discussion ........................................................................................ 102

5.6.1 Screening of SFE studied variables ........................................................................ 102

5.6.2 Effect of extraction factors on the extraction of lutein and chlorophyll ............... 103

5.6.3 Mathematical treatment of data and evaluation of the fitted model .................. 111

5.6.4 Selectivity of the supercritical solvent ................................................................... 112

5.6.5 Determination of the optimum conditions ........................................................... 113

5.6.6 Comparison with a conventional green extraction process .................................. 115

5.7 Conclusion ......................................................................................................... 115

5.8 Acknowledgements............................................................................................ 116

6 Modelization of the supercritical carbon dioxide solubility of carotenoids and

chlorophyll using Hansen theory ............................................................................. 117

6.1 Transition contextuelle ...................................................................................... 118

6.2 Résumé ............................................................................................................. 119

6.3 Abstract ............................................................................................................. 120

6.4 Introduction ...................................................................................................... 121

6.5 Material and methods ........................................................................................ 123

6.5.1 Experimental extraction of lutein and chlorophyll using supercritical carbon dioxide

(SC-CO2) ............................................................................................................................... 123

6.5.2 Computational method ......................................................................................... 126

6.5.3 Solute solubility parameters determination.......................................................... 129

6.6 Results ............................................................................................................... 130

6.6.1 Experimental results .............................................................................................. 130

6.6.2 Effects of extraction parameters ........................................................................... 130

6.6.3 Computational results ........................................................................................... 133

6.7 Discussion .......................................................................................................... 138

6.8 Conclusion ......................................................................................................... 140


XI

7 Supercritical fluid extraction from spinach by-products: process design and

economic analysis ................................................................................................... 142

7.1 Transition contextuelle ...................................................................................... 143

7.2 Résumé ............................................................................................................. 144

7.3 Abstract ............................................................................................................. 145

7.4 Introduction ...................................................................................................... 146

7.5 Modeling ........................................................................................................... 148

7.5.1 Raw material: Spinach by products ....................................................................... 148

7.5.2 Operational conditions .......................................................................................... 148

7.5.3 Process model and extraction system: equipment capacity ................................. 148

7.5.4 Description of the extraction section .................................................................... 151

7.5.5 Description of the separation section ................................................................... 151

7.5.6 Description of the modifier separation and recycle section ................................. 151

7.6 Economic analysis .............................................................................................. 152

7.7 Results and discussion ........................................................................................ 154

7.7.1 Selection of operating conditions .......................................................................... 154

7.7.2 Economic analysis .................................................................................................. 158

7.7.3 Profitability analysis ............................................................................................... 165

7.8 Conclusion ......................................................................................................... 167


8 Discussion, conclusion et perspectives ............................................................. 168

8.1 Discussion .......................................................................................................... 169

8.2 Conclusion ......................................................................................................... 177

8.3 Perspectives ...................................................................................................... 177

9 Bibliographie ................................................................................................... 179

XII

Liste des figures Figure 1-1: Situation mondiale de la production d'épinard (Source : FAO STAT

http://www.fao.org/faostat/fr/#data/QC/visualize) ............................................. 5

Figure 1-2: Répartition mondiale de la production d'épinard (Source : FAO STAT

http://www.fao.org/faostat/fr/#data/QC/visualize) ............................................. 6

Figure 1-3: Structure de la chlorophylle ............................................................................. 8

Figure 1-4: Structure de la lutéine .................................................................................... 13

Figure 1-5: Diagramme de phase d’un composé pur ........................................................ 22

Figure 1-6: Visualisation du passage à l'état supercritique ............................................... 24

Figure 1-7: Variation de la densité d'un corps pur en fonction de son état de la matière.

Adapté de Bendaoud A. (Bendaoud, 2014) ............................................................... 24

Figure 1-8 : Courbe de suivi cinétique montrant les différentes périodes de transfert de

masse pendant l’extraction par fluide supercritique (exemple de l’épinard) ............ 27

Figure 1-9: diagramme de l'installation de laboratoire utilisée pour les extractions ........ 29

Figure 1-10: Représentation de la solubilité totale du CO2 supercritique obtenue par

utilisation de l’équation 1.6, donc en fonction de la pression et de la température. . 38

Figure 1-11: Sphère de solubilité de Hansen .................................................................... 39

Figure 3-1: HPLC chromatogram of total extraction of lutein and chlorophyll obtained

using conventional solvent extraction i.e acetone, measured at 450 nm by UV/vis

detector ...................................................................................................................... 54

Figure 3-2: Response surface 3D plots showing the interaction effect of extraction

temperature and solvent concentration on lutein yield ............................................. 59


temperature and solvent concentration on chlorophyll yield .................................... 60

XIII

Figure 4-1: RP-HPLC chromatograms of lutein and chlorophyll from spinach by-products,

on a C30 column, at 450 nm (see Material and Methods for details). A) acetone

extract; B) ethanolic extract performed after saponification. Peak identification: (1)

chlorophyll b ............................................................................................................. 80

Figure 4-2: Response surface plots of chlorophyll recovery from spinach by-products for

different combinations of saponification parameters (time, temperature and

concentration of sodium hydroxide). ........................................................................ 84

Figure 4-3: Response surface plots of lutein recovery from spinach by-products for


concentration of sodium hydroxide). ........................................................................ 85

Figure 5-1: SC-CO2 process flow diagram ....................................................................... 99

Figure 5-2: HPLC chromatogram of SC-CO2 of extraction of lutein and chlorophyll

obtained at different extraction conditions measured at 450 nm by UV/vis detector.

Peak identification: (1) lutein (2) β-caroten (3) chlorophyll b (4) chlorophyll a. ... 105

Figure 5-3: Prevision 3D plots outputs after maximization of the desirability function for

extraction yields of lutein and chlorophyll ............................................................. 114

Figure 6-1: SC-CO2 process flow diagram .................................................................... 126

Figure 7-1: Process flow diagram of the design factory ................................................. 152

Figure 7-2: 3D plots exhibiting the influence of pressure and temperature on the extraction

yield......................................................................................................................... 156


obtained at different extraction combination parameters, with and without modifier,

at 450 nm by UV/vis detector. Peak identification: (1) lutein (2) 𝛽-caroten (3)

chlorophyll b (4) chlorophyll a. .............................................................................. 157

Figure 7-4: Direct manufacturing cost repartition, in percentage ................................... 159

Figure 7-5: Cost of utilities repartition in percentage ..................................................... 160

XIV

Liste des tableaux Tableau 1-1: Présentation des techniques d’extraction conventionnelles......................... 15

Tableau 1-2: Présentation des différents solvants verts .................................................... 20

Tableau 1-3: Températures et pressions critiques de différents composés purs ............... 23

Tableau 3-1: Box Behnken matrix with predicted and experimental response values for

lutein and chlorophyll ............................................................................................... 55

Table 3-2: Analysis of variance (ANOVA) of quadratic polynomial model for lutein and

chlorophyll responses................................................................................................ 57

Table 3-3: Regression coefficients for the estimated yields in lutein and chlorophyll ..... 61

Tableau 4-1: : Recovery of lutein and chlorophyll for different combinations of

saponification parameters ......................................................................................... 81

Tableau 4-2: Regression coefficients for the lutein and chlorophyll variable .................. 82

Table 4-3: Multivariate analysis and desirability value predict by the statistical model .. 89

Tableau 5-1: Regression coefficients for the estimated yields in lutein and chlorophyll 107

Tableau 5-2: Regression coefficients for the estimated yields in lutein and chlorophyll 109

Table 6-1: Experimental results of ScCO2 extraction of lutein and chlorophyll ............ 132

Tableau 6-2: Structures and hansen solubility parameters of Lutein and Chlorophyll... 134

Table 6-3: Hansen solubility parameters of CO2 at different conditions ........................ 136

Table 6-4: Distance and solubility of lutein and chlorophyll in different conventional

solvents ................................................................................................................... 137

Table 6-5: Distance and solubility of lutein and chlorophyll at different pressure condition

of ScCO2 ................................................................................................................. 138

XV

Tableau 7-1: Operating conditions used to run the simulation ....................................... 150

Tableau 7-2: Repartition of the equipment energetic consumption per batch ................ 161

Tableau 7-3: Total yearly operating cost calculation based on the Turton methodology162

Tableau 7-4: Yearly cost directly connected to the operation for the design plant ........ 166

Tableau 8-1: Rendements d'extraction de l'expérience par fluide supercritique ............ 173

XVI

Remerciements Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de thèse, Paul Angers, pour m’avoir

donné l’opportunité de réaliser ce doctorat et de mener à bien ce projet. Aussi, j’ai apprécié

la liberté de décision au cours de ces années, m’ayant permet d’acquérir beaucoup

d’autonomie. Je voudrais aussi le remercier pour son soutien et ses conseils tout au long de

cette thèse. Je tiens également à remercier André Gosselin, co-directeur de ce projet, pour

avoir partagé sa vision industrielle du projet à travers ce fructueux partenariat industriel

avec DianaFoodCanada (anciennement Nutra Canada). Je voudrais également remercier

Yacine Boumghar, également co-directeur du projet, pour m’avoir permis d’accéder aux

équipements du CEPROCQ et de fait m’avoir permis d’acquérir des précieuses

connaissances sur les fluides supercritiques et les procédés chimiques. Aussi, je voudrais

le remercier pour sa disponibilité et sa confiance en me confiant des projets très

intéressants, ainsi que son très bon suivi dans les révisions de mes articles. Je remercie

aussi Yves Desjardins pour sa grande disponibilité et ses révisons de qualités de mes

articles. J’ai grandement apprécié vos conseils donnés tout au long de ma thèse. Je tiens

également à remercier Milad Aghabaranejad pour sa grande disponibilité, ses conseils et

la révision de mes articles.

Je tiens aussi à exprimer ma gratitude envers les partenaires industriels du projet,

DianaFood et Vegpro international. Aussi, je voudrais remercier le Fond de recherche

nature et technologie du Québec (FRQNT) et le conseil de recherches en sciences naturelles

et en génie du Canada (CRSNG) pour le financement de cette thèse par l’obtention d’une

bourse BMP (Bourse en milieu pratique).

Je tiens également à remercier l’équipe de la plateforme analytique, Pascal Dubé,

Véronique Richard, Perrine Feutry et Stéphanie Dudonné pour leurs disponibilités, leurs

conseils, la qualité de leurs expertises et leur soutien tout au long de ces 3 années. Merci

également à mes collègues de laboratoire Ashraf, Christiana, Minty, Rafik, Ines, Ishrak

pour les moments passés ensembles. Aussi, je voudrais remercier le personnel du

CEPROCQ pour leurs disponibilités et leurs patiences au cours de mon passage.

Je voudrais également remercier tous mes collègues et amis INAFiens, Camille,

Mérilie, Joseph, Alex, Ana-Sofia, Juan, Jeremie, Benedicte, Lémia et tous les autres pour

XVII

les lunchs, les moments passés au soccer (Vive l’équipe des Bas-Longs !) ainsi que les

nombreux restos, soirées et 5 à 7 partagés. Une petite pensée supplémentaire à Jérémie,

Perrine et Véro pour les pauses chocolats bien méritées à leur bureau.

Je voudrais également remercier tous mes amis Vincent, Marine, Benjamin,

Samuel, Marie Lugaz, Marie Verheyde, Valentin, Camille, Mérilie, Émilie et Francis, de

fait, à tous les membres abonnés de la cagette espagnole, pour leurs soutiens, les moments

passés ensemble et leur présence assidue aux apéros.

Je voudrais remercier bien évidemment mes parents, pour m’avoir encouragée et

soutenu tout au long de cette thèse par les nombreux appels Skype. Merci également de

m’avoir donné tout au long de ma vie les outils me permettant de prétendre maintenant au

grade de docteur. Cette réalisation est en grande partie possible grâce à vous.

Je tiens également à remercier Jeremy, mon partenaire de vie, qui a été

suffisamment patient pour me soutenir et me supporter au cours de ces 3 années de thèse

même dans mes moments de stress et de doutes. Merci également de me soutenir ou de me

canaliser dans toutes mes idées un peu « farfelues » (Le Mont Denali en Alaska c’est

toujours non ?)

XVIII

Avant-propos Cette thèse comporte 8 chapitres. Les résultats principaux sont présentés sous forme

d’articles scientifiques, soumis ou publiés dans des journaux avec comités de lecture. Le

premier chapitre introduit le sujet en présentant l’état de l’art concernant les propriétés

santé de l’épinard, reliés directement à son contenu en biomolécules, notamment en lutéine

et en chlorophylle. Aussi, ce premier chapitre présente le principe de l’extraction verte et

son enjeu dans la société, avec une brève introduction aux méthodes conventionnelles et

novatrices qui y sont associées. Ces méthodes d’extraction écologiques constituent une

bonne solution de remplacement des solvants pétrochimiques, toujours utilisés pour

l’extraction des biomolécules dans le monde de l’industrie pharmaceutique et

nutraceutique.

À la suite de cette revue de la littérature, le chapitre 2 présente la problématique et

l’hypothèse de ce projet, dont découleront naturellement l’objectif principal et les objectifs

spécifiques. S’en suivra dans les chapitres 3, 4, 5, 6 et 7, contenant les résultats principaux

répondant aux différents objectifs présentés.

Le chapitre 3 présente une optimisation de l’extraction écologique de la lutéine et

de la chlorophylle à partir de sous-produits d’épinards selon une méthode d’extraction

conventionnelle avec utilisation d’eau et d’éthanol, deux solvants verts, et des surfaces de

réponse comme outil statistique. Les résultats ont été publiés sous forme d’un article

scientifique intitulé Optimization of a green process for the extraction of lutein and

chlorophyll from spinach by-products using response surface methodology (RSM),

publié dans LWT, journal of Food Science and Technology dont les auteurs sont Maëlle

Derrien ; Ashraf Badr ; André Gosselin ; Yves Desjardins ; Paul Angers. (79, 170–177.

http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2017.01.010)

Le chapitre 4, présente une optimisation de l’extraction et une séparation de la

lutéine et de la chlorophylle à partir de sous-produit d’épinard avec des solvants verts et de

l’hydroxyde de sodium. Cet article a été soumis au Journal of Food Engineering et s’intitule

Optimization of a sustainable purification of lutein and chlorophyll from spinach by-

products by a saponification procedure using Box Behnken design and desirability

XIX

function. Les auteurs sont Maëlle Derrien; Ashraf Badr; André Gosselin; Yves Desjardins;

Paul Angers.

Le chapitre 5 introduit l’extraction de la lutéine et de la chlorophylle par fluide

supercritique et l’optimisation des paramètres en adoptant les principes des surfaces de

réponses comme outils statistique. Ce chapitre fait aussi l’objet d’une publication qui

s’intitule Optimization of a sustainable SC-CO2 extraction of lutein and chlorophyll

from spinach by-products using response surface methodology, accepté dans LWT,

journal of Food Science and Technology. Les auteurs sont Maëlle Derrien, Milad

Aghabaranejad, André Gosselin, Yves Desjardins, Paul Angers, Yacine Boumghar.

Le chapitre 6, présente le développement d’un outil de prédiction de la solubilité

des composés phytochimiques dans le dioxyde de carbone supercritique. Ce chapitre fait

l’objet d’un article scientifique, soumis à journal of supercritical fluids et s’intitule

Modelization of the supercritical carbon dioxide solubility of carotenoids and

chlorophyll using Hansen theory. Les auteurs sont Maëlle Derrien, Milad

Aghabaranejad, André Gosselin, Yves Desjardins, Paul Angers, Yacine Boumghar.

Le chapitre 7 étudiera la faisabilité du procédé d’extraction de la lutéine et de la

chlorophylle par fluide supercritique par une analyse technico-économique du procédé. Ce

chapitre fait également l’objet d’un article scientifique, soumis à journal of supercritical

fluids dont les auteurs principaux sont Maëlle Derrien, Milad Aghabaranejad, André

Gosselin, Yves Desjardins, Paul Angers, Yacine Boumghar. Cet article s’intitule

Supercritical fluid extraction from spinach by-products: process design and economic

analysis.

Enfin, le chapitre 8 présente une discussion plus large et une conclusion faisant le

lien entre tous les chapitres présentés et tout en faisant ressortir les perspectives qui

découlent de ce projet.

XX

L’auteur de la thèse, à savoir Maëlle Derrien, était responsable de la planification,

de l’exécution des manipulations aux laboratoires, ainsi qu’à l’interprétation de ces

derniers et aussi à la rédaction des différents articles présentés. L’auteur est d’ailleurs le

premier auteur de tous les articles rédigés dans le déroulement de cette thèse. Le Dr Paul

Angers, directeur de la thèse, et les Dr André Gosselin, Yacine Boumghar, co-directeurs

de la thèse ont participé à la planification des travaux de recherche, à la discussion des

résultats lors de réunions ainsi qu’à la révision des articles présentés. Le Dr Yves

Desjardins a également participé à la planification des travaux de recherche, à la discussion

des résultats lors de réunions ainsi qu’à la révision des articles présentés. Le Dr Milad

Aghabaranejad a participé à l’interprétation et à la discussion des résultats, a réalisé la

simulation du procédé à l’échelle industrielle sur Aspen présenté au chapitre 7 et enfin à la

révision des articles présents dans les chapitres 5, 6 et 7. Le Dr Ashraf Badr a contribué à

la discussion des résultats et la planification des expériences conventionnelles (chapitres 3

et 4).

1

Introduction De nombreuses études épidémiologiques ont montré qu'une alimentation saine et riche en

fruits et légumes a un impact positif sur la santé et réduit l’incidence négative du risque

de plusieurs maladies chroniques comme le cancer, les maladies cardio-vasculaires, le

diabète. En plus d’une alimentation saine, l’engouement des consommateurs pour les

compléments alimentaires et les aliments fonctionnels, composés ou enrichis en

molécules issus des plantes n’a cessé de croître au fils des années (Ferruzzi and

Blakeslee, 2007a; Herrero et al., 2006). En effet, tout comme une alimentation saine, ces

composés sont à l’origine d’effets bénéfiques sur les fonctions physiologiques en

augmentant le bien-être et en diminuant les risques des différentes pathologies citées plus

haut. Ce phénomène s'explique par la présence de composés phytochimiques contenus

dans les plantes. Ces dernières possèdent en effet plusieurs groupes de molécules ayant

une activité biologique avérée agissant sur les cellules de notre organisme. Ces molécules

appartiennent par exemple à la famille des polyphénols, terpénoïdes, alcaloïdes et des

composés soufrés. Les composés phytochimiques sont connus pour leur capacité à

stimuler la réponse immunitaire et aussi leurs propriétés antioxydantes, anti-radicalaires,

anti-inflammatoires (Dudonne et al., 2009; Humayoun Akhtar and Bryan, 2008).

De ce fait, il est intéressant d’effectuer une valorisation des molécules bioactives

contenues dans les fruits et légumes. Beaucoup de légumes déclassés ou rejetés par

l’industrie maraîchère contiennent de fortes concentrations en de molécules

fonctionnelles, mais restent peu exploités. La valorisation de ces sous-produits végétaux

est donc susceptible de fournir des extraits riches en composés fonctionnels leur donnant

des propriétés bénéfiques pour la santé humaine et animale.

L’épinard (Spinacia oleracea L.) est un légume très consommé partout à travers le monde.

La surface cultivée d’épinard au Canada atteint 822 hectares, avec un rendement de 7,1

tonne par hectares. On retrouve par contre des taux élevés de pertes qui peuvent atteindre

près de 25%, soit 1,75 tonne par hectares, dont une bonne partie peut être valorisée

(Canada, 2013; LÁgriculture and Statistique, 2013). Les épinards sont connus pour être

une bonne source de caroténoïdes (lutéine et son isomère la zéaxanthine) et de

chlorophylle (Bunea et al., 2008a). La chlorophylle et la lutéine sont des molécules

essentielles à la vie sur terre étant essentielles à la photosynthèse. Elles confèrent par

2

ailleurs la couleur aux légumes et à plusieurs fruits. Les extraits ainsi obtenus peuvent

être utilisés sur le marché des ingrédients pour diverses utilisations par exemple pour

servir de colorant naturel ainsi que d’ingrédients pouvant entrer dans la composition

d’aliments fonctionnels. En effet, ces deux molécules présentent des effets santé

(antioxydant, anti-inflammatoire, anti-mutagène) avérés par de nombreux auteurs (

Schoefs, 2002; Ferruzzi and Blakeslee, 2007a; Kijlstra et al., 2012; Lienau et al., 2003;

Sharma et al., 2007; Simonich et al., 2008).

Compte tenu de la nature hydrophobe de plusieurs molécules bioactives, l’extraction de

substances naturelles nécessite l’usage de solvants organiques et demeure la méthode la

plus utilisée dans l’industrie. Les solvants pétrochimiques sont des solvants très efficaces,

car ils dissolvent des solutés d’intérêts facilement et leur volatilité facilite grandement

leur élimination en fin de procédé. Toutefois, ces solvants organiques sont nocifs et

potentiellement cancérigènes, en plus d'être impliqués dans la pollution

environnementale. Aussi, l’épuisement progressif des ressources pétrolières pousse les

industriels à se pencher sur une solution plus durable et plus respectueuse à la fois de

l’environnement et des consommateurs. Le domaine de l’extraction végétale, sous

l’influence des évolutions sociétales et économiques, valorise le développement de

techniques d’éco-extraction permettant une extraction saine et sécuritaire pour le

consommateur et l’environnement tout en étant peu coûteuses (Chémat, 2010). Les

extraits obtenus au cours de ce projet auront une haute teneur en molécules bioactives qui

leurs permettrons d’améliorer la santé animale et humaine ainsi que d’intégrer le marché

des ingrédients fonctionnels. Les techniques qui seront utilisées pour l’extraction de la

lutéine et de la chlorophylle ont été choisies pour leurs caractères innovants et pour

répondre au mieux aux contraintes écologiques de ce projet.

Ce projet a donc pour but de valoriser les légumes déclassés ou rejetés de l’industrie

maraîchère. Plus spécifiquement, ces travaux porteront sur l’épinard et l’optimisation de

procédés écologiques d’extraction et de purification de la lutéine et de la chlorophylle

permettant d’obtenir de nouveaux extraits potentiellement bioactifs pour une utilisation

en nutrition animale. Les techniques d’extraction utilisées dans ce projet respecteront les

procédés d’éco-extraction avec l’utilisation de techniques innovantes et de solvants verts.

3

1 État de l’art

4

1.1 Valorisation de sous-produits issus de l’agriculture : Choix de l’épinard.

1.1.1 Valorisation des déchets et chimie verte : Principes

La valorisation des sous-produits issus de l’agriculture intensive et du domaine de la

transformation alimentaire a été introduite pour répondre au gaspillage alimentaire et

aussi pour permettre la limitation de l’utilisation des sources énergétiques fossiles.

D’autre part, la gestion des déchets est particulièrement coûteuse pour les différents

secteurs concernés. Pour ces raisons, l’industrie ainsi que les instances gouvernementales

sont intéressées à exploiter et valoriser ces sous-produits, constituant un matériel très

prometteur représentant plusieurs mégatonnes chaque année à travers le monde (Martins

and Ferreira, 2017).

Selon la nature des sous-produits à valoriser, différentes méthodologies de valorisation

sont privilégiées. Ainsi, une des voies de valorisation très prometteuse sur le plan

économique et écologique est la transformation de ces déchets en produits chimiques, en

biocarburants et en biosolvants. Par exemple, les huiles alimentaires usagées peuvent être

transformées en biocarburants, les sous-produits de la vinification comme le marc de

raisin peuvent fournir des molécules pour l’industrie pharmaceutique et les graisses

animales fondues peuvent être valorisées par l’industrie chimique. D’autres types de sous-

produits peuvent intégrer le marché de l’alimentation animale pour leurs propriétés

nutritionnelles. Les déchets issus de l’agriculture et de la pêche sont également largement

valorisés pour leurs contenus en composés bioactifs (Tuck et al., 2012). Les molécules

retrouvées dans les fruits et les légumes peuvent être valorisées afin d’intégrer le domaine

de la santé et des aliments fonctionnels, permettant ainsi la diminution de l’incidence des

maladies chroniques (Lam et al., 2014; Peschel et al., 2006).

Ce projet se concentrait plus particulièrement sur l’exploitation phytochimique des sous-

produits issus de l’industrie maraîchère tels que l’oignon, le brocoli, l’asperge et

l’épinard, en partenariat avec deux entreprises locales au Québec : Vert Nature et

DianaFood Inc. Plus particulièrement, notre projet se penche sur la valorisation

phytochimique de l’épinard.

1.1.2 L’épinard : Botanique et production mondiale

L’épinard est un légume feuille, cultivé dans le monde entier. La Chine est le premier

producteur mondial d’épinard, avec plus de 2207220 tonnes produites en 2014 et une

surface cultivée d’environ 760000 hectares, correspondant à plus de 90% de la production

5

mondiale. Les États Unis suivent, avec 350410 tonnes produites cette même année pour

une surface cultivée de 18870 hectares. Le Canada est un faible producteur d’épinard,

avec une production chiffrée à 5611 tonnes en 2014, pour une surface cultivée de 688

hectares. Sa production a augmenté de façon très importante, avec une augmentation de

419% depuis les années 1970. Toutefois, la consommation d’épinard en Amérique du

Nord reste inférieure à celle d’autres légumes verts feuillus, tels que la salade, le kale et

la laitue. Les déchets issus de cette production sont estimés pour l’épinard à 25%,

représentant pour le Canada seul, en 2014, 1400 tonnes de déchets exploitables pour la

valorisation en composés phytochimiques. (Source : FAO STAT

http://www.fao.org/faostat/fr/#data/QC).

Figure 1-1: Situation mondiale de la production d'épinard (Source : FAO STAT

http://www.fao.org/faostat/fr/#data/QC/visualize)

6

Figure 1-2: Répartition mondiale de la production d'épinard (Source : FAO STAT

http://www.fao.org/faostat/fr/#data/QC/visualize)

1.2 Intérêt santé de l’épinard Les épinards sont connus pour avoir des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires,

antiprolifératives, anti-obésité, hypoglycémique et enfin de réduction des lipides

sanguins, permettant par ces différents effets la réduction des maladies chroniques. Des

études in vitro et in vivo ont été réalisées dans ce sens, sur des modèles cellulaires,

animaux et des modèles humains. Le plus souvent, ces études ont été réalisées avec des

extraits aqueux ou éthanoliques d’épinards (effet antioxydant, anti-inflammatoire), des

échantillons d’épinards lyophilisés, des extraits de thylakoïdes (effet anti-obésité,

hypoglycémique, diminution de lipides sanguins), des repas avec des épinards frais, des

extraits d’épinards obtenus avec de l’acétone, des fractions de glycolipides (anticancer)

(Roberts and Moreau, 2016). Une autre étude a également démontré une modulation du

microbiote intestinal lors de la prise d’extrait de thylakoïdes d’épinards (Montelius et al.,

2013). Ces effets sont expliqués par la composition de l’épinard, contenant 92 % d’eau,

2,9 % de protéines, 3,6 % de glucides et 0,4 % d’acide gras. Parmi ces acides gras, des

acides gras mono- et polyinsaturés (acide linoléique, alpha linolénique et oléique) ont été

principalement caractérisés. Quelques traces d’acides gras saturés (acide caprique,

myristique et stéarique) ont également été détectées. L’épinard a également une quantité

non négligeable de fibres (2,2 g pour 100 g d’épinard frais, soit 9 % de la quantité

recommandé par jour et par portion). Enfin, cette plante à une haute valeur nutritionnelle

due à la présence de fortes teneurs en minéraux (Fe, Mg, Mn) et de vitamines (A, B9, K,

7

C). Une portion de 100 g d’épinard permet d’atteindre voir même de dépasser les

recommandations journalières de certaines vitamines et de certains minéraux, comme

c’est le cas pour la vitamine C (47 % des besoins journaliers couverts), la vitamine K (604

%), la vitamine A (188 %), folate (49 %), Mg (20 %), K (16 %) et Fe (15 %).

L’épinard contient également des composés phytochimiques tels que les caroténoïdes, les

polyphénols et la chlorophylle (Bunea et al., 2008). Les composés phytochimiques sont

des nutriments non essentiels pour l’homme, mais présents de façon ubiquitaire dans les

plantes. Ils possèdent notamment des effets santé avérés par de nombreux auteurs(Roberts

and Moreau, 2016). Les composés phénoliques sont présents de façon importante dans

l’épinard. Ils produisent des métabolites secondaires en réponse à un stress comme lors

d’une exposition aux UV, aux pathogènes, aux basses températures et à un déficit en

nutriments. Leurs proportions dans les épinards sont 40 à 70% plus élevées que dans les

laitues et salade, en faisant donc une source très intéressante.

La quantité de chlorophylle retrouvée dans les épinards est d’environ 130 mg pour 100 g

d’épinard frais (Ferruzzi and Blakeslee, 2007a; Khachik et al., 1986). Le caroténoïde

majoritaire contenu dans l’épinard est la lutéine dont la concentration dans cette plante

varie entre 3,9 et 9,5 mg pour 100 g d’épinard frais comparativement à 6,4-15 mg pour

100 g de kale frais et 1.5-2.8 pour le brocoli (Burri, 2013). La présence de la lutéine est

masquée par la chlorophylle qui donne à la feuille sa couleur verte. La lutéine et la

chlorophylle sont également impliquées dans les effets santé des extraits d’épinards de

par leurs effets anti oxydant, anti-inflammatoire et antimutagène.

8

1.3 Les composés majeurs d’intérêt dans l’épinard

1.3.1 La chlorophylle

1.3.1.1 Description

La chlorophylle est un pigment vert largement distribué dans la nature. Cette molécule

est responsable de la couleur verte des feuilles et de la capture de l’énergie lumineuse

utilisée lors de la photosynthèse. Les chlorophylles trouvées dans les fruits verts et les

légumes sont les chlorophylles a et b, avec une concentration plus importante de la

chlorophylle a selon un rapport 3 pour 1. Elles ne diffèrent entre elles que par de petits

détails de structure. La chlorophylle a est la seule à se retrouver dans tous les végétaux.

La chlorophylle est constituée de deux parties, une tête hydrophile formée d’une

porphyrine et d’une longue queue aliphatique hydrophobe ou phytol. Elle contient aussi

un ion magnésium en son centre formant un chélat avec les quatre autres atomes d’azote

(Figure 1). La chlorophylle b est identique à la chlorophylle a sauf qu’elle possède un

groupement formyle (-CHO) à la place du groupement méthyle (-CH3) sur le noyau

pyrrolique II, en position 7 (Hopkins, 2003). Dans la plante, la chlorophylle est

essentiellement localisée au dans les membranes des thylakoïdes des chloroplastes. La

chlorophylle est composée d’un circuit fermé de doubles liaisons conjuguées et

d’électrons délocalisés lui permettant d’absorber la lumière (Scheer, 2013; Schoefs,

2002)

Figure 1-3: Structure de la chlorophylle

9

1.3.1.2 Les dérivés de la chlorophylle

En plus de la chlorophylle a et b, il existe de nombreux dérivés de cette molécule, qui se

forment lors d’un traitement à la chaleur ou lorsque que la molécule est mise en contact

avec un milieu acide, ou alors avec une dégradation enzymatique (Huang et al., 2008). Il

s’agit de la phéophytine a et b, la pyrophéophytine a et b, la phéophorbide a et b et la

chlorophyllide a et b, présents dans les plantes (Pumilia et al., 2014).

La chlorophylle est une molécule très sensible, car elle contient une longue chaîne

aliphatique insaturée. Cette chaîne réagit facilement avec les acides, bases, l'oxygène et

est également très sensible à la chaleur et à la lumière. (Schoefs, 2002). À cause de sa

forte réactivité, la chlorophylle est susceptible d'être dégradée en différents dérivés par

les procédés industriels de transformation des aliments et aussi par la digestion (Ferruzzi

and Blakeslee, 2007a).

Les procédés utilisant de la chaleur ou un milieu acide (lors de la digestion par exemple)

induisent la transformation de la chlorophylle à l'origine verte en des produits de couleur

marron. La perte de la couleur verte est caractéristique de la phéophitinization, une

réaction provoquée par la libération de l'ion Mg2+ de la molécule de chlorophylle qui se

dégrade en phéophitine et en pyrophéophitine. L'activité de la chlorophyllase est

augmentée par les procédés utilisant de la chaleur, induisant des dérivés nommés

chlorophyllide. Cette enzyme catalyse l'hydrolyse de l'ester de phytol de la molécule

initiale.

Des formes de chlorophylle semi-synthétiques sont plus résistantes faces aux procédés

alimentaires, ayant souvent des étapes utilisant des températures élevées. En effet, le

remplacement de l'ion Mg2+ des métallochlorophylles par l'ion Zn2+ et Cu2+ (réaction

nommée « regreening ») va rapidement former des Zn ou Cu-phéophitine ainsi que des

Zn ou Cu-pyrophéophitine. Ce procédé est fait avant un traitement thermique pour

augmenter de façon significative la stabilité de la molécule à la chaleur, car les Zn ou Cu

chlorophylles sont connus toutes les deux pour leurs grandes stabilités à la chaleur et aux

procédés industriels par rapport à la chlorophylle native. D’autres dérivés commerciaux

de la chlorophylle telle que la SCC (sodium copper chlorophyllin) sont solubles dans

l’eau, ce qui présente différents avantages lors de l’élaboration d’extraits. En effet, il

s’agit de molécules très stables, résistant à la chaleur et aux variations de pH et ayant

aussi un faible coût. Dans ce cas, le magnésium de la porphyrine a été remplacé par l’ion

10

Cu2+ avec un traitement par un hydroxyde de sodium méthanolique. Le produit final

obtenu est un mélange de nombreux types de composés chlorés dérivés de la chlorophylle

naturelle, dont les principaux sont le Cu-chlorin-e4, le Cu-chlorin-e6, le Cu pheophorbide

a et le Cu-rhodin g7 (Ferruzzi and Blakeslee, 2007b; Inoue et al., 1994). Ce type de dérivé

soluble commercial de la chlorophylle est utilisé de façon importante en Europe et moins

importante aux États-Unis (Ferruzzi and Blakeslee, 2007b; Ferruzzi et al., 2002). Ces

molécules transformées de chlorophylle sont utilisées afin d'améliorer la couleur verte

dans les procédés de mise en conserve des denrées alimentaires par exemple.

1.3.1.3 Les effets bénéfiques de la chlorophylle et de ses dérivés

La chlorophylle et ses dérivés ont été étudiés pour leurs effets sur l'organisme, car ils

possèdent des effets bénéfiques sur la santé des individus.

Les dérivés de cette molécule ont montré des activités biologiques in vivo et in vitro telles

que la prévention du cancer, liées à leurs activités antioxydantes, antimutagènes et pro

apoptotiques. Les dérivés de la chlorophylle ont aussi des applications médicales, comme

le traitement photodynamique du cancer dûe à leur propriété photosensible (Ferruzzi and

Blakeslee, 2007b) (Ferruzzi et al., 2002). De récentes études ont montré un lien entre la

consommation de la chlorophylle et la diminution du risque de cancer colorectal. Dans

l’estomac, la chlorophylle est dégradée en phéophytine sans métal en présence du milieu

acide de cet organe. Cette molécule étant liposoluble, elle sera absorbée par les cellules

intestinales. Cette absorption étant limitée et variant selon la concentration, une grande

quantité de chlorophylle se retrouve dans le gros intestin où elle est dégradée par le

microbiote. De plus, une activité anti-génotoxique luttant contre les dommages de l’ADN

par la chlorophylle a et b et la chlorophylline a été démontrée (Bez et al., 2001) ainsi

qu’un effet inhibiteur de la phéophorbide sur l’apparition de cancers de la peau chez la

souris. La capacité antioxydante de la chlorophylle naturelle est variable, tout dépendant

de sa structure moléculaire, mais elle reste néanmoins significativement inférieure à celle

de son dérivé soluble, la SCC (Fernandes et al., 2007; Tumolo and Lanfer-Marquez,

2012). La chlorophylline (SCC) a suscité beaucoup d’attention au cours des dernières

années en raison de sa forte activité santé et ceci sans effet secondaire. Plusieurs études

ont révélé que les chlorophyllines ont une influence sur diverses molécules et voies de

signalisation cellulaires impliquées dans la prolifération cellulaire, l’inflammation,

l’apoptose, les défenses antioxydantes, l’angiogenèse, le métabolisme des molécules

cancérigènes (Kamat et al., 2000; Nagini et al., 2015; Sharma et al., 2007). Dans ce

11

dernier cas, la chlorophylline agit en tant qu’intercepteur des molécules cancérigènes

pendant le temps de l’exposition en formant des complexes avec le composé toxique

rendant difficile son absorption (Fernandes et al., 2007).

En plus de son excellent effet santé, la chlorophylline est également une molécule

facilement assimilable par l’organisme, en comparaison avec la chlorophylle. En effet, la

chlorophylle naturelle, connue pour sa sensibilité aux pH extrêmes va être dégradée dans

l’estomac en dérivés lipophiles (phéophitine, Zn-phéophitine). Le caractère apolaire de

ces dérivés nécessite une étape de mycelisations avant d’être absorbé par les cellules

intestinales. Les dérivés SCC n’ont pas besoin d’être solubilisés par les micelles pour leur

absorption. Ces dérivés sont également résistants aux pH acides de la digestion. De plus,

une faible quantité de dérivés naturels de chlorophylle sera assimilée par rapport à la

quantité ingérée (de 5 à 10 %), mais étant donné la forte présence de chlorophylle dans

l’alimentation, même si une faible proportion est assimilée elle se retrouvera quand même

à une concentration significative au niveau intracellulaire des tissus cibles comme

l’intestin. En comparaison avec les dérivés de la chlorophylle naturelle, les dérivés semi-

synthétiques comme la SCC montrent une absorption de 45 à 60% par les cellules

intestinales en culture.

Hormis ses nombreux effets santé et son utilisation comme complément alimentaire, la

chlorophylle est susceptible d’avoir d’autres applications pour l’industrie

agroalimentaire. En effet, cette molécule est largement utilisée comme colorant

alimentaire. Il est possible de distinguer le colorant alimentaire naturel vert issu de la

chlorophylle native (E140), et les colorants alimentaires verts semi-synthétiques comme

la Cu-chlorophylline (E141) (Humphrey et al., 1980).

1.3.2 La lutéine

1.3.2.1 Description

Les caroténoïdes, formant une famille de pigments oranges et jaunes présents dans les

organismes photosynthétiques. Ils sont présents en grandes quantités dans les plantes (les

fleurs, les fruits et les feuilles) plus précisément dans les carottes, tomates, les épinards.

Les caroténoïdes sont localisés dans la membrane des plastes (Arnold et al., 2014). Il

s'agit d'une molécule de 40 carbones ayant pour formule chimique C40H56, formée de 8

unités isopréniques dont quatre sont l’image inversée en son centre des quatre autres. Ces

molécules appartiennent à la famille des terpénoïdes et possèdent deux extrémités

12

cyclisées. Le précurseur des caroténoïdes est le phytoène (molécule linéaire de 40 C) qui

est synthétisé par condensation de deux molécules de géranyl pyrophosphate (molécule à

20C), elles-mêmes synthétisées par condensation de quatre molécules d'isoprène

pyrophosphate (molécule à 5C). Le phytoène subit ensuite des désaturations, cyclisations

à ses extrémités pour former les carotènes. Le carotène va ensuite être hydroxylé pour

former les xanthophylles, la famille de molécules contenant la lutéine et son isomère la

zéaxanthine. Les caroténoïdes peuvent donc être divisés en deux classes distinctes à

savoir les carotènes qui n'ont pas de fonction OH et les xanthophylles, comme la lutéine,

qui en contiennent deux. La structure chimique de ces molécules les rend lipophiles et

donc insolubles dans l'eau. Les caroténoïdes sont retrouvés majoritairement en

configuration trans, mais également quelques-uns assez stables en configuration cis

(Rodriguez, 2001; Scheer, 2013; schoefs, 2005). La répartition de ces molécules au sein

de la cellule est influencée par leur caractère hydrophobe. Une fois assimilés par

l’organisme, les caroténoïdes sont répartis au niveau de la bicouche lipidique

membranaire des cellules. La configuration trans présente plus d'avantages à ce niveau,

car elle facilite l'insertion dans les membranes. A l'aide de leurs groupements hydroxyles,

la lutéine et la zéaxanthine vont interagir avec les têtes polaires de la bicouche lipidique

créant un déplacement de ces caroténoïdes qui vont alors se positionner d'une façon qui

permet de modifier la fluidité de la bicouche lipidique (Carpentier et al., 2009). Les

caroténoïdes, et tout particulièrement les xanthophylles, sont des molécules sensibles à

l’isomérisation et à l’oxydation. En effet, les caroténoïdes ont une sensibilité différente

pour l’oxydation, la lutéine étant plus instable que d’autres molécules de cette même

famille. C’est la raison principale de la dégradation de ces molécules. L’isomérisation de

la forme trans de ces molécules vers la forme cis induit une perte de leur bioactivité et de

leur couleur. L’isomérisation et l’oxydation sont deux réactions se produisant dans les

conditions régnant lors de la préparation, l’analyse, la conservation, la transformation des

aliments : des précautions doivent être prises afin de prévenir tout risque de dégradations

des caroténoïdes. La manipulation de la lutéine doit être réalisée à des températures

faibles, inférieures à 60°C afin d’éviter sa dégradation (Gómez-Prieto et al., 2007;

Macías-Sánchez et al., 2010). Les échantillons doivent être placés à l’abri de la lumière

et protégés par de l’aluminium, car les rayons Ultraviolet (UV) induisent une photo-

isomérisation provoquant de fait une photodégradation des molécules. La présence d’O2

et de tout autre agent oxydant dans les échantillons induit rapidement leur dégradation

pour produire deux dérivés : l’époxycaroténoïde et les apocarotals (Britton, 1991).

