細胞表面の糖鎖及びＦＧＦシグナルを 利用した精子運動能を亢進する方法

国立大学法人 浜松医科大学

医学部産婦人科学講座　准教授　杉原一廣

精子は、腟内から子宮に入�り、卵管を上り、1155ccmmもの距離を泳ぎます。 精子はその途中、栄養を全く補給すること無く、とてつもなく長い距離 ヒトの身長に換算すると44KKmmを移動します。

精子

60μm  (0.00006m)

卵巣�

15cm移動

受精�

不妊症で悩む夫婦→88組に11組

男性側の要因が約半分 4488%%を占める！

男性不妊症の主な原因：

精子数が少ない→乏精子症 運動精子が少ない→精子無力症

受精

卵

精子

不妊症は受精し胚が子宮に着床できない疾患

WWHHOOの定義では「避妊をしていないのに22年以上にわたって妊娠に至れない状態」

精子を活性化する薬剤 ① 漢方：補中益気湯など ② ビタミン剤：ビタミンBB1122、ビタミンCC 「何もしないより・・・」ということで処方することが多い

培養液中に添加する薬剤 精液の洗浄、質の良い精子や運動率の高い精子を集める際、 精子の凍結・融解に培養液を用いる。 ① 活性酸素の除去： 　 グルタチオン、ジムスターゼ((SSOODD))、タウリン ② 活性酸素の抑制や金属イオンの除去： 　 コエンザイムQQ1100、カテキン

作用機序や臨床効果が不明である 精子運動率や受精率を向�上する薬剤が存在しない

不妊症の治療 ① AAIIHH（人工授精）：成功率1100%% ② IIVVFF--EETT（体外受精--胚移植）成功率2200〜3300%% しかし、

精子運動率が低いと成功率は極端に下がる その際は、 IICCSSII（顕微授精）が必要になる

IICCSSII

ヒトの卵に針を刺し精子を注入�する 過激とも思える授精方法

基礎研究の成果を臨床へ応用する橋渡し研究 （トランスレーショナルリサーチ）が必要 さらに、 治療は根拠に基づいた医療 （EEBBMM:: EEvviiddeennccee--BBaasseedd MMeeddiicciinnee）の必要がある

「精子活性化剤およびそれを用いた活性化方法」 　の発明に至った

精子の表面は多量の多糖((ggllyyccaannss))で覆われている J Urol. 180(2):767-71. 2008他

多糖

EEnnddoo--β--GGaallaaccttoossiiddaassee((EEBBGG))で多糖を根元から切断できる ［EEBBGGはppoollyyLLaaccss ((ppoollyy--NN--aacceettyyll--llaaccttoossaammiinnee ttyyppee ggllyyccaannss))を加水分解する］

精子

精子にEEBBGGを添加して多糖を除去すると精子が活性化され顕著に早く動く

A" B"

Contro

lEBG

20

40

60

80

100To

tal m

otilit

y (%

)

**p=0.0041

Contro

l

Sialida

se

#-gala

ctosid

ase

Trypsin

20

40

60

80

100

Tota

l mot

ility

(%)

p=0.1011

*p=0.0271

p=0.4552

C" D"

0 30 60 90 120 150 1800.0

5.0×107

1.0×108

1.5×108

2.0×108

Min

Fluorescence

精子にEEBBGG添加してみると

EEBBGGを精子に添加すると運動率、直進運動率ともに有意差を持って上昇した 精子の運動率はCCAASSAA((CCoommppuutteerr AAssssiisstteedd SSaammeenn AAnnaallyyssiiss))を用い定量的に測定

精子にEEBBGGを添加すると精子運動が亢進する

EEBBGG添加によるシグナル伝達経路

Ca2+

EBG(-)

EEBBGG--ttrreeaatteedd ++ oorr -- EEBBGG--ttrreeaatteedd

cAMP

EEBBGG添加により精子細胞質のccAAMMPPが上昇し、イオンチャンネルを介してCCaa22++が 細胞内に取り込まれてカルシウム濃度が顕著に上昇し精子運動を亢進した

ppoollyyLLaaccssが精子に結合しccAAMMPP、カルシウムイオンチャンネル依存性に 精子運動を調節している

精子運動はイオンチャンネルに依存 CCaa22++の取込みはccAAMMPPに依存

EBG(+)

A  

B   m/z  

m/z  

Rela1ve  intensity

 (%)  

Rela1ve  intensity

 (%)  

ヒト精子から分離精製したppoollyyLLaaccssの構造 質量分析法（MMaassss SSppeeccttrroommeettrryy AAnnaallyyssiiss))

