Embed Size (px)
Citation preview
Casa abierta al tiempo UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA f-
DIVISION DE CIENCIAS BIOL~GICAS Y DE SALUD
Proyecto de Docencia e Investigación
"Determinación de las Isoenzimas de la p-Mananasa durante la germinación y postgerminación de
I. purpurea."
ALUMNO: Daniel Padilla ChacÓn. ASESOR: Dr. DAvid Díaz Pontones.
LABORA: OR10 DE C~WQUÍMICA.
Julio-2001
Determinación de las isoenzimas de la B-mananasa durante la
germinación y postgermianción de Ipomoea purpurea,
Introducción.
En la actualidad existe una gran preocupación por la invasión de malezas a cultivos de
interés comercial cuyos daños pueden incidir de manera directa e indirecta en la
producción y rendimiento de los mismos.
Las malas hierbas conocidas como arvenses se definen como aquellas plantas que
causan daños considerables al desarrollo de cultivos, por lo cual, constituyen uno de los
problemas de mayor importancia en la agricultura en México así como en otros países. El
género Ipomoea, se ha integrado al grupo de las arvenses, siendo una dicotiledónea que
pertenece a la familia Convolvulaceae. Dentro de este género se encuentra una especie
llamada Lpurpurea que infesta principalmente cultivos como el maíz y frijol. La razón por
la que se le considera mala hierba es debido a que posee ventajas adaptativas muy marcadas
que le permiten competir exitosamente con otras plantas; como son la producción de una
gran cantidad de semillas que llegan a la madurez, una alta viabilidad, prolongada
longevidad, una cubierta seminal impermeable al agua, y un rápida germinación (Brechú-
Franco et ai., 1990).
Se ha observado en semillas maduras de varias dicotiledóneas que las paredes del
endosperm0 están constituidas del 10 al
también se ha observado la presencia de este polímero en varias especies de la Familia
Convolvulaceae (Brechú-Franco et al,. 1984). En las semillas de 1. purpurea se encuentra
la acumulación de sustancias de reserva que contienen cantidades apreciables de dos
carbohidratos de reserva como el almidón donde existe una acumulación transitoria a nivel
de la cubierta seminal (Díaz Pontones et ai., 1992); y una hemicelulosa del tipo
galactomanano (GLM) (Preiss and Levi, 1980).
50 % por galactomanano (Reid, 1971). El que
Estudios realizados durante la germinación y postgerminación en I. purpurea se
encontró que la hidrólisis de los carbohidratos de reserva (galactomanano) se lleva a cabo
por tres enzimas: (I-mananasa, a-glactosidasa y (I-manosidasa. Se estableció que en I.
purpurea durante la germinación y postgerminación la actividad de a-galactosidasa y (I-
1 i
mananasa a nivel de endosperm0 se incrementa la actividad conforme el GLM desaparece
(García, 1998). De lo anterior deriva la importancia de determinar la presencia de las
isoenzimas de mananasa con el fin de aportar conocimientos sobre la posible
transformación y utilización de éste carbohidrato de reserva de la semilla.
, 2
An tecedentes. I. purpurea es una enredadera que infesta a los cultivos de interés comercial, en
los que se encuentran al maíz y fijo1 . Se ha estimado que ocasiona un decremento en la
producción del cultivo que invade hasta de un 33% cuando no se controla los primeros días.
(Agundis, 1984).
Lpurpurea posee ventajas adaptativas muy marcadas que le permiten competir
exitosamente con otras plantas; estas ventajas se reflejan en la producción de una gran
cantidad de semillas que llegan ala madurez, una alta viabilidad, prolongada longevidad,
una cubierta impermeable al agua y una rápida germinación (Brechú-Franco et al., 199 1).
Todas esta características se encuentran en relación con los fenómenos que ocurren durante
el desarrollo de la semilla, incluyendo la acumulación de sustancias de reserva (Díaz
Pontones et al., 1992).
Se ha sugerido que el galactomanano es un carbohidrato de reserva y se encuentra en el
paredes del endosperm0 de las semillas de numerosas especies; Leguminosae, Palmae,
Anonaceae, Rubiaceae y Convolvulaceae. (McCleary y Mathenson, 1974).
El GLM ha sido estudiado en varias especies; leguminosas, tomate, lechuga
(McCleary and Matheson 1975; Reid et al, 1977; Halmer and Bewley 1976; Groot et ai
1988; Nonogaki et al 1992) donde se ha observado que son polímeros de azúcares de
manosas con enlaces p-( 1-4) alcanzando hasta el 90% del total de la cadena, presentando
sustituciones de galactosas y glucosa en menor proporción; en el primer caso se denomina
galactomananos y en el segundo glucomananos (Murray, 1988). Las substituciones de
galactosa o glucosa son en el residuo manopiranosil de la manosa con enlaces a-( 1-6).
Dependiendo del porcentaje de substituciones, el galactomanano va a presentar diferentes
propiedades de solubilidad; cuando las substituciones son mínimas el galactomanano
tiende a ser es insoluble en agua. Por esta razón, se forma en una extensa red cristalina en
las paredes celulares. (Dea, et al,. 1975).
Durante las fases de germinación y postgerminación se observa la movilización de éste
polisacárido, producto de la hidrólisis de tres enzimas degradativas: 1) p-mananasa que
hidroliza los enlaces p-( 1 4), a-galactosidasa que hidroliza enlaces a-( 1 +6) y
manosidasa (Reid and Meier 1973; McCleary and Mathenson 1975). La a-galactosidasa y p-
t.: 3
p-mananasa son producidas por la capa de aleurona del endospenno, probablemente por
síntesis de novo, mientras que la P-manosidasa esta presente en un estado activo en el
endospermo (Reid & Mier, 1972; Seiler, 1977; McCleary, 1983). Los monosacáridos
liberados de la hidrólisis son usados como recursos de energía permitiendo el crecimiento
de la plántula (Bewley et al., 1985). Se ha sugerido que estas enzimas inician durante las
etapas de germinación, la hidrólisis del GLM localizado en la porción micropilar de la
semilla degradando el tejido, facilitando así la protusión de la radícula (Groot et al., 1988;
Nonogaki et al., 1996).
