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機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

Ⅲ. 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基礎研究

代表者 朴 龍洙 創造科学技術大学院・教授

分担者

尾形 慎

加藤 竜也

坂元 尚紀

徳元 俊伸

Vipin Kumar Deo

村川 明子

山崎 昌一

創造科学技術大学院・特任助教

農学部・助教

工学部・助教

理学部・教授

創造科学技術大学院・特任助教

創造科学技術大学院・特任助教

創造科学技術大学院・教授

１．研究目的 ウイルスはエンベロープと呼ばれるタンパク質、或いはカプシドと呼ばれるタンパク質（非エンベ

ロップウイルス）の殻で覆われている。このエンベロープタンパク質やカプシドタンパク質のみで、

遺伝情報を持たないものをウイルス用粒子（Virus like particle, VLP）と呼ばれる。VLP は、表面に抗原

タンパク質などを提示しているので、抗原性を持つので、成分ワクチンとしての研究が注目されてい

る。特に VLP は遺伝物質を持たないので感染の心配が無いので、ウイルスの構造をミミックしたもの

と言える。既に 30 種以上のウイルスを用いた VLP の発現が知られ、その中でパピロマウイルス様粒子

はワクチン用として臨床試験段階に至っている。そこで、VLP を量産する場合、大量発現が可能であ

る点、血清のような動物由来のタンパク質が必要ない点、バキュロウイルスは狭い宿主範囲である点、

バキュロウイルスは簡単な処理で不活性化できる点で昆虫細胞が用いられる。そこで、本研究では、

VLP の作製、相互作用、及び評価に分けて、下記の様な分担体制で研究を遂行する。

作製

１）ワクチン用ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の開

発（朴）

２）Papilloma virusのＶＬＰに RSV-gagを融

合したＶＬＰの作製（加藤）

３）インフルエンザ検出用ナノビーズの作製（村

川）

４）Display of cancer targeting scFVs and Fab

Antibodies on Virus like Nanoparticles for

new drug delivery system（Deo）

作製

相互作用

評価

64

Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

相互作用

５）キュービック相を用いた生体膜の膜融合の研究（山崎）

６）膜タンパク質の機能解析（徳元）

評価

７）ヘマグルチニン提示ＶＬＰの評価（尾形）

８）透過型電子顕微鏡による VLP 粒子の微構造評価（坂元）

２．研究計画・方法

（１）ワクチン用ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の開発（朴）

前年度 Rous Sarcoma virus の Gag タンパク質からなるウイルス様粒子（RSV-gag VLP）の発現と精

製に成功した。この成果を基に、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）を提示したウイル

ス様粒子の発現と精製を試みた。インフルえん罪ウイルス Aの H1N1タイプは感染性が強く短時間で拡

散することから、これに対するワクチンの開発や検出手法の開発が急務である。そこで、昨年発現に

成功した Gag-VLPを用い、Gag-VLPの表面に HAの発現を目的とした。

Trichoplusia ni由来の Tn-5B1-4 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) を発現用宿主として用いた。

細胞は 1% (v/v) antibiotic– antimycotic (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を添加した Express five

serum free medium (SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)培地を用い、25 cm2 組織細胞培養用フ

ラスコ(Falcon, Lincoln Park, NJ, USA)にて、27ºC インキュベーター (Hitachi, Japan)で培養を行

った。大量のタンパク質発現のために培地を 200 ml含む 500 mlフラスコにて浮遊培養を行った。

安定発現株の作製には、それぞれ pIB/V5-His-Destと pIZ/V5-His-Dest Gateway vector (Invitrogen,

Carlsbad, CA, USA)を用いた。pRep (A) (ATCC catalogue No. 87702)を鋳型として RSV-gag cDNA を

PCR で増幅した。更に RSV-gag-577 断片は Forward primer: 5′-CACC ATGGAAGCCGTCATAAAGGTG -3′;

reverse primer: 5′-TTA CGA GAC GGC AGG TGG CTC AGG-3′を用い、PCRで増幅した。また、HAの cDNA

は Forward primer: 5′-CGGGGTACCATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGATGAAGGCAAACCTACTGGT-3′; reverse

primer: 5′-TCCCCGCGGTCAGATGCATATTCTGCACT3′を用い、pDP122B vector から PCR で増幅した。PCR

断片は、それぞれ pIB/V5-His-Dest と pIZ/V5-His-Dest に挿入し、 pIB/V5-His-RSV-gag-577 と

pIZ/V5-His-HAを得た。挿入配列は Thermo Sequenase Cycle Sequencing kit (USB, Cleveland, Ohio,

USA)によって確認した。pIB/V5-His-RSV-gag-577は安定株作製に用いられ、pIZ/V5-His-HA vectorと

共発現によってVLPs/HAの作製を行った。発現したVLPs及びHAはそれぞれAnti-p10とAnti-HA (Abcam,

USA)抗体を用いた western blottingで確認した。

65

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

（２）Papilloma virusのＶＬＰに RSV-gagを融合したＶＬＰの作製（加藤）

ウイルスはエンベロープの有無によって分類することができ、エンベロップを有しないウイルス（非エンベロップウイルス）はカプシドと呼ばれるタンパク質の殻で覆われている。このカプシドタンパク質のみを発現させることで、遺伝情報を持たないウイルス用粒子（VLP）を生産することができる。またエンベロップを有するウイルス（エンベロップウイルス）に関しても、ウイルスを構成するタンパク質だけを発現させることにより、エンベロップを持つ VLP を生産することができる。VLP はウイルスの大きさと同じく数十から数百 nm の大きさであり、ナノ粒子としてドラッグデリバリーやワクチン、ナノカプセルなど機能性ナノマテリアルとして利用可能である。本研究ではこの VLP をカイコで生産し、効率的な精製方法を確立する。またこの VLP 表面への機能性タンパク質の提示法を確立し、機能性タンパク質のアッセイヘの応用を試みる。

前年度、非エンベロップウイルスであるヒト papillomavirus（HPV）の L1 タンパク質を用いた。完全

長の L1（L1 Full）および C 末端側を欠損させた L1（L1 479）をカイコで発現させ、脂肪体から部分精

製を行った。今年度はその結果を基に、以下の研究を遂行する。

・HPV L1 VLP のカイコからの精製 2 種類の HPV 6b L1 タンパク質遺伝子（1-500 アミノ酸残基（Full）と 1－479 アミノ酸残基（Short））を構築し、L1-Full と L1-Short をカイコ-バクミド発現系を用いてカイコ幼虫で発現させた。それぞれ

の遺伝子を持つ BmNPV バクミド DNA をトランスフェクション試薬 DMRIE-C（Invitrogen）と一緒

に注射後、6-7 日飼育したカイコから脂肪体を回収した。回収した脂肪体に 1 匹あたりの脂肪体に 5mlの割合で PBS（pH7.4）を加え懸濁して、超音波破砕により、タンパク質を抽出した。破砕液を遠心分

