環状過酸化物の抗マラリア作用機序の解析ousar.lib.okayama-u.ac.jp/files/public/5/50737/...2 2.5. 熱帯熱マラリア原虫の同調培養法 19 2.6. N-89及びN-251の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害の解析

博士論文

環状過酸化物の抗マラリア作用機序の解析

平成 25年 3月

森田将之

岡山大学大学院

医歯薬学総合研究科

博士後期課程創薬生命科学専攻

１

目次

要約 5

略語表 7

1 章序論 9

1.1. マラリアとは 10

1.2. マラリア原虫の種類 10

1.3. 赤血球内でのマラリア原虫のライフサイクル 10

1.4. 抗マラリア薬 11

1.5. 抗マラリア作用機序 13

1.6. 環状過酸化物 13

1.6.1. Artemisinin 13

1.6.2. N-89及び N-251 14

1.7. N-89 誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質 15

1.8. 本研究の目的及び意義 16

2 章方法 17

2.1. 材料 18

2.2. 細胞株 18

2.3. 熱帯熱マラリア原虫の in vitro 培養 18

2.3.1. RPMI1640 (-) 培地の調製 18

2.3.2. ヒト赤血球と血清 18

2.3.3. 熱帯熱マラリア原虫の継代培養 18

2.4. 熱帯熱マラリア原虫の薬剤感受性試験 19

２

2.5. 熱帯熱マラリア原虫の同調培養法 19

2.6. N-89 及び N-251 の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害の解析 20

2.7. プロテオーム解析 21

2.7.1. 熱帯熱マラリア原虫タンパク質 lysate の調製 21

2.7.2. タンパク質定量 22

2.7.3. 二次元電気泳動 22

2.7.4. イメージの検出と解析 23

2.7.5 タンパク質スポットの切り出し 24

2.7.6. タンパク質のゲル内消化 24

2.7.7. タンパク質の同定 24

2.8. Western blotting 25

2.8.1. SDS-PAGE 25

2.8.2 Semi-dry blotting 25

2.8.3. ブロッキング及び抗体反応 25

2.8.4. Chemiluminescent detection (化学発光による検出) 26

2.8.5. ストリッピング 26

2.9. PfERC と相互作用するマラリア原虫タンパク質の探索 26

2.9.1 マラリア原虫タンパク質 Lysate の調製 26

2.9.2. 免疫沈降 27

2.9.3. MBP (Maltose binding protein)-ΔPfERC 27

2.9.4. Pull down assay 28

2.10. 表面プラズモン共鳴法 (Surface Plasmon Resonance; SPR) 28

2.11. 電子スピン共鳴法 (Electron Spin Resonance; ESR) を用いたラジカルの検出 29

３

2.12. PfERC を過剰発現する遺伝子組換え原虫の作製 29

2.13. 長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野研究室でのマラリア原虫培養 29

2.14. 長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野研究室でのマラリア原虫タンパク質 Lysate の調製

30

2.15. Real-time PCR 30

2.15.1. プライマー 30

2.15.2. RNase-free 処理 31

2.15.3. Total RNA 抽出 31

2.15.4. RNA の定量 32

2.15.5. First-Strand cDNA 合成 32

2.15.6. Real-time PCR 32

2.16. 免疫蛍光染色による局在観察 34

2.16.1. PEI-coated cover glass の作製 35

2.16.2. 免疫蛍光染色法 35

2.17. 遺伝子組換え原虫の薬剤感受性試験 36

3 章結果 37

3.1. N-89 及び N-251 の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害の解析 38

3.2. N-89 又は N-251 作用時のプロテオーム解析 40

3.2.1. N-89 作用時に変動するタンパク質 41

3.2.2 N-251 作用時に変動するタンパク質 57

3.2.3. 標的候補タンパク質の選抜 76

3.3. PfERC と相互作用するマラリア原虫タンパク質の探索 78

3.3.1. 免疫沈降法による PfERC と相互作用するタンパク質の探索 78

４

3.3.2. Pull down assay による PfERC と相互作用するタンパク質の探索 79

3.4. 表面プラズモン共鳴を用いたΔPfERC と N-89、N-251 との親和性測定 80

3.5. 電子スピン共鳴法を用いた N-89 及び N-251 のラジカル産生の解析 81

3.6. PfERC 過剰発現原虫の作製と薬効評価 83

3.6.1. PfERC の mRNA 発現量の解析 83

3.6.2. PfERC のタンパク質レベルの解析 83

3.6.3. 免疫蛍光染色法を用いた PfERC と PfERC-3Ty の局在観察 84

3.6.4. 薬効評価 87

4 章考察 88

引用文献 98

謝辞 102

５

要約マラリアは 2010年における年間感染者数が 2億 1600万人、死亡者数は 65万 5000人の世界最大の

寄生原虫感染症である。従来治療に用いられてきた Chloroquine、Mefloquine に対する耐性原虫に加

え、現在、WHO が推奨する ACTs (Artemisinin を基本とした多剤併用療法 : Artemisinin-based

combination therapies) に耐性を示す Artemisinin耐性マラリア原虫がタイ・カンボジア国境付近で出現

したことが報告されており、マラリア制圧において深刻な問題となっている。また、昨今、イギリス

の製薬会社をはじめとしてマラリアワクチンの開発が行われているが、未だ実用に耐えうるワクチン

の開発は達成されておらず、したがって、新たな抗マラリア薬の開発は国際的な緊急課題である。こ

れまでに抗マラリア薬の開発研究から、環状過酸化物 N-89及び N-251が優れた抗マラリア活性を有

することが見出されている。これらの化合物は不斉炭素を持たない簡単な構造であり、安価に大量合

成できる利点を有している。N-89 及び N-251 の臨床応用へ向けた安全性研究、製剤研究、及び抗マ

ラリア作用機序の解析研究が行われている。現在、臨床で使用されている抗マラリア薬には作用機序

が明らかなものは非常に少ないが、併用薬の選択、副作用の回避、薬剤耐性化の克服のためには作用

機序を明確にすることが重要である。そのため、本研究は N-89及び N-251の抗マラリア作用機序を

明らかにすることを目的として行った。

熱帯熱マラリア原虫は赤血球内で様々に形態を変えるライフサイクルを有し、各ステージで

種々の遺伝子及びタンパク質の発現量が変動していることが知られている。そこで、環状過酸

化物 N-89 及び N-251 の作用機序解析のため、マラリア原虫生育ステージ特異的な阻害効果の

検討を行った。その結果、N-89 及び N-251 は Trophozoite 期の原虫に特異的な増殖阻害作用を

有することが分かった。N-89 及び N-251 と同様の環状過酸化物である Artemisinin 系薬剤では

全てのステージのマラリア原虫に増殖阻害作用を示すことが報告されていることから、N-89

及び N-251 は Artemisinin系薬剤とは作用機序が異なることが示唆された。

N-89 及び N-251 は Trophozoite 期のマラリア原虫の増殖を特異的に阻害することから、

Trophozoite 期に発現しているマラリア原虫タンパク質の機能を阻害していることが考えられ

た。N-89 又は N-251 を Trophozoite 期のマラリア原虫に作用させた時にどのようなタンパク質

が変動するかをプロテオーム解析によって網羅的に解析した。その結果、約 70 種類のマラリ

ア原虫タンパク質が薬剤作用によって増減した。これまでに N-89 誘導体と親和性を有するマ

ラリア原虫タンパク質が同定されている。その中でも、本プロテオーム解析で N-89 作用時及

び N-251作用時両方の場合に共通して変動していたマラリア原虫タンパク質 PfERCを N-89及

び N-251 の標的候補タンパク質として選抜した。PfERC は N-89 又は N-251 の作用によって減

少し、N-89 誘導体と親和性を有するため、N-89 及び N-251 と PfERC の結合が PfERC の減少に

関与している可能性が考えられた。

PfERC の機能解析のため、PfERC と相互作用するマラリア原虫タンパク質の探索を行ったが、

相互作用するタンパク質は本研究では見出せなかった。このことから、PfERC は他のタンパク

６

質と非常に弱い相互作用をしている可能性が考えられた。表面プラズモン共鳴法を用いた解析

より、N-89 及び N-251 は弱いながらも PfERC と特異的な親和性を有することが示された。N-89

及び N-251 は鉄の存在下で自身の環状過酸化構造よりラジカルを産生することから、産生され

たラジカルが直接 PfERC と反応し、PfERC を減少させて抗マラリア作用を示す可能性が考え

られた。そのため、原虫内で PfERC を過剰発現させることによって薬剤の作用にどのような

影響が出るかを検討した。PfERC を 2 倍多く発現する遺伝子組換え原虫を作製し、N-89 の感

受性を測定した結果、その感受性は 1/2 に低下した。この結果は、PfERC が標的タンパク質で

ある可能性を支持するものである。

本研究により、抗マラリア薬候補として有望な化合物 N-89、N-251 の標的候補タンパク質 PfERC

が見出され、そのタンパク質が薬剤の感受性に寄与していることが明らかにされた。PfERC 過剰発

現原虫作製においては、PfERCを 10倍以上過剰発現させることを期待して研究を行ったが、実際の

発現量は約 2 倍が限度であった。これは、PfERC が多過ぎるとマラリア原虫の生育に悪影響を与え

るために、発現抑制が起こった可能性があると考えられる。PfERCはその構造内に EF hand motif (Ca2+

結合モチーフ) を有する CREC (Cab45、Reticulocalbin、ERC-55、Calumenin) タンパク質ファミリー

に属している。PfERCの機能はまだ明らかになっていないが、CRECタンパク質ファミリーのタンパ

ク質は小胞体内での Ca2+制御への関与、細胞の生存に必須であることが複数の研究グループから報

告されている。PfERC も他の CREC タンパク質ファミリーと同様の機能を有している、すなわち、

PfERCは原虫の生存に必須でありなおかつ Ca2+制御へも関与していることが考えられる。そのため、

N-89又は N-251を作用させると PfERCが減少し、原虫小胞体内で Ca2+制御異常が起こり、原虫が死

に至る可能性が考えられる。

N-89 と N-251 は環状過酸化抗マラリア薬である Artemisinin 系薬剤と異なり、熱帯熱マラリア原

虫の Trophozoite 期に特異的に作用する。また、N-89 と N-251 の標的候補タンパク質である

PfERC は Artemisinin とは親和性を示さなかった。このことは N-89 及び N-251 は Artemisinin

系薬剤とは抗マラリア作用機序が異なることを示している。近年、Artemisinin 系薬剤に対する

耐性原虫が出現し問題となっているが、N-89 及び N-251 は Artemisinin 耐性原虫に対しても有

効であり、マラリア制圧に貢献できる有望な抗マラリア薬であると考える。

本研究によって新規抗マラリア薬として有望な環状過酸化物 N-89 及び N-251 の作用機序の

一端が提示でき、臨床における併用薬の選択、副作用の回避、耐性の克服に大きく寄与できる

と考えられる。

７

略語表論文中で以下の略語を用いた

ACTs Artemisinin-based combination therapies

ATP adenosine triphosphate

BPB bromo phenol blue

bp base pair

BSD Blasticidin S

cDNA complementary DNA

CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate

CM Complete medium

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DBNBS 3,5-dibromonitrosobenzenesulfonate sodium salt

DEPC diethyl pyrocarbonate

DFO deferoxamine

DMSO dimethylsulfoxide

DNA deoxyribonucleic acid

DNase deoxyribonuclease

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

DTT Dithiothreitol

EC50 Effective concentration of 50% inhibition

EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

ER Endoplasmic reticulum

ESR electron spin resonance

HEPES

HC

2-hydroxyethylpiperazine-N’-2- ethanesulfonic Acid

hematocrit

HPLC high performance liquid chromatography

HRP Horseradish peroxidase

HSP Heat shock protein

IEF isoelectric focusing

i.p. intraperitoneal

IPG immobilized pH gradient

i.v. intravenous

kDa kilodalton

LC Liquid Chromatography

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

MBP Maltose binding protein

MS Mass Spectrometry

mAb Monoclonal antibody

８

mRNA messenger RNA

PAGE polyacrylamide gel electrophoresis

PBS phosphate-buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

PEI polyethyleneimine

pI Isoelectric point

PIPES Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)

P. f. Plasmodium falciparum

PMF Peptide mass fingerprinting

p.o. per os

RBC red blood cell

RNA ribonucleic acid

RNase Ribonuclease

RT-PCR reverse transcriptase-PCR

siRNA small interfering RNA

s.c. subcutaneous injection

SDS sodium dodecyl sulfate

SPR surface plasmon resonance

TBS Tris buffered saline

TEMPO 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxy

TOF Time of flight

Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane

UV Ultraviolet

WHO World Health Organization

９

１章序論

１０

1.1. マラリアとは

マラリアは、Plasmodium 属の原虫がハマダラカ (Genus Anopheles) の吸血によりヒトに感染

することで引き起こされる寄生原虫感染症であり、熱帯地域全体のみならず、亜熱帯、温帯の

多くの地域まで広く蔓延している。マラリアの典型的な症状は 6~8 時間続く 40°C を超える激

しい発熱であり、重度になると錯乱、痙攣、昏睡にまで発展し死亡の危険もある。世界保健機

構 (World Health Organization; WHO) の報告では、世界 107 カ国で 30 億人以上がその脅威に曝

されており、2010 年のマラリア感染は 2 億 1600 万件にのぼり、死亡者数は 65 万 5000 人 (う

ち約 86%が 5 歳未満の子供) といわれている 1)。世界でのマラリアの分布を Figure 12)に示す。

WHO: Programmes and projects, international travel and health, Chapter 7 Malaria.

Figure 1. マラリア伝搬地域

1.2. マラリア原虫の種類

ヒトに寄生するマラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum)、三日熱マラ

リア原虫 (P. vivax)、四日熱マラリア原虫 (P. malariae)、卵形マラリア原虫 (P. ovale) である。

さらに 2004 年にはこれまでサルに寄生するマラリア原虫であった P. knowlesi がヒトにも寄生

することが報告されている 3)。これらの中でも熱帯熱マラリア原虫は感染すると重篤になりや

すく、最も致死率の高いマラリア原虫である。

1.3. 赤血球内でのマラリア原虫のライフサイクル

赤血球内でのマラリア原虫のライフサイクルを Figure 2 に示す。マラリア原虫はヒトの体内

で赤血球へ侵入後、Merozoite から Ring、栄養体とも呼ばれる Trophozoite、核と細胞質が分裂

した Schizont へと成熟し、赤血球を破壊し、放出された Merozoite が新しい赤血球に侵入する。

１１

マラリア原虫は Trophozoite 期においても形態、遺伝子及びタンパク質の発現が大きく変化

する。しかし、その変化を区別する客観的な指標はないため、当研究室ではマラリア原虫の細

胞質の大きさ、原虫内に占めるヘモゾイン＊量の割合から主観的に Trophozoite 期を Early、

Middle、Late trophozoite 期の 3 種類に分類している。

＊ヘモゾインはマラリア原虫内で遊離したヘムが重合化されたものである。マラリア原虫は栄

養源として赤血球内のヘモグロビンを取り込み、分解してアミノ酸を得る際に遊離する鉄を含

んだ有害なヘムを無毒化するためにヘムを重合化したヘモゾインを生成する。

Figure 2. 赤血球内でのマラリア原虫のライフサイクル

1.4. 抗マラリア薬

既存の抗マラリア薬には quinoline骨格を基本とした Chloroquineや Mefloquineなどがあるが

これら抗マラリア薬に対する薬剤耐性マラリア原虫が世界に拡散する傾向にある。既存の抗マ

ラリア薬の構造式を Figure 3 に示す。

１２

Quinine Chloroquine Mefloquine Primaquine

Lumefantrine Pyrimethamine

Figure 3. 既存の抗マラリア薬の構造式

Figure 3 に示す抗マラリア薬とは異なり、分子内に peroxide 構造というユニークな構造を有

する Artemisinin という化合物が中国古来の生薬青蒿 (Artemisia) から単離され、優れた抗マラ

リア作用を有することが分かっている。体内動態の改善を目指して Artemisinin の半合成化合

物である Artemisinin 系薬剤が開発され、臨床で使用されている。Artemisinin の活性代謝物で

ある Dihydroartemisinin から脂溶性向上を目的に Artemether、水溶性向上を目的に Artesunate が

合成された。Artemisinin 系薬剤の構造式を Figure 4 に示す。

Artemisinin Dihydroartemisinin Artemether Artesunate

Figure 4. Artemisinin 系薬剤の構造式

これら Artmisinin系薬剤は半減期が短く (Artemisininが 2~3時間、Dihydroartemisininが 40~60

分、Artemetherが 3~7時間 (Dihydroartemisininへの変換)、Artesunateが 2~5分 (Dihydroartemisinin

への変換))、再燃が起こりやすいという問題点がある。そのため 2001 年から WHO より、半減

期の長い既存の抗マラリア薬と Artemisinin 系薬剤を組み合わせた多剤併用療法 (Artemisinin

１３

based-combination therapies; ACTs) がマラリア治療に推奨されている 4), 5)。今日まで ACTs はマ

ラリア治療の第一選択として用いられてきたが、近年タイ・カンボジア国境付近で Artemisinin

系薬剤耐性熱帯熱マラリア原虫の出現が報告されている 6), 7)。

1.5. 抗マラリア作用機序

既存の抗マラリア薬の中で作用機序が解明されているものはほとんどない。現在、唯一作用

機序が解明されている抗マラリア薬は Pyrimethamine のみである 8)。2003 年に Artemisinin の標

的タンパク質として SERCA (Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase) が発見されたという報

告 9)があるが、まだ決定的なエビデンスは得られていない。

1.6. 環状過酸化物

1.6.1. Artemisinin

前項でも述べた既存の抗マラリア薬である Artemisinin は既存抗マラリア薬とは異なり、分子内に

peroxide構造というユニークな構造を有することから Chloroquine 耐性原虫にも有効である 10)。ま

た、Artemisinin はその peroxide構造がマラリア原虫内の Fe2+と反応し、ラジカルを産生することが

報告されている 11)。さらに、Artemisininの peroxide構造より酸素原子が一つ少ない nonperoxidic analog

である Deoxyartemisinin (Figure 5) はその抗マラリア活性が Artemisininに比べて 1/1000以下に低下す

る 12)。

Figure 5. Deoxyaretmisininの構造式

ラジカルのスピントラップ剤である TEMPO (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxy) 又は鉄のキレート

剤である DFO (deferoxamine) を Artemisininと併用した場合、Artemisininの抗マラリア作用が低下す

る 12)。これらは Artemisininの抗マラリア作用には、ラジカルを産生することと鉄の存在が関与して

いることを示している。以上より、環状過酸化物の抗マラリア活性には peroxide構造が重要な役割を

果たしていると考えられる。

１４

1.6.2. N-89及び N-251

当研究室では peroxide 構造に注目し、大阪大学工学部野島教授との共同研究により約 500 種の

peroxide構造を持つ化合物を合成し、その抗マラリア活性の検討を行ってきた 13)。現在までに種々の

化合物が抗マラリア活性を有することが確認されており、その中でも tetraoxan の環が 8員環であり、

cyclododecaneを有する N-89 (1,2,6,7-tetraoxaspiro[7.11]nonadecane) が in vitro 及び in vivo で優れ

た抗マラリア活性を示すことを見出した 14)。また、N-89 に -OH 基を導入した誘導体 N-251

(6-(1,2,6,7-tetraoxaspiro[7.11]nonadec-4-yl)hexan-1-ol) をさらに合成し、この化合物は N-89 と同

等の抗マラリア活性を維持していることが分かっている 15)。このことより、N-251 の-OH 基を

用いてプロドラッグを合成するなどの誘導体化が可能となる。Figure 6 に N-89 と N-251 の構造

式を、Table 1、2 に in vitro と in vivo における抗マラリア活性を示す。これらの結果より、N-89、

N-251 は共に高い抗マラリア活性を有しており、選択毒性も高く、さらに、 in vivo でもその有

用性が証明されている。現在、これら化合物を有望な抗マラリア薬候補化合物として開発研究

及び作用機序の解析を行っている。

Figure 6. N-89 及び N-251 の構造式

Table 1. N-89 及び N-251 の in vitro における抗マラリア活性と細胞毒性

FCR-3a) FM3A cellb) Compound

EC50 (M) EC50 (M) Selectivity

N-89 2.5×10-8 8.2×10-6 328

N-251 2.3×10-8 8.0×10-6 324

a) Plasmodium falciparum b) Mouse mammary carcinoma cell

Table 2. N-89 及び N-251 の in vivo における抗マラリア活性

i.v. p.o. i.p. s.c.

