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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃOMESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE.
Caracterização de Candida spp. isoladas da corrente sanguínea de pacientes internados em hospital terciário do Oeste Paulista.
Kelly Cristina Barzan Yabunaka
Presidente Prudente – SP2018
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Presidente Prudente – SP2018
Projeto apresentado à Coordenadoria de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação (CPDI), da Universidade do Oeste Paulista.
Orientador: Profa. Dra. Daniela V. Moris de Oliveira
Co-Orientador: Marcus Vinicius Pimenta Rodrigues
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃOMESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE.
Caracterização de Candida spp. isoladas da corrente sanguínea de pacientes internados em hospital terciário do Oeste Paulista.
Kelly Cristina Barzan Yabunaka
Resumo
Atualmente a infecção por Candida está associada a um dos
principais quadros de infecção hospitalar. As taxas de incidência de candidemia
podem ser altas, e no Brasil chega a 3,9 casos por 1000 admissões hospitalares.
Já as taxas de mortalidades para aqueles que a desenvolvem são altas em torno
de 50-72%, se tornando nos últimos anos grande problema de saúde em
hospitais terciários. Este projeto tem por objetivo avaliar a incidência das
infecções de corrente s sanguínea por Candida spp isoladas de pacientes
internados na Associação Lar São Francisco de Assis da Providencia de Deus,
Hospital Regional de Presidente Prudente – São Paulo no período de dois anos;
identificar por técnicas morfológicas e bioquímicas as amostras de Candida spp.
isoladas; pesquisar a ocorrência do Complexo Candida parapsilosis - dentre os
isolados de hemocultura analisados; determinar o perfil de sensibilidade aos
antifúngicos das amostras isoladas. Este será um estudo prospectivo de
vigilância laboratorial e clínica com amostras de Candida spp. previamente
isoladas de hospital Regional de Presidente Prudente-São Paulo. O perfil de
sensibilidade antifúngica será realizado de acordo com a metodologia AFST-
EUCAST. A análise molecular do Complexo Candida parapsilosis será realizada
por PCR-RFL, amplificando-se o fragmento SADH -S1F: 5’
GTTGATGCTGTTGGATTGT-3’; S1R: 5’- CAATGCCAAATCTCCCAA-3’. Os
produtos do PCR serão digeridos com enzima de restrição BanI em tampão
específico da enzima por 90 minutos. A incidência de candidemia será calculada
por 1.000 admissões hospitalares, considerando-se um intervalo de confiança de
95%, assumindo-se a distribuição de Poisson dos casos. As variáveis
categóricas serão apresentadas como porcentagens e avaliadas pelo teste do χ2
ou, como alternativa, pela prova exata de Fisher; as variáveis contínuas serão
apresentadas como medianas e intervalos interquartis e avaliados pelo teste de
Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis. Todos os testes serão realizados utilizando-
se o programa SPSS 19.0 (IBM SPSS Statistics, IBM Corporation, Chicago, IL,
USA), admitindo-se p<0,005 para rejeitar a hipótese de nulidade.
Palavras-chave: Candidemia. Candida spp. Perfil de sensibilidade antifúngica.
Análise molecular.
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1. Introdução
I.1 Candidemia As infecções fúngicas de corrente sanguínea (ICS) incluem as
candidemias, denominadas também candidíases hematogênicas, desde que
seus principais agentes são espécies do gênero Candida. Espécies desse
gênero estão associadas a um dos principais quadros de infecção hospitalar,
tendo sido o quarto agente de ICS nos Estados Unidos(1).
As taxas de incidência, de modo geral, aumentaram no final da década de
80 e início dos anos 90; porém, trabalhos mais recentes indicam incidência
estável ou até decrescente em alguns estudos norte-americanos (2)
Trabalhos realizados em distintas regiões da América Latina mostram que a
Candida albicans é a espécie que predomina (3–5), com incidência geral de 1,18
casos por 1000 admissões hospitalares. Este valor varia de acordo com o país
como Chile com 0,33, Equador e Honduras com 0,90, Brasil com 1,38,
Venezuela com 1,72 (13), Argentina com 1,95 e Colombia com 1,96.