Los productos de la hidrólisis del GLM son la D-galactosa y D-manosa donde son
absorbidos rápidamente por el embrión y pueden ser convertidos en sacarosa ylo almidón
transitorio, lo cual permite el establecimiento y crecimiento de la plántula. (Dirk et al.,
1999). Por otro lado se ha propuesto que el embrión juega un papel importante en la
movilización de éste polisacárido; el embrión produce una señal química que interactua con
las sustancias inhibitoria que induce la síntesis de la enzimas degradativas. (Spyropoulos et
al., 1985), este fenómeno se ha asociado al debilitamiento de las paredes del endospenno
seguido de la protusión de la radícula (Groot and Karseen, 1987). Sólo después de la
protusión de la radícula la actividad de la enzima se detecta en el resto del endospermo
(Toorop; 1996)
En lo que se refiere a la degradación de GLM en I.purpurea, se ha establecido que la
movilización de la mayor cantidad de galactomanano es un evento postgerminativo, ya que
a las 24 hrs de imbibición se ha observado que comienza su hidrólisis, este proceso esta
correlacionado con la protusión de la radícula; en donde se ha observado una relación
directa con la actividad de la Qmananasa que presenta un máximo de actividad a las 36
hrs de imbibición, el incremento inicial es proporcional a la de gradación de GLM en el
endospermo (Garcia, 1998). Al igual que en otras semillas, también se observa que la
actividad de p- mananasa incrementa al inicio de la postgenninación (Halmer et al., 1976;
McCleary y Matheson, 1974; McCleary, 1978; D e m o n et al., 1985). Estos patrones de
actividad son consistentes con los observados en T. foenum-graecum por Reid y
colaboradores (1 973 y 1977) donde demuestran que la enzima localizada en el endospermo
incrementa cuatro veces su actividad y alcanza un máximo entre las 42-48 hrs de
imbibición. En semillas de tomate (Lycopersícon esculentum) se observó que la actividad
4 C
de p-mananasa en el embrión aumenta drásticamente hacia las 24-60 hrs de imbibición y
posteriormente disminuye, estos resultados se han observado en el endosperm0 (Toorop et
al., 1996).
Existen algunas fitohormonas tales como las giberelinas (GAS) que estimulan la
germinación, mientras que el ácido abscicico (ABA) inhibe este proceso en tomate (Groot
and Karsen, 1987), lo que implica también que las GAS inducen el aumento en la actividad
de la endo-Bmananasa. Estos estudios has sido observados en mutantes de tomate (gibl)
(Groot et ai, 1988).
Bownie et al., 1994 han desarrollaron un método que facilita el estudio de la actividad
de la endo-P-mananasa, éste método se basa en la difusión de la enzima sobre un gel que
contiene galactomanano, cual es posible cuantificar la actividad de la enzima midiendo el
diámetro sobre el gel donde se presento la actividad. Este ensayo esta basado en la tinción
de galactomanano por el colorante Rojo Congo. Este mismo procedimiento de tinción ha
sido utilizado para detectar isoformas de endo-j3-mananasa en un gel de isoelectroenfoque
(IEF) (Dirk et al,. 1995) el método se realiza por una transferencia de la enzima desde el gel
de íEF hacia el gel de actividad que contiene galactomanano, de esta manera se puede
determinar de una manera efectiva los distintos PI de la enzima p-mananasa. En este
trabajo, se uso el método antes mencionado para determinar las isoenzimas de endo-p-
mananasa durante la germinación y postgerminación, logando así determinar las distintas
isoenzimas de endo-&mananasa en I. purpureu durante las fases de genninación y
postgerminación.
5
Objetivo General:
Determinar durante el proceso de genninación y postgenninación de la
Lpurpurea, las isoenzimas de p-mananasa.
semilla
Objetivos particulares:
Implementar dentro del laboratorio la técnica de isoelectroenfoque (IEF) para detectar
las isoenzimas de p-mananasa.
Determinar las isoenzimas de f3-manananasa en el germinado total entre O y 72 hrs de
imbibición.
6
MATERIALES Y METODOS.
1.-Extracción y cuantificación de proteína.
A. Germinación de las semillas.
Lotes de seis semillas se escarifícaron en la región del micrópilo, se esterilizaron
superficialmente en una solución de hipoclorito de sodio durante 15 min y posteriormente
se lavaron tres veces con agua estéril. En condiciones de esterilidad, las semillas se
colocaron en cajas Petri y se les adicionó 10 ml de agua destilada estéril. Las semillas se
germinaron en oscuridad a 25°C durante periodos de O a 72 horas de imbibición; con
intervalos de 12 horas determinado. Al término de cada periodo de imbibición se tomaron
los pesos peso fresco de cada semilla.
B. Extracción de la enzima.
Una vez terminado el tiempo de germinación de las etapas previamente señaladas,
las semillas fueron homogenizadas en 6 ml de amortiguador McIvaine (citratos O. 1 M y
fosfatos 0.2 M pH 5.1). Posteriormente el homogenado fue centrifugado a 1000 g durante
1 O min (fig 1 c). Una vez terminada la centrifugación se colocó el sobrenadante en un tubo
limpio, ai que se denomino extracto. Posteriormente se almacenó momentáneamente a
4" C donde se usó para determinación de proteína por duplicado mediante el método de
Bradford, la solución stock es con BSA 1 mg/ml (fig1 d).
a) Siembra de las semillas en condiciones esterilidad.
1 b) HomogeniAción en un h amortiguador McIvaine (citratos O. 1 M y fosfatos 0.2 M) pH 5.1
c) Centrifugar a 1 100 g durante 10 min, manteniendo los extractos a
d) Cuantificar proteína por el método de Bradford. Usando
(595" como proteína patrón BSA.
-
Figura 1. diagrama del método de extracción y cuantificación de la proteína.
7
ELECTROFORESIS
A. Electroforesis SDS-PAGE.
La determinación de los pesos moleculares de proteínas del extracto se realizó con
la utilización de un gel de acrilamida desnaturalizante. Se utilizó un gel separador al 10%
de acrilamida, se preparó con las siguientes soluciones madre: acrilamida 30% -bis-
acrilamida 0.8 %, amortiguador TRIS-HCL 1M pH 8.8, TEMED, SDS 10 %, agua
desionizada y persulfato de amonio (APS) con las proporciones (V:V:W:V:W:V:W) al
0.05 %. Se empleo un gel concentrador al 5 Yo de acrilamida donde se preparó con las
soluciones madre antes mencionadas en las siguientes proporciones (V:V:W:V:W:V: W) gel
se montó en la cámara de electroforesis colocando en la parte inferior de la cámara el gel
separador, una vez geleficado se colocó el gel concentrador poniéndole el peine con el fin
de formar los p i t o s donde se coloca la muestra (ver fig 2 ay b).
A cada pocito de la agregó 30 1.11 (aprox 20p.g de proteína) de la mezcla que contiene
exbzrcto:amortiguador de muestra en una proporción 1 : 1. El amortiguador de muestra se
preparó de la siguiente manera: azúl de bromofenol, glicerol, SDS lo%, TRIS-HCL 0.2 M
pH 6.8 en una proporción (W:V:W:W)
Una vez montadas todas las muestras en el gel, se realizó el corrimiento a 200 V con
tiempo medio de 45 min. El amortigador de comda se preparó con gíicina, SDS 1 O%,
TRIS-HCL pH 8.8 y agua desionizada en proporciones (W: W: W:V). Inmediatamente de
que termino el tiempo de corrida se tiñó el gel con el azúl de Coomassie O. 1 % , TCA al
10 YO (Ver fig 2 d).
B. ZIMOGRAMA (Nativo).
El zimograma se realizó en una electroforesis vertical con un gel de acrilamida no
desnatura1izant.E. Se utilizó un gel separador al 7% y un gel concentrador de 5%; se
utilizaron las soluciones madre antes mencionadas. El gel se montó en la cámara de
electroforesis Colocando en la parte inferior de la cámara el gel separador, una vez
geleficado se colocó el gel concentrador poniéndole el peine con el fin de formar los
pozitos donde se coloca la muestra.