離（30000 x g, 10 分間）後、上清を回収した。上清を HiTrap heparin カラムクロマトグラフィーに供

した。PBS（pH7.4）で平衡化した HiTrap heparin カラムに上清 6ml 供し、10ml の PBS でカラムを

洗浄した。洗浄後、1M の NaCl を含む PBS で吸着したタンパク質をグラジエント溶出で溶出させた。

Western blot により、L1 タンパク質の存在するフラクションを決定し、フラクションを回収した。精

製したそれぞれの L1 タンパク質を電子顕微鏡により確認した。 ・HPV L1 VLP への EGFP の提示 HPV 6b L1 タンパク質のアミノ酸残基 55-56, 174-175, 348-349 の間へ EGFP を挿入し、L1-EGFP融合タンパク質の構築を試みた。PCR により、それぞれの L1-EGFP 融合タンパク質遺伝子

（L1-EGFP55, L1-EGFP174, L1-EGFP348）を構築した。それぞれの融合タンパク質遺伝子を BmNPVバクミドに挿入して、カイコ-バクミド発現系を用いてカイコ幼虫でそれぞれの融合タンパク質を発現

させた。それぞれの遺伝子を持つ BmNPV バクミド DNA をトランスフェクション試薬 DMRIE-C（Invitrogen）と一緒に注射後、6-7 日飼育したカイコから脂肪体を回収した。回収した脂肪体に 1 匹

あたりの脂肪体に 5ml の割合で PBS（pH7.4）を加え懸濁して、超音波破砕により、タンパク質を抽

出した。破砕液を遠心分離（30000 x g, 10 分間）後、上清を回収した。上清から L1-Full および L1-Shortと同様の方法で HiTrap heparin カラムクロマトグラフィーにより、それぞれの融合タンパク質を精製

した。精製した融合タンパク質を電子顕微鏡で確認した。

ヒト papillomavirus VLP Rous sarcoma virus VLP

L1 タンパク質

Gag タンパク質

hPRR または scFv 脂質二重膜

VLP の構造

66

Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

BC CD DE EF FG HI

HPV 16 L1 protein

: Loop region

（３）インフルエンザ検出用ナノビーズの作製（村川） インフルエンザウイルスは 2003 年 11 月以来、東南アジアや中央アジアでトリからヒトへ感染する

事例が多数報告され、高い致死率を示している。本来トリとヒトの上皮細胞に発現される糖鎖構造は

異なっているためトリ型インフルエンザウイルスがヒトへは感染しないとされていた。しかし近年ヒ

ト由来細胞にもトリ型が認識する糖鎖を発現したり、感染が流行しているインフルエンザウイルスに

おいてはそのアミノ酸の点変異により認識性が変化したりすることがわかってきた。そこで本研究で

はインフルエンザウイルス感染を防ぐナノビーズを用いたワクチン開発を目的とした。インフルエン

ザウイルスに提示されたヘマグルチニン(HA)が糖鎖を認識することで標的となる生物種へ感染する。

しかしながら HA 固定化ナノビーズや糖鎖が提示されたナノビーズを競合添加することによって、移

入種の HA が標的細胞に侵入することを阻害することが可能となる。まずはヒト型とトリ型の HA を作

製する。ビーズにおいては金属種およびサイズを最適化し、実際にヒト由来細胞を用いてナノビーズ

の結合挙動の観察および定量的評価することを目指す。

（４）Display of cancer targeting scFVs and Fab Antibodies on Virus like Nanoparticles for new drug delivery system（Deo）

New type of DDS: scFvs and Fabs antibody will be produced and displayed on VLPs by co-expression in silkworms. The proposed research shall make a true DDS using nanoparticles produced in silkworms. These VLPs based nanoparticles shall be tested as carriers and their specificity shall be determined by the scFvs and Fabs on the surface of VLPs. This unique approach shall provide a method to direct therapeutics towards the cancer cells and avoid toxicity effects on the normal cells as shown in the figure.

（５）キュービック相を用いた生体膜の膜融合の研究（山崎）

膜が 3 次元的につながった生体膜/脂質膜のキュービック相（Q 相）と２分子膜の液晶相 (Lα相) の相転移は生体膜のトポロジー変化で重要であるが未解明な点が多い。山崎らは膜の表面電荷（負電荷

を持つ脂質の膜内濃度、または膜界面に結合する電荷を帯びたペプチド濃度で制御）に基づく静電相

互作用により、これらの相転移を誘起できることを初めて発見した (Biophys. J. 81, 983, 2001; Langmuir, 19, 4745, 2003; Adv. Planar Lipid Bilayers & Liposomes, 9, 163, 2009)。静電相互作用はマイルドな相互作用

なので、生体中で起こっている可能性は高い。J. Cell Biol. (173, 839, 2006) の生体中の Q 相の総説で上

記の研究は高く評価された。最近、水溶液の pH を下げることにより (pH2.9 以下)、ジオレオイルホス

ファチジルセリン(DOPS)とモノオレイン(MO)の混合膜（Lα相）の多重層リポソーム(MLV)が Q 相に相

転移し、かつそれが可逆的であることを発見した。さらに DOPS/MO 膜の一枚膜リポソーム（LUV）

の懸濁液の pH を下げることにより、1 時間以内に LUV を Q 相に構造転移することに成功した (Langmuir, 24, 3400, 2008)。これらは pH 制御による生体膜の Lα相と Q 相の間の構造転移の初めての例

である。pH 変化による機能制御は細胞中でよく行われるので、この結果の生物学的意義は非常に大き

Expected results

Cancer cell line

Tumor associated glycoprotein-72

FusionCancer cell line

RSV-gag-577 VLPsscFvs or Fabs

67

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

い。これらの相転移や構造転移には膜融合が伴うので、生体膜の膜融合のメカニズムやその応用の研

究のためにも、上記の Lα相と Q 相の間の構造転移の研究は重要である。 本研究ではこの pH 制御による生体膜の Lα相と Q 相の間の構造転移の素過程やメカニズム、および

応用の研究を行う。本年度は、低い pH が誘起する DOPS/MO 膜の Lα相から Q 相への相転移の素過程

を、X 線強度が強い SPring-8 の放射光と混合後ミリ秒単位で測定できる急速二液混合装置やストップ

トフローの装置を用いる時分割 X 線小角散乱法 (SAXS) により研究し、相転移のキネティックス（速

度定数や中間体の同定など）の解明をおこなう。その結果に基づいて、この相転移のメカニズムを解

明する。 （６）膜タンパク質の機能解析（徳元） 新規 GPCRステロイド膜受容体の発現、精製法の確立)

本研究は新たに見つかったステロイド膜受容体

（mPR）の大量発現とその精製法の確立を目的とする。

一般にステロイドホルモンは核内受容体を介して

mRNAの転写誘導を伴うゲノミック反応により作用す

るものと考えられてきた。しかし、核内受容体だけで

はなく細胞膜表面のステロイド膜受容体を介して

mRNAの転写誘導を伴わないノンゲノミック反応によ

り作用する経路の存在が古くから指摘されてきた（右

図）。ステロイド膜受容体の同定に向け多くの努力が

はらわれたが、同定には至らなかった。しかし、最近

になりついにステロイドの膜受容体候補である mPR分

子が発見された。 mPR分子はあらゆる組織で発現することが明らかになり、このことから細胞膜表面

のステロイド膜受容体を介したノンゲノミックなシグナル伝達経路が一般的なステロイドホルモンの

作用機構の一つであることが示唆され、ステロイド膜受容体分子の構造と機能の解明は生殖医療やニ

ューロステロイドによる脳の機能調節の理解などへの貢献が期待されている。しかし、細胞表面にお

けるステロイドの作用は世界的な議論の過中にあり、未だにこの分子の研究は活発化しておらず国内

において本格的に研究を進めているのは静岡大学のみである。 （７）ヘマグルチニン提示 VLP の評価（尾形） 我々はこれまでに天然ポリペプチドである納豆菌産生 γ-ポリグルタミン酸のカルボキシ基にヒト型

