Biosynthtic Pathway of Desomine in Elastin

5/28/2018 Biosynthtic Pathway of Desomine in Elastin

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4 5i o c h e m . J . 1 9 7 3 ) 1 3 6 , 4 5 - 5 5P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

B i o s y n t h e t i c P a t h w a y o f D e s m o s i n e s i n E l a s t i nBy GILLIAN FRANCIS, RHYS JOHN a n d JOHN THOMASD e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y C o l l e g e , P . O . Box 7 8 , C a r d i f f C F I 1 X L , U . K .

( R e c e i v e d 1 4 F e b r u a r y 1 9 7 3 )

1 . E l a s t i n s p u r i f i e d b y v a r i o u s m e t h o d s f r o m t h e l i g a m e n t u m n u c h a e a n d t h e l u n g so f c a t t l e o f v a r i o u s a g e s w e r e a n a l y s e d f o r a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n s a n d l y s i n e - d e r i v e dc r o s s - l i n k s . 2 . I n f u l l y m a t u r e e l a s t i n s f r o m a d u l t s t h e m a i n c r o s s - l i n k s w e r e d e s m o s i n e ,i s o d e s m o s i n e a n d l y s i n o n o r l e u c i n e a n d t h e s o - c a l l e d a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t .T r a c e a m o u n t s o f m e r o d e s m o s i n e w e r e a l s o f o u n d . 3 . D u r i n g t h e n o r m a l m a t u r a t i o no f e l a s t i n s t h e a m o u n t s o f d e s m o s i n e , i s o d e s m o s i n e a n d l y s i n o n o r l e u c i n e i n c r e a s e d ,w h e r e a s t h e a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t a n d i n t a c t l y s i n e r e s i d u e s d e c r e a s e d a n dm e r o d e s m o s i n e r e m a i n e d t h e s a m e . 4 . E l a s t i n s f r o m y o u n g a n i m a l s c o n t a i n e ds i g n i f i c a n t a m o u n t s o f d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e w h e r e a s e l a s t i n s f r o m a d u l t s c o n t a i n e dv i r t u a l l y n i l . E v i d e n c e i s p r e s e n t e d w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y o fd e s m o s i n e a n d i s o d e s m o s i n e p r o c e e d s v i a t h e a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t a n dd e h y d r o m e r o d e s m o s i n e .E l a s t i n i s a r u b b e r - l i k e i n s o l u b l e p r o t e i n p r e s e n t i nm a m m a l i a n c o n n e c t i v e t i s s u e s . T h e r e i s e v i d e n c et h a t t h e e l a s t i c f i b r e s o f t h e s e t i s s u e s a r e f o r m e d b ya g g r e g a t i o n o f s o l u b l e p r o t e i n s u b u n i t s i n t h e e x t r a -c e l l u l a r s p a c e ( S a n d b e r g e t a l . , 1 9 6 9 ) . T h e e x t r e m ei n s o l u b i l i t y o f e l a s t i n i s d u e t o a c o n s i d e r a b l e e x t e n tt o t h e f o r m a t i o n o f c o v a l e n t c r o s s - l i n k s b e t w e e n

g r o u p s o n t h e s i d e c h a i n s o f l y s i n e r e s i d u e s w h i c h l i ei n c l o s e p r o x i m i t y i n a d j a c e n t p o l y p e p t i d e c h a i n s .T h e f i r s t t w o c r o s s - l i n k i n g c o m p o u n d s t o b e i s o -l a t e d f r o m e l a s t i n w e r e d e s m o s i n e a n d i s o d e s m o s i n e( T h o m a s e t a l . , 1 9 6 3 ) , a n d l a t e r o t h e r l y s i n e - d e r i v e d ,b u t c h e m i c a l l y s i m p l e r , c r o s s - l i n k i n g c o m p o u n d sw e r e d i s c o v e r e d . T h e s t r u c t u r e o f t h e s e c o m p o u n d sa n d t h e p o s s i b l e r o u t e s o f t h e i r b i o s y n t h e s i s f r o ml y s i n e r e s i d u e s a r e p r e s e n t e d i n S c h e m e 1 .I t i s g e n e r a l l y a g r e e d t h a t t h e k e y s t e p i n t h e b i o -s y n t h e s i s o f a l l t h e s e l y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s i s t h eo x i d a t i v e d e a m i n a t i o n o f t h e c - a m i n o g r o u p s o fs e l e c t e d l y s i n e r e s i d u e s t o y i e l d r e s i d u e s o f o c - a m i n o -a d i p i c 8 - s e m i a l d e h y d e r e a c t i o n 1 , S c h e m e 1 ; M i l l e re t a l . , 1 9 6 7 ) . T h e s e a l d e h y d i c r e s i d u e s c a n t h e np a r t i c i p a t e i n S c h i f f - b a s e r e a c t i o n s w i t h c - a m i n og r o u p s o f o t h e r l y s i n e r e s i d u e s o r i n a l d o l c o n -d e n s a t i o n s w i t h o t h e r s i m i l a r a l d e h y d i c r e s i d u e s .T h u s t h e c r o s s - l i n k i n g c o m p o u n d l y s i n o n o r l e u c i n ef i r s t i s o l a t e d f r o m a c i d h y d r o l y s a t e s o f e l a s t i n b yF r a n z b l a u e t a l . 1 9 6 5 ) w a s s h o w n t o b e ad i c a r b o x y l i c d i a m i n o a c i d p r o d u c e d b y t h e r e d u c t i o ni n v i v o o f a S c h i f f - b a s e p r e c u r s o r d e h y d r o l y s i n o -n o r l e u c i n e ) f o r m e d b y t h e i n t e r a c t i o n o f a r e s i d u e o ft h e s e m i a l d e h y d e w i t h a l y s i n e r e s i d u e ( S c h e m e 1 ,r e a c t i o n s 2 a n d 3 ) . S i m i l a r l y , t h e p r o d u c t d e r i v e df r o m t h e a l d o l c o n d e n s a t i o n o f t w o s e m i a l d e h y d er e s i d u e s , t h e s o - c a l l e d a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c tV o l . 1 3 6

s e e r e a c t i o n 4 , S c h e m e 1 ) , w a s i s o l a t e d a s t h e c o r r e -s p o n d i n g a l c o h o l d e r i v a t i v e f r o m a l k a l i n e h y d r o -l y s a t e s o f e l a s t i n t h a t h a d b e e n f i r s t t r e a t e d w i t h t h er e d u c i n g a g e n t NaBH4 L e n t e t a l . , 1 9 6 9 ) .A c o m p l e x c o m p o u n d d e r i v e d f r o m t h r e e l y s i n er e s i d u e s w a s d e t e c t e d i n t r a c e a m o u n t s i n a l k a l i -t r e a t e d e l a s t i n b y S t a r c h e r e t a l . 1 9 6 7 ) . T h i s c o m -p o u n d , m e r o d e s m o s i n e , i s p r o b a b l y f o r m e d f r o md e h y d r o m e r o d e s m o s i n e , a n a c i d - l a b i l e c o m p o u n dr e s u l t i n g f r o m t h e i n t e r a c t i o n o f t h e a l d o l - c o n -d e n s a t i o n p r o d u c t o f r e a c t i o n 4 a n d t h e c - a m i n og r o u p o f a t h i r d l y s i n e r e s i d u e . T h i s i n t e r a c t i o n S c h i f f - b a s e f o r m a t i o n ) c a n b e c a t a l y s e d i n t h e l a b o r a -t o r y b y h o t a l k a l i a n d t h e s u b s e q u e n t r e d u c t i o no f t h e p r o d u c t w i t h NaBH4 y i e l d s a c i d - s t a b l e m e r o -d e s m o s i n e s e e S c h e m e 1 , r e a c t i o n s 5 a n d 6 ) w h i c hc a n t h e n b e i s o l a t e d f r o m a c i d - h y d r o l y s e d e l a s t i n .T h e p o s s i b i l i t y h a s t h e r e f o r e e x i s t e d t h a t t h em e r o d e s m o s i n e d e t e c t e d i n e l a s t i n h y d r o l y s a t e s b yS t a r c h e r e t a l . 1 9 6 7 ) w a s a n a r t i f a c t a r i s i n g f r o mt h e e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e s e m p l o y e d . H o w e v e r ,P a z e t a l . 1 9 7 1 ) h a v e s u b s e q u e n t l y r e p o r t e d t h ep r e s e n c e o f b o t h m e r o d e s m o s i n e a n d d e h y d r o -m e r o d e s m o s i n e i n e l a s t i n i s o l a t e d w i t h o u t e x p o s u r et o a l k a l i a n d r e d u c t i o n . I t t h e r e f o r e s e e m s p r o b a b l et h a t b o t h c o m p o u n d s o c c u r n a t u r a l l y i n t h e e l a s t i nm o l e c u l e .T h e m o s t c o m p l e x o f t h e e l a s t i n c r o s s - l i n k i n gc o m p o u n d s a r e d e s m o s i n e a n d i s o d e s m o s i n e . B o t ha r e i s o m e r i c p y r i d i n i u m c o m p o u n d s d e r i v e d f r o mt h e c y c l i z a t i o n o f t h e s i d e - c h a i n g r o u p s o f f o u rl y s i n e r e s i d u e s . A t t h e p r e s e n t t i m e t h e b i o s y n t h e t i cr o u t e t o t h e s e i s o m e r s i s n o t c l e a r l y d e f i n e d . A n u m b e ro f p a t h w a y s a r e p o s s i b l e a n d t h e o n e s u g g e s t e d b yS t a r c h e r e t a l . 1 9 6 7 ) , b a s e d o n t h e i n t e r a c t i o n o f


2/11

G . FRANCIS, R . JOHN AND J . THOMAS

NH2CH-(CH2)4-NH2COOH

L y s i n e

NH2 NH2 NH2C H - ( C H 2 ) 3 - C H O - C H - ( C H 2 ) 3 - C H = N - ( C H 2 ) 4 - C HCOOH COOH COOHo c - A m i n o a d i p i c D e h y d r o l y s i n o n o r l e u c i n e8 - s e m i a l d e h y d e

j 4H2N - CH - COOH

C H 2 ) 2C H2

NH2 /CHCH-(CH2)2-CCOOH CHO

A l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t

H2N-CH-COOH C i H 2 ) 2C H 2

j H 2 HuHf-CH2)2-CC O O H I C H

N( C H 2 ) 4

H2N-CH-COOHD e h y d r o m e r o d e s m o s i n e

{ 3

NH2 NH2CH-(CH2)3-CH2-NH- ( C H 2 ) 4 - 7 HCOOH COOH

L y s i n o n o r l e u c i n e

H2N-CH-COOH C H k 2 ) 2C H 2

N H 2 I H6 . >CH-(CH2)2-C

COOH CH2NH

C H 2 ) 4H2N-CH-COOH

M e r o d e s m o s i n e

7H2N-CH-COOH jINH2 C H 2 ) 3 COOH

C H - ( C H 2 ) CH2)2-CHCOOHH 2

( C H 2 ) 4H2N- CH-COOH

D e s m o s i n e

NH2NH2 ( C H 2 ) 2 - C HC H - ( C H 2 ) 2 t C O O HCOOH N , NH2( C H 2 ) 3 - C H( U H 2 ) 4 I H 2 ) 4 COOHH 2 N - C H - 7 - C O O H