精子表面のppoollyyLLaaccssはssiiaallyyll LLeewwiiss XX((ssLLeeXX))、LLeewwiiss YY((LLeeYY))糖鎖抗原と判明

ヒト精子表面ppoollyyLLaaccssの起源 精巣 精巣上体

精管 射出精子

EBG-

EBG-

EBG+ EBG+

EBG+

EBG-

EBG- EBG+

精子表面のPPoollyyLLaaccssはssLLeeYY糖鎖抗原のため抗ssLLeeYY抗体を用いて免疫組織染色を行った

ppoollyyLLaaccssは精巣上体と精管から分泌されている

精管 精管 精巣上体垂

精巣上体頭部

精巣上体体部

精巣上体尾部

精巣輸出管

精巣縦隔内 精巣網

白膜

精巣中隔 精巣小葉

（精細管が存在）

精索血管

精巣

精巣上体 精管

SSppeerrmm wwaasshhiinngg mmeeddiiuummで洗浄した精子にppoollyyLLaaccを添加すると精子運動が抑制される

精子にppoollyyLLaaccss依存性細胞内情報伝達系の受容体が存在することが示唆される

Table S1 A partial list of human sperm tail proteins identified by proteomics.

Score Protein name Localization 1.000 SPAG4 (sperm associated antigen 4) Cytoplasm 0.446 ODF1 (outer defence fiber sperm 1) Cytoplasm 0.355 ODF4 (outer defence fiber sperm 4) Cytoplasm 0.332 SPAG5 (sperm associated antigen 5) Cytoplasm 0.278 CATSPER1 (cation chennel of sperm 1) Cell surface 0.276 ODF3 (Outer defence fiber of sperm 3) Cytoplasm 0.246 CCDC65 (coiled coil containing protein 65) Cytoplasm 0.235 PPP1CC (protein phosphatase 1) Cytoplasm 0.230 FGFR2 (Fibroblast growth factor receptor 2) Cell surface 0.218 APOA1BP (apolipoproteinA1 binding protein) Secretory 0.215 AURKC (protein kinase 13) Cytoplasm 0.215 RNF38 (ring finger protein 38) Cytoplasm, nucleus 0.174 TAF7L (TAF7 like RNA polymerase) Nucleus 0.172 NPHP1 (nephronophthisis) Cytoplasm 0.158 PLK1 (polo like kinase 1) Cytoplasm 0.150 SPEF2 (sperm flagellar 2) Cytoplasm 0.150 SLC26A8 (solute carrier family 26A8) Cell surface 0.123 BSG (beisigin) Cell surface 0.121 SLC16A10 (solute carrier family 16) Cell surface 0.120 SLC25A31 (solute carrier family 25A31) Cell surface 0.119 DNAI2 (dynein, axonemal, intermediate chain 2) Cytoplasm 0.118 TSGA10 (testis specific antigen 10) Nucleus 0.109 SORD (sorbitol dehydrogenase) Cytoplasm 0.102 RSPH1 (radial spoke head 1 homolog) Nucleus 0.100 Pcdp1 (primary ciliary dyskinesia protein 1) Cytoplasm 0.089 TRIP6 (thyroid hormone receptor interactor 6) Cytoplasm

ppoollyyLLaaccss依存性情報伝達系の受容体を同定するために行ったプロテオミクスのデータ解析

FFGGFFRR22受容体は細胞内のccAAMMPPを介してカルシウムイオンの取込みを亢進する ヒト精子を用いた検討結果と一致するためFFGGFFRR22にffooccuussを当てた

FFGGFF受容体22((FFGGFFRR22))

抗FFGGFF22抗体による免疫染色 一次抗体なし

FFGGFFRR22受容体はヒト精子に発現していることを確認

Blank

FGF1FGF2

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

poly

Lac

bind

ing

OD

450

nm

****P<0.0001

****P<0.0001

03.1

26.2

512

.5 25 500.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Poly

Lac

bind

ing

OD

450

nm

FGF or EGF (ng/well)

FGF1

FGF2

EGF

A" B"

C"Blan

kFGF1

FGF20.0

0.1

0.2

0.3

0.4

poly

Lac

bind

ing

OD

450

nm

****P<0.0001

****P<0.0001

03.1

26.2

512

.5 25 500.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Poly

Lac

bind

ing

OD

450

nm

FGF or EGF (ng/well)

FGF1

FGF2

EGF

A" B"