およびトリ型インフルエンザウイルスが特異的に認識するレセプター分子（糖鎖）を多価に結合させ

た人工糖鎖ポリペプチドの合成に成功している。本糖鎖ポリペプチドは親水性の糖鎖と疎水性の主鎖

からなり、両親媒性分子の特徴を有しているのでポリスチレンプレートの疎水基盤上に容易に固定化

できる。この特性を利用し、ELISA 法を基盤としたヘマグルチニン提示 VLP の評価を行う。具体的に

は、各濃度に調製したヒト型またはトリ型インフルエンザウイルスレセプター構造を含有する糖鎖ポ

リペプチドをユニバーサルプレートに添加後、1 分間 UV（254 nm）を照射することで固定化を行う。

続いて、BSA 溶液を用いてブロッキングしたのち、村川特任助教（分担者）によって作製された FLAGタグ配列を有するヘマグルチニン提示 VLP を添加・洗浄後、一次抗体・二次抗体を処理し最後に ELISA POD 基質 TMB キット HYPER の発色基質溶液を添加し 405 nm の吸光度を測定する。これにより VLPのヘマグルチニン提示の有・無および結合特異性を評価する。

（８）透過型電子顕微鏡による VLP 粒子の微構造評価（坂元）

透過型電子顕微鏡による VLP の微構造観察を行う。透過型電子顕微鏡でウィルス等の生物試料を観

察する際には、試料の輪郭を明瞭にするためにオスミウム等の重金属元素を用いたネガティブ染色操

作が必要となる。分担者はこれまでに様々な種類の VLP 観察を行ってきた経験を有している。透過型

電子顕微鏡観察には JEM2100F もしくは JEM2000FX-II を用い、透過像観察を行う。分担者はこれらの

装置の操作に習熟しており、本研究提案においても VLP 粒子の観察に技術的な問題は無いものと考え

ている。

68

Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

３．主な研究成果

（１）（３）ワクチン用ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の開発（朴、村川）

HA を提示した VLP を得るために VLP を発現している安定株の単離を行ったところ、D6 株が

VLP を発現していることが分かった。D6 株からは 0.78 mg の VLP を得ることができた。これは、

VLP 精製効率 4.5%に当たる。この株に HA を提示する株を得るために pIZ/V5-His-HA ベクターを

トランスフェクッションし、HA を発現する安定化株 D6/HA を得

た。この株は、二種類以上のタンパク質を発現し、これらは、VLP表面に提示されていると考えられる。そこで、D6/HA 細胞をマウス

一次抗体 Anti-FLAG と Cy3 ラベルした二時抗体 Anti-IgG を用い

て提示を確認した（図１）.

図１. 抗 anti-FLAG 一時抗体と Cy3 をラベルした抗 anti-IgG 抗体

を用い安定株 D6/HA の共焦点レーザー顕微鏡写真

D6/HA 株の培養液上澄みを取り、western blotting と SDS-PAGE を行い、結果を図２に示す。約

75 kDa のバンドはプロテアーゼによる切断されたサブユニットと考えられる。VLP の発現につい

ては、Gag のモノマー61 kDa及びサブユニットのバンドが確認された（図１、２B）。

20 kDa

50 kDa

2 31RSV-gag-577

p10-CA-NC

P10-CA

4 61 kDa50 kDa

25 kDa

42 kDa30 kDa

6 kDaMA-p10

RSV-gag-577MA-p10-CAp10-CA-NCp10-CA

p10

MA p10 CA NC

A B

図２. 精製担パック質の Western blotting。Lanes 1, 2, 3, 及び 4 は分子量マーカー (Magic marker XP)、D6/HA 株より得られたタンパク質を anti-influenza A で確認したバンド、D6 株より得られ

たタンパク質を anti-p10 抗体で確認した gag タンパク質、及びカイコから得たタンパク質を

anti-p10 抗体で確認した gag タンパク質。

更に精製タンパク質を 12% (w/v) SDS-PAGE ゲルに流し、Comassie blue 染色を行ったところ、51

と 25 kDaの分子量が確認できた (図３)。

図３．精製タンパク質の SDS-PAGE。Lane M と HA はそれぞ

れ分子量マーカー(Magic marker XP)と D6/HA株はから得ら

れた HAの Coomassie blue染色写真。

得られたＨＡの機能を確認するためにヘマグルチニンアッセイを行ったところ、粗精製ＨＡとＶ

ＬＰの結合によるヘマグルチニン凝集を確認した（図４）。ヘマグルチニン凝集は、ＨＡがウサギ

赤血球細胞表面のシアル酸と結合するとき見られる現象である。 また、粗精製サンプルについてＶＬＰ、ＶＬＰにＨＡを提示したものを Transmission electron microscopy (TEM)で観察を行った。ＶＬＰの形成は確認でき、また、ＶＬＰ状のＨＡもＶＬＰ表面

に金ナノ粒子が確認できた（図５）ので提示されたと考えられる。しかし、ＶＬＰ当たり結合した

ＨＡ分子の数は未確認であり、今後の課題である。

25 kDa

50 kDa

HAM

69

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

図４．粗精製サンプルのヘマグルチニンアッセイ。ウエル

１〜３までヘマグルチニン凝集が確認できた。

図５．VLPs のＴＥＭ写真。Ｄ

６株から 100 ml の培養液をシ

ョ糖密度勾配（10-60%(v/v)）に

かけ、2% phosphor tungstenic acid で染色を行い、ＴＥＭ

（JEOL-2100F at 200 kV）で観察

した（Ａ）。 同様な方法でＦＬ

ＡＧをコンジュゲーションし

た金ナノ粒子と反応させた

VLPs/HA のＴＥＭ写真（Ｂ）。 （２）Papilloma virusのＶＬＰに RSV-gagを融合したＶＬＰの作製（加藤）

HPV L1 VLP のカイコからの精製 L1-Full と L1-short の脂肪体抽出液を 25-60%スクロース密度勾配遠心分離に供したところ、L1-Fullはスクロース密度が高いフラクションに、L1-short はスクロース密度が低いフラクションに確認でき

た。脂肪体破砕液から HiTrap heparin カラムクロマトグラフィーによるそれぞれの L1 タンパク質の

精製を試みた。1M NaCl のグラジエント溶出でタンパク質を溶出したところ、ほぼ同様のフラクショ

ンの位置にそれぞれの L1 タンパク質が溶出された。SDS-PAGE ゲル上で両方の L1 タンパク質がバン

ドとして確認できたが、まだそれ以外のタンパク質も含まれていた。透過型電子顕微鏡でそれぞれの

L1 タンパク質を確認したところ、L1-Full では直径 20 – 50 nm の粒子が確認できたが、L1-Short は直

径数 nm 程度の粒子しか確認できなかった（図 1 (A), (B)）。この結果から、L1-Full は HPV VLP を形

成することができるが、L1-Short は VLP を形成できず、5 量体から成るカプソマーの状態で存在して

いることが示唆された。

(A) L1-Full (B) L1-Short

100 nm 100 nm

図 1 精製 HPV L1 の電子顕微鏡図 (A) L1-Full, (B)