Compound ED50

(mg/kg)

ED90

(mg/kg)

ED50

(mg/kg)

ED90

(mg/kg)

ED50

(mg/kg)

ED90

(mg/kg)

ED50

(mg/kg)

ED90

(mg/kg)

N-89 12 20 20 40 12 20 2.5 3.8

N-251 22 45 15 40 15 26 7 10

１５

1.7. N-89 誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質 16)

これまでに平成 17 年度修了生佐内仁美氏により N-89 誘導体と親和性を有するマラリア原

虫タンパク質が同定されている。

2003 年の Artemisinin の標的タンパク質が発見されたという報告 9)から、同様の環状過酸化

物である N-89 及び N-251 においても標的タンパク質があるのではないかと考えられた。この

標的タンパク質を同定する目的で N-89 及び N-251 をカラムに固定しマラリア原虫タンパク質

Lysate中から親和性を有するタンパク質を単離するアフィニティーカラムを用いた解析を行っ

た。しかし、N-89 及び N-251 には自身をカラムに固定するための側鎖がない。そのため、側

鎖にリジン残基を有する N-89 誘導体 (N-346) を合成し、それをアズラクトンカラムに固定し

た (Figure 7)。

Figure 7. N-89 誘導体 (N-346) のアズラクトンカラムへの固定

N-346を固定したカラムを用いて親和性を有するタンパク質を溶出し、同定した。その結果、

6 種類のマラリア原虫タンパク質 (Merozoite surface protein 7、Rhoptry-associated membrane

antigen、14-3-3 protein、Heat shock protein 70、Endoplasmic reticulum-resident calcium binding

protein (PfERC)、Glideosome-associated protein 45) が N-89 誘導体と親和性を有するマラリア原

虫タンパク質として同定している。

上記 6 種類のマラリア原虫タンパク質の中でも、当研究室では PfERC に注目しており、こ

れまでに就実大学薬学部平岡修准教授との共同研究のもと、PfERC の組換え体 (ΔPfERC)

及びモノクローナル抗体 (anti PfERC mAb) を作製している。

１６

1.8. 本研究の目的及び意義

WHOより Roll Back Malaria Initiativeと呼ばれるマラリア対策が宣言されてから 10年以上が

経過するが、未だにマラリアによる死亡者は 65 万人近くにのぼっている。近年においても実

用に耐え得るマラリアワクチンの開発は成されておらず、ACT 療法に対する薬剤耐性マラリア

原虫も出現し始めた。このような現況において、マラリア制圧へ向けた新たな抗マラリア薬の

開発は世界的な急務となっている。

当研究室では in vitro、 in vivo 共に優れた抗マラリア活性を有する N-89 及び N-251 を新規抗

マラリア薬候補化合物として開発研究を行っている。現在は臨床試験へ向けた安全性研究と製

剤研究が行われているが、これらと並行して抗マラリア作用機序の解析研究も行われている。

作用機序を解明することによって併用薬の選択が可能となり、薬剤耐性の克服に大きく貢献

する。また、未だ臨床試験が行われていない薬剤の作用機序が分かれば副作用の予測が可能と

なり、臨床試験における被験者のリスク回避へとつながる。そのため、私は本研究において

N-89 及び N-251 の抗マラリア作用機序を解明することを目的として研究を行った。

本研究では、N-89及び N-251の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害を解析し、

化合物作用時のプロテオーム解析によって N-89 及び N-251 の標的候補タンパク質として

PfERC を選抜した。さらに、PfERC の機能解析及び PfERC を過剰発現する遺伝子組換え原虫

の作製と薬効評価を行った。

本研究で得られた知見は、有望な新規抗マラリア薬候補化合物である N-89 及び N-251 がど

のようにしてマラリア原虫に作用して抗マラリア活性を示すかを知る一助となる。さらに今後、

PfERC がどのような機能を有しているかを知ることによって、より詳細に作用機序を解明でき、

N-89 及び N-251 の臨床での使用に向けて大きく貢献できるようになると期待できる。

１７

2章方法

１８

2.1. 材料

N-89 及び N-251 は株式会社ナード研究所に合成を依頼した。Artemisinin は Sigma より購入

した。各化合物は DMSO (WAKO) に溶解して使用した。

2.2. 細胞株

熱帯熱マラリア原虫 FCR-3株 (ATCC 30932) は American Type Culture Collectionより入手し、

岡山大学薬学部分子医薬品情報学研究室及び国際感染症制御学研究室にて取り扱った。熱帯熱

マラリア原虫 Dd2-attB 株及び遺伝子組換え原虫株は長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野研究

室にて取り扱った。遺伝子組換え原虫の扱いに関しては、長崎大学の規定に従い遺伝子組換え

実験講習を受け、実験許可を得た。

2.3. 熱帯熱マラリア原虫の in vitro 培養 13), 17)

2.3.1. RPMI1640 (-) 培地の調製

10.4 g の RPMI1640、5.95 g の HEPES を約 800 mL の milliQ 水に添加し、約 20 分撹拌した。

2.0 g の NaHCO3を加え、さらに 5 分撹拌した後、1 M NaOH を用いて pH 7.2 に調製した。

Gentamicin sulfate (50 mg/mL) を 0.5 mL 添加し (終濃度 25 µg/mL)、1 L にメスアップした。安

全キャビネット内で 0.22 µm ボトルトップフィルターを用いて濾過滅菌を行い、これを

RPMI1640 (-) 培地とし、4°C で保存し、1 ヶ月以内に使用した。実際の培養には終濃度 10％と

なるようにヒト血清を添加した RPMI1640 (+) 培地として使用した。

2.3.2. ヒト赤血球と血清

血液は、マラリア原虫培養に血液を提供することに同意したボランティア (A 型) より岡山

大学保健管理センターにて得たもの、及び感染症検査が陰性かつ血液製剤の規格に適合しない

ものを日本赤十字社より得て使用した。

2.3.3. 熱帯熱マラリア原虫の継代培養

継代培養は、24 穴培養プレートを用いて Hematocrit 値 (HC 値 ; 全容量に対する赤血球容量

の割合) が 5%、全量 1111 µL/well になるようにして行った。培養条件は O2濃度 5.0%、CO2濃

度 5.0%、N2濃度 90%、温度は 37°C とした。24 穴培養プレートから感染赤血球を 1.5 mL チュ

ーブに回収し、2500 rpm (TOMY MRX-150)、5 分間、25°C で遠心後、上清を除いた。感染赤血

球、RPMI1640 (+) 培地、新鮮赤血球を用いて、感染率が 0.3％となるように、HC 値 50％の原

虫培養液を調製した。24 穴培養プレート 1well に RPMI1640 (+) 培地を 1 mL 加え、さらに HC

値 50％の原虫培養液を 111 µL 加え、HC 値 5％として培養した。

液替え注 1)は毎日行い、感染率注 2)が 3％を超えた際は 0.3％になるように継代培養を行った。

１９

この感染率は、スライドガラスに薄層塗抹標本を作製し、Diff-Quik 染色注 3) (シスメックス) を

行い、油浸光学顕微鏡 (×1000) で計測した。

注 1) 原虫や赤血球に消費された培地の含有成分を補い、培地中に蓄積された代謝産物や赤血

球の分解物を除くための操作である。プレートの各 well の RPMI1640 (+) 培地を 800 µL 除去

後、新しい RPMI1640 (+) 培地を 800 µL 加えた。

注 2) 全赤血球に対する熱帯熱マラリア原虫が感染した赤血球の割合である。複数の原虫が感

染していても感染赤血球は 1 個として計測した。油浸光学顕微鏡 (×1000) で 20 視野観察し、

以下の計算式で算出した。

観測した視野の全感染赤血球数感染率 (%) ＝

観測視野数×1 視野内全赤血球数 × 100

注 3) 固定液、染色液 I、染色液 II から成る。薄層塗抹標本を乾燥させた後、固定液に 1 秒間

に 1 回の割合で 10 回程度浸し、染色液 I では 3-4 回、染色液 II では 10 回以上、染色を行い、

その後、水で洗い流し乾燥させた。染色は約 1-2 分で完了するため、これまで用いられてきた

ギムザ染色と比較すると染色に要する時間を大幅に短縮できる。

2.4. 熱帯熱マラリア原虫の薬剤感受性試験 18)

培養した原虫を回収し、2500 rpm (TOMY MRX-150)、5 分間、20°C で遠心し、上清を除去し

た。RPMI1640 (+) 培地、新鮮赤血球、感染赤血球より HC 値 3%、初期感染率 0.3%となるよう

に原虫培養液を調製した。目的の終濃度より 200 倍濃く調製した化合物をそれぞれの濃度につ

いて、24 穴培養プレート 1well あたり 5 µL ずつ duplicate で加えた。Negative control として化

合物の希釈に用いた溶媒を 5 µL、Positive controlとして EC60濃度に相当する Quinine溶液を 5 µL

添加した well も duplicate で用意した。化合物を加えた well に、上記の通り調製した原虫培養

液を 995 µL ずつ加え、培養を開始した。初期感染率はこの原虫培養液から作製した薄層塗抹

標本より算出した。72 時間の培養後に 1well あたり 1 枚の薄層塗抹標本を作製し、それぞれ感

染率を測定し、以下の計算式に従い増殖率 (%) を求めた。

72 時間後のサンプル作用時の感染率-初期感染率増殖率 (%) ＝

72 時間後のコントロールの感染率-初期感染率 × 100

片対数グラフの x 軸に各サンプルの終濃度を、y 軸に求めた増殖率をプロットし、EC50値を算

出した。

2.5. 熱帯熱マラリア原虫の同調培養法 19), 20)

これまでに報告されている赤内期熱帯熱マラリア原虫のステージを同調させる方法の中で、

最も正確かつ汎用されているものの一つに、D-sorbitol 処理による同調法がある。この方法は、

Trophozoite 期、Shizont 期のような Ring 期以外のステージのマラリア原虫感染赤血球が

２０

D-sorbitol 処理により選択的に破壊されるという現象を利用し、マラリア原虫を Ring 期に同調

させるものである。D-sorbitol で処理すると感染赤血球のうち、赤血球膜が弱っている

Trophozoite 期、Shizont 期の熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球膜が壊れ、これら原虫は放

出されてしまい原虫自体も D-sorbitol による膜障害を受け増殖しなくなる。しかし、赤血球膜

が強いままである Ring 期の原虫が感染している赤血球膜は壊れず、そのまま増殖が可能であ

る。また、Schizont 期のマラリア原虫より放出された Merozoite 期のマラリア原虫も、D-sorbitol

障害を受けない。この D-sorbitol の作用を利用することにより Ring 期の原虫を集めることがで

きる。

培養したマラリア原虫感染赤血球を回収し、2500 rpm (TOMY MRX-150)、10 分間、25°C で

遠心し、上清を除去した。5% D-sorbitol 水溶液 (37°C) を赤血球の 4-5 倍量添加し、5 分毎に

転倒混和しながら 15 分間、室温で静置した。2500 rpm (TOMY MRX-150)、10 分間、25°C で遠

心し、上清を除去した。RPMI1640 (+) 培地を加え、転倒混和後、2500 rpm (TOMY MRX-150)、

10 分間、25°C で遠心し、上清を除去する赤血球の洗浄操作を 3 回行った。初期感染率を約 1%、

HC 値 5%になるように調製し、培養を開始した。40-44 時間後の Ring 期原虫が最も多い時点で

再度 5% D-sorbitol 処理を行った。１時間毎に原虫発育段階をモニターして 2 回目の処理時間を

決めると同調率の高い培養が行える。また、別のステージのマラリア原虫を実験に用いる時は

同調後のマラリア原虫を数時間毎にモニターして観察すれば得られる。Figure 8 に熱帯熱マラ

リア原虫の赤内期形態変化に関する時間を示す。

Figure 8. 熱帯熱マラリア原虫の赤内期形態変化に要する時間

2.6. N-89 及び N-251 の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害の解析

マラリア原虫は各ステージにおいて発現する遺伝子とタンパク質が異なることが知られて

いる 21), 22)。例えばあるステージにのみ特異的に発現するものや、ステージの移行に従って増

減するものである。作用機序を解析する上で薬剤がどのようなステージに作用するかを調べる

ことは重要であるため、N-89 及び N-251 の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害

の解析をした。Ring、Early trophozoite、Middle trophozoite、Late trophozoite、Schizont 期へ同調

したそれぞれのマラリア原虫に 3 µM の N-89 又は N-251 を作用させた。薬剤を作用させた後、

0、6、12、24、48、72 時間後にスメアを作製し、各時間におけるマラリア原虫のステージの割

合を観察した。

２１

2.7. プロテオーム解析

マラリア原虫は生物学的にあまり研究が進んでおらず、タンパク質研究で用いる抗体で市販

されているものはほとんどない。そのため、1.7.で同定された N-89 誘導体と親和性を有するマ

ラリア原虫タンパク質を個々に解析することが難しい。本項目では N-89 及び N-251 の標的候

補タンパク質を選抜するため、化合物作用時のプロテオーム解析を行った。N-89 及び N-251

は相互作用するタンパク質に対して作用していることが考えられるため、化合物を作用させた

場合に、化合物とタンパク質の相互作用に起因してどのようなタンパク質が増減及び翻訳後修

飾などの変化を示すかを網羅的に解析した。

2.7.1. 熱帯熱マラリア原虫タンパク質 lysate の調製

6穴培養プレート 12枚分 (HC値 5%) の原虫を感染率が約 3％になるまで GIT培地 (WAKO)

で培養した。感染赤血球浮遊液を 50 mL 遠心管 4 本に回収し、2500 rpm (HITACHI CF 7D2)、

10 分間、4°C で遠心した。遠心後、ヘモゾインを除去し、pellet へ PBS (-) と 0.3％ Saponin 溶

液 (in PBS (-)) を加え、転倒混和し (Saponin 終濃度 0.15％)、20 分間、37°C でインキュベート

した（5分毎に転倒混和した）。この過程で Saponinは赤血球膜及び Parasitophorous vacuolar (PV)

膜は透過するが、Parasite plasma membrane を損傷せず、膜透過イオン勾配は維持できるので原

虫を損傷することなく、赤血球膜を特異的に破壊し、溶血させる。溶血後、3300 rpm (HITACHI

CF 7D2)、10 分間、4°C で遠心した。さらに、0.15％ Saponin 溶液で 3500 rpm、10 分間、4°C

で遠心し、上清を除去した。再び 0.15% Saponin 溶液で 3700 rpm、10 分間、4°C で遠心する。

次に Saponin 溶液を除去するために ice-cold PBS (-) を用いて 4000 rpm (HITACHI CF 7D2)、10

分間、4°C で遠心し、洗浄した。この洗浄操作を 2 回行った。この洗浄操作の過程で 50 mL 遠

心管 4 本の pellet を 1 本にまとめた。上清を除き、pellet を 15 mL 遠心管に 1.5 mL の

Rehydration/Sample buffer (Bio-Rad; 8 M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10,

0.001% BPB) で洗い出した。Rehydration/Sample buffer には urea が含まれているので 4°C 以下

では urea が析出し、30°C 以上では urea がカルバミル化する恐れがある。よって、その後の操

作は室温で行った。全過程において用いる溶液には Protease Inhibitor Cocktail for Plant Cell and

Tissue Extracts (Sigma) を 1:100 となるように添加した。30 分間室温で静置し、続いて超音波破

砕を Branson Sonifire-250 を用いて行った (条件 ; Duty cycle 40％、Output Control 3.0×5 cycle、1

cycle は 5 回のシグナルで、1 cycle 毎に 30 秒間氷上静置した)。1.7 mL タンパク質 Low binding

チューブに移し、液体窒素中で 5 回凍結融解を行った。再度超音波破砕を同条件で 3 cycle 行

い、15000 g、10 分間、25°C で遠心し、上清を 0.6 mL タンパク質 Low binding チューブに分注

し、-80°C で保存した。二次元電気泳動の直前に 100000 g、1 時間、25°C で超遠心し、不純物

を完全に取り除いた。

２２

2.7.2. タンパク質定量

2.7.1.で調製したマラリア原虫タンパク質 Lysate を RC DC Protein Assay (Bio-Rad) を用いて

定量した。RC DC protein assay は Lowry 法に基づき、界面活性剤だけでなく還元剤を含むサン

プルにも適用可能に改良されており、Urea 等を含むタンパク質サンプルにも応用可能となって

いる。検量線は、Albumin Standard (PIERCE) を用いて 0.2 mg/mL から 1.5 mg/mL のタンパク質

濃度で作成した。

スタンダード、サンプルそれぞれ 25 µLを 1.7 mLタンパク質 Low bindingチューブに入れた。

RC1 reagent、RC2 reagent それぞれ 125 µL を加え vortex し、1 分間室温でインキュベーション

した。15000 g、5 分間、25°C で遠心し、上清を除去した。RC1 reagent を 125 µL、RC2 reagent

を 40 µL 加え vortex し、1 分間室温でインキュベーションした。15000 g、5 分間、25°C で遠心

し、上清を除去し、overnight で pellet を乾燥させた。A’試薬 127 µL を加え vortex し、5 分間室

温でインキュベーションした (A’試薬 ; A 試薬 :S 試薬＝50:1)。DC protein assay B 試薬 1 mL を

加え vortex し、15 分間室温でインキュベーションした。分光光度計 DU7400 (BECKMAN) を

用いて 750 nm の吸光度を測定した。

2.7.3. 二次元電気泳動

i) IPG ストリップの膨潤

マラリア原虫タンパク質 Lysate をタンパク質濃度 80 µg/300 µL となるように希釈し、フォー

カシングトレイ (Bio-Rad) の各レーンに 300 µL 加えた。室温に戻した IPG ReadyStrip pH 3-10

Linear 17 cm (Bio-Rad) からゲルを保護しているカバーフィルムを剥がし、タンパク質 Lysate

を加えたフォーカシングトレイの各レーンにゲル面を下向きにし、気泡が入らないようにセッ

トし、ミネラルオイルを 1.5 mL 重層した。ミネラルオイルは膨潤及びフォーカシング中にゲ

ルの乾燥と二酸化炭素の吸収による pH のシフトを防ぐ役割がある。乾燥した場合、尿素が濃

縮され析出する恐れがある。蓋をしたフォーカシングトレイを PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad) に

