Carbon Papa

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3.3 TAXONOMÍA DEL AGENTE CAUSAL DEL CARBÓN DE LA PAPA

Gastón Muñoz V.Rafael Galdames G.Orlando Andrade V.

Al agente causal del carbón de la papa se le considera integrante de un grupo de hongosparticular denominados genéricamente como carbones ("smuts" en inglés). El términocarbones delimita la organización y estrategia de vida de un grupo de hongos y nocorresponde a un concepto taxonómico. A pesar que el concepto fue acuñado enreferencia a parásitos de plantas, muchos de estos hongos causantes de carbones presentanfases saprofíticas.

Figura 3.20 Esquema del ciclo de vida de los carbones (Ustilaginomycetes).

En la figura 3.20 se presenta un esquema del ciclo de vida de un carbón. En estos hongosel cuerpo o soma está compuesto de células haploides y micelio dicariótico. El primero,en algunas especies, puede producir crecimiento levaduriforme, mientras que el miceliodicariótico es usualmente parasítico y casi sin excepción sobre especies angiospermas.El micelio es ramificado, a menudo desarrolla haustorios dentro de las células delhospedero y normalmente no induce síntomas de su presencia en las plantas. Esto últimoocurre después de la formación de las esporas (clamidosporas, teliosporas o ustilosporas),las que representan los órganos de diseminación y resistencia. Las esporas se formanen una cavidad del hospedero denominada soro, constituido por tejido del hospedero,

ANTECEDENTES HISTÓRICOS, DIAGNÓSTICO Y EPIDEMIOLOGÍA

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una masa de esporas y en algunos casos, células de tejido fúngico modificado. Loscarbones producen una amplia variedad de síntomas en sus hospederos, desarrollandosoros de aspecto variable en diferentes órganos: raíces, tallos, hojas, inflorescencias,flores, anteras, ovarios. Las esporas pueden ser simples, en pares o agregadas en gruposvariables (aglomerado de esporas o "spore-balls") y más o menos persistentes pudiendogerminar e infectar a sus hospederos después de 13-15 años, en el caso de algunosustilaginomycetes. La germinación de las esporas diploides produce un promicelio(basidio o ustidio), que luego de divisiones meióticas del núcleo genera esporidiashaploides (basidiosporas) u, ocasionalmente, hifas haploides. Posteriormente, ocurreuna fusión celular (plasmogamia), restaurando el estado dicariótico generándose elmicelio parasítico. La infección de los carbones puede ser localizada, restringida a uncierto órgano o parte del hospedero o generalizado (sistémico). Las plantas infectadasusualmente no son distinguibles de las sanas hasta que se forman las esporas.

3.3.1 Sistema de clasificación de los carbones

Se estima que existirían alrededor de 1200 especies de hongos considerados carbones,distribuidos en alrededor de 50 géneros. El sistema de clasificación de los carbones haido variando con el tiempo tomando en cuenta diversos aspectos o caracteres quepermiten la diferenciación o agrupamiento de los mismos. Inicialmente, se considerabancaracterísticas identificables visualmente tales como: color, tamaño, forma y ornamentaciónde las esporas, esterilidad de las células, estructura de los aglomerados de esporas,estructura del soro y tipo de germinación de las esporas. El esquema de clasificaciónactualmente aceptado fue propuesto por Bauer, Oberwinkler y Vánky en 1997 (Fig.3.21) y se ha desarrollado en base a caracteres ultra estructurales tales como interaccionescelulares con el hospedero, características del poro septal, modalidad de desarrollo delas esporas y forma de las paredes de las mismas. De este modo, se considera que loscarbones han evolucionado en dos clases de la división Basidiomycota: Ustilaginomycetesy Urediniomycetes, siendo la primera la clase donde se presenta el mayor número dehongos causantes de carbones.

En la actualidad y con el objeto de comprender mejor la diversidad de especies, no sólose toma en cuenta la taxonomía, sino también información filogenética, ecológica eincluso paleontológica. En este contexto la filogenia molecular o la reconstrucción dela historia evolutiva de los individuos basados en las diferencias de la secuencia nucleo-tídica de determinados genes, ha contribuido a corroborar los sistemas de clasificaciónpropuestos en bases a caracteres fenotípicos y, a su vez, han propuesto nuevas relacionesen algunas especies.


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Figura 3.21 Esquema del sistema de clasificación taxonómica de hongos que involucra a los car-bones hasta llegar a la familia Glomosporiaceae que agrupa al género Thecaphora. Entre paréntesisse mencionan géneros conocidos de hongos clasificados en esos grupos (adaptado de Bauer,Oberwinkler y Vánky, 1997; y Bauer, Begerow, Oberwinkler, Piepenbring y Berbee, 2001).