L1-Short

FLAG tagged HA with 10nm gold particles

Lipid bilayer

100 nm

Protein shell

100 nm

Protein shell

Lipid bilayer

A B

70

Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

HPV L1 VLP への EGFP の提示 それぞれの L1-EGFP 融合タンパク質（L1-EGFP55, L1-EGFP174, L1-EGFP348）をカイコ幼虫で発

現させて、L1-Full および L1-Short と同様の方法で抽出、精製を行った。それぞれの融合タンパク質

を発現させたカイコでは、はっきりとした EGFP 蛍光が確認できなかった。SDS-PAGE ゲル上で脂肪

体破砕液のタンパク質の EGFP 蛍光を確認したところ、L1-EGFP348 の破砕液のみではっきりとした

EGFP 蛍光が確認できたが、予想よりも低分子量の位置にのみにバンドが確認された。それぞれの

L1-EGFP 融合タンパク質をカイコ脂肪体から L1-Full および L1-Short と同様の方法で精製し、精製し

た融合タンパク質を電子顕微鏡で確認した。L1-EGFP55 でははっきりとした VLP が確認できたが、

L1-EGFP174, L1-EGFP348 ははっきりとした VLP が確認できず、VLP の形が崩れていた（図 2 (A), (B), (C)）。1 次抗体としてマウス anti-EGFP 抗体と 2 次抗体として金コロイドが結合した anti-マウス

IgG 抗体を用いて免疫電子顕微鏡法で L1-EGFP55 VLP を解析したところ、VLP 上に金コロイドが確

認された（図 2 (D)）。このことから、L1-EGFP55 は EGFP を含んだ形で VLP を形成していると示唆

される。しかし、精製した L1-EGFP55 明確な EGFP 蛍光が無いことから、L1-EGFP55 内の EGFPは正しい構造を有しておらず、蛍光が無い構造で L1 タンパク質と融合されていることが示唆された。

100 nm 100 nm

100 nm 100 nm

(A) L1-EGFP55 (B) L1-EGFP174

(C) L1-EGFP 348 (D) L1-EGFP55 IEM

図 2 精製 HPV L1-EGFP 融合タンパク質の電子顕微鏡図 (A)

L1-EGFP55, (B) L1-EGFP174, (C) L1-EGFP348, (D) L1-EGFP55の免

疫電子顕微鏡図

71

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

（４）Display of cancer targeting scFVs and Fab Antibodies on Virus like Nanoparticles for new drug delivery system（Deo） Bacmid design

The hCC49 cDNA was picked up from pDONG1 (A kind gif from Prof. Ueda) and TOPO cloned into pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) to give pENTR/VHCH1 and pENTR/VLCL respectively. The sequences of all the PCR fragments inserted into pENTR/D-TOPO were confirmed by dideoxynucleotide chain terminating sequence (Sanger et al., 1977) using Thermo Sequenase Cycle Sequencing kit (USB, Cleveland, Ohio, USA). They were used to prepare the BmNPV expression bacmid for expression of protein in silkworm larvae. VHCH1 and VLCL from pENTR/VHCH1 and pENTR/VLCL respectively were transferred to pDEST8 by LR reaction according to the protocol to make pDEST8/ VHCH1 and pDEST8/ VLCL respectively, which were then transformed in to DH10 BmNPV wild type competent cells to make recombinant bacmids (Deo et al., 2006). White colonies of recombinant bacmids carrying the VHCH1 and VLCL were isolated and resulting bacmids were designated as BmNPV bacmid/ VHCH1 and BmNPV bacmid/ VLCL, respectively, and inoculated into 3 ml LB medium along with the antibiotics used for screening. After culturing them in LB medium with the antibiotics for 36 hours the BmNPV bacmids were isolated and confirmed by using standard M13 primers. Positive transformants were re-inoculated in 100 ml LB medium and isolated in large amount for injecting them into fifth-instar silkworm larvae. Silkworms rearing and injection

Fifth instars larvae (Ehime Sansyu Co. Ltd., Ehime, Japan) were reared on an artificial diet Silkmate S2 (Nihon Yokohama, Japan) for silkworms in a chamber (MLR-351H, Sanyo, Tokyo, Japan) with 65% humidity at 27◦C. Each Silkworm was injected with 40 μl recombinant bacmid DNA solutions containing 10 μg of BmNPV bacmid DNA, 10% (v/v) DMREI-C reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in PBS using 1 ml syringes. Post injection 7th day the silkworm’s hemolymph was harvested in tubes containing 2 mM phenyl thiourea to inhibit the melanization (Falcon, Lincoln Park, NJ, USA). These samples were then aliquoted into 1 ml eppendorf tubes and stored at – 80ºC.

Protein expression and purification

To detect the expression of recombinant protein, larval hemolymph and fat body from silkworm larvae, were collected respectively and subjected to 12% (w/v) SDS-poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using the mini-protean II system (Bio-Rad) (Deo and Park, 2006). After SDS-PAGE, proteins were blotted on to a PVDF membrane using the Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer cell (Bio-Rad). The membranes were probes with mouse anti-DDDDK primary antibody solution for 1 h and secondary mouse anti-rabbit IgG antibody labeled with horse-radish peroxidase (HRP) for 1 h. Using ECL plus western blotting reagent pack (Amersham Biosci.) specific bands were detected. Those bands were analyzed using a Fluor-S/MAX multi-imager (Bio-Rad).

The protein concentrations were estimated using standard BCA protein estimation protocol from kit (Pierce BCA Assay kit, Japan). Purification of VLPs displaying ScFvs and Fabs will be done in two stages, first in similar fashion as for VLPs isolation (J. Biotechnology,155,185-192, 2011) and then further purification of the protein using FLAG affinity gel. Immuno electron microscopy

Samples diluted 1:500 in distilled w buffer were spotted upon the carbon grid (Okenshoji,

72

Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

Tokyo, Japan) and dried at room temperature. Negative staining was performed using 2% phospho tungstenic acid (Silverman and Glick, 1969; Vogt and Simon, 1999). Samples were observed at 50,000× magnifications on TEM (JEM 2100F, JOEL, Tokyo, Japan) operating at 200 kV (Briggs et al., 2006). ELISA test for activity confirmation The activity of the ScFvs and Fabs will be done by ELISA using MUC-1 and TAG-72 antigens (Analytical Biochemistry; 386, 36-44, 2008. Further confirmation of the activity of the protein will be performed using LS174T cell line as its surface has TAG-72. The bacmids carrying the Fab, ScFvs and VLPs were prepared and confirmed by DNA sequencing. These bacmids were then injected into the silkworm for protein expression and purification. The expression of ScFvs and Fabs was confirmed by western blotting using Anti-FLAG antibodies (Figure 1 A and B).