13

Le marché mondial de la lutéine était d’environ 233 millions de dollars US en 2010 et il

est devrait atteindre 308 millions de dollars en 2018, avec une croissance annuelle de

3,6 % (Lin et al., 2014). Actuellement, les extraits de lutéine proviennent essentiellement

d’Asie et sont produits à partir de la fleur de souci (marigold) qui contient également une

forte concentration de lutéine par rapport à l’épinard (21,6 à 97,6 mg/100g de matière

fraîche).

Figure 1-4: Structure de la lutéine

1.3.2.2 Les effets bénéfiques de la lutéine

La lutéine, avec son isomère la zéaxanthine se retrouve au niveau de la rétine, avec une

concentration importante dans la macula lutea. Elle a pour rôle de protéger cette région

de l’œil contre la photo-oxydation. En effet, elle a un rôle dans la prévention de la

dégénérescence maculaire liée à l’âge (AMD). La rétine est sensible au stress oxydatif à

cause de sa demande en O2, son métabolisme aérobie et de la grande quantité d’acides

gras polyinsaturés qu’elle contient (Carpentier et al., 2009). La lutéine et la zéaxanthine

représentent respectivement 36 et 18% des pigments caroténoïdiens contenus dans la

rétine. La zéaxanthine est présente en plus grande concentration au niveau de la région

centrale et la lutéine est plus abondante en régions périphériques. La lutéine et la

zéaxanthine permettent également de réduire les dommages liés à la lumière (Ultra-

violets) dans l’œil, plus particulièrement dans la macula lutea dû à la présence de doubles

liaisons conjuguées dans leurs structures (le chromophore). (Carpentier et al., 2009).

Aussi, à l’aide de liaisons spécifiques avec d’autres types de molécules, la lutéine pourrait

protéger contre les accidents vasculaires cérébraux (AVC) et contre les maladies

coronariennes (Kijlstra et al., 2012; Simonovska et al., 2013). Cette molécule à également

un rôle dans l’amélioration de la fonction immunitaire et protégerait de certains cancers

(Tanaka et al., 2012). La lutéine aurait aussi un impact sur les fonctions cognitives. Des

auteurs ont en effet pu mettre en évidence un lien entre la démence chez des personnes

âgées et la concentration de lutéine dans le cerveau (Johnson, 2012).

14

Des études portant sur la biodisponibilité des caroténoïdes montrent que la lutéine et son

isomère le zéaxanthine sont stables durant le processus de digestion in vitro (Nimalaratne

et al., 2015). La libération des caroténoïdes à partir de la matrice alimentaire suivie de

leur absorption sont les facteurs déterminant leur bioactivité. En général, la

biodisponibilité de la lutéine est affectée par un certain nombre de facteurs, comme les

procédés industriels et la présence de lipides dans la matrice. Il a été observé que la

biodisponibilité in vitro de la lutéine et la zéaxanthine atteint presque 100% à partir de

fruits (orange, kiwi, pamplemousse et la patate douce), comparativement à 19% et 38%

pour l’épinard et le brocoli (Abdel-Aal et al., 2013). La lutéine, comme les autres

molécules de la famille des caroténoïdes est aussi un colorant alimentaire naturel.

1.4 Purification et extraction des molécules à l’étude

1.4.1 Techniques d’extractions conventionnelles

De nos jours, les techniques d’extraction, que ce soit pour l’industrie chimique,

pharmaceutique ou même agroalimentaire, doivent répondre à plusieurs exigences, telles

que la recherche de l’efficacité d’extraction du composé choisi, la sélectivité, la

préservation de ce composé, ainsi que le choix de techniques dites « propres », pour la

préservation de l’environnement. Les extractions conventionnelles sont par définition

celles utilisées traditionnellement et depuis de nombreuses années dans l’industrie pour

l’extraction de différents composés phytochimiques. Elles comprennent les extractions

en batch, par soxhlet, l’extraction assistée par sonication et l’hydrodistillation. Cette

dernière technique consiste en un entrainement à la vapeur et concerne plus

particulièrement les huiles essentielles (Chémat, 2010; Yim et al., 2014). Le tableau 1.2

décrit les avantages et les inconvénients de chacune de ces techniques conventionnelles.

Ces méthodes conventionnelles sont connues pour utiliser de grands volumes de solvants

organiques, engendrant des problèmes environnementaux et aussi économiques,

nécessitant beaucoup d’énergie pour leur évaporation. De plus, elles sont souvent basées

sur des protocoles nécessitant beaucoup de main-d’œuvre et de suivis. Enfin, la

génération de déchets issus de ces procédés est importante.

Le principe de l’extraction verte, mais aussi de la chimie verte dans son ensemble passe

par des efforts dans la réduction de l’énergie utilisée pendant les procédés. La

minimisation de la consommation d’énergie passe par l’optimisation de ces derniers, mais

également par la récupération et la réutilisation de l’énergie libérée pendant le procédé,

15

par l’innovation et l’intensification des procédés. Pour finir, la réduction des différentes

étapes lors d’un procédé permet de sauver du temps, d’économiser l’énergie et réduire les

coûts de main d’œuvre (Chemat and Strube, 2015).

Tableau 1-1: Présentation des techniques d’extraction conventionnelles

1.4.2 Techniques d’extraction innovantes

Face aux inconvénients des techniques conventionnelles, de nouvelles méthodes

d’extractions ont été développées afin d’améliorer l’efficacité de l’extraction de

molécules alimentaires. Ces nouvelles méthodes d’extractions, détaillées ci-après,

permettent d’automatiser des procédés dans les usines, de réduire l’utilisation de solvants

organiques et d’augmenter la sélectivité de l’extraction.

L’extraction assistée par liquide pressurisé est basée sur l’utilisation de solvants à

température élevée et soumise à des pressions suffisamment élevées pour maintenir leur

état liquide. Ces conditions procurent certains avantages tels qu’un temps d’extraction et

un volume de solvant réduits, une possibilité d’automatisation ainsi qu’une efficacité

d’extraction accrue. En effet, le travail à une température plus élevée permet d’augmenter

la solubilité des composés dans un liquide en diminuant la viscosité et la tension de

surface du liquide utilisé, assurant ainsi un meilleur contact avec la matrice. De plus, une

Types d’extraction Avantages Inconvénients

Batch Contrôle de la température,

préservation des composés

thermosensibles

Travail avec mélanges de solvants

Étapes de filtrations et évaporations nécessaires

Soxhlet Échantillon en contact avec solvant

pur, meilleur transfert de matières

Pas d’étape de filtration après

l’extraction

Durée importante d’extraction

Grande quantité de solvants

Haute température pendant longues périodes

(destruction molécules sensibles, économiques et

environnementales)

Échauffements locaux possible

Étape de concentration et d’évaporation

Pas facilement automatisable

Assistée par

sonication

Augmentation rendement

d’extraction

Accélération de la cinétique

Diminution de la température

d’extraction utilisée

Étapes de filtration

Étapes d’évaporation et concentration

Hydrodistillation Pour les huiles essentielles Distillation très coûteuse

16

température plus haute va favoriser un meilleur transfert de matières à partir de la matrice

végétale. Seulement deux facteurs varient au cours de ce type extraction : le temps et la

température d’extraction. Pour les caroténoïdes et la chlorophylle, des températures

supérieures à 100°C engendrent des dégradations significatives de ces deux composés.

L’éthanol soumis à une pression de 100 bar et 50°C a permis d’obtenir de bons

rendements d’extraction des caroténoïdes de germes de maïs (Jaime et al., 2010; Mattea

et al., 2009).

L’extraction par de l’eau subcritique est également très utilisée pour l’extraction

de phytomolécules. L’état subcritique d’un liquide est défini lorsque la température ou la

pression atteint sa température critique, c’est-à-dire la température maximale en phase

liquide. L’eau dans sa forme subcritique possède une constante diélectrique beaucoup

plus faible qu’à son état normal, c’est-à-dire à température et pression normale (TPN). En

effet, à ces températures, on retrouve une constante diélectrique (휀) de l’eau d’environ

80; elle s’abaisse à 25 lorsque la température atteint 250°C. Cette dernière valeur est

similaire à celle de solvants organiques à TPN, tels que l’éthanol et le méthanol (Herrero

et al., 2006). Rappelons que plus une constante diélectrique est basse, plus le solvant

présente des caractéristiques apolaires, car moins il sera capable de séparer les charges,

caractérisant les molécules polaires. Néanmoins, la plupart des caroténoïdes ont une

polarité bien plus basse, rendant inefficace cette technique pour l’extraction de ces

molécules, et la chlorophylle, bien que plus polaire que la lutéine est une molécule

hautement thermosensible (Schoefs, 2005).

L’extraction assistée par micro-onde est une technique simple, basée sur la

destruction des cellules végétales permettant par conséquent la libération de leurs

contenus. L’appareil va émettre des ondes de hautes fréquences et donc soumettre le

matériel à extraire à un champ électromagnétique. L’eau contenue dans la matière de

départ va être chauffée par ce champ, provoquant une lyse des cellules végétales.

L’avantage de cette méthode est qu’elle requiert moins d’énergie que les méthodes

conventionnelles qui ont recours à un broyage cellulaire et que requiert moins de solvant

pour l’extraction. L’inconvénient majeur de cette technique est la chaleur émise au cours

du procédé qui peut-être incompatible avec les caractéristiques de thermolabililité des

molécules (Gong and Bassi, 2016; Herrero and Ibáñez, 2015; Herrero et al., 2010, 2013)

17

1.4.3 Méthodes de purification

Des méthodes de purification innovantes et récentes peuvent être utilisées pour la

séparation de la lutéine et de la chlorophylle, par exemple une chromatographie à contre-

courant à haute vitesse (HSCCC), l’utilisation de colonne de chromatographie en phase

inverse, la précipitation par fluide supercritique avec utilisation d’un antisolvant (Gong

and Bassi, 2016). Cependant, même si ces méthodes permettent d’obtenir des puretés en

lutéine et en chlorophylle plus importantes, les coûts qui y sont associés sont élevés en

comparaison avec une méthode de purification et d’extraction simple obtenue par

saponification. Ce type de procédé est largement utilisé pour la purification des

caroténoïdes à partir de microalgues, de légumes verts et de fleur de souci, ainsi que pour

dans la production d’extraits concentrés en chlorophylline. Cette méthode fait d’ailleurs

l’objet de nombreux brevets (Liu and FAN, 2010; Ole, 1955; QIU et al., 2017). De fait,

il est parfois préférable d’obtenir une pureté un peu moins élevée pour garantir des coûts

de production bénéfiques pour l’industrie.

La saponification est une procédure analytique standard, utilisée pour éliminer la

chlorophylle des légumes verts afin d'éviter le problème d'interférence entre la

chlorophylle et les caroténoïdes lors de la détection chromatographique (Rodriguez, 2001

; Rodríguez-Bernaldo de Quirós et Costa, 2006). Elle consiste à hydrolyser en milieu

basique un ester en ion carboxylate et un alcool. Cette réaction implique une base forte

qui est souvent de l’hydroxyde de sodium ou de potassium (NaOH ou KOH). La

saponification est également utilisée à l'échelle industrielle dans des procédés d'extraction

et de purification de caroténoïdes. Elle permet l’amélioration du rendement d'extraction

de la lutéine de la fleur de souci en éliminant les lipides saponifiables et en augmentant

la rupture des cellules végétales. La saponification est également utilisée pour la

production de lutéine à partir de microalgues. Dans ce cas, un traitement alcalin dans un

premier milieu aqueux (4% de solution aqueuse de KOH, 40 °C) est très utile pour retenir

les acides gras et la chlorophylle dans la première fraction aqueuse. En effet, la

concentration de KOH ou NaOH utilisée varie généralement de 2,5% à 40% dans la

littérature, avec une température maintenue en dessous de 60°C (Gong and Bassi, 2016).

Les caroténoïdes sont ensuite extraits avec un solvant organique (Fernández-Sevilla,

Acién Fernández, et Molina Grima, 2010). Néanmoins, ce procédé, efficace pour la

séparation des caroténoïdes et de la chlorophylle, provoque des dégradations importantes

de la lutéine et des caroténoïdes en général (Granado, Olmedilla, & Blanco, 2001). Ainsi,

18

les paramètres de saponification doivent être optimisés afin de rechercher le bon

compromis entre l’extraction d’un maximum de chlorophylle et le maintien de l’intégrité

de la lutéine. Plus le temps de saponification est élevé, plus il y a rupture des cellules et

la libération de leur contenu. La lutéine et la chlorophylle, localisées dans les

chloroplastes, deviennent plus accessibles lors de l’exposition à l’hydroxyde de sodium.

Les auteurs utilisent généralement la saponification pendant une longue période de temps,

jusqu'à 10 heures (Rodriguez, 2001 ; (Gong and Bassi, 2016).

La température est un paramètre important lors de la saponification. En effet, le procédé

de saponification est exothermique et, par conséquent, l'augmentation de la température

accélère la réaction de saponification. D'autre part, la lutéine n’est pas stable à haute

température, en fait une température modérée pendant le procédé semble permettre une

meilleure récupération de cette molécule (Han et al., 2013). L'utilisation d'hydroxyde de

sodium provoque une perte importante de lutéine. Cette tendance a été largement décrite

dans la littérature, où, dans la plupart des expériences de saponification, on observe une

dégradation des caroténoïdes. Les caroténoïdes les plus sensibles aux traitements alcalins

sont les xanthophylles, en particulier les epoxycarotenoides (Granado et al, 2001; F.

Khatchig et al, 1992). Ces dégradations sont causées par l’apparition de phénomène

d’isomérisation des caroténoïdes (Granado et al., 2001). La perte de lutéine pourrait être

réduite en utilisant une atmosphère d'azote ou en ajoutant un antioxydant pendant la

réaction (Kimura, Rodriguez-Amaya, et Godoy, 1990). Certains auteurs ont utilisé la

saponification après l’extraction sur le résidu, afin de réduire le temps de saponification

et de la perte de caroténoïdes. La chlorophylle est alors séparée de la lutéine de façon

simple et peu coûteuse par ce procédé. En effet, la chlorophylle est hydrolysée et

convertie en sels, devenant ainsi soluble dans l’eau et extractible lors de la première

extraction aqueuse. Les caroténoïdes, avec les autres lipides insaponifiables, constitués

par les cires, les phospholipides, les stérols et la chaîne phytol de la chlorophylle sont

extraits par la suite lors de l’addition d’un solvant organique.

1.5 La sélection de solvants et la chimie verte Pour se conformer aux exigences relatives à la chimie verte et plus particulièrement à

l’extraction verte et la mise au point d’écoprocédés, il importe de sélectionner de façon

adéquate un solvant qui sera utilisé pour l’extraction. Les solvants pétrochimiques,

toujours les plus couramment utilisés dans le monde de l’industrie chimique et

pharmaceutique sont issus d’origine fossile, donc non renouvelables. La majorité d’entre

19

eux sont inflammables, volatiles, toxiques, responsables de pollution environnementale

et contribuent à l’effet de serre. C’est pourquoi les agrosolvants sont de plus en plus

privilégiés. Un solvant vert, ou agrosolvant est un solvant renouvelable produit à partir

de produits naturels tel que le bois, les fruits, les huiles végétales (Chémat, 2010). Ils

présentent des caractéristiques qui permettent de se substituer aux pétrosolvants. Ils sont

biodégradables, non toxiques et présentent un fort pouvoir solvant. Les bio solvants

utilisés sont par exemple l’éthanol, les terpènes, les méthyles esters des acides gras des

végétaux, le glycérol, l’eau, l’eau pressurisée, le CO2 supercritique et la cyclodextrine

(tableau 1.1). Le plus utilisé est l’éthanol, présent de façon importante dans l’industrie du

fait de sa haute disponibilité, son faible prix, sa non-toxicité et enfin son caractère

biodégradable (Chémat, 2010; Chemat and Strube, 2015; Sicaire et al., 2015).

Néanmoins, ce solvant, idéal pour les molécules hydrosolubles est moins efficace pour

les composés apolaires.

De nombreux guides permettant la sélection des solvants en fonction de leurs

caractéristiques physico-chimiques sont disponibles dans la littérature dont les plus

récents sont ceux publiés par les industries elles-mêmes (Soh and Eckelman, 2016). Il

s’agit de ceux publiés par Pfizer, Sanofi, GSK (Alder et al., 2016; Prat et al., 2013, 2016).

Un dernier guide, le CHEM21 permet aussi une classification des solvants les plus récents

(Prat et al., 2016). Ces différents guides classent de nombreux solvants utilisés en fonction

de leurs impacts environnementaux, de leurs sécurités et aussi en fonction de leurs

impacts sur la santé des individus. Une fois leurs paramètres physico-chimiques et

niveaux de toxicité étudiés, ils sont classés en différentes catégories qui vont de

recommandable à très toxique.

Cette classification prend en compte le potentiel inflammable et d’explosivité du solvant

(Pression en vapeur, température d’auto-ignition, le point éclair, le potentiel à former des

peroxydes). Pour l’impact sur la santé des individus, les paramètres considérés sont la

toxicité, le pouvoir mutagène ainsi que cancérigène du solvant. Enfin, l’étude d’impact

environnemental passe par l’étude de l’écotoxicité, de l’émission de VOC (volatiles

organic compounds) relié aussi au point d’ébullition, et par l’influence du solvant sur la

couche d’ozone. L’éthanol et l’eau utilisés comme solvant dans cette étude sont classés

dans la catégorie recommandée.

20

La récupération et le recyclage des solvants utilisés sont également favorisés dans une

démarche d’extraction verte. Les procédés généralement utilisés pour le recyclage des

solvants sont l’évaporation, la condensation, mais aussi la distillation. Dans le cas du CO2

supercritique, les composés extraits sont séparés du solvant par une simple baisse de

pression. Le CO2 de retour à l’état gazeux après la dépressurisation est ensuite réutilisé

pour d’autres procédés d’extractions (Dennis R. Gere, Lenore G. Randall (1), 1997).

Tableau 1-2: Présentation des différents solvants verts

Adapté de (Chemat and Strube, 2015)

Solvants Caractéristiques

CO2 supercritique Solubilité comparable à l’hexane.

Utilisé pour des composés peu polaires, (caroténoïdes, acides gras, arômes) disponible,

peu cher, non toxique, non inflammable.

Terpène Peu polaires, utilisé pour l’extraction d’acides gras et d’huile.

Exemple de terpènes : Limonène (citron) et alpha pinène (Pin)

Liquides ioniques Utilisé pour l’extraction de caroténoïdes de la crevette, artemisin. Non VOCs, non

inflammable, stabilité thermique et chimique.

Éthanol Disponible, peu cher, biodégradable.

Extraction de composés polaires, faiblement apolaires (chlorophylle, polyphénols…)

Issus de la fermentation de biomasses riches en sucre (céréale et betterave)

Méthyle ester Pas d’émission de VOCs, peuvent remplacer les solvants pétrochimiques.

Issus des acides gras d’huile végétale (soja, coco, rapeseed)

Glycérol Utiliser dans l’industrie pharmaceutique, macération herbes et épices. Extraction de

polyphénols.

Issus des sous-produits issus de la transestérification des acides gras d’huile végétale

Eau Extraction de protéines, sucres, acides organiques et substances inorganiques

21

1.6 Les fluides supercritiques

1.6.1 Introduction

L’extraction par fluide supercritique est une technique verte de plus en plus

populaire auprès des industries alimentaires et pharmaceutiques. Cette méthode permet

l’extraction d’une vaste gamme de molécules naturelles (Guedes et al., 2013). Le principe

de cette technique repose sur l’utilisation de CO2 à l’état supercritique, qui sous une

pression importante et sous une température modérée et contrôlée, se comporte comme

un solvant. L’utilisation d’une température modérée va permettre d’éviter la dénaturation

des molécules au cours du procédé (Mezzomo and Ferreira, 2016). Lorsque celui-ci est

terminé, une simple baisse de pression permet l’élimination du solvant d’extraction, le

CO2 retournant à l’état gazeux à la pression atmosphérique. À l’état supercritique, le CO2

a une solubilité proche de celle de l’hexane et présente donc un pouvoir solvant accru,

comparable à celui des solvants pétrochimiques, mais avec des propriétés cinétiques et de

transports beaucoup plus intéressantes qui se rapprochent de celles des gaz. La variation

de la pression permet une sélectivité plus ou moins importante des molécules d’intérêts

(Dennis R. Gere, Lenore G. Randall, 1997). Cette méthode d’extraction a été sélectionnée

pour l’extraction de la lutéine et de la chlorophylle, car elle répondait à toutes les

problématiques de ce projet et sera décrite plus en détail ci-dessous.

Le CO2 supercritique est utilisé pour différentes applications dans le milieu

industriel. En effet, il est utilisé dans des réactions chimiques telles que l’hydrogénation,

l’hydroformylation et l’oxydation (Hunt et al., 2010). Son utilisation principale reste

l’extraction de composés phytochimiques, comme l’extraction du houblon pour

l’industrie brassicole, des huiles essentielles (Ferreira et al., 1999; Martinez et al., 2007)

et aussi pour la décaféination du café (de Melo et al., 2014). Une autre application

intéressante et aussi appliquée à l’échelle industrielle est celle de l’extraction de l’acide

trichloracétique des bouchons de liège, responsable du goût bouchonné du vin (Taylor et

al., 2000). Il est intéressant de noter que beaucoup d’articles portent sur l’extraction par

CO2 supercritique d’une gamme de molécules à partir de différentes matières de départ.

Par contre, peu d’articles rapportent l’application de ces procédés à l’échelle industrielle.

En effet, un des désavantages de ce procédé est son coût d’investissement initial, qui

décourage souvent les industries (de Melo et al., 2014).

22

1.6.2 L’état supercritique : définition

L’état supercritique d’un composé pur est atteint lorsque la pression et la température de

ce dernier dépassent leurs valeurs critiques sur le diagramme de phase (figure 1-9).

Lorsqu’un seul de ces paramètres a dépassé son point critique, on parle alors d’état

subcritique. Quand la pression et la température ont dépassé leur point critique, le

composé atteint alors un état de la matière intermédiaire entre un gaz et un liquide

(Cavalcanti et al., 2012). La figure 1.10 représente cet état. À température ambiante et

pression atmosphérique, les phases liquide et gazeuse sont bien séparées par un ménisque.

Lorsque la température augmente, on observe une expansion de la phase liquide, et

lorsque la pression augmente à son tour jusque son point critique, on observe une

disparition de la séparation des deux phases, néanmoins, le fluide supercritique possède

toujours une densité qui se rapproche plus de la phase liquide, expliquant son aspect

laiteux, que l’on peut comparer à un aérosol. Sur le diagramme de phase, le point triple

correspond à un couple de pression et température où les trois phases de la matière, à

savoir solide, liquide et gazeux sont en équilibres.

Figure 1-5: Diagramme de phase d’un composé pur

Les courbes représentent l’équilibre entre 2 phases. Pour le CO2 : point triple Pt, est la

pression au point triple= 5,2 bar et température au point triple est -56,4°C. La

Températureen°C

Tc

Pc

Pressionenbar

Pointcritique

Phasesupercritique

Phasegazeuse

Vapeur

Phasesolide

Phaseliquide

PointtriplePt

Tt

23

température et la pression au point critique sont respectivement de 31,1°C et 73,8 bars.

Adapté de (Bendaoud, 2014)

1.6.3 Choix du solvant supercritique

Le choix du dioxyde de carbone comme solvant supercritique s’impose par le fait qu’il

s’agit d’un solvant classifié comme GRAS (generally regarded as safe), qu’il n’est pas

toxique, et que son état supercritique est facilement atteignable, dès 31°C et 73,8 bars,

contrairement à d’autres solvants (da Silva et al., 2016) (tableau 1.3). Cette caractéristique

permet l’extraction de molécules thermosensibles telles que la lutéine et la chlorophylle.

De plus, ce solvant est inerte chimiquement, est disponible en grande quantité (sous-

produits de beaucoup d’industries, p. ex. fermentations, combustions et synthèses de

l’ammoniac) et est non corrosif. D’autres composés purs peuvent être utilisés comme

fluide supercritique, mais possèdent soit des contraintes environnementales et de sécurités

ou des points critiques difficilement atteignables (Cavalcanti et al., 2012) (tableau 1.3).

Tableau 1-3: Températures et pressions critiques de différents composés purs

Composé Tc (°C) Pc (bar)

Dioxyde de carbone 31,1 73,8

eau 374,1 220,6

Éthane 32,3 48,7

Propane 96,8 42,5

n-Hexanes 234,5 30,1

Ethanol 240,9 61,4

Méthanol 239,6 80,9

Tc= Température critique Pc= Pression critique

(Cavalcanti et al., 2012)

24

Figure 1-6: Visualisation du passage à l'état supercritique

Adapté de Bendaoud A.(Bendaoud, 2014)

1.6.4 Propriétés de transport

Le SC-CO2 a des propriétés de transports intermédiaires entre l’état gazeux et liquide. La

viscosité de ce solvant à l’état supercritique se rapproche de celui d’un gaz et garantit

donc un bon transfert de masse. La viscosité va cependant augmenter avec la pression,

mais diminuer avec une augmentation de température. Les fluides supercritiques

présentent également des propriétés de diffusion intermédiaires entre un gaz et un liquide.

Ils permettent une meilleure pénétration dans la matrice, due à l’absence de tension de

surface de ce solvant. En plus de ces deux avantages, le fluide supercritique va présenter

une densité proche de l’état liquide qui de fait va permettre une meilleure solubilité de ce

solvant (figure 1.11). La combinaison de toutes ces propriétés de transports fait du CO2

supercritique un outil très intéressant dans le monde industriel (A.Meireles, 2014).

Figure 1-7: Variation de la densité d'un corps pur en fonction de son état de la

matière. Adapté de Bendaoud A. (Bendaoud, 2014)

Température

Pression

T Tc Tc

P PcP

Fluidesupercritique

GAZLIQUIDE FLUIDESUPERCRITIQUE

SOLIDE

DENSITÉ+ _

25

1.6.5 Effet des conditions opératoires sur la solubilité du SC-CO2

La solubilité peut se définir par la quantité d’un composé qui peut être dissous dans un

solvant, ici le CO2 supercritique. La propriété de solubilisation du CO2 dépend de sa

densité, qui peut être modifiée en fonction de la pression et de la température (Mezzomo

and Ferreira, 2016). Les forces d’interactions intermoléculaires, ainsi que la pression de

vapeur sont donc deux paramètres importants à prendre en compte pour comprendre le

comportement du soluté dans un solvant. Il est important de noter que le SC-CO2 atteint

une capacité de solubilisation comparable à celles des solvants organiques dès que sa

densité dépasse 800 kg.m3. En utilisant le paramètre de solubilité de Hildebrand pour

réaliser une comparaison de pouvoir solvant entre les solvants organiques et le SC-CO2,

on peut constater que le paramètre de solubilité de ce dernier se situe entre ceux du

cyclohexane et du toluène (de Melo et al., 2014).

La structure moléculaire du soluté influence aussi la solubilité dans les fluides

supercritiques. En effet, la présence de groupes polaires –OH, C=O et COOH réduisent

de façon significative la solubilité des composés dans ce solvant (Cavalcanti et al., 2012).

Enfin, le CO2 supercritique va solubiliser préférentiellement des molécules de faibles

poids moléculaires et apolaires et de façon moins efficace les autres molécules (de Melo

et al., 2014).

1.6.5.1 Effet de la température en conditions isobariques sur la solubilité du SC-CO2

L’effet de la température sur un solvant supercritique est complexe. À pression constante,

donc en condition isobarique, plus la température du système augmente, moins le CO2

supercritique est dense. De fait, plus la température augmente et plus le pouvoir solvant

du CO2 est faible. L’effet de la température influence plusieurs paramètres : la pression

de vapeur du soluté et la densité du fluide. De fait, quand la température augmente à

pression constante et faible, la pression de vapeur du soluté augmente, augmentant sa

solubilité dans le CO2 supercritique. Quand la température augmente de façon trop

importante, la densité du fluide décroît, causant de fait une diminution de la capacité de

solubilisation du solvant supercritique. Ainsi, entre 100 et 200 bar, une augmentation de

la température entraîne une diminution de la solubilité du soluté, car l’effet dominant sur

la solubilité sera la densité du fluide, alors que passé 200 bar, une augmentation de

température va entraîner une augmentation de la solubilité du soluté, car l’effet dominant

sera ici sur sa pression de vapeur (Group, 2007; Williams et al., 2004).

26

1.6.5.2 Effet de la pression en condition isotherme sur la solubilité du SC-CO2

En condition isotherme, la pression a une influence importante sur l’efficacité

d’extraction. En effet, plus elle augmente, plus le fluide supercritique devient dense, ce

qui conduit généralement en une augmentation du rendement d’extraction. Le pouvoir

solvant du CO2 est alors accru, permettant l’extraction d’un plus vaste éventail de

molécules, mais diminuant de fait la sélectivité du solvant. En effet, selon les paramètres

de pression choisis, différentes molécules seront extraites en fonction de leurs solubilités.

Néanmoins, une augmentation de pression trop importante entraînera une diminution de

la taille des pores de la matrice, engendrant une diminution du transfert de masse et ce

qui diminuera par conséquent le rendement d’extraction. Au contraire, une diminution de

pression va diminuer la densité ; seuls les composés ayant une plus grande affinité pour

le CO2 seront extraits (A.Meireles, 2014; Cavalcanti et al., 2012).

1.6.5.3 Effet de l’ajout d’un cosolvant sur la solubilité du SC-CO2

L’addition d’un cosolvant permet d’augmenter la solubilité et donc l’efficacité

d’extraction de molécules plus polaires dans le solvant supercritique. Les cosolvants ont

une forme liquide, dont les plus courants sont l’éthanol, le méthanol, l’eau, le

dichlorométhane et enfin le l’hexane. L’éthanol est le plus utilisé (53% des études), car il

est considéré comme GRAS (generally recognize as safe), c’est à dire reconnu comme

inoffensif en alimentation et donc utilisable en industrie agroalimentaire (de Melo et al.,

2014). Ces cosolvants influencent le rendement d’extraction en agissant directement sur

le soluté par des interactions physico-chimiques liées à leurs affinités spécifiques avec la

molécule à extraire (liaison hydrogène, acide-bases et dipôle-dipôle), et vont donc

augmenter sa miscibilité dans le CO2 supercritique. L’ajout d’un cosolvant va aussi

permettre l’augmentation de la densité du solvant supercritique (Cavalcanti et al., 2012).

1.6.6 Cinétique et transfert de masse de l’extraction par SC-CO2

La durée de l’extraction a également une influence importante sur le rendement. Ce

paramètre doit être optimisé par un suivi cinétique afin d’évaluer le temps d’extraction

optimum requis pour chacune des molécules et matrices. En général, le suivi cinétique

permet l’étude du transfert de matière avec un solvant particulier. La courbe de suivi

cinétique (le rendement en matière en fonction du temps d’extraction) peut généralement

être divisée en 3 parties distinctes. La première partie, appelée CER (constant extraction

rate) se produit quand le soluté à extraire est présent de façon importante dans la matrice

et lorsque les phénomènes de transfert sont régis par le débit du solvant. Lors du second

27

stade de l’extraction, appeler FER (falling extraction rate) le soluté facilement accessible

commence à diminuer dans le matériel extrait, laissant place à des phénomènes de

diffusion. Le taux de transfert de matière entre la matrice et le solvant diminue de façon

importante. La troisième étape, DC (diffusion controlled) est l’étape d’extraction

contrôlée uniquement par des phénomènes de diffusion à l’intérieur de la matrice

végétale, car tous les solutés facilement accessibles au solvant ont été extraits. De fait, le

temps d’extraction optimum est celui obtenu à la fin de la première période d’extraction

(CER), ou l’efficacité d’extraction est la meilleure. Il y a d’ailleurs peu de différence sur

le rendement d’extraction après cette étape de la courbe, tendant vers un plateau. En effet,

la pente de la courbe est représentative de la vitesse du transfert de masse (Z. Huang, Shi,

& Jiang, 2012; Sovova, 2005).

Figure 1-8 : Courbe de suivi cinétique montrant les différentes périodes de

transfert de masse pendant l’extraction par fluide supercritique (exemple de

l’épinard)

1.6.7 Prétraitement de la matière de départ

L’humidité du matériel de départ influence également de façon importante l’extraction

des composés cibles. L’eau présente dans l’échantillon va induire un changement dans la

tension de surface et l’angle de contact du solvant sur la matrice. L’élimination de l’eau

avant l’extraction va permettre d’augmenter le rendement par une amélioration de l’accès

aux pores de la matrice, et par conséquent une augmentation des propriétés de transports.

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

time

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

extr

act

predextract

CER FER DC

tCER tFER

Tempsd’extractionenheure

Ren

dem

entdel’extractionen%

28

Plus il y a d’eau dans l’échantillon et plus il y a de chance que cette eau forme un film

entre les pores de la matrice et le fluide supercritique (Cavalcanti et al., 2012).

1.6.8 Équipement

Le procédé d’extraction par fluide supercritique peut être divisé en deux parties

distinctes : Une partie constituant l’extraction et l’autre la séparation du solvant

supercritique de l’extrait et son recyclage (A.Meireles, 2014).

Le CO2, issu d’un réservoir, est en premier refroidi afin de s’assurer qu’il arrive sous

forme liquide dans la pompe et d’éviter la cavitation de cette dernière. Il est ensuite

compressé à la pression choisie (supérieure à la pression critique) et passe au travers un

échangeur de chaleur afin d’y atteindre la température désirée (supérieur à la pression

critique). Le CO2, ayant ainsi atteint son état supercritique, passe à travers l’extracteur où

a préalablement été placée la matière à extraire. Le solvant supercritique emporte avec lui

les molécules à extraire, jusqu’à une vanne de décompression, contenant en général un

élément chauffant pour éviter la formation de glace et le blocage des lignes lors de la

dépressurisation du CO2. De fait, après cette vanne de décompression, la pression du CO2

ayant chuté de façon importante, le CO2 est de nouveau à l’état gazeux et séparé de

l’extrait dans le séparateur, ou la pression en générale est de 50 bar (au lieu de 300 bars

par exemple). Le CO2 passe ensuite à travers un filtre pour enlever les impuretés et dans

un condenseur pour qu’il y retrouve son état liquide afin d’être à nouveau utilisé.

29

Sc-CO2

Spinach

Valve

Cooler

CO2 PumpHeater

Cosolvent pump

Cosolvent

Extractor

BPR

separator

Extract

CO2

Valve

ValveCooler Filter

Figure 1-9: diagramme de l'installation de laboratoire utilisée pour les extractions

1.6.9 Extraction de la lutéine et de la chlorophylle par le CO2 supercritique

La majorité des études réalisées sur l’extraction au CO2 supercritique ont été faites sur

des graines ou sur des feuilles. Toutefois, aucune étude n’a encore été faite sur l’extraction

de la lutéine et de la chlorophylle à partir de l’épinard. La matrice végétale a une influence

importante sur l’extraction par fluide supercritique. L’efficacité d’extraction des

caroténoïdes et de la chlorophylle sont variables et dépendent des matrices végétales

utilisées. Dans la majorité des cas, les auteurs observent une bonne efficacité d’extraction

de ces composés. (Macias-Sanchez et al., 2009; Macías-Sánchez et al., 2005; Nobre et

al., 2006). De nombreux articles rapportent l’extraction de ces deux molécules à partir

de microalgues et de la fleur de souci. (Gao et al., 2010; Macías-Sánchez et al., 2005,

2007). La lutéine et la chlorophylle sont des molécules peu solubles dans le CO2, mais

l’ajout d’un cosolvant tel que de l’éthanol permet d’augmenter leurs solubilités ainsi que

le rendement d’extraction. La majorité des chlorophylles et des caroténoïdes sont extraits

en 300 minutes (Macias-Sanchez et al., 2009; Macías-Sánchez et al., 2007, 2010). Avec

l’ajout d’un cosolvant éthanolique, le temps d’extraction diminue à 240 min (Guedes et

al., 2013; Zhengyun et al., 2007). Les extraits obtenus à partir de cette méthode sont

souvent des mélanges de molécules peu purifiés. En effet, les matrices végétales sont

riches en composés extractibles. (de Melo et al., 2014). La variation des différents

30

paramètres de pression, température, temps, concentration en co-solvant permet

d’augmenter la sélectivité de cette technique pour les molécules d’intérêts. À notre

connaissance, ce sera la première fois que l’épinard sera utilisé dans une étude concernant

l’extraction de la lutéine et de la chlorophylle par CO2 supercritique.

1.7 Applications industrielles et analyse technico-économique

1.7.1 Mise à l’échelle industrielle : étude des paramètres opérationnels

Avant l’implémentation à grande échelle de procédés mise au point au laboratoire, des

informations concernant l’optimisation du procédé doivent avoir été étudiées et fournies.

Une optimisation adéquate du procédé permettra de limiter les coûts d’installation et les

coûts de production de l’extrait. Pour cela, les paramètres de pression, de température et

d’addition de colsolvant, les débits de CO2 et ceux de cosolvant doivent optimiser pour

permettre une bonne extraction des composés, tout en limitant la consommation

énergétique et afin de réduire les coûts de production. Les courbes de cinétiques vont

permettre d’optimiser le rendement en matière en fonction du temps et donc de

sélectionner le temps d’extraction idéal en fonction du transfert de masse. En effet, faire

trop durer l’extraction va engendrer une augmentation significative des coûts de

production sans pour autant augmenter de façon significative le rendement d’extraction.

Une récente étude montre qu’un temps d’extraction prolongé après l’épuisement de la

biomasse est contre-productif (Martins et al., 2015). L’extraction après la fin de la

première période d’extraction (CER) est moins efficace ; les coûts de production associés

deviennent trop élevés par rapport au faible rendement d’extraction obtenue à partir de la

deuxième période d’extraction (FER). (Melo et al., 2014).

1.7.2 Estimation des coûts de production

Une fois les paramètres d’extraction bien établis, il convient d’estimer des frais relatifs

aux coûts de production, mais aussi d’estimer les frais d’installations de l’équipement

nécessaires à grande échelle. En effet, différentes capacités de réacteurs sont disponibles

et doivent être choisies en fonction des besoins de la production. Cette estimation de la

mise à l’échelle peut être effectuée grâce à la simulation du procédé à l’aide de logiciels

de simulations tels que SuperProDesigner et AspenPlus. Une fois le procédé simulé, il est

possible de connaître le coût relatif à l’investissement total de l’usine (TCI, total capital

investment), comprenant le prix de l’installation de l’usine (FCI, fixed capital investment)

et les fonds de roulement. Aussi, le résultat de la simulation permet la connaissance de la

consommation énergétique totale du procédé ainsi que celle de chaque pièce composant

31

l’équipement. À partir des indicateurs obtenus, il est ensuite facile de calculer les coûts

de production annualisés ainsi que les coûts spécifiques, correspondant au prix de

production pour un kilogramme d’extrait produit. Cette méthodologie va permettre de

déterminer la viabilité du procédé avant l’investissement potentiel à grande échelle.

Dans la littérature, une méthodologie souvent employée pour l’étude économique des

procédés supercritiques est celle de Turton, qui a étudié l’influence des coûts de

production, mais les coûts fixes de la production et des dépenses générales de l’usine

selon les formules ci-dessous (Richard Turton, Richard C. Bailie, Wallace B. Whiting,

2013) :

𝐶𝑂𝑀 = 𝐷𝑀𝐶 + 𝐹𝑀𝐶 + 𝐺𝐸

Avec COM, cost of manufacturing ; DMC, direct manufacturing cost ; FMC, fixed manufacturing cost ;

GE, general expenses.