I s o d e s m o s i n e

S c h e m e 1 . S t r u c t u r e s o f l y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s i n e l a s t i n s h o w i n g t h e i r p o s s i b l e s y n t h e s i s f r o m l y s i n e m o l e c u l e sI n e l a s t i n t h e a - a m i n o a n d a - c a r b o x y l g r o u p s f o r m p e p t i d e b o n d s .1 9 7 3

4 6


3/11

BIOSYNTHESIS OF DESMOSINES

u S l l y U i U r i o m i U r o u i e i U m o s WilI a i o U r I L 1 i y s i n e V r e s i U U e i n 1t h e f o r m o f s e m i a l d e h y d e r e a c t i o n 7 ) , i s shown i nS c h e m e 1. U n f o r t u n a t e l y t h e r e i s as y e t l i t t l e e x p e r i -m e n t a l e v i d e n c e t o s u p p o r t t h i s p a t h w a y .T h e p r e s e n t w o r k was u n d e r t a k e n t o t h r o w l i g h ton t h e p a t h w a y o f b i o s y n t h e s i s o f t h e d e s m o s i n e s .E l a s t i n i n t h e m a t u r e a n i m a l i s a p p a r e n t l y t u r n e dover e x t r e m e l y s l o w l y , i f a t a l l S l a c k , 1 9 5 4 ) . I f t h et y p e o f b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s u g g e s t e d i n S c h e m e 1i s v a l i d , i t f o l l o w s t h a t a s e l a s t i n m o l e c u l e s m a t u r et h e n u m b e r o f l y s i n e r e s i d u e s s h o u l d d i m i n i s h a s morea n d more o f t h e m b e c o m e i n v o l v e d i n t h e f o r m a t i o no f c r o s s - l i n k s . I t a l s o f o l l o w s f r o m Scheme 1 t h a t a st h e c r o s s - l i n k s b e c o m e m o r e c o m p l e x w i t h m a t u r i t y ,s o t h a t l a r g e r amounts o f t h e i s o m e r i c d e s m o s i n e smake t h e i r a p p e a r a n c e , so a l s o w i l l t h e p r o p o r t i o no f c r o s s - l i n k s o f l o w e r c o m p l e x i t y i . e . b a s e d o nt w o o r t h r e e l y s i n e r e s i d u e s ) d e c r e a s e . D e t e r m i n a t i o no f t h e n u m b e r o f l y s i n e r e s i d u e s a n d t h e number a n dt y p e s o f c r o s s - l i n k i n g c o m p o u n d s i n e l a s t i n f r o m a n i -m a l s o f i n c r e a s i n g m a t u r i t y s h o u l d t h e r e f o r e t h r o wl i g h t on t h e p r e c i s e b i o s y n t h e t i c r o u t e t o t h e i s o m e r i cd e s m o s i n e s . A n u m b e r o f d i f f e r e n t s ources o f e l a s t i nh a v e b e e n e m p l o y e d i n t h e s t u d y a n d f o u r d i f f e r e n ti s o l a t i o n m e t h o d s o f d i f f e r i n g c h e m i c a l s e v e r i t y )h a v e b e e n u s e d t o l e s s e n t h e l i k e l i h o o d o f a r t i f a c t sr e s u l t i n g f r o m i s o l a t i o n p r o c e d u r e s .E x p e r i m e n t a lP u r i f i c a t i o n o f e l a s t i n

E l a s t i n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e l i g a m e n t u m n u c h a ea n d t h e v i s c e r a l p l e u r a o f f o e t a l , 1 - w e e k - o l d , 2 - 3 -y e a r - o l d a n d 1 0 - 1 2 - y e a r - o l d c a t t l e . E l a s t i n s w e r ea l s o i s o l a t e d f r o m t h e a o r t a o f c a t t l e , c h i c k s , h u m a n sa n d r a t s a n d f r o m t h e v i s c e r a l p l e u r a a n d t h e paren-c h y m a o f t h e l u n g s o f c a t t l e a n d h u m a n s . T h ep u r i f i c a t i o n m e t h o d s w e r e b a s e d on t h e g r e a t i n s o l u -b i l i t y o f e l a s t i n s a n d i n v o l v e d t h e r e m o v a l o f a l l o t h e rs u b s t a n c e s f r o m t h e t i s s u e s . T h e p r o c e d u r e s i n v o l v e da n i n i t i a l e x t r a c t i o n o f t h e t i s s u e s w i t h s a l t s o l u t i o na n d o r g a n i c s o l v e n t s . T h e r e s i d u e s w e r e t h e n e x t r a c t e db y o n e o f f o u r p r o c e d u r e s w h i c h i n v o l v e d e i t h e r a u t o -c l a v i n g o r t r e a t m e n t w i t h c o l l a g e n a s e o r f o r m i c a c i do r h o t a l k a l i s e e J o h n & T h o m a s , 1 9 7 1 ) . T h ei n s o l u b l e m a t e r i a l s r e m a i n i n g a f t e r t h e d i f f e r e n tt r e a t m e n t s w e r e t a k e n as pure e l a s t i n s .I s o l a t i o n o f m e r o d e s m o s i n e f r o m a c i d h y d r o l y s a t e so f n o n - r e d u c e d a n d r e d u c e d e l a s t i n sThe l i g a m e n t u m n u c h a e f r o m 1 - w e e k - o l d c a l v e s t o t a l o f 4 8 ) w e r e c u t i n t o s m a l l p i e c e s a n d h o m o g e n -i z e d i n 1 M - N a C l i n a V i r T i s 4 5 h o m o g e n i z e r t o g i v e

a creamy s u s p e n s i o n . The r e s i d u e r e m a i n i n g a f t e rc e n t r i f u g i n g w a s e x t r a c t e d t w i c e more w i t h 1 MV o l . 1 3 6

N a C l . T h e i n s o l u b l e m a t e r i a l was t h e n w a s h e dr e p e a t e d l y w i t h w a t e r , d e f a t t e d b y s u s p e n d i n g s u c -c e s s i v e l y i n c h l o r o f o r m - m e t h a n o l 2 : 1 , v / v ) , a l c o h o la n d a c e t o n e , a n d f i n a l l y d r i e d i n v a c u o t o g i v e a f i n ep o w d e r . N o n - r e d u c e d e l a s t i n w a s e x t r a c t e d f r o m ap o r t i o n 2 0 0 g ) o f t h i s p o w d e r b y t r e a t m e n t w i t hh o t 0 . 1 M-NaOH L a n s i n g e t a l . , 1 9 5 2 ) , a n d a f u r t h e rp o r t i o n 2 0 0 g ) w a s f i r s t r e d u c e d w i t h KBH4 b e f o r ee x t r a c t i o n w i t h h o t a l k a l i . R e d u c t i o n w a s p e r -f o r m e d b y s u s p e n d i n g t h e p o w d e r i n 0 . 2 M - T r i s - H C lb u f f e r , p H 7 . 2 2 . 5 l i t r e s ) , a d d i n g KBH4 l O g ) w i t hs t i r r i n g a n d l e a v i n g o v e r n i g h t . E x c e s s o f KBH4was d e s t r o y e d b y a c i d i f y i n g w i t h a c e t i c a c i d a n di n s o l u b l e m a t e r i a l w a s r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g i n ga n d w a s h e d w i t h w a t e r . T h e m a t e r i a l w a s t h e ne x t r a c t e d w i t h h o t a l k a l i L a n s i n g e t a l . , 1 9 5 2 )t o g i v e r e d u c e d e l a s t i n .M e r o d e s m o s i n e w a s e x t r a c t e d f r o m n o n - r e d u c e da n d r e d u c e d e l a s t i n s l O O g o f e a c h ) b y s u s p e n d i n gi n 5 . 7 M - H C I 2 . 5 l i t r e s ) a n d r e f l u x i n g i n a na t m o s p h e r e o f N 2 f o r 2 4 h . H C l w a s r e m o v e d b yr e p e a t e d e v a p o r a t i o n a n d t h e h y d r o l y s a t e w a sd i s s o l v e d i n t h e m i n i m u m v o l u m e o f w a t e r , c o o l e dt o 0 C a n d i n s o l u b l e m a t e r i a l r e m o v e d b y c e n t r i -f u g i n g . To t h e s u p e r n a t a n t w a s a d d e d 0 . 2 M - s o d i u mc i t r a t e - H C l b u f f e r , p H 2 . 2 6 1 i t r e s ) , a n d t h e s o l u t i o nwas a p p l i e d t o a c o l u m n ( 4 0 c m x 5 c m ) o f Z e o - K a r b2 2 5 [ 8 c r o s s - l i n k e d DVB d i v i n y l b e n z e n e ; P e r -m u t i t C o . L t d . , L o n d o n W . 4 , U . K . ) ; Na+ f o r m :1 0 0 - 2 0 0 m e s h ] . T h e c o l u m n w a s w a s h e d w i t h0 . 2 M - s o d i u m c i t r a t e - H C l b u f f e r , p H 4 . 2 5 9 . 5 l i t r e s )t o e l u t e t h e a c i d i c , n e u t r a l a n d a r o m a t i c a m i n oa c i d s . W a s h i n g w a s t h e n c o n t i n u e d w i t h 3 . 5 l i t r e so f 0 . 3 5 M - s o d i u m c i t r a t e - H C l b u f f e r , p H 5 . 2 8 ,t h e f i r s t 2 . 5 l i t r e s b e i n g d i s c a r d e d , a n d t h e r e m a i n i n g1 l i t r e c o n t a i n e d m e r o d e s m o s i n e c o n t a m i n a t e d w i t hd e s m o s i n e s , l y s i n o n o r l e u c i n e a n d l y s i n e . T h i s l a t t e rf r a c t i o n w a s e n r i c h e d i n m e r o d e s m o s i n e b y l o w e r i n gt h e pH t o 2 . 2 w i t h H C I , a d d i n g w a t e r 1 l i t r e ) a n dp a s s i n g t h e w h o l e v o l u m e t h r o u g h a colun( 1 5 0 c m x 2 . 4 c m ) o f Z e o - K a r b 2 2 5 8 % c r o s s - l i n k e dD V B ; Na+ f o r m ) . T h e c o l u m n w a s t h e n w a s h e d w i t h0 . 3 5 M - s o d i u m c i t r a t e - H C l b u f f e r , p H 5 . 2 8 1 . S l i t r e s )a n d m e r o d e s m o s i n e e m e r g e d i n t h e n e x t 7 5 0 m l .T h i s f r a c t i o n w a s f u r t h e r e n r i c h e d i n m e r o d e s m o s i n eb y r e f r a c t i o n a t i o n o n t h e s a m e c o l u m n a f t e r t h ep H h a d b e e n l o w e r e d t o 2 . 2 w i t h H C I . T h e c o l u m nw a s d e v e l o p e d w i t h t h e p H 5 . 2 8 b u f f e r , f r a c t i o n s( 2 0 m l ) w e r e c o l l e c t e d a n d m e r o d e s m o s i n e w a s l o c a t e db y a p p l y i n g p o r t i o n s t o a n a m i n o a c i d a u t o a n a l y s e r .T h e p o o l e d m e r o d e s m o s i n e f r a c t i o n s w e r e d e s a l t e d b yp a s s i n g t h r o u g h a c o l u m n f i l l e d w i t h s u f f i c i e n tZ e o - K a r b 2 2 5 r e s i n 8 % c r o s s - l i n k e d DVB; H+ f o r m )t o r e m o v e a l l c a t i o n s . A f t e r t h e c o l u m n h a d b e e nw a s h e d w i t h w a t e r t h e m e r o d e s m o s i n e w a s d i s -p l a c e d w i t h 0 . 2 M - N a O H . From l O O g a m o u n t s o fn o n - r e d u c e d a n d r e d u c e d e l a s t i n s 17mg a n d 72mgo f m e r o d e s m o s i n e w e r e o b t a i n e d r e s p e c t i v e l y .

