BioScope Resolve BioAFMbruker-nano.actonsoftware.com/acton/attachment/9063/f...BioScope Resolve BioAFM The Most Advanced AFM for Life Science Research Masami Saito Application Engineer,

BioScope Resolve BioAFM The Most Advanced AFM for Life Science Research

Masami Saito Application Engineer, Bruker Nano surface Devision

Bruker Nano Surfaces Division

How Does AFM Work?

9/3/2015 3 Bruker Nano Surfaces Division

(Figures and video from www.freesbi.ch)

Bruker Series of AFMs for Life Science

9/3/2015 4

MultiMode® 8

Highest resolution AFM for molecular imaging

BioScope Resolve™

True functional integration of AFM and

optical microscopy

Dimension FastScan Bio™

High-speed imaging of biomolecular and cellular

dynamics.

• Multiple Bruker AFM Platforms being used in leading biological research and biotechnology industry.


FastScan Bio AFM 高速・高分解能測定

0.5fps

2.0fps

1.0fps

3.0fps

Lamba Digest DNA in buffer.

(500nm x 500nm x 2nm)

Bruker Nano Surfaces Division 9/3/2015 5

高速測定でも:

イメージ分解能の劣化を最小に抑え

DNAを破壊することなく測定

Mouse embryonic stem cells. Obtained over 12hrs with a 40x phase contrast objective.

© The Exploratorium, www.exploratorium.edu

50 mm

50 mm

Obtained over ~1hr at 40sec/frame at 512 x 128 pixel resolution. Phase images shown. (~10 mm scan size)

FastScan Bio AFM of Cell Structure Dynamics 哺乳類の細胞移動


Bruker BioScope ResolveTM BioAFM 比類のないイメージ分解能をもち、機械生物特性が計測できる PeakForce Tapping®を搭載

9/3/2015 8

• 細胞と分子メカニクスのために開発した最も包括的なパッケージ

• 新 PeakForce QNM® は、生細胞上で最高速、最高分解能の

ナノ機械特性が得られる

• 新 FASTForce VolumeTM は新たな特性マッピングを搭載し、

さまざまな速度と荷重感度でデータ取得できる

• BioAFMの中で、実質的に最高の感度をもつ

• ルーチン測定で最高分解能の分子構造測定が可能

• 生細胞の全体をアーティファクトなくScanAsyst自動イメージング

• AFMと光学顕微鏡が完全に融合し、高度な相関が取れる

• 完全な融合により、AFMイメージと様々な光学測定技術をシンクロできる

• 自動測定機能により、ハイスループットでデータを取得

• 生物試料のハンドリングに優れ、生細胞研究向けの高度な環境制御オプション


BioScope Resolve バイオ実験のための完璧なアクセサリー

• ディッシュ、スライドガラス、カバーガラスいずれのサンプルにも、容易にアクセスできる

• EasyAlignプローブ取付ステーション

• マイクロボリュームセル (60µL)

• サンプルヒーター

• 還流ステージインキュベーター (PSI)

• 直上観察用光学顕微鏡

9/3/2015 9

Unrivalled open design for easy sample access

New EasyAlign platform for Easy Probe Loading


New Cantilever Holder & Micro Volume cell (60µL)

Top View Optics with stand

New BioScope Resolve User Interface 究極の Ease-of-Use データ取得


MIROView Optical Synchronization 光学顕微鏡とAFMのシームレスな融合

• CCDカメラや共焦点顕微鏡で高機能な蛍光像や明視野像を取得し、自動的にAFMソフトにインポート

• 光学像が取得できるタイミングは:

• AFMスキャンラインごと

• AFMイメージごと

• フォースカーブごと (アプローチやリトラクト)

• AFM と光学像の位置合わせは、後処理もできる。光学データはナノスコープ上のムービーメーカーで再生可能

12 9/3/2015

Synchronization of AFM and Confocal Imaging of MDCK cells. Actin fibers are fluorescently labeled with Alexa Fluor® 546 Phalloidin.

Confocal images showing deliberate photobleaching of the dye are captured every 25s during continuous AFM imaging of the cell structure.