No Brasil, estudos recentes mostram que as taxas de incidência de
candidemia variam de 0,83 a 3,9 casos por 1000 admissões (6–9). Essas taxas
são maiores que aquelas observadas na maioria dos estudos realizados no
Hemisfério Norte incluindo EUA (0,28 a 0,96) (1,10), Canadá (0,02 a 0,45)
(11,12) e na Europa (0,20 a 0,96) (13,14). E estudo realizado na Espanha
encontrou 1,09 casos por 1.000 admissões (15). Enquanto uma análise
realizada em hospitais terciários da Espanha e Itália revelou taxa de 1,55
(16,17). Ambos apresentam taxas elevadas de incidência similares às
encontradas no Brasil e outros países da América Latina, como Argentina,
Venezuela e Colômbia (18).
Acredita-se que as candidemias estão entre as principais infecções
nosocomiais, devido ao aumento no número de hospitalizações, cirurgias de alto
risco, depressão imunitária secundária à doença de base ou distúrbios
metabólicos do hospedeiro, fatores iatrogênicos relacionados aos procedimentos
médicos invasivos, quimioterapia, uso profilático de antifúngicos e abuso na
utilização de antibióticos de amplo espectro (18–21). Apesar dos avanços
observados nos tratamentos antifúngicos, a mortalidade por candidemia tem-se
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mantido elevada, da ordem de 50 a 72%, e admitindo-se que ICS causadas por
Candida spp. têm se tornado o maior problema em hospitais terciários em todo o
mundo (21–24). Durante a década de 1980, a infecção por Candida spp.
apresentava-se como a sétima causa mais frequente de infecções nosocomiais
nos Estados Unidos (EUA) (25). No período 1986 - 1990, este gênero
encontrava-se entre os cinco primeiros agentes isolados em hemoculturas de
pacientes internados (26). Já na década de 1990, de acordo com os dados
obtidos por (26) através do programa SCOPE (Surveillance and Control of
Pathogens of Epidemiological), realizado em 50 centros médicos dos EUA,
Candida spp. passou a ocupar a quarta posição na categoria de infecções
nosocomiais mais frequentes, responsável por 8% (379) dos 4.725 episódios de
ICS obtidos nessas instituições. Nesta casuística, C. parapsilosis foi encontrada
em 8% (30) dos pacientes com candidemia, posicionando-se entre as espécies
de Candida mais freqüentes.
Em estudo conduzido por Wisplinghoff et al. (2004) (10), reunindo dados de
40 hospitais terciários de várias regiões dos EUA, foram analisados 24.179
episódios de bacteremias e fungemias documentados entre março de 1995 e
setembro de 2002. Candida respondeu por 9% (1890) das ICS, posicionando-se
após os casos de bacteremia por Staphylococcus coagulase-negativo (31%),
Staphylococcus aureus (20%) e Enterococcus spp. (9%). Entre as espécies de
Candida mais comuns, C. parapsilosis foi a terceira mais prevalente, detectada
em 11% (208) dos casos de candidemia. Nos EUA, alguns estudos encontraram
grande variação na prevalência de C. parapsilosis como agente causador de
ICS, com taxas variando entre 7 e 21% (23,27–29)
O aumento progressivo na frequência de ICS por leveduras do gênero Candida
foi observado em muitos países que monitoram esse evento. O fato ocorre,
particularmente, entre pacientes que estão recebendo antibióticos, terapia
imunossupressora e nutrição parenteral, bem como, naqueles expostos a
procedimentos médicos invasivos como o uso de cateter venoso central e
cirurgias (19,30,31).
Dados do Sistema Nacional de Controle de Infecções Nocosomiais do
Centers for Disease Control and Prevention (CDC) dos Estados Unidos
mostraram que, durante a década de 90, os fungos foram agentes de 7,9% das
infecções nosocomiais, em hospitais de grande e pequeno porte, e a incidência
3
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desses quadros aumentou para 9% de 1990 a 1996, emergindo como o quinto
patógeno hospitalar.
Entre os microrganismos que causam ICS, os fungos ocuparam o quarto
lugar, à frente de outros microorganismos tão comuns como, Escherichia coli. As
espécies do gênero Candida causaram 78% das infecções fúngicas em
pacientes imunocomprometidos, ou gravemente enfermos, com taxa de
mortalidade superior a 55%; a incidência de candidemia aumentou
aproximadamente 500% em hospitais de alta complexidade (27,28), estimado-se
que 6-11% de todas as infecções invasivas nosocomiais podem ser atribuídas a
Candida spp. Países desenvolvidos dispõem de vários dados publicados
confirmando a magnitude do problema de espécies de Candida como agente de
ICS, além de maior quantidade de informação sobre a ocorrência de candidemia,
os dados trazem detalhes sobre a distribuição de espécies e suscetibilidade a
antifúngicos, diferentemente da América Latina, cujos dados ainda são
insuficientes para descrever a epidemiologia dessa grave infecção (6,18,21,32).
