細胞応答を利用する迅速・簡便な生物毒素の検出法

富山大学大学院理工学研究部（工学系）生命工学科 教授 篠原寛明

研究背景

迅速・簡便な生物毒素の検出法

○ 食の安全を守る（海産物、農産物他）

○ ライフサイエンス研究や創薬への応用

生物毒素：貝毒、キノコ毒 食中毒（麻痺、神経障害、死亡）

貝毒検査の意義海産物に恵まれる富山の食だけでなく世界の食の安全を守る！

貝毒とは：二枚貝類は、海域に特定のプランクトンが特異的に増殖すると、そのプランクトン（渦鞭毛藻類）を摂食して毒を体内に蓄積することが知られている。

貝毒には麻痺性貝毒と下痢性貝毒の２種類があり、麻痺性貝毒では舌、口唇のしびれや運動失調、重症時には呼吸困難から死に至る。下痢性貝毒では下痢・腹痛等といった特有の症状が現れる。

貝毒は調理などの加熱では消えないが、海水中の原因となるプランクトン密度が低くなると徐々に貝の体内から排出されて消失する。

貝毒の規制値：貝毒の毒量はマウスユニット（ＭＵ）という単位で表され、規制値が設定されている。

貝のむき身重量１グラム当たり、麻痺性貝毒では４マウスユニット、下痢性貝毒では0.05マウスユニットを超えた場合、当該海域の生産者は、直ちに出荷自主規制を行い、毒化した貝類が市場に出回らないようにしなければならない。

１ ＭＵ（マウスユニット）とは？ （1MU = 0.23μｇ・ｓｔｘ 相当）麻痺性貝毒：体重２０ｇ のマウスが１５ 分で死亡する毒の量

人の致死量：体重６０ｋｇの人で約３０００ＭＵ下痢性貝毒：体重２０ｇ のマウスが２４ 時間で死亡する毒の量

• マウスアッセイ法公定法だが、標準マウスが必要で手間と時間がかかる。

• 培養神経細胞を用いるバイオアッセイ細胞の生死判定を利用し確か。しかし手間と時間がかかる。

• 液体クロマトグラフィ-蛍光検出法（HPLC-FLD)種々の毒素を判別・定量できるが、手間がかかる。

• 液体クロマトグラフィｰ質量分析法（ LC-MS)種々の毒素を判別・定量できるが、装置が極めて高価。

• 酵素免疫測定法（ELISA)抗体を用いるので特定の毒素の検出・定量に優れ、

時間も短縮。 抗体の作製がKey一般人でも分析操作が可能。しかし手順はまだ煩雑。

↓より簡便な貝毒検査法が開発できれば、その場で短時間判定が可能に。

従来の貝毒検査法食の安全を守る！ 麻痺性貝毒の分子構造

LC-MS（機器分析）による貝毒検査

サキシトキシン

種々の毒素を判別・定量できるが、装置が極めて高価。

発色が薄いほど、サンプル中に貝毒が多い。

ELISAキットの開発北里大学水産学部

児玉教授、佐藤助教授による

抗体を用いるので特定の毒素の検出・定量に優れ、時間も短縮。 抗体の作製がKey。一般人でも分析操作が可能。しかし手順はまだ煩雑。

貝剥き身（５個,１００ｇ）を粉砕し、塩酸で熱抽出して検体液とする

研究目的従来の貝毒検査法に比べて、取扱が容易で、できる

だけ安価に、しかも短時間で貝毒の検出を行える検査法を開発する。

新技術の特徴私達の開発した酵素発光法を用いる生体アミンの分

析法を応用して、細胞応答から培養細胞を用いるナトリウムイオンチャネル、イオンチャンネル型受容体に作用する麻痺性貝毒、記憶喪失性貝毒や興奮性キノコ毒などの高感度で簡便な検出法が開発できた。