4 7


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G . FRANCIS, R . JOHN AND J . THOMAS

A m i n o a c i d a n a l y s e sE l a s t i n s a m p l e s ( 1 0 m g i n 5 m l o f c o n s t a n t - b o i l i n gH C l ) w e r e h y d r o l y s e d a t 1 1 0 C f o r 7 2 h i n e v a c u a t e ds e a l e d g l a s s t u b e s . A m i n o a c i d a n a l y s e s w e r e c a r r i e do u t o n t h e L o c a r t e A u t o a n a l y s e r b y t h e p r o c e d u r e

o f J o h n & T h o m a s 1 9 7 1 ) .M e a s u r e m e n t o f l y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s i n e l a s t i nD e s m o s i n e , i s o d e s m o s i n e , l y s i n o n o r l e u c i n e a n dm e r o d e s m o s i n e . T h e s e w e r e d e t e r m i n e d o n t h eL o c a r t e A u t o a n a l y s e r b y a p p l y i n g s a m p l e s ( 4 m g )o f a n a c i d h y d r o l y s a t e o f e l a s t i n t o a 26cm c o l u m no f s u l p h o n a t e d p o l y s t y r e n e r e s i n . T h e r e g i o n b e t w e e nt h e a r o m a t i c a n d b a s i c a m i n o a c i d s w a s e x p a n d e db y u s i n g a n e l u t i n g b u f f e r s y s t e m o f 0 . 2 M - s o d i u mc i t r a t e - H C l , pH 4 . 2 5 8 0 m i n ) , 0 . 3 5 M - s o d i u mc i t r a t e - H C I , p H 5 . 2 8 ( 6 5 m i n ) a n d 1 . 0 M - s o d i u mc i t r a t e - H C I , p H 6 . 6 5 1 1 0 m i n ) . T h e n i n h y d r i nc o l o u r y i e l d s o f d e s m o s i n e s w a s t a k e n a s f o u r t i m e s ,l y s i n o n o r l e u c i n e a s t w i c e a n d m e r o d e s m o s i n e sa s t h r e e t i m e s t h a t o f l e u c i n e c a l c u l a t e d o n a m o l a rb a s i s .D e h y d r o m e r o d e s m o s i n e . A s a r o u t i n e t h i s w a sm e a s u r e d b y c o n v e r t i n g i t i n t o t h e a c i d - s t a b l em e r o d e s m o s i n e b y r e d u c i n g t h e e l a s t i n w i t h KBH4b e f o r e e x t r a c t i o n a n d a c i d h y d r o l y s i s . T h e m e r o -d e s m o s i n e w a s t h e n m e a s u r e d b y u s i n g n i n h y d r i nr e a g e n t o n a n a m i n o a c i d a u t o a n a l y s e r a s d e s c r i b e da b o v e . T h e e l a s t i c t i s s u e s w e r e e x t r a c t e d w i t h s a l t ,d e f a t t e d w i t h o r g a n i c s o l v e n t s , s u s p e n d e d 1 g ) i n0 . 5 M - T r i s - H C l b u f f e r , pH 7 . 2 l O O m l ) , a n d KBH4( 5 0 m g ) w a s a d d e d . T h e s u s p e n s i o n w a s s t i r r e d a troom t e m p e r a t u r e f o r 2 h , e x c e s s o f KBH4 d e s t r o y e db y a c i d i f i c a t i o n w i t h a c e t i c a c i d t o pH 3 . 0 , t h e m i x t u r ec e n t r i f u g e d , a n d t h e e l a s t i n w a s w a s h e d w i t h w a t e rt o r e m o v e a l l s a l t s a n d d r i e d w i t h o r g a n i c s o l v e n t s .P o r t i o n s o f r e d u c e d e l a s t i n ( 2 5 0 m g ) w e r e p u r i f i e db y t h e a b o v e f o u r p r o c e d u r e s . P u r i f i e d r e d u c e d e l a s -t i n s ( 1 0 m g ) w e r e h y d r o l y s e d i n 5 . 7 M - H C I a n da m i n o a c i d s a n d m e r o d e s m o s i n e w a s m e a s u r e d o nt h e a u t o a n a l y s e r . T h e d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e c o n -c e n t r a t i o n w a s t h e a m o u n t o f m e r o d e s m o s i n er e c o v e r e d i n e x c e s s o f t h a t p r e s e n t i n n o n - r e d u c e de l a s t i n s .D e h y d r o l y s i n o n o r l e u c i n e . T h i s w a s d e t e r m i n e d i na m a n n e r a n a l o g o u s t o t h a t u s e d f o r d e h y d r o -m e r o d e s m o s i n e , b y m e a s u r i n g t h e e x c e s s o f l y s i n o -n o r l e u c i n e i n r e d u c e d e l a s t i n a s c o m p a r e d w i t h n o n -r e d u c e d e l a s t i n .A l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t . T h i s w a s m e a s u r e da s t h e a l c o h o l d e r i v a t i v e i n a l k a l i n e h y d r o l y s a t e so f e l a s t i n b y t h e p r o c e d u r e o f L e n t e t a l . 1 9 6 9 ) .R e d u c e d e l a s t i n s ( 3 0 m g ) , p r e p a r e d b y t h e f o u rd i f f e r e n t e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s d e s c r i b e d a b o v e ,w e r e h y d r o l y s e d i n 2M-NaOH 2 m l ) a t 1 0 5 C f o r2 2 h i n s t o p p e r e d p o l y p r o p y l e n e b o t t l e s . T h e h y d r o -l y s a t e s w e r e a d j u s t e d t o p H 2 . 2 w i t h 2 M - H C I , d i l u t e d

t o 2 0 m l a n d 2 m l s a m p l e s w e r e a p p l i e d t o a 26cmx 1 . 4 c m r e s i n c o l u m n o n t h e L o c a r t e A u t o a n a l y s e r .T h e e l u t i n g b u f f e r s y s t e m w a s 0 . 2 M - s o d i u m c i t r a t e -H C 1 , p H 3 . 2 5 6 5 m i n ) , 0 . 2 M - s o d i u m c i t r a t e - H C I ,p H 3 . 8 8 5 m i n ) , a n d 0 . 2 M - s o d i u m c i t r a t e - H C I ,pH 4 . 2 5 , c o n t a i n i n g s u f f i c i e n t N a C l t o g i v e a 0 . 6 Ms o l u t i o n w i t h r e s p e c t t o Na+ ( 1 0 0 m i n ) . T h e r e d u c e da l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t g a v e a n i n h y d r i n -p o s i t i v e p e a k e m e r g i n g b e t w e e n l e u c i n e a n dt y r o s i n e . T h e n i n h y d r i n c o l o u r y i e l d o f t h e a l d o l -c o n d e n s a t i o n p r o d u c t w a s t a k e n a s t w i c e t h a t o fl e u c i n e c a l c u l a t e d on a m o l a r b a s i s .R e d u c t i o n o f e l a s t i n w i t h KB3H4

R a d i o a c t i v e b o r o h y d r i d e ( f r o m T h e R a d i o c h e m i c a lC e n t r e , A m e r s h a m , B u c k s . , U . K . ) w a s p r e p a r e d b yd i l u t i n g KB3H4 w i t h n o n - r a d i o a c t i v e KBH4 t o g i v e am i x t u r e c o n t a i n i n g 1 1 m C i / m o l o f K B H 4 . S a l t -e x t r a c t e d a n d d e f a t t e d e l a s t i n 1 g ) w a s r e d u c e d w i t ht h e b o r o h y d r i d e m i x t u r e ( 5 0 m g ) a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y a n d t h e r e d u c e d e l a s t i n w a s p u r i f i e d b yt h e h o t - a l k a l i p r o c e d u r e . P o r t i o n s o f e l a s t i n w e r eh y dr o l y s e d w i t h 5 . 7 M - H C I a n d o t h e r s w e r e h y d r o -l y s e d w i t h 2M-NaOH. T h e a c i d h y d r o l y s a t e s w e r ec o n c e n t r a t e d t o d r y n e s s o n a r o t a r y e v a p o r a t o r a n dd i s s o l v e d i n 0 . 2 M - s o d i u m c i t r a t e - H C l b u f f e r ,p H 2 . 2 . T h e a l k a l i n e h y d r o l y s a t e s w e r e a d j u s t e dt o g i v e a f i n a l Na+ c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 M . T h ea c i d a n d a l k a l i n e h y d r o l y s a t e s ( 2 m g ) w e r e e a c hf r a c t i o n a t e d o n a 26cm x 1 . 4 c m r e s i n c o l u m n o nt h e L o c a r t e A u t o a n a l y s e r b y u s i n g t h e b u f f e r s y s t e m0 . 2 M - s o d i u m c i t r a t e - H C I , p H 3 . 2 5 4 0 m i n ) , 0 . 2 M -s o d i u m c i t r a t e - H C l , p H 4 . 2 5 8 0 m i n ) , 0 . 3 5 M - s o d i u mc i t r a t e - H C I , p H 5 . 2 8 7 0 m i n ) a n d 1 . O M - s o d i u mc i t r a t e - H C I , pH 6 . 6 5 1 0 0 m i n ) . A f r a c t i o n c o l l e c t o rw a s a t t a c h e d t o t h e b o t t o m o f t h e c o l u m n a n df r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d e v e r y 3 m i n . F r a c t i o n sw e r e t e s t e d f o r r a d i o a c t i v i t y b y a d d i n g p o r t i o n s 0 . 1 m l ) t o s c i n t i l l a t i o n l i q u i d [ 0 . 6 g o f 1 , 4 - b i s - 4 - m e t h y l - 5 - p h e n y l o x a z o l - 2 - y l ) b e n z e n e , 7 g o f 2 , 5 -d i p h e n y l o x a z o l e i n 7 5 0 m l o f t o l u e n e a n d 2 5 0 m lo f 2 - m e t h o x y e t h a n o l ] a n d c o u n t i n g o n a P a c k a r dT r i - C a r b l i q u i d - s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r . T h e c o m -p o n e n t s p r e s e n t i n r a d i o a c t i v e p e a k s w e r e i d e n t i f i e db y c o m b i n i n g s i m i l a r f r a c t i o n s , a d d i n g a n e q u a lv o l u m e o f w a t e r , a d j u s t i n g t h e pH t o 2 . 2 w i t h s t r o n gHCI a n d s e p a r a t i n g o n a n a u t o a n a l y s e r , a m i n oa c i d s b e i n g l o c a t e d w i t h n i n h y d r i n r e a g e n t .R e s u l t sA m i n o a c i d c o m p o s i t i o n s o f e l a s t i n s p u r i f i e d b yd i f f e r e n t m e t h o d s

T h e e l a s t i n i n l i g a m e n t u m n u c h a e i s r e a d i l yp u r i f i e d c o m p a r e d w i t h t h a t o f o t h e r m a m m a l i a nt i s s u e s . T a b l e 1 s h o w s t h e s i m i l a r i t y i n t h e o v e r a l lc o n t e n t s o f a m i n o a c i d s i n e l a s t i n s e x t r a c t e d f r o m

1 9 7 3

4 8


5/11


T a b l e 1 . A m i n o a c i d c o m p o s i t i o n s o f e l a s t i n s i s o l a t e d b y v a r i o u s m e t h o d s f r o m t h e l i g a m e n t u m n u c h a e a n d v i s c e r a lp l e u r a o f a d u l t c a t t l eT h e m e t h o d s i n c l u d e d t h e u s e o f a l k a l i , a u t o c l a v i n g , e n z y m e s a n d f o r m i c a c i d . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s a m i n oa c i d r e s i d u e s / 1 0 0 0 r e s i d u e s .

