COURTE NOTE Ann. Virol. (Inst. Pasteur) 1981, 132 E, 389-393

POUR

B R O N C H I O L I T E S DU N O U R R I S S O N

V I R U S R E S P I R A T O I R E S Y N C Y T I A L :

INT]~RI~T E T L I M I T E S DES T E C H N I Q U E S

D ' I M M U N O F L U O R E S C E N C E

L E D I A G N O S T I C R A P I D E , D I R E C T E T I N D I R E C T

p a r F . F r e y m u t h (0, A. H a r d o u i n (0, E . B u t h i a u (0, D. L e h o u e z e c (~), P. B o u t a r d (0, J" G u i h a r d (0, P. C h a r b o n n e a u (0, C. Baz in (a) e t C. L e c a c h e u x (0

(x) Laboratoire de Virologie CHU de Caen (Pro[. Agr. F. Fregmuth), (0 Services de P~dialrie, CHU de Caen (Pro[. J. Guihard, Pro[. J. L'Hirondel), el (3) Service des Maladies in/ectieuses,

CHU de Caen (Pro/. C. Bazin)

SUMMARY

EFFICIENCY AND LIMITS OF IMMUNOFLUORESCENT TECHNIQUES FOR RAPID DIRECT DIAGNOSIS

AND SEROLOGY OF R S V BRONCHIOLITIS

From October, 1980, to March, ~.981, the direct fluorescent antibody technique from nasal aspirates and the serology by immunofluorescence (IF) were developed to evaluate their efficiency for the rapid diagnosis of respiratory syncytial virus (RSV) infections. RSV was identified in 208 of the 365 specimens. In Caen, hospitalized infants with bronchiolitis had secretions mostly weakly positive (90/154) than strongly positive (64/154), in spite of specimens taken at an early stage of the disease, without any relation t o the severity of bronchiolitis. Paired sera were rarely available for serology (11/154). Increasing IF antibodies are present in 7 cases, and absent with CF test. On 80 acute sera, IF antibodies were absent (21/80) or low (28/80). In the other cases (39/80), IgM activity was also detected two times out of three.

KEY-WORDS: Bronchiolitis, BSV, Immunofluorescence; Comparison, FC.

Manuscrit re~u le 21 novembre 1980, accept6 le 7 mai 1981.

390 F. FREYMUTH ET COLL.

Au cours de l 'hiver 1980-1981, une forte ~pid~mie d'infections ~ virus respiratoire syncitial (VBS) a s~vi en Basse Normandie. Elle est apparue plus pr~cocement que lors de l 'hiver precedent, a pr~sent~ son acm6 en d~cembre et s'est t radui te par un nombre anormalement 61ev~ de bronchio- lites graves chez les nourrisons hospitalis~s (plus de 1/3 des cas).

A cette occasion, les techniques d'immunofluorescence (IF) ont 6t~ utilis6es pour le diagnostic direct et indi rect ; leurs avantages et limites respeetives seront envisages.

MATt~RIEL ET MI~THODES

1) Entre octobre 1980 et mars 1981, 368 aspirations nasales ont ~te examinees. Elles provenaient d'enfants hospitalises au CHU de Caen et dans les h6pitaux r6gionaux.

Selon les techniques classiques, les secretions ont et5 soigneusement lavees en tampon phosphate (PBS). Le surnageant a 6re inocule aux cultures cellulaires (HEp2, MRC5) et le culot a permis de preparer des frottis qui, fixes dans l'acetone, ont ensuite etr marques ~ l'aide d'un serum fluorescent anti-VRS (serum Flow, lot n ~ 45637.006) [3, 5, 11, 12].

2) Le serodiagnostic est realise, avec l'antig6ne MBA, en fixation du complement (FC) ou par IF. Deux techniques d 'IF ont ere utilisees.

Dans l'une, technique sur lame (IF1), on pr6pare - - en milieu MEM contenant du serum de veau nouveau-ne (2 ~o), du tampon HEPES (4,76 mg/ml), du bicar- bonate de sodium (0,22 mg/ml), de la penicilline (150 UI/ml) et de la streptomycine (100 ~g/ml) - - une suspension A raison de l0 s cellules/ml de cellules HEp2 infect~es par le VRS epid6mique et presentant 1 ~ 2 syncitiums/champ microscopique. Des gouttes de suspension sont deposees sur des lames, qui sont s~chees et fix~es duns l'ac6tone A -- 20 ~ C.

Duns l'autre technique, technique en plaques (IFp),. on melange 90 % de cette suspension ~ 10 % d'une suspension de HEp2 sames contenant 107 cel- lules/ml; on inocule 0,1 ml du m61ange duns les cupules d'une plaque de micro- titrage. Apr6s incubation pendant 5 h h 37 ~ C, on fixe pendant 10 min duns le melange acetone 80 ~o ~-eau 20 %. Le conjugu6 fluorescent anti-immunoglo- bulines humaines (Welcome) est employ~ au 1/406, et l'anti-IgM (Hyland) au 1/206.