Approach Retract

z Δz

Zajac & Discher (2008) Curr Opin Cell Biol 20: 609-6150

Glycosan Biosystems & SigmaAldrich

AFM in Cell Mechanics 生物機械特性

• 細胞は‘力’を感知し、反応する

• それぞれの組織でさまざまな弾性を示す

• 病気は細胞の機械特性に影響を及ぼす

• AFM フォースカーブが測定できるのは: • Elasticity/Modulus

• Adhesion

• Molecular (un)folding

• Binding interactions

• Response to mechanical stimulus


z Δz

F= -k(Δz)


Exposure Time

• 選択したスキャン範囲上で、2次元のアレイ状の各位置でフォースカーブを取得

イメージングスピードと分解能はトレードオフの関係をもつ

• 繊維芽細胞にサイトカラシンBを投与した後に

アクチンフィラメントがほどけていく様子

Radmacher et al. (2000) Biophys. J., vol 78: 520-35.

Force Volume Imaging 細胞の弾性マッピング

New

Increased flexibility & productivity for force mapping

9/3/2015 16

• 高速, 定量的フォースマッピングが <1Hz から最大 300 Hz のランプレートで測定可能

• データ取得が改良

• ランプ中のZ-sensorデータを保存よってクローズドループはもはや必要なし

• 時間の無駄なく、コの字型の両方向のスキャンも選択可能

• 軟らかいサンプルのための低荷重のトリガー

• 新 FASTForce Volume ウィンドウ

• 複数のランプデータチャンネル

• 複数の特性マッピング: force modulus, stiffness, adhesion, force slice (and height)

• 高分解能測定

• (256x256)x2048 or max pixels (956x956)x256

• 解析の改良

• “Real Height” データ

• 密度プロット, 輪郭プロット等


Movie 1: Traditional Force Volume image acquired at 1Hz (16x16 pixels)

Movie 2: New FASTForce Volume image acquired at 156Hz (128x128 pixels)

PeakForce Tapping Technology Controls and measures force as feedback

Z motion

Deflection

Z position

Probe motion resembles a typical

force curve…

PeakForce Tapping モード:

• プローブが低い周波数、小さい振幅で振動する (125-2kHz).

• フィードバック信号にはチップとサンプル間の最大フォースを使う

• イメージングとーすを直接制御し、弱い荷重で測定が可能 (<100pN).

• 高分解能の計測が一般的なスキャン速度で取得可能 (1000’s force curves/sec).


PeakForce Tapping Imaging Accurately Measuring the Diameter of DNA

9/3/2015 18

イメージングフォースを低くし、かつ精密に制御することが可能なPeakForce Tapping技術を使えば、B-DNAの約2nmの直径を正確に計測することができる

50nm


Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Fo

rce

Separation

Sneddon Model

DMT Model

Adhesion Imaging

Dissipation

Modulus

Deformation

• 形状測定と同時に、定量性のある二次元のナノ機械特性データが取得できる

• 広範囲での材料物性が計測可能

(kPa-GPa).

• DMT と Sneddon 弾性モデルに対応

• PeakForce キャプチャー機能で全フォースカーブを保存し、計測後に解析することが可能

Modified from Cox and Erler. Dis. Model. Mech. (2011) 4:165-178.


of Live Cells

再現性の良いデータ、高分解能の細胞機械特性

9/3/2015 20

• PeakForce QNM マッピングで生細胞観察に供給するのは:

• 高分解能機械特性マッピングの高速データ取得(最速2kHzまで)

• 定量的な、再現性の高い測定

• Achieved Through:

• サンプルを非常に安定に固定できる機構を有する

• ブルカーの PeakForce QNM-Live Cell プローブ (k~0.08N/m, 17µm tip, ~65nm 先端曲率固定)

• 新 PeakForce Tapping live cell バックグランド除去アルゴリズム

PeakForce QNM topography image (top) and modulus image (bottom) of living MDCK cells.

5µm

5µm


~130nm

PeakForce QNM-Live Cell Probe

9/7/2015 22 BRUKER CONFIDENTIAL

Glioblastoma (isogenic cell line) Low Res (but faster) imaging with PFQNM

Topography (z: 0-250 pN) Elasticity (z: 0-1.2 MPa) Adhesion (z: 0-800 pN)

Deformation (z: 0-250 nm)

• 128x128 images (5 min per image): averaging on a high number of images

• Highly quantitative

• No damage of the sample

75x75 µm

9/7/2015 23 BRUKER CONFIDENTIAL

Glioblastoma (isogenic cell line) Results

Elasticity (kPa)