C"ppllaattee aassssaayy uussiinngg aannttii--LLeeYY aannttiibbooddyy

ppoollyyLLaaccssはFFGGFF11,, FFGGFF22と濃度依存性に結合する

DDoossee ddeeppeennddeenntt bbiinnddiinngg

FFGGFFとヒト精液中とppoollyyLLaaccの結合

FFGGFFと強く結合するヒト精液中の多糖（ggllyyccaannss）のTToopp1100は ppoollyyLLaaccssであることを確認した

Sfrs%1�

Sfrs%1�

���������� ������ �

���� ����

GGllyyccaann aarrrraayy aannaallyyssiiss ffoorr FFGGFF

Blank

FGF1FGF2

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0.1

0.2

0.3

0.4

poly

Lac

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450

nm

****P<0.0001

****P<0.0001

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512

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0.2

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Poly

Lac

bind

ing

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450

nm

FGF or EGF (ng/well)

FGF1

FGF2

EGF

A" B"

C"

SSPPRR:: SSuurrffaaccee PPllaassmmoonn RReessoonnaannccee iimmaaggiinngg..

Fig. 5!

pY!

FGFR2!

FGF !polyLac!

-  - + +!-  + - +!

B !

C !

A!

D !

E ! F !*!

*!

FFGGFFRR22を発現するHHEEKK229933TT細胞を用いた検討

FFGGFFとFFGGFFRR22の結合

ppoollyyLLaaccssによりFFGGFFと FFGGFFRR22の結合は抑制される

FFGGFF依存性チロシンリン酸化

FFGGFFとFFGGFFRR22が結合して起こる チロシンリン酸化はppoollyyLLaaccssにより抑制される

EEBBGG、FFGGFFを添加した際の精子運動能の変化

EEBBGGとFFGGFFを添加すると精子運動率が最も高くなる！

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Summary

*

Case4 ±��­³�RP�³#¦®�½��ÂÖÆÕØÓo³�ÌØįm3²n"³w·»¾½¸²²�m3ØÌØÄn"�*<D ?Ù��Ú��Z�o±U´K»�±9°�£¯��µ©��m3H×~;���«©��¬µ¼�n"¥©m3²��@�Z�o±U´��£¯��p�»¾½� GWRQ ��������������

ヒト精子受精能の評価

受精能を測定する手段としアクロビーズテストを行い EEBBGG添加により受精能が上がることが判明した

CCoonnttrrooll

EEBBGG ++

EEBBGGおよび//またはFFGGFFを添加し精子運動能を亢進して 精子を活性化する方法・精子活性化剤を発明した

発明の効果 ① 新規に見いだされた作用機序により精子の運動能が増強される

　 ので、結果、受精効率を飛躍的に向�上させることができる。 ② 本発明の精子活性化剤および活性化方法はヒトを含む哺乳動物 　 の体外受精・胚移植（IIVVFF--EETT))に活用することができる。 ③ 本発明により精子運動能不全に起因する不妊症患者の人工授精 　（AAIIHH))の効率を向�上させることができる。

EEBBGGおよび//またはFFGGFFを添加し精子運動能を亢進して 精子を活性化する方法・精子活性化剤を発明した

社会への波及効果 現在まで、精子運動のを改�善する薬剤や不妊治療薬がない。 発明した機序は、基礎研究からスタートし臨床へ応用している ため特効薬となり得る。

不妊治療の特効薬は、少子化対策の極めて有効な手段となる。 注） 厚生労働省が66月５日発表した人口動態統計によると、22001122年の合計特殊出生率((１人の女性が生涯に産むとされる子どもの数)) は11..4411と低水準。 結婚年齢の上昇と高齢出産の増加で、今後も不妊症患者は増加する。

想定される用途 Hamamatsu University School of Medicine

●配偶者間人工授精 （AAIIHH:: AArrttiiffiicciiaall IInnsseemmiinnaattiioonn bbyy HHuussbbaanndd） ●体外受精・胚移植 （IIVVFF:: IInn VViittrroo FFeerrttiilliizzaattiioonn)) ●家畜の保存

産業界に期待すること Hamamatsu University School of Medicine

臨床研究・共同開発のパートナー

ノウハウや経験を有する企業

日本で臨床研究を進めるためのパートナー

お問合わせ先：

浜松医科大学 知財活用推進本部

　担当：小野寺雄一郎

　〒443311--33119922 　静岡県浜松市東区半田山11--2200--11 　Ｔeell ： 005533--443355--22223300　　 　Ｆaaxx： 005533--443355--22117799 　UURRLL： hhttttpp::////wwwwww..hhaammaa--mmeedd..aacc..jjpp// 　ee--mmaaiill： ttookkkkyyoo@@hhaammaa--mmeedd..aacc..jjpp

知的財産権等について ● 精子活性化剤およびそれを用いた活性化方法 　 PPCCTT//JJPP22001133//000055553388 ((出願日22001133..99..1199)) 本研究成果にご興味を持たれた方はお気軽に下記までご連絡ください。