En ce qui concerne les coûts directement influencés par la production (DMC) on peut

distinguer :

Ceux liés au prix du matériel de départ utilisé (CRM) comprenant les solvants

(CO2 et cosolvant) et la matière de départ végétale,

ceux liés aux salaires du personnel (COL),

ceux liés aux coûts du traitement des déchets (CWT), et qui ne sont pas pris en

compte dans le cas du CO2 supercritique, car l’ensemble des solvants utilisés sont

recyclés. On considère qu’il n’y a pas de déchet à traiter.

Ceux liés aux coûts de fonctionnement (CUT) en énergie, de l’installation ainsi

que le coût de l’eau froide et de la vapeur utilisée pour les échanges thermiques.

Les coûts non liés directement à la production (FMC) sont ceux qui concernent :

Les taxes,

Les assurances

La dépréciation de l’usine (coûts issus de la dégradation de l’usine au cours du

temps), en général estimée sur 10 à 15 ans donc 10 à 15% du capital

d’investissement.

32

Les dépenses générales (GE) concernent quant à elles les coûts reliés au maintien des

affaires, c’est-à-dire à l’administration, au département de recherche et développement et

aussi des ventes.

La formule la plus utilisée dans la littérature pour l’estimation des coûts a été adaptée par

Meireles et al (Rosa and Meireles, 2005) :

Équation 1.1

𝐶𝑂𝑀 = 0.304𝐹𝐶𝐼 + 2.73𝐶𝑂𝐿 + 1.23(𝐶𝑅𝑀 + 𝐶𝑊𝑇 + 𝐶𝑈𝑇)

Avec COM, cost of manufacturing; FCI, fixed capital investment; COL, cost of labor; CRM, cost of raw

material; CWT, cost of waste treatment; CUT, cost of utilities.

1.7.3 Comparaison économique des procédés conventionnels et supercritiques

Une analyse technique et économique du procédé est donc nécessaire pour évaluer ces

coûts et pour déterminer la rentabilité d’un procédé supercritique par rapport aux procédés

conventionnels. Ces études montrent, dans de nombreux cas, que le CO2 supercritique

peut être plus rentable que les procédés conventionnels, comme c’est le cas pour

l’extraction des huiles essentielles, utilisant comme procédé conventionnel la distillation

qui est très coûteuse. De fait, de nombreuses études dans la littérature portent sur l’analyse

économique de procédés utilisant du CO2 supercritique à l’échelle industrielle. En effet,

des études réalisées sur les feuilles de romarin montrent que le procédé supercritique est

plus rentable que le procédé conventionnel avec un coût de production allant de 30.29 à

61 USD par kg d’extrait de 76.50 USD par kg d’extrait respectivement. Une autre étude

réalisée sur de la menthe montre que les extraits obtenus par SC-CO2 ont un COM autour

de 300 dollars comparativement à ceux du conventionnel compris entre 600 et 1600

dollars (Mezzomo et al., 2011). Les procédés supercritiques sont également plus

avantageux dans le cas d’une production d’extraits d’anis, de fenouil et de clou de girofle

(respectivement de 14.34 ; 9.15 et 10 USD/kg d’extraits comparé à 51, 15 et 40 USD/kg

d’extraits obtenus en procédé d’extraction conventionnel) (Pereira et al., 2013). D’autres

études mettent aussi en évidence le fait que l’utilisation de co-solvant engendre une

augmentation des coûts d’investissements et aussi de productions. Il est donc important

de déterminer si l’utilisation de cosolvant est indispensable au procédé et si le produit

final obtenu aura une valeur suffisamment intéressante sur le marché pour pouvoir amortir

ces frais supplémentaires (de Melo et al., 2014; Pereira et al., 2013).

33

1.8 Prédiction de la solubilité des composés phytochimiques dans un solvant : Application de la théorie de Hansen à la lutéine et chlorophylle dans un solvant supercritique.

La sélection de solvant est basée sur les propriétés de solubilité et aussi sur les

caractéristiques de polarité des molécules étudiées. Néanmoins, la réglementation en

vigueur a une grande influence sur le choix de solvant utilisé pour les extractions, limitant

drastiquement les choix disponibles. De plus, les chercheurs et les industries sont amenés

à privilégier des outils de prédictions préliminaires pour s’assurer de la solubilité des

molécules dans un solvant. Cette étape permet de diminuer le nombre d’expériences, et

de fait limiter les coûts liés au domaine de la recherche et du développement. Les modèles

de thermodynamiques modernes permettent d’identifier de façon très précise le choix

d’un solvant approprié, ou dans notre cas dans la prédiction des meilleurs paramètres de

pression et température pour obtenir une solubilité efficace de la lutéine et de la

chlorophylle dans le CO2 supercritique (Moity et al., 2012).

Cependant, le travail sur des matrices végétales n’est pas facile, car de nombreux facteurs

vont influencer la solubilité des molécules que la matrice contient, mais qui ne seront pas

pris en compte dans les différents modèles thermodynamiques disponibles comme

l’UNIFAC, HANSEN, COSMO-RS. Le modèle UNIFAC (Universal functional activity

coefficient, ou coefficient d’activité des groupements fonctionnels universels) est un

modèle semi-empirique de prédiction d’une activité chimique non électrolyte d’un

mélange non idéal. Ce modèle permet de prédire les interactions entre les molécules selon

les interactions moléculaires existantes entre les groupements fonctionnels. Des bases de

données basées sur ces modèles sont disponibles et sont très utiles pour les terpènes et les

alcaloïdes. Dans le cas de molécules complexes, le modèle est inefficace (cas de la

chlorophylle). (Chemat and Strube, 2015)

Le modèle COSMO (COnductor like Screening MOdel) est un modèle prédictif basé

essentiellement sur des calculs de chimie quantique (thermostatistique) reliant les

structures des composés étudiés à leurs propriétés thermodynamiques. Cette méthode est

incompatible avec les fluides compressés, et par conséquent non compatible avec le CO2

supercritique (Chemat and Strube, 2015).

Dans le monde de l’industrie, la théorie de Hansen est utilisée pour déterminer la

solubilité et la miscibilité de deux composés en se basant sur les forces de cohésions des

molécules. Cette théorie est en effet utilisée de façon courante dans la formulation de

34

peintures, de cosmétiques, d’encres et d’autres produits. Elle permet par exemple le choix

d’un solvant adéquat de façon théorique et rapide pour la solubilisation d’une molécule.

Les paramètres de solubilité aident à la sélection d’un solvant adéquat parmi de nombreux

choix, sans avoir à tester chaque solvant (Chemat and Strube, 2015).

Il existe au sein des molécules différentes forces de cohésion s’opposant leurs séparations.

Il s’agit des forces de Van der Waals, comprenant les forces de London, Keesom et de

Debye et la force des liaisons hydrogènes. L’énergie nécessaire pour rompre les liaisons

entre ces molécules est appelée Énergie de vaporisation et est notée ∆Hv. L’énergie de

cohésion molaire du système correspond à la soustraction de la valeur du travail effectué

afin d’obtenir une valeur de l’énergie E correcte.

Ceci se fait grâce à la loi des gaz parfaits :

Équation 1.2

𝐸 = ∆Hv − RT

Avec ∆Hv, l’énergie de cohésion ; R, la constante des gaz parfaits et T, température.

Hildebrand en 1916 a proposé une théorie de solubilité basée sur cette énergie interne du

solvant et du soluté. Ce concept est basé sur la loi de Gibbs, montrant que pour qu’il y ait

dissolution, l’enthalpie libre d’un système doit être inférieure à 0. En effet, l’enthalpie du

mélange, qui défavorise la dissolution, ne doit pas être supérieure à l’entropie associée à

la température.(Hansen, 2007).

L’énergie de liaison peut être utilisée pour déterminer de nombreuses propriétés d’une

substance, dont la solubilité. Hildebrand a utilisé ce concept et l’a exprimé par unité de

volume, montrant que le rapport énergie interne par rapport au volume molaire, noté E/V

(cm3 /mol), correspond à la densité d’énergie de cohésion. En d’autres termes, la densité

d’énergie de cohésion permet d’exprimer l’énergie nécessaire à la dissolution d’un

système en calorie par cm3, représentant le degré des forces de Van der Waals intervenant

dans le maintien des molécules dans un liquide ensemble. De même, il y a une relation

entre les forces de Van der Waals et la solubilité d’un système, car pour qu’il y ait

solubilité, il faut qu’il y ait dissolution pour que les molécules constituant un système

soient suffisamment espacées pour se lier à d’autres molécules de mêmes affinités. Pour

35

qu’il y ait miscibilité entre deux liquides par exemple, il faut que la force liée à leurs

liaisons intermoléculaires soit la plus proche possible et donc que leur densité d’énergie

de cohésion soit la plus proche possible (Hansen and Poulsen, 2007).

Le paramètre de solubilité de Hildebrand, noté 𝛿, correspond à la racine carrée de la valeur

de la densité d’énergie de cohésion.

Équation 1.3

𝛿 =√(∆Hv − RT)

𝑉

L’approche de solubilité de Hildebrand, très utilisée dans le passé, était limitée aux

solutions n’ayant pas beaucoup d’interactions intermoléculaires (polaires et hydrogènes),

car elles n’étaient pas prises en compte. Cette approche ne représentait pas de façon idéale

la solubilité des « vrais fluides ».

La théorie de solubilité de Hansen, plus récente (1960), est basée sur le fait que la

solubilité d’une molécule ou d’un solvant, correspondant à racine carrée de la valeur de

la densité d’énergie de cohésion peut être divisé en 3 parties distinctes.

En effet, selon la théorie de Charles Hansen, la solubilité totale 𝛿𝑡2 représente l’addition

des:

Interactions non polaires, autrement appelées forces de dispersion 𝛿𝑑2

Interactions polaires de types dipôle induit-dipôle induit 𝛿𝑝2

Interactions liées aux liaisons hydrogènes 𝛿ℎ2

L’équation de solubilité de Hansen est donc l’addition de ces 3 interactions, comme le

montre l’équation ci-dessous (Hansen, 2007; Lanty, 2005) :

Équation 1.4

𝛿𝑡2 = 𝛿𝑑

2 + 𝛿𝑝2 + 𝛿ℎ

2 (MPa)2

36

Ainsi, un espace à 3 dimensions est obtenu par le biais de cette formule, en supposant que

les solvants à l’étude soient localisés selon l’addition de leurs forces intermoléculaires

comme le montre la formule ci-dessus. Ces 3 paramètres vont correspondre à chacun des

3 axes de l’espace de Hansen. Le point correspondant au milieu de la sphère représente

l’intersection ou la combinaison de ces 3 forces appelées interaction radius (ra), qui

assurent la cohésion du liquide. Pour qu’une substance soit soluble avec le solvant à

l’étude, il faut qu’ils aient une situation spatiale proche, de fait que le composé soit à

l’intérieur de la sphère de solubilité de Hansen (Srinivas et al., 2010a) (figure 1.14).

La solubilité du CO2 est mesurée actuellement en terme de pression atmosphérique et à

25°C.

Or, les variations de pression et la température font varier la solubilité du CO2 de façon

significative. C’est en effet ces variations qui sont utiles pour permettre de trouver des

paramètres de pression/température optimaux pour l’extraction de biomolécules par la

technique de CO2 supercritique. Une augmentation de la pression à température constante

accroît la solubilité en augmentant la densité du solvant et une augmentation de la

température à pression constante diminue la solubilité, en diminuant la densité du CO2.

Il s’avère donc important pour les futurs calculs de la solubilité de la lutéine et de la

chlorophylle de modifier l’équation de Hansen pour prendre en compte de ces paramètres

importants.

Pour cela, nous avons utilisé l’approche de Laurie L permettant une intégration de

l’équation d’état à l’équation de Hansen selon des dérivées partielles pour étudier

l’influence de la pression et de la température sur les propriétés de solubilité du CO2

supercritique (Williams et al., 2004).

Équation 1.5 : Forme intégrée de la formule de solubilité de Charles Hansen modifiée par

Laurie L. Williams en fonction de la pression et de la température.

37

𝛿2 =

[

𝛿𝑑𝑟𝑒𝑓

(𝑉𝑟𝑒𝑓𝑉 )

−1.25

] 2

+

[

𝛿𝑝𝑟𝑒𝑓


−0.5

] 2

+

{

𝛿ℎ𝑟𝑒𝑓

𝑒𝑥𝑝 [−1.32 × 10−3(𝑇𝑟𝑒𝑓 − 𝑇) − 𝑙𝑛 (𝑉𝑟𝑒𝑓𝑉 )

0.5

]}

2

La formule, utilisant des dérivées partielles, permet d’observer l’influence de la pression

et de la température sur chaque interaction intermoléculaire en jeux dans l’étude de la

solubilité totale.

Avec:

𝛿2= solubility parameters depending of density; V = Molar Volume, cm 3/mol (Variable); 𝛿𝑑ref = (15.6)2

Mpa1/2(constant); Tref = 25 °C (Constant); 𝛿p ref = (5.2)2 Mpa1/2(constant); T = temperature of the table

corresponding molar volume used (°C) (Variable); 𝛿href = (5.8)2 Mpa1/2 (constant); Vref = 39.13 cm3/mol

(constant); V = Molar volume study, depending on the pressure/temperature combination (cm3/mol).

Les constantes utilisées pour les différentes forces intermoléculaires de la formule de

solubilités sont celles du CO2, soumises à une pression de 905 bar, à 25°C, correspondant

à un volume molaire de référence de 39,13 cm3

/mol.

38

Figure 1-10: Représentation de la solubilité totale du CO2 supercritique obtenue par

utilisation de l’équation 1.6, donc en fonction de la pression et de la température.

Adapté de Laurie L. Williams (Williams et al., 2004)

Une fois la solubilité du CO2 modifiée pour chaque condition de pression et de

température, il est possible d’étudier la solubilité de la lutéine et de la chlorophylle. Cela

permet de déterminer une distance entre nos molécules et le paramètre

pression/température du CO2 à l’étude, exprimé en MPa, et appelé Ra.

Équation 1.6

𝑅𝑎2 = 4(𝛿𝐷1 − 𝛿𝐷2)2 + (𝛿𝑃1 − 𝛿𝑃2)2 + (𝛿𝐻1 − 𝛿𝐻2)2

Avec D1= Le soluté et D2= le solvant, qui est le CO2 selon les paramètres de température et de pression

étudiés.

Plus le Ra est petit, plus la solubilité entre le solvant et la molécule est proche, car plus

distance dans l’espace de Hansen est proche entre le soluté et le solvant (Sicaire et al.,

2015).

La RED (Relative energy difference) entre les paramètres de solubilité du solvant et de la

molécule est calculée à l’aide de l’équation suivante, permettant de déterminer leurs

miscibilités.

39

Équation 1.7

𝑅𝐸𝐷 = 𝑅𝑎

𝑅𝑜

Où Ro est le radius de la sphère de Hansen de la lutéine ou de la chlorophylle et Ra est la distance entre

le soluté et le solvant du centre de la sphère.

Un solvant, ici une condition température/pression du CO2 a un RED compris entre 0 et

1 s’il est très bon. Ensuite, plus la RED augmente, plus le pouvoir solvant va

progressivement diminuer. On peut considérer qu’un RED supérieur à 2 a un faible

pouvoir solvant (Chemat and Strube, 2015; Sicaire et al., 2015).

Figure 1-11: Sphère de solubilité de Hansen

La sphère verte représente la sphère de solubilité d’une molécule, pendant que les points en son centre

représentent les solvants qui permettent sa solubilisation. Si un point est au centre, alors son RED est

compris entre 0 et 1, s’il sort de la sphère, c’est que son pouvoir solvant ne permettait pas ou moins de

solubiliser la molécule à l’étude. Adapté de Mohamed et al. (Mohamed and Wilson, 2012)

40

2 Problématique, hypothèse de recherche, objectif principal et objectifs spécifiques

41

2.1 Problématique L’industrie maraîchère génère une quantité importante de résidus d’épinards pouvant être

valorisés pour leurs contenus en biomolécules, notamment en lutéine et en chlorophylle

et qui pourront être destinées aux marchés des aliments fonctionnels et des nutraceutiques.

Les solvants pétrochimiques sont des solvants d’extractions efficaces et peu dispendieux

pour ces molécules, mais présentent néanmoins des effets nocifs sur l’environnement

ainsi que sur la santé humaine en général. En effet, en plus d’être issus de ressources non

renouvelables, ces solvants contribuent à la pollution environnementale et à l’effet de

serre. Les solvants pétrochimiques peuvent également présenter des propriétés

cancérigènes, mutagènes et aussi reprotoxiques, c'est-à-dire affecter les capacités

reproductrices par une action sur les gonades ou agissant comme perturbateur

endocrinien. La mise en place d’une chimie plus durable dans le monde pharmaceutique

ainsi qu’agroalimentaire a donc pour but de limiter l’impact néfaste des solvants toxiques

toujours utilisés de façon intensive par les industriels. En effet, nous avons pu constater à

travers la littérature disponible que la production de lutéine et la chlorophylle à l’échelle

industrielle passent toujours par l’utilisation de solvants pétrochimiques permettant

cependant une extraction très efficace de ces composés.

2.2 Hypothèse de recherche L’hypothèse de recherche de ce projet est donc qu’il est possible d’extraire et de purifier

la lutéine et la chlorophylle, à partir de sous-produits d’épinards, en respectant les

principes de la chimie verte, de façon aussi efficace qu’avec l’utilisation de solvants

pétrochimiques.

2.3 Objectif principal L’objectif principal de ce projet était donc l’obtention d’extraits riches en lutéine et en

chlorophylle à partir de sous-produits d’épinards en respectant les principes de la chimie

verte et les exigences énoncées par Écocert. De fait, les méthodes choisies au court de ce

projet seront dites écologiques.

42

2.4 Objectifs spécifiques Optimisation d’une technique d’extraction conventionnelle de la lutéine et de la

chlorophylle à partir de sous-produits d’épinard en utilisant un système de solvant

vert composé uniquement d’eau et d’éthanol

Développement d’une technique d’extraction et aussi de séparation

conventionnelle de la lutéine et de la chlorophylle à partir de sous-produits

d’épinards en utilisant un système de solvants verts composés uniquement d’eau

et d’éthanol avec ajout d’une étape de saponification

Mise en place d’une technique d’extraction, voire de séparation, innovante par

fluide supercritique de la lutéine et de la chlorophylle à partir de sous-produits

d’épinards avec de l’éthanol comme cosolvant.

Modélisation de la solubilité des composés phytochimiques dans le CO2

supercritique selon la théorie de Hansen afin de prédire la solubilité de ces

molécules dans ce solvant.

Étude de l’applicabilité industrielle du procédé d’extraction par fluide

supercritique à partir de sous-produits d’épinards : Étude technique et économique

43

3 Optimization of a green process for the extraction of lutein and chlorophyll from spinach by-products using response

surface methodology (RSM)

44

3.1 Transition contextuelle Le présent projet a donc pour objectif principal de développer un procédé d'extraction et

de séparation de deux biomolécules d’intérêts, la lutéine et la chlorophylle, à partir de

sous-produits d’épinards, par une optimisation de procédés écologiques. L’efficacité

d’extraction de ces molécules selon une méthode conventionnelle, composée d’un

système de solvants vert (eau et éthanol), a été comparée avec l’extraction obtenue par

des solvants pétrochimiques dans ce chapitre. La méthodologie de la réponse de surface

a été utilisée afin d’optimiser les paramètres d'extraction de la lutéine et de la chlorophylle

avec des solvants verts. Différentes combinaisons de paramètres d’extractions ont été

testées afin d’obtenir une extraction présentant une efficacité proche de celle obtenue lors

de l’utilisation de solvants pétrochimiques.

Ce chapitre est présenté sous la forme d’un article intitulé : « Optimization of a

green process for the extraction of lutein and chlorophyll from spinach by-products using

response surface methodology (RSM) » publié dans LWT, journal of Food Science and

Technology dont les auteurs sont Maëlle Derrien ; Ashraf Badr ; André Gosselin ; Yves

Desjardins ; Paul Angers. (79, 170–177. http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2017.01.010)

Les auteurs sont Maëlle Derrien (premier auteur), qui a participé à la planification,

l’interprétation, la discussion et à la rédaction de l’article. Le Dr Paul Angers, directeur

de la thèse, et les Dr André Gosselin, Yves Desjardins, co-directeurs de la thèse ont

participé à la planification des travaux de recherche, à la discussion des résultats lors de

réunions ainsi qu’à la révision de l’article présenté. Le Dr Ashraf Badr, professionnel de

recherche, a participé à la discussion des résultats.

45

3.2 Résumé Les résidus de fruits et légumes générés par l’industrie maraîchère contiennent des

composés phytochimiques pouvant pouvant être valorisés afin de générer des extraits

riches en biomolécules. La production d'épinards génère environ 25% de déchets, riches

en biomolécules, notamment en lutéine et en chlorophylle. Une méthode d'extraction

verte, utilisant de l'éthanol et de l'eau comme solvants d'extraction, a été développée afin

d'extraire ces composés à partir de sous-produits des épinards. La méthodologie de la

surface de réponse a été utilisée afin d’optimiser les paramètres d'extraction de la lutéine

et de la chlorophylle avec des solvants verts. Différentes combinaisons de paramètres

d’extraction ont été testées afin d’obtenir une extraction présentant une efficacité

d’extraction proche de celle obtenue lors de l’utilisation de solvants pétrochimiques. Les

paramètres optimaux d’extraction étaient de 93% de concentration en éthanol, pendant

4,3 h à 43 ° C et un rapport solvant sur matières premières de 1/66. Ces paramètres ont

été validés avec une expérience réalisée avec les conditions optimales déterminées par le

modèle, et les résultats montraient que le rendement en lutéine et en chlorophylle était

très bon (96% pour la chlorophylle et 70% pour la lutéine). Les résultats montrent donc

la possibilité d’extraire la lutéine et la chlorophylle à partir de matières renouvelable, les

sous-produits d’épinards, avec utilisation de solvants verts de façon aussi efficace qu’avec

des solvants pétrochimiques, nocifs.

46

3.3 Abstract Industrial vegetables wastes contain valuable phytochemicals that can be used as a source

of biomolecules. Spinach production yields about 25% of waste material that is high in

lutein and in chlorophyll. A green extraction method, using ethanol and water as

extraction solvents was developed in order to extract these phyto-compounds from

spinach by-products. Response Surface Methodology was used to optimize the extraction

parameters of lutein and chlorophyll. The model predicted that a high yield of lutein and

chlorophyll could be obtained with ecological extraction, close to the conventional

methods. The optimum extraction parameters predicted were 93% ethanol concentration,

for 4.3 h at 43°C and a solvent to raw material ratio of 1/66. These parameters were

validated with an experiment carried out under the optimal conditions determined, given

a recovery of these molecules close to those predicted (96% for chlorophyll and 70% for

lutein). These results confirmed that the model was adequate to optimize extraction of

lutein and chlorophyll from spinach by-products using green solvents.

47

3.4 Introduction Several epidemiological studies have demonstrated that a diet rich in fruit and vegetables

has a positive impact on health. This effect can be explained by the presence of

phytochemicals in plants (Cubas et al., 2008). There are indeed several classes of

molecules with biological activity proven to have effect on human metabolism, including

carotenoids and chlorophyll. These phytochemicals display antioxidant activity in vitro,

and are believed to counter oxidative stress by radical scavenging and anti-inflammatory

activity (Dudonne et al., 2009).

Industrial vegetable wastes contain high levels of phytochemicals that can be used to

enhance various health products. Spinach is a highly consumed vegetable worldwide, and

its production lead to 25% of waste, from which valuable biomolecules can be extracted.

In fact, spinach is a rich source of carotenoids (lutein and zeaxanthin) and chlorophyll

and contains high levels of vitamins (A, B9 and K), minerals (Fe, Mg, Mn), as well as

phenolic compounds such as phenolic acids (Bunea et al., 2008a; Canada, 2013). It is

especially rich in lutein, a symmetrical tetraterpene skeleton formed by tail-to-tail linkage

of two geranylgeranyl diphosphate molecules (C20 unit). This carotenoid molecule exerts

antioxidant activities with its singlet oxygen quenching properties and its ability to trap

free radicals (Ligor, Trziszka et al. 2013). Lutein is involved in the reduction of the

incidence of eye diseases; it is present in high concentration in the retina close to the

macula densa, where it protects the eye tissues against damage related to light and the

age-related macular degeneration (Carpentier et al., 2009; Fernández-Sevilla et al., 2010;

Johnson, 2012). Chlorophyll, a natural amphiphilic green pigment found in most plants

(Cubas et al., 2008), is composed of hydrophilic head formed by a porphyrin group and a

long lipophilic hydrocarbon tail or phytol group. Chlorophyll display biologicals

activities in vitro and in vivo including antioxydant activity, antimutagenetic and pro-

apoptotic effect and may reduce the risk to develop a colorectal cancer(Ferruzzi and

Blakeslee, 2007b). Like lutein, chlorophyll is insoluble in polar solvents due to its phytol

tail containing 20 carbons (Scheer, 2013). These two molecules show comparable

solubility in organic solvents, requiring a supplementary step for their purification, which

can be time consuming and costly (Lin et al., 2014).

The lutein extraction process predominantly used is a multi-step solid-liquid extraction

from dried material (Lin et al., 2014). Current methods for the extraction of chlorophyll

are solid-liquid extraction from fresh or freeze-dried biomass. In addition to the solid

48

liquid extraction, studies are also conducted on supercritical carbon dioxide (SC-CO2)

extraction to extract lutein and chlorophyll from different crops. This technique uses non-

toxic and sustainable SC-CO2(Macías-Sánchez et al., 2005). Organic solvent extraction

remains the widely used method. Indeed, carotenoids are mostly extracted by hexane for

both food and pharmaceutical purposes. Petrochemical solvents are very efficient in the

extraction of these molecules because they dissolve solutes easily and their volatility

facilitates their removal at the end of the process. However, they may represent

carcinogenic risks and cause environmental pollution. For these reasons, eco-extraction

technique are sought to allow safe extraction for both the environment and consumers. A

green solvent is a environmentally friendly solvent from natural sources such as wood,

fruits and vegetable oils. Ethanol is a green solvent widely used in industry because of its

low cost, easy availability, safety and biodegradability. However, this solvent is less

effective for the extraction of apolar compounds such as lutein and chlorophyll to obtain

high yields(Chémat, 2010). Thus, extraction of these molecules using ethanolic solvent

has to be optimized in order to obtain high extraction efficiency.

The aim of this work was thus to optimize a sustainable extraction of chlorophyll and

lutein from spinach by-products using response surface methodology (RSM), employing

a Box-Behnken design, and with only ethanol and water as solvents, in order to respect a

green procedure according to the Ecocert requirements.

49

3.5 Materials and methods

3.5.1 Chemicals

Spinach by-products were kindly provided by VegPro International (Sherrington, QC;

Canada). The material used did not meet the commercial criteria and thus were intended

to waste by the vegetable producer. Chlorophyll a, b and lutein standards (95% purity)

were purchased from Sigma Aldrich (Oakville, Canada), and ethanol (95%) and acetone

used for extraction were obtained from Les alcools du Commerce Inc. (Boucherville,

Canada). HPLC grade solvents were purchased from VWR (Mississauga, Canada). HPLC

water was prepared using a MilliQ water purification system from Millipore (Etobicoke,

Canada).

3.5.2 Methods

3.5.2.1 Quantification of lutein and total chlorophyll

Spinach by-products were freeze-dried, vacuum packaged and stored in the dark since

lutein and chlorophyll are highly sensitive to O2, light and heat.

Acetone was used as a reference solvent for the extraction of lutein and chlorohyll from

freeze-dried spinach The extraction was carried out at room temperature, under agitation,

for 20 min using 0.5 g of freeze-dried spinach and 10 mL of acetone. The supernatant was

collected and the residue was extracted with acetone once more until obtaining a non-

colored residue. the extraction was repeated 2 times to obtain a decolorized residue. The

supernatants from all the extractions were combined and evaporated under vacuum at 45

°C. The dry extract was stored under nitrogen at -80 °C until analysis. The extraction

protocol was performed in triplicate.

3.5.2.2 Optimization of parameters for both chlorophyll and lutein extraction using

ethanol as solvent

Experiments were performed to identify the optimal parameters for ethanol/water

extraction of lutein and chlorophyll, the dependent variables, from freeze-dried sample

(0.5g) including solvent to raw material ratio (1/33 to 1/100 v/w), ethanol concentration

(0 to 95%, v/v), time (1-7 h) and temperature (20 to 60 °C). The supernatants from the

extractions, carried out in triplicate, under constant agitation, were evaporated under

nitrogen and the residues were stored at -80°C until analysis.

50

3.5.2.3 Box Behnken design

The response surface methodology (RSM) is an efficient statistical technique for the

optimization of multiple variables experiments allowing the determination of optimum

process parameters with a minimum number of runs. Response surface optimization is

more advantageous than the traditional single parameter testing approaches that observe

the effect of one factor at a time on the variable. Besides being time consuming, these

conventional methods are also unable to detect the interactions between the different

factors tested in these experiments (Ferreira et al., 2007). The most common types of

RSM models are the three-level factorial, the central composite and the Box Behnken

design (Baş and Boyacı, 2007). The latter was used in this study, because it enables the

determination of optimal parameter with a minimal number of experiments compared to

other designs.

A preparatory procedure (screening analysis) comprises a primary study discarding the

effects of extraction parameters exhibiting negligible impact on the lutein and chlorophyll

extraction. Hence, optimum parameters found in this study were selected as they

contribute to influence the extraction process.

The relation between the coded values and actual values used for statistical analysis are

described in the following equation (Katsampa et al., 2015):

Equation 3.1

𝑋𝑖 =(𝐴𝑖 − 𝐴𝑜)

∆𝐴

The dependent and independent variables, with their low, medium, and high levels were

selected based on the results from preliminary experiments. The range of extraction time

(X1), extraction temperature (X2), solvent concentration (X3), solvent to raw material ratio

(X4) used to prepare the 27 experiments are presented in Table 1, with their respective

observed and predicted responses. The effects of these four independents variables (X1,

X2, X3, X4) on the lutein (Υ1) and chlorophyll (Υ2) response were investigated to determine

the optimal conditions by employing the Box–Behnken experimental design.

The adequacy of the model was verified using the determination coefficient R2, the

adjusted determination coefficient R2a and the lack of fit test. The statistical significance

was supported by an F-test and their corresponding 𝜌-value at the 5% significance level.

Analysis based on the response surface, the desirability function, the canonical and ridge

51

analysis was also used to validate the optimum extraction parameters. The present model

was corroborated for both response Υ1 and Υ2 with an experiment, run in triplicate, using

the optimal conditions predicted by the model, and the average values of the validation

experiment were compared with the predicted values. (Dong et al., 2009; Yin and Dang,

2008).

3.5.2.4 HPLC analysis

Lutein and chlorophyll were quantified by HPLC-UV on an Agilent 1260 liquid handling

system (Mississauga, Canada), equipped with a UV detector, set at 450 nm for both

carotenoids and chlorophyll, and a C30 YMC column (250mm×4,6mm id., 5mm particle

size; Allentown, U.S.A.), maintained at a constant temperature of 35°C. Carotenoids and

chlorophyll were resolved with a mobile phase that consisted of methanol: water (98/2,

v/v) (eluent A) and methyl-tert-butyl ether (MTBE) (eluent B). The flow-rate was 1.0

mL/min and the gradient elution was: initially2% B, 2.0–80% B; 0.0-27.0 min, isocratic

80% B; 27.0-31.0 min, 80.0-2.0% B; 31.0-31.1 min, isocratic 2% B; 31.1-34.00 min.

Identification of each compound was confirmed using retention time and UV spectra

(190-640nm) of pure compounds. Data acquisition was carried out with Chemstation

software. On the day of the analysis, lutein and chlorophyll standards and sample were

solubilized with methanol/dichloromethane (65/35; v/v) (Gleize et al., 2012).

3.5.2.5 Statistical analysis

Analysis of variance (ANOVA) and multiple regression analysis of experimental data

were conducted for fitting the second order polynomial model:

Equation 3.2

𝑌 = 𝛽0 +∑𝛽𝑖 𝑋𝑖

4

𝑖=0

+∑𝛽𝑖𝑖𝑋𝑖2 +∑

4

𝑖=𝑜

∑𝛽𝑖𝑗

4

𝑗=0

4

𝑖=0

𝑋𝑖 × 𝑋𝑗

Where 𝑌 were the response (yield (%) of lutein or chlorophyll); β0 the constant

coefficient; 𝛽𝑖 the linear coefficient; 𝛽𝑖𝑖 the quadratic coefficients; 𝛽𝑖𝑗 the two factor

interaction coefficient and 𝑋𝑖 and 𝑋𝑗 the independents variables (Baş and Boyacı, 2007).

Regression and variance analyses were carried out using RSREG procedure of the

Statistical Analysis System (SAS) (version 9.4, SAS institute Inc, Cary, NC, USA). Both

52

canonical and ridge analyses were conducted in addition to the Derringer’s desirability

function, known as an efficient method for optimization of multiple responses.

3.5.2.6 Derringer’s desirability function

The optimal parameters for responses from lutein and chlorophyll were obtained using

Derringer’s desirability function. This method converts each response into an individual

desirability function 𝑑𝑖, ranging from 0 to 1 (from the lowest and highest desirability).

These individual’s functions are then combined into an overall desirability function, D:

Equation 3.3

𝐷 = (𝑑1𝑤1𝑑2

𝑤2𝑑𝑛𝑤𝑛)

1∑𝑤𝑖⁄

Where D is the overall desirability, di is individual response desirability and wi is a

response weight.

Equation 3.4

𝑑𝑖 = {

0 𝑦1 ≤ 𝑦𝑖−𝑚𝑖𝑛

[𝑦𝑖 − 𝑦𝑖−𝑚𝑖𝑛

𝑦𝑖−𝑚𝑎𝑥 − 𝑦𝑖−𝑚𝑖𝑛]𝑟

1 𝑦𝑖 ≥ 𝑦𝑖−𝑚𝑎𝑥

𝑦𝑖−𝑚𝑖𝑛 < 𝑦𝑖 < 𝑦𝑖−𝑚𝑎𝑥

Where di is individual response desirability, Yi is the response values, Yi-min is the

minimum acceptable value for response i, Yi-max is the maximum acceptable value for

response i, and r is a weight used to determine the scale of desirability (Hu et al., 2008;

Islam et al., 2012). ). Desirability function was used in this study in order to find the

optimum parameters maximizing the lutein and the chlorophyll response.

53

3.6 Results

3.6.1 Quantification of lutein and chlorophyll in spinach

Extraction of spinach samples was performed with acetone to determine their total content

in lutein and chlorophyll by HPLC-UV (Fig. 1.1). The results showed that the spinach

samples used for the experiment had a total concentration of 10.1 mg/100g FW in lutein

and 112.8 mg/100g FW in chlorophyll. The amount of lutein and chlorophyll obtained

during the optimization was then compared to the total amount of lutein and chlorophyll

obtained using acetone, a conventional solvent, with the following formula:

Equation 3.5

Yield of lutein or chlorophyll (%)

= (𝑎𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑜𝑓 𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑜𝑟 𝑐ℎ𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝ℎ𝑦𝑙𝑙 𝑜𝑏𝑡𝑎𝑖𝑛 𝑤𝑖𝑡ℎ 𝑒𝑡ℎ𝑎𝑛𝑜𝑙 (

𝑚𝑔100𝑔 𝐹𝑊)

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑎𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑜𝑓 𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑜𝑟 𝑐ℎ𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝ℎ𝑦𝑙𝑙 𝑤𝑖𝑡ℎ 𝑐𝑜𝑛𝑣𝑒𝑛𝑡𝑖𝑜𝑛𝑎𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡 (𝑚𝑔100𝑔 𝐹𝑊)

)

× 100

The results are presented in table 3.1.

54

Figure 3-1: HPLC chromatogram of total extraction of lutein and chlorophyll

obtained using conventional solvent extraction i.e acetone, measured at 450 nm by

UV/vis detector

Peak identification: (1) chlorophyll b (2) lutein (3) chlorophyll a (4) 𝛽-carotene.

mAU

Min

55

Tableau 3-1: Box Behnken matrix with predicted and experimental response values for lutein and chlorophyll

Coded and uncoded Variables Lutein yield (%) Chlorophyll yield (%)

Run No 𝑋1 𝑋2 𝑋3 𝑋4 Experimental Predicted Experimental Predicted

1 -1 (1) -1 (20) 0 (47.5) 0 (66) 1.93 2.34 0.62 1.05

2 1 (7) -1 (20) 0 (47.5) 0 (66) 2.64 2.24 1.39 1.61

3 -1 (1) 1 (60) 0 (47.5) 0 (66) 9.72 6.59 3.53 2.49

4 1 (7) 1 (60) 0 (47.5) 0 (66) 10.65 5.05 2.63 1.26

5 0 (4) 0 (40) -1 (0.0) -1 (33) 0.50 0.26 0.34 0.21

6 0 (4) 0 (40) 1 (95.0) -1 (33) 56.10 114.47 61.47 78.52

7 0 (4) 0 (40) -1 (0.0) 1 (100) 16.83 4.83 1.05 0.8

8 0 (4) 0 (40) 1 (95.0) 1 (100) 63.25 67.68 75.77 98

9 -1 (1) 0 (40) -1 (0.0) 0 (66) 0.93 1.34 0.71 0.71

10 1 (7) 0 (40) -1 (0.0) 0 (66) 0.07 0.28 0.05 0.2

11 -1 (1) 0 (40) 1 (95.0) 0 (66) 51.45 26.06 72.56 39.25

12 1 (7) 0 (40) 1 (95.0) 0 (66) 67.18 91.98 92 144.34

56

13 0 (4) -1 (20) 0 (47.5) -1 (33) 1.86 2.58 1.22 1.41

14 0 (4) 1 (60) 0 (47.5) -1 (33) 4.68 5.15 0.89 1.12

15 0 (4) -1 (20) 0 (47.5) 1 (100) 3.75 6.71 1.30 1.62

16 0 (4) 1 (60) 0 (47.5) 1 (100) 15.01 21.47 2.86 3.90

17 -1 (1) 0 (40) 0 (47.5) -1 (33) 2.68 2.89 1.05 1.38

18 1 (7) 0 (40) 0 (47.5) -1 (33) 5.75 3.25 2.3 1.52

19 -1 (1) 0 (40) 0 (47.5) 1 (100) 8.15 12.57 2.93 3.50

20 1 (7) 0 (40) 0 (47.5) 1 (100) 9.86 8.13 3.92 2.40

21 0 (4) -1 (20) -1 (0.0) 0 (66) 0.79 0.57 0.62 0.40

22 0 (4) 1 (60) -1 (0.0) 0 (66) 0.57 0.93 0.15 0.21

23 0 (4) -1 (20) 1 (95.0) 0 (66) 54.31 29.47 61.83 35.07

24 0 (4) 1 (60) 1 (95.0) 0 (66) 94.33 114.80 96.40 121.80

25 0 (4) 0 (40) 0 (47.5) 0 (66) 4.24 5.98 2.95 3.54

26 0 (4) 0 (40) 0 (47.5) 0 (66) 7.59 5.98 3.19 3.54

27 0 (4) 0 (40) 0 (47.5) 0 (66) 6.65 5.98 4.70 3.54

57

3.6.2 Accuracy and variance analysis of the regression model

The quadratic regression model for lutein resulted in a determination coefficient (R2 =

0.97), indicating that only 0.03% of the variation cannot be explained by the model. The

adjusted determination coefficient at R2a = 0.95, confirmed that the model was highly

significant. The lack of fit associated with 𝜌- values of 0.11, indicates a non-significance,

supporting that the model fits with the data. A 𝜌-value lower than 0.0001was found,

demonstrating again the high significance of the regression model. Neglecting the

insignificants terms, the model is given by the following second order polynomial

equation:

Equation 3.6

Υ = 15,342 − 0,959 × 𝑋3 + 0,012 × 𝑋3𝑋3 + 0,011 × X3X2

For chlorophyll, the quadratic regression model showed a determination coefficient (R2

= 0.98), showing that only 0,02% of the variation can’t be explained by the present model.

The adjusted determination coefficient (R2a = 0.97), confirmed that the model was highly

significant. The lack of fit associated with a 𝜌 -value of 0.1237 indicated that the model

fits with the data. The total model was associated with a p-value <0.0001, proving the

high significance of the regression model. The results of ANOVA are presented in Table

3.2. The final predicting equation for the chlorophyll extractability taking into account

only the significant terms, given bellow:

Equation 3.7

Υ = 8,992 − 1,353 × 𝑋3 + 0,016 × 𝑋3𝑋3 + 0,009 × X3X2

The small difference between the yield predicted by the model and the experimental

results, the variance analysis of the model and the insignificant lack of fit, all indicate that

the accuracy and the fitness of the model was highly satisfactory.

Table 3-2: Analysis of variance (ANOVA) of quadratic polynomial model for lutein

and chlorophyll responses

58

Three-dimensional plots were used to represent the predicted model equation and thus the

interaction between the different extraction parameters and the lutein and chlorophyll.