Almost 30μg of Fabs were purified using FLAG sepaharose affinity gels from 1ml Silkworm hemolymph. The purified Fab showed activity in its ability to recognize TAG-72 antigen in an ELISA (Figure 1 C). The VLPs have been purified from silkworm hemolymph using sucrose gradient method (Journal of Biotechnology. Vol. 155(2011): 185-192). The cost effectiveness of the new system will be a major advantage as silkworms are easy to rear and handle. The ingenuity in this proposed research lies in the fact that any antibody against any other marker can be used in future just by co-expression along with VLPs. Thus, this research will for the first time unite two major targets for making a biotechnological product viable; efficient expression of antibodies and effective delivery of drugs.

73

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

（５）キュービック相を用いた生体膜の膜融合の研究（山崎）

中性で Lα相である 20%ジオレオイルホスファチジルセリン (DOPS)と 80%モ

ノオレイン(MO)の混合膜の多重層リポソーム(MLV) の水溶液の pH を下げるとき

に誘起される Lα相から Q224 相への相転移 のキネティックスを SPring-8 の放射光

を用いて時分割 X 線小角散乱法 (TR-SAXS) により研究した。中性の緩衝液中で作

成した 20%DOPS/80%MO-MLV の懸濁液と低い pH の緩衝液を新しく開発した急速

二液混合装置を用いて急速に混合し、その後の膜構造変化を TR-SAXS により測定

した。ポリエチレングリコール（PEG）存在下で最終 pH が 2.6 から 2.9 の時は、混

合後 2-10 秒以内にヘキサゴナル II (HII) 相（単分子膜が丸まった管状構造が六方晶

的に積み上がった構造）のピークが現れ成長するが、30-90 s 後から Q224相のピー

クが現れ始め、その後 HII相から Q224相への相転移が起こり、15-30 分以内で HII

相のピークが消失した。この結果から低い pH が誘起する Lα相から Q224相への相

転移では中間体として HII相が出現することを初めて明らかにし、HII相から Q224

相への転移の速度定数を求めることができた。これらの結果は、現時点では以下の

ように解釈できる。この領域の pH では、自由エネルギーから考えれば Q224相がも

っとも安定であるが、Lα相から Q224 相への活性化エネルギーが Lα相から HII相へ

のそれに比べて大きいために、最初に Lα相から HII相への相転移が急速に起こり、

その後HII相からQ224相への相転移がゆっくり起こったと考えられる(J. Chem. Phys., 134, 145102, 2011)。 さらに上記の研究では明らかにできなかった Lα 相から Q 相への相転移の初期過程を解明すること

を目的にして、SPring-8 の BL40B2 より X 線強度が強い BL45XU にてストップトフローの装置を用い

て、 DOPS/MO-MLV が低い pH になったときの Lα 相から Q 相への相転移のキネティックスパスウエ

イを研究した。200 ms のＸ線の露光時間で脂質膜の構造を同定することが可能になり、

23%DOPS/77%MO-MLV が低い pH になったときの Lα 相から Q 相への相転移の初期過程で、Lα 相から

HII 相が成長していく過程を検出することに初めて成功した。

（６）膜タンパク質の機能解析（徳元） 新規 GPCRステロイド膜受容体の発現、精製法の確立)

膨大な数に及ぶ化学物質群との反応性の評価のためにはより簡便なアッセイ系が必要になるた

め、膜タンパク質の発現に適した酵母株（Pichia）を用いた新たな大量発現系の構築を進めた。

これまでに mPRα分子発現 Pichia酵母株を樹立し、至適培養条件を見出した。本研究ではさらに

精製に向けた可溶化法の検討として界面活性剤による可溶化について検討した。

膜タンパク質の結晶化に実績のある界面活性剤 7種類について可溶化を試みた結果、n-Dodecyl—β-D-maltoside (DDM)により共雑タンパク質の混入の少ない良好な結果が得られた。そこで可溶化

品についてニッケルアフィ二ティークロマトグラフィーによる精製を行ったところ、ｍPRαタンパ

ク質が分画された。精製度がまだ不十分ではあるが分画できる条件が見出されたことは大きな前進

であった。2 段階目以降の精製ステップを早期に確立し、アッセイ系の構築に進めたい。

本研究により mPR 分子の発現に成功すれば、本特別経費の研究課題である機能性ナノ粒子へ応用

する受容体分子の候補となり得る。これにより mPR分子をターゲットとした創薬に貢献が期待され

る他、化学物質のノンゲノミック反応に対する安全性評価が可能となることが期待される。

活性を有するリコンビナント mPRの大量発現系の構築

膨大な数に及ぶ化学物質群との反応性の評価のためにはより簡便なアッセイ系が必要になるため、膜タン

パク質の発現に適した酵母株（Pichia）を用いた新たな大量発現系の構築を進めた。これまでの研究で

mPRα分子発現 Pichia 酵母株を樹立し、至適培養条件を見出した。本年度はさらに精製に向けた可溶化

法の検討として界面活性剤による可溶化について検討した。これまで一般的な界面活性剤について検討

したが、本年度は膜タンパク質の結晶化に実績のある界面活性剤 7 種類について可溶化を試みた結果、

74

Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

n-Dodecyl—β-D-maltoside (DDM)により共雑タンパク質の混入の少ない良好な結果が得られた。そこで可

溶化品についてニッケルアフィ二ティークロマトグラフィーによる精製を行ったところ、ｍPRαタンパク質が

分画された。精製度がまだ不十分ではあるが分画できる条件が見出されたことは大きな前進であった。2段階目以降の精製ステップを早期に確立し、アッセイ系の構築に進めたい。

Ni-NTA⑥イミダゾール濃度 M 17 18 M 1718

75

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

以上、翻訳後修飾系を有することが知

られている Pichia 株によりステロイド

膜受容体が発現可能であることが示され

た。今後の精製法の確立が鍵となるがス

テロイド膜受容体反応性物質のハイスル

ープットスクリーニング系の実現へ向け

て大きな前進が出来た。

（７）ヘマグルチニン提示 VLP の評価（尾形）

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発において、VLP 表面上に提示した分子の確認および評価

は研究の進行において非常に重要な要素を担っている。本研究においては、ヘマグルチニン提示

VLP 評価の前段階として、ヒト型インフルエンザウイルスと同様の糖鎖認識特性を示すセイヨウ

ニワトコレクチン（SNA）および組換えヒト型インフルエンザウイルスヘマグルチニン

｛A/California/04/2009(H1N1)｝を用いて ELISA 法を試みた。その結果、両方とも糖鎖構造特的

（Neu5Acα2,6Gal）な相互作用を確認した。コントロールとして用いたアシアロ構造や α2,3 シアリ

ルガラクトース構造には結合を示さなかった。これにより、本 ELISA 法がインフルエンザウイル

スヘマグルチニンの糖鎖認識特性を指標とする評価系として利用可能であることを実証した。 （８）透過型電子顕微鏡による VLP 粒子の微構造評価（坂元） 透過型電子顕微鏡(TEM)を用いた VLP 粒子の微構造観察により、合