セットした。IEF Cell の Rehydration Program を Active に設定し、Active mode 50 V、20°C で 12

時間 IPG strip を膨潤させた。

ii) 一次元目の泳動 ; 等電点電気泳動 (Isoelectric focusing; IEF)

膨潤終了後、ウイック＊ (Bio-Rad) を滅菌 milliQ 水で湿らせ、フォーカシングトレイの白金

線とゲル間に挿入した。フォーカシングトレイに蓋をして IEF Cell にセットし、次に記す条件

で等電点電気泳動を行った。

＊ IPG strip を用いた等電点電気泳動ではサンプル中に含まれる塩、イオン性の成分が多いと

電気泳動中に電圧が上がらない場合があり、ウイック (ろ紙) を電極とゲルの間に挟み込むこ

とでイオン成分の除去が可能となる。

２３

○フォーカシング条件 step 1: 250 V 15 min ; slow

step 2: 10000 V 2 hr ; linear

step 3: 10000 V 50000 V-hr ; rapid

step 4: 500 V 24 hr ; rapid

iii) 平衡化

フォーカシング終了後、フォーカシングトレイから IPG strip を取り出しゲル面を傷付けない

ように余分なミネラルオイルをキムタオルで吸い取った。Equilibration buffer I (Bio-Rad; 6 M

urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 20% Glycerol, 2% (w/v) DTT) を 4 mL/lane 加えたディス

ポーザブルトレイ (Bio-Rad) にゲル面を上にして IPG strip を入れ、室温で 20 分間震盪した。

震盪後、Equilibration bufferⅡ (Bio-Rad; 6 M Urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl pH 8.8, 20%

Glycerol, 2.5% (w/v) Iodoacetamide) 4 mL で、同様に室温で 10 分間震盪した。

iv) 二次元目電気泳動 ; SDS-PAGE

二次元目のゲルは PROTEAN II Ready Gels 12% Tris-HCl (Bio-Rad; ゲルサイズ 160×158 mm)

を用いた。ゲルは室温に戻した後、開封しコームを抜いて milliQ 水で洗いゲルスタンド Any Gel

スタンド (BioRad) に立てかけ固定した。Equilibration buffer II から取り出した IPG ストリップ

を泳動 buffer で軽く洗浄し、キムタオルで余分な Buffer を吸い取った後、IPG strip 用のウェル

にローメルトアガロース ReadyPrepTM Overlay Agarose (Bio-Rad; 0.5% (w/v) low melting point

agarose, 1×Tris/Glycine/SDS buffer, 0.001％BPB) を加えたゲルのウェルにアプライした。マーカ

ー用ウェルにタンパク質マーカーPrecision Plus ProteinTM Standard Plugs, Unstained (Bio-Rad) を

アプライし、再度ローメルトアガロースを流し込み、ゲルの封入及び固定をした。ゲルを泳動

装置 PROTEAN II xi 2-D Cell (Bio-Rad) にセットし、20°C の冷却水を泳動装置のセントラルク

ーリングコア (冷却水循環タンク) に循環させて POWER PACTM 1000 Power Supply (Bio-Rad)

を用いて Tris/Glycine/SDS running buffer (Bio-Rad; 25 mM Tris/192 mM Glycine/0.1% SDS) 中、16

mA/gel、30 分間、24 mA/gel、5 時間の条件で SDS-PAGE を行った。

2.7.4. イメージの検出と解析

ゲルの染色は検出感度が銀染色と同等の 1-10 ngで高い定量性を有する蛍光染色試薬 SYPRO

Ruby Protein Gel Stain (Bio-Rad) を用いて行った。二次元電気泳動終了後のゲルを染色トレイに

入れ、固定液 (10% methanol, 7% acetic acid) 200 mL を加え室温で 30 分間震盪した。固定液を

捨て、SYPRO Ruby Protein Gel Stain を 200 mL 加え、室温で 16 時間震盪した。染色液を捨て、

脱色液 (10% methanol, 7% acetic acid) 200 mL を加え、室温で 1 時間震盪した。脱色後のゲルは

milliQ 水で 30 分以上震盪し、Molecular Imager FX Pro (Bio-Rad) でゲルイメージを検出した。

薬剤非作用時と N-89 作用時又は N-251 作用時のプロテオーム比較解析には二次元電気泳動解

２４

析ソフトウェア PDQuest version 8.0 (Bio-Rad) を用いた。

2.7.5 タンパク質スポットの切り出し

ゲルイメージ上の目的タンパク質スポットに存在するタンパク質を同定するため、目的のス

ポットを EXQuestTM Spot Cutter (Bio-Rad) で切り出し、0.2 mL PCR tube へ入れた。

2.7.6. タンパク質のゲル内消化

切り出したゲルの入った 0.2 mL PCR tube からピペットマンで水を除き、脱水液 (50% (v/v)

CH3CN, 25 mM NH4HCO3) 200 µL を加え、37°C で 30 分間震盪した。脱水液を取り除き、再度

脱水液 200 µL を加え、37°C で 30 分間震盪した。脱水液をほぼ完全に取り除き、穴をあけた蓋

をつけ、15 分間遠心 evaporation した。遠心 evaporation 後、蓋を注意して開け、Trypsin solution

(10 µg/mL Trypsin (Promega), 45 mM NH4HCO3) 50 µL 加え、30 分間氷上静置した。余分な Trypsin

solution を除き、50 mM NH4HCO3を 10 µL 加え、37°C で 4 時間静置した。ゲルの入った tube

から液を取り、新しい 0.2 mL PCR tubeへ移した。ゲルの入った tubeに抽出液 (50% (v/v) CH3CN,

1% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA)) 50 µL 加え、37°C で 30 分間震盪した。液を先程の新しい 0.2

mL PCR tube へ移した。ゲルの入った tube へ再度抽出液 20 µL 加え、37°C で 30 分間震盪し、

液を先程の新しい 0.2 mL PCR tube へ移した。液のみが入った 0.2 mL PCR tube に穴のあいた蓋

をして 3 時間遠心 evaporation し、完全に液体を蒸発させた。遠心 evaporation 後、蓋を閉め-20°C

で保存した。

2.7.7. タンパク質の同定 16)

タンパク質の Trypsin 消化物 (ペプチド混合物) の MS、MS/MS 解析のピークリスト (質量分

析データ) と、データベースに登録されているアミノ酸配列解析データから計算して得られた

仮想の質量分析データとのマッチングによりタンパク質を同定する Peptide Mass Fingerprinting

(PMF) 及び MS/MS ion search を行った。

NCBInr database を用いて検索を行った場合、PMF 及び MS/MS ion search において MASCOT

score がそれぞれ 55 及び 28 よりも大きいとき、有意 (p<0.05) に同定されたと判断した。

Swiss-Prot databaseを用いて検索を行った場合、PMF及びMS/MS ion searchにおいてMASCOT

score がそれぞれ 56 及び 28 よりも大きいとき、有意 (p<0.05) に同定されたと判断した。

MASCOT score は以下の式に基づいて算出された。

Score=-10×logP＊

＊ P は与えられたヒットが無作為事象である絶対確率

HPLC-Chip/MS を用いてタンパク質同定を行った場合、Peptide score が 11 よりも大きいとき

有意 (p<0.05) に同定されたと判断した。

２５

用いた質量分析装置、検索エンジン及びデータベースを以下に記す。

MALDI-TOF/TOF/MS システム ; Autoflex III (Bruker Daltonics)

LC-MS/MS システム ; HPLC-Chip/MS (Agilent Technologies)

検索エンジン ; MASCOT

データベース ; NCBInr (version 2012_04_15, 17848406 sequences, 6126535335 residues;

P.falciparum タンパク質の検索) 又は Swiss-Prot (version 2012_03, 535248 sequences, 189901164

residues; ヒトタンパク質の検索)

2.8. Western blotting

2.8.1. SDS-PAGE

Polyacrylamide gel はゲル濃度が 12.5%、12 ウェル又は 18 ウェルの E-R12.5L (ATTO; ゲルサ

イズ 90×83 mm) を用いた。ゲルプレートからコームを抜き取り Tris/Glycine/SDS running buffer

でウェルを洗浄した。ゲルをラピダス・ミニスラブ電気泳動槽 AE-6500 (ATTO) 泳動槽にセッ

トし、Tris/Glycine/SDS running buffer を泳動槽に加え、sample を各ウェルに 20 µL アプライし

た。タンパク質スタンダードは Chemiluminescent detection 用に ECL DualValue Western Blotting

Markers (Amersham Biosciences) を、SYPRO Ruby Protein Gel Stain 用に Protein Marker Broad

Range (BioLabs) を用いた。電気泳動は定電流 20 mA/Gel、最高電圧 250 V、70 分間の条件で行

った。

2.8.2 Semi-dry blotting

電気泳動終了後の Polyacrylamide gel を Cathode buffer (25 mM Tris, pH 9.4, 40 mM Glycine,

10% methanol) 100 mL に 15 分間浸しゲルの平衡化を行った。ImmobilonTM transfer membrane を

15秒間、100% methanolに浸し、その後 2分間 milliQ水に浸し Anode buffer II (25 mM Tris, pH 10.4,

10% methanol) に 5 分間浸し平衡化を行った。Anode buffer I (0.3 M Tris, pH 10.4, 10% methanol)

にろ紙 2 枚、Anode buffer II にろ紙 1 枚、Cathode buffer にろ紙 3 枚を浸し、Blotting paper を調

製した。平衡化終了後、トランスファーユニット HoeferTM TE77 semi-dry transfer units (Amersham

Biosciences) の Base (Anode) 側に Blotting paper 3 枚 (Anode buffer I に浸したろ紙 2 枚、Anode

buffer II に浸したろ紙 1 枚) 、メンブレン、ゲルの順に置き、さらに Blotting paper 3 枚 (Cathode

buffer に浸したろ紙 3 枚) を重ねて Cover (Cathode) をセットして 0.8 mA/cm2、60 分の条件で

トランスファーを行った。

2.8.3. ブロッキング及び抗体反応

メンブレンを 5% BSA in TBS-T (20 mM Tris, pH7.4, 68 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween 20) で 25°C、

1 時間インキュベ−ションして抗体の非特異的な結合をブロッキングし、TBS-T でメンブレン

２６

を 2 回リンスした。一次抗体を 5% BSA in TBS-T で最適抗体濃度に希釈後、メンブレンに添加

して 4°C、overnight でインキュベーションした。TBS-T でメンブレンを 2 回リンス後、十分量

の TBS-T で洗浄した。（15 分間×1 回、5 分間×3 回）

HRP (Horseradish peroxidase) 標識されている二次抗体を TBS-T で最適抗体濃度に希釈後、メ

ンブレンに添加して 25°C、1時間インキュベーションし、TBS-Tでメンブレンを 2回リンス後、

十分量の TBS-T で洗浄した。（15 分間×1 回、5 分間×3 回）

本実験で用いた一次抗体 ;

・Mouse anti-PfERC mAb ・Anti-BiP antibody sc-33757 (SANTA CRUZ)

・Monoclonal anti-heat shock protein 90 antibody clone AC-16 (Sigma-Aldrich)

本実験で用いた二次抗体 ;

・Anti-Mouse IgG HRP linked whole antibody (from sheep) (Amersham Biosciences)

・Anti-Rabbit IgG HRP linked whole antibody (from donkey) (Amersham Biosciences)

2.8.4. Chemiluminescent detection (化学発光による検出)

メンブレンをラップ上に置き、調製しておいた検出試薬 (ECL plus Western blotting detection

reagents kit (GE Healthcare) の Solution A:Solution B=40:1 で混合) を添加し、5 分間静置後 Versa

Doc Imaging System Model 5000 (Bio-Rad) により撮影し、Quantity One 1-D Analysis Software

(Bio-Rad) を用いて解析した。

2.8.5. ストリッピング

検出後のメンブレンを milliQ 水で wash 後、2 M Glycine buffer (pH2.8) で 10 分間×3 回浸透さ

せ、抗体と抗原を遊離させた後、milliQ 水でメンブレンを wash し、TBS-T で 2 回リンスした

後、2.8.3. ブロッキング及び抗体反応以降の操作を行った。

2.9. PfERC と相互作用するマラリア原虫タンパク質の探索

2.9.1. マラリア原虫タンパク質 Lysate の調製

6 穴培養プレート 4 枚分の原虫を感染率が約 2-3%になるまで GIT 培地で培養し、50 mL 遠心

管を用いて感染赤血球を 3600 rpm、5 分間、4°C で遠心して回収した。遠心後、上清を除去し、

PBS (-) と 0.3% Saponin 溶液 (in PBS (-)) を加え総量を 14 mL とし、転倒混和した(Saponin 終

濃度 0.15％)。転倒混和して溶血後、3600 rpm、5 分間、4°C で遠心した。再び 0.15% Saponin

溶液を加え、3600 rpm、5 分間、4°C 遠心し、上清を除去した後 ice-cold PBS (-)を用いて 3600 rpm、

5 分間、4°C で遠心し、洗浄した。この後、pellet を 1.7 mL タンパク質 Low binding チューブに

移し、ice-cold PBS (-) で 15000 rpm、5 分間、4°C で遠心し再度洗浄した。この操作を 2 回行っ

た。全過程において用いる溶液には Protease Inhibitor Cocktail for Plant Cell and Tissue Extracts

２７

を 1/100 容量となるように添加した。上清を除き、pellet に適量の PBS-T (PBS with 0.1% Tween

2023))又は Tris buffer-Tween 20 (20 mM Tris, pH 8.0, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween 2023)) を加えマラリ

ア原虫を可溶化した後、15000 rpm、5 分間、4°C で遠心し、上清を相互作用解析用 sample とし

た。Ca2+存在の有無による影響を検討するため、タンパク質の抽出は 1 mM Ca2+の非存在下と

存在下の場合で行った。

2.9.2. 免疫沈降

Dynabeads Protein-G (Invitrogen) 50 µL を 1.7 mL タンパク質 Low binding チューブへ加え、遠

心後、上清を除去した。200 µL の anti PfERC mAb in PBS-T を加え、10 分間、rotation した。遠

心し、上清除去後、200 µL PBS-T で wash した。上清除去後にマラリア原虫タンパク質 Lysate

200-1000 µL 加え、室温で 10-60 分間 rotation した。上清 (=unbound sample) を回収し、200 µL

の PBS (-) での Beads の wash を 3 回行った。60 µL の 1×Sample buffer (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8,

2% SDS, 10% Glycerol, 5% 2-Mercaptoethanol, 0.001% BPB) を加え、5 分間 boiling し、上清を免

疫沈降サンプル (=IP sample) として得た。

上記の実験を 1 mM Ca2+の非存在下と存在下の場合で行い、各 sampleを 20 µLずつ泳動した。

Ca2+非存在下の場合のサンプルはタンパク質バンドの分離能向上を目的として、レディーゲ

ル J PII 12.5% (Bio-Rad; ゲルサイズ 160×158 mm) を用いて 16 mA/gel、30 分間、24 mA/gel、5

時間の条件で SDS-PAGE を行った。

Ca2+存在下の場合は 2.8.1.と同様の条件で SDS-PAGE を行った。

2.9.3. MBP (Maltose binding protein)-ΔPfERC

当研究室ではこれまでに PfERC の組換え体 (ΔPfERC) を作製している。熱帯熱マラリア原

虫 FCR-3 株のゲノム DNA から PCR によって、PfERC の遺伝子配列からシグナル配列を除いた

部分 (ΔPfERC) を pMAL-p プラスミドに組み込んだ。ΔPfERC を組み込んだ pMAL-p プラス

ミドを大腸菌に導入し、大腸菌内で MBP-ΔPfERC として大量発現させた。MBP-ΔPfERC にプ

ロテアーゼ Factor Χa (New England Biolabs) を作用させ、ΔPfERC を得た (Figure 9)。

２８

Figure 9. ΔPfERC の作製

ΔPfERCを作製する際、大腸菌内では MBPタグがΔPfERCに結合した状態 (MBP-ΔPfERC) で

大量発現させており、次項 2.9.4. Pull down assay はこの MBP-ΔPfERC を用いて行った。

2.9.4. Pull down assay

Amylose magnetic beads (New England Biolabs) 100 µL を 1.7 mL タンパク質 Low binding チュ

ーブへ加えた。Magnetic Particle Separator (Invitrogen) にセットし、上清を除去した。MBP column

binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH7.4, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 500 µL を加え vortex

し、Magnetic Particle Separator にセットし、上清を除去した。この wash を再度行った。Sample

300 µL を加え、1 時間、4°C で rotation した (Pre-clear)。Pre-clear 後の sample を新しい 1.7 mL

タンパク質 Low binding チューブに移した。wash した新しい Amylose magnetic beads 50 µL へ

MBP-ΔPfERC (または control として MBP) 300 µL を加え 4°C、1 時間で rotation した。Magnetic

Particle Separator にセットし、上清を除去した。Tris buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 0.15 M NaCl) に

よって 3 回 wash した。Pre-clear 後の sample 300 µL を加え、4°C、1 時間で rotation した。Magnetic

Particle Separator にセットし、上清を sample として得た (上清=Pull down 後 sample)。Beads を

Tris buffer によって 3 回 wash した。Beads に 1×Sample buffer 60 µL を加え、5 分間 boiling した。

Magnetic Particle Separator にセットし、上清を sample として得た (=Pull down sample)。

上記の実験を 1 mM Ca2+の非存在下と存在下の場合で行い、各 sample を 20 µL ずつ 2.8.1.と

同様の条件で SDS-PAGE を行った。

2.10. 表面プラズモン共鳴法 (Surface Plasmon Resonance; SPR)