These plots show the interaction between two factors while the others are kept at their

medium level. The response surface plots of influencing parameters of lutein and

chlorophyll are shown in figure 3.2 and 3.3, respectively, and the corresponding

regression coefficients and 𝜌-value for the estimated yields in lutein and chlorophyll are

presented in Table 3.3.

Lutein yield (R2 = 0.97; R2a= 0.95) Chlorophyll yield (R2 = 0.98; R2

a = 0.97)

Sources of

variations

DF SS MS F-

value

𝜌 -value DF SS MS F-value 𝜌 -value

Model 14 17448 1246.28 30.76 <.0001** 14 26883 1920.21 57.20 <.0001**

Pure error 2 0.19 0.09 2 0.12 0.06

Linear 4 11829 2957.25 72.99 <.0001** 4 17619 4404.75 131.21 <.0001**

Quadratic 4 5105.34 1276.33 31.50 <.0001** 4 8808.50 2202 65.59 <.0001**

Cross-product 6 513.60 85.6 2.11 0.13 6 455.03 75.83 2.26 0.11

Lack of fit 10 7.69 0.77 8.23 0.11 10 4.64 0.46 7.47 0.12

Total error

model

12 486.22 40.52 12 402.86 33.57

* Significant at 5% level

** Significant at 1% level

DF, degree of freedom; SS, sum of squares; MS, mean square; R2, coefficient of determination; R2a , R2adjusted.

59


temperature and solvent concentration on lutein yield

Solvent concentration(%)

Lutein yield (%)

60


temperature and solvent concentration on chlorophyll yield

Chlorophyll yield (%)

Solvent concentration(%)

61

Table 3-3: Regression coefficients for the estimated yields in lutein and chlorophyll

Variables Coefficient based on

actual value

Standard

error

𝜌-value Coefficient

based on

coded

value

Coefficient based on

actual value

Standard

error

𝜌-value Coefficient based on

coded value

Lutein Chlorophyll

Intercept 15.342 27.850 0.592 6.214 8.992 25.351 0.729 3.643

𝑋1 1.027 4.049 0.804 1.771 -1.519 3.686 0.688 1.748

𝑋2 -0.786 0.694 0.279 5.827 -0.198 0.632 0.759 3.295

𝑋3 -0.959 0.242 0.002** 30.554 -1.353 0.220 <.0001** 38.135

𝑋4 0.039 0.414 0.927 3.773 0.257 0.377 0.508 1.714

𝑋1 × 𝑋1 -0.203 0.306 0.520 -1.827 0.094 0.279 0.742 0.845

𝑋1 × 𝑋2 0.001 0.053 0.987 0.054 -0.007 0.048 0.887 -0.419

𝑋2 × 𝑋2 0.005 0.007 0.520 1.827 -0.001 0.006 0.861 -0.450

𝑋3 × 𝑋1 0.029 0.022 0.217 4.145 0.035 0.020 0.107 5.050

𝑋3 × 𝑋2 0.011 0.003 0.008* 10.058 0.009 0.003 0.011* 8.762

62

𝑋3 × 𝑋3 0.012 0.001 <.0001** 27.585 0.016 0.001 <.0001** 35.753

𝑋4 × 𝑋1 -0.003 0.032 0.915 -0.348 -0.001 0.029 0.978 -0.080

𝑋4 × 𝑋2 0.003 0.005 0.527 2.074 0.001 0.004 0.885 0.429

𝑋4 × 𝑋3 -0.001 0.002 0.471 -2.371 0.002 0.002 0.272 3.335

𝑋4 × 𝑋4 0.000 0.002 0.917 0.292 -0.002 0.002 0.292 -2.766

* Significant at 5% level

** Significant at 1% level

63

3.6.3 Analysis the effects of extraction parameters on lutein and chlorophyll

extractability

The first stage of the work comprised the screening of the linear, quadratic and crossed

effects of the extraction parameters, in order to analyze the significant effects and

discarding the irrelevant ones on the extraction of lutein and chlorophyll. 𝝆-Values were

used to determine the significance of each parameter and the interaction effect between

each independent variable.

For both dependent variables lutein and chlorophyll, the regression of the linear and

quadratic term of ethanol concentration, the interaction of this term with extraction

temperature were found significant (Table 3).

3.6.3.1 Lutein extractability

The extraction parameter of ethanol concentration and its interaction with the temperature

exerted the highest influence on lutein recovery.

The plot depicting the influence of the two factors, ethanol concentration and temperature,

on the extraction yields in lutein, is shown in Fig. 2. The plot indicates that at 20°C, there

was 1, 4 and 54% of the was lutein extracted with respective concentration of ethanol in

water of 0, 50 and 95%. At 40°C, respective values were 0.5%; 7%; 64%, whereas at

60°C, these were 0.6%; 10%; 94%. It can be seen that the yield of lutein increases when

higher ethanol concentrations were used. The linear factor of extraction temperature did

not exert a significant effect on lutein extraction (𝜌-value = 0.279), but its interaction

with solvent concentration allowed efficient extraction of lutein from spinach, with a 𝜌-

value = 0.002. In other words, extraction temperature increased the efficacy of the lutein

extraction when it was associated with high concentration of ethanol (95%) in the

extraction solvent.

3.6.3.2 Chlorophyll extractability

Like lutein, extraction parameters depicting the highest influence on the recovery of

chlorophyll were the ethanol concentration and its interaction with the temperature. The

three-dimensional plots (Fig. 3) presents the effect of these two independent variables on

the chlorophyll response. This plot shows that at 20°C, 0.6% of the chlorophyll was

extracted in pure water, whereas the extractability was1.3% and 62% at 50 and 95%,

respectively. With the same ethanol concentrations, the extractability of chlorophyll was

64

1; 3.5 and 76% at 40°C; and 0.1; 3% and 122% at 60°C, respectively. Ethanol

concentration exerted a stronger effect on chlorophyll extraction than that of temperature,

which was found to be insignificant. This fact was in correlation with the insignificant

effect of extraction temperature (linear and quadratic interactions) on chlorophyll

extraction and the significant effect found for solvent concentration (P-value < 0,0001

for the linear and quadratic interactions). As for lutein, extraction temperature allowed

higher recovery of chlorophyll when this factor is associated with ethanol 95%.

3.6.4 Optimization of the extraction parameters

The canonical analysis exhibits different signs of eigenvalues for lutein and chlorophyll

variables, indicating that the stationary point is a saddle point for these two models (Dong

et al., 2009). Therefore, the estimated surface did not have a unique optimum and a ridge

analysis was performed to identify the optimum. The result of the ridge analysis indicated

that the four variables (extraction time, temperature, ethanol concentration and ratio

solvent to raw material) were positively related to the response, and the optimum value

was 77%, for an extraction time of 4.5 h, an extraction temperature of 44 °C an ethanol

concentration of 93% and a ratio of solvent to raw material of 1 to 63. For chlorophyll,

the maximum yield predicted by the model was 112% with respective optimum

parameters of 4.6 h; 42 °C; 94% and a ratio solvent to raw material at 1 to 67.

Responses for both lutein and chlorophyll were simultaneously optimized by the

desirability function. The desirability profile was carried out in order to find the optimum

parameters that would result in maximum lutein and chlorophyll recoveries in an

ethanolic extract. The results indicate that the maximum overall desirability D = 0,84 (on

a scale of 0 to 1) can be achieved with an extraction performed for 4.4 h, at 43°C, with a

solvent concentration of 93% and a solvent to raw material ratio of 1 to 66.

In order to validate the adequacy of the model equations, an experiment was carried out

under the optimal conditions predicted by the Derringer’s desirability model. This

experiment was performed in triplicate and meanvalues of 96% for chlorophyll and 70%

for lutein were obtained, compared to acetone extraction.

3.7 Discussion The reported amount of chlorophyll in spinach is around 130 mg/100g FW (Ferruzzi and

Blakeslee, 2007a; Khachik et al., 1986). For lutein, the value varies between 3.5 and 20

mg/100g FW (Bunea et al., 2008a; Simonovska et al., 2013). Acetone has often been used

65

for extraction of carotenoid and chlorophyll from spinach. Tetrahydrofuoran (THF) gives

a better efficacy for carotenoids extraction according to the literature but acetone also

provides a good recovery and is less toxic (Simonovska et al., 2013). Acetone was used

as a reference solvent for the comparison of the extractability of lutein and chlorophyll

with aqueous ethanol. RP-HPLC parameters that comprised a C30 column resulted in

complete resolution of geometric and structural isomers of lutein and chlorophyll which

were detected at 450 nm. It resulted in the same elution order than that reported in the

literature (Rodríguez-Bernaldo de Quirós and Costa, 2006; Rodriguez, 2001).

The results clearly showed that lutein and chlorophyll exhibited close to identical

extraction characteristics meaning that they were both extracted with the same level of

extraction parameters. Indeed, when efficient extraction parameters combination was

found for one response, it was the same combination that enable the most efficient

extraction of the other molecule.

First, three dimensional plots, for both lutein and chlorophyll responses, exhibit mostly a

linear shape, showing that there was not a unique optimum set of extraction parameters.

Canonical analysis was thus carried out for confirmation. Indeed, canonical analysis can

determine, based on the eigenvalues and eigenvectors, if the stationary point is a

maximum, minimum or a saddle point and thus determine the shape of the response. In

the present case, canonical analysis indicated that the stationary point is a saddle point

and thus confirm that the response did not have a critical optimum. Therefore, ridge

analysis was further performed to determine the optimum common parameters for the

simultaneous extraction of lutein and chlorophyll. Ridge analysis identified a region to

which the optimum belongs and then provided an optimum level for each parameter that

will result in the highest responses. The results show that lutein and chlorophyll have

similar optimum extraction parameters. Derringer’s desirability function was used to

predict the parameters allowing the best recovery of lutein and chlorophyll in a single

extraction by an multivariate analysis (Ahmad et al., 2015). The optimum recovery values

obtain with derringer’s function were 77% for lutein and 115% for chlorophyll. The

function predicted these results with an extraction temperature of 43 °C; a concentration

of 94% ethanol for an extraction time of 4.4 h and a ratio solvent to raw material at 1 to

66. These observations were similar to the results obtain with the ridge analysis,

confirming that these are the optimum parameters for co-extraction of both lutein and

chlorophyll. This desirability function is a convenient solution when two dependents

66

variables have to be optimized at the same time, which was the case here. This method

allows the determination of the optimum parameters for both responses in a single

extraction whereas RSM analysis identifies the optimum parameters for a single variable

at a time. However, parameters that are optimum for one variable are not systematically

the optimum ones for other variables, although it was the case for lutein and chlorophyll

(Hu et al., 2008).

Experiment was carried out under the optimal conditions predicted by the model in order

to obtain the best recovery of lutein and chlorophyll in a same extraction. Thus, the

conditions used for this experiment where those predicted by the derringer’s desirability

function: an extraction time of 4.3 h, an extraction temperature of 43°C, ratio of water to

raw material at 1 to 66 and a solvent concentration at 93%. Recoveries of 96% of

chlorophyll and 70% of lutein were obtained, in close agreement with the respective

predicted values of 115 and 77%, confirming that the model was adequate to optimize the

common extraction parameters for both lutein and chlorophyll.

3.8 Conclusion Using an optimized green extraction procedure, we successfully obtained high extraction

yields of lutein and chlorophyll that compare to values obtained with a conventional

extraction solvent, acetone. The approach of response surface methodology using the

Box-Behnken design has suitably estimated the optimized values for extraction with

ethanol. The results showed that the recovery of lutein and chlorophyll are mainly

affected by ethanol concentration. Time and temperature did not have a significant effect

on their yield, neither did solvent to raw material ratio; presenting an advantage for the

food and pharmaceutical industry, since extraction can be carried in a short time and at a

low temperature.

The optimum extraction parameters retained for both lutein and chlorophyll with the ridge

analysis and the desirability function were 93% ethanol, for 4.3 h at 43°C and with 1/66

solvent to raw material ratio. However, this extraction method was not selective to

separate these two compounds. This problematic will be addressed in future work, based

on response surface methodology and on the same tenet of using green extraction

procedures.

67

3.9 Acknowledgements The authors wish to express their gratitude to Pascal Dubé for his support with the

chemical analyses, and to Gaétan Daigle, for helping with the statistics. We acknowledge

financial support of the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of

Canada (Collaborative Research and Development Grant) and the industrial partners

Nutra Canada (Champlain, Canada) and VegPro International (Sherrington, Canada). The

authors are also grateful to the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les

Technologies (FQRNT) and NSERC of Canada for a PhD Industrial Innovation

Scholarship to M. Derrien.

68

4 Optimization of a sustainable purification of lutein and chlorophyll from spinach by-products by a saponification

procedure using Box Behnken design and desirability function.

69

4.1 Transition contextuelle Les résultats obtenus au Chapitre précédent ont permis l’étude d’un procédé d’extraction

conventionnel écologique pour l’extraction de la lutéine et de la chlorophylle de l’épinard.

Les résultats montrent pour l’extraction à l’eau et à l’éthanol une efficacité de 70% de

lutéine et 96% de chlorophylle en utilisant les paramètres retenus par le modèle statistique

avec un rendement en matière de 1,4%. Toutefois, ce procédé nécessite de nombreuses

étapes, de grands volumes de solvants et ne sépare pas la lutéine et la chlorophylle. Ainsi,

dans ce chapitre, une technique d’extraction et de purification simple et écologique est

présentée, en utilisant une étape de saponification avant l’extraction éthanolique.

Ce chapitre est présenté sous la forme d’un article intitule : « Optimization of a

sustainable purification of lutein and chlorophyll from spinach by-products by a

saponification procedure using Box Behnken design and desirability function». Cet

article va prochainement être soumis au Journal of Food Engineering


l’exécution des travaux de laboratoire et à la rédaction de l’article. Le Dr Paul Angers,

directeur de la thèse, et les Drs André Gosselin, Yves Desjardins, co-directeurs de la thèse

ont participé à la planification des travaux de recherche, à la discussion des résultats lors

de réunions ainsi qu’à la révision de l’article présenté. Le Dr Ashraf Badr, professionnel

de recherche, a participé à la discussion des résultats et à la révision du présent article.

70

4.2 Résumé L'objectif de cette étude était de développer un procédé écologique, pour extraire et

séparer la lutéine et la chlorophylle des sous-produits des épinards. Une saponification

dans un premier milieu aqueux a été effectuée afin d'hydroxyler la liaison ester de la

chaîne aliphatique de la chlorophylle. Des dérivés de chlorophylle polaires ont ainsi été

formés, restant dans le milieu aqueux. La lutéine, apolaire et non saponifiable reste dans

le résidu et a finalement été extraite par macération dans de l'éthanol à 95%. Cependant,

l'étape de saponification était responsable d'une dégradation significative de la lutéine.

Néanmoins, la saponification engendrait d’importes dégradations de la lutéine, de fait,

cette étape a été optimisée afin de trouver les paramètres de saponification permettant de

limiter les dégradations de la lutéine. Les conditions optimales trouvées étaient de 16 h

de saponification, à 60 ° C et avec 3,9% d'hydroxyde de sodium. Ce procédé peut être

appliqué pour la production de lutéine et de chlorophylle de l’épinard à l’échelle

industrielle avec utilisation de solvants approuvés par Écocert.

71

4.3 Abstract The objective of this study was to develop a sustainable, safe and ecological protocol, to

extract and separate lutein and chlorophyll from spinach by-products. A saponification in

an aqueous medium was carried out in order to free the phytyl aliphatic chain. Polar

chlorophyll derivatives were thus formed, that remained in the aqueous medium, whereas

apolar lutein stayed in the residue and was extracted by maceration in 95% ethanol.

However, the saponification step may cause of a significant degradation of lutein,

resulting in low extraction yields. The saponification parameters were studied using

response surface methodology to determine the conditions that will provide the highest

recovery of lutein in an ethanolic extract, combined with the lowest loss of chlorophyll

derivatives. Through this procedure, using the derringer’s desirability function, the

optimal conditions for saponification were a time of 16 h, at 60°C, using a concentration

of 3.9% (W/V) of sodium hydroxide. This procedure can be streamlined in a commercial

extraction process for these compounds.

72

4.4 Introduction Food wastes and fruits and vegetables by-products are valuable source of nutraceuticals

and food ingredients. Fruits and vegetables by-products have especially been actively

studied by the scientific community because of their high phytochemicals and fiber

content, with proven health benefits.

Spinach is known for its high content in phytochemicals, especially carotenoids (lutein

and zeaxanthine) and chlorophyll. It also has a high level of vitamins (A, B9, K), minerals

(Fe, Mg, Mn), phenolic compounds and phenolic acids (Bunea et al., 2008a; Canada,

2013). Fresh spinach production generates 25% of discards that can be value-added

following the extraction of the biomolecules they contain.

Lutein extracts are often provided as a natural colorant (E161b) or as ingredients for the

composition of functional foods. Indeed, lutein has proven health benefits such as

antioxidant, anti-inflammatory and anti-mutagenic, and plays many key roles in the

prevention of several diseases (Kijlstra et al., 2012; Lienau et al., 2003; Sharma et al.,

2007; Simonich et al., 2008). Lutein structure is made of conjugated double bonds which

are implicated in the reduction of light-related damages to the macula lutea, thus

preventing the age-related macular degeneration (AMD) (Carpentier et al., 2009). Lutein

is also involved in the improvement of the immune function, a possible inhibition of some

cancers (Tanaka et al., 2012) and a possible impact on cognitive functions. Indeed, some

authors have demonstrated a relationship between dementia in the elderly and lutein

concentration in brain tissues (Johnson, 2012). Currently, commercial lutein extracts are

mainly produced from the marigold flowers, which are rich in this molecule, with values

of 21.6 to 97.6 mg / 100g (FW). Microalgae, a unicellular algeal form containing large

amount of chlorophyll, are also a rich source of carotenoids.

Spinach, like microalgeae, contains a high levels of chlorophyll, an amphyphilic

molecule, giving to spinach and many other plants their green color. Chlorophyll

possesses several health advantages (anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-mutagen

propriety) (Bez et al., 2001; Ferruzzi and Blakeslee, 2007b; Kumar et al., 2004; Sharma

et al., 2007) and can be used as a as an ingredient such as a green colorant.

Lutein and chlorophyll present similar polarity characteristics. Thus, their separation one

from the other to generate two distinct extracts or products, requires further purification

steps, which are known to be time consuming and costly at the industrial level (insérer

73

une référence). Saponification is the standard analytical procedure to remove chlorophyll

from green vegetables in order to prevent the interference problem between chlorophyll

and carotenoids for chromatographic detection (Rodríguez-Bernaldo de Quirós and

Costa, 2006; Rodriguez, 2001). Saponification can also perform on an industrial scale in

the extraction and purification procedures. For lutein production from marigold,

saponification improves the extraction yield by removing ionizable lipids and causing a

softening and collapse of cell tissues. Saponification is also used for lutein production

from microalgae. In this case, an initial alkaline treatment in an aqueous medium (4%

aqueous KOH, 40°C) is advantageously used to retain fatty acids and chlorophyll in the

aqueous fraction. Chlorophyll-free carotenoids are then extracted with petrochemical

solvents (Fernández-Sevilla et al., 2010). Hexane remains the most common solvent used

for lutein extraction from marigold or microalgae. However, its toxicity and recycling

problems has led many to seek more eco-friendly extraction techniques. In this context,

ethanol appears the safest and greenest solvent owing to its biodegradability, non-toxicity

and capacity of regeneration; for this reason, it has an Ecocert label. The saponification,

conditions used in the separation process of carotenoid and chlorophyll results in a

significant degradation of lutein (Granado et al., 2001).

Response surface methodology (RSM) is a powerful statistical technique used to optimize

experimental parameters influencing the response. This tool which has been widely used

in the optimization of extraction conditions for phytochemicals, enables unraveling the

most influencing factors and combination of levels optimizing extraction yields. The

three-level factorial, the central composite and the Box benhken design are the most

largely RSM design used in optimization studies (Baş and Boyacı, 2007). The RSM

technique presents some disadvantages when several variables have to be optimized at

the same time: the optimal parameters for one variable are in most cases not optimal for

the others variables. To avoid this pitfall, Derringer and Suich devised a multi-response

technique, called desirability function, which appears efficient for optimization of

multiple responses (Hu et al., 2008).

The objective of this study was to develop, through ecological approaches, a method to

extract and separate lutein and chlorophyll derivatives from spinach by-products. For this

purpose, response surface methodology and desirability function were applied to optimize

the saponification step in order to extrac a maximum amount of chlorophyll without

causing overly lutein degradation, and extract lutein from the residue with ethanol.

74

4.5 Material and methods

4.5.1 Plant material

The industrial spinach by-products were graciously provided by Vegpro International

(Sherrington, QC, Canada). These residues were destined to discard because they were

non-marketable dur to their below export and commercialisation standards. Spinach

discards were lyophilized and stored at -20oC in the dark under vacuum until further use,

since lutein and chlorophyll are highly sensitive to O2, light and heat.

4.5.2 Chemicals

Lutein, β-carotene, chlorophyll a and b, each at 95% purity, were purchased from Sigma-

Aldrich (Oakville, ON, Canada). Chlorin e6; Cu pheophorbide; Cu Isochlorin e4; Cu

pyropheophorbide a and chlorin e4 were purchased from Frontier Scientific (Logan, UT).

Sodium copper were purchased at Sigma Aldrich. All solvents used were HPLC grade

and were from VWR (Ville Mont-Royal, QC, Canada). Ultrapure water was used

throughout the experiments and was produced using milli-Q RG system from Millipore

(Billerica, MA). Solvents ethanol 95% and acetone used for extraction and quantification

were ACS grade and were purchased from Les alcools du commerce (Boucherville, QC,

Canada)

4.5.3 Methods

4.5.3.1 Optimization of saponification parameters for separation of both chlorophyll and

lutein

Acetone was used for the determination of the total amount of lutein and chlorophyll in

the raw material (Derrien et al., 2017) for reference values. Briefly, the extraction was

carried out at room temperature, under agitation, for 20 min using 0,5 g of freeze-dried

spinach and 10 mL of acetone. The supernatant was collected and the residue was

repeatidly extracted with acetone (typically 2 more times) until the obtention of a non-

colored residue. The supernatants from all the extractions were combined and evaporated

under vacuum at 45 ˚C. The dry extracts were stored under nitrogen at -80°C until

analysis. The extraction protocole was performed in triplicate.

Experiments were performed to identify the optimal parameters for the

saponification/extraction of lutein and chlorophyll, the dependant variables, from spinach

samples, including saponification temperature and time, and NaOH concentration of the

aqueous phase

75

Aqueous solutions of NaOH (concentrations of 2, 21, 40%; v/w). were added to freeze-

dried spinach samples (x.y g) and placed in a water bath at different temperatures (20, 40,

60°C), for variable durations (2, 9, 16 h). The extract was filtered and the residue was

washed with water. 300 ppm of sodium copper were added to the combined water extract

with the aim to stabilize the green color of the chlorophyll and was then filtered. The

residue was extracted with ethanol 95% (xx mL) under agitation for 2 hours at 45°C (in

the dark? under nitrogen?). The ethanolic solution was filtered and evaporated under

vacuum. The water and ethanolic extracts were kept at -80°C until analysis. All the

experiments were done in triplicate.


4.5.3.2.1 Chlorophyll and lutein

Lutein and chlorophyll were quantified according to Derrien et al., (2017). Briefly, the

carotenoids and chlorophyll analyzed by HPLC-UV on an Agilent 1260 liquid handling

system with a Chemstation software (Mississauga, ON, Canada), equipped with a UV

detector, set at 450 nm for both carotenoids and chlorophyll, using a C30 reversed phase

column (250mm×4,6mm id., 5mm particle size; YMC, Allentown, PA), kept at constant

temperature (35°C) and at a flow-rate of 1.0 mL/min. The mobile phase consisted of

methanol: water (98/2, v/v) (eluent A) and methyl-tert-butyl ether (MTBE) (eluent B).

The elution gradient started at 2% of B until 80% of B (0 to 27 min), isocratic for 4 min

(27 to 31 min) before returning to 2%B over 3 min. Compounds identification was

confirmed using retention time and UV spectra (190-640nm) of the pure compounds. For

quantification, lutein and chlorophyll standards were solubilized in

methanol/dichloromethane (65:35, v/v). Dilutions provided five points calibration curves.

4.5.3.2.2 Chlorophyllin

Quantification of copper chlorophyllins (Chlorin e6; Cu pheophorbide; Cu Isochlorin e4;

Cu pyropheophorbide a and chlorin e4) was performed on the same HPLC instrument as

above for chlorophyll and lutein, with a Synergi Hydro-RP 80 Å (250mm×4,6mm id.

4µm particle size; Phenomenex, Torrance, CA), at constant temperature (25°C). The

different copper chlorophyllins were separated with methanol:ammonium acetate 1M

(80/20, v/v; eluent A) and methanol: acetone (50:50; eluent B), at a flow-rate of 1.0

mL/min using the following elution gradient: 0% B to 100% B (0.00-33.00 min); and

returning to the original conditions (0%B) over 5 min. The UV detector was set at 650nm.

76

Identification of the different copper chlorophyllins was confirmed based on retention

time and UV spectra (214-950nm) of the pure compounds. For quantification,

chlorophyllin samples were separately solubilized in methanol/acetone (50:50, v/v).

Dilutions provided five points calibration curves

4.5.3.3 Box Behnken design: Analysis of the effect of saponification parameters

The chlorophyll yield 𝑌1, and the lutein yield 𝑌2 obtain in the second ethanolic extraction

were optimized using the Box-Behnken experimental design after a saponification step in

the first aqueous medium. Several combinations of factors were used (15), with centrals

points in order to examine the stability and the variability of the model. The different

levels and combination of levels parameters of saponification time (X1), saponification

temperature (X2), sodium hydroxide concentrations in water (v/w) (𝑋3), used in the

experimental design are showed in Table 1. The effect of the three factors study (𝑋1, 𝑋2,

𝑋3) and their interactions on the responses variables 𝑌1 and 𝑌2 were carried out using

variance analysis (ANOVA).

ANOVA and multiple regression analysis of experimental data were conducted for fitting

the second order polynomial model as follow:

Equation 4.1


3

𝑖=0


3

𝑖=𝑜

∑𝛽𝑖𝑗

3

𝑗=0

3

𝑖=0


Where Y is the response associated with each factor level combination; β0 is an intercept;

βi is regression coefficients calculated from the observed experimental values of Y; and

Xi is the coded levels of independent variables. The terms XiXj and Xi2 represent the

interaction and the quadratic terms, respectively. The quality of the model was expressed

by the 𝐹-test at 5% significance level. Ridge analysis was performed to seek the optimum

parameters giving the best response for the two variables (Derrien et al., 2017).

The analyses of regression and variance were carried out using the MIXED procedure of

the Statistical Analysis System (SAS) (Version 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

4.5.3.4 Derringer’s desirability function: Multivariate optimization of the saponification

The Derringer’s desirability function is a multi-response mathematical tool that was used

to simultaneously maximize the lutein content in the final extract and minimize the

77

chlorophyll recovery. All the variable were first converted into individual desirability

functions d_i, from 0 to 1. For lutein, 0 and 1 corresponded to the lowest and highest

amounts of lutein extracted, respectively. For chlorophyll, minimum recovery was

sought. Thus, the individual desirability of chlorophyll were the opposite than those for

lutein, and ranged from 0, the highest recovery, to 1, the lowest recovery which,

corresponds to the most efficient saponification. The mathematical relationship of the

desirability function and the variables, lutein and chlorophyll, can be described as

follows:

Equation 4.2

𝑑1 (𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛) = {

0 𝑦𝑖 ≤ 𝑦𝑖−𝑚𝑖𝑛

[𝑦𝑖 − 𝑦𝑖−𝑚𝑖𝑛




Equation 4.3

𝑑2 (𝑐ℎ𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝ℎ𝑦𝑙𝑙) = {

1 𝑦𝑖 ≤ 𝑦𝑖−𝑚𝑖𝑛

[𝑦𝑖−𝑚𝑎𝑥 − 𝑦𝑖




Where di is the individual response desirability, Yi is the response values, Yi-min is the


response i, and r is a weight used to determine the scale of desirability (Derrien et al.,

2017; Hu et al., 2008; Islam et al., 2012).

Where di is the individual response desirability, Yi is the response values, Yi-min is the


response i, and r is a weight used to determine the scale of desirability (Derrien et al.,

2017; Hu et al., 2008; Islam et al., 2012).

78

Once the desirability functions have been described for all of the different compounds,

they are merged into a combined desirability function (D) which will allow the

determination of the parameters giving the highest yield of lutein while keeping

chlorophyll at the lowest level in the final ethanolic extract:

𝐷 = (𝑑1𝑤1𝑑2

𝑤2𝑑𝑛𝑤𝑛)

1∑𝑤𝑖⁄

The overall desirability D can be viewed as a weighted geometric mean of the individual

response desirability, wi being the weight associated to 𝑑𝑖 (Derrien et al., 2017).

4.6 Results and discussion

4.6.1 Observation and analysis of the preliminary results

The results showed that for all the experiments, lutein and chlorophyll were successfully

separated one from the other, the ethanolic extracts exhibiting only trace amounts of

chlorophyll. The RP-HPLC chromatogram presented in Fig. 4.1.A indicated the presence

of chlorophylls a and b, and carotenoids lutein and caroten, in an acetone extract of

spinach by-products. Close elutions for lutein and chlorophyll on the chromatogram

suggests similar polarity characteristic for these compounds. Contents of 10.14 and

112.75 mg/100g FW in spinach by-products were found for lutein and chlorophyll,

respectively. These values compare to those reported in the literature for spinach, at

around 130 mg/100g FW for chlorophyll (Ferruzzi and Blakeslee, 2007a; Khachik et al.,

1986), and 5 to 15 mg/100g FW, for lutein (Bunea et al., 2008b; Simonovska et al., 2013).

After saponification, the RP-HPLC chromatogram of the ethanol extract showed mainly

two peaks (Fig.4.1B) that corresponded to lutein (peak 2) and 𝛽-carotene (peak 4). The

peaks of chlorophyll (peaks 1 and 3), present in the acetone extract, before the

saponification, were observed at very low levels on this chromatogram, indicating a high

efficiency for the separation of lutein and other carotenoids from chlorophyll by this

approach. The results shown in Table1 exhibited also that a large amount of lutein have

been degraded during the saponification. Indeed, it can be clearly see that in each case,

around 80% of lutein have been degraded during the saponification. However, these

observations exhibited that some combinations have less impact on carotenoids than

others and thus, an optimization of the saponification conditions should lead to a decrease

of the degradations. The firsts results exhibited clearly a negative influence of sodium

hydroxide on lutein recovery. Indeed, when 40% of sodium hydroxide is used for the

79

saponification, the recovery of lutein never exceeded 1,53mg/100g FW, while the

recovery reached 2,5mg with 2% of NaOH. However, the results showed also that the

purification of chlorophyll was positively influence by the sodium hydroxide

concentration. Also, higher saponification time seems to lead at an increase of the

recovery of lutein, when the concentration of sodium hydroxide is not too high. This

observation is corroborated with the results obtained with 21% of sodium hydroxide, were

an increase of the saponification time leaded to an enhancement of lutein recovery (2h,

0,43mg/100g FW; 16h, 2,43mg/100g FW) while at 40% of NaOH, the reverse effect was

observed (2h, 1,53 mg/100g FW; 16h, 0,87mg/100g FW). The lowest amount of

chlorophyll in the ethanolic fraction were found with 21% of sodium hydroxide. Also,

saponification time seems to enhance the purification efficacy. Indeed, at 40°C and 40%

of sodium hydroxide, an increase in the saponification time leaded to lower recovery of

chlorophyll (2h, 4,35mg/100g FW; 16h, 1,67mg/100g FW) (table 4.1).

80

Figure 4-1: RP-HPLC chromatograms of lutein and chlorophyll from spinach by-

products, on a C30 column, at 450 nm (see Material and Methods for details). A)

acetone extract; B) ethanolic extract performed after saponification. Peak

identification: (1) chlorophyll b

81

Tableau 4-1: : Recovery of lutein and chlorophyll for different combinations of

saponification parameters

Coded and uncoded values Responses (mg/100 g FW)

No X1 X2 X3 Time

(h) Temperature

(°C) Sodium

hydroxide (%) Lutein Chlorophyll

1 -1 -1 0 2 20 21 2,34 0,69

2 1 -1 0 16 20 21 2,36 0,55

3 -1 1 0 2 60 21 0,43 0,10

4 1 1 0 16 60 21 2,43 0,75

5 -1 0 -1 2 40 2 1,98 0,61

6 1 0 -1 16 40 2 2,23 0,54

7 -1 0 1 2 40 40 1,53 4,35

8 1 0 1 16 40 40 0,87 1,67

9 0 -1 -1 9 20 2 2,53 0,68

10 0 1 -1 9 60 2 2,09 0,43

11 0 -1 1 9 20 40 0,79 1,45

12 0 1 1 9 60 40 1,29 2,75

13 0 0 0 9 40 21 1,40 0,22

14 0 0 0 9 40 21 1,42 0,21

15 0 0 0 9 40 21 1,38 0,20

4.6.2 Effects of saponification parameters on lutein and chlorophyll recovery in

the ethanolic extract: analysis of the statistical data

Three-dimensional plots enable a better understanding of the influence of each factor on

the lutein recovery and on the saponification efficiency. The figure 4.2 indicated that

moderate sodium hydroxide concentration lead to a better saponification efficiency in

accordance with lowest chlorophyll recovery obtain. Besides, temperature did not seem

to exert an important effect on saponification efficiency, proven by 𝑝 −value > 0.05 and

by the horizontal shape of the plot. In addition, time show high effect on saponification

efficiency since the highest temperature gives the lowest recovery of chlorophyll. The

figure 4.3 indicates that sodium hydroxide concentration appear to exert a negative

influence on the lutein recovery, in accordance with the negative regression value

describe by the model. Furthermore, this effect can be also proven by the fact that lowest

to medium concentration of sodium hydroxide gave the highest amount of lutein

recovery. In addition, lutein recovery is negatively influence by temperature, describe by

82

a negative regression value of this term and a better recovery of lutein at the lowest

saponification temperature. The saponification time exerts a negative and significant

influence on lutein yield, describe by a 𝑝-value < 0.05. On the other hand, the cross

product temperature-NaOH exerted a significant interaction on the saponification

efficacy, and also did the linear and quadratic terms of sodium hydroxide concentration

and temperature. The statistical results were then found in correlation with the observed

results.

Tableau 4-2: Regression coefficients for the lutein and chlorophyll variable

Lutein Chlorophyll

Variables Estimation Standard error 𝝆-value Estimation Standard error 𝝆-value

Intercept 14.04 2.13 <.0001** -1.47 0.28 <.0001**

𝑋1 -0.95 0.33 0.0060* -0.36 0.08 <.0001**

𝑋2 -0.06 0.33 0.8612 -0.09 0.08 0.2283

𝑋3 -5.19 0.23 <.0001** 0.78 0.06 <.0001**

𝑋1 × 𝑋1 3.71 1.42 0.0128* 0.44 0.19 0.0278*

𝑋1 × 𝑋2 2.16 1.42 0.1353 0.23 0.19 0.2352

𝑋2 × 𝑋2 -1.17 1.43 0.4187 1.15 0.19 <.0001**

𝑋3 × 𝑋1 5.43 1.85 0.0057* 0.41 0.24 0.1016

𝑋3 × 𝑋2 -2.31 0.33 <.0001** -0.25 0.08 0.0034*

𝑋3 × 𝑋3 2.50 0.33 <.0001** 0.39 0.08 <.0001**

* Significant at 5% level; ** Significant at 1% level

Lutein recovery was influence in significant way by saponification time and NaOH

concentration. The effect of saponification time is complexes and is influence by the

concentration in sodium hydroxide. Indeed, longer saponification time induced cell

breakage and the release of their content. Lutein and chlorophyll are localized in the

chromoplasts and their liberations from this matrix made them accessible to sodium

hydroxide. Authors generally use saponification for a long period of time, up to 10 h

(Rodriguez, 2001) in concordance with the optimum saponification time found by the

model giving the lowest recovery of chlorophyll, and thus the highest purity in lutein,

which was 16 h. Temperature shows, in interaction with other factors, an important

impact on the saponification procedure. Indeed, the saponification process is

endothermic, and thus, the increase of temperature favor the saponification reaction. On

the other hand, lutein is not stable at high temperature and moderate temperature seems

83

to generate better recovery of lutein (Han et al., 2013). Several researchers have observed

better carotenoid extraction when high temperatures are employed in the saponification

step, but at the expense of xanthophyll recovery (Khachik et al., 1986; Scott, 1992). In all

runs, the use of sodium hydroxide resulted in important loss of lutein, close to 70% in

comparison to the total content of this molecule in spinach. This trend was described in

the literature, where in most saponification experiments a carotenoid degradation was

reported. The most sensitive carotenoids compounds to alkaline treatments are

xanthophylls, particularly the epoxycarotenoids (Granado et al., 2001; Khachik et al.,

1992), and the degradation varying from a few percent to 100%. These degradations are

caused by the formation of carotenoids adducts following isomerization and degradation

of lutein during saponification procedure (Granado et al., 2001). The losses of lutein could

be reduced by using an nitrogen atmosphere or adding an antioxidant during the reaction

(Kimura et al., 1990). For leafy vegetables, containing high level of fibrous material, like

spinach, pigments are not easily accessible to the NaOH. Thus, some authors used the

saponification after extraction on the residue in order to reduce the saponification time

and the loss of carotenoids. Saponification is usually performed with methanolic sodium

or potassium hydroxide (5-30%), which is added to the pigment extract.

The three-dimensional plots of all cross product presented in figs 4.2 and 4.3 show mostly

linear shape tendency. Thus, saponification efficiency and lutein recovery seems to have

several optimum parameters and did not exhibit clearly a unique optimum. This fact was

observed for the two variables, which did not exhibit many significant parameters or

interaction parameters effects on their recovery even if their regression model was

considered highly significant.

84

Figure 4-2: Response surface plots of chlorophyll recovery from spinach by-

products for different combinations of saponification parameters (time, temperature

and concentration of sodium hydroxide).

A) Variation in temperature and time, at a fixed sodium hydroxide concentration of 21% (w/v); B) variation

in sodium hydroxide concentration and time at a fixed temperature of 40 °C; and C) variation in sodium

hydroxide concentration and temperature at a fixed time of 9 h.

Time(h)

Sodium

hydro

xide(%

)

Temper

ature(°C

)Time(h)

Temperature(°C) Sodium

hydro

xide(%

)

Chlorophyllrecovery(%)



A B

C

85

Figure 4-3: Response surface plots of lutein recovery from spinach by-products for


concentration of sodium hydroxide).

A) Variation in temperature and time, at a fixed sodium hydroxide concentration of 21% (w/v); B) variation in sodium

hydroxide concentration and time at a fixed temperature of 40 °C; and C) variation in sodium hydroxide concentration

and temperature at a fixed time of 9 h

86

4.6.3 Analysis of variance of the model

A screening analysis were first performed in order to seek variables exerting the highest

influence during an extraction and purification of lutein and chlorophyll using

saponification. Then, in this present study the goal was to optimize these parameters in

order to obtain a carotenoid extract free of chlorophyll. Before analyzed the effect of the

parameters on the recovery of these two molecules, it is fundamental to study the

pertinence of the statistical model.

The most influencing parameters for saponification to remove chlorophyll in a first

aqueous phase to purify lutein in a second ethanolic extraction namely, saponification

temperature, saponification time and sodium hydroxide concentration were studied.

Analysis of variance (ANOVA) was used to statistically analyze the experimental data.

For chlorophyll yield in ethanol (i.e saponification efficiency), the regression of the linear

term X1 (saponification time), the linear term X3 (saponification temperature) and the cross

product X1X2, X2X3 were significant showing interactions between saponification

temperature and saponification time. All the quadratics terms were found to exerted

positive influence on the saponification efficacy. Neglecting the insignificant term, the

final predictive equation obtained for saponification (𝑌1) are given below:

Equation 4.4

Υ1 = −1.47 − 0.36𝑋1 + 0.78𝑋3 + 0.44𝑋12 + 1.15𝑋2

2 + 0.39𝑋32 + 0.23𝑋1𝑋2

+ 0.41𝑋3𝑋1 − 0.25𝑋2𝑋3

For lutein recovery 𝑌2, the regression of the linear term X1 (saponification time), and the

linear term X3 (saponification temperature) the quadratic term 𝑋12, 𝑋3

2 and the cross

product, X3X1, X2X3 were significant showing interactions between saponification

temperature and saponification time. The results are presented in table 4.4. Neglecting

the insignificant term, the final predictive equation obtained for lutein (𝑌) are given

below:

87

Equation 4.5

Υ2 = 14.04 − 0.95𝑋1 − 5.19𝑋3 + 3.71𝑋12 + 2.50𝑋3

2 + 5.43𝑋1𝑋3 − 2.31𝑋2𝑋3

The results are exhibited in table 4.2 and showed that the statistical model of both lutein

and chlorophyll were highly satisfactory, with respectively a F value found for the model

of 110.46 and 30.94, corresponding both to a p-value less than 0.0001. Then, these models

can be used to study the effects of the different parameters on the two responses.