8
A cada pocito de la agregó 30 pl (aprox 20pg de proteína) de la mezcla que contiene
muestra extracto:amortiguador de muestra en una proporción 1 : 1 . se utilizó el mismo
amortiguador de muestra que en la sección anterior, eliminando el SDS y sustituyendo su
volumen con agua.
Una vez montadas todas las muestras en el gel, se realizó el corrimiento a 200 V durante
aproximadamente 45 min. El amortigador de corrida utilizado fue idéntico al de la
sección anterior. Al terminó del corrimiento, se equilibró el gel con amortiguador
McIvaine pH 5.1 durante 15 min. Posteriormente el gel se colocó sobre un gel de actividad
(Phytagel- GLM) durante 16 horas y posteriormente se realizó la tinción con el colorante
Rojo Congo (Ver más adelante punto 4,5 y 6 ).
Figura 2. Electroforesis SDS-PAGE y (Nativo).
SDS-PAGE ZIMAGRAMA (NATIVO)
a) Gel separador al 12 % de acrilamida. acrilamida.
a’) Gel separador al 7% de
b’) Gel concentrador al 5% de acrilamida b) Gel concentrador al 5% de acrlamida
e) A cada pocito se le agrega 30p1 de la mezcla que contiene extract0:amortiguador.
d) Se realiza el corrimiento a 200V durante 45 min.
1 e) El gel se tiñe con Coomassie O. 1 YO- TCA 10% contrastando con acético al S?4
e’) Se coloca el gel sobre un gel de actividad (Phytagel-GLM) por 16 horas y se tiñe con rojo congo. (Ver punto 4,5 y 6)
9
3.- ISOELECTROENFOQUE (ZIMOGRAMA).
En la figura 3 muestra esquemáticamente el proceso de isoelectroenfoque (IEF). Para
cada etapa de estudio se utilizaron 3 grupos de tubos. El primer grupo consiste en los tubos
em pleados para determinar el gradiente de pH; cada uno de ellos contiene una mezcla de
acrilamida al 4.5 % y una de la siguientes ampholitas: ampholitas pH 3-10 ampholitas pH
4 4 y ampholitas pH 5-7 (fig 3 a). El segundo grupo o tubos muestra, consistió en tres
tubos que contenían una mezcla de acrilamida al 4.5 % con uno de los tipos de ampholitas
antes mencionadas y 30 p1 de extracto con aproximadamente lOpg de proteína por cada 10
cm de tubo (fig 3c). El tercer grupo consistió en un tubo con acrilamida 4.5% , ampholitas
pH 3-10 y 10 pl de estándares que incluye a: hemoglobina A PI 7.1, mioglobina PI 6.65;
mioglobina PI 6.65; anhidrasa carbónica humana PI 6.3; anhidrasa carbónica bovina PI
5.85; lactoalbúmina PI 5.0; ficocianina PI 4.7; ficocianina 4.6; ficocianina 4.45, (fig 3b).
Una vez gelificados los tubos se colocaron en la cámara y se hizo una corrida de 6
horas con un voltaje de 200V, utilizando una solución de NaOH [ 2OmMl ajuatada a pH 8.8
en la cámara superior, mientras que en la cámara inferior se utilizó una solución
H3P04 [2.5mM] ajustado el pH 3.5
Estudios preliminares muestran que un gel de 10 cm corrido bajo estas condiciones se
obtiene una curva de pH lineal y los colorantes indicadores llegan a su PI y no modifican su
posición dejándolos por mas tiempo. Los colorantes utilizados fueron: azúl de bromofenol
al O. 1 % obteniéndose unas bandas de color amarillo al pH de 6.8 y color rojo al pH de 8.4,
mientras que el otro colorante rojo de fenol al O. 1 5 mostró bandas de color púrpura a pH
4.6 y amarillo a pH 3.0.
Terminado el tiempo de corrimiento los geles se sacaron del tubo y se equilibraron con
McIvaine pH 5.1 (Citratos O. 1 M y fosfátos 0.2 M)durante 15 minutos; posteriormente se
colocaron sobre una canal realizada en un gel de actividad consistente en un gel de
Phytagel al O. 1% conteniendo galactomanano al O. 1 % (ver sección 4).
Los geles utilizados para la obtención del gradiente de pH se sacaron del tubo y se
fraccionaron en pedazos de 0.5 cm, depositándolos en vilaes de vídrio debidamente
rotulados a los que se les agregó 2 ml de agua; dejándolos en refiigeración toda la noche
para posteriormente determinar el pH.
10
El gel de estándares de PI se tiño con una solución de Coomassie y se contrasto con
ácido acético al final se hizo una gráfica utilizando los puntos del gradiente de pH
conjuntamente con los Rf de los estandres de PI
A los geles que Únicamente contienen ampholitas se cortan en fragmentos de 0.5 cm, colocándose en 2 ml de agua desionizada.
Cada tubo contiene: O Ampholitas. O Aailamida 30%
o TEMED APS
bis acril-0.8 TO
3-10 5-7 4 6
1
commiento a 200 V Realizar el
diirante h hrs I 3-10 5-7 4-6
1 Mezcla mas 1 Opg de proteína de la muestra por tubo
.. ...~
/ T 1 18 cm
standares 3-10
Colocar los geles sobre un gel de actividad (Phytagel-GLM) y teñir con Rojo Congo (Ver punto 5)
pH=3.5
11
4.- PREPARACIbN DEL GEL DE ACTIVIDAD (PHYTAGELGLM)
Para la preparacion del gel de actividad se realizó disolviendo GLM al O. 1 % en agua
destilada con agitación constante sobre un baño Maria a 60" C durante 2 hrs.
Posteriormente se aircldió el GLM disuelto en un recipiente de vidrio limpio, e
inmediatamente después se le anadió Phytagel (Sigma) al 0.7 %, después se colocó el
recipiente sobre una parrilla eléctrica a temperatura máxima con el fin de disolver el
Phytagel a ebullición. Una vez disuelto del Phytagel se quitó el recipiente de la parrilla y se
dejo enfriar unos minutos, posteriormente se colocan unas varillas de vidrio del largo del
recipiente de vidrio de tal forma de que las puntas de la varilla atoren en las paredes del
recipiente y no se sumerjan hasta el fondo del recipiente sino que dejen un canal en el gel
(ver fig 4c). Posteriormente el gel con las varrilas en la posición adecuada se metieron a
refiigeración durante 1 hr para que se lleve a cabo el proceso de gelificación, después se
sacó el gel y se equilibró con amortiguador McIvaine a pH 5.1, por último se metió el gel
toda la noche a refrigeración a 4" C.