解析は ProteOn XPR36 システム (Bio-Rad) によって行った。GLH Sensor Chip へアミンカッ

プリング法によってΔPfERC 又はコントロールとして MBP を結合させた。ランニング緩衝液に

２９

は HEPES buffer (10 mM HEPES, pH7.4, 0.15 M NaCl, 1 mM CaCl2, 0.1% Tween, 10% DMSO) を用

いた。この HEPES buffer を用いて各環状過酸化物 (N-89, N-251, Artemisinin) を 500、250、125、

62.5、31.2 µM の濃度に希釈し、タンパク質を固定化した Sensor chip 上に流し反応させた。Flow

rate は 50 µL/min、Association 1 min、Dissociation 1 min で行った。

2.11. 電子スピン共鳴法 (Electron Spin Resonance; ESR) を用いたラジカルの検出

4 mM N-89 又は 4 mM N-251 を含む PIPES buffer (20 mM PIPES、pH6.0、0.15 M NaCl、50 mM

DBNBS (3,5-dibromonitrosobenzenesulfonate sodium salt)) へ FeSO4 (in 1 mM HCl) を Fe2+の終濃

度が 5 mM となるように加え、37°C、30 分間インキュベートした。その後、扁平セルへ反応溶

液を満たし、JES-FA100 (JEOL) へセットし ESR を測定した。測定条件を以下に記す。

Power =4.000000 mW Frequency (周波数) =9425.046 MHz Field center =335.500 mT

Sweep width (測定幅) =±5.000 mT Sweep time (測定時間) =15.0 min

Mod. width (変調幅) =0.1000 mT Amplitude (増幅度) =5000.0 Time constant (時定数) =0.03 sec

2.12. PfERC を過剰発現する遺伝子組換え原虫の作製

PfERC を過剰発現する遺伝子組換え原虫は長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野金子修教授

に作製して頂いた。ライフテクノロジーズ株式会社が開発した Gateway DNA クローニング技

術によって PfERC の遺伝子配列を組み込んだプラスミドを作製した。発現用のプロモーター

として、PfERC と同等のプロモーター活性を有する Plasmodium falciparum chloroquine resistance

transporter (PfCRT) のプロモーター 24)を用いた。作製したプラスミドを熱帯熱マラリア原虫

Dd2-attB 株に episomal transfection し、選択薬剤として 25 µg/mL Blasticidin S を作用させ 25)、

PfERC を過剰発現する原虫を得た。Full length の PfERC を発現するプラスミドを組み込んだ遺

伝子組換え原虫を Crt-Full株、Full lengthの PfERCの C末端側に 3つの Ty配列 26) (Saccharomyces

cerevisiae の構造タンパク質由来の 10 個のアミノ酸配列であり、本研究では内在性の PfERC と

区別するために用いた) を付加した PfERC-3Tyを発現するプラスミドを組み込んだ遺伝子組み

換え原虫を Crt-Ty 株とした。

2.13. 長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野研究室でのマラリア原虫培養

培養フラスコを用いて行った。培地及び赤血球は原虫学分野研究室にて調製されている、A

型及び AB 型の血清が含まれている完全培地 (Complete medium; CM)と O 型赤血球を用いた。

培養熱帯熱マラリア原虫は Dd2-attB 株及び Dd2-attB 株にプラスミドを導入した遺伝子組換え

原虫株を用いた。CM を用いて目的の感染率及び HC 値へ調製し、パスツールピペットを用い

て N2/O2/CO2混合ガスを培養フラスコ内に充満させフラスコを密閉し、37°C インキュベータ内

で培養した。感染率はスライドガラスに薄層塗抹標本を作製し、Diff-Quick 染色を行い油浸光

３０

学顕微鏡 (×1000) で計測した。

2.14. 長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野研究室でのマラリア原虫タンパク質 Lysate の調製

6 穴培養プレート 1 枚分の原虫を同調し、非同調のマラリア原虫の感染率が約 2-3%になるま

で CM で培養し、50 mL 遠心管を用いて感染赤血球を 3600 rpm、5 分間、4°C で遠心して回収

した。遠心後、上清を除去し、PBS (-) と 0.3% Saponin 溶液 (in PBS (-)) を加え総量を 14 mL

とし、転倒混和した(Saponin 終濃度 0.15％)。転倒混和して溶血後、3600 rpm、5 分間、4°C で

遠心した。再び 0.15% Saponin 溶液を加え、3600 rpm、5 分間、4°C 遠心し、上清を除去した後

ice-cold PBS (-)を用いて、3600 rpm、5 分間、4°C で遠心し、洗浄した。この後、pellet を 1.7 mL

タンパク質 Low binding チューブに移し、ice-cold PBS (-)で 15000 rpm、5 分間、4°C で遠心し、

再度洗浄した。この操作を 2回行った。全過程において用いる溶液には Protease Inhibitor Cocktail

for Plant Cell and Tissue Extracts を 1/100 容量となるように添加した。上清を除き、pellet と等量

の 2×Sample buffer (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% Glycerol, 10% 2-Mercaptoethanol,

0.002% BPB) と適量の 1×Sample buffer (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% Glycerol, 5%

2-Mercaptoethanol, 0.001% BPB) を加えマラリア原虫を可溶化した後、5 分間 boiling し、原虫

lysate とした。感染率から原虫 Lysate 中の原虫数を計算し、SDS-PAGE において 1 レーンあた

り 1×107 cells 泳動した。

2.15. Real-time PCR

2.15.1. プライマー

PlasmoDB (http://www.plasmodb.org/plasmo/) より熱帯熱マラリア原虫 3D7 株の PfERC 遺伝

子のシークエンスを入手し、当研究室修士 2 年林孝輔氏がプライマー配列を設計した。Table 3

に Real-time PCR に用いたプライマー配列を示す。Seryl-tRNA synthetase gene はマラリア原虫

内在性 control として、今回の RNA 定量結果の補正に用いた。

Table 3. Real-time PCR に用いたプライマー

Primer Sequence (5'→3') Location＊ Product size (bp)

PfERC (PF3D7_1108600)

PfERC-F GATGATGAAATGGCTCTTGA +631→+650

PfERC-R TCGTTTACATTGATTGCTCC +758→+739 128

Seryl-tRNA synthetase, putative (PF3D7_0717700)

PF07_0073-F CCGAACTTGATGACTTTGAA +743→+762

PF07_0073-R CTGCCTGTGATGATATCTTTG +833→+813 91

＊Translation start codon is +1 (3D7 strain)

３１

2.15.2. RNase-free 処理

RNA を扱う実験用の器具、試薬は素手で触れず、ディスポーザブルの手袋を着用し、さら

に唾液が飛ばないようにマスクを着用し、使用する試薬、機器は使用前に RNase-free 処理を行

った。RNase-free 処理の方法は DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) 処理、乾熱滅菌、過酸化水素水処

理等の方法がある。今回使用するガラス器具は 240°C で 4 時間以上乾熱滅菌したものを用い、

ピペットチップ等はガンマ線滅菌済みの DNase-free、RNase-free のものを用いた。また、マイ

クロピペット、遠心機、プラッテ等は RNase AWAY (Molecular Bio Products) で湿らせたキムタ

オルで拭き RNase-free 処理を行った。

2.15.3. Total RNA 抽出

RNeasy Plant Mini Kit および RNase-Free DNase Set (共に QIAGEN 社) を用いて抽出した。感

染率約 2% (HC 値 5%) の非同調の熱帯熱マラリア原虫感染赤血球浮遊液 25 mL を 50 mL 遠心

管に回収し、1700 rpm (HITACHI)、10 分間、4°C で遠心し、上清を除去した後、8.5 mL の 0.15%

Saponin in PBS (-) を加え、5 分毎に転倒混和しながら氷上で 15 分間溶血させた。全量が 35 mL

になるように ice-cold PBS (-) を添加し、3000 rpm (HITACHI CF 7D2)、10 分間、4°C で遠心す

る洗浄操作を 3 回行った。

以下の操作は RNase free の場所で行った。Pellet に 2-Mercaptoethanol を終濃度 10 µL/mL と

なるように添加した Buffer RLT 450 µL を加え、よく混和した後、QIAshredder spin column に全

量アプライし、15000 rpm (TOMY MRX-150)、2 分間、室温で遠心した。QIAshredder spin column

を通過した流出液を回収し、99.5% ethanol を流出液の半量加えて混和後、全量を RNeasy mini

spin column に移した。10000 rpm (TOMY MRX-150)、15 秒間室温で遠心し、流出液を捨てた。

Column に Buffer RW1 を 350 µL 加え、10000 rpm (TOMY MRX-150)、15 秒間室温で遠心し、カ

ラム内のメンブレンに DNaseⅠ incubation mix (10 µL DNaseⅠ stock solution, 70 µL Buffer

RDD) を 80 µL 加え、15 分間室温で静置することで DNA を分解除去した。その後、カラムに

Buffer RW1 を 350 µL 加え、10000 rpm (TOMY MRX-150)、15 秒間室温で遠心し、流出液を捨

てた。新しい 2 mL collection tube に RNeasy mini spin column を移した後、Buffer RPE を 500 µL

加え、10000 rpm (TOMY MRX-150)、15 秒間室温で遠心した。再び新しい 2 mL collection tube

に RNeasy mini spin columnを移した後、Buffer RPEを 500 µL加え、15000 rpm (TOMY MRX-150)、

2 分間室温で遠心し、1.5 mL の RNase-free eppendorf tube に RNeasy mini spin column を移し、

column 中のメンブレンに RNase-free water を 12 µL 加え、１分間室温で静置後、10000 rpm

(TOMY MRX-150)、1 分間室温で遠心した。再度 column 中のメンブレンに RNase-free water を

11 µL 加え、１分間室温で静置後、10000 rpm (TOMY MRX-150)、１分間室温で遠心し、total RNA

溶液を得た。

３２

2.15.4. RNA の定量

2.15.3.で抽出した Total RNA 溶液を RNase-free water で希釈し、260 nm の吸光度を測定して

定量を行った。Real-time PCR を行うために RNA 溶液を最終濃度 50 ng/µL に希釈した。

2.15.5. First-Strand cDNA 合成

Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads (GE Healthecare; dNTP, FPLCpure M-MuLV Reverse

Transcriptase, RNAguard, BSA, Reaction Buffer) を用いた。このキットには 0.5 mL のチューブ内

に cDNA 合成に必要な試薬がビーズの状態で添加されており、RNA 及びプライマーを加える

だけで cDNA 合成が行えるため使用が簡便である。

2.15.4.で調製した 50 ng/µL の RNA 溶液を PCR チューブに分注し、65°C、10 分間インキュベ

ーションし RNA を変性させた後、2 分間氷中で急冷した。First-Strand Reaction Mix Beads が添

加されている 0.5 mL チューブに RNA 溶液 28 µL (=RNA 量 1.4 µg)、0.1 µg/µL Oligo dT primer

(Invitrogen) を 5 µL 加えた。1 分間室温で静置後、混和し 37°C、1 時間インキュベーションし

逆転写反応を行った。これを cDNA 溶液とし、100 倍希釈したものを template cDNA として用

いた。

2.15.6. Real-time PCR

LightCycler および LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (共に Roche Diagnostics)を

用い、SYBR Green 法により検出した。SYBR Green I は 2 本鎖 DNA (dsDNA) の副溝に結合す

る色素であり、dsDNA と結合している時のみに蛍光を発するため特異性が高い。

以下に Reaction mix および PCR 反応のプログラムを示す。Denaturation の温度を 95°C、

Annealing の温度を 57°C、Elongation の温度を 72°C に設定した。得られたデータの解析および

融解曲線分析は LightCycler Software Ver.3.5 を用いた。

Table 4. Reaction mix の組成

µL/tube Final concentration

H2O (PCR grade) 9.4 -

MgCl2 stock solution (25 mM) 2.4 3 mM (Total 4 mM)

10×LightCycler FastStart

Reaction Mix SYBR Green I 2

contains Fast Taq DNA polymerase,

reaction Buffer, dNTP mix, SYBR

Green I dye, 1 mM MgCl2

Forward primer (10 µM) 0.6 0.3 µM

Reverse primer (10 µM) 0.6 0.3 µM

Template cDNA 5 -

Total 20 -

３３

Table 5. PCR program 1, Denaturation

Cycle Program Data Value

Cycles 1

Analysis Mode None

Temperature Targets Segment 1

Target Temperature (°C) 95

Incubation Time (sec) 600

Temperature Transition Rate (°C/sec) 20.0

Second Targets Temperature (°C) 0

Step Size (°C) 0.0

Step Delay (Cycles) 0

Acquisition Mode None

Table 6. PCR program 2, Amplification


Cycles 40

Analysis Mode Quantification

Temperature Targets Segment 1 Segment 1 Segment 1

Targets Temperature (°C) 95 57 72

Incubation Time (sec) 10 10 5

Temperature Transition Rate (°C /sec) 20.0 20.0 20.0

Second Targets Temperature (°C) 0 0 0

Step Size (°C) 0.0 0.0 0.0

Step Delay (Cycles) 0 0 0

Acquisition Mode None None Single

３４

Table 7. PCR program 3, Melting curves


Cycles 1

Analysis Mode Melting Curve

Temperature Targets Segment 1 Segment 1 Segment 1

Targets Temperature (°C) 95 65 95

Incubation Time (sec) 0 15 0

Temperature Transition Rate (°C /sec) 20.0 20.0 0.1

Second Targets Temperature (°C) 0 0 0

Step Size (°C) 0.0 0.0 0.0

Step Delay (Cycles) 0 0 0

Acquisition Mode None None Continuous

Table 8. PCR program 4, Cooling


Cycles 1

Analysis Mode None

Temperature Targets Segment 1

Target Temperature (°C) 40

Incubation Time (sec) 30

Temperature Transition Rate (°C /sec) 20.0

Second Targets Temperature (°C) 0

Step Size (°C) 0.0

Step Delay (Cycles) 0

Acquisition Mode None

PCR 後、段階希釈した control sample において目的とする遺伝子が一定の増幅産物量に達す

るのに必要とした cycle 数 (Ct 値) を縦軸に、control sample の希釈濃度を横軸にプロットし、

検量線を作成した。この検量線に assay sample における目的遺伝子の Ct 値を代入し、相対的な

定量を行った。

2.16. 免疫蛍光染色による局在観察

遺伝子組換え原虫内における PfERC の局在を知るために、anti- PfERC mAb を用いた免疫蛍

光染色を行った。さらに、核の染色には DAPI (4’, 6’-diamidino-2-phenylindole) を、ER の染色

３５

には小胞体マーカーとして使用される BiP の抗体として、熱帯熱マラリア原虫の BiP と相同性

の高いシロイヌナズナの抗 BiP 抗体を用いて多重染色を行い、PfERC の局在を蛍光顕微鏡で観

察した。

2.16.1. PEI-coated cover glass の作製

milliQ水で 50% PEI (polyethyleneimine) solution を希釈し、1% PEI (polyethyleneimine) solution

を調製した。カバーガラス上に 1% PEI solution をアプライし、室温で 1 時間静置し、milliQ 水

で 3 回 wash した後、overnight で乾燥させ、免疫蛍光染色実験に用いた。

2.16.2. 免疫蛍光染色法

24 穴培養プレートを用いて、感染率約 2%になるまで CM でマラリア原虫を培養した。1 well

分のマラリア原虫を 1.7 mL タンパク質 Low binding チューブに回収し、200 g、25°C、1 分間遠

心 (TOMY MRX-150) し、上清を取り除き、37°C に温めた PBS (-) で wash した。マラリア原

虫を 37°C に温めた 4%パラホルムアルデヒド+0.0075%グルタルアルデヒド in PBS (-) に懸濁

し、室温で 30 分間転倒混和し、固定した。PBS (-) で wash 後、0.1% Triton X-100 in PBS (-) に

懸濁し、室温で 10 分間転倒混和し、透過処理を行った。これによって抗体が原虫内に入り、

抗原抗体反応が可能となる。透過処理後、0.1 mg/mL Sodium borohydride (NaBH4) に懸濁し、

アルデヒドの還元を行った。PBS (-) で wash 後、3% BSA in PBS (-) に懸濁し、室温で 1 時間

転倒混和し、ブロッキングを行った。これによって抗原抗体の非特異的な結合を阻害した。一

次抗体を最適抗体濃度になるように加え、室温で 1 時間転倒混和を行った。反応終了後、遠心

により上清を除去した。その後、3% BSA in PBS (-) に再懸濁し、最適抗体濃度に希釈した二

次抗体溶液を添加し、PEI-coated cover glass にアプライし、室温で 1 時間静置した。Cover glass

を PBS (-) で wash し、1 µg/mL DAPI をアプライし 5 分間静置して核染色を行い、PBS (-) で 3

回 wash 後 Prolong Antifade Kit (Invitrogen) を用いてスライドガラスにマウントし、2-3 時間乾

燥させた後マニキュアで封入し、蛍光顕微鏡で観察した。

本実験で用いた一次抗体 ;

・Mouse monoclonal anti-PfERC antibody clone 2F11 ・Mouse anti-Ty antibody (和光純薬)

・Rabbit polyclonal anti-BiP antibody sc-33757 (SANTA CRUZ)

本実験で用いた二次抗体 ;

・Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG antibody (Invitrogen)

・Alexa Fluor 594 chicken anti-rabbit IgG antibody (Invitrogen)