Estudo retrospectivo de Wille et al. (2013) (6) realizado na região sudeste do
Brasil, durante um período de 11 anos em um hospital terciário, a incidência foi
de 1,20 episódios de candidemia por 1000 admissões hospitalares, identificados
na UTI de adultos com 21,9% dos casos e na UTI pediátrica com 17% de casos,
que totalizaram 388. Hinrichsen et al. (2008) (5) em um dos poucos estudos
realizados na Região Nordeste, indicou maior taxa de incidência (3,9
episódios/1000 admissões) em hospital terciário de Recife (PE).
De acordo com os últimos informes do Sistema de Vigilância
Epidemiológica do Estado de São Paulo, sobre os microrganismos isolados em
hemoculturas em Unidades de Terapia Intensiva (UTI), Candida spp. foi de
terceiro a quinto agente isolado, com freqüência próxima a 5%, no período de
2004 a 2008 (33) (Centro de Vigilância Epidemiológica, 2010). Já em 2014 a
Candida spp. apresentou frequência de 8%, sendo o terceiro agente mais
isolado da UTI estando atrás apenas das bactérias gram-negativas, em primeira
colocação e bactérias gram-positivas, em segundo lugar. Estes achados
demonstram o importante aumento dos casos de candidemia nesta população
de risco (34).
1. 2 Agentes de candidemia
4
4
C. albicans, no presente considerada como o complexo Candida albicans,
constituído por C. dubliniensis, C. africana e C. stellatoidea, é a espécie mais
prevalente dentre as candidemias. No entanto, diversos estudos mostram
alteração na distribuição das espécies, com aumento de leveduras não-C.
albicans (6,9,35–37). Entre elas as mais comuns são: C. tropicalis, C. glabrata,
C.parapsilosis e C. krusei (5,18,32,35).
Em estudo multicêntrico realizado na França e denominado AmarCand
(Analyse Du Management en Anesthésie et Réanimation dês Candidoses
Invasives), do qual participaram 101 unidades de cuidados intensivos
(outubro/2005 a maio/2006), foram avaliados episódios de candidemia ocorridos
em 271 pacientes. Desse grupo, 305 amostras foram identificadas, resultando
em 57% de C. albicans, 16,7% de C. glabrata, 7,5% de C. parapsilosis, 5,2% de
C. krusei, 4,9% de C. tropicalis e 3,6% C. kefyr. Um aspecto diferente nesse
estudo, em relação a outros semelhantes, está na incidência de C. tropicalis, que
em regra é maior, com taxas em torno de 10% (38).
Na América Latina foi observada uma prevalência em torno de 40,9% para
C. albicans, seguido por 20,9% de C. parapsilosis, 20,5% de C. tropicalis e 4,9%
de C. glabrata (39). No entanto estudo mais recente realizado em 21 hospitais
terciários de sete países da América Latina, 37,6% de C. albicans, seguidos por
26,5% de C. parapsilosis, 17,6% de C. tropicalis, 6,5% C. guilliermondii, 6,3% de
C. glabrata e 2,7% de C. krusei (18).
A Brazilian Network Candidemia Study também identificou o aumento da
taxa de candidemia por C. glabrata, ao longo dos anos. No período de 1995 a
2003 ocorreram oito (3,5%) de 228 casos de candidemia. Já no período de 2005
a 2007 ocorreram 28 (10,6%) de 263 casos de candidemia, cenário que pode
estar relacionado ao maior uso profilático de fluconazol entre o pacientes
internados (39).