Fig 4. Preparación del gel de actividad.
a) Para preparar el gel se disuelve GLM O. 1% en agua con agitación 71 constante sobre baño maria a 60°C durante 2 a hrs.
b) Una vez disuelto e GLM se añade a un recipiente de vidrio con Phytagel al 0.7 %. Se calienta a ebullición para disolver el phytagel.
rd
c) Se le colocan unas varillas de vidrio antes de que gelifique para formar un canal en el gel.
pH 5.1 y se guarda toda la
d) Se mete a refrigeración a 4°C durante 2 hr . Equilibrar con McIvaine
noche a la misma temperatura. 1- I
12
5.- COLOCACIÓN DEL GEL (IEF) SOBRE GEL DE ACTIVIDAD
(PHYTAGEL-GLM).
Siguiendo del último paso del punto 4, las varillas se separaron del gel con mucha
precaución para no romper el gel, posteriormente se elimina el exceso de amortiguador
colocando los geles de IEF previamente corridos en la cámara, después se colocó cada gel
en uno de los canales antes formados por las varillas indicando en el extremo del recipiente
de vidrio donde quedo el lado ácido y básico.
Cada recipiente de vidrio corresponde a un periodo de genninación en donde se formaron
tres canales, y cada canal corresponde a un rango de ampholitas pH 4-6,5-7 ,3-10 (ver
figura 5b). Una vez que esten en contacto ambos geles ise mete inmediatamente a
incubación el gel a 25" C durante 16 hrs en oscuridad.
Figura 5 . Coiacación del gel (IEF) sobre gel de actividad (PHYTAGEL-GLM).
a) Quitar las varillas de vidno y eliminar el exceso de amortiguador.
b) Colocar el gel TEF sobre gel 3-10 de actividad Phytagel-GLM 4-
+ 5-7
1 c) Inmediatamente se incuba el gel durante 16 hrs a25" C en oscuridad.
4-6
13
6.- TINCION DEL (PHYTAGELGLM)
Una vez terminado el tiempo de incubación que se indicó en el paso anterior, se
eliminó el gel de IEF y se le añadió amortiguador de fosfátos 0.2M a pH 9, se dejó durante
30 min con agitación suave (ver figura 6a). Una vez terminados los 30 min se decantó el
amortiguador y se le añadió el colonte Rojo Congo al 1% junto con mida de sodio 0.05 % ,
ambos disueltos en amortiguador de fosfátos antes descrito. El colorante ya preparado se
dejó en el gel durante 15 min con agitación suave (ver figura 6b). Posteriormente se
dacantó el colorante y se le añadió NaCl IM para realizar el contraste, se hicieron varios
lavados hasta que el NaCl quedó incoloro (ver figura 6c). Los geles se almacenaron en el
misma solución de NaCl y se les tomó fotografías.
Figura 6. Tinción del gel de actividad.
a) Se agrega amortiguador de fosfatos pH 9, dejándose 30 min con agitación constante.
1 Y
b) Agregar colorante rojo congo al 1 % junto con mida de sodio 0.05%. Mover siisvemcnte diirante 15 min
c) Se elimina el exceso de colorante y se le añade NaCl 1M para realizar el contraste, haciendo varios lavados hasta que el NaCl este incoloro. I I/
14
7.- DETERMINACIÓN DE LOS PI.
Una vez obtenidos los valores de pH a partir de los tubos con los fragmentos de gel
como se indica en el punto 3% se prosigue a obtener una gráfica de pH contra fragmento de
gel. De esta manera cuando se mide la posición del Rf obtenido de la banda en gel de
actividad (Phytagel-GLM) va a corresponder a un valor de PI a partir de la gráfica.
Ejemplo:
Curva de pH Vs Fragmento del gel
15
Resultados.
Zimograma.
La actividad de la enzima p-mananasa se realizó en un gel de acrilamida no
desnaturalizante sobre un gel de actividad que contiene GLM como sustrato, donde no se detectó actividad en etapas tempranas (fase de germinación; O a 18 horas). En la fase
temprana de la postgerminación, es decir 24 y 36 horas de imbibición, se observa la
presencia de tres bandas, presentándose que la banda con mayor masa es la que también
presenta la de mayor actividad a las 24 horas, mientras que las dos mas pequeñas es menor
la actividad de la enzima; a las 36 horas el patrón de actividad cambia poseyendo mayor
actividad las enzimas de menor peso, disminuyendo drásticamente la actividad de mayor
peso con respecto a las 12 horas de imbibición. (ver página 17)
PAGE-SDS.
La determinación de los pesos moleculares se determino mediante un gel de acrilamida
al lo%, donde se observaron varias bandas como se muestra en la págtna 19 la banda a)
tiene un peso molecular de 29,000 Kd mientras que la banda b) posee un peso de 20,100 Kd
La tercera tiene un peso de 14,300 Kd y las bandas c) y d) tienen pesos menores a los
14,000 Kd. a las doce horas se observó la presencia de mínimo cuatro bandas, para las 24
horas se presentan en la misma zona solamente 3 bandas, entre las 36 horas en la zona de
bajo peso molecular permanece las bandas de menor peso molecular ( c y d), disminuyendo
en actividad la banda b y desapareciendo totalmente la banda a. Entre las 48 y 60 horas
permanece la banda d y conforme transcurre el tiempo de imbibición disminuye de
intensidad. (ver página 18)
Standares de IEF.
Los marcadores de IEF de la marca (BIO-RAD) se usaron para observar el gradiente
formado durante el tiempo de corrimiento; donde se observo la presencia de varias bandas
que corresponden a un PI conocido. En la pag 19 claramente se observa la presencia de
varias bandas con PI con valores de 7.7,7.0,6.75,6.55,6.30,6.0,5.65,5.25 donde las
bandas de menor PI no se presentaron ni tampoco las de mayor PI ,posiblemente a que el
gel se equilibró a un pH neutro, y por lo tanto aparecienron las bandas a pH cercanos a la
neutralidad (ver página 19).
16
ZIMOGRAMA (NATIVO)
Zimograma en gel dc aci-ilaniida no destiatiiralizante.
Tiempo de imciibaci6n: 24 Iirs 25°C
Cantidad de proteína: aprox 20 p g
Fig 8. Zimograma. Gel nativo al 7 % de acrilamida; corrido a 200 V durante 45 min. En la
parte superior se indica el tiempo de imbibición de 72 a O hrs.