蛍光試薬の波長

・DAPI; 励起波長 ; 360 nm、蛍光波長 ; 460 nm

・Alexa Fluor 488; 励起波長 490 nm、蛍光波長 520 nm

３６

・Alexa Fluor 594; 励起波長 590 nm、蛍光波長 617 nm

2.17. 遺伝子組換え原虫の薬剤感受性試験

長崎大学熱帯医学研究所では 2.4.と同様の方法で行ったが、一部改変を加えた。以下にその

内容を記す。

遺伝子組換え原虫の薬剤感受性試験は 25 µg/mL Blasticidin Sの薬剤プレッシャー存在下で行

った。選択薬剤存在下では、ネガティブコントロールにおいても原虫増殖がある程度抑制され、

化合物作用時との差を顕著に観察できない可能性が考えられたので化合物作用開始時の初期

感染率は 0.6%とした。また、培地も CM を用いた。

上記以外の条件は全て 2.4.と同様とした。

３７

3章結果

３８

3.1. N-89 及び N-251 の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害の解析

マラリア原虫へ N-89 又は N-251 を作用させると細胞質や核の縮小する形態変化を起こした

原虫が現れた (Figure10)。このようなマラリア原虫は培地を交換し薬剤を除去しても再び増殖

することはなく、ステージの移行も起こらず死に向かっていく状態である。

Figure 10. 形態変化を起こしたマラリア原虫

Ring、Early trophozoite、Middle trophozoite、Late trophozoite、Schizont 期へ同調したそれぞれ

のマラリア原虫に 3 µM の N-89 又は N-251 を作用させ、その後のマラリア原虫のステージの

移行を観察した (Figure 11)。

Figure 11. N-89 作用後のマラリア原虫ステージ移行

３９

Ring 期に 3 µM N-89 を作用させると、作用後の時間が経過するにつれて Early trophozoite、

Middle trophozoite 期へとステージが移行した。しかしその後、形態変化を起こした原虫が観察

され、作用後 48 時間には全ての原虫が形態変化を起こした。

Early trophozoite 期作用では、Middle trophozoite 期までステージが移行したがその後は形態

変化を起こした原虫が観察され、作用後 24 時間には全ての原虫が形態変化を起こした。

Middle trophozoite 期作用では、6 時間後に Late trophozoite 期の原虫が全体の原虫数の約 20%

になったが、その後 Late trophozoite 期の原虫の割合は増加することなく、作用後 48 時間には

全ての原虫が形態変化を起こした。

Late trophozoite 期作用では、6 時間後から形態変化を起こした原虫が観察されたが一部の原

虫は Schizont 期へと移行した。その後、Schizont 期の原虫は Ring 期を経て、Middle trophozoite

期まで移行したが、それ以上ステージが進行することはなく、72 時間後には全ての原虫が形態

変化を起こした。

Schizont 期作用では、6 時間後に Ring 期の原虫が観察され、その割合は約 60%であった。そ

の後、Early trophozoite、Middle trophozoite 期の原虫が観察されたが、作用後 72 時間には全て

の原虫が形態変化を起こした。

マラリア原虫に 3 µM N-251 を作用させた場合でも同様の結果が得られた (Figure 12)。

４０

Figure 12. N-251 作用後のマラリア原虫ステージ移行

以上の結果から、N-89 及び N-251 は熱帯熱マラリア原虫の Trophozoite 期において特異的に

増殖を阻害することが分かった。

3.2. N-89 又は N-251 作用時のプロテオーム解析

N-89及び N-251は Trophozoite期において特異的にマラリア原虫の増殖を阻害したことより、

Trophozoite 期に作用点があると考えられる。Middle 又は Late trophozoite 期のマラリア原虫に

化合物を作用させた場合、その作用点を過ぎてしまう可能性が考えられるため、本研究では

Early trophozoite 期のマラリア原虫に化合物を作用させ、N-89 又は N-251 作用時に変動するマ

ラリア原虫タンパク質をプロテオーム解析の手法を用いて調べた。3 µM N-89 又は N-251 を

Early trophozoite 期の原虫に作用させ、形態変化を起こした原虫が観察され始める薬剤作用後 6

時間の時点でマラリア原虫タンパク質 Lysate を調製した。Early trophozoite 期の原虫に DMSO

を作用させ、6 時間後に調製したマラリア原虫タンパク質 Lysate をコントロールサンプルとし

た。これらのサンプルを用いて薬剤作用時と非作用時に変動するタンパク質をプロテオーム解

４１

析によって網羅的に調べた。

3.2.1. N-89 作用時に変動するタンパク質

二次元電気泳動によってタンパク質をゲル上に分離し比較解析した結果、N-89 作用によっ

て Fold change 1.5 以上増加したタンパク質スポット及び N-89 作用時にのみ検出されたタンパ

ク質スポットは 99 個あった (Figure 13)。N-89 作用によって Fold change 1.5 以上減少したタン

パク質スポット及び N-89 作用時に消失したタンパク質スポットは 67 個あった (Figure 14)。こ

れらタンパク質スポットを切り出し、タンパク質を同定した結果を Table 9-12 に示す。

3 µM N-89 を 6 時間作用させた結果、Fold change 1.5 以上増加したタンパク質スポット及び

N-89 作用時にのみ検出されたタンパク質スポットから、代謝に関わる Phosphoethanolamine

N-methyltransferase、s-adenosylmethionine synthetase、Ornithine aminotransferase などが同定され

た。Fold change 1.5 以上減少したタンパク質スポット及び N-89 作用時に消失したタンパク質ス

ポットからは多くのシャペロンタンパク質や 14-3-3 protein、Endoplasmic reticulum-resident

calcium binding protein などが同定された。また、機能未知のタンパク質も多く同定された。

４２

Figure 13. N-89作用によって Fold change 1.5以上増加したタンパク質スポット及び N-89作用時

にのみ検出されたタンパク質スポット (N-89 作用時サンプル泳動ゲル ; n=3、p<0.05)

４３

Figure 14. N-89作用によって Fold change 1.5以上減少したタンパク質スポット及び N-89作用時

に消失したタンパク質スポット (コントロールサンプル泳動ゲル ; n=3、p<0.05)

４４

Table 9. N-89作用時に増加したタンパク質

PMF MS/MS (MALDI) MS/MS (Nano-LC)

Spot No. Protein name Spiecies Acc. no.a Fold change Seq. cov. (%) Score Seq. cov. (%) Score Seq. cov. (%) Score

1 Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 1.9 Not id.1 2 134 N.D.

Heat shock protein 70 homologue P. falciparum 124506906 18 91 11 271 N.D. 2

Heat shock cognate 71kDa protein Human P11142 1.6

15 60 1 84 N.D.

3 Flotillin-2 Human Q14254 1.7 20 66 14 107 N.D.

4 Flotillin-2 Human Q14254 2.0 Not id.1 12 126 N.D.

5 Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 2.2 Not id.1 2 206 N.D.


7 Transmission-blocking target antigen s230 P. falciparum 14801059 2.4 3 63 Not id.2 N.D.

Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 Not id.1 2 167 N.D. 8

Glutaminase kidney isoform, mitchondrial Human O94925 3.8

13 62 Not id.2 N.D.

HAP protein P. falciparum 124808181 Not id.1 9 75 N.D. 9

Band 3 anion transport protein Human P02730 2.0

Not id.1 1 39 N.D.



12 Tropomodulin-1 Human P28289 1.6 Not id.1 5 74 N.D.

13 Tropomodulin-1 Human P28289 1.5 Not id.1 10 106 N.D.

Phosphoethanolamine N-methyltransferase P. falciparum 124513590 Not id.1 16 82 N.D. 14

Zinc finger protein 175 Human Q9Y473 2.2

9 65 Not id.2 N.D.

Actin, cytoplasmic 1 Human P60709 Not id.1 10 91 N.D. 15

Ankyrin-1 Human P16157 3.0

Not id.1 0 47 N.D.

Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 Not id.1 1 106 N.D. 16


Not id.1 0 35 N.D.

17 Not identified 4.7 Not id.1 Not id.2 N.D.

４５






Dematin Human Q08495 N.D. N.D. 9 45.65

Ankyrin-1 Human P16157 N.D. N.D. 1 34.37

Hemoglobin subunit beta Human P68871 N.D. N.D. 17 33.57 20

Pyridoxine/pyridoxal 5-phosphate biosynthesis enzyme P. falciparum 86171362

4.1

N.D. N.D. 19 86.14

Hemoglobin subunit beta Human P68871 N.D. N.D. 23 49.81

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human P04406 N.D. N.D. 12 40.99

Hemoglobin subunit alpha Human P69905 N.D. N.D. 16 30.96 21

Heat shock protein 101, putative P. falciparum 124803903

2.0

N.D. N.D. 3 30.49

22 Tropomyosin alpha-3 chain Human P06753 2.1 Not id.1 7 60 N.D.



25 Band 3 anion transport protein Human P02730 2.2 Not id.1 1 43 N.D.


Flotillin-1 Human O75955 Not id.1 2 64 N.D. 27

Protein transport protein Sec23A Human Q15436 2.5

Not id.1 1 32 N.D.

28 Plasmodium exported protein P. falciparum 124505615 2.1 Not id.1 2 35 N.D.

29 Erythrocyte band 7 integral membrane protein Human P27105 1.6 Not id.1 21 236 N.D.

30 Peroxiredoxin-2 Human P32119 2.0 24 58 14 252 N.D.




４６





35 Ras-related protein Rap-2a Human P10114 2.3 Not id.1 5 53 N.D.





Actin, cytoplasmic 2 Human P63261 N.D. N.D. 13 62.1 40

Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 3.0

N.D. N.D. 2 63.98

41 Surfin 4.2 P. falciparum 298716834 2.3 15 62 Not id.2 N.D.



QF122 antigen P. falciparum 124802200 2.8

N.D. N.D. 2 42.59

Heat shock protein 70 homologue P. falciparum 124506906 Not id.1 3 121 N.D. 44

Cysteine-rich surface protein P. falciparum 237664910 1.6

6 62 Not id.2 N.D.


Band 3 anion transport protein Human P02730 Not id.1 2 88 N.D.

Tropomyosin alpha-1 chain Human P09493 Not id.1 3 51 N.D. 46

Putative tropomyosin alpha-3 chain-like protein Human A6NL28

4.9

Not id.1 6 36 N.D.

Band 3 anion transport protein Human P02730 Not id.1 4 148 N.D. 47

Zinc finger protein OZF Human Q15072 1.8

13 58 Not id.2 N.D.

48 Hemoglobin subunit beta Human P68871 10.7 N.D. N.D. 17 32.24

Plasmodium exported protein, unknown function P. falciparum 124513774 N.D. N.D. 16 53.05 49

Hemoglobin subunit beta Human P68871 2.6

N.D. N.D. 17 31.56

４７




50 Ankyrin-1 Human P16157 1.5 Not id.1 1 111 N.D.

51 Cytosolic phospholipase A2 epsilon Human Q3MJ16 12.0 6 59 Not id.2 N.D.


53 Not identified 3.9 N.D. N.D. Not id.3



56 S-adenosylmethionine synthetase P. falciparum 124506992 3.2 Not id.1 7 70 N.D.

Ornithine aminotransferase P. falciparum 12005661 Not id.1 9 61 N.D.

Surface protein, Pf113 P. falciparum 124808655 9 71 Not id.2 N.D. 57

Nucleolin Human P19338

3.7

14 64 Not id.2 N.D.

Thioredoxin peroxidase 1 P. falciparum 124809308 N.D. N.D. 13 35.93

Peroxiredoxin-1 Human Q06830 N.D. N.D. 29 76.24

55 kDa erythrocyte membrane protein Human Q00013 N.D. N.D. 4 52.96

Flavin reductase Human P30043 N.D. N.D. 11 33.03

58

Hemoglobin subunit beta Human P68871

3.5

N.D. N.D. 17 32.97

Heat shock cognate 71 kDa protein Human P11142 N.D. N.D. 15 134.4



Flotillin-1 Human O75955 N.D. N.D. 8 50.65

59


3.7

N.D. N.D. 14 33.97



４８




Erythrocyte membrane protein 1 P. falciparum 323392639 15 59 Not id.2 N.D. 62


Not id.1 15 70 N.D.


Hemoglobin subunit beta Human P68871 Not id.1 21 113 N.D. 64

Hemoglobin subunit alpha Human P69905 4.5

Not id.1 10 97 N.D.


Erythrocyte band 7 integral membrane protein Human P27105 N.D. N.D. 28 120.81 66


N.D. N.D. 17 35.15

67 Surface protein P. falciparum 237664934 2.4 N.D. N.D. 3 33.95

68 DNA/RNA-binding protein, putative P. falciparum 124802054 3.5 N.D. N.D. 29 34.32

Flavin reductase Human P30043 Not id.1 7 58 N.D. 69

Integrin beta-4 Human P16144 5.2

4 57 Not id.2 N.D.



Not id.1 1 72 N.D.



73 Plasmodium exported protein P. falciparum 124512176 2.5 17 65 Not id.2 N.D.

74 Peroxiredoxin-2 Human P32119 62.8 N.D. N.D. 13 32.62


Conserved plasmodim protein, unknown function P. falciparum 124511652 2.7

N.D. N.D. 28 31.53


77 Putative ubiquitin-conjugating enzyme E2 N-like Human P61088 2.9 N.D. N.D. 13 31.15

４９




Erythrocyte membrane protein band 4.2 Human P16452 N.D. N.D. 6 56.53 78

Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 5.4

N.D. N.D. 1 48.97

79 Erythrocyte membrane protein band 4.2 Human P16452 85.7 N.D. N.D. 3 37.38




Peroxiredoxin-2 Human P32119 N.D. N.D. 9 74.19


Heat shock 70 kDa protein P. falciparum 124512406

4.1

N.D. N.D. 9 74.75




8.5

N.D. N.D. 7 53.31

85 Hemoglobin subunit beta Human P68871 12.8




89 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase P. falciparum 124810131 13.3 Not id.1 11 54 N.D.

Acc. No., accession number; Seq. cov., sequence coverage; N.D., Not done; Not id.1, Not identified by PMF; Not id.2, Not identified by MS/MS ion search (MALDI); Not id.3, Not identified by MS/MS ion search (Nano-LC)

a Accession number from Swiss-prot database (Human) or NCBI database (P. falciparum)

５０

Table 10. N-89作用によって現れたタンパク質



Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 N.D. N.D. 3 134.76

Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 N.D. N.D. 2 69.04

Ankyrin-1 Human P16157 N.D. N.D. 1 41.51 90

26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4 Human P55036 N.D. N.D. 7 34.83

91 Not identified Not id.1 Not id.2 N.D.


ATP synthase subunit d, mitochondrial Human O75947 N.D. N.D. 30 86.85

Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 N.D. N.D. 2 47.23 92


93 Not identified N.D. N.D. Not id.



Appeared

N.D. N.D. 17 31.17

Phosphoglycerate kinase 1 Human P00558 N.D. N.D. 15 98.63


Hemoglobin subunit alpha Human P69905 N.D. N.D. 16 33.65

Heat shock 70 kDa protein 6 Human P17066 N.D. N.D. 4 32.36

Catalase Human P04040 N.D. N.D. 6 31.87

Heat shock 70 kDa protein P. falciparum 124512406 N.D. N.D. 18 174.23

Heat shock protein hsp70 homologue P. falciparum 124804504 N.D. N.D. 8 74.46

95

Conserved Plasmodim protein, unknown function P. falciparum 124513666

Appeared

N.D. N.D. 12 63.59

５１





Alcohol dehydrogenase [NADP+] Human P14550 N.D. N.D. 15 68.76

Poly(rC)-binding protein 1 Human Q15365 N.D. N.D. 6 36.94

GMP reductase 1 Human P36959 N.D. N.D. 10 34.1

96



98 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase P. falciparum 4103985 N.D. N.D. 23 106.24

99 4-methyl-5(B-hydroxyethyl)-thiazol monophosphate

biosynthesis enzyme P. falciparum 86171677

Appeared

N.D. N.D. 29 92.07



５２

Table 11. N-89作用時に減少したタンパク質





Surface protein, Pf113 P. falciparum 124808655

0.2

N.D. N.D. 3 50.29

2 Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124511866 0.4 N.D. N.D. 5 47.4

3 Endoplasmic reticulum-resident calcium binding protein P. falciparum 124803623 0.2 N.D. N.D. 7 36.08

4 Band 3 anion transport protein Human P02730 0.2 N.D. N.D. 2 31.28





9 Ankyrin-1 Human P16157 0.6 Not id.1 N.D. 2 66.72


11 Endoplasmic reticulum-resident calcium binding porotein P. falciparum 124803623 0.6 Not id.1 3 60 N.D.

12 Endoplasmic reticulum-resident calcium binding porotein P. falciparum 124803623 0.5 Not id.1 3 85 N.D.

13 14-3-3 protein homologue P. falciparum 296005038 0.2 Not id.1 9 90 N.D.


15 Conserved protein, unknown function P. falciparum 124809152 0.2 N.D. N.D. 7 41.67


Stress-70 protein, mitchondrial Human P38646 Not id.1 2 42 N.D.

Heat shock cognate 71 kDa protein Human P11142 Not id.1 3 36 N.D. 17


0.6

Not id.1 7 81 N.D.

５３




Heat shock protein hsp70 homologue P. falciparum 124804504 23 98 9 252 N.D. 18

Armadillo repeat-containing X-linked protein 1 Human Q9P291 0.6

14 57 Not id.2 N.D.

19 60 kDa heat-shock protein PfHsp60 P. falciparum 124802320 0.7 36 106 20 146 N.D.

20 Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124803479 0.4 10 56 Not id.2 N.D.


22 Variant surface antigen rifin 2 P. falciparum 5901725 0.1 30 70 Not id.2 N.D.

Dematin Human Q08495 N.D. N.D. 24 136.63 23

Flotillin-1 Human O75955 0.4

N.D. N.D. 12 90.79

24 Ubiquitin conjugating enzyme, putative P. falciparum 124506851 0.4 35 64 Not id.2 N.D.



Heat shock protein 101, putative P. falciparum 124803903

0.3

N.D. N.D. 6 49.35

26 DNAJ domain protein, putative P. falciparum 86171763 0.6 Not id.1 2 44 N.D.


Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124504965 N.D. N.D. 23 54.01 28

ClpB protein, putative P. falciparum 124512450 0.3

N.D. N.D. 3 41.61

29 GrpE protein P. falciparum 225719934 0.6 Not id.1 9 132 N.D.

Putative erythrocyte membrane protein P. falciparum 237664726 9 58 Not id.2 N.D.

Putative erythrocyte membrane protein P. falciparum 238630195 9 56 Not id.2 N.D. 30

Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124808070

0.4

Not id.1 3 30 N.D.

31 Hemoglobin subunit beta Human P68871 0.3 Not id.1 21 50 N.D.

５４






34 Protein 4.1 Human P11171 0.4 Not id.1 1 81 N.D.

35 Conserved Plasmodium protein P. falciparum 124802173 0.5 Not id.1 6 47 N.D.



38 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase P. falciparum 124803860 0.4 Not id.1 19 138 N.D.

