BOJENJE MIKROORGANIZAMA

BOJENJE:

Morfološki nivo izučavanja MO (veličina, oblik, neke unutrašnje i spoljašnje strukture)

BOJA:

Hromoforna grupa → daje obojenost

Auksohromna grupa → omogućava elektrolitičku disocijaciju boje i interakciju sa ćelijskim strukturama

PH BOJE:

BAZNE → imaju afinitet za negativno

naelektrisane (kisele) strukture u ćeliji (ćelijski

zid)

KISELE → zbog negativnog naelektrisanja ne

vezuju se za ćelijske strukture nego boje

okolinu ćelija – negativna bojenja

I bazne i kisele su najefikasnije u neutralnoj ili

alkalnoj sredini.

PRIPREMA PREPARATA

Fikiranje preparata – zaustavljanje enzimatske

aktivnosti bakterija, ubijanje ćelija i lepljenje

ćelija za pločicu.

Razmaz bakterija se fiksira brzim prenošenjem

pločice kroz plamen nekoliko puta (toplotna

fiksacija). Alternativno - metanolna fiksacija

Trajni preparati- kanada balzam + pokrovno

staklo

TIPOVI BOJENJA

Prosta bojenja → jedna boja; određivanje

oblika, veličine, broja i načina grupisanja MO

Složena (diferencijalna) bojenja → više boja;

omogućavaju diferenciranje i identifikaciju

bakterija (bojenje po Gramu)

Specijalna bojenja → prosta ili složena;

uočavanje određenih struktura (spore, kapsule,

flagele)

PROSTA BOJENJA:

BOJENJE PO LOEFLER-U

N

2x2cm U uglu mikroskopske pločice napišite neki svoj

znak i taj deo pločice neka ostane netretiran,

znak će služiti kao orijentir sa koje se strane

preparat nalazi

U uglu mikroskopske pločice napišite neki svoj

znak i taj deo pločice neka ostane netretiran,

znak će služiti kao orijentir sa koje se strane

preparat nalazi

Na poleđini pločice nacrtajte kvadrat 2x2 cm, u

okviru kojeg će se nanositi uzorak

Na poleđini pločice nacrtajte kvadrat 2x2 cm, u

okviru kojeg će se nanositi uzorak

Na obeleženu površinu naneti 0,01 ml uzorka Na obeleženu površinu naneti 0,01 ml uzorka

N 2x2cm Ezom razmazati uzorak B. subtilis po

obeleženoj površini

Ezom razmazati uzorak B. subtilis po

obeleženoj površini

PROSTA BOJENJA:

BOJENJE PO LOEFLER-U

Fiksirati preparat provlačenjem kroz plamen

(pažljivo!), ćelije se ubijaju i lepe za pločicu

Fiksirati preparat provlačenjem kroz plamen

(pažljivo!), ćelije se ubijaju i lepe za pločicu

Naneti nekoliko kapi boje Metilensko plavo preko

razmaza, sačekati oko 3 min, pa isprati vodom i

sačekati da se osuši

Naneti nekoliko kapi boje Metilensko plavo preko

razmaza, sačekati oko 3 min, pa isprati vodom i

sačekati da se osuši

Posmatrati preparat pod mikroskopom Posmatrati preparat pod mikroskopom

ODREĐIVANJE UKUPNOG BROJA MO PO BREED-U

Na preparatu obojenom po Loefler-u prebrojati

nekoliko vidnih polja pa odrediti prosečan broj

ćelija po vidnom polju → a

Broj ćelija / ml →

A = 100 a K

Na pločicu je nanešeno

0,01 ml (stoti deo ml)

Na pločicu je nanešeno

0,01 ml (stoti deo ml)

Koeficijent polja:

K=P/p,

P – površina razmaza (4cm2)

p = r2π, r se određuje preko

objekt mikrometra

K≈2 × 104

Koeficijent polja:

K=P/p,

P – površina razmaza (4cm2)

p = r2π, r se određuje preko

objekt mikrometra

K≈2 × 104

BOJENJE PO GRAMU (Hans Christian Gram 1884.)