4.6.4 Quantification of chlorophyllin in the first aqueous medium

The results show in the first water extract an average between the experiments of 25

mg/100g of Cu chlorophyllin constitute by several derivatives, mostly Chlorin e6; Cu

pheophorbide. The water extract did not show the presence of chlorophyll, proven that

the green color is the result of Cu-chlorophyll polar derivative and not the native

chlorophyll. The HPLC profile of the aqueous medium after saponification on figure 4.5

showed 2 peaks, corresponding at Chlorin e6; Cu pheophorbide, which were not present

in this medium before saponification step. Chlorophyll was indeed transformed to Cu-

chlorophyll polar derivatives, extracted with the first aqueous medium. The concentration

of Cu-chlorophyllin, were close to the result presented by Ozkan et al, working also with

spinach, showing 39 mg/100g of Zn-chlorophyllin in their extract after a saponification

step and addition of Zn-salt instead of copper-salt, like is the case here (Özkan and Ersus

Bilek, 2015). Several authors have studied the composition of chlorophyll polar

derivatives after a saponification procedure. Several authors reported chlorin e6,

chlorophyllin derivative common at all studies, and chlorin e4 as a major constituents of

copper chlorophyllin (Egner et al., 2000). Ferruzi and Blakeslee (2007) found Cu chlorin

e4 as major constituent. Authors also write about the difficulties to identify the Cu-

components due to impure standards (Scotter et al., 2005).

4.6.5 Optimization saponification parameters

Ridge analysis was performed to identify the optimum saponification parameters and the

best recovery of lutein. The result of the ridge analysis found the optimum values to be

for lutein 31% with a saponification time of 2h, a saponification temperature of 20 °C and

sodium hydroxide concentration of 2%. For chlorophyll (i.e. saponification efficacy), the

minimum yield predicted (corresponding at the maximum saponification efficiency) was

88

0.18% with the optimum parameters found to be 10h; at 48°C with 13.4% of sodium

hydroxide.

Ridge analysis is a powerful tool to describe the optimal parameters for each variable.

However, we need to determine parameters giving the best recovery of lutein while

keeping the amount of chlorophyll at its lowest level in the ethanolic extract. The result

observed for the RSM and the ridge analysis lead to the conclusion that the parameters

considered to be the most efficient for lutein recovery were not the optimal parameters

for the removal of chlorophyll from the extract. In fact, ridge analysis gave different

optimum saponification parameters for lutein and chlorophyll. In this study, multi

response is an important approach in order to determine saponification parameters

generating the most efficient response simultaneously for these two variables. Thus,

chlorophyll yield and lutein recovery were simultaneously optimized by the desirability

function, in order to seek saponification parameters resulting in the highest recovery of

lutein with the lowest recovery of chlorophyll. The result indicates that the highest overall

desirability D were obtain with 16h, at 60°C and 3.9% of NaOH. Lower saponification

time would work with higher concentration of sodium hydroxide or higher saponification

temperature, but at the expense of larger lutein degradation. Indeed, the maximum

recovery for lutein found by the desirability profile were 2h, 20°C and 10% of NaOH

while the minimum recovery of chlorophyll, meaning the most efficient purification was

done at 16h, 60°C and 13.4% of NaOH. However, with these parameters, higher amount

of lutein was degraded by the experimental conditions. The results of the desirability

function are presented in table 4.3.

This results were in concordance with the results obtained from the analysis of the

saponification effects on the recovery of molecules. Indeed, the plots showed that high

amount of sodium hydroxide exhibited negative effects on the lutein recovery and at the

opposite, higher amount of sodium hydroxide gave a better saponification and elimination

of chlorophyll from the extract. Thus, using lower concentration in sodium hydroxide and

enhancing the saponification time were the most efficient compromise enable to preserve

the lutein and allowing the highest amount of chlorophyll removed from the extract. In

addition, temperature, which were found to exert a negative effect on the lutein recovery

was kept at its lowest level.

89

Table 4-3: Multivariate analysis and desirability value predict by the statistical

model

Time (h)

Temperature ( °C)

NaOH (%)

Desirability

Lutein Chlorophyll Overall

16.0 60 3.9 0.82 0.91 0.86

16.0 60 2.0 0.83 0.89 0.86

16.0 60 5.8 0.78 0.92 0.86

16.0 60 7.7 0.78 0.93 0.85

16.0 60 9.6 0.76 0.94 0.84

16.0 58 2.0 0.79 0.90 0.84

16.0 58 3.9 0.77 0.91 0.84

16.0 58 5.8 0.75 0.93 0.84

16.0 60 11.5 0.73 0.95 0.83

16.0 58 7.7 0.73 0.94 0.83

15.3 60 2.0 0.75 0.91 0.82

15.3 60 3.9 0.73 0.92 0.82

16.0 56 2.0 0.75 0.90 0.82

16.0 60 13.4 0.71 0.95 0.82

16.0 56 3.9 0.73 0.92 0.82

15.3 60 5.8 0.72 0.94 0.82

16.0 58 9.6 0.71 0.95 0.82

16.0 56 5.8 0.71 0.93 0.81

15.3 60 7.7 0.70 0.95 0.81

2.0 20 9.6 0.90 0.73 0.81

Legend: Each variable was converted into an individual desirability function from 0 to 1. For

lutein, 0 corresponded to the lowest amount of lutein extracted and 1, to the highest recovery

obtained. For chlorophyll, minimum recovery was sought. Thus, the individual desirability of

chlorophyll ranged from 0 (highest recovery), to 1 (lowest recovery), corresponding to the most

efficient saponification conditions.

4.7 Conclusion The objective of this study was to identify, using an ecological approach, a method to

extract and to separate lutein and chlorophyll from spinach by-products. A saponification

in an aqueous medium was carried out in order to hydroxylate the ester bond of the

aliphatic chain of chlorophyll. This step generated polar chlorophyll derivatives,

remaining in the aqueous medium. Lutein, non-saponifiable lipid, stayed in the residue

90

and was finally extracted by maceration in 95% ethanol. However, this saponification

procedure was responsible of larger lutein degradation. Thus, an optimization by the

response surface methodology was done in order to seek saponification parameters giving

the highest recovery of lutein in the final ethanolic extract with the lowest amount of

chlorophyll. The more influent saponification parameters on chlorophyll yield were the

time, the sodium hydroxide concentration and the interaction between time and

temperature and those for lutein yield were the time and the quadratic effect of

temperature. The majority of plots did not exhibit clear optimum condition but mostly a

range of optimum condition. Canonical analysis was done and had confirmed that there

were not unique optimum parameters for both two variables (lutein and chlorophyll

yield). It was important in this study to seek the optimum parameters giving in a same

time the highest recovery of lutein in the final ethanolic extract with the lowest

chlorophyll concentration in this extract. Therefore, a multivariate analysis using the

derringer’s desirability function was performed, and the best combination of

saponification parameters were found to be 16 h of saponification, at 60°C and with 3.9%

of sodium hydroxide. (See fig 1). However, for an industrial application, lower

saponification time and lower saponification temperature will be preferred enable less

energetic consumption, at the expense of chlorophyll purification, that will be less

efficient.

Spinach is an interesting lutein source and can be also valorized for the other molecules

that it’s contain. In this sense, one residue can be used for a multiple extractions purpose

in order to obtained polyphenol, chlorophyll and lutein extracts. So, even if spinach

contains lower quantity of lutein than marigold and microalgae, it can reach a good

commercial value. Also, spinach by products are important and a cheap source of

biomolecules.

4.8 Acknowledgements This project was funded by the Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de

l'Alimentation (MAPAQ) and the industrials partner of this project (Nutra Canada,

Vegpro International). The authors thanks the Fonds Québécois de la Recherche sur la

Nature et les Technologies (FQRNT) and the Conseil de Recherches en Sciences

Naturelles et Génie (CRSNG) from Canada for BMP-Innovation PhD fellowship. The

authors would like to thank, Pascal Dubé, Chemist, M.Sc. for his chemical expertise and

Gaetan Daigle, M.Sc for his statistical support.

91

5 Optimization of a sustainable SC-CO2 extraction of lutein and chlorophyll from spinach by-products using response surface

methodology

92

5.1 Transition contextuelle Les résultats obtenus dans les deux derniers chapitres ont démontré que l’utilisation de 2

procédés d’extraction conventionnels verts a permis de séparer la lutéine et la chlorophylle

de l’épinard. Les résultats montrent pour l’extraction à l’eau et à l’éthanol une efficacité

d’extraction de 70% de lutéine et 96% de chlorophylle en utilisant les paramètres retenus

par le modèle statistique avec un rendement en matière de 1,4%. Toutefois, ce procédé

nécessite de nombreuses étapes, l’utilisation de grands volumes de solvants et ne sépare

pas la lutéine et la chlorophylle. Le procédé utilisant la saponification permet une

séparation et une extraction efficace de ces deux molécules, mais engendre d’importantes

dégradations de la lutéine (récupération de 27% de lutéine avec un rendement en matière

de 0,63%). Il utilise aussi de grandes quantités de solvants, de nombreuses étapes et est en

plus dangereux pour le personnel (utilisation de NaOH).

L’extraction par fluide supercritique, une méthode plus récente, est étudiée dans le présent

chapitre dans le but de répondre aux différents désavantages rencontrés avec les extractions

conventionnelles.

Ce chapitre est présenté sous la forme d’un article intitulé : « Optimization of a sustainable

SC-CO2 extraction of lutein and chlorophyll from spinach by-products using response

surface methodology » a été accepté dans LWT, journal of Food Science and Technology.



directeur de la thèse, et les Dr André Gosselin, Yves Desjardins, Yacine Boumghar, co-

directeurs de la thèse ont participé à la planification des travaux de recherche, à la

discussion des résultats lors de réunions ainsi qu’à la révision de l’article présenté. Le Dr

Milad Aghabaranejad, professionnel de recherche, a participé à la discussion des résultats,

à la révision du présent article.

93

5.2 Résumé La chimie verte est un défi majeur du XXIe siècle. Les sous-produits de fruits et légumes

contiennent des hautes concentrations de composés phytochimiques qui peuvent être

utilisés pour la production d’extraits à hautes valeurs ajoutées. Ce chapitre a donc pour but

le développement et l'optimisation de processus écologiques d'extraction de la lutéine et de

la chlorophylle, deux molécules ayant des impacts positifs sur la santé, en utilisant

l’extraction par CO2 supercritique, à partir de sous-produits d’épinards. L'effet de la

pression, de la température, du temps et de la concentration en co-solvant a été étudié. Les

paramètres d’extraction optimaux ont été obtenus par la fonction de désirabilité, et étaient

3,6 h à 390 bars, avec 10% de co-solvant (éthanol) et à 56 ° C. Les paramètres optimaux

d’extraction obtenus par le modèle statistique permettaient un rendement de 72% de lutéine

et 50% de chlorophylle. L'extraction de fluide supercritique est donc une méthode de choix

pour l'extraction de la lutéine et de la chlorophylle et de plus respecte tous les principes de

la chimie verte et de fait la santé des consommateurs, des opérateurs et de l’environnement.

94

5.3 Abstract Industrial vegetable wastes contain high amounts of valuable molecules and constitute a

valuable source of bioactive compounds providing health benefits. Spinach (Spinacia

oleracea), a green leafy vegetable, is known to its valuable phytochemical’s content.

However, its production yields about 25% of wastes that can be valorized for the

production of value-added food supplements. This work focuses on the development and

optimization of sustainable extraction using supercritical CO2 (SC-CO2) of the lutein and

chlorophyll, two health functional molecules, from spinach by-products. Box–Behnken

experimental design was used to optimize the process variables: pressure (10, 30, 50 MPa),

co-solvent percentages (0, 5, and 10 % (v/v), temperature (40, 50, 60 °C), time (1, 3, 5 h).

It was found that the optimum extraction parameters were at temperature of 56 °C,

extraction time of 3.6 h, pressure of 39 MPa, and 10 % ethanol as cosolvent. Under these

conditions, a yield of 72 % lutein and 50 % of chlorophyll was obtained.

95

5.4 Introduction Large amounts of food by-products are produced yearly and they constitute an important

source of bioactive compounds that can be valorized for further utilization, as they

provided health benefits. The recovery of these wastes for their phytochemical compounds

have been widely studied by pharmaceutical and cosmetic industries (Lam, Sze, & Lin,

2014; Martins & Ferreira, 2017). Indeed, industrial wastes like those from shrimp, tomato

and wood manufactory contain high amounts of valuable molecules, respectively

astaxanthine (Sachindra, Bhaskar, & Mahendrakar, 2006), lycopene (Ranveer, Patil, &

Sahoo, 2013) and flavonoid (polyphenols) as well as betulin for the last one (Diouf,

Stevanovic, & Boutin, 2009; Rosdiana et al., 2017).

Spinach, a green leafy vegetable, is known to its valuable phytochemical’s content. Indeed,

this vegetable contains high level of polyphenols (200 mg gallic acid equivalent/100g of

spinach, fresh weight, (FW)) (Bunea et al., 2008) such as lutein (from 3,9 to 9,5 mg/100g

FW) (Bunea et al., 2008; Derrien, Badr, Gosselin, Desjardins, & Angers, 2017) and

chlorophyll (130 mg/100g FW) (Roberts & Moreau, 2016; Derrien et al., 2017). Spinach

cultivation leads to 1500 tons of by-products each year in Canada, available for a

phytochemical valorization, especially in lutein and chlorophyll. Lutein, an isoprenoid

polymer, is a linear aliphatic molecule with two OH functions. It exhibits several health

benefits, which could prevent age related macular degeneration, cardiovascular and cancer

diseases and possesses anti-inflammatory, and anti-oxidant properties (Fernández-Sevilla,

Acién-Fernández, & Molina- Grima, 2010; Yara-Varón et al., 2016). Chlorophyll is a green

pigment found in most plants. Chlorophyll is also known to possess several health benefits

by exhibiting antioxidant, anti-inflammatory, anti-mutagenic properties and may prevent

colorectal cancer incidence (Ferruzzi & Blakeslee, 2007).

Plant natural molecules are still predominately extracted using large amounts of

petrochemical solvents (Fernández-Sevilla et al., 2010). Besides being hazardous and

toxic, these solvents require supplementary processing steps for their elimination and are

concerned with expensive waste disposal. Petrochemicals solvents like hexane and

acetone, are indeed reported to be highly efficient for the extraction of these phyto-

compounds (Fernández-Sevilla et al., 2010). Hexane, still widely used for the extraction of

96

carotenoids, is known for its capacity to decrease fertility and is suspected to cause unborn

child. Acetone exhibits low health impact but is reported to cause eyes irritation issues

along with flammability, explosion risk and environmental consideration as it produced

volatile organic compounds (VOCs). Utilization of these petrochemical solvents in factory

required additional security measures and equipment’s, along with significant

supplementary costs (Prat et al., 2016). Environmental and economic impacts of chemistry

utilization have raised awareness among the society, from industrials to consumers. Thus,

agro-industrial and pharmaceutical plants were encouraged and invited to focus on a

replacement solution regarding these extraction solvents. The concept of sustainable

extraction of naturals products principles was introduced in 2010. This concept is based on

the choice of innovative design and technologies to enable energy saving during an

extraction process. Green solvents are promoted instead of petrochemical solvents, thereby

solving several environment safety issues. The green chemistry concept strive to use

renewable resources instead of fossil energy (Chemat & Strube, 2015).

New emerging technologies are now considered by the pharmaceutical, food and

nutraceutical industries for the development of greener extraction processes. Supercritical

carbon dioxoide (SC-CO2) is a green extraction technology often used for the extraction

of phytochemicals. It is a renewable source, non-flammable and non-toxic. This technology

enables the extraction of many natural molecules and can be recovered from the extract by

a simple pressure drop, avoiding additional energetic consuming evaporation step. Carbon

dioxide is usually recycled, leaving no waste (Chemat et al., 2017). SC-CO2 extraction of

lutein, a carotenoid, and chlorophyll was performed by several authors using different raw

materials (Macías-Sánchez et al., 2007; Guedes et al., 2013). Indeed, SC-CO2 was used to

extract lutein and chlorophyll from micro-algae, nettle, with a good efficiency when a

coslovent was added to the process (Sovová, Sajfrtová, Bártlová, & Opletal, 2004).

Spinach is considered as a great sources of phytochemical, especially lutein and

chlorophyll (Roberts & Moreau, 2016). Because SC-CO2 is a non-polar solvent, a

modifier is often used in order to enhance the extraction capacity of molecules exhibiting

intermediate solubility, as its the case for lutein and chlorophyll. The most often such

modifier used is ethanol, a green solvent, generally recognized as safe (GRAS status)

97

(Cavalcanti, Meireles, & Sp, 2012). It enables to decrease the selectivity of the SC-CO2

and thus, to extract a larger panel of molecules.

The objective of this work was to study the influence of SC-CO2 extraction parameters on

the recovery of lutein and chlorophyll from spinach by-products and to seek the parameters

allowing the most efficient extraction yield of these compounds, using the response surface

methodology and derringer’s mathematical tool. The experimental results were compared

to a conventional green extraction process using water and ethanol as extraction solvents

(Derrien et al., 2017).


5.5.1 Plant material

Vegpro international provided the raw vegetable material required to perform all the

experiments of this present project (Sherrington, QC; Canada). Spinach by-products were

selected based on their quality criteria, which were found to be inadequate for the crops

market. Indeed, these residues were destined to discard because they were non-marketable

due to the fact that they are below commercialization standards. Spinach were first freeze

right after their reception at -20 °C to avoid the degradation of the vegetable material. They

were later dried by lyophilization because of the highly sensitivity characteristics of the

studied molecules and the raw material. The dried material was then stocked in the dark

and at -20 °C until further utilization. Before the conventional and supercritical extraction,

the vegetable material was grinded into a powder.

5.5.2 Chemicals

CO2 (99% purity) used for the supercritical extraction, during the experiments, was from

Oxymed (Montréal, Canada). For the HPLC quantification of the studied molecules, all the

solvents (dichloromethane, methanol, methyl-tert-butyl ether (MTBE)) were of analytical

grade from VWR (Mississauga, Canada). The standards used for the HPLC quantification

of the obtained extracts from both conventional and supercritical extraction were

chlorophyll (a, b and lutein (95% purity) bought from Sigma Aldrich (Oakville, Canada).

98

5.5.3 Experimental method

5.5.3.1 Supercritical Fluid Extraction (SFE) and extraction design

In each run, 25 g of freeze dried spinach were placed in the reactor. The system was filled

with CO2, from a 50 L cylinder, compressed to the desired extraction pressure by a CO2

pump model P50 from Thar Technologies (Pittsburg, Pennsylvania, USA). The head of the

CO2 pump was maintained at 4 °C using a 10 % ethylene glycol cooling agent in order to

avoid formation of gaseous CO2. The pressure was controlled by an automated back-

pressure regulator (model A-BPR-20) also from Thar Technologies. A heating system was

used to prevent the valve freezing as the fluid depressurized at the exit of the instrument.

The modifier was provided using a C5 model pump from Thar Technologies. The CO2-

modifier mixture was then heated to the operating temperature using a heat exchanger to

achieve the supercritical conditions and passed through the reactor where the extraction

takes place. The reactor consisted in a 500 ml stainless steel cylinder from Thar

Technologies which was equipped with a heating element in order to keep the supercritical

conditions. The reactor pressure was controlled by a back-pressure valve, located after the

reactor. The separation of the extract from the solvent occurred by a decrease of the

operating pressure to 5 MPa across the back-pressure valve. To avoid the formation of ice

and blockage of the line due to depressurization, the back-pressure valve is equipped with

a heating element. The CO2, is separated from the extract and is passed through a heat

exchanger which was working with at 4 °C mixture of 10% ethylene glycol as cooling

agent. The recovered CO2 was then recycled and used for the next extraction cycle. The

extracts were recovered from separator and evaporated until dryness by a vacuum rotary

evaporator. The samples were kept at -80 °C in the absence of light until HPLC-UV

analysis. The process flow diagram is shown in Fig. 5.1. The results obtained were then

compared to the total amount of lutein and chlorophyll (by the addition of chlorophyll a

and b amount in mg present in 100 g of FW starting material) present in spinach by-

products using acetone as conventional organic solvent for the extraction of these

molecules as previously detailed in a previous work (Derrien et al., 2017). The

concentration in lutein (9 mg/100g of fresh weight spinach) and chlorophyll (120mg/100g

of fresh weight spinach) obtained previously by this method were considered as the total

99

amount of these molecules present in the raw material and then, the following formula was

used to compared the extraction yield of lutein and chlorophyll with SFE:

Yield of lutein or chlorophyll

(%)=(Amount of lutein or total chlorophyll (a+b)obtained with SFE (

mg100g

FW)

Total amount of lutein or total chlorophyll (a+b)with conventional method (mg

100gFW)

)×100

Sc-CO2

Spinach

Valve

Cooler

CO2 PumpHeater

Cosolvent pump

Cosolvent

Extractor

BPR

separator

Extract

CO2

Valve

ValveCooler Filter

Figure 5-1: SC-CO2 process flow diagram

100

5.5.3.2 Experimental design

The Design of experiment (DOE) selected in this study used a rotatable or nearly rotatable

second order design, called the box Behnken design. This DOE are an incomplete three

levels factorial designs. The effects of the independents variables, corresponding to the

selected extraction parameters to be tested on the lutein and chlorophyll recovery, were

investigated to determine the optimal conditions using the Box–Behnken experimental

design. The selected independent variables consisted in extraction temperature (40 to

60°C), ethanol concentration (0 to 10%, v/v), extraction time (1 to 5h) and pressure (100

to 500 bar). The flow rate was kept constant, at 10g/min. The box Behnken design used 3

levels of each independent variable, from -1, the lowest level; 0, the medium level; +1, the

highest level. Also, 3 centrals points were used for the estimation of the model’s pure error.

It consisted to run in triplicate the medium level combination (0; 0; 0). All the levels

extractions parameters were at equidistance from the central points. The level of the

different extraction factor used to perform 24 experimentations are presented in Table 2 as

well as their coded and uncoded identifications.

5.5.3.3 Statistical analysis

Experimental lutein and chlorophyll yields were analyzed through a response surface

methodology in order to fit the second order polynomial equation described as follow:

Équation 5.1


4

𝑖=0


4

𝑖=𝑜

∑𝛽𝑖𝑗

4

𝑗=0

4

𝑖=0


Where 𝑌 is the response (lutein or chlorophyll in % of yield); β0 is the constant coefficient;

𝛽𝑖 is the linear coefficient; 𝛽𝑖𝑖 is the quadratic coefficients; 𝛽𝑖𝑗 is the two factor interaction

coefficient and 𝑋𝑖 and 𝑋𝑗 are the independents variables (Derrien et al., 2017). The

statistical analyses of the model were performed using RSREG procedure of the Statistical

Analysis System (SAS) (version 9.4, SAS institute Inc, Cary, NC, USA). The accuracy of

the model was studied and validated through several statistical parameters. As reported in

the majority of articles using RSM as statistical design to perform process optimization,

101

these statistical parameters consisted in the determination coefficient R2, the lack of fit test

as well as the F-test along with its corresponding p-value at 5% significance level.

The optimal extraction parameters for both responses (lutein and chlorophyll) allowing the

higher recovery of molecules were seeked through a multivariate analysis called the

derringer’s desirability function. Predicted values obtained from this model were converted

into a dimensionless individual desirability function 𝑑𝑖, varying from 0, the lowest and

unacceptable recovery of the studied molecules to 1, the highest and the desire recovery

of the lutein and chlorophyll. The individual’s desirability functions are then combined into

an overall desirability function (D), corresponding to the geometric mean of each

desirability values and plotted in a response surface. The model was finely corroborated

with the experiments, ran in triplicate, using the optimal conditions predicted by the

derringer’s model, and the obtained values of the validation experiment were compared

with the predicted values (Dong et al., 2009; Yin and Dang, 2008).

5.5.4 HPLC analysis

HPLC analysis was performed based on the methodology previously described by Derrien

et al. (2017) (Derrien et al., 2017). Briefly, an Agilent 1260 liquid handling system

f(Agilent, Mississauga, Canada) was used in this study for the analysis of the spinach

extracts obtained using supercritical fluid extraction. A C30 YMC column

(250mm×4,6mm id., 5mm particle size; Allentown, U.S.A.), maintained at a constant

temperature of 35°C was used for the separation of the studied phytomolecules

(chlorophyll and carotenoids). These molecules were eluted with a mobile phase that

consisted in a mixture of methanol: water (98/2, v/v) (eluent A) and methyl-tert-butyl ether

(MTBE) (eluent B). The flow-rate was set at 1.0 mL/min and the gradient elution started

at 2% B, followed by a linear gradient until 80% B in 27 min. These last conditions were

kept constant from 27.0 to 31.0 min, and the initial conditions were used from 31.1 to 34.00

min. Identification of each compound was performed using retention time and UV spectra

(190-640 nm) of pure compounds. Data acquisition was carried out with Chemstation

software (Gleize et al., 2012). The standards were solubilized using a mixture of

methanol/dichloromethane (65/35; v/v). These final solutions were then diluted to perform

five-points calibration curves.

102


5.6.1 Screening of SFE studied variables

Extraction using supercritical fluids had been extensively studied during the past years,

applied on different raw materials. This technique has been widely studied for the

extraction of several carotenoids, especially the lycopene from tomato (de la Fuente,

Oyarzún, Quezada, & del Valle, 2006; de Melo, Silvestre, & Silva, 2014) astaxanthin from

shrimp (Sánchez-Camargo, Martinez-Correa, Paviani, & Cabral, 2011; Sánchez-Camargo,

Meireles, Ferreira, Saito, & Cabral, 2012); lutein, zeaxanthin, β-cryptoxanthin and β-

carotene from persimmon (Zaghdoudi et al., 2016), lutein, β-carotene and chlorophyll from

microalgae (Macías-Sánchez et al., 2005, 2007; Macías-Sánchez, Fernandez-Sevilla,

Fernández, García, & Grima, 2010) carotenoids from carrot (Sun & Temelli, 2006). Several

other studies have been conducted on the optimization of the astaxanthin extraction. This

carotenoid is also part of the xanthophyll family, like lutein and its optimum extraction

conditions were similar to those found by our optimization. Indeed, a research studying the

extraction of astaxanthin from yeast, had found an optimum temperature of 40 °C and an

optimum pressure of 50 MPa with ethanol as cosolvent (Lim, Lee, Lee, Haam, & Kim,

2002). Liau et al. (2010), working on the extraction of astaxanthin from microalgae,

reported the same conclusion. Maciaz-Sanchez et al. (2009) concluded through several

studies performed on microalgae that the highest recovery of carotenoids and chlorophyll

in SC-CO2 was obtained using high pressure and temperature (40 MPa and 60 °C). They

also observed that the highest ratio between lutein and chlorophyll was obtained, in pure

CO2, at lower extraction pressure (20 MPa). Finally, the results presented by these authors

showed also an inefficient extraction of the chlorophyll using pure CO2, where the best

extraction was found at 50 MPa and 60 °C to be 18 % of the total amount of chlorophyll

present in the raw material.

Then, many studies reported the necessity to use a co-solvent during the extraction of lutein

and chlorophyll, in line with their intermediate polarity characteristics (de Melo et al.,

2014). For the same reason, working at higher pressure (30 to 50 MPa) was considered in

this study in order to increase the solvating power of the supercritical solvent. Also, several

103

authors used an extraction time less than 300 minutes regarding the extraction of lutein and

chlorophyll from different starting material, enables us to fix the higher extraction time to

5 hours ( Macías-Sánchez et al., 2007; Macias-Sanchez et al., 2009; Mattea, Martín, &

Cocero, 2009). The flow rate of the experiments was chosen based on several studies

reported that low flow rate exhibits a low efficacy in the extraction of chlorophyll and

lutein and was settled at 10g/min (Mattea, et al., 2009).

5.6.2 Effect of extraction factors on the extraction of lutein and chlorophyll

The supercritical results were compared to a conventional extraction using organic solvent,

acetone, as previously described by Derrien et al (2017).

5.6.2.1 Pressure

The results presented in Table 5.1 shows the high influence of the pressure on the molecules

recovery, at each condition. Without modifier addition, at 10 MPa, 3h of extraction and 50

°C, only a low amount of lutein and chlorophyll were extracted (respectively 1.1 and 0 %),

in comparison with 30 MPa (respectively 2.7 % and 0.1 %) or 50 MPa (respectively 15.7

% and 5.3 %). At 5 h and 30 MPa, the extraction yield reached 31.5 % of the lutein and 0.5

% of the chlorophyll. These results showed that lutein exhibit better extraction yield than

chlorophyll in SC-CO2 without co-solvent addition.

Variation of pressure causes major variation in solvent density. Higher pressure exhibit a

better extraction yield of the two studied molecules, by a decrease of the selectivity of the

solvent. Lower pressure, providing lower solvent density, allows the extraction of

molecules exhibiting high affinity for the supercritical solvent. At higher density,

molecules known to exhibit medium to low solubility in SC-CO2 start to be extracted,

because of the lower selectivity of this solvent. Between 10 MPa to 30 MPa, lutein was

extracted with a very low extraction yield but, between 30-50 MPa, it exhibits an efficient

extraction yield. Chlorophyll, exhibiting more polar characteristics than lutein, was never

extracted with an acceptable yield with only the SC-CO2. In fact, even at 50 MPa, the

extraction yield was never higher than 5 % of the total amount of chlorophyll. These results,

also clearly illustrated in Fig. 5.2, where chromatograms of some extraction parameters

combination are provided. Indeed, the absence of chlorophyll peak at 10 MPa can be

104

noticed when lutein is present, and the presence of both molecules for the same extraction

conditions at 50 MPa.

The statistical analysis of the results was in correlation with the first observations. Indeed,

for both lutein and chlorophyll, pressure exert a significant negative quadratic effect with

a P value of 0.0058 and 0.0045 respectively (Table 5.2). The negative quadratic effect of

pressure phenomenon can be explained by the porous matrix of vegetables, that excessive

pressure causes a decrease of their size, followed by a decrease of the mass transport

efficacy and then a reduction of extraction yield (Huang, Shi, & Jiang, 2012; Sajfrtová &

Sovová, 2012). In other hand, the solvent selectivity is decreased at higher pressure,

devoting the extraction of different solutes with higher extraction yield ( Cavalcanti et al.,

2012). Then, compromise has to be done between enhancing pressure to obtain better yield

and the reduction of the mass-transfer efficacy, leading to a decrease of the extraction yield.

However, the polar chemical characteristics of the molecules necessitate higher pressure

of CO2 in order to extract lutein and chlorophyll with acceptable yield.

105


obtained at different extraction conditions measured at 450 nm by UV/vis detector.

Peak identification: (1) lutein (2) β-caroten (3) chlorophyll b (4) chlorophyll a.

5.6.2.2 Temperature

The results showed that extraction temperature of 40 and 50 °C enables the extraction of

chlorophyll with higher efficacy than at 60 °C in similar conditions (table 5.1). Indeed, this

molecule is reported to be heat sensitive, thus, higher extraction temperature will promote

its degradation. This effect was less important with lutein, that was found to be extracted

with an efficient yield with temperature close to 60°C. Lutein is also reported to be heat

sensitive, however, this compound exhibited a higher stability at higher temperature than

chlorophyll. The effect of temperature on the solubility is complex, because both solute

106

and solvent characteristics had to be considered. Indeed, at constant pressure, when the

temperature is enhancing, the density of the solvent decreases which reduces its solubility.

This effect is dominant for region below 11 MPa. However, the compound vapor pressure

increases by increasing the temperature which enhances its solubility in the present solvent

(Cavalcanti et al., 2012). At region between 11 and 50 MPa, increasing temperature

increases the solubility of the molecule and then, the major effect is the vapor pressure of

the solutes in these regions.

The statistical analysis, in correlation with the observed results, exhibiting that the

temperature as linear factor did not exert a significant effect on the lutein and chlorophyll

but this effect was found to be a significant with associated with pressure and time (table

5.2). For chlorophyll, the cross-product of pressure*temperature exerted a positive effect

on the recovery (P-value = 0.0086), meaning that higher solvent density enables the

recovery with higher efficacy of this compound. The temperature as linear factor did not

exert a significant effect on the lutein and chlorophyll but this effect was found to be a

significant with associated with pressure and time (table 5.2). For chlorophyll, the cross-

product of pressure*temperature exerted a positive effect on the recovery (P-

value = 0.0086), meaning that higher solvent density enables the recovery with higher

efficacy of this compound.

107

Tableau 5-1: Regression coefficients for the estimated yields in lutein and chlorophyll

Coded and uncoded Variables Responses

Run No X1 (time, h) X2 (temperature, °C) X3 (pressure, MPa) X4 (modifier, %) Lutein yield (%) Chlorophyll yield (%)

Ratio Lutein/Chlorophyll

1 -1 (1) -1 (40) 0 (30) 0 (5) 7.0 4.9 1.4

2 1 (5) -1 (40) 0 (30) 0 (5) 33.8 8.9 3.8

3 -1 (1) 1 (60) 0 (30) 0 (5) 23.9 3.4 7.1

4 1 (5) 1 (60) 0 (30) 0 (5) 78.2 18.7 4.2

5 0 (3) 0 (50) -1 (10) -1 (0) 1.1 0.0 30.1

6 0 (3) 0 (50) 1 (50) -1 (0) 15.8 5.3 3.0

7 0 (3) 0 (50) -1 (10) 1 (10) 24.7 10.2 2.4

8 0 (3) 0 (50) 1 (50) 1 (10) 63.8 44.2 1.4

9 -1 (1) 0 (50) -1 (10) 0 (5) 0.0 0.0 0.0

10 1 (5) 0 (50) -1 (10) 0 (5) 19.5 0.4 54.0

11 -1 (1) 0 (50) 1 (50) 0 (5) 18.1 1.9 9.4

108

12 1 (5) 0 (50) 1 (50) 0 (5) 45.5 19.6 2.3

13 0 (3) -1 (40) 0 (30) -1 (0) 29.8 1.1 27.2

14 0 (3) 1 (60) 0 (30) -1 (0) 3.8 0.3 11.8

15 0 (3) -1 (40) 0 (30) 1 (10) 60.1 59.8 1.0

16 0 (3) 1 (60) 0 (30) 1 (10) 43.3 23.9 1.8

17 -1 (1) 0 (50) 0 (30) -1 (0) 2.7 0.1 24.3

18 1 (5) 0 (50) 0 (30) -1 (0) 31.5 0.5 66.0

19 -1 (1) 0 (50) 0 (30) 1 (10) 13.8 6.2 2.2

20 1 (5) 0 (50) 0 (30) 1 (10) 53.9 71.0 0.8

21 0 (3) -1 (40) -1 (10) 0 (5) 5.4 3.3 1.7

22 0 (3) 1 (60) -1 (10) 0 (5) 3.4 0.0 0.0

23 0 (3) -1 (40) 1 (50) 0 (5) 21.1 11.5 1.8

24 0 (3) 1 (60) 1 (50) 0 (5) 74.7 31.6 2.4

25 0 (3) 0 (50) 0 (30) 0 (5) 39.0 19.4 2.0

26 0 (3) 0 (50) 0 (30) 0 (5) 29.0 14.4 2.0

27 0 (3) 0 (50) 0 (30) 0 (5) 54.7 22.0 2.5

109

Tableau 5-2: Regression coefficients for the estimated yields in lutein and chlorophyll

Parameters

Lutein Chlorophyll

Estimate

Standard

Error

P-value

Estimate

Standard

Error

P-value

time 2.651225 1.100504 0.0330* 2.600590 2.202029 0.2605

temperature 0.007757 0.332908 0.9818 -0.005096 0.666125 0.9940

pressure 0.021092 0.011005 0.0794 -0.000748 0.022020 0.9735

cosolvent 0.067877 0.424343 0.8756 0.725627 0.849079 0.4095

time*time -0.160246 0.080168 0.0688 -0.352530 0.160410 0.0483*

temperature*time -0.004706 0.018514 0.8036 0.014029 0.037045 0.7115

temperature*temperature -0.000967 0.003207 0.7682 -0.004683 0.006416 0.4795

pressure*time -0.002659 0.000926 0.0140* -0.002345 0.001852 0.2294

pressure*temperature 0.000215 0.000185 0.2677 0.001162 0.000370 0.0086*

pressure*pressure -0.0000268 0.0000080 0.0058* -0.0000558 0.0000160 0.0045*

cosolvant*time -0.026292 0.037028 0.4912 0.024862 0.074090 0.7430

cosolvent*temperature 0.008514 0.007406 0.2727 0.001517 0.014818 0.9202

cosolvent*pressure -0.000401 0.000370 0.2996 -0.000865 0.000741 0.2655

cosolvent*cosolvant -0.013397 0.012827 0.3169 -0.019944 0.025666 0.4522

* Significant at 5% level; ** Significant at 1% level

110

5.6.2.3 Cosolvent concentration

Ethanol, a green solvent from renewable sources, was used as a modifier or co-solvent in

this study. Co-solvent concentration exhibits a significate effect on lutein and chlorophyll

extraction. When no co-solvent is added, the yield of lutein and chlorophyll is very low.

Chlorophyll is more affected by the co-solvent than lutein. In fact, SC-CO2 is a poor solvent

for polar to intermediate compounds. Lutein and chlorophyll exhibit an intermediate

solubility in SC-CO2, explaining by the two OH functions carrying by the lutein and the

hydrophilic pyrol head of the chlorophyll. Lutein exhibits slightly more nonpolar

characteristic than chlorophyll, explaining the fact that this carotenoid is less affected by

the absence of cosolvent. Indeed, without co-solvent we were able to reach an extraction

yield of 31% of lutein when the yield of chlorophyll was never higher than 5% without the

co-solvent. When co-solvent is added, the extraction yield of lutein and chlorophyll reach

at least 60% of the theoretical value. The effect of the co-solvent can be explained with the

solubility characteristic of these molecules and the capacity of these compounds to form

hydrogen bound with ethanol is added to the SC-CO2, allowing better release of the lutein

and the chlorophyll from the matrix (Nobre et al., 2006).

5.6.2.4 Time

Extraction time exerted significant effect on both lutein and chlorophyll (table 5.2). The

extraction yield of these two compounds were found to increase with the extraction time.

Indeed, extended extraction time is correlated with higher ratio solvent to feed, previously

reported in the literature to have a positive impact on the extraction efficiency (Farías-

Campomanes et al., 2015) . With only 1h of extraction, the extraction yield of both lutein

and chlorophyll were low, with a maximum recovery of 24% for lutein and 8% for

chlorophyll. 3h of extraction associated with co-solvent addition of 10% give good

extraction yield of lutein and chlorophyll, up to 60% for both compounds. At 5 h of

extraction, the extraction yield was 78% for lutein and 70% for the chlorophyll (Table 5.1).

However, after 4 h of extraction (see fig 5.3) small variations in solutes recovery were

observed due to the gradual extraction and then the gradual decrease of the solutes

concentration in the solid matrix, leading therefore to the reduction of mass transfer driving

111

forces (Farías-Campomanes et al., 2015; Sovová et al., 2004). Indeed, after this period,

diffusion controlled extraction period takes place, due to the fact that the majority of the

easily accessible solutes have been extracted and the solutes remaining in the matrix were

less accessible and then slowly extracted.

The statistical analysis of the results clearly demonstrates that chlorophyll exhibited a

negative quadratic effect of the extraction time (P-value = 0.048). This effect is not

reported for the lutein extraction, where time exhibiting a linear positive effect on the

molecules recovery with a 𝜌-value of 0.033. Higher stability of the carotenoids than

chlorophylls was then observed. For lutein, the cross-product of pressure*time exerted a

negative effect on the extraction (P-value = 0.014), meaning that higher pressure and

higher extraction time was not necessary for lutein recovery. This observation may be

explained by the fact that lutein is more easily accessible to the solvent in the vegetable

matrix than chlorophyll. Indeed, this fact was not reported for the chlorophyll extraction.

5.6.3 Mathematical treatment of data and evaluation of the fitted model

P-values were used to determine the significance of each extraction parameter and their

interaction effects. The results are presented in table 5.2. The response behavior of lutein

and chlorophyll was described by fitting the data to a mathematical equation used to better

understand the effect of extraction parameters on the lutein and chlorophyll extraction. The

model was then evaluated by analysis of variance, in order to compare the variations related

to the experimental conditions studied and variations due to the random errors, associated

to an evaluation of the significance of the fitted mathematical model (Bezerra et al., 2008).