Actin, cytoplasmic 2 Human P63261 N.D. N.D. 19 92.03

Erythrocyte membrane protein band 4.2 Human P16452 N.D. N.D. 6 47.22 39

Endoplasmin homolog precursor, putative P. falciparum 124806075

0.4

N.D. N.D. 4 36.32



Heat shock protein 60 P. falciparum 124802320 N.D. N.D. 17 93.88 40

Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124809214

0.5

N.D. N.D. 6 68.77

Ribonuclease inhibitor Human P13489 N.D. N.D. 15 101.85



Flotillin-1 Human O75955

0.3

N.D. N.D. 8 53.99

42 Erythrocyte membrane protein 1 P. falciparum 323393686 0.4 40 58 Not id.2 N.D.



５５





Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124511866 N.D. N.D. 10 61.93 46

60S ribosomal protein P0 P. falciparum 124804377 0.1

N.D. N.D. 9 48.11

47 DNA/RNA-binding protein Alba, putative P. falciparum 124512500 0.1 N.D. N.D. 12 34.34

48 Not identified 0.3 N.D. N.D. Not id.




52 Plasmodium exported protein, unknown function P. falciparum 124505193 0.4 N.D. N.D. 11 33.19

53 Protein 4.1 Human P11171 0.1 N.D. N.D. 4 51.46

Catalase Human P04040 N.D. N.D. 27 207.46 54


N.D. N.D. 3 87.84





５６

Table 12. N-89作用によって消失したタンパク質







61 Not identified N.D. N.D. Not id.3

62 Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 N.D. N.D. 2 58.58

63 Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 N.D. N.D. 1 37.83


65 Hemoglobin subunit beta Human P68871 N.D. N.D. 17 32.37


67 Fibrinogen beta chain Human P02675

Dissapeared

N.D. N.D. 22 148.71



５７

3.2.2 N-251 作用時に変動するタンパク質

二次元電気泳動によってタンパク質をゲル上に分離し比較解析した結果、N-251 作用によっ

て Fold change 1.5以上増加したタンパク質スポット及び N-251作用時にのみ検出されたタンパ

ク質スポットは 113 個あった (Figure 15)。N-251 作用によって Fold change 1.5 以上減少したタ

ンパク質スポット及び N-251作用時に消失したタンパク質スポットは 56個あった (Figure 16)。

これらタンパク質スポットを切り出し、タンパク質を同定した結果を Table 13-16 に示す。

3 µM N-251 を 6 時間作用させた結果、Fold change 1.5 以上増加したタンパク質スポット及び

N-251 作用時にのみ検出されたタンパク質スポットから、Actin-1、26S proteasome subunit 4、

surface protein、Pf113、Plasmodium exported protein などが同定された。Fold change 1.5 以上減

少したタンパク質スポット及び N-251 作用時に消失したタンパク質スポットからは多くのシ

ャペロンタンパク質や 14-3-3 protein、Endoplasmic reticulum-resident calcium binding protein など

が同定された。また、機能未知のタンパク質も多く同定された。

５８

Figure 15. N-251作用によって Fold change 1.5以上増加したタンパク質スポット及び N-251作用

時にのみ検出されたタンパク質スポット

(N-251 作用時サンプル泳動ゲル; n=3、p<0.05)

５９

Figure 16. N-251作用によって Fold change 1.5以上減少したタンパク質スポット及び N-251作用

時に消失したタンパク質スポット (コントロールサンプル泳動ゲル; n=3、p<0.05)

６０






3 Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 3.6 4 92 2 351 N.D.




Actin-1 P. falciparum 113224 Not id.1 2 59 N.D.

Actin, cytoplasmic 1 Human P60709 Not id.1 14 302 N.D.

Beta-actin-like protein 2 Human Q562R1 Not id.1 9 151 N.D.

Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124513636 8 57 Not id.2 N.D.

POTE ankyrin domain family member E Human Q6S8J3 9 104 Not id.2 N.D.

POTE ankyrin domain family member F Human A5A3E0 8 90 Not id.2 N.D.

POTE ankyrin domain family member I Human P0CG38 7 72 Not id.2 N.D.

Actin, alpha cradiac muscle 1 Human P68032 15 71 Not id.2 N.D.

7

Actin, alpha skeletal muscle Human P68133

2.5

15 71 Not id.2 N.D.




26S proteasome regulatory subunit 4, putative P. falciparum 124802104 N.D. N.D. 7 41.22



26S protease regulatory subunit 4 Human P62191 N.D. N.D. 9 63.87

11

Actin, cytoplasmic 1 Human P60709

3.9

N.D. N.D. 5 32.29

６１





13 Actin, cytoplasmic 1 Human P60709 4.1 Not id.1 5 91 N.D.


14-3-3 protein, putative P. falciparum 296005038 Not id.1 9 123 N.D. 15

Heat shock 70 kDa protein P. falciparum 124512406 3.2

Not id.1 1 37 N.D.


Proteasome subunit alpha type-5 Human P28066 1.8

N.D. N.D. 12 40.84

Endonuclease domain-containing 1 protein precursor Human O94919 Not id.1 6 133 N.D. 17

Erythrocyte membrane protein P. falciparum 78041787 4.0

30 56 Not id.2 N.D.



N.D. N.D. 1 33.12


Tropomyosin alpha-3 chain Human P06753 4.3

Not id.1 7 42 N.D.


21 Calpain small subunit 1 Human P04632 2.2 Not id.1 5 60 N.D.



24 Actin, cytoplasmic 1 Human P60709 3.1 Not id.1 4 80 N.D.

25 Rho GDP-dissociation inhibitor 2 Human P52566 7.5 N.D. N.D. 28 80.02

26 Protein 4.1 Human P11171 2.4 Not id.1 1 42 N.D.


28 Not identified 10.3 Not id.1 1 77 N.D.

６２





Heat shock cognate 71 kDa protein Human P11142 N.D. N.D. 3 30.31 29

Conserved Plasmodium protein P. falciparum 124802011

3.7

N.D. N.D. 9 30.18







36 Band 3 anion transport protein Human P02730 9.0 7 66 5 109 N.D.




40 Erythrocyte band 7 integral membrane protein Human P27105 3.1 27 106 20 171 N.D.



43 Tropomodulin-1 Human P28289 4.9 N.D. N.D. 4 37.28





48 Flotillin-1 Human O75955 4.2 12 56 8 61 N.D.

６３




Flotillin-1 Human O75955 16 59 5 64 N.D. 49


Not id.1 1 33 N.D.

Flotillin-1 Human O75955 Not id.1 11 95 N.D.

Ankyrin-1 Human P16157 Not id.1 0 42 N.D. 50

Protein transport protein Sec23A Human Q15436

2.3

Not id.1 1 33 N.D.

Flotillin-1 Human O75955 16 70 8 103 N.D. 51


Not id.1 1 41 N.D.


Dematin Human Q08495 N.D. N.D. 15 78.56 52

S-formylglutathione hydrolase Human P10768

2.2

N.D. N.D. 12 46.22

53 Small heat shock protein, putative P. falciparum 124512832 2.3 Not id. 9 31 N.D.

Carbonic anhydrase 1 Human P00915 N.D. N.D. 15 68.75

Acyl-protein thioesterase 1 Human O75608 N.D. N.D. 13 56.69

Protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase Human P22061 N.D. N.D. 8 32.47 54


2.9

N.D. N.D. 17 31.53

55 Ankyrin-1 Human P16157 3.3 N.D. N.D. 2 62.88

Erythrocyte band 7 integral membrane protein Human P27105 4.1 N.D. N.D. 26 114.95 56



Low molecular weight phosphotyrosine phosphatase Human P24666 Not id.1 5 41 N.D. 58

Leucine-rich repeat-containing protein 24 precursor Human Q50LG9 2.4

Not id.1 1 33 N.D.

59 Erythrocyte membranee protein band 4.2 Human P16452 2.3 Not id.1 3 97 N.D.


６４






Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 N.D. N.D. 3 110.85 63


N.D. N.D. 2 66.28



66 Actin, cytoplasmic 2 Human P63261 4.9 N.D. N.D. 10 49.49


Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 5.8

N.D. N.D. 1 53.18

Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 Not id.1 1 98 N.D.


Protein FAM124B Human Q9H5Z6

4.5

26 62 Not id.2 N.D.

Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 Not id.1 N.D. 2 70.29

cAMP-dependent protein kinase type l-alpha regulatory subunit Human P10644 N.D. N.D. 12 64.65


Erythrocyte band 7 integral membrane protein Human P27105

5.9

N.D. N.D. 6 32.66


Band 3 anion transport protein Human P02730 N.D. N.D. 7 78.4



70


20.3

N.D. N.D. 7 32.91

６５






Actin, cytoplasmic 2 Human P63261

9.2

N.D. N.D. 8 38.19

72 Prohibitin Human P35232 7.2 28 58 21 71 N.D.



Erythrocyte membrane protein band 4.2 Human P16452 16.2

N.D. N.D. 5 49.11

Surface protein. Pf113 P. falciparum 124808655 Not id.1 0 54 N.D. 75

Trypsin-1 Human P07477 6.2

Not id.1 8 33 N.D.



Plasmodium exported protein P. falciparum 124505615 N.D. 2 27 N.D. 78

Erythrocyte band 7 integral membrane protein Human P27105 7.5

N.D. 17 120 N.D.


80 Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 4.5 N.D. N.D. 3 110.97



Not id.1 4 56 N.D.






６６




Programmed cell death protein 6 Human O75340 Not id.1 5 33 N.D.

Band 3 anion transport protein Human P02730 Not id.1 3 30 N.D.

GDP-mannose 4, 6 dehydratase Human O60547 19 60 Not id.2 N.D. 87


5.1

20 63 Not id.2 N.D.




Tropomyosin alpha-3 chain Human P06753 16.7

Not id.1 3 36 N.D.

91 Plasmodium exported protein, unknown function P. falciparum 124505193 4.8 N.D. N.D. 9 32.73

92 Erythrocyte membrane protein band 4.2 Human P16452 44.9 N.D. N.D. 3 39.93








Actin cytoplasmic 2 Human P63261 N.D. N.D. 8 32.88 100


N.D. N.D. 17 30.55



V-type proton ATPase subunit E 1 Human P36543 N.D. N.D. 28 106.91 103


N.D. N.D. 17 33.2

６７




104 55 kDa erythrocyte membrane protein Human Q00013 38.8 Not id.1 8 109 N.D.

105 Erythrocyte band 7 integral membrane protein Human P27105 7.5 Not id.1 Not id.2 14 60.71


RNA binding protein, putative P. falciparum 124507026 3.9

34 64 Not id.2 N.D.



６８




107 Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 Not id.1 1 101 N.D.

108 Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 Not id.1 1 32 N.D.


Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] Human P14550 23 58 Not id.2 N.D.




113 Not identified

Appeared

Not id.1 Not id.2 N.D.



６９




1 Not identified 0.6 N.D. N.D. Not id3

2 Not identified 0.2 N.D. N.D. Not id3


4 14-3-3 protein homologue P. falciparum 296005038 0.6 Not id.1 6 97 N.D.

5 Cochaperonin P. falciparum 124513410 0.4 Not id.1 11 136 N.D.

6 40S ribosomal protein S12, putative P. falciparum 124504807 0.4 Not id.1 16 74 N.D.


Spectrin alpha chain, erythrocyte Human P02549 N.D. N.D. 3 164.51 8

Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124507064 0.5

N.D. N.D. 15 52.58

9 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase-loke protein 1 Human Q96QU6 0.4 10 70 Not id.2 N.D.


Heat shock 70 kDa protein P. falciparum 124512406 N.D. N.D. 5 46.26



Protein 4.1 Human P11171

0.1

N.D. N.D. 4 44.61

７０







Tropomodulin-1 Human P28289 N.D. N.D. 16 72.24

Flotillin-2 Human Q14254 N.D. N.D. 12 66.57


12

Band 3 anion transport protein Human P02730

0.1

N.D. N.D. 1 31.06

Heat shock protein 70 (HSP70) homologue P. falciparum 124506906 13 11 9 252 N.D. 13

Heat shock cognate 71 kDa protein Human P11142 0.4

Not id.1 1 49 N.D.

14 Heat shock protein hsp70 homologue Pfhsp70-3 P. falciparum 11127605 0.4 16 69 6 115 N.D.

26S protease regulatory subunit 7 Human P35998 N.D. N.D. 18 118.29



Erythrocyte membrane protein band 4.2 Human P16452 N.D. N.D. 5 55.83

Flotillin-2 Human Q14254 N.D. N.D. 9 45.64


Annexin A7 Human P20073 N.D. N.D. 5 39.62

15

Alpha-adducin Human P35611

0.5

N.D. N.D. 4 36.64

７１




Chaperonin, cpn60 P. falciparum 258597535 N.D. N.D. 9 90.38

T-complex protein 1 subunit beta Human P78371 N.D. N.D. 13 66.45

55 kDa eruthrocyte membrane protein Human Q00013 N.D. N.D. 8 56.55 16

Beta-adducin Human P35612

0.3

N.D. N.D. 2 32.8

17 Plasmodium exported protein P. falciparum 124505615 0.3 N.D. N.D. 8 41.38





18

Ankyrin-1 Human P16157

0.4

N.D. N.D. 1 30.62

19 Catalase Human P04040 0.4 Not id.1 5 79 N.D.

20 55 kDa erythrocyte membrane protein Human Q00013 0.5 Not id.1 5 50 N.D.



Fibrinogen beta chain Human P02675 N.D. N.D. 7 42.81 21

Protein 4.1 Human P11171

0.3

N.D. N.D. 3 32.82



Fibrinogen beta chain Human P02675

0.3

N.D. N.D. 5 30.29

55 kDa erythrocyte membrane protein Human Q00013 N.D. N.D. 12 85.45 23


N.D. N.D. 2 53.79

７２




Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124513666 N.D. N.D. 14 59.17

Phosphoglycerate kinase P. falciparum 124506998 N.D. N.D. 3 42.26


Porphobilinogen deaminase Human P08397

0.3

N.D. N.D. 6 35.6


26S protease regulatory subunit 10B Human P62333 N.D. N.D. 13 64.46

Mannose-1-phosphate guanyltransferase alpha Human Q96IJ6 N.D. N.D. 6 33.61 25


0.2

N.D. N.D. 23 32.96

26 Dematin Human Q08495 0.1 Not id.1 5 97 N.D.

27 Dematin Human Q08495 0.5 14 60 6 69 N.D.

QF122 antigen P. falciparum 124802200 N.D. N.D. 2 45.32

Dematin Human Q08495 N.D. N.D. 16 97

Desmoplakin Human P15924 N.D. N.D. 1 55.13


28

Flotillin-1 Human O75955

0.0

N.D. N.D. 7 34.13

29 Dematin Human Q08495 0.5 15 57 11 67 N.D.

30 Conserved Plasmodium protein, unknown function P. falciparum 124513666 0.2 Not id.1 5 73 N.D.


Phosphoglycerate kinase P. falciparum 124506998 N.D. N.D. 7 32.55 31

26S protease regulatory subunit 10B Human P62333

0.3

N.D. N.D. 12 63.15

32 DNAJ domain protein, putative P. falciparum 86171763 0.6 N.D. N.D. 14 75.56

７３




60S ribosomal protein P0 P. falciparum 124804377 N.D. N.D. 15 54.65

Eukaryotictranslation initiation factor, putative P. falciparum 124512470 N.D. N.D. 11 31.95



33

Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 Human O43488

0.4

N.D. N.D. 6 31.22





Ribose-phosphate pyrophosphokinase 1 Human P60891 N.D. N.D. 16 101.54 37

Ankyrin-1 Human P16157

0.3

N.D. N.D. 1 36.88

38 Co-chaperone GrpE, putative P. falciparum 258597308 0.5 Not id.1 3 92 N.D.



Hemoglobin subunit alpha Human P69905 0.2

N.D. N.D. 23 42.38

Heat shock 70 kDa protein P. falciparum 124512406 N.D. N.D. 9 81.91 41

Heat shock protein hslv P. falciparum 258597527 0.4

N.D. N.D. 17 58.7

42 Spectrin beta chain, erythrocyte Human P11277 0.2 N.D. N.D. 0 31.89

43 Endoplasmic reticulum-resident calcium binding protein P. falciparum 124803623 0.2 10 26 4 41 N.D.

44 60S ribosomal protein P0 P. falciparum 124804377 0.3 N.D. N.D. 16 67.72

７４




Mature parasite-infected erythrocyte surface antigen P. falciparum 3044185 N.D. N.D. 3 63.24 45


N.D. N.D. 2 45.35


47 Fibrinogen beta chain Human P02675 0.1 N.D. N.D. 17 111.16

48 Dematin Human Q08495 0.5 N.D. N.D. 29 145.56


Hemoglobin subunit beta Human P68871 61 77 29 166 N.D.

Carbonic anhydrase 2 Human P00918 Not id.1 11 61 N.D. 50

Hemoglobin subunit alpha Human P69905

0.4

Not id.1 10 52 N.D.

GTP-binding nuclear protein ran/tc4 P. falciparum 124803934 57 123 18 90 N.D.

Heat shock 70 kDa protein P. falciparum 124512406 Not id.1 4 32 N.D.

Stress-70 protein, mitchondrial Human P38646 Not id.1 2 32 N.D. 51

Coilin Human P38432

0.5

22 64 Not id.2 N.D.