Dentro de las secuencias utilizadas para analizar las relaciones filogenéticas entre losUstilaginomycetes se encuentra la región 5' del gen nuclear de la subunidad ribosomalgrande (LSU). Dicha secuencia presenta regiones conservadas entre los hongos. Esto hapermitido diseñar partidores de PCR, tales como los indicados en la Fig. 3.22A, quepermiten amplificar dicha región desde prácticamente cualquier hongo (Fig. 3.22B). Almismo tiempo, la región LSU presenta variaciones que permiten establecer la lejanía oproximidad evolutiva con otros hongos. Una vez amplificado, el fragmento es secuenciadopara obtener el orden de las bases nucleotídicas del mismo (Fig. 3.22C). La secuenciaes entonces utilizada en el análisis filogenético, el que nos describe la historia evolutivaque tienen los organismos analizados. Para esto, inicialmente se establece un alineamientode las secuencias de los individuos incluidos en el estudio, que evidencian zonas dela secuencia donde hay similitudes y diferencias respecto al resto de las analizadas. Enbase a esta comparación se calculan las distancias genéticas entre ellos, lo cual serepresenta finalmente a través de un gráfico o árbol filogenético. En el ejemplo de laFig. 3.22D, la posición de cada individuo está relacionada con el resto en base a unadistancia evolutiva. Así, los individuos I2 e I3 forman un grupo independiente, diferentepero relacionado con I1. Estos tres, a su vez, son diferentes estando menos relacionadoscon I4.


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Figura 3.22 Región genómica y etapas involucradas en el análisis filogenético de hongosUstilaginomycetes. A. Estructura de los genes nucleares que codifican proteínas de las unidadesribosomales, SSU unidad ribosomal pequeña; ITS, región espaciadora interna transcrita; LSU;subunidad ribosomal mayor; IGS, región espaciadora intergénica. NL1 y NL2 son los partidoresque amplifican parte de la región 5' de LSU utilizada en el análisis. B. Separación electroforéticade los productos de la amplificación de PCR utilizando los partidores NL1 y NL2 de cuatroindividuos. La flecha indica la migración del fragmento de la región LSU obtenido. C. Ejemplode la obtención de la secuencia nucleotídica de la banda amplificada y análisis de comparaciónmediante Blast. D. Ejemplo de un dendograma producto del análisis filogenético el cual se realizautilizando los programas ClustalX y MEGA2.1.

Los análisis filogenéticos basados en la región LSU han contribuido a establecer lasrelaciones evolutivas entre los Ustilaginomycetes. El ordenamiento obtenido medianteesta vía ha sustentado, para la gran mayoría de las especies, el actual sistema declasificación propuesto para los Ustilaginomycetes (Fig. 3.21).

En el sistema actual, el género Thecaphora forma parte de la familia Glomosporiaceae,el que se ubica en el orden de los Ustilaginales, subclase Ustilaginomycetidae (Fig. 3.21)posición que comparte con los géneros Glomosporium y Tothiela. La familia Glomos-poriaceae es un buen ejemplo de la dinámica que ocurre en las clasificaciones. Estafamilia agrupa los géneros Thecaphora, Sorosporium y Glomosporium ya que losantecedentes disponibles señalaban que los tres géneros estaban relacionados entre si,sin grandes diferencias morfológicas. En 1997, Sorosporium saponariae fue incorporadoal género Thecaphora, renombrándolo como T. saponariae, mientras que en 1994


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Glomosporium amaranthi fue redefinido como T. amaranthi. En todo caso, se consideraque el género Thecaphora no representa un grupo naturalmente homogéneo, puestoque la forma de germinación es altamente variable entre las especies.