The quadratic regression model for lutein resulted in a determination coefficient of

R2 = 0.88, indicating that only 0.12% of the variation was not explained by the model. The

lack of fit was found non-significant associated with P and F values of 0.3 and 2.71,

respectively, meaning that the model fitted well with the experimental data. The total model

was associated with a P-value of 0.0011, showing the significance of the regression model,

explained by the second order polynomial equation given bellow, neglecting the

insignificant terms:

112

Equation 5.2

Υ = −8.28 + 2.65 × 𝑋1 − 0.00003 × 𝑋3𝑋3 − 0.003 × X3X1

For chlorophyll, the quadratic regression model showed a determination coefficient of

R2 = 0.89, then only 0.11% of the variation were not explained by the present model. The

lack of fit associated with a P-value of 0.06 indicated that the model fits with the data. The

total model exhibited a P-value of 0.0009, proving the high significance of the regression

model. The final predicting equation for the chlorophyll response taking into account only

the significant terms, is given bellow:

Equation 5.3

Υ = −4.20 − 0.35 × 𝑋1𝑋1 − 0.00006 × 𝑋3𝑋3 + 0.001 × X3X2

5.6.4 Selectivity of the supercritical solvent

The previous results exhibited a relationship between lutein and carotenoid extraction.

Indeed, the table 5.1 show clearly that the extraction efficacy of these 2 compounds where

closely related at the same extraction parameters. As previously described by other authors,

a ratio between lutein and chlorophyll recovery has been calculated to demonstrate this

relationship (Macias-Sanchez et al., 2009). The higher ratio between these 2 compounds

where found with extraction combinations using a pressure of 10 MPa associated with 0 to

5% of modifier concentration, meaning that the selectivity of the supercritical extraction

was enhance at these parameters. Indeed, the highest ratio was found at10 MPa, 5% of

modifier with 5h of extraction at 50°C, and was 54. For the other combinations, the ratio

of lutein and chlorophyll was found to be between 0 to 4. The lowest ratio, meaning the

lowest selectivity of the extraction, was found using 10% of modifier, especially with the

combination 15, exhibiting a ratio of 0.8.

A Pearson correlation test was used to understand the relation existing between the lutein

and chlorophyll response. The test shows that these variables were highly positively

correlated, with a r = 0.86. This mathematical observation was in accordance with our

experimental results exhibiting that the optimum extraction of the both molecules was

obtained with close parameters. To conclude, the use of pure CO2 increases the selectivity

of the extraction while the addition of a modifier will decrease this selectivity of the

113

supercritical solvent. Also, both observed and statistical analysis demonstrate the close

relationship between the lutein and chlorophyll. These observations lead us to focus on a

multivariate analysis instead of univariate analysis.

5.6.5 Determination of the optimum conditions

Derringer’s desirability function was used to predict the parameters allowing the best

recovery of lutein and chlorophyll in a single extraction by a multivariate analysis (Ahmad

et al., 2015). This method is very helpful when several responses have to be optimized at

the same time and to seek the most efficient extraction parameters (Bezerra et al., 2008).

Response surface plot was used to visualize the profiles of predicted desirability’s values.

The plots are provided on figure 5.3, exhibiting the overall desirability (from 0 to 1) for the

maximization of lutein and chlorophyll extraction yield, with the variation of extraction

parameters. The optimum extraction parameters found by this multivariate tool are in

correlation with the observed effects as well as the statistical analysis of each extraction

parameters previously described in this study. Indeed, a concentration of modifier of 10%

was found to be the optimum concentration enable the highest recovery of the both

molecules. This result was in line with the first observations, showing a linear increase of

extraction yield associated with an increase of modifier concentration (figures 5.3C, 5.3E,

5.3F). Also, a pressure of 39 MPa were found to be the most effective for the extraction of

the studied molecules, associated with a temperature of 56°C. These results given by the

model were also in accordance with the observed results and the statistical analysis of the

model described in table 5.2, exhibiting a quadratic effect of the pressure on the responses

(figure 5.3B, 5.3D, 5.3F). The optimum extraction time was found to be 3.6h by the

function, once again in accordance with the first analysis of the results, showing clearly a

decrease in the extraction rate after this time (figure 5.3A and 5.3B).

Thus, the optimum extraction parameters found by the mathematical function and

confirmed by the plots were 39 MPa, at 56 °C, for 3.6 h and with 10 % of co-solvent

concentration. With these parameters, we were able to reach an extraction yield of 72% for

lutein and 50 % for the chlorophyll. Experiment was carried out under the optimal

conditions predicted by the function, exhibiting close similarity with the predicted values

obtained by the model, confirming its adequacy to optimize the extraction parameters for

both lutein and chlorophyll in SC-CO2.

114

Figure 5-3: Prevision 3D plots outputs after maximization of the desirability function for extraction yields of lutein and

chlorophyll

The predicted values represente the overall desirability D (average of desirability of lutein, d1 and chlorophyll, d2).

115

5.6.6 Comparison with a conventional green extraction process

A recent paper was published on the optimization of conventional green extraction of lutein

and chlorophyll from spinach using a green solvent system containing water and ethanol

(Derrien et al., 2017). The extraction yield of chlorophyll is lower in SC-CO2 at the

optimum parameters (recovery of 50 % of the total chlorophyll), compared to the yield

obtained with conventional green extraction (96 %). However, the extraction yield of lutein

is higher in the present work (72 %), compared to the value obtained with aqueous ethanol

extraction (70 %). With conventional green extraction previously developed, a recovery of

96 % of chlorophyll and 70 % of lutein was obtained. However, the selectivity of these

molecules in ethanol was lower than with supercritical carbon dioxide (Derrien et al.,

2017). In addition, the amount of ethanol used for the conventional extraction was

significantly higher, with a ratio of 1 to 66 of solvent to raw material while in the

supercritical process using 10% modifier addition, this ratio was found to be 1 to 8.5. The

optimal extraction time used in this SC-CO2 process was lower than the optimal extraction

time used with the conventional green extraction of these compounds (respectively 240

min with conventional extraction and 216 min with SC-CO2 at optimal conditions). Thus,

utilization of SC-CO2 enables to save significant energetic consumption during the process,

directly proportional to the environmental impacts.

This innovative technology is found to be a good candidate for the replacement of

conventional solvent for the extraction of lutein and chlorophyll from spinach by-products.

5.7 Conclusion The aim of this paper was to find optimum operating condition using response surface

methodology regarding the extraction of lutein and chlorophyll in SC-CO2. Another

objective was also to study the effect of the different extraction parameters on the both

phytochemicals. The more efficient extraction combination for the simultaneous extraction

of lutein and chlorophyll was at 56°C, for 3.6 h and with 10% of co-solvent concentration,

given a recovery of lutein and chlorophyll respectively up to 70% and 50%. The

temperature did not exhibit significant effect on the recovery of molecule, instead of

116

pressure, time and co-solvent addition. The SC-CO2 is then a suitable method for the

extraction of lutein and chlorophyll from spinach by-products.


l'Alimentation (MAPAQ) and the industrials partner of this project (Nutra Canada, Vegpro

International). The authors thanks the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et

les Technologies (FQRNT) and the Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et Génie

(CRSNG) from Canada for BMP-Innovation PhD fellowship. The authors would like to

thank, Perrine Feutry & Véronique Richard, Chemists, for the chemical expertise, and

Gaetan Daigle, M.Sc for his statistical support

117

6 Modelization of the supercritical carbon dioxide solubility of carotenoids and chlorophyll using Hansen theory

118

6.1 Transition contextuelle L’extraction et la séparation de la lutéine et de la chlorophylle à partir de sous-produits

d’épinards ont été étudiées à travers deux procédés conventionnels utilisant un système de

solvants verts (eau, éthanol, NaOH) ainsi que par un procédé d’extraction utilisant du CO2

supercritique (SC-CO2). L’extraction par SC-CO2, la plus prometteuse des méthodes

optimisées, permet l’extraction de 72% de la lutéine et de 50% de la chlorophylle en

comparaison avec la quantité totale de ces molécules présentent dans la matière de départ

non traitée. Ce chapitre du projet porte sur la modélisation de la solubilité des molécules

dans le SC-CO2 qui permettra la prédiction de la solubilité de différentes phytomolécules

dans le solvant supercritique. De fait, cet outil permettra la diminution des tests

expérimentaux, connus pour être couteux.

Ce chapitre est présenté sous la forme d’un article intitulé : « Modelization of the

supercritical carbon dioxide solubility of carotenoids and chlorophyll using Hansen

theory ». Il a été soumis à Journal of Supercritical Fluids.



directeur de la thèse, et les Drs André Gosselin, Yves Desjardins, Yacine Boumghar, co-

directeurs de la thèse ont participé à la planification des travaux de recherche, à la

discussion des résultats lors de réunions ainsi qu’à la révision de l’article présenté. Le Dr

Milad Aghabaranejad, professionnel de recherche, a participé à la discussion des résultats,

à la révision du présent article.

119

6.2 Résumé L’utilisation de CO2 supercritique permet l’extraction d’un large groupe de molécules

naturelles. L'optimisation et la sélection des conditions optimales d'extraction représente

une étape importante quant à la production d’extraits naturels. L'objectif principal de ce

projet était de développer une approche prédictive basée sur la théorie de la solubilité de

Hansen pour déterminer et optimiser la solubilité des solutés, avec l'exemple des

caroténoïdes et de la chlorophylle, dans le CO2 supercritique (SC-CO2). La différence

d'énergie relative (RED) entre les paramètres de solubilité Hansen du SC-CO2 à différentes

conditions de pression et celles des solutés a été calculée. La RED obtenue a été comparée

aux résultats expérimentaux des expériences précédentes. L'approche prédictive a suggéré

qu'une plus grande solubilité de la lutéine et de la chlorophylle était obtenue à 500 bar.

Aussi, sans ajout de co-solvant, le SC-CO2 ne représente pas un solvant efficace pour la

récupération de la lutéine et de la chlorophylle. Les résultats expérimentaux ont validé les

résultats de l’étude prédictive, montrant un faible rendement d'extraction sans ajout de

cosolvant, même à 500 bars. De fait, le modélisation mis en place dans ce chapitre peut

être considérée comme un outil efficace en ce qui concerne la prédiction de la solubilité

des solutés dans SC-CO2. Cet outil peut être utilisé pour estimer la solubilité des molécules

phytochimiques à l’intérieur d’un large panel de pressions et de températures.

120

6.3 Abstract Supercritical carbon dioxide technology is involved in the extraction of a large group of

natural molecules. The process optimization regarding the selection of the optimum

extraction conditions requires a critical analysis. The main objective of this project was to

develop a predictive approach based on the Hansen solubility theory to ascertain and

optimize the solubility of solutes, with the example of carotenoids and chlorophyll, in

supercritical carbon dioxide (SC-CO2). The relative energy difference (RED) between the

Hansen solubility parameters of SC-CO2 at different pressures conditions and the solutes

were calculated. The obtained RED were compared with experimental results from

previous experiments. The predictive approach suggested that higher solubility of lutein

and chlorophyll were reached at 500 bar. Without modifier addition, SC-CO2 wasn’t an

efficient solution for lutein and chlorophyll recovery. Experimental results suggested the

same trend, showing a low extraction yield without modifier even at 500 bar. The

predictive approach was then considered an efficient tool regarding the solubility of solutes

in SC-CO2 and can be used to estimate the condition for solutes-SC-CO2 optimum

miscibility in a wide range of pressure.

121

6.4 Introduction Natural products have been widely studied by the scientific and industrial community.

Health benefits associated to these products are directly related to their phytochemical

content. Indeed, many authors have established correlation between the reduction of

several chronic diseases and the biomolecules intake.

Extraction techniques from pharmaceutical to food and nutraceutical industries have to

meet several requirements concerning the economic and ecological aspects of the product

while ensuring protection of consumers and operators as well as the health and the safety

of environment. Conventional extractions (Soxhlet, solid-liquid extraction, liquid-liquid

extraction) are known to require large volumes of organic solvent and are time and cost

consuming. In order to face these disadvantages and to meet the environmental and safety

restrictions norms, new methods of extraction have been implemented in the field of food

and pharmaceuticals for extraction of naturals molecules. These new technologies offer to

reduce the consumption of organic solvents and also improve the selectivity and the

extraction yield. Among these novel technologies, supercritical fluid extraction (SFE),

subcritical water extraction (SWE), pressurized liquids extraction (PLE), microwave

assisted extraction (MAE), and ultrasound extraction (UAE) (Herrero et al., 2006, 2010,

2012, 2013) are more studied.

Supercritical fluid extraction, with CO2 as a solvent, is a green technology used in food and

pharmaceutical industries. This extraction method is involved in the extraction of a large

group of natural molecules. Supercritical CO2 exhibits physico-chemical properties

between gas and liquid. The supercritical fluid solubility can be adjusted by variation of

pressure and temperature, allowing the extraction of a wild range of compounds

(Cavalcanti et al., 2012). Supercritical temperature and pressure of carbon dioxide (31°C

and 72 bar) is much lower than other solvents. Furthermore, CO2 is readily available,

nontoxic and can be recovered easily by depressurizing and separating from the extract.

These properties make it an excellent candidate for supercritical extraction processes.

Several studies reported the extraction of lutein and chlorophyll from micro-algae, nettle,

using SC-CO2 process (Macías-Sánchez et al., 2007; Mezzomo et al., 2011; Nobre et al.,

122

2006; Sovová et al., 2004). They referred that using a co-solvent such as ethanol increases

the yield of extraction.

Predictive approach to quantify the solubility of molecules in supercritical solvents are

mostly based on methods using the equations of state (EOS) and empirical correlations

(Dadkhah et al., 2016). EOSs are widely used in chemical engineering because of their

ability to describe the phase behavior and the thermodynamic characteristics of fluids over

a large range of pressure and temperature. The correlation model, a density-model based,

describes the relationship between the logarithm of the solubility and the logarithm of the

solvent density (Škerget et al., 2011). These models provide acceptable results within a

density region of the solvent corresponding at pressure from 10 MPa to 30 MPa, but are

considered not efficient for higher pressure and when the studied solutes possess

complexes structures, like it is the case for lutein and chlorophyll (King et al., 2009).

Thermodynamic model of mixing and dissolving include mainly UNIFAC, COSMO-RS,

and Hansen parameters solubility theory. UNIFAC model based on the group contribution

method also fails in the case of complex molecules (Chemat and Strube, 2015). COSMO-

RS (conductor like screening model) is a predictive model based on quantum chemical

calculations (thermo-statistic) connecting the structures of the compounds studied in their

thermodynamic properties. This method is reported to be inefficient for supercritical state

(Moity et al., 2012). Hansen solubility parameters theory, have been widely used in

formulation of paints and plasticizers to test the solubility of polymers in a panel of solvents

and the solubility of biological material in various solvents. This concept was also applied

by King et al for the subcritical extraction modelization of several compound and the

transformation of the biomass using carbonated water (King and Srinivas, 2009; King et

al., 2009; Srinivas et al., 2009, 2010a, 2010b).

The main objective of this paper is to find an efficient predictive method to optimize solute

extraction with a supercritical solvent using Hansen solubility parameters theory. Precisely,

we focus to develop a predictive approach to ascertain and predict the combination of

temperature and pressure allowing the greater solubility of the phytochemicals in

supercritical CO2 using Hansen theory, with the example of two heath benefits molecules:

lutein and chlorophyll

123

Computational methods were then compared to experimental results from supercritical

fluid extraction with CO2 (SC-CO2) using RSM as statistical design, in order to validate

the accuracy of this predictive model.


6.5.1 Experimental extraction of lutein and chlorophyll using supercritical carbon

dioxide (SC-CO2)

6.5.1.1 Characterization of lutein and chlorophyll from Spinach

Spinach by-products were first freeze-dried and stored in the dark under vacuum since

lutein and chlorophyll are highly sensitive to oxygen, light, and heat. Quantification of

chlorophyll and lutein was used as a reference for the future SC-CO2 experiments. 0.5 g of

freeze dried powder samples of spinach were extracted with 10 ml acetone. Samples were

then sonicated for 20 min with vortexes each 5 min. The supernatant was collected after

centrifugation for 4 min at 4000 rpm and the residue was used for the second extraction

using the same method. The two supernatants were collected and mixed together. Two ml

were evaporated under nitrogen and stocked at -80°C for the HPLC analysis.

6.5.1.2 Experimental design

SC-CO2 experiments were performed in order to identify the most efficient extraction

parameters of lutein and chlorophyll from freeze-dried spinach. 27 experiments were done

using a Box Behnken statistical design, including 3 centrals points. Analysis of variance

(ANOVA) was performed to evaluate significant differences between independent

variables (p<0.05) and multiple regression analysis of experimental data were done in order

to fit the second order polynomial model:

Équation 6.1


4

𝑖=0

+∑𝛽𝑖𝑖𝑋𝑖2 +∑∑𝛽𝑖𝑗

4

𝑗=0


4

𝑖=𝑜

4

𝑖=0

In the above equation, 𝑌 is the response (lutein or chlorophyll % in the yield); β0 is the

constant coefficient; βi the linear coefficient; βii is the quadratic coefficients; βij is the two

124

factor interaction coefficient and Xi and Xj are independents variables (Baş and Boyacı,

2007). Regression and variance analyses were carried out using RSREG procedure of the

Statistical Analysis System (SAS) (version 9.4, SAS institute Inc, Cary, NC, USA).


Lutein and chlorophyll were quantified by HPLC-UV on an Agilent 1260 liquid handling

system (Mississauga, Canada), equipped with a UV detector, set at 450 nm for both

carotenoids and chlorophyll, and a C30 YMC column (250mm×4,6mm id., 5mm particle

size; Allentown, U.S.A.), maintained at a constant temperature of 35°C. Carotenoids and

chlorophyll were separated from spinach extracts with a mixture of solvents that consisted

of methanol: water (98:2, v/v) (eluent A) and methyl-tert-butyl ether (MTBE) (eluent B).

The mobile phase flow-rate was set to 1.0 ml/min and the gradient elution started at 2% B,

changed linearly until 80% of B; from 0.0 to 27.0 min. These parameters were maintained

for 4 min and then the mobile phase was set back to the initial condition from 31 to 34.00

min. Identification of each compound was confirmed using retention time and UV spectra

(190-640nm) of pure compounds. Data acquisition was carried out with Chemstation

software (Gleize et al., 2012). The day of the analysis, lutein and chlorophyll standards

were solubilized with methanol/dichloromethane (65/35; v/v). These final solutions were

then diluted to perform five-point calibration curves. The samples were also diluted in

methanol/dichloromethane solution (65/35; v/v) before HPLC analysis.

6.5.1.4 SC-CO2 equipment and experimental procedure

The experiments were performed using an automated high pressure supercritical fluid

equipment. Liquid CO2 is pressurized by a P-50 model from Thar technologies and is

mixed with the co-solvent. The co-solvent is fed using a C5 model pump from Thar

technologies. The head of the CO2 pump is maintained at 4°C using a 10 % ethylene glycol

cooling agent. This is to avoid formation of gaseous CO2 at the pump. The flowrate of CO2

and co-solvent is adjusted using a Coriolis mass flow-controller from Rheonik, Germany.

The CO2-solvent mixture is then heated in a heat exchanger to achieve the supercritical

conditions and then is passed through the reactor where the extraction takes place. The

reactor is a 500 ml stainless steel cylinder from Thar technologies which is equipped with

a heating element in order to keep the supercritical conditions. The pressure of the reactor

125

is controlled by a back pressure valve which is located right after the reactor. The pressure

decreases from the operating pressure to 50 bar across the back pressure valve and

therefore, the fluid temperature decreases drastically due to depressurization. To avoid the

formation of ice and blockage of the line, the back pressure valve is heated using a heating

element. The temperature of the heating element can also be controlled automatically.

The depressurized mixture is then entered to the separator where the extract and CO2 is

recovered and co-solvent with the extract are accumulated in the separator. The CO2 is then

passed through a heat exchanger which is working at 4°C with a mixture of 10% ethylene

glycol as cooling agent. The recovered CO2 is then recycled and ready to be pumped for

the next cycle. A 50 liters CO2 syphon cylinder is connected to system in order to fill up

the system during the start-up.

In each run, 25g of freeze dried spinach were weighted and placed in the reactor. The

system was purged with CO2, compressed to the desired extraction pressure and then

heated to the operating temperature. Once at supercritical state, the CO2 flowed through

the reactor, set at supercritical temperature previously selected, where the extraction

occurred. The selected extractions parameters consisted in extraction temperature (from 40

to 60°C), modifier concentration (ethanol, ranging from 0 to 10%, w/w), extraction time (1

to 5h) and pressure (100 to 500 bar). The flow rate was kept constant, at 10g/min. Thus,

the mass of solvent passed through the reactor per mass unit of raw material ranged from

2.4 to 120 g CO2/g raw material. The extracts were recovered in the separator after the

depressurization of the supercritical solvent and were evaporated until dryness by a vacuum

rotary evaporator. The samples were then kept at -80°C in the absence of light until HPLC-

UV analysis. (The detailed procedure is schematized figure 6.1)

126

Sc-CO2

Spinach

Valve

Cooler

CO2 PumpHeater

Cosolvent pump

Cosolvent

Extractor

BPR

separator

Extract

CO2

Valve

ValveCooler Filter

Figure 6-1: SC-CO2 process flow diagram

6.5.2 Computational method

Hildebrand (1916) proposed a solubility theory based on internal energy of the solvent and

the solute (Hansen, 2004). This concept is based on the Gibbs law, showing that the free

energy of a system must be less than zero to be dissolved. In fact, the enthalpy of mixing

should not exceed the entropy associated with the temperature, promoting dissolution. The

energy required to break bonds between molecules, i.e. energy of vaporization (ΔHv) can

127

be used to determine many properties of a substance, like solubility. This is done using the

ideal gas law:

Equation 6.2

𝛿 =√(∆Hv − RT)

𝑉

With ΔHv, the cohesive energy; R the gas constant and T the temperature.

In other words, cohesion energy density (calorie/cm3) is associated to the degree of the Van

der Waals forces involved in maintaining molecules in a liquid phase. The Hildebrand

solubility parameter is the square root of the cohesive energy density and is limited to

solutions exhibiting weak intermolecular interactions.

Since the present study deals with strong intermolecular interactions, the Hildebrand

solubility theory is not practical.

The Hansen solubility theory (Hansen, 2007), is based on the total solubility of a molecule

or of a solvent (𝛿𝑡2), corresponding to square root of the value of the cohesive energy

density that can be divided into 3 distinct parts:

𝛿𝑑2 nonpolar interactions, known as dispersion forces (van der Waals)

𝛿𝑝2 polar interactions

𝛿ℎ2 interactions related to hydrogen bonds

The Hansen solubility equation is the addition of these three interactions, as shown below:

Equation 6.3

𝛿𝑡2 = 𝛿𝑑

2 + 𝛿𝑝2 + 𝛿ℎ

2 (MPa)2

The solubility parameters are currently measured at ambient pressure and temperature (P=1

atm, T=25 °C). Moreover, changes in pressure and temperature cause major variations in

CO2 solubility. Each pressure and temperature combinations exhibiting characteristic

solubility parameters. An increase in pressure at constant temperature increases the

solubility by increasing the solvent density and an increase in temperature at constant

pressure reduces the solubility, decreasing the CO2 density. Laurie L. Williams has

integrated the variation of pressure and temperature on the solubility parameters using

128

equation of state (EOS) in order to evaluate the influence of pressure and the temperature

on the solubility properties of supercritical CO2. Hence, the solubility parameters of the

supercritical CO2 were calculated using the equation developed by this authors (Srinivas et

al., 2010b; Williams et al., 2004):

Equation 6.4

𝛿2 =

[

𝛿𝑑𝑟𝑒𝑓


−1.25

] 2

+

[

𝛿𝑝𝑟𝑒𝑓


−0.5

] 2

+

{

𝛿ℎ𝑟𝑒𝑓

𝑒𝑥𝑝 [−1.32 × 10−3(𝑇𝑟𝑒𝑓 − 𝑇) − 𝑙𝑛 (𝑉𝑟𝑒𝑓𝑉 )

0.5

]}

2

where:

δ2= solubility parameters depending of density; V = Molar Volume, cm 3/mol (Variable);

𝛿d ref = (15.6)2 Mpa1/2(constant); T ref = 25 °C (Constant); 𝛿p ref = (5.2)2 Mpa1/2(constant);

T = temperature of the table corresponding molar volume used (°C) (Variable); 𝛿h ref =

(5.8)2 Mpa1/2 (constant); V ref = 39.13 cm3/mol (constant); V = Molar volume study,

depending on the pressure/temperature combination (cm3/mol)

The density chosen in the equation corresponds to an applied pressure of 905 bars at 25°C

on the solvent. This combination resulted in a molar volume of 39.13 cm3/mol.

For solvent optimization based on Hansen solubility parameter (HSP), the relative energy

difference between the supercritical solvent at a specific density and the solute has been

calculated. Each solvent density exhibiting distinct solubility parameters.

RED (Relative energy difference) between the solvent and the solute is calculated using

the following equation, to determine their miscibility.

129

Equation 6.5

𝑅𝐸𝐷 = 𝑅𝑎

𝑅𝑜

Where Ro is the radius of the sphere of Hansen lutein or chlorophyll and Ra is the distance

between the solute and solvent from the center of the sphere.

Ra is obtained using the following equation:

Equation 6.6

𝑅𝑎2 = 4(𝛿𝐷1 − 𝛿𝐷2)2 + (𝛿𝑃1 − 𝛿𝑃2)2 + (𝛿𝐻1 − 𝛿𝐻2)2

Where D1 is the solute (lutein or chlorophyll) and D2 is the solvent. The number 4 is based

on Prigogine’s corresponding state theory. In this case, this factor is useful to give spherical

plots (Hansen, 2000).

Ra refers to the distance of the solute or solvent from the center of mass of the Hansen

solubility sphere. Less is the distance between the solute and the solvent and higher is the

solubility between them. A solvent is considered superior if the RED value is between 0

and 1, medium if the value is comprised between 1 and 2 and beyond 2 the solvent is

considered as poor (Hansen and Poulsen, 2007; Yara-Varón et al., 2016).

6.5.3 Solute solubility parameters determination

Solubility parameters of lutein were obtained using the Yamamoto Molecular Breaking

Method (Y-MB) program from HSPip, version 4.0, using group contribution method after

an online search of the Simplified Molecule Input Line Entry Specification (SMILES) of

this molecule. Solubility parameters of chlorophyll was obtained from the literature

(Hansen and Poulsen, 2007).

130

6.6 Results

6.6.1 Experimental results

6.6.1.1 Characterization of lutein and chlorophyll from Spinach

Characterization of the total amount of lutein and chlorophyll was performed using acetone

as the extraction solvent. The obtained extract was further analyzed by HPLC-UV. The

results showed that the spinach used for the experiment had a total concentration of 9

mg/100g FW for lutein and 120 mg/100g FW for chlorophyll.

This characterization was used as a reference for the comparison of extraction yield

between a conventional extraction and supercritical fluid extraction using CO2 as solvent.

The yield of these molecules was expressed in % of the total amount of lutein and

chlorophyll found using acetone, using the following formula:

Équation 6.7

Yield of lutein or chlorophyll (%)

= (𝑎𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑜𝑓 𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑜𝑟 𝑐ℎ𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝ℎ𝑦𝑙𝑙 𝑜𝑏𝑡𝑎𝑖𝑛𝑒𝑑 𝑤𝑖𝑡ℎ 𝑆𝐹𝐸 (

𝑚𝑔100𝑔 𝐹𝑊)

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑎𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑜𝑓 𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑜𝑟 𝑐ℎ𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝ℎ𝑦𝑙𝑙 (𝑚𝑔100𝑔 𝐹𝑊)

) × 100

6.6.2 Effects of extraction parameters

Response surface methodology (RSM) is a powerful statistical method used in order to

optimize experimental parameters influencing the extraction of lutein and chlorophyll. The

results obtained clearly indicated that the co-solvent, the time, and the pressure have a

significant effect on the recovery of lutein and chlorophyll (-value<0.05). The

temperature did not have a significant effect on the extraction yield (-value>0.05). Also,

without co-solvent, it is observed that SC-CO2 exerted a poor to medium solvent capacity

for molecules presenting certain polar characteristics which was the case for lutein and

chlorophyll. The pressure has an important impact on the recovery of these compounds. At

100 bar and 3h of extraction, only a low amount of lutein and chlorophyll were extracted

(respectively 1 and 0%), in comparison with 300 bar (respectively 2.7% and 0.11%) or 500

bar (respectively 15% and 5%). At 5h and 500 bar, we were able to extract 31% of the

lutein and 0.47% of the chlorophyll. This observation also showed that lutein exhibit better

extraction yield than chlorophyll in SC-CO2 without co-solvent addition. The extraction

131

time exerted a quadratic effect on the chlorophyll recovery with a -value<0.05. This fact

is in accordance with the first results observations, showing an increase extraction

efficiency when the pressure increases until 3h and after a decrease of the extraction yield.

Chlorophyll indeed exhibited a higher sensitivity for the extractions conditions than lutein.

The lutein extraction time parameters exhibit a linear effect, showing an increase of the

extraction efficiency with extraction time. The pressure exerted also a quadratic effect on

the extraction yield of both lutein and chlorophyll (-value<0.05). This fact can be

explained by the porous matrix of spinach that at higher pressure starts to decrease, limiting

the mass transfer (Cavalcanti et al., 2012). The experimental results showed also that the

use of a co-solvent in the extraction process lead to an efficient extraction yield of both

lutein and chlorophyll, with a maximum yield obtained for lutein up to 75% and 70% for

chlorophyll (Table 6.1, experiments 4 and 20).

The coefficients estimated were put into the generalized model in order to predict a

quadratic polynomial equation describes as follow, neglecting the insignificant terms:

Lutein:

Equation 6.8

Υ = −8.28 + 2.65 × 𝑋1 − 0.00003 × 𝑋3𝑋3 − 0.003 × X3X1

R2=0.9 with a -value of the total model less than 0.05 (0.001) showing the high

significance of the present model; lack of fit -value<0.05 (0.3) showing that the model

fits the data.

Chlorophyll:

Equation 6.9

Υ = −4.20 − 0.35 × 𝑋1𝑋1 − 0.00006 × 𝑋3𝑋3 + 0.001 × X3X2

R2=0.9 with a -value of the total model less than 0.05 (0.0009) showing the high

significance of the present model; lack of fit -value<0.05 (0.06) showing that the model

fits the data.

132

Table 6-1: Experimental results of ScCO2 extraction of lutein and chlorophyll

Coded and uncoded Variables Lutein

yield

(%)

Chlorophyll

yield (%) Run

No

𝑿𝟏

(time,

h)

𝑿𝟐

(temperature,

°C)

𝑿𝟑

(pressure,

bar)

𝑿𝟒

(modifier,

%)

1 -

1

(1) -1 (40) 0 (300) 0 (5) 7.02 4.92

2 1 (5) -1 (40) 0 (300) 0 (5) 33.78 8.87

3 -

1

(1) 1 (60) 0 (300) 0 (5) 23.90 3.38

4 1 (5) 1 (60) 0 (300) 0 (5) 78.22 18.74

5 0 (3) 0 (50) -1 (100) -1 (0) 1.12 0.04

6 0 (3) 0 (50) 1 (500) -1 (0) 15.75 5.29

7 0 (3) 0 (50) -1 (100) 1 (10) 24.70 10.19

8 0 (3) 0 (50) 1 (500) 1 (10) 63.83 44.23

9 -

1

(1) 0 (50) -1 (100) 0 (5) 0.00 0.00

10 1 (5) 0 (50) -1 (100) 0 (5) 19.52 0.36

11 -

1

(1) 0 (50) 1 (500) 0 (5) 18.08 1.92

12 1 (5) 0 (50) 1 (500) 0 (5) 45.54 19.59

13 0 (3) -1 (40) 0 (300) -1 (0) 29.79 1.09

14 0 (3) 1 (60) 0 (300) -1 (0) 3.82 0.32

15 0 (3) -1 (40) 0 (300) 1 (10) 60.06 59.75

16 0 (3) 1 (60) 0 (300) 1 (10) 43.26 23.92

133

6.6.3 Computational results

6.6.3.1 Molecules solubility

The Hansen solubility parameters and the chemical structure of lutein and chlorophyll are

presented in table 6.2. Chlorophyll exhibit a higher hydrogen interaction than lutein (𝛿ℎ2 =

18.2 and 4 Mpa1/2 respectively), demonstrating more polar characteristics than lutein. This

observation is in concordance with the structure and the literatures reported on the

physicochemical properties of these molecules (Arnold et al., 2014; Hörtensteiner and

Kräutler, 2011). Indeed, these two compounds are reported to be non-polar, with

chlorophyll slightly more polar than lutein.

17 -

1

(1) 0 (50) 0 (300) -1 (0) 2.72 0.11

18 1 (5) 0 (50) 0 (300) -1 (0) 31.48 0.48

19 -

1

(1) 0 (50) 0 (300) 1 (10) 13.75 6.20

20 1 (5) 0 (50) 0 (300) 1 (10) 53.90 71.02

21 0 (3) -1 (40) -1 (100) 0 (5) 5.44 3.29

22 0 (3) 1 (60) -1 (100) 0 (5) 3.39 0.00

23 0 (3) -1 (40) 1 (500) 0 (5) 21.12 11.48

24 0 (3) 1 (60) 1 (500) 0 (5) 74.71 31.56

25 0 (3) 0 (50) 0 (300) 0 (5) 38.99 19.42

26 0 (3) 0 (50) 0 (300) 0 (5) 28.99 14.38

27 0 (3) 0 (50) 0 (300) 0 (5) 54.73 22.02

134

Tableau 6-2: Structures and hansen solubility parameters of Lutein and Chlorophyll

Solute

Hansen solubility

parameters (Mpa)1/2

𝜹𝒅 𝜹𝒑 𝜹𝒉

Lutein

17.7 1.2 4

Chlorophyll

20.2 15.6 18.2

135

6.6.3.2 SC-CO2 solubility based on computational methods

The first results of the computation showed that the temperature did not exert a significant

effect on the solubility of SC- CO2. This result was also in concordance with our first

experimental results. The model exhibited also that an increase of the extraction pressure

increases the solubility parameters of the SC-CO2. Indeed, an increase of the pressure leads

to a decrease of the distance separating the solvent molecules, rising the density of the

liquid. As the density increases, the solvent extraction selectivity decreases, allowing the

extraction of molecule which did not exhibit a good solubility when atmospheric condition

apply. This is the case for the SC-CO2, exhibiting at lower pressure higher selectivity

characteristics, enabling the extraction of more non-polar compounds. When the pressure

is increased, the solubility of the SCF enable the extraction of more polar molecules by

decreasing the selectivity of the solvent leading to a rise of the solvent capacity (table 6.3).

6.6.3.3 RED

Table 6.3 show the distance, i.e the radius of the Hansen space, between the 2 selected

compounds and reference solvents. For lutein, hexane was chosen as a reference solvent,

because of its high solubility. The Ra between lutein and hexane was 6.98, corresponding

at a RED of 1. For chlorophyll, the reference solvent was ethanol, because of its high

affinity for chlorophyll. The distance between this solvent and the chlorophyll was 11.18,

with a RED of 1.04. These two Ra solvents were used as Hansen solubility space Radii

(Ro) and then the distance between the compounds and the solvents were compared to this

chosen Ro. At 100 bar, the Ra of the lutein is higher than at 500 bar (21.18 and 10.31 MPa

respectively), corresponding at a RED value of 1.93 at 100 bar and 1.47 at 500 bar. The

same trend was observed with chlorophyll, which at 100 bar exhibited a Ra value of 30.98

MPa, corresponding at a RED value of 2.81 and at 500 bar a Ra value of 21.58,

corresponding at a RED of 1.96 (Table 6.4 and 6.5).

136

Table 6-3: Hansen solubility parameters of CO2 at different conditions

CO2

conditions

Hansen solubility parameters (MPa)1/2 V (cm3/mol)

𝜹𝒕 𝜹𝒅 𝜹𝒑 𝜹𝒉

100 bar 40°C 9.45 7.50 3.88 4.23 70.01

200 bar 40°C 12.66 10.78 4.48 4.90 52.41

300 bar 40°C 13.78 11.91 4.66 5.10 48.37

400 bar 40°C 14.52 12.68 4.78 5.23 46.03

500 bar 40°C 15.10 13.26 4.87 5.32 44.40

25°C 905 bar

(reference)

17.51 15.6 5.2 5.8 39.13

137

Table 6-4: Distance and solubility of lutein and chlorophyll in different conventional

solvents

solvents

Lutein

Chlorophyll

Ra (MPa)1/2 RED Ra (MPa)1/2 RED

Ethanol 17.58 2.44 11.18 1.04

Acetone 10.63 1.54 15.51 1.44

Hexane 6.98 1.01 26.20 2.43

138

Table 6-5: Distance and solubility of lutein and chlorophyll at different pressure

condition of ScCO2

6.7 Discussion Solvent selection is based on the solubility properties and also on the polarity

characteristics of the molecule studied. Nevertheless, the regulations and consumers also

have a great influence on solvent selection, drastically limiting the choices available. Due

to complexity of plant matrix, the modelization of solubility in supercritical fluids can be

difficult. This is why authors focus on the solubility of a molecule or oil in supercritical

CO2. Modern thermodynamic models are able to guide the choice of the experimenter for

SFE chosen

conditions

Lutein

Chlorophyll

Ra (MPa)1/2 RED Ra (MPa)1/2 RED

100 bar 40°C 21.18 3.02 30.98 2.81

200 bar 40°C 14.88

2.12 25.37 2.30

300 bar 40°C 12.75 1.82 23.57 2.14

400 bar 40°C 11.36 1.62 22.42 2.03

500 bar 40°C 10.31 1.47 21.58 1.96

905 bar 25°C

(reference)

6.83 0.62 18.7 1.70

139

seeking the greener solution. Hansen solubility parameters theory, based on the strengths

of cohesions molecules, is largely used in laboratory and industry for determination of the

solubility of two compounds, for formulation of paints, cosmetics and chemicals. This

method is used for seeking the most efficient way of how dissolving a solid in a suitable

solvent. The solubility parameters of Hansen precisely help the choice of solvent from

hundreds, without wasting time in the experimentation of each solvent following a random

approach (Hansen, 2004).

The computational and experimental results and observations help us to understand and

observe the solubility of lutein and chlorophyll in the supercritical solvent. The

manipulation of pressure caused major variations in the density of the solvent, leading to a

major change in the solvent capacity of SC-CO2 (Cavalcanti et al., 2012). This fact was

observed both in computational and experimental system, showing that higher pressure

causes higher solubility of lutein and chlorophyll in the solvent. At 100 bar, only few

amount of lutein was extracted and no chlorophyll was observed while at 500 bar, higher

amount of lutein and chlorophyll were noticed. Computational method reported the same

trend, showing that both experimental and theoretical methods was in accordance.

Lutein and chlorophyll exhibit medium and low solubility in SC-CO2. The polarity of lutein

is less than that chlorophyll, resulting in a higher solubility in SC- CO2. This characteristic

is corroborated by the literature and also by the Hansen solubility parameters results of

these two compounds, were chlorophyll was found to possess more hydrogen bounding

than lutein (see Table 6.1). Our both computational and experimental results was in

accordance with these observations and even at a higher pressure, the SC-CO2 is a poor

solvent for the extraction of chlorophyll. The experimental results showed that the use of a

co-solvent in the extraction process lead to an efficient extraction yield. Modifier enhance

the extraction yield by a direct effect between the co-solvent and the solute and an indirect

effect related to the interaction between the solvent and the co-solvent, by a rise of solvent

capacity (Cavalcanti et al., 2012).

Hansen solubility theory was used by several authors in order to find greener solvent than

the use of hexane in the carotenoid extraction and also to seek a suitable predictive method

in the extraction of bioactive compounds from subcritical water (Srinivas et al., 2009; Yara-

140

Varón et al., 2016). This method was found acceptable and efficient in the prediction and

optimization parameters for the extraction of compounds. In our case, this method was well

corroborated by experimental results and by the literature, given a suitable qualitative

method to seek optimum extraction conditions in SC-CO2. This method allows to save a

considerable time to the operator and a lot of energy by limiting experimental tests. To our

knowledge, this is the first time that Hansen solubility parameters was applied to optimize

the extraction parameters of carotenoid and chlorophyll in a supercritical media. This

method can be applied to a wild range of supercritical extraction of phytochemicals.