L i g a m e n t u m n u c h a e V i s c e r a l p l e u r aC o l l a g -e n a s e

1 0 . 57 . 18 . 06 . 71 4 . 41 2 5 . 03 3 8 . 02 2 0 . 01 4 0 . 02 6 . 05 8 . 47 . 22 8 . 83 . 96 . 8

A u t o -c l a v e d1 1 . 07 . 38 . 16 . 91 5 . 71 2 0 . 03 3 4 . 0

2 2 4 . 01 4 2 . 52 5 . 46 0 . 86 . 52 7 . 53 . 86 . 9

F o r m i ca c i d9 . 05 . 47 . 55 . 61 3 . 91 2 2 . 53 4 3 . 0

2 2 4 . 01 4 4 . 02 4 . 55 7 . 76 . 02 7 . 63 . 56 . 4

A l k a l i9 . 65 . 46 . 35 . 31 5 . 51 1 6 . 03 3 4 . 0

2 2 3 . 01 4 5 . 82 7 . 66 4 . 07 . 53 2 . 43 . 54 . 31 0 0 0 . 8 1 0 0 0 . 4 1 0 0 0 . 6 1 0 0 0 . 2

C o l l a g -e n a s e9 . 01 5 . 61 1 . 79 . 92 7 . 41 0 8 . 53 1 4 . 0

1 9 8 . 51 3 1 . 52 7 . 07 0 . 09 . 52 9 . 21 5 . 52 3 . 41 0 0 0 . 7

C o l l a g -e n a s e +t r y p s i n9 . 86 . 57 . 67 . 11 5 . 21 2 1 . 63 3 4 . 6

2 0 5 . 41 4 1 . 52 8 . 16 5 . 89 . 63 2 . 47 . 47 . 6

A u t o -c l a v e d9 . 71 0 . 39 . 48 . 02 0 . 71 2 8 . 03 3 2 . 0

2 1 2 . 01 3 9 . 02 5 . 36 2 . 05 . 52 4 . 06 . 97 . 7

F o r m i ca c i d1 0 . 16 . 47 . 97 . 41 7 . 11 2 4 . 03 3 5 . 0

2 1 6 . 01 4 1 . 02 6 . 06 1 . 07 . 22 9 . 24 . 87 . 4

A l k a l i9 . 56 . 26 . 56 . 51 6 . 61 1 7 . 03 4 0 . 0

2 2 1 . 01 4 5 . 02 5 . 96 2 . 46 . 62 8 . 94 . 54 . 21 0 0 0 . 2 1 0 0 0 . 5 1 0 0 0 . 5 1 0 0 0 . 8

t h e l i g a m e n t s o f 2 - 3 - y e a r - o l d c a t t l e b y t h e f o u rd i f f e r e n t m e t h o d s o f i n c r e a s i n g s e v e r i t y d e s c r i b e da b o v e . T h e s e a n a l y s e s w e r e a l s o v i r t u a l l y i d e n t i c a lw i t h t h o s e f o r i n s o l u b l e e l a s t i n s i s o l a t e d f r o m f o e t a l ,1 - w e e k - o l d a n d 1 2 - y e a r - o l d c a t t l e b y t h e s a m em e t h o d s .T h e e l a s t i n i n t h e v i s c e r a l p l e u r a o f c a t t l e w a sm o r e d i f f i c u l t t o p u r i f y ( J o h n & T h o m a s , 1 9 7 1 ) .To o b t a i n p l e u r a l e l a s t i n s t h a t w e r e s i m i l a r i nc o m p o s i t i o n t o l i g a m e n t a l e l a s t i n s i t w a s n e c e s s a r yt o u s e f o r m i c a c i d o r a l k a l i ( T a b l e 1 ) . A u t o c l a v i n gg a v e e l a s t i n s t h a t w e r e v e r y d i f f e r e n t . A t r y p t i cd i g e s t i o n a f t e r c o l l a g e n a s e t r e a t m e n t g a v e e l a s t i n st h a t a p p r o x i m a t e d t o t h o s e o f l i g a m e n t .O c c u r r e n c e o f m e r o d e s m o s i n e a n d d e h y d r o m e r o -d e s m o s i n e i n e l a s t i nAmino a c i d c h r o m a t o g r a m s o f a c i d h y d r o l y s a t e so f l i g a m e n t e l a s t i n c o n t a i n e d t h e w e l l - e s t a b l i s h e dc r o s s - l i n k s i s o d e s m o s i n e , d e s m o s i n e a n d l y s i n o n o r -l e u c i n e . H o w e v e r , t h e s e c h r o m a t o g r a m s a l s o c o n -t a i n e d a n unknown n i n h y d r i n - p o s i t i v e s u b s t a n c ew h i c h t r a v e l l e d , on a n e x p a n d e d a m i n o a c i dc h r o m a t o g r a m , i n a p o s i t i o n b e t w e e n d e s m o s i n e a n dl y s i n o n o r l e u c i n e F i g . 1 ) . T h i s unknown s u b s t a n c e

was p r e s e n t i n e l a s t i n s i s o l a t e d b y d i f f e r e n t e x t r a c -t i o n p r o c e d u r e s f r o m a v a r i e t y o f t i s s u e s f r o mV o l . 1 3 6

F i g . 1 . P o s i t i o n o f m e r o d e s m o s i n e o n a c h r o m a t o g r a mf r o m an a m i n o a c i d a u t o a n a l y s e rAn a c i d h y d r o l y s a t e o f e l a s t i n ( 4 m g s a m p l e ) p u r i f i e db y f o r m i c a c i d e x t r a c t i o n o f c a l f l i g a m e n t u m nuchaei s s h o w n . The d a s h e d l i n e shows t h e i n c r e a s e i nm e r o d e s m o s i n e c o n c e n t r a t i o n i n e l a s t i n r e d u c e db e f o r e p u r i f i c a t i o n . Th e r e g i o n b e t w e e n t h e a r o m a t i ca n d b a s i c a m i n o a c i d s h a s b e e n e x p a n d e d . Peaks are 1 ) t y r o s i n e , 2 ) p h e n y l a l a n i n e , 3 ) i s o d e s m o s i n e , 4 ) d e s m o s i n e , 5 ) m e r o d e s m o s i n e , 6 ) l y s i n o n o r -l e u c i n e a n d 7 ) l y s i n e .

I s o l a t i o nm e t h o dHy pA s pT h rS e rG l uP r oG l yA l aV a lI l eL e uT y rP h eL y sA r gT o t a l

N

00t-c sl al a

1 8 0T i m e m i n )

4 9


6/11

G . F R A N C I S , R . JOHN AND J . THOMAS

d i f f e r e n t a n i m a l s p e c i e s . T h e s e i n c l u d e d t h e a o r t a s ,l i g a m e n t s a n d l u n g s v i s c e r a l p l e u r a a n d p a r e n c h y m a )o f c a t t l e a n d h u m a n s , a n d t h e a o r t a s o f c h i c k s a n dr a t s .T h e p o s s i b i l i t y e x i s t e d t h a t t h i s unknown s u b s t a n c ew a s m e r o d e s m o s i n e , t h e c r o s s - l i n k i s o l a t e d b yS t a r c h e r e t a l . 1 9 6 7 ) f r o m a c i d h y d r o l y s a t e s o f b o v i n el i g a m e n t e l a s t i n t h a t h a d b e e n t r e a t e d w i t h h o t a L k a l ib e f o r e r e d u c t i o n w i t h K B H 4 . T h e unknown s u b -s t a n c e w a s i s o l a t e d i n a r e a s o n a b l e a m o u n t( 1 7 m g / 1 0 0 g o f e l a s t i n ) f r o m a c i d h y d r o l y s a t e s o fa l k a l i - p u r i f i e d c a l f l i g a m e n t e l a s t i n t h a t h a d n o tb e e n r e d u c e d . T h e b e h a v i o u r o f t h i s u n k n o w n

s u b s t a n c e o n d i f f e r e n t s e p a r a t i o n p r o c e d u r e s w a sc o m p a r e d w i t h t h a t o f m e r o d e s m o s i n e i s o l a t e df r o m a c i d h y d r o l y s a t e s o f e l a s t i n t h a t h a d b e e nr e d u c e d b e f o r e a l k a l i e x t r a c t i o n y i e l d 7 2 m g / 1 0 0 go f e l a s t i n ) . T h e u n k n o w n s u b s t a n c e a n d m e r o d e s -m o s i n e m o v e d i n t h e s a m e p o s i t i o n s o n p a p e re l e c t r o p h o r e s i s [ 0 . 1 % a q u e o u s ( N H 4 ) 2 C O 3 , p H 8 . 7a t 5V/cm f o r 1 h i n a L o c a r t e H i g h V o l t a g e E l e c t r o -p h o r e s i s A p p a r a t u s ] , o n p a p e r c h r o m a t o g r a p h y b u t a n - 1 - o l - p y r i d i n e - 9 M - a m m o n i a , 1 : 1 : 1 , b yv o l . ) a n d o n i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( a m i n oa c i d a u t o a n a l y s e r ) . T h e c h r o m a t o g r a m s w e r e d e -v e l o p e d w i t h n i n h y d r i n r e a g e n t . I n e a c h o f t h e s e

3 ) a )

1 ) 2 )I.'

b )

I )

I ~ A

( 9 ) 4 ) 5 ) 6 ) 7 ) 8 ) O )I 0 9

6

3

9

6 3 ) 4 ) 3

3 0 6 0 90 uF r a c t i o n n o .

3 ) c )

1 ) 2 )1 H

: d )

7 ) 4 ) 5 ) 6 ) 8 )l 111

3 0 6 0 90F r a c t i o n no.

F i g . 2 . D i s t r i b u t i o n o f 3H i n h y d r o l y s a t e s o f r e d u c e d e l a s t i n f r o m young a n d a d u l t a n i m a l sE l a s t i n s f r o m t h e l i g a m e n t u m n u c h a e o f 1 - w e e k - o l d and 3 - y e a r - o l d c a t t l e were r e d u c e d w i t h K B 3 H 4 , p u r i f i e dw i t h f o r m i c a c i d a n d s a m p l e s ( 2 m g ) h y d r o l y s e d w i t h a c i d and a l k a l i and s e p a r a t e d on a s u l p h o n a t e d p o l y s t y r e n ec o l u m n . a ) A c i d - h y d r o l y s e d e l a s t i n f r o m young a n i m a l s ; p e a k s 1 ) c - h y d r o x y n o r l e u c i n e , 2 ) g l y c i n e , 3 ) d e -g r a d e d a l d o l , 4 ) i s o l e u c i n e , 5 ) c - c h l o r o n o r l e u c i n e , 6 ) t y r o s i n e , 7 ) i s o d e s m o s i n e , 8 ) m e r o d e s m o s i n e , 9 )l y s i n o n o r l e u c i n e , 1 0 ) l y s i n e . b ) A c i d - h y d r o l y s e d e l a s t i n from a d u l t s ; p e a k s 1 ) E - h y d r o x y n o r l e u c i n e , 2 )d e g r a d e d a l d o l , 3 ) c - c h l o r o n o r l e u c i n e , 4 ) m e r o d e s m o s i n e . c ) A l k a l i - h y d r o l y s e d e l a s t i n f r o m young a n i m a l s ;peaks 1 ) E - h y d r o x y n o r l e u c i n e , 2 ) g l y c i n e , 3 ) l e u c i n e + a l d o l , 4 ) t y r o s i n e , 5 ) i s o d e s m o s i n e , 6 ) m e r o d e s m o s i n e , 7 ) l y s i n o n o r l e u c i n e , 8 ) l y s i n e . d ) A l k a l i - h y d r o l y s e d e l a s t i n from a d u l t s ; p e a k s 1 ) E - h y d r o x y n o r l e u c i n e , 2 )l e u c i n e + a l d o l .