Moretti et al. (2013) (20) em estudo epidemiológico de episódios de
candidemia realizado em um hospital universitário de referência na região
sudeste do Brasil, durante o período de 2006 a 2010, verificou 313 episódios,
138 (44%) das quais foram identificados como C. albicans, 68 (21,7%) C.
tropicalis, 45 (14,4%) C. parapsilosis, 35 (11,2%) C. glabrata e 11 (3,5%) C.
krusei. Este trabalho revelou associação de C. glabrata a pacientes com
neoplasia, e entre 2008 e 2009 sua incidência foi maior, também relacionada à
5
5
doenças malignas, entre os pacientes internados no serviço de gastrenterologia.
A espécie de C. krusei foi mais isolada de pacientes com doenças
hematológicas. Dentre a população pediátrica verificaram-se 25 episódios de
candidemia, 40% das quais causadas C. albicans, seguida por C. parapsilosis e
C. tropicalis, ambas com sete episódios e um isolado de C. glabrata.
A importância do conhecimento da prevalência relativa das distintas
espécies de Candida e a ocorrência de outros gêneros de leveduras, além de
Candida spp., está nos diferentes perfis de sensibilidade a antifúngicos e nas
características epidemiológicas das infecções causadas pelos distintos agentes
(6,22,35). O fato de o gênero Candida fazer parte da microbiota humana, este
está relacionado às infecções humanas como um patógeno oportunista: C.
tropicalis, por exemplo, está relacionada a infecções endógenas pós-cirúrgicas
pois habita o trato intestinal, a pacientes neutropênicos e imunossuprimidos (40).
Enquanto a C. parapsilosis, é comensal da pele humana e menos de superfícies
mucosas, está associada à ICS por manipulação do paciente, sendo bem
conhecida por causar infecções em crianças e neonatos (9,29) (41) e está,
quase sempre relacionada à presença de catéteres e sua grande habilidade em
formar biofilmes, o favorece sua patogênese. C parapsilosis que era antes
considerada espécie única é, desde os anos 90, considerada um complexo
englobando três espécies: C. parapsilosis (strictu sensu), C. metapsilosis e C.
orthopsilosis (42,43). A espécie C. glabrata, por sua vez, também está hoje
muita relacionada a outras duas espécies fenotipicamente semelhantes (C.
bracarensis e C. nivariensis), separadas, apenas, por análise molecular do DNA
e assimilação da trealose. A C. nivariensis é considerada um microrganismo
multirresistente a antifúngicos, enquanto que C. bracarensis tem patogenia e
resistência a antifúngicos pouco conhecidos (44,45). A ocorrência de C. glabrata
foi associada ao uso prévio de fluconazol e sua freqüência é maior em
população acima de 60 anos(6,9,24).
A importância da tipagem molecular destas novas espécies permite
melhor definição da prevalência, distribuição e susceptibilidade antifúngica dos
agentes de infecções invasivas. A causa possível para a alteração da proporção
entre as espécies poderia estar associada ao uso profilático ou empírico amplo
de fluconazol, (46–48). No entanto, esse argumento para explicar o aumento
considerável de infecções por espécies antes menos frequentes, não é
6
6
compartilhado por todos os especialistas, os quais consideram que a utilização
ampla de fluconazol não foi proporcional ao aumento das espécies resistentes à
droga (49–51). Para estes e outros estudiosos, o aumento de espécies de
Candida não-albicans é resultante do uso crescente de procedimentos
hospitalares invasivos com artefatos que, a partir de fontes abióticas ou mãos de
profissionais, veiculam esses agentes para a corrente sanguínea de pacientes
internados (22).
1.3 Resistência de agentes de candidemia a antifúngicos e métodos para sua determinação
A resistência aos antifúngicos pode ser classificada em resistência
microbiológica e resistência clínica. A resistência microbiológica subdivide-se em
três tipos: intrínseca ou inata, primária e secundária ou adquirida. Diz-se que é
intrínseca é dita quando nenhum membro de uma espécie é sensível ao
antifúngico. A resistência primária se caracteriza pela transformação de uma
espécie normalmente sensível a resistente a determinado antifúngico, encontra-
se uma cepa com resistência natural contra o mesmo, sem necessidade de
haver estado em contato com a droga. Denomina-se resistência secundária, ou
adquirida, quando uma cepa, previamente sensível desenvolve resistência à
droga após a exposição a ela que pode ser devido a alterações fenotípicas, ou
genotípicas, que se manifestam de forma estável ou transitória (52,53).