6.8 Conclusion The aim of this study was to develop a predictive approach using Hansen solubility

parameters theory, in order to predict the solubility of phytochemicals, with the example

of lutein and chlorophyll in SC-CO2. The model was able to predict the optimum pressure

for the extraction of interested compounds. Indeed, the computational method exhibited

that the best extraction condition for lutein and chlorophyll were at 500 bar, with a RED of

1.47 and 1.96 respectively. These results indicated that the SC- CO2 can be a medium

solvent for lutein and a poor solvent for chlorophyll as the RED value is higher than 1.5 in

the latter case. The experimental results exhibited the same trend by showing a better

extraction efficiency for both molecules at 500 bar, but without adding co-solvent the

recovery of these molecules was difficult, especially for chlorophyll. The computational

results were in accordance with experimental results, as they were able to predict that the

lutein and chlorophyll exhibit respectively a medium to poor solubility in this solvent.

Work on plant matrices is not an easy task due to many factors influencing the solubility

of the molecule present in the matrix, not included in the various thermodynamic models

available.

6.9 Acknowledgements

This project was funded by the Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de




141

(CRSNG) from Canada for BMP-Innovation PhD fellowship. The authors would like to

thank, Perrine Feutry & Véronique Richard, Chemists, for the chemical expertise, and

Gaetan Daigle, M.Sc for his statistical support.

142

7 Supercritical fluid extraction from spinach by-products: process design and economic analysis

143

7.1 Transition contextuelle Différents procédés d’éco-extraction de la lutéine et de la chlorophylle à partir de sous-

produits d’épinards ont été développés dans les chapitres précédents par un procédé

conventionnel utilisant un système de solvants verts (eau, éthanol, NaOH) ainsi que par un

procédé d’extraction par CO2 supercritique (SC-CO2). L’extraction par SC-CO2,

permettant l’extraction du meilleur rendement en matière ainsi que l’obtention des extraits

les plus concentrés en lutéine et en chlorophylle (respectivement 2,4% et 20% dans

l’extrait) a été retenue. De fait, ce chapitre porte sur l’étude de la faisabilité industrielle,

soit technico-économique du procédé d’extraction par fluide supercritique et permettra de

fait, d’évaluer les différents coûts associés à l’investissement d’un tel équipement ainsi que

les coûts de productions associés à l’obtention des extraits.

Ce chapitre est présenté sous la forme d’un article intitulé : « Supercritical fluid extraction

from spinach by-products : process design and economic analysis ». Il sera prochainement

soumis au Journal of Supercritical Fluids


l’interprétation, la discussion et à la rédaction de l’article. Le Dr Paul Angers, directeur de

la thèse, et les Dr André Gosselin, Yves Desjardins, Yacine Boumghar, co-directeurs de la

thèse ont participé à la planification des travaux de recherche, à la discussion des résultats

lors de réunions ainsi qu’à la révision de l’article présenté. Le Dr Milad Aghabaranejad a

réalisé la simulation du procédé sur Aspen, a participé à l’interprétation et à la discussion

des résultats, ainsi qu’à la révision du présent article.

144

7.2 Résumé L’extraction par fluide supercritique est largement utilisée pour l’obtention d’extraits

phytochimiques, mais le coût d'investissement élevé de cette méthodologie est souvent un

facteur limitant pour la mise en œuvre de ce processus à l'échelle industrielle. L'épinard est

connu comme une excellente source de composés phytochimiques, en particulier en

lutéine, en chlorophylle et en polyphénols. L'ajout de co-solvants pour l'extraction de ces

molécules est nécessaire, connu pour augmenter les coûts de production et

d’investissement du procédé supercritique. Ainsi, la simulation du procédé à l’échelle

industrielle et son analyse économique ont permis de conclure sur sa faisabilité et sa

rentabilité à l’échelle industrielle. Les résultats ont montré que la production de 911 kg

d’extraits par an concentrés à 2.4% de lutéine et 20% de chlorophylle engendrait un coût

d’investissement total de 5 555 000 USD, avec un coût de production annuelle estimé à

1 800 000 USD.

145

7.3 Abstract SC-CO2 is widely used for the recovery of high value extracts, however, the high

investment cost of this methodology is often a limiting factor for the implementation of

this process in an industrial scale. Spinach is known as a great source of phytochemicals,

especially in lutein, chlorophyll and polyphenol. The addition of modifier for the extraction

of these phytochemicals was needed, known to increase the capital and production cost of

SC-CO2 process. Thus, process design and economic analysis of the process using Aspen

was used to conclude about the viability and the feasibility of the eventual SC-CO2

proposed process for the replacement of conventional one for the extraction of lutein and

chlorophyll from spinach by-products. For the production of 911kg of extract concentrated

at 2.4% of lutein and 20% of chlorophyll each year, corresponding to the supercritical

extraction of 33 tone of dried material, a total capital investment (TCI) of 5,555,000 USD

was calculated, along with a yearly production cost estimated at 1,800,000 USD.

146

7.4 Introduction Supercritical carbon dioxide extraction (SC-CO2) is a sustainable and innovative

technology widely used for the recovery of naturals compounds from vegetable matrices.

Decaffeination of coffee and tea provides a good example of the application of SC-CO2 in

replacement of harmful petrochemical solvents. Until the middle of the 70’s,

dichloromethane and ethyl acetate were the solvents used for this purpose. Because of the

high negatives and harmful impacts of these solvents on the environment and the human

health, SC-CO2 has been adopted by industrials for their sustainable replacement. Another

prime example of SC-CO2 commercial application is the extraction of edible oils, usually

obtained using hexane, known for its hazardous and flammability proprieties. SC-CO2 was

selected as its solubility properties can be compared to those of hexane and thus allowing

the production of extract with close chemical characteristics of those obtained by this

harmful solvent. SC-CO2 has been also selected for the production of nicotine from

tobacco, the extraction of aroma, flavors and the production of hops extracts for the

brewing industry (Hunt et al., 2010). Several authors have explored the utilization of SC-

CO2 for extraction from plant matrices, studying several aspects of the extraction process

like optimization of extraction conditions, kinetics and modeling (de Melo et al., 2014;

Silva et al., 2014).

The high investment cost of SC-CO2 factory is often a limiting factor for the

implementation of this technology at the industrial scale. Besides requiring a high capital

investment, the extraction process exhibit sometimes a high operating cost, depending of

the raw material being proceed. In addition, phytochemicals from vegetables often

occurred to possess high polarity, while the supercritical solvent exhibit low polarity. Thus,

the extraction of more polar compounds, like polyphenols, glucosinolates, chlorophyll and

some carotenoids (lutein) required to modify the polarity of the supercritical solvent

through an addition of a modifier (Farías-Campomanes et al., 2015). However, modifier

utilization during the process present major impacts on the capital and the production costs

of the factory (Pereira et al., 2013).

Thus, techno-economic analysis of the process is widely used to conclude about the

viability and the feasibility of the eventual industrial application of proposed process for

147

the replacement of conventional ones. Several economic evaluations have been done the

last years regarding SC-CO2 factory from several biomasses. These studies demonstrated

that in many cases, the replacement of petrochemicals solvent using SC-CO2 is viable and

more economically attractive. This happened for the production of essentials oil from

rosemary, for which a conventional process required a costly distillation step leading to a

cost of manufacturing of 77USD.kg of extract, compared to 30 USD.kg using SC-CO2

(Pereira et al., 2013). This process is also recommended for unstable and thermolabile

molecules, subject to degradations when exposed to extraction conditions (Pereira and

Meireles, 2010). Lutein and chlorophyll are found to be sensitive at higher temperature,

light and acidic medium, prone to isomerization and oxidation (Arnold et al., 2014; Derrien

et al., 2017).

Spinach is known as a great source of phytochemicals, especially in lutein, chlorophyll and

polyphenol. These phytochemicals have been widely study for their health benefits. Also,

several studies reported the spinach extracts activities on the human and animal health,

based on in vitro and in vivo studies (Roberts and Moreau, 2016). Lutein and chlorophyll

exhibit indeed antioxidant, anti-inflammatory, anti-mutagen and anti-genotoxique

activities. Native chlorophyll may act against the colorectal cancer incidence and the lutein

against the age related macular degenerescence (AMD). Current production of carotenoid

and chlorophyll still used high quantity of petrochemical solvents (hexane and methanol)

for the process (Fernández-Sevilla et al., 2010; Gong and Bassi, 2016).

Previously we did many experiments on the optimization of the extraction of lutein and

chlorophyll by SC-CO2 from spinach by-products to seek the influence and the optimum

extraction parameters for the recovery of these two compounds. Utilization of modifier was

required for this purpose because of their intermediate solubility’s in this solvent. The

extracts obtain by SC-CO2 had high concentration in lutein and chlorophyll and then were

intended to the functional food market for human and animal nutrition.

The objectives of the present study are to evaluate the feasibility and the applicability of

this process in a scale up level for the production of high value added spinach extracts, rich

in lutein and chlorophyll. A designed process is proposed, along with an economic and

profitability analysis.

148

7.5 Modeling

7.5.1 Raw material: Spinach by products

Spinach by-products were provided by VegPro International (Sherrington, QC; Canada)

and were selected among the production as they did not fit to the commercial criteria and

were destined to wastes. The annual spinach production in Canada was estimated at 5611

tons in 2014, with an estimated waste as high as 25%, corresponding to around 1400 tones

destined to waste each year (FAO stat). Freeze dried spinach by-products were stored

protected from light and under vacuum since lutein and chlorophyll are highly sensitive to

O2, light and heat. For ensure of the stability of the raw material, spinach was stocked at

- 20°C in order to slow or stop the enzymatic and oxidative reactions inside the matrix.

7.5.2 Operational conditions

Data were obtained from preliminary experiments performed on a laboratory SC-CO2 unit

from Thar technologies (Pittsburg, Pennsylvania, USA). The goal of these experiments was

to obtain a high quality spinach extract using green technology and renewable sources. The

influence of extraction parameters was tested through a response surface methodology

(RSM) approach. Several levels of extraction time, pressure, temperature and modifier

concentration were studied using a box Behnken design. The optimum extraction

parameters for the most efficient recovery of extract containing high level of lutein and

chlorophyll were seek using a mathematical function name desirability function. Thus, the

optimized extraction conditions were used in the large scale design factory. Economic

evaluation was then performed in order to evaluate the feasibility of a large scale process

regarding the production of extract rich in lutein and chlorophyll from spinach by products.

The design scale-up process was performed using a process simulation software: Aspen

Plus, V. 8.8.

7.5.3 Process model and extraction system: equipment capacity

The process model was based on the assumption that the optimum extraction time and the

obtain yield are similar to laboratory scale if the parameters of solvent to feed ratio are kept

constant, as reported by several authors (Pereira et al., 2013; Prado et al., 2011, 2012). The

flowsheet is provided in figure 7.1. The CO2 flow rate was 14.3 kg/min and for modifier

was 1.43kg/min. The operating conditions used to run the simulation are exhibited in table

149

7.1. Also, process modeling and economic feasibility required information regarding the

behavior of the solutes in the supercritical solvent. Phase equilibrium calculations were

performed using SRK (Soave-Redlich-Kwong) as thermodynamic model, one of the most

used in the literature in the determination of thermodynamic equilibrium related to SC-CO2

(Cavalcanti et al., 2012). This model is based on the cubic equation of state and used the

volume, pressure, temperature and the composition of the system to determine the

equilibrium between the phases.

The factory was designed for a processing capacity of 33 tons of dried raw material per

year, representing 330 tons of fresh material, and consisted in 3 distinct blocks: the

extraction section, the separation section and the modifier distillation and recycle section.

150

Tableau 7-1: Operating conditions used to run the simulation

Industrial units

2 reactors (0.4 m3)

Depreciation rate 10 %

Labor (USD/h) 20

Raw material (USD/kg)

Spinach (by products)

Milling and drying

Cultivation, transportation, freezing

CO2 (2% loss)

Ethanol (modifier)

agro-industrial residue

0,5

1

0,15

0,22

Utilities (USD/h)

Electricity

Cooling water

Steam

Cooling

5,6

0,02

0,16

3,48

Operating conditions 216 min; 39Mpa; 329,15K; 10% modifier

Annual operating time 24h/d; 330d/year; 7920h

Separating conditions

Batch density

50 bar, 35 oC

83kg.m3

Scale-up method

Constant ratio between raw material mass and CO2

flow rate (Mezzomo et al., 2011)

151

7.5.4 Description of the extraction section

During the extraction process, liquid CO2 is passed through a cooler (Cooler 1) before the

passage in the pump (P-CO2). This cooling step is required to avoid the cavitation of the

pump. After P-CO2, the solvent has reached the desire extraction pressure and the modifier,

which was ethanol, is added to the system by another pump (P-SOLV). CO2-ethanol

mixture is then heated by a heat exchanger (HX-MAIN) to the selected extraction

temperature before passing through the reactors, working in parallel. In the reactor, the

supercritical solvent is passed through the fixed bed. The yield obtain in function of time

was calculated in previous experiments done in our laboratory and the result were set up in

Aspen.

7.5.5 Description of the separation section

The separation step between CO2 and the extract was simulated using an expansion valve

(BPV-1). The extract is then precipitated in the separator (SEP-1), were the pressure and

temperature were settled up at 50 bar and 35°C. The CO2 were finely cooled down at 4°C

by the cooler 1 and used again for another extraction cycle.

7.5.6 Description of the modifier separation and recycle section

The modifier was separated from the extract by a distillation in the experimental process.

With Aspen, this part was simulated using a back pressure (BPV-2) in order to decrease

the pressure from 50 bars to a vacuum pressure of 0.25 bar followed by an evaporation step

of ethanol (HX-2). The vacuum is supplied by a vacuum pump (COMP). The final extract,

free of any solvent was collected in the separator 2. The modifier was then condensed by

COND and then reached the initial modifier pump (P-SOLV), ready to use for another

extraction cycle. The design factory is presented in figure 7.1.

152

Figure 7-1: Process flow diagram of the design factory

7.6 Economic analysis The capital cost of the factory, which was the expenses related to the cost needed for the

construction of the factory, was estimated using the process flow diagram (PFD) simulated

on Aspen. The PFD integrated the material of construction selected, the energy balance of

each major piece of equipment and the sizing of the pieces composing this factory.

The methodology developed by Turton et al have been used in the present study to estimate

the manufacturing costs (Richard Turton, Richard C. Bailie, Wallace B. Whiting, 2013).

The total cost of investment (TCI) included the cost related to the building, (FCI) and the

working capital, which are the capital required to start up the factory, assumed to be 15%

of the TCI. Then, the fixed capital was calculated as follow:

153

Equation 7.1

FCI= 0,85TCI

The operating costs, related to the costs required to the factory to yearly operate, was

estimated by means of the sum of direct manufacturing costs (DMC), fixed manufacturing

cost (FMC) and general expenses (GE):

Equation 7.2

𝑂𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔 𝑐𝑜𝑠𝑡 = 𝐷𝑀𝐶 + 𝐹𝑀𝐶 + 𝐺𝐸

The DMC are the expenses directly affected by the production efficiency. This category

included the cost of raw material (CRM), the cost of waste treatment (CWT), utilities

(CUT), and the cost of operating labor (COL).

Equation 7.3

𝐷𝑀𝐶 = 𝐶𝑅𝑀 + 𝐶𝑈𝑇 + 𝐶𝑊𝑇 + 𝐶𝑂𝐿

The CRM included the vegetable material used for the extraction and CO2 lost during the

process, due to depressurization of the extractor at the end of each batch. The modifier,

which was ethanol, was also part of this category. The cost of CO2 was assumed to be 0.15

USD/kg and those of ethanol to be 0.22USD/kg based on literature data (Mezzomo et al.,

2011). The CWT was neglected in the simulation because the spinach used for this work

as vegetable matrices did not contain any toxic substances and can be used after the

extraction process for other applications, like its incorporation into the soil as fertilizer or

commercialized as a by-product for animal feeding and was then assumed to be recycled.

Also, all the solvents used during the experiments were recycled after the extraction. The

CUT integrated the cost of energy from the condenser, cooler, heat exchanger, pumps,

compressors used for the extraction and distillation process and were estimated by the

software. The COL was estimated based on the capacity of the reactor and was 1 operator

for each reactor. Also, the labor time for the maintenance of the factory was estimated

approximately as 4h of extraction and 4h for recharging, cleaning and charging the reactor.

It was admitted that the factory will run 7920h per years, corresponding to 330 days, 24h

per day, with 30 days reserved for the maintenance of the equipment, as reported in several

similar studies (Pereira and Meireles, 2010) (Table 7.1).

154

The FMC are the expenses related to the depreciation of the factory, the local taxes and

also the insurance. These two costs are directly related to the FCI, and were calculated

using the following formulas as reported in the Turton methodology (Richard Turton,

Richard C. Bailie, Wallace B. Whiting, 2013):

Equation 7.4

Local taxes and insurance = 0.032FCI

The yearly depreciation (dk) was calculated using the straight line methods, given each

year an equal amount of money charged for the life plant.

Equation 7.5

𝑑𝑘 =[𝐹𝐶𝐼 − 𝑆]

𝑛

with S, the salvage value, assumed to be 0 and n, the life plant, generally admitted to be 10

years for chemical industries.

The general expenses (GE) are related to the administrative costs of the plants as well as

the costs related to the distribution and selling department and the research and

development.


7.7.1 Selection of operating conditions

The extraction parameters, i.e., the extraction time, pressure, temperature, modifier

concentration and the solvent to feed ratio were optimized using a response surface

methodology and desirability function. These statistical tools are very convenient in order

to seek the influence of several independents variables (extraction parameters) on a

dependent variable (extraction of lutein and chlorophyll). Also, the desirability function

was useful in the determination of the optimum extraction condition, found to be at 3.6h,

56°C, at 390 bar and 10% of modifier. Figure 7.2 exhibited the influence of extraction time

and pressure on the recovery of the extract. It was found that the time exerted a great

influence on the recovery of our molecules and was optimized with the desirability function

155

at 3.6 h. Small variations in solutes recovery were observed after, due to the decrease of

the solutes concentration in the solid matrix, leading therefore to the reduction of mass

transfer capacity (Farías-Campomanes et al., 2015; Sovová et al., 2004). Indeed, after this

period, diffusion controlled extraction period take place, because the majority of the easily

accessible solutes were extracted within the optimal extraction time. The optimal time is

an important parameter in the cost estimation. Indeed, prolonged time of extraction will

enhance the cost of manufacturing without enhancing in a significant way the recovery of

extract. Optimized conditions will lead then to the higher yield and also to lower utilities

and fixed cost (Pereira et al., 2013). Also, the results have shown that the addition of a

modifier is an important step in the recovery of extract from spinach. This phenomenon is

well described with the chromatograms available on figure 7.3, where when no modifier is

added, the recovery of biomolecules, along with the extract yield are very low (close to 0%

at 100 bar, figure 7.3.A) even at higher pressure (500 bar, figure 7.3.B). The addition of

10% of modifier enable the recovery of 60% of lutein and chlorophyll (figures 7.3.C and

7.3.D), with an extraction yield around 2.5%. These results are in correlation with the

intermediate solubility characteristics of the lutein and chlorophyll. Indeed, several authors

reported the necessity of adding modifier for the extraction of these compounds using SC-

CO2 (Macías-Sánchez et al., 2007; Mattea et al., 2009).

156

Figure 7-2: 3D plots exhibiting the influence of pressure and temperature on the

extraction yield

157


obtained at different extraction combination parameters, with and without modifier,

at 450 nm by UV/vis detector. Peak identification: (1) lutein (2) 𝛽-caroten (3) chlorophyll b (4)

chlorophyll a.

158

7.7.2 Economic analysis

7.7.2.1 Investment and capital cost

The total capital investment was estimated using AspenPlus, which was used for design

the process and collected information regarding the sizing and the value of the equipment

of the plant. The TCI was then estimated for a plant equipped by 2 reactors with a capacity

of 0.4m3 to be 5,555,000 USD. This price was comparable with those of similar process

simulated by Solana et al, which designed a supercritical plant involving water as cosolvent

for the extraction of glucosinonates from rocket salad. Thus, their supercritical system was

composed by 3 main parts included a modifier drying section. This author reported a TCI

of 5,344,313 USD for the total plant (Solana et al., 2016). This result were also comparable

with those from Fiori et al, (Fiori, 2010), with a process estimated to be 4,650,000 USD.

The fixed capital investment represent the part of the total capital related to the plant

building, without the cost of working capital, and was assumed to be 85% of the TCI

(4,721,240 USD), as it is indicated in the economics methodology developed for chemical

process by Turton et al. (Richard Turton, Richard C. Bailie, Wallace B. Whiting, 2013).

This term included then the depreciation of the plant, for a 10 years’ life class, like it is

estimated for chemical process. Based on that result, the depreciation was calculated using

the straight line method described also by Turton and al (Richard Turton, Richard C. Bailie,

Wallace B. Whiting, 2013)and were found to be 472,124 USD per year, corresponding to

the repayment of the initial investment.

7.7.2.2 Operating cost

The results are provided in table 7.2. The total yearly cost of the simulated plant has been

estimated at 1,800,000 USD. This value is comparable with those find in the literature for

similar plants. Indeed, Fiori et al estimated the yearly manufacturing cost to be 1,800,000

(Fiori, 2010) and Solana et al 1,542,000 USD per year (Solana et al., 2016). Also, in their

literature survey, Martinez et al reported that with similar capacity of supercritical plant,

the operation cost for clove production were found to be around these last results, with

(Martinez et al., 2007). If we considered only the costs directly related to the production

(DMC), the yearly costs were estimated at 1,000,000 USD (Table 7.3). The DMC can be

subdivided in several categories, as explained in the methodology, were the cost of raw

159

material exhibited the most important part (53%), followed by the maintenance and repairs

(26%), cost of labor (14%), Utilities (3%) and direct supervisory (3%) (figure 7.5).

Figure 7-4: Direct manufacturing cost repartition, in percentage

The cost of labor represented an important part of direct manufacturing costs (158,400

USD). Comparing the results based on literature survey, the COL in most cases do not

exceed 15% of the COM. Also, the majority of the available studies in the literature were

performed in Brazil (Pereira and Meireles, 2010; Vardanega et al., 2017), exhibiting a very

low medium salary compared with those from North America. Indeed, in Brazil the

medium salary was found around 6 USD/h instead of 20USD/h in North America. Another

study was performed in Portugal, were the cost of labor were estimated at 10 euros per

hour based on the economy of the country (Martins et al., 2015). The study of Fiori et al

indicated a COL higher than this study, with a part in a yearly production cost estimated to

be 55% and 360,000 USD, explained by the higher capacity of their developed process,

requiring more labor (Fiori, 2010).

The cost of raw material was estimated to be 570,000 USD per year. This cost category

integrated the cost of CO2 and modifier used for the process. Many economic studies

working with agro-industrial residues reported that the cost of vegetable material was zero

since it was provided as a by-product. However, this fact appears unrealistic since this

Raw material53%

Utilities3%

Operating labor15%

Direct supervisory3%

Maintenance and repairs

26%

DIRECT MANUFACTURING COSTS

160

category of cost has to integrate the cost of cultivation, freezing the vegetable raw material

to avoid the degradation as well as the cost of transportation. Also, the preparation of the

raw material for the supercritical extraction involved a drying and a milling step. The final

production cost is highly influenced by the cost of raw material. Indeed, as reported by

Solana and al, in case of non-saleable raw material and thus considerate a price of raw

material to be 0, the final cost of raw material in our case were found to be 84,000 USD.

Figure 7-5: Cost of utilities repartition in percentage

The cost of utilities only represents 6% of the total COM (88,000 USD per year). This

category was related to the cost related to the electrical and steam consumption. Among

that, electrical cost was the major part of the cost of utilities, related to the pumping, cooling

and condensation system of the whole process. The steam is used for the heating and the

evaporation needing of the process (Fiori, 2010). The repartition of the utilities cost was

comparable to those exhibited in the literature but slightly higher because of the modifier

evaporation part added to this present plant. For SC-CO2 plant without evaporation system,

the CUT was less than 3% in the majority of case. The energetic consumption of the process

was also estimated and was comparable to the energetic consumption estimated for

conventional process of extraction. The total energetic consumption was found to be nearly

4000 MJ, with the 2914 MJ used for the extraction cycle and 1005 MJ for the modifier

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

ELECTRYCITY REFRIGERANT WATER STEAM

88

9

0,3 3

PER

CEN

TAG

E

161

evaporation and recycle part of the process (table 7.1). The repartition of the utilities cost

is available in figure 7.6.

Tableau 7-2: Repartition of the equipment energetic consumption per batch

Equipment Consumation (MJ) per batch

Cooler 1 1200

Cooler 2 600

HX-2 475

HX-Main 430

P-CO2 660

P-Solv 60

Cond 410

Comp 60

Total 3900

162

Tableau 7-3: Total yearly operating cost calculation based on the Turton methodology

Cost Item USD/year

GE 300,000

Administrative costs 70,000

Distribution and selling costs 160,000

Research and development 70,000

FMC 620,000

Depreciation 470,000

Local taxes and insurance 50,000

DMC 1,000,000

Raw material 570,000

Waste treatment 0

Utilities 50,000

Operating labor 160,000

Direct supervisory 30,000

Maintenance and repairs 280,000

Total Operating Costs 1,800,000

163

Because of the high investments cost of supercritical extraction plant, many economics

analysis evaluations are available regarding several raw materials. Pereira et al. (Pereira et

al., 2013) have reported the production cost of many SC-CO2 process from various raw

material and compared them. Several authors reported that the production cost using SC-

CO2 process is often lower than the conventional one excepted when the obtained product

exhibited a low value added. It is the case for the extraction of essential oil, using

petrochemical harmful solvents for their extraction and thus, requiring an expensive

distillation part for the separation of solvent from the extract. Supplementary step for the

elimination of the extraction solvent, like distillation or evaporation occurring during a

conventional process are not necessary for SC-CO2 process, found in a gaseous form at

atmospheric condition (Ferreira et al., 1999; RAMSEY et al., 2009). However, several

studies reported that the utilization of modifier enhances drastically the cost related to these

processes, because of the necessity to add a distillation process to separate the modifier

from the extract. However, the volume of modifier added to the process can be considerate

as very low compared to the volume of solvent used for conventional extractions. (Pereira

et al., 2013). The simulated process in this work is very interesting because few data are

available regarding the simulation of a SC-CO2 plant with a modifier separation and recycle

section. Besides of the supercritical related costs, SC-CO2 is reported to be a convenient

greenest extraction solution. This technique is often used in food, pharmaceutical and also

in cosmetic industry in the replacement of petrochemical solvent, usually resulting several

health, safety or environmental issues. The impact on the environment and health is

considered for a wide range of solvents, based on their physico-chemical properties.

Conventional petrochemicals solvents often present environmental, health and safety

consideration. Hexane, for example, still in used for extraction of carotenoid in Asia

(Fernández-Sevilla et al., 2010) possess a flash point of -22°C, and is then considered as

highly hazardous for the safety related to the flammability risk of this solvent. In

comparison, acetone exhibits a flash point of -18°C, slightly less flammable than hexane.

The utilization of these solvents in chemical plants require specific and strong measures,

often associated with significant energy consumption (Prat et al., 2016). CO2 did not

exhibit a flash point and is considered by the global harmonized system (GHS) to be

inflammable.

164

The health impact of conventional solvent is corroborated with their occupational hazard.

Hexane is known to its capability to damaging fertility or suspected to cause unborn child

(H361). Ethanol like acetone exhibit low health impact (reported to causing eyes irritation

related). CO2 has no health issues, however a good ventilation system had to be part of the

system because of the asphyxious capacity of this solvent in order to avoiding its inhalation.

Regarding the environmental aspect of solvents use in the conventional extractions of

lutein and chlorophyll, hexane, among the GHS classification is categorized as H411 (toxic

for aquatic life with long term effects), and is considered as environmentally hazardous,

associated with a boiling point of 69°C. Acetone and ethanol are not classified as H4 among

the GHS classification but acetone possess a boiling point of 56°C, associated with its

capacity to generate VOC’s (volatiles organics compounds) (Chémat, 2010). Ethanol, a

non-petrochemical solvent from renewable resources (wood), is classified as REACH

(Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals). However it is

flammable (Prat et al., 2016). CO2 is relatively inert, cannot be oxidized, and is

nonflammable and nonexplosive. High-pressure equipment is necessary SC-CO2 process,

creating potential risks and safety hazards compared to atmospheric pressure equipments.

Based on the global harmonized system (GHS), and physico-chemical characteristics, SC-

CO2 does not present any health and environmental consideration (No H3 or H4 reported

so far). CO2 is from renewable sources, considering as a byproduct, requiring little energy

for its synthesis. Also, CO2 is not distilled or incinerated after being used but instead is

recycled, leaving then no waste after extraction procedure (Hunt et al., 2010). CO2 is

reported to be a convenient greenest extraction solution. This technique is often used in

food, pharmaceutical and also in cosmetic industry in the replacement of petrochemical

solvent, usually possessing several health, safety or environmental issues.

165

7.7.3 Profitability analysis

The capacity of the plant enables the production of 911 kg of extract each year, and then

the specific production cost required to obtaining one kg of extract was found to be 1723

USD.Using ecological solvent respecting the exigencies of Écocert certification, the

industrial partner of the present project presently processes spinach extracts production.

These extracts exhibited a concentration in lutein of 0.15% and at in chlorophyll of 6%,

along with a specific cost estimated by the company at 50 USD/kg of extract. These

obtained extracts are currently sold in the market at 80 USD/kg. The supercritical process

allowed an extract recovery with a concentration in lutein up to 2% (2.4%) and chlorophyll

at 20%. The selling price of the present extract produced by this process is estimated at 800

USD by the company. In the literature, lutein and chlorophyll extract are ranging from 10

to 1000 USD/kg. The cost of manufacturing is higher than the selling price but if the purity

and the quality of the SC-CO2 extract compared with those obtain from conventional

process is about 16 times more concentrated in lutein and more than 3 time more

concentrated in chlorophyll. In order to give a meaningful comparison, the production of

carotenoid from marigold using SC-CO2 exhibit a specific cost ranging from 611 to 785

USD/kg, compared with those from the conventional process using harmful solvents,

comprised between 283 and 584 USD/kg of extract (Pereira et al., 2013). In addition to the

design process, a simple enzymatic or chemical hydrolysis of chlorophyll will have allowed

the recovery of two high purified and concentrated extracts in lutein and in chlorophyll.

Then, both extract can be sold separately at 800 USD each and will be allowed leading then

to a recovery of 1600 USD/kg for the two extracts.

166

Tableau 7-4: Yearly cost directly connected to the operation for the design plant

Items Cost USD/year

Labor cost 160,000

Electricity 44,000

Steam 950

Raw material 574,000

Maintenance 284,000

Total cost without depreciation 1,000,000

Total cost with depreciation** 1,570,000

Specific costs without depreciation US/kg 1100

Specific costs with depreciation US/kg 1723

*Considering a productivity per year = 911 kg of extract (yield 2,76%; 330000 kg of

raw material proceeded*0,0276= 911 kg)

** depreciation estimated for 10 years’ life plant (0,1FCI = 472124 USD/year)

167

7.8 Conclusion Reports on laboratory scale supercritical fluid extraction are widely found in the literature,

but their applications at an industrial scale are far from a systematic fact. Indeed, this

technology exhibit advantages regarding the extract quality and is known to be

environmentally friendly compared to the conventional process. However, it is also known

that this equipment requiring high investment cost. Then, simulation of the process is very

helpful to seek the feasibility at industrial scale. No report has been found in the literature

regarding a SC-CO2 using ethanol as modifier and from spinach as raw material. This

article contributed substantially to this lack of information. In addition to the developed

process, a first water extraction before the supercritical extraction will be able to extract

the polar compounds to make a supplementary product. Also, an enzymatic or chemical

hydrolysis of chlorophyll will enable the purification and the separation of lutein from

chlorophyll leading to two high value extracts instead of one, aimed to the nutraceutical

sector. Also, when comparing to the conventional solvent, the SC-CO2 present major

environmental, safety and health benefits.





(CRSNG) from Canada for BMP-Innovation PhD fellowship

168

8 Discussion, conclusion et perspectives

169

8.1 Discussion La chimie verte est une tendance forte qui a beaucoup d’impacts dans le monde de la

chimie, allant de l’échelle du laboratoire à industriel. Cette révolution a su rendre profitable

la chimie tout en limitant les impacts néfastes de cette dernière sur l’environnement ainsi

que sur la santé humaine. Ces différents avantages ont généré beaucoup d’enthousiasme de

la part de la communauté scientifique, comme l’atteste l’émergence de fonds

gouvernementaux, de centres de recherche et également de programmes d’étude sur le

sujet. La réduction d’effets néfastes par l’application de la chimie verte a également eu des

retours économiques positifs.

Ce projet se déroulait en partenariat avec une entreprise spécialisée dans l’obtention

d’extraits végétaux destinés aux marchés des ingrédients fonctionnels, aux cosmétiques et

au domaine des nutraceutiques. De fait, la finalité et les résultats obtenus au court de ce

projet devaient répondre d’une part aux problématiques de recherche, mais aussi

correspondre à certaines exigences de l’entreprise partenaire. En effet, l’entreprise était

désireuse d’obtenir un extrait concentré à minimum 1% de lutéine ainsi qu’avec une

possible séparation de la chlorophylle. Aussi, ce procédé se devait d’apporter une certaine

rentabilité et un intérêt financier à l’entreprise. Cette discussion va donc permettre de

revenir sur les principaux résultats et permettre de définir quel procédé va être le plus

adapté à une possible application industrielle.

Les expériences d’optimisation d’extraction sont basées sur une méthodologie

statistique appelée les surfaces de réponse, et plus particulièrement, nous avons utilisé le

plan d’expérience Box Behnken. Ces outils statistiques, très utilisés dans le domaine

industriel et de génie consistent à une étude de la fonction réponse en faisant varier les

paramètres expérimentaux. Ces outils modélisent la réponse par une fonction

mathématique polynomiale de second ordre. Ils permettent d’observer l’effet des facteurs

expérimentaux, dans notre cas les facteurs d’extractions, sur les variables réponses, ici

l’efficacité d’extraction, ainsi que les interactions entre ces facteurs. De fait, ces outils

statistiques permettent de modéliser la réponse afin de connaître de façon simple et

innovante le niveau des paramètres permettant l’efficacité d’extraction maximale.

170

Dans une première partie, nous avons optimisé l’extraction de la lutéine et de la

chlorophylle en utilisant de l’eau et de l’éthanol, un système de solvant entièrement vert.

Rappelons que les solvants utilisés souvent pour l’extraction de ces molécules sont de

l’hexane et du méthanol. Cette partie est aussi très innovante, car elle permet l’extraction

de ces molécules d’intérêts sans nécessiter d’équipements coûteux à l’échelle industrielle.

Les meilleurs paramètres retenus ont été une extraction de 4,3 heures, à 43°C, avec de

l’éthanol 95% et un ratio solvant/matière végétale de 1/66, permettant l’obtention de 70 et

96% de lutéine et chlorophylle, respectivement. Ce procédé permettait donc de répondre à

l’objectif spécifique qui était d’optimiser un procédé utilisant des solvants verts de façon à

obtenir une extraction aussi efficace qu’avec l’utilisation de solvants pétrochimiques.

Néanmoins, nous n’avons pas obtenu de séparation de la lutéine et de la chlorophylle avec

ce procédé, car les deux molécules possèdent des affinités pour ces solvants assez

similaires. De fait, il était difficile de les séparer en faisant juste varier les paramètres

d’extractions.

D’un point de vue industriel, cette technique ne permet pas l’obtention d’un extrait assez

enrichit en lutéine et nous n’avons pas répondu donc pas aux attentes de l’entreprise. Dans

cet extrait, la lutéine ne représentait que 0,4% et la chlorophylle 6%. Ce procédé, reproduit

à l’échelle pilote puis industrielle n’a permis d’obtenir qu’un rendement de 0,1% en lutéine

et les mêmes quantités en chlorophylle. De plus, aux échelles pilotes et industrielles,

d’importants problèmes de collages au niveau des canalisations et de bouchages des filtres

ont été constatés, diminuant de beaucoup le rendement d’extraction et nécessitant

d’importantes étapes de nettoyage à la fin du procédé. Le coût de production de ce procédé

a été estimé à 50 USD par kg d’extrait obtenu par la compagnie, avec un prix de vente fixé

à 80 USD pour un kilogramme de produit.

Le second objectif était donc d’extraire était de séparer ces deux molécules selon un

procédé écologique, de façon à réussir de concentrer la lutéine au-delà des 1 % requis et

par la même occasion d’obtenir un extrait concentré en chlorophylline. Pour cela, nous

avons utilisé la saponification, avec de l’hydroxyde de sodium, qui réagit avec les liaisons

ester des acides gras saponifiables de l’épinard, dont fait partie la chlorophylle. La queue

phytol de la chlorophylle, lui conférant son caractère apolaire, va être ainsi estérifiée

171

rendant cette molécule polaire et de fait soluble dans l’eau. Le principe de ce nouveau

procédé est donc de faire macérer une certaine quantité d’épinards lyophilisés avec une

solution d’eau et d’hydroxyde de sodium pendant un certain temps, à une température

déterminée. Une optimisation des conditions de saponification était nécessaire afin de

trouver les paramètres permettant de saponifier au mieux la chlorophylle tout en préservant

au maximum la lutéine, sensible à l’hydroxyde de sodium.

Les résultats obtenus à l’échelle laboratoire sont un succès quant à la séparation de la

lutéine et de la chlorophylle, obtenues de façon vraiment très simple. L’utilisation de

colonne permettrait une purification encore plus élevée, mais augmenterait les étapes de ce

procédé en ajoutant de fait des coûts de production plus élevés. Nous obtenions 1,6% de

lutéine concentrée dans l’extrait final, avec un rendement de 0,63%. Le coût de production

de ce procédé a été estimé à 50 USD par kg d’extrait obtenus par la compagnie, avec un

prix de vente autour des 100 USD du kilo. L’intérêt de ce procédé est que l’on obtient une

purification ainsi qu’une extraction simple et efficace de nos molécules avec utilisation de

solvants verts en respectant tous les grands principes de la chimie verte. L’objectif

spécifique ainsi que l’objectif principal de ce projet ont donc été atteints. Également, les

exigences de l’entreprise vis-à-vis de la concentration en lutéine dans l’extrait au-delà des

1% ainsi que l’obtention d’une séparation de la lutéine et de la chlorophylle ont été

rencontrées.

Néanmoins, d’un point de vue industriel, le rendement en matière obtenu par ce

procédé est très faible, seulement de 0,63%. Ceci veut dire que pour produire un

kilogramme d’extrait, il serait nécessaire de disposer de 158 kg d’épinards lyophilisés,

représentant autour de 1,5 tonne d’épinards frais. Appliqué à l’échelle pilote, ce procédé

nous permettait d’obtenir un extrait concentré à 1,6% en lutéine de 1,8g, obtenu à partir de

285g d’épinards lyophilisés. De plus, ce procédé permet de réduire de façon importante les

problèmes de filtration et de collage de l’extrait, observés lors de la filtration et

l’évaporation. Ces problèmes, que l’on pensât associés aux fibres contenus dans l’épinard

semblent de fait plus associés à la présence de composés lipophiles, dont la majeure partie

sont saponifiés lors de l’addition d’hydroxyde de sodium. Néanmoins, des pertes

importantes de lutéine sont constatées durant la saponification, fait qui est également

172

rapporté dans la littérature. Les solutions pour limiter ses pertes seraient d’utiliser un

antioxydant lors de la saponification et de travailler sous une atmosphère protégée de

l’oxygène, sous azote par exemple.

Face aux résultats concernant ces deux techniques d’extraction conventionnelles,

l’extraction par fluide supercritique a été envisagée en raison de ses qualités d’extraction.

À la différence des méthodes traditionnelles qui utilisent des solvants nocifs, l’extraction

par fluide supercritique est une technique verte prenant de l’importance dans les industries

alimentaires et pharmaceutiques. Cette méthode permet l’extraction d’un large groupe de

molécules naturelles. Après une optimisation des conditions opérationnelles, cette méthode

a permis une efficacité d’extraction de la lutéine et de la chlorophylle de 70 et 50%

respectivement, avec un rendement en matière de 2,76% qui dépasse de fait de loin les

autres rendements en matière obtenus avec les précédentes techniques d’extraction

conventionnelles. Il faut aussi ajouter que la lutéine représentait 2,4% de l’extrait sec et la

chlorophylle 20%. Cette méthode permettait également une séparation des deux composés.

En effet, sans utilisation de cosolvant, seul les caroténoïdes, plus apolaires que la

chlorophylle étaient extraits. La quantité de chlorophylle extraite par rapport à sa quantité

totale présente dans la matière de départ avant les traitements n’a jamais dépassé les 5 %,

même à 500 bar. De fait, la combinaison permettant la meilleure séparation des 2 composés

avec la plus haute quantité d’extraits récupérés était la combinaison 18 (tableau en annexe),

permettant l’obtention rendement d’extraction de 1.34%, concentré en lutéine à 1.95%

(correspondant à 31% de lutéine extraite à partir de la matière de départ) et en chlorophylle

à 0.39% (correspondant à 0,48% de chlorophylle extraite à partir de la matière de départ).