1 9 7 3

9p

6

3

n

0I - I

d

C )

0* e

x0

9

6

3

5 0

2


7/11


t h r e e d i f f e r e n t s e p a r a t i o n p r o c e d u r e s t h e u n k n o w ns u b s t a n c e a n d m e r o d e s m o s i n e m o v e d i n i d e n t i c a lp o s i t i o n s a n d w e r e f r e e f r o m o t h e r n i n h y d r i n -p o s i t i v e m a t e r i a l s . I t w a s c o n c l u d e d t h a t t h e u n k n o w ns u b s t a n c e w a s m e r o d e s m o s i n e . T h e h i g h e r y i e l d o fm e r o d e s m o s i n e r e c o v e r e d f r o m t h e r e d u c e d c a l fl i g a m e n t e l a s t i n c o u l d b e e x p l a i n e d b y t h e p r e s e n c eo f t h e r e d u c i b l e p r e c u r s o r , d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e ,i n c a l f e l a s t i n . I t w i l l b e s h o w n b e l o w t h a t t h e a m o u n to f d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e d e p e n d e d o n t h e a g e o ft h e a n i m a l , b e i n g h i g h i n t h e y o u n g a n d v e r y l o w i nt h e a d u l t . T h e p r e s e n c e o f d e h y d r o m e r o d e s m o s i n ea n d m e r o d e s m o s i n e i n e l a s t i n s , p u r i f i e d w i t h o u t e x -p o s u r e t o a l k a l i , f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s , s u g g e s t e dt h a t b o t h c o m p o u n d s w e r e n o r m a l c o n s t i t u e n t s o fe l a s t i n . T h e n i n h y d r i n c o l o u r y i e l d o f m e r o d e s m o s i n ew a s a b o u t t h r e e t i m e s t h a t o f l e u c i n e c a l c u l a t e d o na m o l a r b a s i s . By u s i n g t h i s a s a m e a s u r e o f m e r o -d e s m o s i n e c o n c e n t r a t i o n t h e c o n t e n t s i n t h e a b o v et i s s u e s w e r e e s t i m a t e d a t a b o u t 0 . 2 5 r e s i d u e / 1 0 0 0a m i n o a c i d r e s i d u e s i n e l a s t i n s i s o l a t e d f r o m t h et i s s u e s l i s t e d p r e v i o u s l y .S t u d i e s o n a c i d a n d a l k a l i n e h y d r o l y s a t e s o f e l a s t i nr e d u c e d w i t h K B 3 H 4

C a l f a n d a d u l t l i g a m e n t u m n u c h a e w e r e e x t r a c t e dw i t h s a l t a n d o r g a n i c s o l v e n t s , r e d u c e d w i t h K B 3 H 4a n d p u r i f i e d b y h o t - a l k a l i e x t r a c t i o n . P o r t i o n s o f t h et r i t i a t e d e l a s t i n s w e r e h y d r o l y s e d w i t h e i t h e r a c i d o ra l k a l i , f r a c t i o n a t e d b y i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h ya n d f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d t e s t e d f o r b o t hr a d i o a c t i v i t y a n d n i n h y d r i n c o l o u r y i e l d . When a c i dh y d r o l y s a t e s o f e l a s t i n s f r o m c a l f w e r e e x a m i n e da p r o m i n e n t r a d i o a c t i v e m e r o d e s m o s i n e p e a ka p p e a r e d F i g . 2 a ) . T h i s p e a k w a s v i r t u a l l y a b s e n ti n s i m i l a r h y d r o l y s a t e s o f e l a s t i n s f r o m a d u l t F i g .2 b ) . I n h y d r o l y s a t e s o f e l a s t i n s o f b o t h a g e s o t h e rt r i t i a t e d p e a k s w e r e p r e s e n t , w h i c h c o u l d b e i d e n t i -f i e d b y c o n s i d e r a t i o n o f a n a l o g o u s e x p e r i m e n t s o fL e n t e t a l . 1 9 6 9 ) a n d b y r e f e r e n c e t o t h e p a t t e r n s o fr a d i o a c t i v e p e a k s o b t a i n e d w h e n t h e e l a s t i n s f r o mc a l f a n d a d u l t w e r e h y d r o l y s e d w i t h a l k a l i F i g s .2 c a n d 2 d ) . I n a c i d h y d r o l y s a t e s t h e p r e - g l y c i n e a n dp r e - t y r o s i n e p e a k s c o u l d b e i d e n t i f i e d ( b y r e f e r e n c e t ot h e w o r k o f L e n t e t a l . , 1 9 6 9 ) a s c - h y d r o x y n o r l e u c i n ea n d E - c h l o r o n o r l e u c i n e r e s p e c t i v e l y . I n a l k a l i n e h y d -r o l y s a t e s t h e c h l o r o d e r i v a t i v e w a s a b s e n t w h e r e a s t h er a d i o a c t i v e p e a k c o r r e s p o n d i n g t o e - h y d r o x y n o r l e u -c i n e i n c r e a s e d . T h e l a r g e r a d i o a c t i v e p r e - i s o l e u c i n ep e a k w h i c h a p p e a r e d i n a c i d h y d r o l y s a t e s F i g s . 2 a a n d2 b ) a r o s e f r o m t h e d e g r a d a t i o n o f t h e r e d u c e d a l d o l -c o n d e n s a t i o n p r o d u c t . T h i s p e a k d i s a p p e a r e d o na l k a l i n e h y d r o l y s i s a n d w a s r e p l a c e d b y t h a t o f t h eu n d e g r a d e d a l c o h o l d e r i v a t i v e o f t h e a l d o l - c o n -d e n s a t i o n p r o d u c t , w h i c h o c c u p i e d t h e p o s i t i o n o fl e u c i n e F i g s . 2 c a n d 2 d ) . T h i s c o m p o n e n t c o u l d b es e p a r a t e d f r o m l e u c i n e a n d o t h e r a m i n o a c i d s b yV o l . 1 3 6

c o m b i n i n g s i m i l a r f r a c t i o n s a n d s e p a r a t i n g t h e m o nt h e a u t o a n a l y s e r b y u s i n g t h e b u f f e r s y s t e m d e s c r i b e di n t h e a p p r o p r i a t e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n a n d d e v e l o p -i n g w i t h n i n h y d r i n r e a g e n t . T h e t r i t i a t e d n i n h y d r i n -p o s i t i v e r e d u c e d a l d o l a p p e a r e d o n l y on c h r o m a t o -g r a m s o f a l k a l i n e h y d r o l y s a t e s o f e l a s t i n s t h a t h a db e e n r e d u c e d b e f o r e e x t r a c t i o n .I d e n t i c a l p a t t e r n s o f 3H u p t a k e w e r e a l s o s e e n i nb o t h a c i d a n d a l k a l i n e h y d r o l y s a t e s o f t r i t i a t e de l a s t i n t h a t h a d b e e n p u r i f i e d b y t h e a u t o c l a v i n g ,e n z y m i c a n d f o r m i c a c i d p r o c e d u r e s .T h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o a c t i v i t y i n a c i d h y d r o -l y s a t e s o f t r i t i a t e d e l a s t i n o b t a i n e d i n t h e p r e s e n t w o r kd i f f e r e d i n s o m e r e s p e c t s f r o m t h o s e o b t a i n e d b yL e n t e t a l . 1 9 6 9 ) . T h u s l i t t l e u p t a k e o f 3 H b y t h ed e s m o s i n e s w a s o b s e r v e d . T h i s c o u l d b e a t t r i b u t e dt o t h e m i l d r e d u c i n g c o n d i t i o n s u s e d N a B H 4 / e l a s t i nr a t i o 1 : 2 0 , w / w ) . A l s o i n t h e p r e s e n t s t u d y l i t t l er a d i o a c t i v i t y w a s a s s o c i a t e d w i t h l y s i n o n o r l e u c i n e ,w h i c h u n d e r t h e f r a c t i o n a t i n g c o n d i t i o n s u s e d w a sw e l l s e p a r a t e d f r o m m e r o d e s m o s i n e .P r o p o r t i o n s o f l y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s i n e l a s t i n se x t r a c t e d f r o m t h e l i g a m e n t u m n u c h a e o f c a t t l e o fd i f f e r e n t a g e s

E l a s t i n s f r o m c a t t l e w h i c h i n c l u d e d f o e t a l ,1 - w e e k - o l d , 3 - y e a r - o l d a n d 1 2 - y e a r - o l d a n i m a l sw e r e p u r i f i e d b y t h e u s u a l m e t h o d s . T h e c o n c e n -t r a t i o n s o f t h e v a r i o u s c r o s s - l i n k s s h o w n i n T a b l e 2w e r e d e t e r m i n e d o n a c i d a n d a l k a l i n e h y d r o l y s a t e s .I r r e s p e c t i v e o f t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e , t h e p r o -p o r t i o n s o f t h e i n d i v i d u a l c r o s s - l i n k s w e r e s i m i l a rf o r a p a r t i c u l a r a g e . S i n c e a l l t h e s e c r o s s - l i n k s w e r ed e r i v e d f r o m l y s i n e r e s i d u e s a n y c h a n g e s i n t h e i rc o n c e n t r a t i o n s s h o u l d b e r e f l e c t e d b y c o r r e s p o n d i n gc h a n g e s i n t h e n u m b e r o f u n m o d i f i e d l y s i n e r e s i d u e s .T h e m o s t s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n c o n c e n t r a t i o n s d u r -i n g n o r m a l m a t u r a t i o n o f t h e a n i m a l s o c c u r i n t h ed e s m o s i n e s , d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e , a l d o l - c o n d e n -s a t i o n p r o d u c t a n d l y s i n e r e s i d u e s .F o r d e s m o s i n e p l u s i s o d e s m o s i n e , f r o m t h e meanv a l u e s f o r t h e d i f f e r e n t e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s , t h ec o n c e n t r a t i o n b e g i n s a t 1 . 6 r e s i d u e s / 1 0 0 0 a m i n oa c i d r e s i d u e s i n e l a s t i n f r o m f o e t u s e s , i n c r e a s e s t o2 . 3 i n t h e 1 - w e e k - o l d c a l f a n d r e a c h e s a maximumo f 3 . 1 i n t h e f u l l y m a t u r e a n i m a l , a v a l u e t h a t i sm a i n t a i n e d i n t h e 1 2 - y e a r - o l d a n i m a l . I n c o n t r a s tt h e c o n c e n t r a t i o n o f d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e d e -c r e a s e s w i t h g r o w t h , b e i n g a b o u t 0 . 8 r e s i d u e / 1 0 0 0a m i n o a c i d r e s i d u e s i n t h e y o u n g a n d d e c r e a s i n g t ot r a c e a m o u n t s i n t h e f u l l y m a t u r e a n d o l d a n i m a l s .F o r m e r o d e s m o s i n e a l o w v a l u e o f a b o u t 0 . 2 r e s i d u e /1 0 0 0 r e s i d u e s i s p r e s e n t a t a l l a g e s . S i m i l a r l y , t h ec o n t e n t o f l y s i n o n o r l e u c i n e a b o u t 0 . 7 5 r e s i d u e s /1 0 0 0 r e s i d u e s ) s h o w s l i t t l e c h a n g e w i t h m a t u r a t i o n .D e h y d r o l y s i n o n o r l e u c i n e i s d e t e c t a b l e i n e l a s t i nf r o m y o u n g a n i m a l s a b o u t O . 1 6 r e s i d u e / l 0 0 0 r e s i d u e s )