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 2 4 6 8 10

Time(sec.)L

umin

esce

nce

inte

nsity

1000 nM↑

10 nM

先にした特許出願（生体アミンの分析方法：特開2006-280201）の応用発明に当たる

背景としての先行特許

【発明の名称】生体アミンの分析方法本発明は、生体アミンの分析方法に関する。特に本発明は、アミンオキシダーゼを利用した生体

アミンの分析方法に関する。本発明の方法は、アミンオキシダーゼ、例えば、チラミンオキシダーゼを用いて、カテコールアミン等の生体アミンを迅速簡便にしかも高感度に酵素化学発光検出する方法である。この方法は、例えば、カテコールアミン分泌能を持つ細胞の刺激応答性の観察評価にも応用できる。さらに本発明は、上記分析法を利用した被験物質の細胞に対する影響を試験する方法に関する。

OH

OH

CH2

CH2

NH2 O2

NH2

NH

O

O

NH

H2O2

HRP

NH2

O

O

O

O

OH2

NH2

O

O

O

O

OH

OH

CH2

CHO H2O2 NH3+ +

Dopamine

Luminol

+ hν

*

+ +Tyramine Oxidase

複合酵素反応によるドーパミンの発光反応と検出パターン

発光検出型プレートリーダーを用いて測定

新技術の概要実施例の１つとしては、貝由来の試験試料をPC12細胞やC6細胞などの培養細胞と共

存させ、ついでベラトリジンなどの電位依存性イオンチャンネルの開放化合物で培養細胞

を刺激し、刺激により培養細胞から放出されるドーパミンやグルタミン酸を、チラミンオキ

シダーゼやグルタミン酸オキシダーゼなどの酸化酵素を用いて酸化し、生成する過酸化

水素と反応するルミノールの発光を計測して、そのドーパミンやグルタミン酸の放出量の

変化から、電位依存性イオンチャンネルの阻害剤として働く貝毒の検出、定量を実現した。

細胞内Na+↑

細胞内 Ca2+↑

Veratridine

Na+Na+

Ca2+

ACｈレセプター電位依存性Na+チャンネル

ドーパミンの放出

脱分極

細胞内

細胞外

脱顆粒

カテコールアミン小胞

ＡＣｈＧＴＸ

ＰＣ１２細胞の薬物応答メカニズム

電位依存性Ca2+ チャンネル

0

200

400

600

800

0 10 100

GTX1/4 / nM

Lum

inesc

ence in

tensi

ty /

a.u

.

PC12細胞を用いるGTXの検出例

GTXで10分インキュベート後、100μＭベラトリジンで刺激し，発光

を計測した。

発光なし

薬物刺激

ルミノール

ＰＯＤ

ＴＯＤＨ２Ｏ２

発光

ドーパミン ＰＣ１２細胞

検出器

ＰＣ

発光計測型プレートリーダー

計測システム

神経系のグリア細胞モデルとしてのC6細胞の興奮応答性と薬物・毒物の作用

培養容器の底面に接着して増えたC6細胞の顕微鏡写真

電位依存性Na+ チャネル

活性化剤:NMDAイボテン酸

（キノコ毒）

Na+流入 Ca2+

influx

細胞内 [Ca2+]↑

Na+流入

グルタミン酸顆粒

グルタミン酸の放出

電位依存性Ca2+チャネル (L-, T-, P/Q- and N-タイプ)

活性化剤：マイトトキシン阻害剤: Nifedipine, Flunarizine & NiCl2

NMDA受容体

K+流出K+流入

Blocker: 4-AP

K+ チャネル

電位依存性Na+チャネルの活性化剤であるVTRDを添加するとグルタミン酸が放出されるが、GTXを添加しておくと、グルタミン酸の放出は阻害される。

活性化剤: VTRD、シガトキシン阻害剤: GTX（毒貝）,

TTX（フグ毒），CBZ, LIDO

カイニン酸受容体

活性化剤:カイニン酸、ドウモイ酸（記憶喪失性貝毒）

●酵素発光法によるグリアモデル細胞の興奮応答観測

【論文発表】

１）S.M.Z.Hossain, H.Shinohara, F.Wang, H.Kitano, Real-time detection of L-glutamate released from C6 glioma cells using a modified enzyme-luminescnce method, Anal. Bioanal. Chem., 389, 1961-1966 (2007).