成された VLP 粒子の形状、サイズ等に関する情報を得ることが出来た。

VLP 粒子の染色には、リンタングステン酸を用いた。右図に示す通り、

観察された VLP 粒子表面を取り囲む明瞭な線が観察されることから、

VLP 粒子の表面が均一にコーティングされていることが明らかとなっ

た。

４．今後の展開

（１）ワクチン用ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の開発（朴）

VLPs は、脂質膜に囲まれたもので、核酸を含んでいない。本研究は昆虫細胞を用い、ＶＬＰの

発現を行い、更にＶＬＰ表面にＨＡの提示を試みた。しかし、ＨＡの機能性確認を行う必要はあ

るが、電子顕微鏡からＨＡの提示が確認された。今後高効率精製を行い、糖鎖との結合実験を必

要とする。糖鎖との結合性が確認できれば、今後インフルエンザワクチンとして開発が可能とな

る。

（２）Papilloma virusのＶＬＰに RSV-gagを融合したＶＬＰの作製（加藤）

本研究で HPV 6b L1 タンパク質の 55-56 番目のアミノ酸残基の間に VLP の構造を破壊することなく

EGFP を挿入することができた。しかし、挿入した EGFP は正しい構造をしていなかった。現在まで

に数十アミノ酸程度のペプチドを L1 タンパク質に挿入して VLP 上へペプチドを提示した報告はある

が、数百アミノ酸からなるタンパク質を提示させた例はない。今後は L1 VLP への効率的でかつ正しい

構造のタンパク質提示法を確立するとともに、機能性ペプチドの L1 VLP への提示を行う。

76

Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

（３）インフルエンザ検出用ナノビーズの作製（村川） ナノビーズにさまざまな分子種を固定化することで機能性ビーズを作製する。機能性ナノビーズと

してヘマグルチニン特異的シアル酸糖鎖を付加させたビーズを作製できれば、世界的に猛威を振るっ

ているインフルエンザウイルスの汎用性のあるワクチンが創製されることになり、死亡者や重篤患者

の削減につながると考えられる。またナノビーズは大量生産が可能であり、機能性ナノビーズは治療

の際のワクチンとしての利用だけでなく検出・解析の際にも有用なツールとなることが期待される。

将来的には多機能を有したナノビーズを創製することを目標とし、オーダーメードな治療に役立つナ

ノビーズとなる可能性を秘めている。

(４）Display of cancer targeting scFVs and Fab Antibodies on Virus like Nanoparticles for new drug delivery system（Deo） The next target is to display the Fabs on the VLPs. In order to anchor the Fabs on VLPs a transmembrane region is necessary. Glycoprotein 64 (gp64) a structural protein of Baculovirus is well studied protein and has been previously used as a fusion protein for displaying foreign proteins. Once this bacmid is prepared it will be injected into the silkworms and VLPs displaying Fabs and ScFvs will be purified. （５）キュービック相を用いた生体膜の膜融合の研究（山崎）

本年度の研究結果に基づいて、Lα 相から Q 相への相転移の初期過程を解明することを目的にして、

DOPS/MO-MLV が低い pH になったときの Lα 相から Q 相への相転移のキネティックスパスウエイを詳

細に研究する。特に、Lα 相から Q 相への相転移の初期過程に対する水溶液の pH や膜の表面電荷密度

の効果を研究する。また、DOPS/MO 膜の 1 枚膜リポソームである LUV（直径 100 nm）から Q 相への

構造転移のキネティックスパスウエイを同様の方法で調べる。

（６） 膜タンパク質の機能解析（徳元） 今後は発現に成功したリコンビナントステロイド膜受容体について質量分析計を用いたペプチドマ

スフィンガープリントによる同定を行い、ウエスタンブロット陽性バンドがステロイド膜受容体である

ことの確証を得る。その後、その精製法を確立する。リコンビナントステロイド膜受容体にはヒスチジ

ンタグが融合してあり、これを利用したアフィニティークロマトグラフィーによる精製をこれまでの予

備実験で試みたがこのクロマトグラフィーのみでは精製が不十分であった。今後、他のカラムクロマト

グラフィーを組み合わせた精製法を確立し、センサーとして利用可能な標品を単離してセンサーの開発

を開始する。

（７）ヘマグルチニン提示 VLP の評価（尾形）

引き続き今後も、ELISA 法を用いたヘマグルチニン提示 VLPの評価系を提供することで本プロジ

ェクトの円滑な進行を提供する。

（８）透過型電子顕微鏡による VLP 粒子の微構造評価（坂元） これまでの研究で、VLP 粒子表面の層状構造を確認することが出来た。染色条件により観察に時間

を要する場合が多く、今後は染色条件の最適化による確実な観察を行えるようにする。また他の系の

VLP 粒子等に関しても同様の手法により微構造評価を行っていく。

77

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

５．研究業績

朴 龍洙

(1) 学術論文・著書等

1） Tatsuya Kato, Suganthi Lavender Manohar, Shin Kanamasa, Makoto Ogata, and Enoch Y Park, Improvement of the transcriptional strength of baculovirus very late polyhedrin promoter by repeating its untranslated leader sequences and co-expression with the primary transactivator, J. Biosci. Bopeng., in press (2012). 2） Ogata M, Yano M, Umemura S, Murata T, Park EY, Kobayashi Y, Asai T, Oku N, Nakamura N, Matsuo I, Usui T, Design and synthesis of high-avidity tetravalent glycoclusters as probes for Sambucus sieboldiana agglutinin and characterization of their binding properties. Bioconjugate Chem., 23, 97-105 (2012).

3） Itaru Minagawa, Masafumi Fukuda, Hisako Ishige, Hiroshi Kohriki, Masatoshi Shibata, Enoch Y. Park, Tatsuo Kawarasaki, and Tetsuya Kohsaka, Relaxin-like factor (RLF)/insulin-like peptide 3 (INSL3) is secreted from testicular Leydig cells as a monomeric protein comprising three domains B-C-A with full biological activity in boars, Biochem. J., 441 (1): 265-273 (2012).

4） Vipin Kumar Deo, Yoshitaka Tsuji, Tomomi Yasuda, Tatsuya Kato, Naonori Sakamoto, Hisao Suzuki, and Enoch Y. Park, Expression of RSV-gag virus like particle in insect cell lines and silkworm larvae, J. Viol. Methods, 177, 147-152 (2011). 5） Yoshitaka Tsuji, Vipin Kumar Deo, Tatsuya Kato, and Enoch Y Park, Production of Rous sarcoma virus-like particles displaying human transmembrane protein in silkworm larvae and its application to ligand-receptor binding assay, J. Biotechnol., 155, 185-192 (2011). 6） Tatsuya Kato, Fumiaki Suzuki, and Enoch Y. Park, Purification of functional baculovirus particles from silkworm larval hemolymph and their use as nanoparticles for the detection of human prorenin receptor (PRR) binding, BMC Biotechnology, vol. 11: 60 (2011). 7） Akifumi Mizutani, Hiroyuki Tsunashima, Ken-ichi Nishijima, Takako Sasamoto, Yuki Yamada, Yasuhiro Kojima, Makoto Motono, Jun Kojima, Yujin Inayoshi, Katsuhide Miyake, Enoch Y. Park, and Shinji Iijima, Genetic modification of a chicken expression system for the galactosylation of therapeutic proteins produced in egg white, Transgenic Res., 13 (2011). 8） Wan-fu Yue, Fang Zhou, Jia-biao Hu, Enoch Y. Park, Joe Hull, Yun-gen Miao, Human insulin gene expressing with Bombyx mori multiple nucleopolyhedrovirus (BmNPV) expression system. Would J. Microbiol. Biotechnol., 27:393–399 (2011).