3.3.2 Estudios para establecer la posición taxonómica del agente causal del Carbón de la Papa

Hasta el año 2001, la posición taxonómica del fitopatógeno no era clara. La primeradescripción del agente causal de la enfermedad fue realizada por Barrus y Muller en1943 y al año siguiente, Barrus describió el hongo denominándolo como Thecaphorasolani Barrus. Las características más relevantes descritas estaban relacionadas con lasesporas, las que formaban agregados firmes de 2 a 8 esporas, de aspecto rugoso en susuperficie, color café oscuro y aspecto polvoriento. Estas características son propias delgénero Thecaphora, cuyo representante tipo es la especie T. seminis-convolvuli(Figs. 3.23C y D). Sin embargo, se omitió una descripción de las características del hongoen latín, formalidad fundamental para revindicar la aceptación de una nueva especie,lo que significó a los autores que se invalidara la denominación propuesta. En 1972,O'Brien y Thirumalachar reexaminaron el hongo describiendo diferencias con respectoa otras especies descritas hasta ese entonces para el género Thecaphora, particularmenteel desarrollo del soro locular y la facilidad de separar los agregados de esporas. Basadoen dichas diferencias propusieron un nuevo género Angiosorus solani Thirum & O'Brien,cumpliendo con la descripción formal en latín. No obstante, un carácter importantepara establecer taxonómicamente el género, como es el modo de germinación de lasesporas, no fue descrito en ninguno de los trabajos.

Posteriormente en 1988, Mordue y Vanky analizaron las descripciones sobre el fito-patógeno resaltando el hecho que Angiosorus solani no presentaba característicasdiferenciales con otras Thecaphora. Sin embargo, no existían a esa fecha nuevos estudiosque ayudaran a esclarecer esta situación. El año 2001 se inició en el Centro de InvestigaciónINIA-Carillanca, Temuco, Chile, un trabajo de investigación que permitiera aportarnuevas evidencias con respecto a la posición taxonómica del fitopatógeno.

3.3.3 Análisis morfológicos y estructurales

Los aspectos morfológicos de las teliosporas aisladas de tumores y agallas de la zonanorte y sur tales como color, disposición y tamaño de las teliosporas concordaban conlo descrito previamente siendo similar a lo reportado para otras especies de Thecaphora(Figs. 3.23A, B). Sin embargo, se constató que las teliosporas no podían ser desagregadas.


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De hecho, la adhesión parece ser bastante fuerte ya que una suspensión de teliosporasagitada a alta velocidad en presencia de perlas de vidrio no logra la liberación de lasustilosporas. Tampoco se logra tal separación cuando se ejerce presión sobre teliosporasdispuestas sobre dos portaobjetos. Ambos hechos están de acuerdo con lo descrito porBarrus.

El análisis ultraestructural de la superficie de las teliosporas realizado mediante microscopiade barrido mostró una superficie rugosa y la presencia de una pared divisoria entre lasustilosporas (Fig. 3.23B). Tales características están presentes en T. seminis-convolvuli(Fig. 3.23D) evidenciándose una relación con el género Thecaphora.

Una característica importante para la clasificación de los carbones es el desarrollo delproceso germinativo. Para estudiar esto, las teliosporas fueron sembradas en placas deagar sólo con agua o con medio nutritivo malta-levadura y observadas bajo microscopiopara detectar la aparición de las estructuras germinativas. En la mayoría de las veces,el hongo en estudio desarrolló micelio septado (Fig. 3.24 A y B) similar a lo descritopara T. seminis-convolvuli (Fig. 3.24C).

Figura 3.23 Comparación morfológica y estructural de teliosporas de T. solani (A y B) y T. seminis-convolvuli. (C y D). A y C muestran el aspecto al microscopio óptico de aglomerados de teliosporas,mientras que B y D muestra el aspecto de las superficie de las mismas visto mediante microscopiaelectrónica de barrido. (Figuras C y D reproducidas de: K. Vánky. 1998. Mycol. Res. 102(5):513-526)


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Figura 3.24 Comparación del proceso germinativo observado en teliosporas de T. solani (A y B)y T. seminis-convolvuli (C). (Figura C reproducida de: M. Woronin. 1881. Naturf. Ges. 12:559-587).

3.3.4 Análisis filogenético basados en la región LSU

La posibilidad de obtener cultivos puros del hongo en laboratorio permitió obtenerbiomasa desde donde se extrajo ADN genómico. A partir de este ADN se pudo amplificarla secuencia LSU y realizar un análisis filogenético tal como se describe en la Fig. 3.22.De este modo, utilizando los aislamientos indicados en el Cuadro 3.2 y los partidoresNL1 y NL4 (Fig. 3.22A) fue amplificado un fragmento de la región 5` LSU mediantePCR. Para todos los aislados se amplificó un sólo fragmento de ADN de alrededor de660 pb (pares de bases). Cada fragmento fue clonado y secuenciado, verificándose quetodos ellos tenían la misma secuencia nucleotídica. Esto indica que todos los aislamientosanalizados, colectados de diversos lugares, hospederos e incluso tipo de tejido fúngico(Cuadro 3.2), corresponden al mismo hongo. La secuencia obtenida fue comparada enla base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) usando elalgoritmo Blast, encontrándose que presentaba homología con la misma región ribosomalde otros hongos Ustilaginomycetes. La similitud más alta se obtuvo con las secuenciasde las únicas tres especies de Thecaphora cuya región LSU es conocida (T. amaranthi, T. saponariae y T. seminis-convolvuli). Esto indica una estrecha relación genética condicho género.