17
SDS-PAGE
Fig 9. Electroforesis PAGE-SDS. Se muestra el patrón electroforético de las muestras
estudiadas de O a 72 hrs, siendo st los carriles con etándares a = 29.000Daltons,
b= 20.000 D, c= 14.300 D; d= 14.000D.
18
STANDARES DE IEF
Standares de iEF
‘rinción : azúl de Cooinassie
Acriiamida : 4.8 Yo
Soluciones de corrimiento: NaOIi20mM
Ampholitas: pH 3-10 H;t>O, 5inM
7.7 7.0
6.75 6.55 6.30 6.0 5.65 5.25
Fig 10. Gel de estándares de p:. se indican los p1 de las proteínas estándares las cuales son
19
Isoelectroenfoque en disco.
Las ampholitas usadas fueron de 3 a 10,5 a 7 y 4 a 6; obteniéndose diferente resolución
con cada UM de ellas, la siguiente tabla muestra los PI obtenidos en los diferentes periodos
de germinación que van desde 12 hasta 72 horas de imbibición:
nación 12
Tabla 1.
5.2 6.4
24
36
48
60
72
3.5 3.91- 4.40 5.2 5.7-5.8 6.4
3.4 3.89 4.35 4.6 5.6-5.7 6.18
3.47-3.6 3.82- 4.0 4.17-4.26 4.54 5.6 6.0
3.31 3.54- 3.75 3.88- 3.94 4.654.96 5.72
3.5 3.93-3.96 4.23 4.4 5.2 5.6-5.8
Cada punto isoelectrico fue obtenido al interpolar los Rf mínimo, máximo y medio de
cada mancha de actividad, como se muestra más adelante en las fotografias, donde las
isoenzimas de de6.4,6.18 y 6.0 se presentaron entre las 12 y 48 horas de imbibición. Por
otro lado, las isoenzimas de PI de 5.7 se presentaron desde las 24 hasta las 72 horas de
imbibición. La isoenzima de 5.2 fue detectada en todos los timpo de de germinación. Los
PI que de valores de 4.0 se presentaron en etapas que corresponden de 36 hasta 72 horas de
imbibición, en donde el PI de 4.4 sólo se encuentran en las etapas de 36 y 48 horas de
imbibición. Por último, las isoenzimas que tienen un punto isoelectric de valores de 3.5 se
presentaron entre 24 y 72 horas de imbibición. (Ver fotografhs de la página 2 1 a la 27).
20
2/15 ) :\iiipiioiitas pl i : 4-6
I<ango de p l i : 3.82 - 5.67 ( ~ ' . i n t i h c I de proteína: I O pg 111: h ) 5.27. c ) 4.00
Sol ticiiiiics dc corriiiiieiito: Va( )I I 'Oiilhl I I,l'O, iilihl
!) :\iilpllc~iitns $1: 1-7 I<JIlgO de pl I: 3.87- 0.74 C';iiitidad de proteiiin: 1 O pg I > [ : L l J S O
i) \lllpll'>!it~ls pti : 3-10 I<ang" de p l l : 3.97 - 8.89
pl: C ) 5 . . ? 5 C'ciiitidxi de proteína: 1 O big
24 hrs 1
Ampholitas pH: 4-6 Rango de pH: 4.16-6.93 Cantidad de proteína: aprox 10 lig pi: f) 4.5, d) 6.26
Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 4.43-7.88 Cantidad de proteína: aprox 20 big pi: t) 4.58
Ampholitas pH: 3-10 Rango de pH: 3.63 - 8.84 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. pi: e) 3.68
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
4lB Exp 4 ) Ampholitas pH: 4-6
Rango de pH: 3.63-7. I 1 Cantidad de proteina: aprox 20 pg. pi: b) 4.39 c) 5.5
) Ampholitas pf4: 5-7. Rango de pH: 3.55-7.13 Cantidad de proteina: aprox 20 lip. pi: a) 4.17 d) 6.26
) Ampholitas pH: 3-10 Rango de pH: 3.56-8.48 Cantidad de proteína: aprox 20 pig pi:
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
4/B Exp 5 ) Ampholitas pH: 4-6
Rango de pH: 3.52 - 5.84 Cantidad de proteína: aprox 20 pg PI: a) 4.17 b) 4.40 c) 5.29
) Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 3.31-6.28 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. pi: d) 7.3
8) Ampholitas pii: 3-10 Rango de pH: 3.49 - 7.37 Cantidad de proteína: aprox 20 pg PI: f-) 3.5
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
22
36 hrs
36 A/ exp 5 I ) I\illpholitas p l l : -1-6
R i i i i g ~ dc pH: 3.52- 5.84 C‘aiitidad de proteína: riprox 20 pg pl : e ) 3.54 tj -7.88
!) ,\tiipholitns p l l : 5-7. Rango de pH: 3 3 1-6.28 C‘mtidad de proteína: aprox 20 pg pl : g) -3.7 1
3 ) /\nipholitas pH: 3-10 Rango de pfi: 3.40-7.37 C’atitidad de proteína: aprox 20 pg pl: h) 3.15
Soliicioncs de corrimiento: NaOfI 20mM I I:I>O, 5inM
6/B Enp 6 ) i\nlpliolitns pl I : -1-0
r i a t i p de pl I : 3.82-5 67 C’aiitidad de proteína: I O pg. 131: a ) 4.07 b) -1.75
) ~\tllpllolitas pl l : 5-7. I<~itigo dc pt l : 787-6.7-1
PI: C)4.87 C’aiititiad clc proteína: I O pg.
) i\rnpholitas pfi: 3-10 1i:iilgo de pH: 3 97-8.89
pl: d ) - l 35 Cantidrid de proteína: I O pg.
Soliicioiics de corriiiiiciito: NaOt I 2On1M I I;I’O, Siilhl
e48 hrs
I
18/C Exp 5 I ) Ampholitas pH: 4-6
Rango de pH: 3.52-4.68 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. pl: f) 3.55 e) 3.82
1 ) Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 3.3 1-6.28 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. PI: j ) 4.53'
3) Ampholitas pH: 3-10 Rango de pH: 3.1 8 - 6.92 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. PI: o) 3.47
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
En esta fótogd-is se muestran ias actividades de ia
18/D Exp 6 I ) Ampholitas pH: 4-6
Rango de pH: 3.59-7.95 Cantidad de proteína: 1 O pg. pl: i) 3.74 h) 4.17 g)5.68
1 ) Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 3.44-8.75 Cantidad de proteína: 10 pg. PI: k) 4.26
1) Ampholitas pH: 3-10 Rango de pH: 3.33- 9.25 Cantidad de proteína: 1 O pg. PI: I ) 3.61
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
. . . . . . isoenzimas a 48 horas de hbibición
25
48 hrs
J8/A Exp 1 I ) Ampholitas pH: 4-6
Rango de pH: 4.16-6.93 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. pi: a)6.0, b)5.2
2) Ampolitas pH: 5-7. Rango de pH: 4.43-7.88 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. PI: b) 5.2
3) Ampholitas pH: 3-10 Rango de pH: 3.63- 8.84 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. pi: 1)3.60
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
48lB Exp 3 I ) Ampholitas pH: 4-6
Rango de pH: 3.67- 8.85 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. pl: c) 4.89d) 6.87
2) Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 3.68-8.50 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. PI: c) 4.83.