(3) 特許等 1） 碓氷泰市, 朴龍洙, 尾形慎, 宮崎忠昭：ウイルス阻害剤, PCT/JP2011/054384

(4) 国際会議発表 1） Vipin Kumar Deo, Takuya Iida, Tatsuya Kato and Enoch Y. Park, Expression and purification of human wnt3a (h-wnt3a) in silkworms, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 2） Jinhua Dong, Takahiro Otsuki, Tatsuya Kato, and Enoch Y. Park, Murine antibodies against Neospora caninum protein, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 3） Iida Takuya, Vipin Kumar Deo, Enoch Y. Park, Expression and purification of human-Wnt3a by using silkworm larvae, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 4） Tatsuya Kato, Fumiaki Suzuki, Enoch Y. Park, Display of the human (pro)renin receptor on Bombyx mori nucelopolyhedrovirus (BmNPV) particles for application of ligand-binding assay, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012.

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Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

5） Takeshi Yamamoto, Vipin Kumar Deo, Tatsuya Kato, Tetsuro Suzuki, Enoch Y. Park, Expression and purification of intracellular antibody (intrabody) in silkworm to develop inhibitors used for treating hepatitis C virus (HCV) infection, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 6） Yuri Kato, Akiko Murakawa, Enoch Y. Park, Expression of hemagglutinin of avian influenza H5N1(A/Vietnam/1194/2004), 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 7） Jiangxue Li, Akiko Murakawa, Enoch Y. Park, Expression and Purification of Hemagglutinin Using Silkworm Expression System, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 8） Takahiro Oizumi, Akiko Murakawa, Enoch Y. Park, Expression of Shigatoxin B subunit, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 9） Megumi Yui, Vipin Kumar Deo, Hiroshi Ueda, Enoch Y. Park, Preparation of virus-like particles tracking cancer cells using bacmid expression system in silkworm, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 10） Hikaru Kato, Tatsuya Kato, Tetsuya Kohsaka, Enoch Y Park, Expression of relaxin-like factor using silkworm expression system, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 11） Iida Takuya, Vipin Kumar Deo, Enoch Y. Park, Large scale expression of h-Wnt3a by using silkworms and insect cells and purification, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 12） Megumi Yui, Vipin Kumar Deo, Hiroshi Ueda, Enoch Y. Park, Preparation of virus-like particles (VLPs) tracking cancer cells using bacmid expression system in silkworm, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 13） Jinhua Dong, Takahiro Ootsuki, Tatsuya Kato, Enoch Y. Park, Development of a novel diagnostic method for cattle neosporosis, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 14） Muthukutty Palaniyandi, Tatsuya Kato, Enoch Y. Park, Expression and Purification of Human Pappilomavirus 6b L1 virus-like particles (VLP) and display of chimeric EGFP whole protein incorporated in VLP epitopes, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 15） Takeshi Yamamoto, Vipin Kumar Deo, Tetsuro Suzuki and Enoch Y. Park, Expression of hepatitis C virus core protein and intrabody, an inhibitor of core protein in the silkworm, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 16） Takahiro Otsuki, Jinhua Dong, Tatsuya Kato, and Enoch Y Park, Display of Neospora caninum antigens using BmNPV bacmid in silkworm larvae for development of neosporosis vaccines, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 17） Deo Vipin Kumar, Tomomi Yasuda, Tatsuya Kato and Enoch Y Park, Display of Hemagglutinin from H1N1 on virus like particles for vaccinations, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 18） Tatsuya Kato, James R. Thompson, Enoch Y. Park, Development of vectors for high-throughput protein expression in silkworms, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 19） Tomomi Yasuda, Vipin Kumar Deo,Tatsuya Kato, Enoch Y. Park, Expression and purification of hemagglutinin displayed virus-like particles using bacmid expression system in insect cells, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and

79

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

Technology–, 11/28-29, 2011. 20） Kanematsu Ayumi, Akiko Murakawa. Taiichi Usui, Enoch Y. Park, Evaluation of the Synthetic Glycolipid Cluster, 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p27, 2011. 21） Vipin Kumar Deo, Tomomi Yasuda, Tsuji Yoshitaka, Tatsuya Kato, Enoch Y. Park, Virus like particles (VLPs) a new display technology for vaccination and drug delivery, 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p19, 2011. 22） Wonseok Oh, Akiko Murakawa, Jaebeom Lee, Enoch Y. Park, Sugar immobilizated metal nanoparticles, 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p41, 2011. 23） Nakagawa Haruyuki, Won Seok Oh, Taichi Usui, Enoch Y. Park, Evaluation of sLeX immobilized nanoparticles binding behavior against E-selectin, 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p33, 2011. 24） Yui Megumi, Vipin Kumar Deo, Hiroshi Ueda, Enoch Y. Park, Construction of virus-like particles (VLPs) tracking cancer cell, 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p34, 2011. 25） Iida Takuya, Vipin Kumar Deo, Enoch Y. Park, Expression of H-Wnt3a by using silkworms, and purification, , 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p35, 2011. 26） Takahiro Oizumi, Akiko Murakawa, Enoch Y. Park, Development of inhibitor for shigatoxin by multivalant glycan, , 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p38, 2011. 27） Ryoken Nakazawa, Daichi Mori, Taiichi Usui, Enoch Y. Park, Expression of rat alpha2,3-sialyltransferase ST3 in silkworm, 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p39, 2011. 28） In-Wook Hwang, Vipin Kumar Deo, Enoch Y. Park, Expression of KATP channel proteins using silkworm, 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p40, 2011.

(5) 受賞・表彰

最優秀ポスター発表賞

1） Megumi Yui, Vipin Kumar Deo, Hiroshi Ueda, Enoch Y. Park, Preparation of virus-like particles tracking cancer cells using bacmid expression system in silkworm, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 2） Takahiro Oizumi, Akiko Murakawa, Enoch Y. Park, Expression of Shigatoxin B subunit, 2nd Zhejiang Univ.-Shizuoka Univ. Student Workshop "Seedling for Green Science and Technology", 3/14-15, 2012. 3） Muthukutty Palaniyandi, Tatsuya Kato, Enoch Y. Park, Expression and Purification of Human Pappilomavirus 6b L1 virus-like particles (VLP) and display of chimeric EGFP whole protein incorporated in VLP epitopes, Shizuoka University International Symposium 2011–Initiatives for Crossing Boundaries within Science and Technology–, 11/28-29, 2011. 4） Nakagawa Haruyuki, Won Seok Oh, Taichi Usui, Enoch Y. Park, Evaluation of sLeX immobilized nanoparticles binding behavior against E-selectin, 2nd Korea-Japan Joint Symposium and Graduate Students Forum proceeding p33, 2011.