Rt~SULTATS

A. - - Par IF directe, on observe que 208 des 365 aspirations nasales contiennent des antig~nes VRS (plus des 2/3 proviennent du CHU de Caen).

Quant i ta t ivement , les lames examin6es apparaissent plus souvent faiblement positives (90/154) que tr~s positives - - nombreuses cellules infeet~es/champ - - (65/154); eela, pour des pr61~vements effectu~s en

F C = f i x a t i o n d u e o m p l d m e n t . I F = i m m u n o f l u o r e s c e n c e . IF1 = I F s u r l a m e .

I F p = I F s u r p l a q u e . V B S = v i r u s r e s p i r a t o i r e s y n c y t i a l .

BRONCHIOLITE A VRS : DIAGNOSTIC PAR IF 391

TABLEAU I. - - C o m p a r a i s o n de la positivit~ des lames d'inspiration naso-pharyng~es marqufies (m~thode directe) au cours des bronchiolites ~ VR~.

Bronchiolites Bronchiolites communes graves

Tr~s positif 64 ( 4 1 % ) 11 (39 %)

Faiblement positif 90 (58 %) 17 (60 %)

Totaux 154 28

moyenne avant le 5~me jour du d~but clinique, et sans rapport avec la gravit~ de l'atteinte (tableau I).

Dans 27 % des cas (42/154), l'interpr~tation des images est rendue difficile par la presence de cellules abim~es, groupies en areas, ou par un exc~s de mucus. Rarement, on observe une r~action faussement posi- t ive (3/154). Enfin, l'etlicacit~ de cette m~thode diagnostique (208/365) est environ 2 lois sup~rieure h l' isolement viral, obtenu dans 29 cas sur 105.

B. - - La comparaison des techniques d'IF est faite sur 12 paires de s~rums d'enfants avee ~l~vation significative d'anticorps FC (fig. 1).

La concordance est bonne et la sensibilit~ de I'IF 4 fois (IFp) h 6 fois (IF1) sup~rieure h celle de la FC. Chez les nourrisons, 11 paires de s~rum

i * 500 W �9 * �9

I s

s

1 " 100 ~ ~ . �9

s s S

�9 s

s ~ �9 s

s s

s

go S s ~

go

F c 8 16 32 64

FIG. 1. - - Comparaison de, la Fc el des techniques d ' IF en plaques (e) et sur lames ( ~ ) dans le s~ro-diagnostic des infections dt VRS.

392 F. FREYMUTH ET COLL.

ont ~tfi obtenues. La FC est n~gative; et en IF on observe 7 s~ro-conversions, 3 :eas avee des t aux d 'antieorps filev~s et stables, et 1 eas avec un t aux faible et stable. Pour les 80 s~rums pr~coees recueillis, la FC est n~gative en IF on note que les anticorps sont souvent absents (21/80) ou presents des t aux tr~s faibles (28/80); lorsqu'ils sont ~lev~s (31/80), la recherche d 'IgM est positive 3 lois sur 4.

DISCUSSION

Le diagnostic des bronchiolites ~ VRS du nourrison par IF directe est un examen rapide et simple h r~aliser. Mais il exige l 'util isation d'excel- lents r~actifs et le recours syst~matique h la m~thode indirecte au moindre doute [2, 5]. La fr~quence de r~sultats faiblement positifs, sans relation avec la gravit~ de la bronehiolite et l 'existence d'images floues h fluo- rescence homog~ne et terne, peuvent ~voquer une fixation d 'anticorps sp6eifiques sur les eellules infect~es [6]. La comparaison avee l ' isolement viral est habi tuel lement eoneordante [1, 3, 9, 13]; le peu de VRS isol~s ici t ient sflrement h l 'absence de precautions prises dans le recueil et le t ranspor t des pr~l~vements, et au fail que le pouvoir infectant disparait plus rapidement que la s t ructure antig~nique [4].

La n~gativit~ du s~ro-diagnostie en FC dans les at teintes h VRS du nourrisson est classique [8] ; l ' IF est h cet ~gard une m~thode plus int~res- sante. L 'absenee en IF d 'anticorps dans environ 1/4 des s~rums recueillis dans les cas aNgus, plaide eontre le m~eanisme immunopathog~nique des bronchiolites [10]; cependant la presence d 'antieorps neutralisants semble plus fr~quente [7]. La recherche d 'antieorps de classe IgM, quand elle est possible - - 38 % des eas - - est utile pour le diagnostic rapide, car elle apparai t positive 2 fois sur 3.

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BRONCHIOLITE A VRS : DIAGNOSTIC PAR IF 393

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