A resistência clínica é definida como crescimento, ou falta de inibição, de
um microorganismo no foco de infecção, embora estando o fármaco em
concentração terapêutica no local da infecção. A resistência clínica está
relacionada com fatores dependentes do fármaco, do paciente ou de ambos
como redução da biodisponibilidade do fármaco, aumento do seu metabolismo,
doenças de base ou redução da imunidade (53,54)
A determinação de resistência em laboratório é feita por testes de
sensibilidade a antifúngicos que visam à correlação entre atividade in vitro e
evolução clínica do caso tratado com a droga. Além disso, os testes visam a
comparação da eficácia relativa de duas ou mais drogas e, ainda, dar
parâmetros para monitorar o aparecimento de cepas resistentes (55–57).
Estudos realizados com metodologia de referência e publicados em todo
o mundo demonstram que C. albicans tem alta sensibilidade não somente a
7
7
fluconazol, mas também a outros azólicos, anfotericina B e equinocandinas
(48,57,58). Os raros casos de resistência estão associados ao uso prévio de
fluconazol em pacientes com doenças hematológicas (58). A resistência a
fluconazol em isolados de Candida spp. é encontrada, quase que
exclusivamente em espécies de Candida não-albicans (29,48) e de modo
particular, Candida krusei que possui resistência intrínseca ao fluconazol.
2. Objetivos
Geral: Avaliar a incidência das infecções de corrente sanguínea por Candida
spp isoladas de pacientes do Hospital Regional de Presidente Prudente – São
Paulo, no período de dois anos.
Específicos: a) Identificar as espécies de Candida spp. isoladas de corrente sanguínea,
por técnicas morfológicas e bioquímicas;
b) Determinar a prevalência de espécies do complexo Candida parapsilosis
isoladas de infecções de corrente sanguínea;
c) Determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos das amostras
isoladas de infecções de corrente sanguínea.
3. Justificativa do estudo
Até o momento existem poucas informações epidemiológicas na Região
Centro-Oeste do Estado de São Paulo, em relação às candidemias.
A maioria das pesquisas realizadas no Brasil e em outros países da
América do Sul (3,4,39,40,59) confirmam que C. albicans supera o conjunto de
outras espécies, ainda que em taxas distintas. Em estudos realizados em
hospitais terciários brasileiros, incluindo o de Chang et al (2008) (60) em Campo
Grande (MS), abrangendo 96 casos e o de da Matta et al. (2007) (61) em São
Paulo, com 1000 amostras de ICS, C. albicans foi agente, respectivamente de
45,8% e 40% dos casos. Também em São Paulo, Colombo et al. (2006) (7)
publicaram trabalho com 712 isolados de Candida, sendo 40,9% amostras de C.
albicans. Na cidade de Botucatu, Estado de São Paulo, Ruiz et al. (2005) (3),
estudando 75 amostras de leveduras causadoras de ICS, confirmaram C.
albicans (38,7%) como a espécie dominante. Em estudo de 200 casos de
8
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candidemia, realizado no Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP), São Paulo, foi observado frequência de 49% de C.
albicans (62). No estudo realizado por Matta et al. (2007) (61), em que foram
avaliadas amostras de período de nove anos, as taxas de C. parapsilosis
subiram de 19% (1995) para 25% (2003) e ressaltam a importância de monitorar
as taxas de freqüência dessa espécie. Pereira et al., (2010) (63) observaram que
C. albicans (18%) não foi a espécie prevalente como agente de candidemia em
hospital público terciário, situando-se depois de C. parapsilosis (26%) e C.
tropicalis (26%). Ainda mais relevante foi a ausência de isolados de C. albicans
no último ano do estudo, realizado entre 2004 e 2008. Em outro estudo
brasileiro, realizado também em hospital público terciário, mas no estado de
Ceará, Medrano et al. (2006) (4) observaram que C. parapsilosis foi o agente
mais isolado (64%) dos casos de candidemia. A posição de destaque de C.
parapsilosis, (34,4%), logo após C. albicans (45,8%) dentre os agentes de
candidemia, foi ressaltada também por Chang et al. (2008), (60) em hospital
público terciário no estado de Mato Grosso do Sul, com 96 casos (55,2% adultos
e 44,8% crianças), ocorridos entre 1998 e 2006. Chama a atenção o estudo
realizado por Bruder-Nascimento et al., em 2010 (64) que confirma também a
importância de C. parapsilosis, como a espécie não-C. albicans mais prevalente
(76,5%) em 102 casos de candidemia na cidade de Botucatu, interior de São
Paulo. Todos estes estudos fornecem informações valiosas sobre a etiologia das
candidemias, uma vez que, dados oficiais são inexistentes.