７５

Table 16.N-251作用によって消失したタンパク質





HAP protein P. falciparum 124808181 N.D. N.D. 10 50.27 54



Heat shock 70kDa protein P. falciparum 124512406 N.D. N.D. 8 70.61 56

DNAJ domain protein, putative P. falciparum 86171763

Dissappeared

N.D. N.D. 14 66.21



７６

3.2.3. 標的候補タンパク質の選抜

N-89 と N-251 は作用機序が共通していると考えられるため、N-89 作用時及び N-251 作用時

両方の場合に共通して変動するタンパク質が作用機序に関与している可能性が高いと考え、

3.2.1.及び 3.2.2.で共通して同定されたタンパク質を選別した。その結果、増加したタンパク質

が 3 種類、減少したタンパク質が 8 種類あった (Table 17)。

Table 17. N-89 作用時及び N-251 作用時両方の場合に共通して変動したマラリア原虫タンパク質

Accession

No.a Protein name Biological process (function)

Theoretical

pI

Theoretical

MW (kDa)

124505615 Plasmodium exported protein Unknown 8.82 35.6

124808655 Surface protein, Pf113 Invasion 4.21 112.6 Increased

124512406 Heat shock 70 kDa protein Protein folding 5.33 73.9

124803623 Endoplasmic reticulum-resident calcium binding

protein

Unknown (Calcium ion

binding) 4.25 39.4

296005038 14-3-3 protein homologue Signal transduction 4.56 30.2

124507064 Conserved Plasmodium protein, unknown function Unknown 5.31 24.7

124512406 Heat shock 70 kDa protein Protein folding 5.33 73.9

86171763 DNAJ domain protein, putative Protein folding 8.23 44.7

124504965 Conserved Plasmodium protein, unknown function Unknown 8.31 30.5

124505615 Plasmodium exported protein Unknown 8.82 35.6

Decreased

124804377 60S ribosomal protein P0 Translation 6.70 35.0

a NCBI primary accession number

Figure 17. 標的候補タンパク質の選抜

Plasmodium exported protein 及び Heat shock 70 kDa protein は増加したタンパク質としても減

７７

少したタンパク質としても同定された。これらタンパク質は増加した場合と減少した場合、そ

れぞれにおいて異なるスポットから同定されている。これは N-89 及び N-251 のラジカル産生

に関連する反応、もしくは原虫死のシグナルによって変動が起こり、増減両方の現象が起こっ

たと考えられる。

N-89 作用時及び N-251 作用時両方の場合に共通して変動したタンパク質の中で、これまで

に N-89 誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質として同定されているもの 16)が 3 種

類 (14-3-3 protein、Heat shock 70 kDa protein (PfHSP70)、Endoplasmic reticulum-resident calcium

binding protein (PfERC)) あった (Figure 17)。PfERC は Figure 18 に示すようにアフィニティー

カラムを用いた解析において二次元電気泳動ゲル上で最も intensityの強いタンパク質スポット

として検出されている。

Figure 18. アフィニティーカラムを用いて溶出したタンパク質サンプルの泳動結果

及び PfERC スポットの拡大図

この結果は、N-89 誘導体との親和性は PfERC が最も強いために濃縮されて intensity が強く

なった可能性を示している。そのため、N-89 及び N-251 の標的タンパク質として PfERC が最

も有力であると私は考えた。プロテオーム解析より、PfERC は N-89 及び N-251 の作用によっ

て減少しており (Figure 19)、N-89 及び N-251 の結合が PfERC の減少に関与していることが考

えられた。

Figure 19. N-89 及び N-251 作用による PfERC スポット intensity の減少

3.3. PfERC と相互作用するマラリア原虫タンパク質の探索

７８

3.3.1. 免疫沈降を用いた PfERC と相互作用するタンパク質の探索

Anti PfERC mAb を用いてΔPfERC 又はマラリア原虫タンパク質 Lysate を免疫沈降した。

PfERC は Ca2+結合性タンパク質であるため、Ca2+の有無によって共沈するタンパク質に違いが

あるかも検討した。Ca2+非存在下及び Ca2+存在下の結果をそれぞれ Figure 20 及び 21 に示す。

Figure 20. Ca2+非存在下で anti PfERC mAb を用いた免疫沈降

A: Western blotting によって PfERC を検出した結果

B: SYPRO Ruby Protein Gel Stain によって染色した SDS-PAGE の結果

Figure 20 の Ca2+非存在下の結果より、western blotting (Figure 20A) において矢頭で示してい

る位置のバンドが IgG、PfERC、ΔPfERC であった。Figure 20B の SDS-PAGE の結果より、マ

ラリア原虫タンパク質 Lysate を免疫沈降したサンプルの 2 番レーンにおいて IgG と PfERC 以

外の特異的なタンパク質バンドは検出されなかった。このことから Ca2+非存在下では PfERC

には相互作用するタンパク質が存在しない可能性が示唆された。

Figure 21 の Ca2+存在下の結果より、western blotting (Figure 21A)、SDS-PAGE (Figure 21B) に

おいて IgG が検出された。免疫沈降で anti PfERC mAb に PfERC が結合していれば約 39 kDa の

矢頭で示した位置に PfERC のバンドが検出されるはずであるが、Figure 21 に示すように該当

するバンドは検出されなかった。このことより、Ca2+を添加すると PfERC は抗体に結合しない

ことが分かった。このことは Ca2+が結合することによって PfERC の立体構造が変化し、PfERC

が抗体に結合できなくなったためと考えられた。

７９

Figure 21. Ca2+存在下で anti PfERC mAb を用いた免疫沈降

A: Western blotting によって PfERC を検出した結果

B: SYPRO Ruby Protein Gel Stain によって染色した SDS-PAGE の結果

3.3.2. Pull down assay による PfERC と相互作用するタンパク質の探索

MBP-ΔPfERC を用いた Pull down assay では Amylose magnetic beads に結合する部分は MBP

である。そのため、Ca2+存在下での PfERC の立体構造変化は無視でき、Ca2+存在下において

PfERC と相互作用するタンパク質を見出せると考えた。

MBP-ΔPfERC 又は MBP を Amylose magnetic beads に結合させてマラリア原虫タンパク質

Lysate を Pull down したサンプルで SDS-PAGE を行い、SYPRO Ruby Protein Gel Stain によって

染色した。Ca2+非存在下及び Ca2+存在下の結果を Figure 22 に示す。

Figure 22. マラリア原虫タンパク質 Lysate を用いた Pull down assay

A: Ca2+非存在下、B: Ca2+存在下

８０

Figure 22 に示した約 79 kDa と約 40 kDa の位置にそれぞれ MBP-ΔPfERC と MBP が検出さ

れた。MBP-ΔPfERC を Amylose magnetic beads に結合させてマラリア原虫タンパク質 Lysate

を Pull down したサンプルの 1 番レーンでは、コントロールとして MBP を Amylose magnetic

beads に結合させてマラリア原虫タンパク質 Lysate を Pull down したサンプルの 2 番レーンと

比べて特異的なタンパク質バンドは検出されなかった。これは Ca2+の有無に関わらず違いは無

かった。

今回行った免疫沈降と MBP pull down assay の結果では、Ca2+の有無に関わらず PfERC と相

互作用するタンパク質を見出せなかった。

3.4. 表面プラズモン共鳴法を用いたΔPfERC と N-89、N-251 との親和性測定

これまでに PfERCは N-89誘導体 (N-346) と親和性を有するマラリア原虫タンパク質として

同定されている。PfERC が N-89 及び N-251 と親和性を有するという直接的なエビデンスが無

いため、ΔPfERC と環状過酸化物 (N-89, N-251, Artemisinin) との親和性を表面プラズモン共鳴

法 (Surface Plasmon Resonance; SPR) によって解析した。

SPR を用いてΔPfERC と環状過酸化物 (N-89, N-251, Artemisinin) との親和性を測定した結果

を Figure 23 に示す。

Figure 23. ΔPfERC と環状過酸化物の親和性評価

Figure 23 より、センサーチップ上へ結合させたΔPfERC へ N-89 を反応させた場合、SPR シ

グナルが検出され、KD=3.8×10-3 (M) であった。N-251 を反応させた場合でも SPR シグナルが

検出され、KD=1.6×10-4 (M) であった。一方、Artemisinin を反応させた場合では SPR シグナル

は検出されず、ΔPfERC は Artemisinin と親和性を示さなかった。

コントロールとして MBP と環状過酸化物との親和性を測定した結果を Figure 24 に示す。

８１

Figure 24. MBP と環状過酸化物の親和性評価

MBP と環状過酸化物を反応させた場合では SPR シグナルは検出されず、環状過酸化物は

MBP と親和性を示さなかった。

これらの結果より、N-89 及び N-251 はΔPfERC と親和性を有することが分かった。

3.5. 電子スピン共鳴法を用いた N-89 及び N-251 のラジカル産生の解析

N-89 及び N-251 と同様の環状過酸化物である Artemisinin は鉄の存在下でラジカルを産生す

るという報告がある 12)。しかし、その論文の中での測定条件は有機溶媒系であり、生理的環境

とは大きく異なるものである。そのため、本研究では生理的環境に近い条件で N-89 及び N-251

がラジカルを産生し得るかどうかを検討した。

ESR では静磁場中に置いた不対電子のマイクロ波の吸収を観測しており、この吸収スペクト

ルは不対電子近傍の原子核のスピンによって影響を受ける。不対電子が核スピンをもつ原子に

捕捉されている場合、スペクトルは何本かに分裂する。この分裂したスペクトルを超微細構造

と呼び、分裂の大きさと本数から原子の種類、分子の構造が分かる。不対電子の電子スピンに

影響する代表的な核スピンに窒素核と水素核がある。窒素核の影響により、吸収スペクトルは

等間隔の 3 本に分裂し、水素核では等間隔の 2 本の信号に分裂する。この超微細構造の解析に

よって産生されたラジカル種の予測も行った。

N-89 又は N-251、DBNBS、FeSO4を PIPES buffer (pH 6.0) の水溶液中で混合し、37°C、30

分間、無酸素条件で incubate した後に ESR を測定した結果を Figure 25 に示す。

８２

Figure 25. 鉄存在下で N-89 が産生するラジカルの ESR による測定

結果より、複数本のシグナルが検出され、これらの超微細構造を解析した。本研究ではスピ

ントラップ剤に DBNBS を用いている (Figure 26A)。

Figure 26. DBNBS (A) 及び DBNBS スピンアダクト (B) の構造式

DBNBS 由来のスピンアダクトは不対電子のある酸素原子のα位に窒素がある (Figure 26B)。

そのため、DBNBS を用いた ESR 測定では必ず吸収スペクトルは 3 本以上に分裂する。Figure 25

の破線で示した 3 本のシグナルは各ピークの距離が等間隔であるため、一つのラジカル由来で

あると考えることができる。シグナルが 3 本であることから不対電子に影響する核スピンは窒

素以外に存在せず、破線で示した 3 本のシグナルは Figure 27 A 及び B に示すアルコキシルラ

ジカル又は第三級炭素ラジカルから形成されたスピンアダクト由来であることを示している。

Figure 27. 形成されたスピンアダクトの構造式

８３

Figure 25 の実線で示した 6 本のシグナルは各ピークの距離が等間隔であるため、一つのラジ

カル由来であると考えることができる。シグナルが 6 本であることから、窒素核の影響で分裂

した 3 本のシグナルにさらに水素核が影響を与え、各シグナルがそれぞれ 2 本に分裂し、6 本

になったと考えられる。このことより、実線で示した 6 本のシグナルは Figure 27C に示す第二

級炭素ラジカルから形成されたスピンアダクト由来であることを示している。以上より、N-89

は鉄の存在下でアルコキシルラジカル、第三級炭素ラジカル及び第二級炭素ラジカルを産生す

ることが示された。

これは N-251 を反応させた場合でも同様の結果が得られた。

3.6. PfERC 過剰発現原虫の作製と薬効評価

本研究の化合物作用時のプロテオーム解析より PfERC が最も有力な標的候補タンパク質で

あることを見出した。PfERC は N-89 及び N-251 と親和性を有すること、さらにプロテオーム

解析で減少したことより、化合物の産生するラジカルによる作用で PfERC が減少することに

より原虫が死に至っていると考えられた。そのため、原虫内で PfERC を過剰発現させること

によって薬剤の作用にどのような影響が出るかを検討した。

3.6.1. PfERC の mRNA 発現量の解析

PfERC 過剰発現原虫から mRNA を抽出し、cDNA を調製した。その cDNA を用いた Real-time

PCR によって PfERC の mRNA 量を解析した結果 (n=2) を Figure 28 に示す。

Figure 28. 遺伝子組換え原虫の PfERC の mRNA レベル

結果より、Crt-Full 株と Crt-Ty 株の PfERC の mRNA 量は Control 株に比べて約 2 倍に増加し

ていた。

3.6.2. PfERC のタンパク質レベルの解析

PfERC 過剰発現原虫からタンパク質 Lysate を調製し、anti PfERC mAb を用いた western

blotting によって PfERC 又は PfERC-3Ty の発現を確認した (Figure 31)。

８４

Figure 29. Western blotting による PfERC 又は PfERC-3Ty の検出

Figure 29 の結果より、PfERC-3Ty は内因性 PfERC より数 kDa 高い位置に検出された。この

ことより、マラリア原虫に導入したプラスミドは正常に機能し、タンパク質を発現していると

考えられる。PfERC を検出したメンブレンをストリッピングし、PfHSP90 を reprobe した。

PfHSP90 を loading control として Quantity One 1-D Analysis Software (Bio-Rad) を用いて各株の