0

20

40

60

80

100

120

140

Ctrl IND Ctrl non-

IND

tp53 non-

IND

tp53 IND pTEN non-

IND

pTEN IND

Deformation (nm)

0

50

100

150

200

250

Ctrl IND Ctrl non-IND tp53 non-

IND

tp53 IND pTEN non-

IND

pTEN IND

Young’s modulus (kPa)

Deformation (nm)

TP53 and PTEN induced are

significantly stiffer and less

deformable than the other

cell types

定量性のある、再現性の高いデータ

9/3/2015 26

PFT -1kHz (kPa) PFT -500Hz

(kPa)

PFT - 250Hz

(kPa)

Sample: 1.25% Agarose Gel

Average* 24.2 13.1 15.2

STD 3.1 3.5 1.8

2.5% Agarose Gel

Average 283 180 120

STD 51 27 24

5% Agarose Gel

Average 485 258 213

STD 75 26 12

• 複数のユーザーが複数のプローブで複数のサンプルを測定

• 広い周波数範囲で、 PeakForce QNM が非常に安定したデータを示した

* Average represents 2 users, alternating with 3 probes and 3 samples on many sites to perform measurements


• 周波数範囲を拡張し、フォースボリュームとPeakForce QNMの計測領域がオーバーラップ

PeakForce QNMの最低周波数を125Hzまで下げ、かつ、FVの速度を300Hzまで増加

• 生産性を向上させ、高分解能FVマッピング実験が可能

• 物性マッピングの時間依存性を調べることができる

Most Comprehensive Package for Biomechanics 物性の時間依存性の研究に貢献


倒立型顕微鏡上に組み合わせたAFMでは最高の分解能

9/3/2015 28

10nm

DNA二重らせん構造の主溝、副溝を分離するサブ分子分解能.

画像は倒立顕微鏡の上で撮影

10nm

バクテリオロドプシン(bR)の格子構造を倒立顕微鏡の上で撮影。挿入図はbR三量体の1分子の平均画像を示している。緑の丸は1格子欠陥を示し、青の丸は1格子構造を示す。Z scale 0.6nm

20 nm


• ScanAsyst Fluid-HiRes プローブ (k ~0.05N/m or 0.4N/m, <2nm 先端曲率)

PeakForce Tapping イメージング生きている細胞

9/3/2015 29

XY= 95µm

Z = 4.5µm

XY = 5µm

Z = 0.7µm

• アーティファクトなしに細胞の全体の構造を計測できる

• XY-Scan 範囲 ≥100µm; Z-Scan 範囲 ≥15µm

• Bruker PeakForce QNM-Live Cell プローブ (k~0.08N/m, 17µm tip高さ)

• 新 PeakForce Tapping 生細胞バックグランド除去アルゴリズム

• 細胞イメージングのための新 ScanAsyst モード


Bioscope Resolve with PeakForce Tapping 生細胞上の微絨毛の高分解能イメージング

9/3/2015 30

5µm

生きているMDCK細胞の1kHz PeakForce Tappingイメージ, Dr. Hermann Schillers, University of Münster. (Inset: SEM image of MDBK cells at

2400x mag.)


PeakForce Tapping of Cell Structures 細胞の上の微絨毛の‘そのままの’構造を、低荷重で分離

PeakForce Tapping of Living MDCK Cells. BioScope Resolve using PFQNM-LC probes (0.1N/m)

170pN

0.3Hz

170pN

0.3Hz

28pN

0.2Hz

28pN

0.45Hz

左: 微絨毛の電子顕微鏡イメージ右: 固定したMDCK細胞のPeakForce Tapping イメージ

• 上皮生細胞に微絨毛は存在し、複数の過程に関与する

• PeakForce Tappingは初めて生きている細胞の上で微絨毛の観察を可能にした.

• <30pNの低荷重イメージングにより、微絨毛が立ち上がった円柱状構造を持っていることがイメージングできる structures.

Schillers et al. (Submitted to J. Mol. Rec.)


Bruker BioScope Resolve BioAFM Unrivalled BioAFM Imaging Resolution and Biomechanics Enabled by PeakForce Tapping

9/3/2015 32

• 細胞と分子機械特性測定のための最も包括的なシステム

• BioAFM史上、最高イメージン分解能に到達

• AFMと光学顕微鏡を完全に融合させ、高度に相関が必要な研究に用いることが可能


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