3) Ampholitas pH: 3-10 Rango de pH: 4.35- 9.38 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. PI: n ) 5.1
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM lI,PO, 5mM
I
1
i c
rn esta fotogdas se muestran las actividades de las isoenzimas a 48 horas de unbibición
69 hrs f>OI:i Exp 3 I) :\nipholitas pfI: 4-6
Rango de pH: 3.67-8.85 Cantidad de proteína: aprox 20 p~ PI: a) 3.99 9 4.96 c) 5.2
2 ) Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 3.68-8.50 Cantidad de proteína: aprox 20 p! PI: i ) 4.52 j) 6.68
I ) Arnpholitas pH: 3-10 Rango de pH: 4.35-9.38 Cantidad de proteína: aprox 20 pc pl: m) 6.73
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
101B Exp 5 Ampholitas pH: 4-6 '
Rango de pH: 3.52-4.68 Cantidad de proteína: aprox 20 pp pl: d) 3.54 e)3.88
Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 3.31-6.28 Cantidad de proteína: aprox 2 0 pg PI: h) 3.3 I
Ampholitas pH: 3-1 O Rango de pH: 3.18-6.92 Cantidad de proteína: aprox 20 pk pr: i)3.45
,r - :a
1 4
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
I 60/C Exp 6 1) Ampholitas pH: 4-6
Rango de pH: 3.59-7.95 Cantidad de proteína: I O pg. PI: a) 3.93 b) 4.65 c) 5. I
2) Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 3.44-8.75 Cantidad de proteína: 1 0 pg. pl: g)5 .72
Ampholitas pH: 3- 1 O Ranga de pH: 3.33-9.25 Cantidad de proteína: 10 pg. PI: k)7.17
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM H,PO, 5mM
3)
26
72 hrs
721 B Exp 6 ! IA Exp 5 I Ampholitas pH: 4-6 Rango de pH: 3.52-4.68 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. pl: a) 3.51 b) 3.96
Ampholitas pH: 5-7 Rango de pH: 3.3 1-6.28 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. pl: a) 3.57
Ampholitas pH: 3-10 Rango de pH: 3.18- 6.92 Cantidad de proteína: aprox 20 pg. PI: h)4.41 i)3.69
Soluciones de corrimiento: NaOfi 20mM H,PO, 5mM
Ampholitas pH: 4-6 Rango de pH: 3.82-5.67 Cantidad de proteína: 1 O pg. P I : a) 3.93 c)4.4 d) 5.62
Ampholitas pH: 5-7. Rango de pH: 3.87-6.74 Cantidad de proteína: 1 O pg. PI: e) 5.4
Ampholitas pH: 3-10 Rango de pH: 3.97-8.89 Cantidad de proteína: I O pg. pi: f> 5.2 g) 5.8
Soluciones de corrimiento: NaOH 20mM HIPO, 5mM
En esta foto@& se muestran las actividades de las isoenziaps a 72 horas de imbibición
! i
Discusión. En se millas de leguminosas endospérmicas, la movilización de GLM durante la
postgerminación es un proceso bioquímico ampliamente comprendido. En el proceso están
involucradas tres enzimas hidrolíticas: a-galactosidasa,, p-mananasa y p-manosidasa
(Meier and Reid, 1982). Durante el proceso de degradación de GLM, la acción de la
p-mananasa en 1. purpurea aumenta drásticamente y posteriormente disminuye, la
actividad máxima se encuentra a las 36 horas de iniciada la imbibición, entre las O y 24
horas la actividad es mínima, esta actividad se localiza principalmente en el endospenno
de las semilla (García, 1998). El aumento en la actividad de la enzima esta íntimamente
correlacionado con la disminución del GLM. Estos patrones de actividad son consistentes
con los observados en varias especies, por lo tanto al igual que en otras semillas la
presencia de p-mananasa en el endospermo de I. purpurea juega un papel importante en
los procesos catabólicos, permitiendo al embrión la absorción de los esqueletos
provenientes del GLM. Por otro lado en el embrión de I. purpurea se detectó actividad de
0-mananasa, pero los niveles de actividad fueron significativamente menores a los del
endospermo.
La actividad de la enzima p-mananasa fue detectada en el gel de acrilamida no
desnaturalizante, se encontró que en las primera etapas tempranas (fase de germinación; O a
18 horas) no se observa actividad en el gel (ver página 17), mas aún, en las fase temprana
de la postgerminación, es decir entre las 24 y 36 horas de imbibición, se observa la
presencia de tres bandas, presentándose que la banda con mayor masa es la que también
presenta mayor actividad a las 24 horas, mientras que las dos más pequeñas es de menor
actividad de la enzima; a las 36 horas el patrón de actividad cambia poseyendo mayor
actividad las enzimas de menor peso, disminuyendo drásticamente la actividad de mayor
peso con respecto a las 12 horas de imbibición(ver página 17). La mayor actividad en el gel
se encontró entre las 36 y 48 horas para las dos bandas de peso molecular bajo,
disminuyendo conforme transcurre el tiempo de imbibición.
28
Cuando se realizó una electroforesis de PAGE-SDS, se observó varias bandas con
distinto peso molecular; a las 12 horas se observó la presencia de cuatro bandas:
a)29,000 Kd. b)20, 100 Kd. c)14,300 Kd y dos menores que corresponden a las bandas c)
y d)14,000 Kd. Para las 24 horas de imbibición se presentaron en la misma zona solamente
tres bandas, dos de las cuales dan alta tinción con aníl de Coomassie que corresponde al
los pesos menores de 14,000 Kd, y una banda de poca tinción que es de 20,100 Kd
desapareciendo la banda de 29,000 Kd, peso que si presento a las 12 horas. Entre las 36
horas de imbibición en la zona de bajo peso molecular, permanece las bandas de menor
molecular que son las menores a 14,000 Kd, disminuyendo en intensidad la banda de
20,100 Kd , y desapareciendo totalmente la banda de 29,000 Kd. entre las 48 y 60 horas de
imbibición permanece la banda de peso menor a 14,000 Kd y conforme transcurre el
tiempo de imbibición disminuye de intensidad (ver página 18)
La correlación entre las electroforesis de PAGE-SDS y la no desnaturalizante, podría
circunscribirse probablemente a estas cuatro proteínas, en donde las bandas de menor peso
molecular que son las de menor a 14,000 Kd, sean las que dan la actividad inferior en el
zimograma. Mientras que la banda de actividad superior en el zimograma a las 12 horas de
imbibición, podría ser la bandas de 14,300 Kd o tal vez las de menor a 14,000 Kd. esto no
excluye que la zona de mayor actividad entre 24 y 36 horas la banda de 14,300 Kd se
encuentre dentro de la mayor zona de actividad dela parte inferior del gel. En resumen, esto
demuestra que mínimamente tendríamos cuatro tipos de p-mananasas en el material de
estudio.