PfERC 及び PfERC-3Ty を定量解析した結果 (n=2) を Figure 30 に示す。

Figure 30 遺伝子組換え原虫の PfERC タンパク質レベル

Figure 30 より、Crt-Full 株の PfERC 量は Control 株の 2.1 倍であった。Crt-Ty 株においては、

内在性の PfERC は Control 株とほぼ同量であったが、PfERC-3Ty と内在性 PfERC の総量は

Control 株の PfERC 量の 1.8 倍であった。

以上より、PfERC を過剰発現させた遺伝子組換え原虫では mRNA、タンパク質の両方におい

て約 2 倍の発現となっていることが分かった。

3.6.3. 免疫蛍光染色法を用いた PfERC と PfERC-3Ty の局在観察

遺伝子組換え原虫内での PfERC 及び PfERC-3Ty の局在を観察した結果をそれぞれ Figure 31

及び 32 に示す。

８５

Figure 31. PfERC のマラリア原虫内局在

８６

Figure 32. PfERC 3Ty のマラリア原虫内局在

Figure 31 の PfERC の局在観察結果より、全ての株において PfERC がマラリア原虫内に局在

していることが確認できた。小胞体マーカーである PfBiPと PfERCの蛍光を重ね合わせた結果、

黄色の場所が観察され、PfERC と PfBiP が共局在することが示された。この結果は Control 株、

Crt-Full 株、Crt-Ty 株の 3 株において PfERC の局在に違いは無かった。

Figure 32 の PfERC-3Ty の局在観察結果より、PfERC-3Ty を発現している Crt-Ty 株でのみ

PfERC-3Ty が発現していることが確認できた。小胞体マーカーである PfBiP と PfERC-3Ty の蛍

８７

光を重ね合わせた結果、黄色の場所が観察され、PfERC-3Ty と PfBiP が共局在することが示さ

れた。

これらの結果より、過剰発現させた PfERC 及び PfERC-3Ty は Control 株と変わらず PfBiP と

共局在していることが分かった。このことから、過剰発現させた PfERC は内在性の PfERC と

同様の機能を果たしている可能性が高いと考えられる。

3.6.4. 薬効評価

PfERC 過剰発現原虫及び Control 株の原虫の N-89 及び Artemisinin の薬剤感受性を測定した

結果 (n=2) を Figure 33 に示す。

Figure 33. N-89 及び Artemisinin の薬剤感受性測定

N-89 の感受性を測定した結果、N-89 を 1×10-7 M 作用させた場合、Control 株での Growth は

45%であったのに対して、Crt-Full 株及び Crt-Ty 株では Growth は 100%であった。このことか

ら、PfERC 過剰発現原虫の N-89 の感受性が低下したことが分かった。

一方で、これらマラリア原虫の Artemisinin に対する感受性を測定した結果、今回の測定濃

度において Control 株、Crt-Full 株、Crt-Ty 株の 3 株で感受性に変化は無かった。PfERC の過剰

発現が Artemisinin の感受性に影響するかどうかを検討するためには、今後 3.0×10-8 M の濃度

での Growth を検討する必要がある。

８８

4章考察

８９

本研究によって、新規抗マラリア薬として有望な環状過酸化物 N-89 及び N-251 の抗マラリ

ア作用機序の一端が示された。

N-89 及び N-251 の熱帯熱マラリア原虫におけるステージ特異的阻害の解析から、N-89 及び

N-251 は Ring、Schizont 期の原虫は阻害しないが、Trophozoite 期のマラリア原虫に対して特異

的にステージ移行を阻害し、形態変化を起こさせることが分かった。これはマラリア原虫のラ

イフサイクルの中でも N-89 及び N-251 の作用点が Trophozoite 期にあることを示唆している。

そのため私は N-89及び N-251は Trophozoite期のマラリア原虫タンパク質をターゲットとして

いるのではないかと考えた。本研究において選抜している標的候補タンパク質 PfERC は

Trophozoite期に増加することが PlasmoDB (http://www.plasmodb.org/plasmo/) に登録されている

マイクロアレイ解析の結果から分かる (Figure 34)。

Figure 34. マラリア原虫のステージ移行と PfERC mRNA 量の関係

すなわち、Merozoite 期から Trophozoite 期にかけて増加する PfERC を阻害すると Schizont

期以降にステージ移行することができなくなり、さらにこの PfERC がマラリア原虫の生存に

必須であれば、このタンパク質へのダメージがマラリア原虫に対して致死的に作用して形態変

化を起こし、死滅するものと考えられ、PfERC が N-89、N-251 の標的タンパク質である可能性

を支持するものと考える。

これまでの先行研究で N-89 誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質が 6 種類同定

されており 16)、N-89 及び N-251 もこれらタンパク質に作用し、マラリア原虫に何らかの影響

を与えていると考えている。そのため薬剤作用時に変動するマラリア原虫タンパク質の解析を

行うことによって、N-89 誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質に対する作用に起

因するマラリア原虫タンパク質の増減及び翻訳後修飾などの変化を解析することができると

考えた。その結果、約 70 種類のマラリア原虫タンパク質が薬剤作用によって増減した。N-89

９０

と N-251 はその構造及び抗マラリア活性の類似性から作用機序が共通していると考えられる。

そのため、N-89 作用時及び N-251 作用時両方の場合に共通して変動する原虫タンパク質を選

別した結果、N-89 作用時と N-251 作用時で共通して増減したタンパク質は 11 種類であった。

選別されなかったタンパク質は約 60 種類あったが、これは N-89 と N-251 の構造のわずかな違

い (-OH 基の有無) により、化合物が作用点に達するまでの時間などの違いが生じ、化合物作

用時の違いへとつながった可能性が考えられる。3 種類 (14-3-3 protein、PfHSP70、PfERC) の

タンパク質は N-89 誘導体とも親和性を有するタンパク質であり、標的タンパク質である可能

性が示唆された。14-3-3 protein は、Al-Khedery B らの報告 27) では、Ring 期からタンパク質レ

ベルで増加し始め、Early trophozoite 期から Middle trophozoite 期で最大となり、その後減少し

ていくとされており、Trophozoite 期においてシグナル伝達等の重要な機能を果たしていると考

えられる。PfHSP70 は、PlasmoDB のマイクロアレイ解析のデータより、転写量が赤血球侵入

後から Trophozoite 期にかけてほぼ一定であり、Schizont 期になると減少するため、赤内期初期

から後期にかけてのタンパク質フォールディングに特に関わっていると考えられる。PfERC は

Figure 34 でも述べたように、Merozoite 期から Trophozoite 期にかけて増加し、アフィニティー

カラムを用いた解析においても最も intensityの強いタンパク質スポットとして検出されている

ため (Figure 18)、本研究では PfERC が N-89 及び N-251 の標的タンパク質として最も有力であ

ると考えた。プロテオーム解析から PfERC は Figure 14 において spot no.3, 11, 12 の三カ所 (そ

れぞれの分子量は約 39, 30, 27 kDa) で同定されている。Spot no. 3 から同定された PfERC はそ

の分子量から Full length であることを示している。Spot no. 11 から質量分析によって同定され

たアミノ酸配列は PfERC の C 末端側であり、spot no. 12 から同定されたアミノ酸配列は N 末

端側であった。このことから、PfERC には複数の isoform が存在する可能性が示唆された。

PfERC は本研究のプロテオーム解析から N-89 又は N-251 の作用によって減少するタンパク

質であること、さらに SPR 解析から N-89 及び N-251 と親和性を有することが分かった。また、

当研究室の平成 22 年度修了生秀野勇人氏の修士論文より、N-89 を作用させても PfERC の

mRNA レベルはコントロールと比べて変わらないという結果が得られている。平成 22 年度修

了生小山貴彦氏の修士論文では、N-89 又は N-251 作用後の PfERC 量のタンパク質レベルでの

経時的変化を anti PfERC mAb を用いた western blotting によって解析している。その研究から、

薬剤作用 6 時間後から PfERC が減少するということが明らかになっている。これらのことか

ら、PfERC は薬剤の作用によってタンパク質レベルで減少すると考えられる。この減少する原

因として 2 つのことが考えられる。

1) 産生されたラジカルによる直接的な PfERC の分解

PfERC は N-89 及び N-251 と親和性を有するために、N-89 及び N-251 由来のアルコキシルラ

ジカルが PfERC 近傍で産生されることが考えられる。このようなアルコキシルラジカルは直

９１

接的に PfERC のペプチド結合を切断することも考えられるが、アルコキシルラジカルが周囲

の水分子や酸素分子と反応してヒドロキシルラジカル (OH・) やスーパーオキシドアニオン

(O2・) も産生し得ることも容易に想像できる。このようなラジカルはタンパク質から水素分子

を引き抜き、タンパク質上にラジカルを作り、ペプチド結合を切断する反応を起こすことが報

告されている 28)。PfERC近傍でこのような反応が起これば PfERCのペプチド結合が切断され、

分解・減少することにつながると考えられる。

2) ラジカルによる PfERC の変性に起因する分解

同様の環状過酸化物である Artemisinin 系薬剤は鉄の存在下でアルコキシルラジカルを産生

し、自身のα位炭素原子とβ位炭素原子の間の単結合を切断し、炭素中心ラジカルを産生する

ことが分かっている 29)。さらに、その炭素中心ラジカルがマラリア原虫タンパク質と反応する

ことによってタンパク質をアルキル化するという報告もある 30)。N-89 及び N-251 も同様に第

一級炭素ラジカルを産生することが分かっており 31)、本研究の ESR によるラジカル検出結果

からも第二級炭素ラジカルと第三級炭素ラジカルを産生することが示唆されている。このこと

より、N-89 及び N-251 由来の炭素中心ラジカルが PfERC をアルキル化している可能性が考え

られる。

タンパク質がラジカルによる攻撃を受け、反応しやすい位置を占めるアミノ酸残基にラジカ

ルが生じ、重合化することも考えられる 28)。通常のタンパク質ではアミノ酸残基に生ずるラジ

カルは反応性が高く、大きな変性を伴うことが予想できる。これと同様の現象が PfERC にも

起こり、重合化が起こり、変性した PfERC が蓄積する可能性が考えられる。

マラリア原虫において、原虫内でのタンパク質分解機構はほとんど調べられていない。2012

年にマラリア原虫の Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) 機構について Chung

らより初めて報告され 32)、マラリア原虫内においてもユビキチン・プロテアソームシステムが

存在することが示された。よって、アルキル化もしくは重合化によって変性した PfERC がこ

のユビキチン・プロテアソームシステムで分解され、減少している可能性が考えられる。

Figure 25 の ESR の結果より、N-89 及び N-251 は FeSO4の存在下でラジカルを産生すること

が示されている。しかし、細胞内で遊離の Fe2+が存在することはなく、実際にマラリア原虫内

でラジカルが産生され得るのかという疑問が生じる。マラリア原虫は宿主赤血球中に存在する

ヘモグロビンを取り込み分解して自身の栄養源とする。その際に生じる遊離ヘムは 30~50%が

Food vacuole 内に存在するが残りは cytosol や細胞膜上に存在することが報告されている 33)。

そのため、Fe2+を含むヘムがマラリア原虫内に広く分布していると考えられ、N-89 及び N-251

もラジカルを産生する環境にあると言える。

同様の環状過酸化物である Artemisinin は鉄のキレート剤やラジカルを捕捉するスピントラ

ップ剤を併用するとその抗マラリア活性が低下するという報告がある 12)。N-89 及び N-251 に

９２

関してはラジカルを産生することが分かっているものの、そのラジカルが抗マラリア作用に関

わっている直接的なエビデンスはない。これまでに上記と同様の実験は行われていないが、本

研究で ESR に用いたスピントラップ剤 DBNBS や鉄のキレート剤の併用によって N-89 及び

N-251 の抗マラリア活性が低下することも十分考えられる。もし活性が低下しなければ、ラジ

カル以外に抗マラリア活性に関わる作用機序が存在する可能性が示唆され、新たな知見となり

得るため、今後上記の実験を行う必要があると考える。

SPR 解析によってΔPfERC と N-89 及び N-251 の親和性を測定した結果、その親和性は低かっ

た。そのためこの親和性が特異的かどうかという点に疑問が生じる。中外製薬三浦隆昭氏の

報告 34)によると低分子化合物と標的タンパク質の結合が特異的かどうかの判断に以下のよう

な基準が適用でき、本研究の SPR 解析においてもその基準を適用し、検討した。

i) 化合物の SPR シグナルレベルがベースラインのノイズレベルに対して有意であるか

ii) センサーグラムの形状が理想的か

iii) 対照タンパク質との比較

iv) 結合の濃度依存性

v) 競争実験

i) 化合物の SPR シグナルレベルがベースラインのノイズレベルに対して有意であるか

本研究の SPR 解析のベースラインのノイズレベルの標準偏差は 1.38~1.85 であった。三浦隆

昭氏の報告によるとベースラインの標準偏差の 3倍以上の結合レスポンスを与えた化合物は有

意と扱っている。N-89 及び N-251 を 62.5 µM 以上の濃度で解析した場合、その結合レスポン

スはベースラインの標準偏差の 3 倍以上であったため、PfERC と N-89 及び N-251 との結合は

有意と判断できる。

ii) センサーグラムの形状が理想的か

低分子化合物の結合親和性は一般的に低いため、結合、解離ともに速いパターンを示すこと

が予想される。Figure 23 より、SPR シグナルの増加、減少ともに瞬時に起こっており、結合、

解離は速いと判断できる。

iii) 対照タンパク質との比較

本研究では対照タンパク質との比較として PfERC とは全く無関係のタンパク質である MBP

を用いており、MBP の N-89 及び N-251 の SPR 解析 (Figure 24) においてシグナルは検出され

なかった。

iv) 結合の濃度依存性

リガンド:アナライトの 1:1 の理想的な結合では化合物濃度が解離定数以上に増加するにつ

れ、結合が飽和することにより結合量が一定の値に収束する。理想的な濃度依存的なセンサー

９３

グラムを Figure 35 に示す。

Figure 35. SPR 解析における理想的な濃度依存的センサーグラム

PfERC と N-89 及び N-251 が 1:1 で結合すると仮定した場合、本研究の SPR 解析から得られ

たシグナル Figure 25 も Figure 35 のセンサーグラムに近く、濃度依存的にシグナルが強くなっ

ている。

v) 競争実験

競争実験には活性部位に結合することが既知の化合物 (ポジティブコントロール) が必要と

される。PfERC は N-89 及び N-251 との結合部位が未知であるので本項目においては検討する

ことができなかった。

以上、5つの項目のうち 4つにおいて SPR解析から得られた PfERCと N-89及び N-251の SPR

シグナルが特異的であると考えられた。そのため、PfERC は N-89 及び N-251 に対して特異的

な親和性を有すると考えられる。

また、その親和性が低いにも関わらず N-89 及び N-251 はマラリア原虫に対して優れた抗マ

ラリア活性を有していることに以下の考察ができる。N-89 及び N-251 は感染赤血球内におい

て生物濃縮がされており、感染赤血球に寄生するマラリア原虫内に高濃度に存在している可能

性が考えられる。平成 23 年度修了生鎌井一気氏の修士論文では、N-251 に蛍光物質を結合

させた N-251-Rhodamin を感染赤血球に作用させるとマラリア原虫内に特異的に集積したとい

う結果が得られている。コントロールとして NHS-Rhodamin のみを感染赤血球に作用させても

マラリア原虫内には蓄積しなかったことより、N-251 が Rhodamin に結合することでマラリア

原虫に集積することが分かった。このことから、N-89 及び N-251 もマラリア原虫内に集積し

高濃度に存在していることが考えられる。それによって PfERC と N-89 及び N-251 の複合体の

割合も増えると考えられる。

以上のことから N-89 及び N-251 の作用に起因する PfERC の減少がマラリア原虫に致死的な

９４

影響を及ぼしていることが考えられた。そのため、マラリア原虫内での PfERC の量を変化さ

せることによって N-89 及び N-251 の感受性が変化すると考えた。細胞内でタンパク質の量を

変化させる方法としてノックダウンとノックインがある。マラリア原虫においてこれまでにノ

ックダウンを行ったという報告はいくつかある 35)-37)が、再現性に乏しい。実際に当研究室に

おいても過去に siRNA とアンチセンスを用いた PfERC のノックダウンを試みたが、全て成功

しなかった。さらに、2009 年にはマラリア原虫には RNA 干渉に必要とされる機構が存在しな

いという報告 38)があり、マラリア原虫におけるノックダウンは非常に難しいと考えられる。そ

のため、本研究では熱帯熱マラリア原虫に PfERC を過剰発現させることを試みた。今回行っ

た PfERC 過剰発現原虫の作製は、Mamoun C. B.らの報告 25)を参考として Episomal transfection

を行い、薬剤選択マーカーには Blasticidin S (BSD) を用いた。Mamoun C. B.らの報告によると、

Episomal transfection の際、BSD 濃度を 25 µg/mL まで増やすと導入したプラスミドのコピー数

は 15 まで増えるはずである。本研究においても用いた BSD 濃度は 25 µg/mL であり、本来で

あれば PfERC を 10 倍以上発現する遺伝子組換え原虫が得られるはずであった。しかし、実際

に作製した遺伝子組換え原虫の PfERC の発現量は Control 株に比べて約 2 倍であった。このこ

とから PfERCを 10倍以上過剰発現するとマラリア原虫の生育に悪影響が出るために PfERCの

発現に何らかの抑制が起きたと考えられる。25 µg/mL の BSD 濃度において遺伝子組換え原虫

が増殖できることから、プラスミドのコピー数が 10 以上に増え、BSD 耐性遺伝子も 10 コピー

以上発現していると予想できる。Real-time PCR による mRNA 量の解析から、遺伝子組換え原

虫の PfERC の mRNA 量は Control 株に比べて約 2 倍であったことから、導入したプラスミドか

ら PfERC が転写される際に転写抑制が起こっている可能性が考えられる。もしくはプラスミ

ドのコピー数は実際には 1-2 で 25 µg/mL BSD の存在下で生育している可能性も考えられるた

め、マラリア原虫内でのプラスミドのコピー数を今後調べる必要がある。

PfERC はその構造内に 6 個の EF hand motif があり、Ca2+との結合能を有しているタンパク質

である 39)。これまでの当研究室での研究から、PfERC と Ca2+との親和性は KD=50 µM であり、

比較的低いことが分かっている。同様の特徴を有しているタンパク質ファミリーに CREC

(Cab45、Reticulocalbin、ERC-55、Calumenin) タンパク質ファミリーがあり、PfERC もこのフ

ァミリーに分類されている 40)。CREC タンパク質ファミリーの特徴として、Ca2+との結合ドメ

インである EF hand ドメインを 5~7 個有していることが挙げられる。Ca2+との親和性は比較的

低く、Ca2+との KD=10-4~10-3 M である。また、その C 末端には小胞体保留シグナルである 4 つ

のアミノ酸配列 KDEL41)と類似の配列を有していることもこのタンパク質ファミリーの特徴で

ある。しかし、その局在は小胞体だけでなく、ゴルジ体や細胞質にも局在しているものもある。

哺乳類と無脊椎動物における CREC タンパク質ファミリーの構造を Figure 36 に示す。

９５

Figure 36. 各生物種における CREC タンパク質ファミリーの構造 42)

A; 哺乳類細胞 B; 無脊椎動物細胞

オレンジ色; シグナル配列赤色; EF hand ピンク色; Ca2+ binding loop

PfERC と最も相同性の高い CREC タンパク質ファミリーに Calumenin がある。CREC タンパ

ク質ファミリーの機能はまだ詳しく分かっていないが、これまでに以下のような報告がある。

マウス心筋細胞の Calumenin は Sarco/endoplasmic reticulum ATPase 2 と相互作用しており、

Calumenin をノックダウンすると sarcoplasmic reticulum での Ca2+放出及び取り込み速度が大き

くなったことが報告されている 43)。また、ウサギの骨格筋細胞で Calumeninは Ryanodine receptor

1 と相互作用しており、過剰発現させるとカフェイン誘導性の Ca2+放出を増加させ、一方で脱

分極誘導性の Ca2+放出を減少させたという報告もあり 44)、CREC タンパク質が細胞内で Ca2+

の濃度調節に関わっていることが示されている。このことから、PfERC も ER 内の Ca2+濃度調

節に関わっている可能性が考えられる。今回行った PfERC 過剰発現原虫の作製において、

PfERC を過剰発現するとマラリア原虫の生育に悪影響が出るために PfERC の発現に何らかの

抑制が起きた可能性が示唆された。これは PfERC が ER 内の Ca2+濃度調節に関わっている可能

性を支持するものと考えられる。PfERC 自体には Ca2+結合モチーフである EF hand motif があ

るものの、Ca2+輸送に関わる機能はないため、Ca2+濃度に依存して他のタンパク質との相互作

用が変化し、パートナータンパク質の機能を制御している可能性も考えられる。しかし、本研

究の PfERC と相互作用するタンパク質の探索において PfERC と相互作用するタンパク質は同

定できなかった。このことより、PfERC は他のタンパク質と非常に弱い力で結合し、パートナ

９６

ータンパク質の制御によって ER 内での Ca2+濃度調節に関わっている可能性が考えられる。

以上のことより、本研究から示唆される N-89 及び N-251 の抗マラリア作用機序を Figure 37

に示す。

Figure 37. 本研究から示唆される N-89 及び N-251 の抗マラリア作用機序

N-89 及び N-251 は Trophozoite 期のマラリア原虫内に集積し、PfERC と結合する。マラリア

原虫内で存在する鉄と反応し、ラジカルを産生する。産生されたラジカルが直接的に、又は変

性を介して間接的に PfERC を分解・減少させる。PfERC の減少に伴って ER 内で Ca2+濃度制御

異常が起こり、ER ストレスのようなストレス応答が起こり、原虫が死に至ると考えられる。

PfERC を 2 倍多く発現する遺伝子組換え原虫を用いて N-89 の感受性を測定した結果、感受

性が低下した。このことは、PfERC が標的タンパク質であることを支持する結果である。今後

PfERC が N-89 及び N-251 の標的タンパク質であるという確証を得るために以下の 2 つの研究

を行う必要があると考える。一つ目が、ノックアウト実験によって PfERC がマラリア原虫の

生存に必須であるかどうかを解析することである。CREC タンパク質ファミリーの一つである

Reticulocalbin のノックアウトは致死的であるという報告 45)もあることから、PfERC がマラリ

ア原虫の生存に必須である可能性も十分考えられる。二つ目が、PfERC の機能を解明すること

である。機能を解明することによって PfERC が減少するとどのようにしてマラリア原虫が死

に至るのか、つまり PfERC の減少に直結する原虫死シグナルを明らかにできる。N-89、N-251

を作用させた場合に、同様の原虫死シグナルが起これば、PfERC が標的である確証が得られる

と考える。

N-89 及び N-251 は既に臨床で抗マラリア薬として使用されている Artemisinin 系薬剤と同様

の環状過酸化構造を有している。そのため、N-89 及び N-251 を臨床試験段階へ進めるために

は Artemisinin 系薬剤と異なる抗マラリア作用機序を有することを示す必要がある。本研究で

９７

N-89 及び N-251 は Trophozoite 期のマラリア原虫のステージ移行を特異的に阻害することが明

らかにされた。それに対して Artemisinin 系薬剤は全てのステージにおいて阻害作用を有する

ことが報告されている 46)。SPR 解析から、PfERC は Artemisinin と親和性を有さないことが示

された。以上より、N-89 及び N-251 は Artemisinin とは異なる抗マラリア作用機序を有すると

言える。このことは、近年現れ始めた Artemisinin 系薬剤に対する耐性原虫に N-89 及び N-251

は有効であることを示唆しており、マラリア制圧に貢献できる有望な抗マラリア薬であると考

えられる。

本研究は新規抗マラリア薬として有望な環状過酸化物 N-89 及び N-251 の作用機序を提示し

たものであり、臨床における併用薬の選択、副作用の回避、耐性の克服に寄与する知見である。

９８

引用文献 1) World Health Organization, WHO malaria report 2011, Geneva, Switzerland 2011.

2) World Health Organization (WHO). Programmes and projects, international travel and health,

Chapter 7 Malaria

3) Singh, B.; Kim, Sung, L.; Matusop, A.; Radhakrishnan, A.; Shamsul, S. S.; Cox-Singh, J.; Thomas,

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１０２

謝辞本研究を遂行するにあたり、素晴らしい実験環境を与えて頂き、終始懇親の御指導と御鞭撻

を賜りました岡山大学綿矢有佑名誉教授並びに岡山大学大学院医歯薬学総合研究科金惠淑

准教授に心より御礼申し上げます。

本論文の作製にあたり御指導と御鞭撻を賜りました岡山大学早津彦哉名誉教授に心より感

謝致します。

本研究遂行において、有益なる御助言並びに御討論して頂いた平本晃子博士並びに岡山大

学薬学部佐藤聡助教に心から感謝致します。

本研究遂行にあたり、多大なるご協力を頂きました就実大学薬学部平岡修准教授、平本一

幸准教授、長崎大学熱帯医学研究所金子修教授、佐倉孝哉様並びに愛媛大学無細胞生命科学

工学研究センター坪井敬文教授に深謝致します。

本論文の作製にあたり格別なる御指導と御助言を賜りました岡山大学大学院医歯薬学総合

研究科田中智之教授、波多野力教授、黒田照夫准教授、西屋禎准教授に深く御礼申し上げ

ます。

本研究の遂行並びに研究生活において、多大なるご協力を賜りました岡山大学薬学部医薬品

情報学講座並びに国際感染症制御学講座の皆様に深く感謝致します。

最後に、博士課程在学の長き時間、絶えず支え続けてくれた両親に心から感謝致します。

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環状過酸化物の抗マラリア作用機序の解析ousar.lib.okayama-u.ac.jp/files/public/5/50737/...2 2.5. 熱帯熱マラリア原虫の同調培養法 19 2.6. N-89及びN-251の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害の解析