２）S.M.Z.Hossain, H.Shinohara, H.Kitano, Drug Assessment Based on Detection of L-Glutamate Released from C6 Glioma Cells Using an Enzyme-Luminescence Method , Anal. Chem., 80, 3762-3768 (2008).

ベラトリジン（VTRD)刺激によるグリアモデル細胞からのグルタミン酸放出の発光観測

VTRD刺激によりグルタミン酸が放出されたことを示す発光パターン

LGO、POD、ルミノールを含む溶液

測定システムの模式図

ウェル

C6細胞

グルタミン酸

VTRD刺激

検出器

発光

インジェクター

LGO

グルタミン酸+Ｏ２→ケトグルタル酸+Ｈ２Ｏ２HRP

Ｈ２Ｏ２+ルミノール→発光

C6細胞を用いるGTX（麻痺性貝毒）の検出例

麻痺性貝毒や興奮性キノコ毒の検出が３０分以内に可能！

C6細胞を用いるイボテン酸（キノコ毒）の検出例

従来技術との比較

・ 食品衛生法での、麻痺性貝毒の検査法（公定法）は、マウスの生死で判定するマウス

アッセイ法であるが、多量のマウスを必要であり手間と時間を要する。

・ 培養神経細胞を用いるバイオアッセイ法（特開2001-17196）は、細胞を用いており確度が向上するものの生存細胞を染色するなど手間がかかる。

・ 貝毒に対する抗体を用いる酵素免疫法（特開2003-12699）は、特定の毒素の検出・定量に優れ、時間の短縮を図ることができるが、抗体作製などに手間・時間を要し、測定手

順が煩雑である。

・ 液体クロマトグラフィ－蛍光検出法（特開平09-133669）は、種々の毒素を判別・定量できるが、やはり手間がかかる。

新技術は、上記の従来の貝毒検査法に比して、操作が簡便で短時間で検出できる。

本新技術は、麻痺性貝毒ばかりでなく、テトラドトキシンなどＮａチャンネルに作用する魚毒、海産物毒素の検出にも応用できる。

さらに記憶喪失性貝毒や興奮性キノコ毒を同様の手法で簡便、迅速に検出することができる。

本技術の想定される用途

• 食の安全（農水産物の安全管理）• ライフサイエンス研究や創薬への応用

•農林水産業、食品産業、流通産業の検査部門

•公的食品・衛生管理機関の検査部門

•製薬産業の研究部や検査部

本技術が利用されると想定される業界

• 試薬キットや培養細胞の供給の具体化が課題

• 生物毒素の抽出技術の開発、キット化も課題

実用化に向けた課題と企業への期待

課題を一緒に考え、解決し、実用化へチャレンジくださる企業を探しています！

・発明の名称：「毒物の検出法」

・出願：出願手続中

・出願人：富山大学

・発明者：篠原寛明

本技術に関する知的財産権

お問い合わせ先

富山大学ＴＬＯ・リエゾンオフィス

産学連携コーディネーター 石黒 雅煕

メール：ishiguro@adm.u-toyama.ac.jpTel: 076-445-6390Fax: 076-445-6939

/ColorImageDict > /JPEG2000ColorACSImageDict > /JPEG2000ColorImageDict > /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 1000 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages true /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict > /GrayImageDict > /JPEG2000GrayACSImageDict > /JPEG2000GrayImageDict > /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages true /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict > /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile () /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False

/Description > /Namespace [ (Adobe) (Common) (1.0) ] /OtherNamespaces [ > /FormElements false /GenerateStructure true /IncludeBookmarks false /IncludeHyperlinks false /IncludeInteractive false /IncludeLayers false /IncludeProfiles true /MultimediaHandling /UseObjectSettings /Namespace [ (Adobe) (CreativeSuite) (2.0) ] /PDFXOutputIntentProfileSelector /NA /PreserveEditing true /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged /UntaggedRGBHandling /LeaveUntagged /UseDocumentBleed false >> ]>> setdistillerparams> setpagedevice