El estudio de isoelectroenfoque en placa, resulto de poca resolución y los
experimentos no reproducibles (datos no mostrados); por lo que se decidió utilizar el
isoectroenfoque en disco, proporcionándonos las sigwentes ventajas como pueden ser que
cada muestra puede ser analizada en forma independiente y en condiciones diferenciales a
las demás respecto a la cantidad de proteína, actividad, profundidad del gel de
isoelectroenfoque en el gel de actividad, el rango de pH de la ampholitas utilizadas, entre
otros. Pero también posee algunas desventajas como pueden ser que los resultados entre las
diferentes muestras a determinar sea comparables es necesario que la longitud de cada gel
29
sea de la misma dimensión, de tal forma que sea fácil la comparación; en el caso de no ser
así, es necesario normalizar la posición de cada banda para su posterior comparación.
Para su realización se usaron ampholitas de pH 4-6,5-7 y 3- 1 O; obteniéndose diferente
resolución con cada una de ellas. Los resultados con ampholitas de pH 3 a 10 se encontró
una actividad muy alta superior a pH 6.5, presentándose ésta de tal forma que fue dificil de
determinar los puntos isoelectricos superiores a este pH. A tal circunstancia, las ampholitas
con intervalo de pH 4-6 y 5-7 nos sirvieron para definir las isoenzimas con puntos
isoelectricos inferiores a pH 6.5 ya que la detección de una isoenzima va a depender de
varios factores como la cantidad de proteína, que esta a su vez va relacionado con la
actividad d la enzima, el tiempo de germinaciónlpostgerminación del cual se haya extraído
la enzima, la superfície de contacto que tenga el gel de isoelectroenfoque y gel revelador,
el tiempo en que permanezcan en contacto ambos geles. Por otro lado, en forma paralela, se
obtuvo el gradiente de pH que se formo en el gel, el cual es coincidente con el intervalo
utilizando marcadores de isoelectroenfoque (ver página 19), pero hay que considerar que la
determinación de la actividad de las isoenzimas de las mananasas se hace por huella que
deja la enzima sobre un gel revelador, en donde se tiene que la resolución es menor en
comparación de una isoenzima que se revela su actividad sobre el mismo gel en que se
realizó el isoelcúoenfoque. Los puntos isoelectricos obtenidos se muestran en la tabla 1, se
obtuvieron al interpolar el valor mínimo, máximo y medio de cada mancha de actividad en
la curva de calibración de pH. Posteriormente se empalmaron todos los experimentos, en
donde se observó que dependiendo de los parámetros antes mencionados, algunos
experimentos de una mancha en un gel era igual en otro gel, mostrando la presencia dos o
más manchas de actividad, en donde originalmente se observaba una sola mancha.
En el caso de I. purpurea se encontró en cuanto las isoenzimas (ver tabla 1 página 20)
con los PI de 6.4,6.18, y 6 entre 12 y 48 horas de imbibición, probablemente se deba a
transformaciones postraduccionales (degradación parcial) como ha sido citada en literatura
( Dirk et al., 1995). Existe una isoenzima con PI de aproximamente 5.7 que se presenta
desde las 24 hasta las 72horas de imbibición. Por otro lado, la isoenzimas de PI 5.2 fue
detectada en todos los tiempos, aunque en forma definida con claridad en los que se
expresan en la tabla 1, por lo que podemos suponer que esta isoforma es constante durante
la genninación y postgermianción
30
Con respecto a las isoenzimas con valores alrededor de PI 4.0 encontramos tres
grupos de las que se encuentran comprendidas las que están entre 4.6 a 4.9, y que
corresponden a etapas entre las 36 a las 72 horas de imbibición, las de PI 4.0 que
únicamente se encontraran definidas en 36 y 48 horas de imbibición, las isoenzimas que
fluctuan entre PI 3.9 a 4.2 se presentan entre 24 y 72 horas de imbibición y por último las
isoenzimas con PI de 3.5 se encuentran entre las 24 y 72 horas de imbibición, donde se
presentaron de igual manera entre 24 y 72 horas de imbibición. (ver página 2 1 a la 27).
Contrastando con la literatura encontramos que en endosperno de dicotiledones en
varias semillas coinciden con nuestros PI, donde podemos resaltar los siguientes:
Tomate: PI de 4.0 a 4.2,4.8,5.2,5.7 (Dirk et al., 1995)
Tomate: PI 5.2, 5.5 y 5.8 (Toorop et al., 1996)
Lechuga: PI 4.4,4.6 4.7 y 5.2 (Dirk et al., 1995)
En lo que se refiere a semilla completa la literatura reporta que:
En tomate: PI de 4.1,4.3 y 4.7 (Toorop et al., 1996) Cyamopsis: PI 5.35 y 6.1 y en menor intensidad 4.8,5.8 y 6.2 (Maccleary et al., 1983).
En la región micropilar del endosperm0 en semillas de tomate se encontró lo siguiente en la literatura: PI de 5.8, observándose isofoimas de baja actividad o a veces ausentes con PI debajo de 5.0 (Voigh et al., 1996).
31 .. .
Conclusiones.
1 .- La enzima involucrada en la degradación de GLM como es la p-mananasa se
incrementa codorme aumenta el proceso de germinación alcanzando la mayor actividad a
las 36 horas de imbibición y va disminuyendo paulatinamente a las a las 60 y 72 horas.
2.- Las isoenzimas encontradas entre 12 y 48 horas fueron de 6.4,6.18, y 6.0 donde
probablemente son modificaciones postraduccionales como glucosilaciones o algún cambio
en la composición de aminoácidos.
3.- Existe una isoenzima con un PI aproximadamente de 5.7 que se presenta desde las
24 horas hasta las 72 horas de imbibición. Por otro lado se presenta una con PI de 5.2 que
fue detectada a todos los tiempos, por lo que se puede suponer que es una isoenzima que
juega un papel importante en la genninación y postgerinación de I. purpurea.
4.- Se encontró otro p p o de isoenzimass con PI que van desde 4.4 a 4.9 que
corresponden a etapas de germinación que van desde 36 hasta 72 horas de imbibición.
Definiéndose unas isoenzimas con PI de 4.4 donde únicamente se encontraron entre las 36
y 48 horas.
5.- Las isoenzimas con PI de 3.5 se presentaron entre las 24 y 72 horas de imbibición,
cabe resaltar que las isoenzimas con estos valores no se reportan con mucha frecuencia en
la literatura, donde probablemente sea un tipo de isoenzima característico de I. purpurea.
Perspectivas.