Para realizar el análisis filogenético, la secuencia obtenida fue alineada con secuenciasLSU de hongos Ustilaginomycetes y Exobasidiomycetes (indicadas en la Fig. 3.25)utilizando el programa ClustalX. Basado en este alineamiento, el análisis filogenéticose realizó mediante el método de "neighbor-joining" usando el programa MEGA2.1resultando en un dendograma cuya topología se muestra en la Fig. 3.25. Este resultadomuestra claramente que T. solani se agrupa junto a las otras especies de Thecaphorapara las cuales se conoce la secuencia LSU, evidenciando definitivamente una estrecharelación genética con dicho género.


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Por otro lado, es importante mencionar que el análisis filogenético muestra al géneroThecaphora más cercano al orden de los Urocistales y alejado de los Ustilaginales. Estose contrapone a lo establecido en el actual sistema de clasificación basado en caracteresultra estructurales donde Thecaphora, como miembro de la familia Glomosporiaceae,es parte del orden Ustilaginales (Fig. 3.21). Es necesario incorporar más secuencias deotros miembros de la familia para clarificar esta discrepancia entre el análisis taxonómicoy el filogenético. Por lo tanto y por el momento, se valida lo descrito en la Fig. 3.21.

Cuadro 3.2 Aislamientos de Thecaphora solani utilizados para amplificar la región LSU para análisis filogenéticos.

1: chamico; 2: tomatillo.

Figura 3.25 Dendograma del análisis filogenético basado en al región LSU de 26 secuencias deLSU rDNA correspondientes a hongos ustilaginomicetes. En cada nodo se presentan los valoresde bootstrap mayores a 50%, lo cual indica que tal nodo es significativo. La barra indica loscambios esperados por sitio.

Aislamiento

Ts-5Ts-15Ts-16Ts-21Ts-21Ts-22Ts-23

Tipo celular Hospedero Región

IVIV

VIIIIX

IVIV

teliosporasmiceliomicelio

teliosporasmicelio

teliosporasteliosporas

S. tuberosumS. tuberosumS. tuberosumS. tuberosum

Datura stramonium1

Solanum furcatum2


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CONCLUSIONES

Los estudios realizados han contribuido a establecer la real posición taxonómica delagente causal del carbón de la papa. Los datos aportados muestran que el fitopatógenopresenta similitudes morfológicas y ultra estructurales con el género Thecaphora. Estarelación está sólidamente respaldada por los análisis filogenéticos basados en la regiónLSU. Por lo tanto, la descripción inicial de Barrus estaría correcta y el patógeno debieraser llamado T. solani Barrus.

Finalmente, hay que hacer notar que T. solani es la única especie del género Thecaphoracapaz de desarrollarse en la zona radical de su hospedero. Así, esta especie presentacaracterísticas fitopatológicas propias, cuyo mecanismo de acción es aún desconocido.El poder elucidar este mecanismo aportará a una mejor comprensión de la enfermedady por ende a elaborar mejores estrategias de control.

LITERATURA CONSULTADA

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Bauer, R., F. ,Oberwinkler, and K. Vánky. 1997. Ultrastructural markers and systematicsin smut fungi and allied taxa. Can. J. Bot. 75:1273-1314.

Begerow, D., R. Bauer, and F. Oberwinkler. 1997. Phylogenetic studies on nuclearlarge subunit ribosomal DNA sequences of smut fungi and related taxa. Can.J. Bot. 75:2045-2056.

Mordue, J. E. 1988. Thecaphora solani. CMI descriptions of pathogenic fungi and bacteriaNº966. Mycopathologia 103:177-178.

Piepenbring, M. and Bauer, R. 1995. Noteworthy germinations of some Costa RicanUstilaginales. Mycol. Res. 99:853-858.

Vánky, K. 1988. Taxonomical studies on ustilaginales III. Mycotaxon 69: 93-115.Vánky, K. 1998. A survey of the spore-ball-forming smut fungi. Mycol. Res. 102: 513

526.Webster, J. 1980. Introduction to fungi. 669 p. 2th ed. Cambridge University Press,

Cambridge, UK.


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