加藤竜也

(1) 学術論文・著書等 1） Deo VK, Tsuji Y, Yasuda T, Kato T, Sakamoto N, Suzuki H, Park EY. “Expression of an RSV-gag virus-like particle in insect cell lines and silkworm larvae.” J. Virol. Methods. 177(2) 147-152 (2011). 2） Tsuji Y, Deo VK, Kato T, Park EY. “Production of Rous sarcoma virus-like particles displaying human transmembrane protein in silkworm larvae and its application to ligand-receptor binding assay.” J Biotechnol. 155(2) 185-192 (2011) 3） Kato T, Suzuki F, Park EY. “Purification of functional baculovirus particles from silkworm larval hemolymph and their use as nanoparticles for the detection of human prorenin receptor (hPRR) binding” BMC Biotechnol 11(1) 60 (2011)

80

Ⅲ 機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究

Vipin Kumar Deo (1) 学術論文・著書等

1） Vipin Kumar Deo, Yoshitaka Tsuji, Tatsuya Kato, and Enoch Y Park (2011) Production of Rous sarcoma virus-like particles displaying human transmembrane protein in silkworm and larvae and its application to ligand-receptor binding assay. J. Biotechnology,155,185-192 2） Vipin Kumar Deo, Yoshitaka Tsuji, Tomomi Yasuda, Tatsuya Kato, Naonori Sakamoto, Hisao Suzuki and Enoch Y Park (2011).Expression of RSV-gag virus like particle in insect cell lines and silkworm larvae. Journal of Virological Methods,177, 147-152

山崎昌一 (1) 学術論文・著書等

1） M. M. Alam, T. Oka, N. Ohta, and M. Yamazaki, “Kinetics of Low pH-Induced Lamellar to Bicontinuous Cubic Phase Transition in Dioleoylphosphatidylserine/Monoolein”, J. Chem. Phys. 134, 145102-1~145102-10, 2011 2） Y. Tamba, H. Terashima, and M. Yamazaki, “A membrane filtering method for the purification of giant unilamellar vesicles”, Chem. Phys. Lipids, 164, 351-358, 2011.

(2) 解説・特集等 1) 山崎昌一、「膜で測る:生体膜の機能やダイナミクスを解明する単一 GUV法」、実験医学、Vol. 29、

No. 7、48-54, 2011 (4) 国際会議発表

1) International Symposium on Synthesizing Life & Biological Systems, Invited Talk Senri Life Science Center (Toyonaka), 25 Oct. 2011 "The Single GUV Method Reveals the Peptide/Protein-Induced Pore Formation in Lipid Membranes" 2) International ERATO Symposium on Lipid Structures in and around Proteins (IESLSP), Invited Talk Hotel Hankyu Expo Park (Suita), 13 Nov. 2011 "The Single GUV Method for Probing Dynamics and Functions of Biomembranes" 3) 1st Annual Symposium of Antimicrobial Research (SAR-2011) , Invited Talk Beijing International Convention Center (Beijing, China), 1 Dec. 2011 "The Single GUV Method for Probing the Antimicrobial Peptide-Induced Pore Formation in Lipid Membranes" 4) 17th International Biophysics Congress (IUPAB)において 4 件ポスター発表 China National Convention Center (CNCC), Beijing, China, Oct. 30− Nov. 3, 2011

徳元俊伸 (1) 学術論文・著書等

1） T. Tokumoto, T. Yamaguchi, S. Ii, M. Tokumoto (2011) In vivo induction of oocyte maturation and ovulation in zebrafish. PLoS ONE 6 (9). 2） T. Ito, N. Yoshizaki, T. Tokumoto, H. Ono, T. Yoshimura, A. Tsukada, N. Kansaku, T. Sasanami (2011) Progesterone is a sperm releasing factor from the sperm storage tubules in birds. Endocrinology 152, 3952-3962. 3） T. Tokumoto, M. Tokumoto, T. Oshima, K. Shimizuguchi, T. Fukuda, E. Sugita, M. Suzuki, Y. Sakae, Y. Akiyama, R. Nakayama, S. R. Roy, Md. S. Rahman, Y. Pang, J. Dong, P. Thomas (2012) Characterization of multiple membrane progestin receptor (mPR) subtypes from the goldfish ovary and their roles in the induction of oocyte maturation. General and Comparative Endocrinology in press. 4） T. Tokumoto (2012) Identification of membrane progestin receptors (mPR) in goldfish oocytes as a key mediator of steroid non-genomic action. Steroids in press.

81

機能性ナノ粒子を用いたワクチン開発の基盤研究 Ⅲ

(4) 国際会議発表

1） Toshinobu Tokumoto 「Identification of membrane progestin receptors (mPR) in goldfish oocytes as a key mediator of steroid non-genomic action」

Rapid Responses to Steroid Hormones 7th International Meeting, 2011, 14-17 Sep, Crete GREECE

(6) 新聞報道等 「魚の排卵過程明らかに ヒトの不妊研究期待」静岡新聞 ２３年９月２２日 尾形慎 (1) 学術論文・著書等

1) Endo, T., Matsuda, S., Obara, T., Chuma, Y., Ogata, M., Yanagida, Y., Hatsuzawa, T., Usui, T. Label-free detection of oligosaccharide-lectin interaction using plasmonic optical device for glycomics application. Sensor. Mater., 2011, 23, 135-146. 2) Ogata, M., Misawa, Y., Usui, T. Molecular design of multivalent glycosides bearing GlcNAc, (GlcNAc)2 and LacNAc: Analysis of cross-linking activities with WGA and ECA lectins. Biosensors – Emerging Materials and Applications, 2011, ISBN 978-953-307-328-6, 17-34. 3) Ogata, M., Yano, M., Umemura, S., Murata, T., Park, E. Y., Kobayashi, Y., Asai, T., Oku, N., Nakamura, N., Matsuo, I., Usui, T. Design and synthesis of high-avidity tetravalent glycoclusters as probes for Sambucus sieboldiana agglutinin and characterization of their binding properties. Bioconjugate Chem., 2012, 23, 97-105. 4) Hattori, T., Sakabe, Y., Ogata, M., Michishita, K., Dohra, H., Kawagishi, H., Totani, K., Nikaido, M., Nakamura, T., Koshino, H., Usui, T. Enzymatic synthesis of α-chitin-like substance via lysozyme-mediated transglycosylation. Carbohydr. Res., 2012, 347, 16-22. 5) Kato, T., Manohar, S. L., Kanamasa, S., Ogata, M., Park, E. Y. Improvement of the transcriptional strength of baculovirus very late polyhedrin promoter by repeating its untranslated leader sequences and coexpression with the primary transactivator. J. Biosci. Bioeng., 2012 in press.

(3) 特許等 碓氷泰市, 朴龍洙, 尾形慎, 宮崎忠昭：ウイルス阻害剤, PCT/JP2011/054384 坂本尚紀 (1) 学術論文・著書等

1) “Expression of an RSV-gag virus-like particle in insect cell lines and silkworm larvae”, Vipin Kumar Deo, Yoshitaka Tsujib, Tomomi Yasuda, Tatsuya Kato, Naonori Sakamoto, Hisao Suzuki, Enoch Y. Park, Journal of Virological Methods 177 (2011) 147-152