Složeno → dve boje

Diferencijalno → razdvaja ćelije na G+ i G- na

osnovu građe ćelijskog zida

Gram-pozitivne bakterije imaju debeo jednoslojan ćelijski zid peptidoglikanske prirode (50-90%), a kao

rezultat se dobijaju ljubičasto obojene ćelije. Gram-negativne poseduju tanji sloj peptidoglikana (oko 10%) i

slabo zadržavaju ljubičastu boju i nanknadno se boje u crveno primenom druge boje.

FIKSIRANJE PREPARATA TOPLOTOM

Jedna mikroskopska pločica

(nije potrebno crtati kvadratić na poleđini pločice)

Razmazi bakterija:

E. coli + B. subtilis

E.coli + L. innocua

1. Nakon fiksiranja ćelija naneti prvu

boju Kristal violet, sačekati da odstoji

1-2 min, pa blago isprati vodom.

1. Nakon fiksiranja ćelija naneti prvu

boju Kristal violet, sačekati da odstoji

1-2 min, pa blago isprati vodom.

KRISTAL VIOLET

2. Odmah sipati par kapi Lugolovog

rastvora (fiksira boju)

2. Odmah sipati par kapi Lugolovog

rastvora (fiksira boju)

LUGOLOV RASTVOR

2. Odmah sipati par kapi Lugolovog

rastvora (fiksira boju)

2. Odmah sipati par kapi Lugolovog

rastvora (fiksira boju)

LUGOLOV RASTVOR

3. Nakon 1 min ispirati 96% etanolom

dok boja ne počne jako da se skida,

prekinuti obezbojavanje vodom.

3. Nakon 1 min ispirati 96% etanolom

dok boja ne počne jako da se skida,

prekinuti obezbojavanje vodom.

ETANOL

4. Naneti drugu boju 0.25% Safranin,

sačekati 30 s i isprati vodom.

4. Naneti drugu boju 0.25% Safranin,

sačekati 30 s i isprati vodom.

SAFRANIN

BOJENJE PO ZIEHL-NEELSONU

Složeno i diferencijalno

“Acid-fast”, zbog kiselog rastvora alkohola koji se

koristi za odbojavanje

Boje se acidorezistentne bakterije čiji ć. zid ima

visok sadržaj lipida, zbog čega se prilikom bojenja

vrši zagrevanje kako bi boja difundovala

Za acidrez. ćelije koristi se boja karbol fuksin,

ostale ćelije se boje metilenskim plavim

M. zeleno

H2O

Safr.

H2O

SPECIJALNO BOJENJE SPORA PO SCHAEFFER-FULTON-U

SPECIJALNO BOJENJE SPORA PO SCHAEFFER-FULTON-U

1. Nakon fiksiranja razmaza (B. subtilis), na

preparat naneti 5% Malahit zeleno i pažljivo

zagrevati na plamenu do pojave pare (prva

pojava belog dima je znak da postupak treba

obustaviti!), preparat ne sme da se osuši, ako

je potrebno dodati još boje, pa isprati vodom.

1. Nakon fiksiranja razmaza (B. subtilis), na

preparat naneti 5% Malahit zeleno i pažljivo

zagrevati na plamenu do pojave pare (prva

pojava belog dima je znak da postupak treba

obustaviti!), preparat ne sme da se osuši, ako

je potrebno dodati još boje, pa isprati vodom.

2. Naneti drugu boju 0,5% Safranin, nakon

30-60 s isprati vodom.

2. Naneti drugu boju 0,5% Safranin, nakon

30-60 s isprati vodom.

3. Postaviti preparat vertikalno da se osuši pa

mikroskopirati.

3. Postaviti preparat vertikalno da se osuši pa

mikroskopirati.

SPECIJALNO BOJENJE KAPSULA

Kapsule se slabo boje baznim bojama, pa na preparatu ostaju neobojene zone oko ćelija

Pošto sadrže dosta vode, prilikom bojenja se ne vrši fiksiranje na plamenu, nego se suše na vazduhu.

Po Olt-u → 2-3% safranin, ćelije obojene crveno, kapsule neobojene zone oko ćelija

Po Giemsa-i → mešavina metilenskog plavog (bazna boja) i eozina (kisela boja), ćelije plave, okolina crvena, kapsule neobojena zona oivičena crvenom linijom

HVALA NA PAŽNJI!