La quantité de chlorophylle présente dans ces échantillons était donc négligeable, mais

cette quantité suffisait à conférer à l’échantillon la couleur verte de cette molécule.

173

Tableau 8-1: Rendements d'extraction de l'expérience par fluide supercritique

Conditions opératoires Rendement de l’extrait Ressources nécessaires pour l’obtention de

1 kg d’extrait

No Temps

min

Température

°C

Pression

Mpa

Cosolvant

%

Yield

%

Lutéine

%

Chlorophylle

%

Matière de départ

Kg

CO2

kg

EtOH

kg

1 60 40 30 5 0,83 0,70 6,55 121 2345 117

2 300 40 30 5 2,68 1,04 3,65 37 4313 216

3 60 60 30 5 0,77 2,58 4,86 130 2487 124

4 300 60 30 5 2,10 3,09 9,86 48 5088 254

5 180 50 10 0 0,00 19,49 8,64 20933 1350000 0

6 180 50 50 0 0,47 2,77 12,40 213 15411 0

7 180 50 10 10 1,47 1,39 7,66 68 4617 462

8 180 50 50 10 2,76 1,92 17,70 36 2586 259

9 60 50 10 5 0,05 0,00 0,00 1827 40179 2009

174

10 300 50 10 5 0,38 4,28 1,06 265 31994 1600

11 60 50 50 5 0,90 1,67 2,36 111 2560 128

12 300 50 50 5 1,94 1,94 11,15 52 5892 295

13 180 40 30 0 1,43 1,72 0,84 70 4608 0

14 180 60 30 0 1,53 0,21 0,23 65 4555 0

15 180 40 30 10 2,68 1,86 24,61 37 2096 210

16 180 60 30 10 1,81 1,97 14,55 55 3067 307

17 60 50 30 0 0,27 0,83 0,46 370 8696 0

18 300 50 30 0 1,34 1,95 0,39 75 8227 0

19 60 50 30 10 1,03 1,11 6,64 97 2192 219

20 300 50 30 10 3,49 1,28 22,50 29 3047 305

21 180 40 10 5 0,81 0,55 4,47 123 7627 381

22 180 60 10 5 0,45 0,63 0,00 224 15517 776

23 180 40 50 5 1,42 1,23 8,91 70 4706 235

24 180 60 50 5 2,05 3,01 16,97 49 3581 179

175

25 180 50 30 5 2,95 1,10 7,27 34 2104 105

26 180 50 30 5 2,30 1,04 6,90 43 2816 141

27 180 50 30 5 1,79 2,53 13,56 56 3702 185

176

Il a été possible après cette première extraction de refaire une autre extraction par

fluide supercritique ou de réaliser une extraction conventionnelle pour extraire la

chlorophylle présente dans la matière de départ et d’obtenir de fait 2 extraits riches en ces

composés bioactifs. Cette méthode atteint donc tous les objectifs industriels et de recherche

de ce projet, à savoir l’obtention d’un extrait riche en lutéine et aussi en chlorophylle selon

une technique respectueuse de l’environnement.

Cette méthode est applicable à une grande gamme de molécules et aussi de matrices

végétales. Afin de faciliter la prédiction, de la solubilité des molécules dans le SC-CO2 et

l’applicabilité de cette méthode à d’autres molécules, une modélisation simple et rapide de

la solubilité de composés phytochimiques dans ce solvant, en utilisant la théorie de

solubilité de Hansen modifiée a été adoptée. Cette méthode de prédiction peut être utilisée

comme un outil permettant d’obtenir avant toute manipulation des informations sur la

solubilité de molécule dans ce solvant supercritique rapide, ainsi qu’une sélection de

paramètres de pression dans laquelle la molécule en question sera la mieux extraite.

Aussi, au vu des bons résultats obtenus lors des expériences par fluide supercritique,

l’applicabilité à l’échelle industrielle a été étudiée. En effet, même si cette technique répond

aux objectifs de recherche et de l’entreprise, il n’en reste pas moins qu’il s’agit d’une

installation dispendieuse qui décourage souvent les industries à investir dans ce genre

d’équipement. D’ailleurs, la littérature est très riche en articles portant sur l’extraction par

fluides supercritiques à l’échelle du laboratoire, mais on a constaté que peu de ces études

font ensuite l’objet d’étude de faisabilité à l’échelle industrielle. En effet, analyse technico-

économique du procédé nous a permis de vérifier la faisabilité et l’applicabilité de ce

procédé à l’échelle industrielle et de déterminer si ces coûts sont amortis par les profits

réalisés chaque année. Nous avons constaté que la matière de départ est trop pauvre en

biomolécules pour assurer un procédé par fluide supercritique rentable, avec un coût de

production estimé autour des 1000 dollars du kilogramme d’extrait. En effet, les coûts

productions annuelles sont comparables aux études rapportées dans la littérature, mais le

rendement d’extraction ne permet pas d’obtenir une production suffisante pour amortir tous

177

les frais engendrés lors de la production. De plus, le marché asiatique de la lutéine est très

compétitif et offre des extraits à prix très concurrentiel.

Ceci nous amène à conclure que malgré les nombreux avantages offerts par

l’extraction par fluide supercritique, ce procédé s’avère difficilement applicable à l’échelle

industrielle pour l’entreprise partenaire. C’est pourquoi, parmi les procédés développés et

étudiés dans cette thèse, celui qui semble le plus adapté à l’échelle industrielle est le

procédé d’extraction et de purification utilisant une étape de saponification suivie d’une

extraction à l’éthanol. Ce procédé est la solution la plus intéressante tant sur le plan

économique et qu’environnemental. De plus, cette méthode présente l’avantage de séparer

et de purifier de façon simple la lutéine et la chlorophylle.

8.2 Conclusion Une fois de plus, il est important de souligner que tous les objectifs de la thèse ont été

atteints, d’un point de vue recherche et industriel. En effet, des résultats concernant

l’efficacité d’extraction de la lutéine et de la chlorophylle à partir de sous-produits

d’épinards comparables à ceux obtenus par solvants pétrochimiques ont été obtenus par

macération dans des solvants verts ainsi que par extraction supercritique pour la première

fois. De plus, une purification des deux molécules a été obtenue avec une saponification,

qui constitue un procédé applicable à l’échelle industrielle. L’extraction par fluide

supercritique, au-delà de ses excellents résultats, ne permettait malheureusement pas

d’obtenir un procédé rentable à l’échelle industrielle. En effet, ce procédé nécessite une

installation bien trop coûteuse engendrant des coûts trop élevés par rapport aux bénéfices

obtenus par la production d’extraits. Néanmoins, cette méthode peut être appliquée à

d’autres sources plus riches en biomolécules que l’épinard.

8.3 Perspectives Les épinards peuvent être valorisés pour leur contenu en d’autres molécules

phytochimiques par exemple les polyphénols. En effet, il faut rappeler que les épinards

contiennent une source non négligeable en ces phytomolécules. Aussi, l’épinard contient

beaucoup de fibres dont les vertus amaigrissantes se manifestant par l’apparition de la

satiété sont aussi présentes en quantité élevée.

178

Une autre perspective intéressante serait de tester un couplage d’extraction par fluide

supercritique suivi d’une séparation par chromatographie de partage centrifuge, permettant

l’obtention de deux extraits très concentrés en lutéine et en chlorophylle. Moins cher que

ce couplage, mais tout aussi intéressant, une autre alternative de purification de ces deux

composés serait l’utilisation de chlorophyllase à la place du NaOH, permettant aussi une

hydrolyse de la queue phytol de la chlorophylle et donc une séparation de ces deux

molécules tout en préservant la lutéine.

Enfin, il serait également intéressant d’étudier l’impact de ces molécules sur le microbiote

intestinal. En effet, la littérature scientifique est très riche en études in vitro et in vivo,

réalisées sur de nombreux modèles cellulaires et animaux dans le but d’étudier et de valider

l’effet santé de la lutéine et de la chlorophylle. Néanmoins, peu d’information est

disponible sur l’effet de ces molécules sur le microbiote intestinal, mis à part pour les

polyphénols et les glucosinolates.

179

9 Bibliographie

180

A.Meireles, S.P.J. andM. A. (2014). Supercritical Fluid Extraction: A Global Perspective

of the Fundamental Concepts of this Eco-Friendly Extraction Technique.

Abdel-Aal, E.S.M., Akhtar, H., Zaheer, K., and Ali, R. (2013). Dietary sources of lutein

and zeaxanthin carotenoids and their role in eye health. Nutrients 5, 1169–1185.

Ahmad, A., Alkharfy, K.M., Wani, T. a, and Raish, M. (2015). Application of Box-

Behnken design for ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Paeonia emodi.

Int. J. Biol. Macromol. 72, 990–997.

Alder, C.M., Hayler, J.D., Henderson, R., Redman, A., Shukla, L., Shuster, L.E., and

Sneddon, H.F. (2016). Updating and further expanding GSK’s solvent sustainability guide.

Green Chem. 4, 1166–1169.

Arnold, C., Schwarzenbolz, U., and Böhm, V. (2014). Carotenoids and chlorophylls in

processed xanthophyll-rich food. LWT - Food Sci. Technol. 57, 442–445.

Baş, D., and Boyacı, İ.H. (2007). Modeling and optimization I: Usability of response

surface methodology. J. Food Eng. 78, 836–845.

Bendaoud, A. (2014). Fluide supercritique et liquide ionique comme plastifiants de polym

` eres biosourc ´ es : application ` a l ’ amidon et ` a l ’ ac ´ etate de cellulose Amine

Bendaoud.

Bez, G.C., Jordão, B.Q., Vicentini, V.E.P., and Mantovani, M.S. (2001). Investigation of

genotoxic and antigenotoxic activities of chlorophylls and chlorophyllin in cultured V79

cells. Mutat. Res. - Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 497, 139–145.

Bezerra, M.A., Santelli, R.E., Oliveira, E.P., Villar, L.S., and Escaleira, L.A. (2008).

Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry.

Talanta 76, 965–977.

Bunea, A., Andjelkovic, M., Socaciu, C., Bobis, O., Neacsu, M., Verhé, R., and Camp, J.

Van (2008a). Total and individual carotenoids and phenolic acids content in fresh,

refrigerated and processed spinach (Spinacia oleracea L.). Food Chem 108, 649–656.

Bunea, A., Andjelkovic, M., Socaciu, C., Bobis, O., Neacsu, M., Verhé, R., and Camp, J.

181

Van (2008b). Total and individual carotenoids and phenolic acids content in fresh,

refrigerated and processed spinach (Spinacia oleracea L.). Food Chem. 108, 649–656.

Burri, B.J. (2013). Carotenoids: Chemistry, Sources and Physiology. Encycl. Hum. Nutr.

1, 283–291.

Campenni’, L., Nobre, B.P., Santos, C.A., Oliveira, A.C., Aires-Barros, M.R., Palavra,

A.M.F., and Gouveia, L. (2013). Carotenoid and lipid production by the autotrophic

microalga Chlorella protothecoides under nutritional, salinity, and luminosity stress

conditions. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 1383–1393.

Canada, A. et A. (2013). Aperçu statistique de l’industrie des légumes du Canada pour

2013.

Carpentier, S., Knaus, M., and Suh, M. (2009). Associations between lutein, zeaxanthin,

and age-related macular degeneration: an overview. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 49, 313–

326.

Cavalcanti, R.N., Meireles, M.A.A., and Sp, C. (2012). Fundamentals of Supercritical

Fluid Extraction (Elsevier).

Chemat, F., and Strube, J. (2015). Gren Extraction of Natural Products : Theory and

Practice.

Chémat, F. (2010). Éco-extraction du végétal, prodédés innovants et solvants alternatifs.

Cubas, C., Gloria Lobo, M., and González, M. (2008). Optimization of the extraction of

chlorophylls in green beans (Phaseolus vulgaris L.) by N,N-dimethylformamide using

response surface methodology. J. Food Compos. Anal. 21, 125–133.

Dadkhah, M.R., Tatar, A., Mohebbi, A., Barati-Harooni, A., Najafi-Marghmaleki, A.,

Ghiasi, M.M., Mohammadi, A.H., and Pourfayaz, F. (2016). Prediction of Solubility of

Solid Compounds in Supercritical CO2 Using a Connectionist Smart Technique. J.

Supercrit. Fluids.

Dennis R. Gere, Lenore G. Randall (1), and D.C. (1997). Chapter 11 Supercritical Fluid

Extraction : Principles and Applications. Instrum. Methods Food Anal. 484.

182

Derrien, M., Badr, A., Gosselin, A., Desjardins, Y., and Angers, P. (2017). Optimization

of a green process for the extraction of lutein and chlorophyll from spinach by-products

using response surface methodology (RSM). LWT - Food Sci. Technol. 79, 170–177.

Dong, C.H., Xie, X.Q., Wang, X.L., Zhan, Y., and Yao, Y.J. (2009). Application of Box-

Behnken design in optimisation for polysaccharides extraction from cultured mycelium of

Cordyceps sinensis. Food Bioprod. Process. 87, 139–144.

Dudonne, S., Vitrac, X., Coutiere, P., Woillez, M., and Merillon, J.M. (2009). Comparative

study of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of industrial

interest using DPPH, ABTS, FRAP, SOD, and ORAC assays. J Agric Food Chem 57,

1768–1774.

Egner, P. a, Stansbury, K.H., Snyder, E.P., Rogers, M.E., Hintz, P. a, and Kensler, T.W.

(2000). Identification and characterization of chlorin e(4) ethyl ester in sera of individuals

participating in the chlorophyllin chemoprevention trial. Chem. Res. Toxicol. 13, 900–906.

Farías-Campomanes, A.M., Rostagno, M.A., Coaquira-Quispe, J.J., and Meireles, M.A.A.

(2015). Supercritical fluid extraction of polyphenols from lees: overall extraction curve,

kinetic data and composition of the extracts. Bioresour. Bioprocess. 2, 45.

Fernandes, T.M., Gomes, B.B., and Lanfer-Marquez, U.M. (2007). Apparent absorption of

chlorophyll from spinach in an assay with dogs. Innov. Food Sci. Emerg. Technol. 8, 426–

432.

Fernández-Sevilla, J.M., Acién Fernández, F.G., and Molina Grima, E. (2010).

Biotechnological production of lutein and its applications. Appl. Microbiol. Biotechnol.

86, 27–40.

Ferreira, S.L.C., Bruns, R.E., Ferreira, H.S., Matos, G.D., David, J.M., Brandão, G.C., da

Silva, E.G.P., Portugal, L. a., dos Reis, P.S., Souza, a. S., et al. (2007). Box-Behnken

design: An alternative for the optimization of analytical methods. Anal. Chim. Acta 597,

179–186.

Ferreira, S.R.S., Nikolov, Z.L., Doraiswamy, L.K., Meireles, M.A. a., and Petenate, A.J.

(1999). Supercritical fluid extraction of black pepper (Piper nigrun L.) essential oil. J.

183

Supercrit. Fluids 14, 235–245.

Ferruzzi, M.G., and Blakeslee, J. (2007a). Digestion, absorption, and cancer preventative

activity of dietary chlorophyll derivatives. Nutr. Res. 27, 1–12.

Ferruzzi, M.G., and Blakeslee, J. (2007b). Digestion, absorption, and cancer preventative

activity of dietary chlorophyll derivatives. Nutr. Res. 27, 1–12.

Ferruzzi, M.G., Failla, M.L., and Schwartz, S.J. (2002). Sodium copper chlorophyllin: In

vitro digestive stability and accumulation by Caco-2 human intestinal cells. J. Agric. Food

Chem. 50, 2173–2179.

Fiori, L. (2010). Supercritical extraction of grape seed oil at industrial-scale: Plant and

process design, modeling, economic feasibility. Chem. Eng. Process. Process Intensif. 49,

866–872.

G, B. (1991). Carotenoid.

Galaffu, N., Bortlik, K., and Michel, M. (2015). An industry perspective on natural food

colour stability (Elsevier Ltd.).

Gao, Y., Nagy, B., Liu, X., Simándi, B., and Wang, Q. (2009). Supercritical CO2 extraction

of lutein esters from marigold (Tagetes erecta L.) enhanced by ultrasound. J. Supercrit.

Fluids 49, 345–350.

Gao, Y., Liu, X., Xu, H., Zhao, J., Wang, Q., Liu, G., and Hao, Q. (2010). Optimization of

supercritical carbon dioxide extraction of lutein esters from marigold (Tagetes erecta L.)

with vegetable oils as continuous co-solvents. Sep. Purif. Technol. 71, 214–219.

Gleize, B., Steib, M., André, M., and Reboul, E. (2012). Simple and fast HPLC method for

simultaneous determination of retinol, tocopherols, coenzyme Q10 and carotenoids in

complex samples. Food Chem. 134, 2560–2564.

Gómez-Prieto, M.S., del Castillo, M.L.R., Flores, G., Santa-María, G., and Blanch, G.P.

(2007). Application of Chrastil’s model to the extraction in SC-CO2 of β-carotene and

lutein in Mentha spicata L. J. Supercrit. Fluids 43, 32–36.

184

Gong, M., and Bassi, A. (2016). Carotenoids from microalgae: A review of recent

developments. Biotechnol. Adv. 34, 1396–1412.

Granado, F., Olmedilla, B., and Blanco, I. (2001). A Fast , Reliable and Low-cost

Saponification Protocol for Analysis of Carotenoids in Vegetables. J. Food Compos. Anal.

14, 479–489.

Group, F. (2007). Density Data of Carbon Dioxide.

Guedes, a. C., Gião, M.S., Matias, A. a., Nunes, A.V.M., Pintado, M.E., Duarte, C.M.M.,

and Malcata, F.X. (2013). Supercritical fluid extraction of carotenoids and chlorophylls a,

b and c, from a wild strain of Scenedesmus obliquus for use in food processing. J. Food

Eng. 116, 478–482.

Han, J., Wang, Y., Ma, J., Wu, Y., Hu, Y., Ni, L., and Li, Y. (2013). Simultaneous aqueous

two-phase extraction and saponification reaction of chlorophyll from silkworm excrement.

Sep. Purif. Technol. 115, 51–56.

Hansen, C.M. (2000). Theory - The Prigogine Corresponding States Theory, the X12

Interaction Parameter, and the Hansen Solubility Parameters. Hansen Solubility

Parameters a User’s Handb. 25–42.

Hansen, C.M. (2004). 50 Years with solubility parameters - Past and future. Prog. Org.

Coatings 51, 77–84.

Hansen, C.M. (2007). Solubility Parameters — An Introduction. Hansen Solubility

Parameters A User’s Handb. 1–24.

Hansen, C.M., and Poulsen, T.S. (2007). Hansen Solubility Parameters - Biological

Materials. Hansen Solubility Parameters A User’s Handb. (2nd Ed. 269–292.

Herrero, M., and Ibáñez, E. (2015). Green processes and sustainability: An overview on

the extraction of high added-value products from seaweeds and microalgae. J. Supercrit.

Fluids 96, 211–216.

Herrero, M., Cifuentes, A., and Ibañez, E. (2006). Sub- and supercritical fluid extraction

of functional ingredients from different natural sources: Plants, food-by-products, algae

185

and microalgae - A review. Food Chem. 98, 136–148.

Herrero, M., Mendiola, J.A., Cifuentes, A., and Ib????ez, E. (2010). Supercritical fluid

extraction: Recent advances and applications. J. Chromatogr. A 1217, 2495–2511.

Herrero, M., Cifuentes, A., and Ib????ez, E. (2012). Extraction techniques for the

determination of carotenoids and vitamins in food. Compr. Sampl. Sample Prep. 4, 181–

201.

Herrero, M., Castro-Puyana, M., Mendiola, J. a., and Ibañez, E. (2013). Compressed fluids

for the extraction of bioactive compounds. TrAC - Trends Anal. Chem. 43, 67–83.

Hojnik, M., Škerget, M., and Knez, Ž. (2007). Isolation of chlorophylls from stinging nettle

(Urtica dioica L.). Sep. Purif. Technol. 57, 37–46.

Hopkins, W.G. (2003). Physiologie végétale.

Hörtensteiner, S., and Kräutler, B. (2011). Chlorophyll breakdown in higher plants.

Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 1807, 977–988.

Hu, Z., Cai, M., and Liang, H.H. (2008). Desirability function approach for the

optimization of microwave-assisted extraction of saikosaponins from Radix Bupleuri. Sep.

Purif. Technol. 61, 266–275.

Huang, S.C., Hung, C.F., Wu, W.B., and Chen, B.H. (2008). Determination of chlorophylls

and their derivatives in Gynostemma pentaphyllum Makino by liquid chromatography-

mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal 48, 105–112.

Huang, Z., Shi, X.-H., and Jiang, W.-J. (2012). Theoretical models for supercritical fluid

extraction. J. Chromatogr. A 1250, 2–26.

Humayoun Akhtar, M., and Bryan, M. (2008). Extraction and quantification of major

carotenoids in processed foods and supplements by liquid chromatography. Food Chem.

111, 255–261.

Humphrey, a M., Boake, B., Lid, A., Lane, B., and Britain, G. (1980). The distribution o /

chlorophyll is considered , jollowed by an historical survey leading to the establishment of

186

the chemical constitution o / chlorophylls a and b . Their use as permitted food colours in

many countries is discussed . A section gives the. Science (80-. ). 5, 57–67.

Hunt, A.J., Sin, E.H.K., Marriott, R., and Clark, J.H. (2010). Generation, capture, and

utilization of industrial carbon dioxide. ChemSusChem 3, 306–322.

Inoue, H., Yamashitaa, H., Furuyaa, K., Nonomuraa, Y., Yoshioka, N., and Lib, S. (1994).

Determination of copper ( II ) chlorophyllin by reversed-phase high-performance liquid

chromatography. 679, 99–104.

Islam, M.A., Alam, M.R., and Hannan, M.O. (2012). Multiresponse optimization based on

statistical response surface methodology and desirability function for the production of

particleboard. Compos. Part B Eng. 43, 861–868.

Jaime, L., Rodríguez-Meizoso, I., Cifuentes, A., Santoyo, S., Suarez, S., Ibáñez, E., and

Señorans, F.J. (2010). Pressurized liquids as an alternative process to antioxidant

carotenoids’ extraction from Haematococcus pluvialis microalgae. LWT - Food Sci.

Technol. 43, 105–112.

Johnson, E.J. (2012). A possible role for lutein and zeaxanthin in cognitive function in the

elderly. Am. J. Clin. Nutr. 96.

Kamat, J.P., Boloor, K.K., and Devasagayam, T.P.. (2000). Chlorophyllin as an effective

antioxidant against membrane damage in vitro and ex vivo. Biochim. Biophys. Acta - Mol.

Cell Biol. Lipids 1487, 113–127.

Katsampa, P., Valsamedou, E., Grigorakis, S., and Makris, D.P. (2015). A green

ultrasound-assisted extraction process for the recovery of antioxidant polyphenols and

pigments from onion solid wastes using Box–Behnken experimental design and kinetics.

Ind. Crops Prod. 77, 535–543.

Khachik, F., Beecher, G.R., and Whittaker, N.F. (1986). Separation , Identification , and

Quantification of the Major Car0 t enoid and Chlorophyll Constituents in Extracts of

Several Green Vegetables by Liquid Chromatography ’. J. Agric. Food Chem. 34, 603–

616.

187

Khachik, F., Englert, G., Daitch, C.E., Beecher, G.R., Tonucci, L.H., and Lusby, W.R.

(1992). Isolation and structural elucidation of the geometrical isomers of lutein and

zeaxanthin in extracts from human plasma. J. Chromatogr. - Biomed. Appl. 582, 153–166.

Khanam, U.K.S., Oba, S., Yanase, E., and Murakami, Y. (2012). Phenolic acids, flavonoids

and total antioxidant capacity of selected leafy vegetables. J. Funct. Foods 4, 979–987.

Kijlstra, A., Tian, Y., Kelly, E.R., and Berendschot, T.T.J.M. (2012). Lutein: More than

just a filter for blue light. Prog. Retin. Eye Res. 31, 303–315.

Kimura, M., Rodriguez-Amaya, D.B., and Godoy, H.T. (1990). Assessment of the

saponification step in the quantitative determination of carotenoids and provitamins A.

Food Chem. 35, 187–195.

King, J.W., and Srinivas, K. (2009). Multiple unit processing using sub- and supercritical

fluids. J. Supercrit. Fluids 47, 598–610.

King, J.W., Zhang, D., and Srinivas, K. (2009). Optimization of Subcritical Water - Carbon

Dioxide Systems for the Extraction and Reactive Processing of Biorenewable Materials.

Proceeding ISSF.

Kumar, S.S., Shankar, B., and Sainis, K.B. (2004). Effect of chlorophyllin against oxidative

stress in splenic lymphocytes in vitro and in vivo. Biochim. Biophys. Acta 1672, 100–111.

LÁgriculture, O. des N.U. pour lÁlimentation et, and Statistique, D. (2013). FAOSTAT.

Lam, W.C., Sze, C., and Lin, K. (2014). Food Waste Valorisation for High Value.

Lanty, D. (2005). Paramètres de solubilité. Clef du succès en formulation. Ocl 12, 299–

301.

Lienau, A., Glaser, T., Tang, G., Dolnikowski, G.G., Grusak, M.A., and Albert, K. (2003).

Bioavailability of lutein in humans from intrinsically labeled vegetables determined by LC-

APCI-MS. J. Nutr. Biochem. 14, 663–670.

Lin, J.-H., Lee, D.-J., and Chang, J.-S. (2014). Lutein production from biomass: Marigold

flowers versus microalgae. Bioresour. Technol. 184, 421–428.

188

Liu, J., and FAN, S. (2010). Lutein Extraction Processes.

Macias-Sanchez, M.D., Mantell, C., Rodriguez, M., Martinez de la Ossa, E., Lubian, L.M.,

and Montero, O. (2009). Comparison of supercritical fluid and ultrasound-assisted

extraction of carotenoids and chlorophyll a from Dunaliella salina. Talanta 77, 948–952.

Macías-Sánchez, M.D., Mantell, C., Rodríguez, M., Martínez De La Ossa, E., Lubián,

L.M., and Montero, O. (2005). Supercritical fluid extraction of carotenoids and chlorophyll

a from Nannochloropsis gaditana. J. Food Eng. 66, 245–251.

Macías-Sánchez, M.D., Mantell, C., Rodríguez, M., Martínez de la Ossa, E., Lubián, L.M.,

and Montero, O. (2007). Supercritical fluid extraction of carotenoids and chlorophyll a

from Synechococcus sp. J. Supercrit. Fluids 39, 323–329.

Macías-Sánchez, M.D., Serrano, C.M., Rodríguez, M.R., and Martínez de la Ossa, E.

(2009). Kinetics of the supercritical fluid extraction of carotenoids from microalgae with

CO2 and ethanol as cosolvent. Chem. Eng. J. 150, 104–113.

Macías-Sánchez, M.D., Fernandez-Sevilla, J.M., Fernández, F.G.A., García, M.C.C., and

Grima, E.M. (2010). Supercritical fluid extraction of carotenoids from Scenedesmus

almeriensis. Food Chem. 123, 928–935.

Martinez, J., Rosa, P.T.V., and Meireles, M.A.A. (2007). Extraction of Clove and Vetiver

Oils with Supercritical Carbon Dioxide: Modeling and Simulation. Open Chem. Eng. J. 1,

1–7.

Martins, N., and Ferreira, I.C.F.R. (2017). Wastes and by-products: Upcoming sources of

carotenoids for biotechnological purposes and health-related applications. Trends Food

Sci. Technol. 62, 33–48.

Martins, P.F., De Melo, M.M.R., and Silva, C.M. (2015). Gac oil and carotenes production

using supercritical CO2: Sensitivity analysis and process optimization through a RSM-

COM hybrid approach. J. Supercrit. Fluids 100, 97–104.

Mattea, F., Martín, Á., and Cocero, M.J. (2009). Carotenoid processing with supercritical

fluids. J. Food Eng. 93, 255–265.

189

Melo, M.M.R. De, Barbosa, H.M.A., Passos, C.P., and Silva, C.M. (2014). The Journal of

Supercritical Fluids Supercritical fluid extraction of spent coffee grounds : Measurement

of extraction curves , oil characterization and economic analysis. J. Supercrit. Fluids 86,

150–159.

de Melo, M.M.R., Silvestre, a. J.D., and Silva, C.M. (2014). Supercritical fluid extraction

of vegetable matrices: Applications, trends and future perspectives of a convincing green

technology. J. Supercrit. Fluids 92, 115–176.

Mezzomo, N., and Ferreira, S.R.S. (2016). Carotenoids Functionality, Sources, and

Processing by Supercritical Technology: A Review. J. Chem. 2016, 1–16.

Mezzomo, N., Martínez, J., and Ferreira, S.R.S. (2011). Economical viability of SFE from

peach almond, spearmint and marigold. J. Food Eng. 103, 473–479.

Mohamed, M.H., and Wilson, L.D. (2012). Porous Copolymer Resins: Tuning Pore

Structure and Surface Area with Non Reactive Porogens. Nanomaterials 2, 163–186.

Moity, L., Durand, M., Benazzouz, A., Pierlot, C., Molinier, V., and Aubry, J.-M. (2012).

Panorama of sustainable solvents using the COSMO-RS approach. Green Chem. 14, 1132.

Montelius, C., Osman, N., Weström, B., Ahrné, S., Molin, G., Albertsson, P.-Å., and

Erlanson-Albertsson, C. (2013). Feeding spinach thylakoids to rats modulates the gut

microbiota, decreases food intake and affects the insulin response. J. Nutr. Sci. 2, e20.

Nagini, S., Palitti, F., and Natarajan, A.T. (2015). Chemopreventive Potential of

Chlorophyllin: A Review of the Mechanisms of Action and Molecular Targets. Nutr.

Cancer 67, 203–211.

Nimalaratne, C., Savard, P., Gauthier, S.F., Schieber, A., and Wu, J. (2015).

Bioaccessibility and Digestive Stability of Carotenoids in Cooked Eggs Studied Using a

Dynamic in Vitro Gastrointestinal Model. J. Agric. Food Chem. 63, 2956–2962.

Nobre, B., Marcelo, F., Passos, R., Beirão, L., Palavra, A., Gouveia, L., and Mendes, R.

(2006). Supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin and other carotenoids from

the microalga Haematococcus pluvialis. Eur. Food Res. Technol. 223, 787–790.

190

Ole, G. (1955). Method of isolating chlorophyll constituents of plant material.

Özkan, G., and Ersus Bilek, S. (2015). Enzyme-assisted extraction of stabilized chlorophyll

from spinach. Food Chem 176, 152–157.

Pereira, C.G., and Meireles, M.A.A. (2010). Supercritical fluid extraction of bioactive

compounds: Fundamentals, applications and economic perspectives. Food Bioprocess

Technol. 3, 340–372.

Pereira, C.G., Prado, J.M., and Meireles, M.A.A. (2013). Economic Evaluation of Natural

Product Extraction Processes.

Peschel, W., Sánchez-Rabaneda, F., Diekmann, W., Plescher, A., Gartzía, I., Jiménez, D.,

Lamuela-Raventós, R., Buxaderas, S., and Codina, C. (2006). An industrial approach in

the search of natural antioxidants from vegetable and fruit wastes. Food Chem. 97, 137–

150.

Prado, J.M., Prado, G.H.C., and Meireles, M.A.A. (2011). The Journal of Supercritical

Fluids Scale-up study of supercritical fluid extraction process for clove and sugarcane

residue. J. Supercrit. Fluids 56, 231–237.

Prado, J.M., Dalmolin, I., Carareto, N.D.D., Basso, R.C., Meirelles, A.J.A., Oliveira, J.V.,

Batista, E.A.C., and Meireles, M.A.A. (2012). Supercritical fluid extraction of grape seed :

Process scale-up , extract chemical composition and economic evaluation. J. Food Eng.

109, 249–257.

Prat, D., Pardigon, O., Flemming, H.W., Letestu, S., Ducandas, V., Isnard, P., Guntrum,

E., Senac, T., Ruisseau, S., Cruciani, P., et al. (2013). Sanofi’s Solvent Selection Guide: A

Step Toward More Sustainable Processes. Org. Process Res. Dev. 17, 1517–1525.

Prat, D., Wells, A., Hayler, J., Sneddon, H., McElroy, C.R., Abou-Shehada, S., and Dunn,

P.J. (2016). CHEM21 selection guide of classical- and less classical-solvents. Green Chem.

18, 288–296.

Pumilia, G., Cichon, M.J., Cooperstone, J.L., Giuffrida, D., Dugo, G., and Schwartz, S.J.

(2014). Changes in chlorophylls, chlorophyll degradation products and lutein in pistachio

191

kernels (Pistacia vera L.) during roasting. Food Res. Int. 65, Part B, 193–198.

QIU, D., Chen, Z., Shi, L., Li, J., and CAI, L. (2017). Lutein feed additive preparation

method.

RAMSEY, E., SUN, Q., ZHANG, Z., ZHANG, C., and GOU, W. (2009). Mini-Review:

Green sustainable processes using supercritical fluid carbon dioxide. J. Environ. Sci. 21,

720–726.

Richard Turton, Richard C. Bailie, Wallace B. Whiting, J.A.S. (2013). Analysis, Synthesis

and Design of Chemical Processes Third Edition.

Roberts, J.L., and Moreau, R. (2016). Functional properties of spinach (Spinacia oleracea

L.) phytochemicals and bioactives. Food Funct.

Rodriguez, D. (2001). A Guide to Carotenoid Analysis in Foods.

Rodríguez-Bernaldo de Quirós, A., and Costa, H.S. (2006). Analysis of carotenoids in

vegetable and plasma samples: A review. J. Food Compos. Anal. 19, 97–111.

Rosa, P.T.V., and Meireles, M.A.A. (2005). Rapid estimation of the manufacturing cost of

extracts obtained by supercritical fluid extraction. J. Food Eng. 67, 235–240.

Scheer, H. (2013). Chlorophylls and carotenoids (Elsevier Inc.).

schoefs, B. (2005). Plant Pigments: Properties, Analysis, Degradation. In Advances in

Food and Nutrition Research, (Academic Press), pp. 41–91.

Schoefs, B. (2002). Chlorophyll and carotenoid analysis in food products. Properties of the

pigments and methods of analysis. Trends Food Sci. Technol. 13, 361–371.

Schoefs, B. (2005). Plant Pigments: Properties, Analysis, Degradation. Prog. Opt. 49, 41–

91.

Scotter, M.J., Castle, L., and Roberts, D. (2005). Method development and HPLC analysis

of retail foods and beverages for copper chlorophyll (E141[i]) and chlorophyllin (E141[ii])

food colouring materials. Food Addit. Contam. 22, 1163–1175.

192

Sharma, D., Kumar, S.S., and Sainis, K.B. (2007). Antiapoptotic and immunomodulatory

effects of chlorophyllin. Mol. Immunol. 44, 347–359.

Sicaire, A.G., Vian, M., Fine, F., Joffre, F., Carré, P., Tostain, S., and Chemat, F. (2015).

Alternative bio-based solvents for extraction of fat and oils: Solubility prediction, global

yield, extraction kinetics, chemical composition and cost of manufacturing. Int. J. Mol. Sci.

16, 8430–8453.

Silva, A.F., De Melo, M.M.R., and Silva, C.M. (2014). Supercritical solvent selection

(CO2 versus ethane) and optimization of operating conditions of the extraction of lycopene

from tomato residues: Innovative analysis of extraction curves by a response surface

methodology and cost of manufacturing hybrid ap. J. Supercrit. Fluids 95, 618–627.

da Silva, R.P.F.F., Rocha-Santos, T.A.P., and Duarte, A.C. (2016). Supercritical fluid

extraction of bioactive compounds. TrAC Trends Anal. Chem. 76, 40–51.

Simonich, M.T., McQuistan, T., Jubert, C., Pereira, C., Hendricks, J.D., Schimerlik, M.,

Zhu, B., Dashwood, R.H., Williams, D.E., and Bailey, G.S. (2008). Low-dose dietary

chlorophyll inhibits multi-organ carcinogenesis in the rainbow trout. Food Chem. Toxicol.

46, 1014–1024.

Simonovska, B., Vovk, I., Glavnik, V., and Černelič, K. (2013). Effects of extraction and

high-performance liquid chromatographic conditions on the determination of lutein in

spinach. J. Chromatogr. A 1276, 95–101.

Škerget, M., Knez, Ž., and Knez-Hrnčič, M. (2011). Solubility of solids in sub- and

supercritical fluids: A review. J. Chem. Eng. Data 56, 694–719.

Soh, L., and Eckelman, M.J. (2016). Green Solvents in Biomass Processing. ACS Sustain.

Chem. Eng. acssuschemeng.6b01635.

Solana, M., Mirofci, S., and Bertucco, A. (2016). Production of phenolic and glucosinolate

extracts from rocket salad by supercritical fluid extraction: Process design and cost benefits

analysis. J. Food Eng. 168, 35–41.

Sovov??, H. (2005). Mathematical model for supercritical fluid extraction of natural

193

products and extraction curve evaluation. J. Supercrit. Fluids 33, 35–52.

Sovová, H., Sajfrtová, M., Bártlová, M., and Opletal, L. (2004). Near-critical extraction of

pigments and oleoresin from stinging nettle leaves. J. Supercrit. Fluids 30, 213–224.

Srinivas, K., King, J.W., Monrad, J.K., Howard, L.R., and Hansen, C.M. (2009).

Optimization of subcritical fluid extraction of bioactive compounds using hansen solubility

parameters. J. Food Sci. 74, 342–354.

Srinivas, K., King, J.W., Howard, L.R., and Monrad, J.K. (2010a). Solubility and solution

thermodynamic properties of quercetin and quercetin dihydrate in subcritical water. J. Food

Eng. 100, 208–218.

Srinivas, K., King, J.W., Howard, L.R., and Monrad, J.K. (2010b). Solubility of gallic acid,

catechin, and protocatechuic acid in subcritical water from (298.75 to 415.85) K. J. Chem.

Eng. Data 55, 3101–3108.

Tachiki, K.H., Parlette, P.R., and Pon, N.G. (1969). Water soluble spinach chloroplast

chlorophyll-protein complexes prepared without added detergents or organic solvents.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 34, 162–169.

Tanaka, T., Shnimizu, M., and Moriwaki, H. (2012). Cancer chemoprevention by

carotenoids. Molecules 17, 3202–3242.

Taylor, M.K., Young, T.M., Butzke, C.E., and Ebeler, S.E. (2000). Supercritical Fluid

Extraction of 2,4,6-Trichloroanisole from Cork Stoppers. J. Agric. Food Chem. 48, 2208–

2211.

Tuck, C.O., Perez, E., Horvath, I.T., Sheldon, R. a., and Poliakoff, M. (2012). Valorization

of Biomass: Deriving More Value from Waste. Science (80-. ). 337, 695–699.

Tumolo, T., and Lanfer-Marquez, U.M. (2012). Copper chlorophyllin: A food colorant

with bioactive properties? Food Res. Int. 46, 451–459.

Vardanega, R., Carvalho, P.I.N., Albarelli, J.Q., Santos, D.T., and Meireles, M.A.A.

(2017). Techno-economic evaluation of obtaining Brazilian ginseng extracts in potential

production scenarios. Food Bioprod. Process. 101, 45–55.

194

Williams, L.L., Rubin, J.B., and Edwards, H.W. (2004). Calculation of Hansen solubility

parameter values for a range of pressure and temperature conditions, including the

supercritical fluid region. Ind. Eng. Chem. Res. 43, 4967–4972.

Yara-Varón, E., Fabiano-Tixier, A.S., Balcells, M., Canela-Garayoa, R., Bily, A., and

Chemat, F. (2016). Is it possible to substitute hexane with green solvents for extraction of

carotenoids? A theoretical versus experimental solubility study. RSC Adv. 6, 27750–

27759.

Yim, K.H., Stambouli, M., and Pareau, D. (2014). Alternative Solvents for Natural

Products Extraction.

Yin, G., and Dang, Y. (2008). Optimization of extraction technology of the Lycium

barbarum polysaccharides by Box–Behnken statistical design. Carbohydr. Polym. 74, 603–

610.

Zaghdoudi, K., Framboisier, X., Frochot, C., Vanderesse, R., Barth, D., Kalthoum-Cherif,

J., Blanchard, F., and Guiavarc’h, Y. (2016). Response surface methodology applied to

Supercritical Fluid Extraction (SFE) of carotenoids from Persimmon (Diospyros kaki L.).

Food Chem. 208, 209–219.

Zhengyun, W., Shimin, W., and Xianming, S. (2007). Supercritical fluid extraction and

determination of lutein in heterotrophically cultivated Chlorella pyrenoidosa. J. Food

Process Eng. 30, 174–185.

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Bioraffinage de sous-produits de l’épinard (Spinacia ...€¦ · Using supercritical fluid extraction along with ethanol as modifier, the optimal extraction parameters allowed