As diferenças acentuadas na distribuição de espécies e susceptibilidade
às drogas antifúngicas entre isolados de diferentes países, ressaltam a
necessidade de vigilância contínua em cada país e em cada região brasileira
para acompanhar as tendências da distribuição de patógenos e sua
suscetibilidade a drogas. O monitoramento também é importante pelo alerta de
emergência de cepas resistentes a antifúngicos (9,18,21,58).
4. Casuística e Métodos
4.1 População de estudo
Será realizado um estudo de vigilância laboratorial e clínica com amostras
de Candida spp. isoladas do primeiro episódio de infecção da corrente
9
9
sanguínea - ICS em pacientes do Hospital Regional de Pres. Pte, localizado na
Região Centro-Oeste do Estado de São Paulo, Brasil, durante período de 2018 a
2019.
As amostras serão isoladas e identificadas pelo laboratório de análise
clínica São José IRELI do Hospital Regional, e posteriormente serão
encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia e Imunologia do bloco G, da
Universidade do Oeste Paulista- UNOESTE, onde serão armazenadas até o
momento do estudo.
4.2 Definição de caso: Será considerado caso de candidemia o paciente com pelo menos um
isolado de Candida spp. do sangue periférico e sinais e sintomas de infecção,
temporariamente relacionados (30). Pacientes com cultura positiva de ponta de
cateter, porém com hemocultura negativa, serão excluídos do estudo. Os
episódios serão considerados independentes se forem causados por diferentes
espécies de Candida ou ocorrerem com pelo menos 30 dias de intervalo, após
resolução das manifestações clínicas e pelo menos uma cultura negativa.
4.3 Coleta de dados. Características demográficas e fatores que possam predispor a candidemia
serão coletados dos prontuários médicos. Entre estes últimos serão avaliados:
idade, presença de comorbidades, uso de quimioterápicos, diálise ou
hemodiálise, cirurgia gastrintestinal e presença de cateteres intravasculares,
terapia profilática com fluconazol e uso de antibacterianos.
4.4 Confirmação da identificação das Amostras. A recuperação das culturas será realizada pela inoculação das leveduras
no meio cromogênico CHROMagar Candida (CHROMagar Microbiology,
França). As placas serão incubadas à temperatura de 35º C e as leituras serão
realizadas após 24 e 48h de incubação. A identificação das amostras será
confirmada por métodos micológicos (morfológicos e bioquímicos)
convencionais.
10
10
4. 5 Teste de sensibilidade a antifúngicos.
As amostras serão submetidas a testes de sensibilidade ao fluconazol,
itraconazol, voriconazol, caspofungina e anfotericina B, com determinação da
concentração inibitória mínima (CIM), empregando-se metodologia de
microdiluição consideradas de referência, o método europeu AFST-EUCAST
(65,66), o meio líquido RPMI 1640 com L-glutamina, sem bicarbonato de sódio e
tamponado com MOPS, pH 7,0, com 0,2% de glicose. As drogas sob forma p.a.,
serão diluídas em dimetilsulfóxido (DMSO). As soluções de antifúngicos serão, a
seguir, diluídas no meio líquido RPMI-1640 até as concentrações finais de 0,03 a
16μg/mL, para anfotericina B, voriconazol, itraconazol e caspofungina, e para o
fluconazol serão de 0,125 a 64 μg/mL, de acordo com o AFST-EUCAST (65).
Serão incluídas, em cada ensaio, duas cepas-controle, a saber: C.krusei ATCC
6258 e C.parapsilosis ATCC 22019 (65).
O inóculo de cada amostra será feito em 5,0 mL de água deionizada e
esterilizada, ajustada à turbidez igual a 0,5 da escala de MacFarland, que
equivale de 1x106 a 5x106 ufc/mL e em seguida, será diluído 100 vezes, para ser
usado nos testes de sensibilidade. O inóculo de cada amostra será adicionado às
mesmas fileiras das placas contendo os antifúngicos, em alíquotas de 100 L, as
placas serão incubadas a 35o C, por 24h (65). As CIMs de fluconazol, voriconazol,
caspofungina e anfotericina B serão as menores concentrações das drogas
capazes de inibir, pelo menos, 50% do crescimento do microrganismo, quando
comparada ao controle positivo. Para anfotericina B e caspofungina a CIM será a
menor concentração capaz de inibir 90% do crescimento. Os pontos de corte que
serão utilizados nos testes de sensibilidade in vitro para diferentes antifúngicos,
seguirão as orientações do AFST-EUCAST (65).