- 5 1


8/11

G . F R A N C I S , R . JOHN AND J . THOMAS

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000 0O3-o I _ 0 O_? oooo66oiom

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b u t a l m o s t d i s a p p e a r s i n m a t u r e e l a s t i n s f r o m a d u l t s .S i g n i f i c a n t c h a n g e s a l s o o c c u r i n t h e c o n c e n t r a t i o no f t h e a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t . E l a s t i n f r o ma f o e t u s c o n t a i n s a b o u t 3 . 4 r e s i d u e s / 1 0 0 0 r e s i d u e s ,d e c r e a s e s t o 2 . 9 i n t h e c a l f , t o 2 . 0 i n t h e a d u l t a n d t o1 . 6 i n t h e o l d a n i m a l . C h a n g e s a l s o o c c u r i n c o n t e n t o fl y s i n e r e s i d u e s , t h e r e b e i n g 9 . 6 r e s i d u e s / 1 0 0 0 r e s i d u e si n e l a s t i n f r o m a f o e t u s , 6 . 9 i n c a l f , 3 . 7 i n t h e f u l l yg r o w n a n i m a l a n d 2 . 6 i n t h e o l d a n i m a l . When a l l t h el y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s a r e e x p r e s s e d a s l y s i n ee q u i v a l e n t s a n d i n t a c t l y s i n e r e s i d u e s a r e i n c l u d e di n t h e t o t a l , t h e mean o f t h e t o t a l l y s i n e r e s i d u e sr e c o v e r e d f r o m e l a s t i n s e x t r a c t e d b y t h e d i f f e r e n tm e t h o d s d e c r e a s e d w i t h a g e , b e i n g 2 7 r e s i d u e s f o rf o e t a l , 2 8 f o r 1 - w e e k - o l d c a l f , 2 2 f o r t h e m a t u r e a n i m a la n d 2 0 f o r t h e 1 2 - y e a r - o l d a n i m a l .E f f e c t o f p r e i n c u b a t i o n o f l i g a m e n t e l a s t i n i n a l k a l i n es o l u t i o n o n t h e c o n t e n t s o f l y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s

T r e a t m e n t o f s a l t - e x t r a c t e d a n d d e f a t t e d e l a s t i n sf r o m 1 - w e e k - o l d a n d 3 - y e a r o l d c a t t l e w i t h a l k a l i ,b e f o r e r e d u c t i o n a n d p u r i f i c a t i o n b y v a r i o u s m e t h o d s ,p r o d u c e d a n i n s o l u b l e e l a s t i n i n w h i c h t h e p a t t e r n o fc r o s s - l i n k s w a s d i f f e r e n t f r o m t h a t o b t a i n e d f o rn o n - a l k a l i - t r e a t e d e l a s t i n . S t u d i e s a t d i f f e r e n t pHv a l u e s 1 0 . 6 , 1 2 . 4 a n d 1 3 . 0 ) a n d t i m e s o f i n c u b a t i o n 1 h a n d 2 h ) s h o w e d t h a t e l a s t i c t i s s u e k e p t a t roomt e m p e r a t u r e i n 0 . 0 5 M - N a O H ( p H 1 2 . 4 ) f o r 1 hp r o d u c e d t h e m o s t s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n t h e a m o u n t so f c r o s s - l i n k s s e e T a b l e 3 ) . E l a s t i n f r o m y o u n ga n i m a l s t h a t h a d b e e n a l k a l i - t r e a t e d i n t h i s w a yc o n t a i n e d s l i g h t l y m o r e d e s m o s i n e , i s o d e s m o s i n e a n dl y s i n o n o r l e u c i n e t h a n d i d t h e n o n - a l k a l i - t r e a t e d ,b u t n o i n c r e a s e w a s f o u n d i n e l a s t i n s f r o m m a t u r ea n i m a l s . H o w e v e r , s i g n i f i c a n t c h a n g e s w e r e f o u n d i nd e h y d r o m e r o d e s m o s i n e s , a l d o l a n d l y s i n e c o n t e n t s ,e s p e c i a l l y i n e l a s t i n s f r o m c a l f . T a k i n g t h e a v e r a g ev a l u e s o f e l a s t i n s p u r i f i e d b y t h e v a r i o u s m e t h o d s ,p r e i n c u b a t i o n i n a l k a l i p r o d u c e d a 2 . 5 - f o l d i n c r e a s ei n d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e t o 2 . 1 8 r e s i d u e s / 1 0 0 0a m i n o a c i d r e s i d u e s , d e c r e a s e d t h e a l d o l - c o n d e n s a -t i o n p r o d u c t b y o n e - h a l f t o 1 . 5 4 a n d t h e l y s y l r e s i d u e sf r o m 6 . 3 t o 5 . 3 .P r e i n c u b a t i o n w i t h a l k a l i a l s o h a d a n e f f e c t o nt h e m a t u r e e l a s t i n s , t h e d e h y d r o m e r o d e s m o s i n ei n c r e a s i n g f r o m a n a v e r a g e o f 0 . 0 3 t o 0 . 5 1 r e s i d u ew h e r e a s t h e a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t d e c r e a s e df r o m 2 . 0 t o 1 . 7 a n d l y s i n e r e s i d u e s f r o m 3 . 9 t o 3 . 5 .A m o u n t s o f l y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s i n e l a s t i n se x t r a c t e d f r o m t h e v i s c e r a l p l e u r a s o f c a t t l e o f d i f f e r e n ta g e s

E l a s t i n s w e r e p u r i f i e d b y t h e f o r m i c a c i d a n d a l k a l im e t h o d s f r o m t h e p l e u r a s o f c a t t l e a g e d 1 w e e k ,3 y e a r s a n d 1 2 y e a r s . T h e a m o u n t s o f l y s i n e c r o s s -1 9 7 3

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5 2


9/11


T a b l e 3 . E f f e c t o f i n c u b a t i o n i n a l k a l i n e s o l u t i o n b e f o r e r e d u c t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o n t h e c o n c e n t r a t i o n s o fc r o s s - l i n k s a n d l y s i n e r e s i d u e s i n e l a s t i nT h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s w e r e 0 . 0 5 M-NaOH f o r 1 h a t room t e m p e r a t u r e . E l a s t i n s w e r e p u r i f i e d f r o m l i g a m e n t u mn u c h a e o f 1 - w e e k - o l d a n d 3 - y e a r - o l d c a t t l e b y a l k a l i , a u t o c l a v i n g a n d f o r m i c a c i d t r e a t m e n t s . C o n c e n t r a t i o n sa r e e x p r e s s e d i n r e s i d u e s / 1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s a n d t h e t o t a l l y s i n e e q u i v a l e n t s a s i n T a b l e 2 . T h e c o n t r o l v a l u e sf r o m T a b l e 2 a r e g i v e n i n p a r e n t h e s e s .

1 w e e k o l d 3 y e a r s o l dI s o l a t i o n m e t h o d . . .

I s o d e s m o s i n e a n dd e s m o s i n eD e h y d r o m e r o d e s m o s i n eM e r o d e s m o s i n eL y s i n o n o r l e u c i n eA l d o lL y s i n eT o t a l l y s i n e

A l k a l i A u t o c l a v e d F o r m i c a c i d A l k a l i A u t o c l a v e d F o r m i c a c i d2 . 5 2 2 . 4 3 ) 2 . 6 4 2 . 3 9 )2 . 2 4 0 . 9 1 ) 2 . 0 6 0 . 7 9 )0 . 2 2 0 . 2 2 ) 0 . 2 6 0 . 2 6 )1 . 1 5 1 . 2 4 ) 0 . 9 1 0 . 9 0 )1 . 5 9 2 . 9 2 ) 1 . 5 0 2 . 7 6 )5 . 5 0 6 . 1 0 ) 5 . 9 0 7 . 0 0 )

2 8 . 4 4 2 7 . 5 3 ) 2 8 . 2 4 2 7 . 0 3 )

2 . 3 4 2 . 0 4 )2 . 1 5 0 . 8 1 )0 . 2 3 0 . 2 3 )0 . 8 6 0 . 8 6 )1 . 5 2 2 . 9 3 )4 . 6 0 5 . 9 0 )2 5 . 8 6 2 4 . 7 6 )

2 . 8 9 3 . 0 0 ) 2 . 9 2 3 . 0 4 ) 2 . 8 4 3 . 0 3 )0 . 5 2 0 . 0 4 ) 0 . 4 5 0 . 0 3 ) 0 . 5 6 0 . 1 0 )0 . 2 2 0 . 2 2 ) 0 . 2 2 0 . 2 2 ) 0 . 1 9 0 . 1 9 )0 . 7 4 0 . 9 1 ) 0 . 9 5 0 . 8 8 ) 0 . 8 7 0 . 8 7 )1 . 8 5 2 . 1 5 ) 1 . 7 0 1 . 8 6 ) 1 . 6 5 1 . 9 5 )3 . 6 0 3 . 5 0 ) 3 . 6 0 3 . 8 0 ) 3 . 4 0 3 . 5 0 )2 2 . 5 6 2 2 . 4 0 ) 2 2 . 5 9 2 2 . 1 9 ) 2 2 . 0 5 2 2 . 1 3 )

T a b l e 4 . C o n c e n t r a t i o n s o f c r o s s - l i n k s a n d l y s i n e r e s i d u e s i n e l a s t i n s i s o l a t e d f r o m v i s c e r a l p l e u r a s o f c a t t l eo f d i f f e r e n t a g e sT h e a n i m a l s w e r e a g e d 1 w e e k , 3 y e a r s a n d 1 2 y e a r s . P u r i f i c a t i o n s i n v o l v e d a l k a l i a n d f o r m i c a c i d m e t h o d s .C o n c e n t r a t i o n s a r e i n r e s i d u e s / 1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s a n d l y s i n e e q u i v a l e n t s a r e c a l c u l a t e d a s i n T a b l e 2 .