En fuhiras investigaciones es necesario indagar acerca de las señales que controlan
las isoenzimas, así como determinar su papel específico de cada isoenzimas en la
degradación del galactomanano. Quedará por establecer las isoenzimas de a-galactosidasa
y P-manosidasa y determinarlas por estructuras. Además, con el uso de la herramientas
bioquímicas y moleculares se podrá discernir los mecanismos y estrategias que ha
desarrollado esta especie en su proceso de adaptación en los cultivares.
32
Bibliografia.
Agundis O (1984). Logros y Aportaciones de la Investigación Agrícola en el Combate
de la Maleza, INIA. SARH. México.
Bewley JD y M Black (1985). Seed Phisiology of Development and germination.
Plenum press N.Y.
Brechú-Franco AE, A Garcia-Argáez y G laguna-Hemández (1984). Cambios en el
Endosperm0 Durante la Germinación de la Semilla Turbina corymbosa (L.) Raf
(Convolvulaceae). Phyton. 44: 95- 1 OO.
Brechú-Franco AE, A Garcia-Argáez, J Marquez-Guzmán, MC Pérez-Amador y F
García Jiménez (1990). Aislamiento y Caracterización de Semillas Turbinu corymbosa (L.)
Raf y de Ipomoea murticoides Roem & Schult (Convolvulaceae). Phyton. 51: 103-100
Dea ICM y A Morrison (1975). Chemistry and Interaction of seed Glactomannan. Adv
Carbohidr Chem Biochem. 31: 241-312
Demason DA R Won, M Gorman y JSG Reid (1985) Structure and biochemistry of the
endosperm breakdown an date palm (Phoenix dactylfercr L.) Seeds. Protoplasms. 126:
157-1 59
Díaz-Pontones DM, J Marquez, M Domínguez y H Becerril(1992). Desarrollo de la
Semilla ipomoeapurpurea (L.) y su Relación con la Cantidad de Almidón. Phyton. 53:
103- 109
Díaz-Pontones DM, S García-Lara, M Ponce-Salazar y J Márquez-Guzman (1996).
Galactomannan (a 1-6 Galactosil p 1-4 Mannan) Content Changes in Developing
Ipomoeapurpurea Seed. Bol. Est. Méd. Bioi. 44: 37-1 10
33
Dirk LMA. AM Griffen, B Downie y JD Bewley (1995) Múltiple isoenzimes ofendo-
p-mannanase in dry and imbideb seeds. Phytochemistry. 40: 1945-1956.
Dirk LMA, A van der Krol, D Vreugdenhil, HWM Hilhorst, JD Bewley. (1999).
Galactomannan, soluble sugar and starch mobilization following germination of Trigonellu
joenum-gruecum seeds. Plant Physiology Biochemistry. 37 (1), 42-50
Downie B, HWM hilhorst y JD Bewley (1994). A new assay quantifjmg endo p-D-
mannanase activity using congo red dye. Phytochenistry. 4: 829-83
Halmer P, JD Bewley y TA Thorpe (1976). An enzime to degrate lettuce endosperm
cell walls. Appearance of mannanase following phitochrome and giberellin-induced
germination. Planta.130: 189-196
Garcia-Lara S (1998). Galactomanano como una Fuente de Carbono durante el
Desarrollo, Germinación y Postgerminación de la Semilla Ipomoea purpureu (L.) Roth.
Tesis de Maestría UAM-Iztapalapa. México.
Groot SPC, CM Karssen (1987). Gibberellins regulate seed germination in tomato by
endosperm weakening: a study whith gibeerellin-deficient mutants. Planta 171, 525-53 1
Groot SPC, B Kieliszewsha-Rokicka, E Vermeer y CM Karssen (1988). Giberellin
induce hidrólisis of endosperm cell walls in giberellin-deficient tomato seeds prior to
radicule protusion. Planta. 174: 500-504.
McCIeary BV y NK Mathenson (1975). Galactomannan structure p-mananase and
B-Mannosidase activity in germinating legume Seeds. Ptytochemistry 14: 1187-1 194
McCleary BV y NK Mathenson (1 974). a-D-Galactosidase activity and Glactomannan
and Galactosylsucrose oligosacchande depletion in germinating seeds. Phytochemistry.
13: 1747- 1754
34
McCleary BV (1978). Purification of a p-mannanase enzyme from Lucerne by sustrate
affinity chromatography. Phytochemistry. 17: 7 1-80
McCleary BV (1983). Enzimatic interactions in the hidrolysis of galactomannan in
germinating guar: the role of exo-p-mamanase. Phytochemistry. 22: 649-658
Murray D (1988). Seed Phvsiolom. Academic press. N.Y. USA
Nonogaki H, H Matsushima y Y Morohashi ( 1992). Galactomannan hidrolysing
activity in the micropylar endosperm tip of tomate seed prior germination. Physiol Plant.
94: 105-109
Nonogaki H, Y morohashi (1996). An Endo- p-Mananase Develops Exclusively in the
Micropylar Endosperm of Tomato Sedes Prior to Radicle Emergence. Plant Physiology,
110: 555-559.
Preiss J y C Levi (1980). Starch Biosynthesis and Degradation. En: The Biochemistry
of Plants. Vol 3 Preiss Academic Press. N.Y
Reid JSG y H Meier (1972). The Fuction of the Aleurone Layer During Glactomannan
Mobilisation in germinating sedds of Fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) and
Lucerna (Medicago savitu L.): A Correlative Biochemical and Ultraestucima1 Study.
Planta. 106: 44-60
Reid JSG y H Meier (1 973). Enymatic activities and galactomannan movilisation in
germinatig seeds of funegreek (trigonella foenum-graecum L.) secretion the a-
galactosidase and P-mannosidase by aleurone layer. Planta. 112: 30 1-308.
35
Reid JSG, C Davies y H Meier (1977). Endo j3-mannanase, the Leguminous Aleurone
Layer and the Storage Galactomannan in Germinating Seeds of Trigonella fonum-graecum
L. Planta 133: 219-222
Seiler A ( 1977). Galacktomannanabbau in Keimenden Johannisbrodsamen (Ceratonia
siliqua L.) Planta. 134: 209-22 1
Spyropouious CG y JSG Reid (1 985). Regulation of the a-galactosidase activity and the
hydrolysis of galactomman in the endosperm of hegreek (trigoneZla foenm-graecunz
L.) Seed Planta. 166: 271-275
Toorop PE, JD Bewley y HWM Hilhorst (1996). Endo+mannanase isoforms are
present in the endosperm and embryo of tomato seeds, but are not essentially linked to the
completion of germination. Planta. 200: 153-158
Voigh B, Bewlew JD. ( 1996). Developing tomato seeds when removed from the
produce multiple forms of germinative and post-germinative ando-j3-mannanase. Responses
to desiccation, abcisic acid and osmoticum. Planta 200,71-77
36