4.6 Análise Molecular do Complexo Candida parapsilosis.As amostras identificadas como C. parapsilosis ´por métodos fenotípicos
serão submetidas à análise molecular para a classificação das espécies do C.
parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis.
4.6.1 Extração do DNA.
As amostras do Complexo C. parapsilosis serão repicadas em tubo de
11
11
Sabouraud dextrose com cloranfenicol e incubadas a 30ºC por 24h para a
extração do DNA genômico que será realizada de acordo com Sambrook et al.,
(67)
4.6.2 Quantificação do DNA.
As alíquotas de DNA serão submetidas a quantificação em Nonodrop, a
absorbância será medida em comprimento de onda de 260 nm, absorbância
igual a 1 contém uma concentração de 50 µg/mL de oligonucleotídeos de fita
simples. O aparelho também mede a absorbância em comprimento de onda de
280 nm para verificar a presença de proteínas e calcular a pureza do DNA. A
razão entre as leituras DO260 / DO280 do aparelho permitirá uma estimativa da
pureza do DNA, cujo ideal encontra-se entre 1,8 e 2,0. A razão abaixo de 1,6
indica grande quantidade de proteína e contaminantes, e na sua ocorrência, a
extração será realizada novamente (67).
4.6.4. Análise molecular para classificação das espécies do Complexo Candida parapsilosis.
Para diferenciação entre C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis
serão utilizadas as técnicas de PCR-RFLP segundo TAVANTI et al., 2005 e
2007 (68,69). Para a PCR-RFLP será amplificado o fragmento SADH utilizando
par de primer S1F: 5’ GTTGATGCTGTTGGATTGT-3’; S1R: 5’-
CAATGCCAAATCTCCCAA-3’ nas seguintes condições: desnaturação inicial de
94ºC por 2’, 30 ciclos de 94ºC por 1’; 50ºC por 1’; 72ºC por 1’ e extensão final de
10’ a 72ºC. Os produtos do PCR serão digeridos com enzima de restrição BanI
em tampão específico da enzima por 90 minutos.
4.7. Análise estatísticaA incidência de candidemia será calculada por 1.000 admissões
hospitalares, considerando-se um intervalo de confiança de 95%, assumindo-se
a distribuição de Poisson dos casos. A distribuição de espécies de Candida será
analisada em função do ano da admissão hospitalar, da idade do paciente e da
unidade em que o paciente foi internado. Pacientes com candidemia mista serão
excluídos da análise estatística. Em casos de vários episódios de candidemia no
mesmo paciente, apenas a primeira ocorrência será considerada. As variáveis
12
12
categóricas serão apresentadas como porcentagens e avaliadas pelo teste do χ2
ou, como alternativa, pela prova exata de Fisher; as variáveis contínuas serão
apresentadas como medianas e intervalos interquartis e avaliados pelo teste de
Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis. Todos os testes serão realizados admitindo-
se um erro tipo α de 5% para rejeitar a hipótese de nulidade.
4.8. Comitê de ÉticaEste projeto de pesquisa será submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa
da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE.
5. Cronograma de Atividades1º semestre 2018
- cursar disciplinas
- reidentificação das amostras previamente identificadas pelo Laboratório
de Análises Clínicas São José IRELI do Hospital Regional.
2º semestre 2018- cursar disciplinas
- execução dos ensaios laboratoriais
- levantamento dos dados clínicos
- apresentação dos resultados parciais em congressos da área
1º semestre 2019- cursar disciplinas
- execução dos ensaios laboratoriais
- levantamento dos dados clínicos
- apresentação dos resultados parciais em congressos da área
2º semestre 2019- análise estatística dos resultados
- atualização bibliográfica
- exame geral de qualificação
- preparação do manuscrito para publicação em periódico especializado
(pelo menos quatro meses)
13
13
1° semestre 2020- apresentação e defesa da dissertação.
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