1 w e e k o l d 3 y e a r s o l d 1 2 y e a r s o l dI s o l a t i o n m e t h o d . . .I s o d e s m o s i n e

D e s m o s i n eD e h y d r o m e r o d e s m o s i n eM e r o d e s m o s i n eD e h y d r o l y s i n o n o r l e u c i n eL y s i n o n o r l e u c i n eA l d o lL y s i n eT o t a l l y s i n e

A l k a l i F o r m i c a c i d0 . 9 31 . 3 70 . 7 90 . 2 30 . 2 11 . 0 82 . 8 86 . 9 02 7 . 5 0

0 . 9 41 . 3 90 . 7 80 . 2 20 . 1 80 . 8 22 . 4 96 . 2 02 5 . 5 0

A l k a l i F o r m i c a c i d A l k a l i1 . 0 02 . 0 00 . 1 00 . 2 50 . 0 11 . 1 01 . 9 74 . 5 02 3 . 7 1

1 . 2 01 . 9 00 . 0 70 . 2 10 . 0 30 . 9 01 . 8 74 . 8 02 3 . 6 4

1 . 1 31 . 8 90

0 . 2 300 . 9 31 . 7 14 . 4 02 2 . 4 5

l i n k s a n d i n t a c t l y s i n e r e s i d u e s i n t h e e l a s t i n s o fd i f f e r e n t a g e s i s shown i n T a b l e 4 . Th e c h a n g i n gp a t t e r n s o f c r o s s - l i n k s a n d l y s i n e r e s i d u e s i s s i m i l a r t ot h o s e o b t a i n e d f o r l i g a m e n t e l a s t i n s .D i s c u s s i o nE l a s t i n i s s y n t h e s i z e d a t a r a p i d r a t e b y y o u n gg r o w i n g a n i m a l s b u t a t a l o w e r r a t e b y a d u l t a n i m a l s .A p a r t f r o m r e p l a c e m e n t o f e l a s t i c t i s s u e s d e s t r o y e db y d i s e a s e p r o c e s s e s and t h e n o r m a l p r o c e s s e s o fw e a r a n d t e a r , i t i s b e l i e v e d t h a t o n c e m a t u r e e l a s t i cf i b r e s are l a i d d o w n t h e y ar e t h e r e f o r l i f e . Th es y n t h e s i s o f l y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s i s a p a r t o f t h en a t u r a l p r o c e s s o f m a t u r a t i o n o f t h e s e f i b r e s . Hencet h e t i m e t o l o o k f o r c h a n g e s i n t h e number and t y p eo f c r o s s - l i n k s i s i n e l a s t i n s i s o l a t e d from y o u n g ,g r o w i n g a n i m a l s . The a m o u n t s a n d t y p e s o f c r o s s -V o l . 1 3 6

l i n k s c an t h e n b e c o m p a r e d w i t h t h o s e f o u n d i n f u l l ym a t u r e e l a s t i n s f r o m a d u l t a n i m a l s . I n s u c h s t u d i e sc a u t i o n m u s t b e o b s e r v e d i n p u r i f y i n g t h e h i g h l yi n s o l u b l e e l a s t i n s , e s p e c i a l l y t h o s e p r e s e n t i n younga n i m a l s w h e r e t h e f u l l c o m p l e m e n t o f c r o s s - l i n k sh a s n o t b e e n a t t a i n e d . F o r e x a m p l e , c o v a l e n t b o n d smay b e b r o k e n b y t h e c h e m i c a l t r e a t m e n t s e m p l o y e di n some p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e s , c a u s i n g s o l u b i l i z a -t i o n o f l i g h t l y - c r o s s - l i n k e d e l a s t i n . F o r t h i s rea sons e v e r a l very d i f f e r e n t p r o c e d u r e s h a v e b e e n e m p l o y e di n t h e p r e s e n t w o r k .The m a i n s ou rce o f e l a s t i n c h o s e n f o r t h e s t u d y

w a s t h a t o f t h e l i g a m e n t u m n u c h a e o f c a t t l e . T h i st i s s u e i s r e a d i l y a v a i l a b l e , h i g h l y e n r i c h e d i n e l a s t i na n d r e a d i l y p u r i f i e d b y m e t h o d s t h a t d o n o t i n v o l v ea c i d i c o r a l k a l i n e m e d i a . The v i s c e r a l p l e u r a f r o mt h e l u n g s o f c a t t l e i s a l s o a g o o d source o f e l a s t i n

F o r m i c a c i d1 . 1 91 . 8 800 . 1 800 . 7 31 . 5 74 . 8 02 2 . 2 2

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G . FRANCIS, R . JOHN AND J . THOMASb u t t h e p r o t e i n w a s more d i f f i c u l t t o p u r i f y f r o m t h i ss o u r c e t h a n f r o m l i g a m e n t . O n l y b y u s i n g a c i d i ca n d a l k a l i n e c o n d i t i o n s c o u l d p l e u r a l e l a s t i n s b eo b t a i n e d w h i c h a p p r o x i m a t e d i n c h e m i c a l c o m p o s i -t i o n s t o t h o s e o f l i g a m e n t . T a k i n g a m i n o a c i d c o m -p o s i t i o n s a s a t e s t f o r p u r i t y e l a s t i n s e x t r a c t e d f r o mb o t h l i g a m e n t a n d p l e u r a b y t h e d i f f e r e n t m e t h o d s h a do v e r a l l c o m p o s i t i o n s t h a t w e r e s i m i l a r a t a l l a g e s .E l a s t i n s e x t r a c t e d f r o m m a t u r e a n i m a l s a l lc o n t a i n e d t h e e s t a b l i s h e d c r o s s - l i n k s l y s i n o n o r -l e u c i n e a n d d e s m o s i n e p l u s i s o d e s m o s i n e a t c o n c e n -t r a t i o n s o f a b o u t 1 a n d 3 r e s i d u e s / 1 0 0 0 a m i n o a c i dr e s i d u e s r e s p e c t i v e l y . T h e d e t e c t i o n o f s u b s t a n t i a la m o u n t s o f t h e a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t a b o u t2 r e s i d u e s / 1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s i n e l a s t i n f r o ma d u l t s w a s o b t a i n e d i n t h e p r e s e n t s t u d y ) c o n f i r m e de a r l i e r w o r k L e n t e t a l . , 1 9 6 9 ) w h i c h p o i n t e d t ot h e p r o d u c t a s a n i m p o r t a n t c r o s s - l i n k i n g a m i n oa c i d i n m a t u r e e l a s t i n . H o w e v e r , t h e p o s s i b i l i t y s t i l lr e m a i n e d t h a t h i t h e r t o u n r e c o g n i z e d l y s i n e - d e r i v e dc r o s s - l i n k s w e r e p r e s e n t i n e l a s t i n f r o m a d u l t s .C h r o m a t o g r a m s o f a c i d h y d r o l y s a t e s o f e l a s t i n f r o md i f f e r e n t t i s s u e s o f d i f f e r e n t a n i m a l s p e c i e s a l l c o n t a i n -. e d a n u n k n o w n n i n h y d r i n - p o s i t i v e p e a k . T h i s c o m -p o u n d h a s b e e n i d e n t i f i e d a s m e r o d e s m o s i n e , t h u sc o n f i r m i n g t h e c o n c l u s i o n s o f P a z e t a l . 1 9 7 1 ) t h a tm e r o d e s m o s i n e a n d i t s r e d u c i b l e p r e c u r s o r , d e h y d r o -m e r o d e s m o s i n e , o c c u r n a t u r a l l y i n t h e e l a s t i n m o l e -c u l e . H o w e v e r , t h e l o w c o n c e n t r a t i o n s o f b o t h t h e s ec o m p o u n d s 0 . 2 5 a n d 0 . 1 r e s i d u e r e s p e c t i v e l y i n1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s ) i n e l a s t i n s f r o m a d u l t ss u g g e s t s t h a t t h e y a r e o f m i n o r i m p o r t a n c e o n l y i nt h e s t r u c t u r e o f m a t u r e e l a s t i n s .E l a s t i n s e x t r a c t e d f r o m y o u n g a n i m a l s w h e nc o m p a r e d w i t h t h o s e f r o m a d u l t a n i m a l s s h o ws i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e p a t t e r n o f c r o s s - l i n k i n gc o m p o u n d s a n d l y s i n e r e s i d u e s . T a k i n g t h e c o n t e n t so f t h e d e s m o s i n e s a s 1 0 0 i n e l a s t i n s f r o m a d u l t s ,t h o s e f r o m t h e e m b r y o w e r e 50 a n d f r o m t h ec a l f 7 5 . T h i s i n c r e a s e i n d e s m o s i n e s w i t h m a t u r i t yw a s b a l a n c e d b y a d e c r e a s e i n t h e c o n t e n t o f r e s i d u e so f i n t a c t l y s i n e a n d a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t .T h u s t h e e l a s t i n f r o m a d u l t s c o n t a i n e d o n l y 60o f t h e a m o u n t o f a l d o l f o u n d i n e m b r y o n i c m a t e r i a l .T h i s d e c r e a s e w i t h g r o w t h i n d i c a t e d t h a t t h e a l d o ls e r v e d t w o f u n c t i o n s . A b o u t 60 o f t h a t p r e s e n ti n t h e e l a s t i n f r o m e m b r y o s r e m a i n e d u n c h a n g e d ,a c t i n g a s a n i n d e p e n d e n t c r o s s - l i n k , w h e r e a s t h er e m a i n d e r a c t e d a s a n i n t e r m e d i a t e f o r t h e s y n t h e s i so f t h e more c o m p l e x c r o s s - l i n k s o f o l d e r e l a s t i n s .T h e r e a r e a t l e a s t t h r e e p o s s i b l e p a t h w a y s f o r t h eb i o s y n t h e s i s o f d e s m o s i n e s f r o m t h e a l d o l - c o n d e n -s a t i o n p r o d u c t . F i r s t , t h e a l d o l c o u l d u n d e r g o aM i c h a e l r e a c t i o n w i t h an c x - a m i n o - 8 - a d i p i c s e m i -a l d e h y d e r e s i d u e . A d d i t i o n w o u l d o c c u r a c r o s s t h ea l d i m i n e b o n d t o g i v e a t r i l y s y l d i a l d e h y d e r e s i d u ew h i c h c o u l d t h e n r e a c t v i a a S c h i f f b a s e w i t h t h ec - a r i n o g r o u p o f a n i n t a c t l y s i n e r e s i d u e . H o w e v e r ,

t h e p r e s e n c e o f i n t e r m e d i a t e s o f t h i s t y p e s h o u l d h a v eb e e n r e f l e c t e d i n t h e a p p e a r a n c e o f new p e a k s ona m i n o a c i d a u t o a n a l y s e r r e c o r d s , a n d t h e a b s e n c eo f s u c h p e a k s s u g g e s t s t h a t t h i s p a r t i c u l a r p a t h w a yi s n o t o p e r a t i n g . S e c o n d l y t h e a l d o l - c o n d e n s a t i o np r o d u c t c o u l d r e a c t w i t h d e h y d r o l y s i n o n o r l e u c i n eo r t h i r d l y a s s h o w n i n S c h e m e 1 ) v i a d e h y d r o m e r o -d e s m o s i n e w h i c h w o u l d t h e n r e a c t w i t h a r e s i d u eo f x - a m i n o - 8 - a d i p i c s e m i a l d e h y d e . I f d e s m o s i n e sw e r e s y n t h e s i z e d v i a d e h y d r o l y s i n o n o r l e u c i n e ,a p p r e c i a b l e a m o u n t s o f t h i s i n t e r m e d i a t e w o u l d b ee x p e c t e d t o o c c u r i n e l a s t i n s f r o m y o u n g a n i m a l s .H o w e v e r , t h i s c o m p o u n d i s o n l y p r e s e n t a t c o n -c e n t r a t i o n s o f 0 . 1 7 r e s i d u e / 1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s ,i n d i c a t i n g t h a t i t s s o l e f u n c t i o n i s t o a c t a s a p r e c u r s o rf o r t h e s y n t h e s i s o f l y s i n o n o r l e u c i n e . T h i s i s i nc o n t r a s t w i t h d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e , t h e c o n t e n t i ne l a s t i n s f r o m y o u n g a n i m a l s b e i n g a b o u t 0 . 8 r e s i d u e /1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s . S i n c e t h e t o t a l c o n c e n -t r a t i o n o f d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e i n e l a s t i n f r o me m b r y o s i s n e a r e r 1 r e s i d u e , i t w o u l d a p p e a r t h a t2 0 % o f t h i s i s s t a b i l i z e d b y r e d u c t i o n o f t h e a l d i m i n eb o n d t o g i v e m e r o d e s m o s i n e . T h e r e m a i n i n g 80m u s t a c t a s a p r e c u r s o r f o r t h e s y n t h e s i s o f d e s m o -s i n e s . T h e a m o u n t o f d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e p r e s e n ti n e l a s t i n s f r o m y o u n g a n i m a l s c o u l d b e i n c r e a s e d b y2 . 5 - f o l d b y e x p o s i n g t h e e l a s t i n t o m i l d a l k a l i n es o l u t i o n b e f o r e e x t r a c t i o n . T h i s i n c r e a s e w a s b a l a n c e db y a d e c r e a s e o f t h e s a m e o r d e r i n t h e c o n t e n t s o ft h e a l d o l - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t a n d i n t a c t l y s i n er e s i d u e s . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e a l d o l a n d l y s i n er e s i d u e s w e r e i n t h e a p p r o p r i a t e p o s i t i o n s i n t h ep o l y p e p t i d e c h a i n s i n e l a s t i n w h i c h w o u l d a l l o w f o rt h e s y n t h e s i s o f d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e . T h i s r e s u l t ,t o g e t h e r w i t h t h e r e c o v e r y o f r e a s o n a b l e a m o u n t s o fd e h y d r o m e r o d e s m o s i n e i n e l a s t i n s f r o m y o u n ga n i m a l s a n d i t s v i r t u a l a b s e n c e f r o m e l a s t i n s f r o ma d u l t s , s e e m s t o b e g o o d e v i d e n c e t h a t t h e b i o -s y n t h e s i s o f d e s m o s i n e s p r o c e e d s b y t h i s r o u t e .To c o m p l e t e t h e s y n t h e s i s o f d e s m o s i n e s a r e s i d u eo f t h e s e m i a l d e h y d e w o u l d b e r e q u i r e d t o g i v e t h et e t r a s u b s t i t u t e d p y r i d i n e r i n g .D a v i s & Anwar 1 9 7 0 ) b y u s i n g m o d e l c o m -p o u n d s s h o w e d t h a t a l i p h a t i c a l d i m i n e s r e a c t e ds p o n t a n e o u s l y w i t h a l i p h a t i c a l d e h y d e s a t roomt e m p e r a t u r e t o y i e l d p y r i d i n i u m c o m p o u n d s w h i c hw e r e a n a l o g o u s t o d e s m o s i n e a n d i s o d e s m o s i n e .T h e s e a u t h o r s s u g g e s t e d t h a t d e s m o s i n e s y n t h e s i sc o u l d p r o c e e d v i a d e h y d r o m e r o d e s m o s i n e . H o w e v e r ,a n a l t e r n a t i v e p a t h w a y t o i s o d e s m o s i n e v i a d e h y d r o -l y s i n o n o r l e u c i n e w a s p o s t u l a t e d . I n t h e p r e s e n t s t u d yt h e f a i l u r e t o d e t e c t s i g n i f i c a n t a m o u n t s o f d e h y d r o -l y s i n o n o r l e u c i n e i n e l a s t i n s i s o l a t e d f r o m g r o w i n ga n i m a l s g i v e s l i t t l e c r e d e n c e t o t h e i m p o r t a n c e o ft h i s p r o p o s e d p a t h w a y .

I t s h o u l d b e p o i n t e d o u t t h a t t h e r e i s a l a r g e d i s -c r e p a n c y b e t w e e n t h e c o n t e n t s o f l y s i n e r e s i d u e s i n t a c t o n e s p l u s t h o s e i n v o l v e d i n c r o s s - l i n k i n g )1 9 7 3

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BIOSYNTHESIS OF DESMOSINES 5 5

i n b o v i n e i n s o l u b l e e l a s t i n s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d ya n d t h e c o n t e n t s i n s o l u b l e e l a s t i n s t r o p o e l a s t i n s )i s o l a t e d b y o t h e r w o r k e r s . S a n d b e r g e t a l . 1 9 7 1 )e x t r a c t e d a t r o p o e l a s t i n f r o m t h e a o r t a s o f c o p p e r -d e f i c i e n t p i g s w i t h a l y s i n e c o n t e n t o f 4 5 r e s i d u e s /1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s a n d S y k e s & P a r t r i d g e 1 9 7 2 ) e x t r a c t e d a t r o p o e l a s t i n f r o m l a t h y r i t i c c h i c k sw i t h a l y s i n e c o n t e n t o f 4 0 r e s i d u e s / 1 0 0 0 a m i n o a c i dr e s i d u e s . N e i t h e r t r o p o e l a s t i n c o n t a i n e d l y s i n e -d e r i v e d c r o s s - l i n k s . I n t h e p r e s e n t s t u d y t h e i n s o l u b l ee l a s t i n i s o l a t e d f r o m t h e t i s s u e s o f c a l v e s c o n t a i n e d2 7 l y s i n e r e s i d u e s / 1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s . T h em e a s u r e m e n t o f a - a m i n o a d i p i c s e m i a l d e h y d e i ne l a s t i n w a s d i f f i c u l t b e c a u s e i t m o v e d o n i o n -e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y i n a p o s i t i o n n e a r g l y c i n e .L e n t e t a l . 1 9 6 9 ) o b t a i n e d 2 - 3 r e s i d u e s o f a - a m i n oa d i p i c s e m i a l d e h y d e / 1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s i nb o v i n e l i g a m e n t e l a s t i n . I n c l u d i n g t h i s f i g u r e i n t h er e s u l t s o b t a i n e d i n t h e p r e s e n t w o r k t h e t o t a l n u m b e ro f l y s i n e r e s i d u e s r e c o v e r e d / 1 0 0 0 a m i n o a c i dr e s i d u e s w o u l d t h e n b e 2 9 - 3 0 . T h e d i s c r e p a n c y i nl y s i n e r e s i d u e s o f 1 0 - 1 5 / 1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e sb e t w e e n t r o p o e l a s t i n s a n d i n s o l u b l e e l a s t i n s c a n n o tb e s a t i s f a c t o r i l y a c c o u n t e d f o r . One e x p l a n a t i o nc o u l d b e t h a t i n s o l u b l e e l a s t i n s c o n t a i n o t h e r u n -i d e n t i f i e d l y s i n e - d e r i v e d c r o s s - l i n k s w h i c h w e r ed e g r a d e d d u r i n g t h e e x t r a c t i o n o f e l a s t i n a n d t h es u b s e q u e n t h y d r o l y s i s . A l s o i t s h o u l d b e p o i n t e d o u tt h a t i n t h e p r e s e n t w o r k e l a s t i n s f r o m a d u l t s c o n t a i n5 f e w e r l y s i n e r e s i d u e s / 1 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e st h a n e l a s t i n s f r o m y o u n g a n i m a l s .T h e n o r m a l p r o c e s s o f m a t u r a t i o n o f e l a s t i c f i b r e ss h o u l d n o t b e c o n f u s e d w i t h t h a t o f s e n e s c e n c e .A p o p u l a r h y p o t h e s i s o f a g i n g i n a n i m a l s s u g g e s t st h a t t h e p o l y p e p t i d e c h a i n s i n e l a s t i n b e c o m ee x c e s s i v e l y c r o s s - l i n k e d i n o l d e r s u b j e c t s . I n t h ep r e s e n t s t u d y e l a s t i n s f r o m t h e l i g a m e n t u m n u c h a ea n d v i s c e r a l p l e u r a o f 1 0 - 1 2 - y e a r - o l d c a t t l e w e r ea n a l y s e d . I t w a s f o u n d t h a t t h e c o n t e n t s o f t h e n a t u r a l

l y s i n e c r o s s - l i n k s w e r e n o h i g h e r t h a n t h o s e i n2 - 3 - y e a r - o l d a n i m a l s ; i n f a c t t h e a m o u n t o f a l d o l -c o n d e n s a t i o n p r o d u c t t e n d e d t o b e l o w e r . T h i sd e c r e a s e i n l y s i n e c r o s s - l i n k s a g r e e d w i t h t h e d e t a i l e ds t u d y made b y J o h n & Thomas 1 9 7 2 ) o n t h e e f f e c to f a d v a n c i n g a g e o n t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n s o fe l a s t i n s i s o l a t e d f r o m t h e a o r t a s a n d l u n g s o f humans u b j e c t s .

T h e w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e S c i e n c e R e s e a r c h C o u n -c i l a n d t h e R o y a l S o c i e t y . G . F . t h a n k s t h e M e d i c a lR e s e a r c h C o u n c i l a n d R . J . t h e S c i e n c e R e s e a r c h C o u n c i lf o r s t u d e n t s h i p s .R e f e r e n c e sD a v i s , N . R . & A n w a r , R . A . 1 9 7 0 ) J . A m e r . C h e m .S o c . 9 2 , 3 7 7 8 - 3 7 8 2F r a n z b l a u C . , S i n e x , F . M . , F a r i s , B . & L a m p i d i s , R . 1 9 6 5 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 2 1 , 5 7 5 - 5 8 1J o h n , R . & T h o m a s , J . 1 9 7 1 ) I n t . J . B i o c h e m . 2 , 5 2 9 - 5 3 6J o h n , R . & T h o m a s , J . 1 9 7 2 ) B i o c h e m . J . 1 2 7 , 2 1 6 - 2 6 9L a n s i n g , A . I . , R o s e n t h a l , T . B . , A l e x , M. & D e m p s e y ,E . W. 1 9 5 2 ) A n a t . R e c . 1 1 4 , 5 5 5 - 5 7 0L e n t , R . W . , S m i t h , B . , S a l c e d o , L . L . , F a r i s , B . &F r a n z b l a u , C . 1 9 6 9 ) B i o c h e m i s t r y 8 , 2 8 3 7 - 2 8 4 5M i l l e r , E . J . , P i n n e l l , S . R . , M a r t i n , G . R . & S c h i f f m a n n ,E . 1 9 6 7 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 2 6 , 1 3 2 - 1 3 7P a z , M. A . , H e n s o n , E . , B l u m e n f i e l d , 0 . O . , S e i f t e r , S . &G a l l o p , P . M. 1 9 7 1 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n .4 4 , 1 5 1 8 - 1 5 2 3S a n d b e r g , L . B . , W e i s s m a n , N . & S m i t h , D . W. 1 9 6 9 )

B i o c h e m i s t r y 8 , 2 9 4 0 - 2 9 4 5S a n d b e r g , L . B . , Z e i k u s , R . D . & C o l t r a i n , I . M. 1 9 7 1 )B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 3 6 , 5 4 2 - 5 4 5S l a c k , H . G . B . 1 9 5 4 ) N a t u r e L o n d o n ) 1 7 4 , 5 1 2 - 5 1 3S t a r c h e r , B . C . , P a r t r i d g e , S . M. & E l s d e n , D . F . 1 9 6 7 )B i o c h e m i s t r y 6 , 2 4 2 5 - 2 4 3 2S y k e s , B . C . & P a r t r i d g e , S . M. 1 9 7 2 ) B i o c h e m . J . 1 3 0 ,1 1 7 1 - 1 1 7 2T h o m a s , J . , E l s d e n , D . F . & P a r t r i d g e , S . M. 1 9 6 3 )N a t u r e L o n d o n ) 2 0 0 , 6 5 1 - 6 5 2

V o l . 1 3 6

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Biosynthtic Pathway of Desomine in Elastin