Upload
lyngoc
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Cellule staminali
• Cellule primarie
• Self-renewal: si rinnovano per divisione cellulare
• Unlimeted potency: si differenziano in qualunque tipo cellulare specializzato
Cellule staminali embrionali
Cellule staminali adulte
Blastocisti
Cordone ombelicale, midollo osseo
Cellule staminali
Totipotenti: morula Possono formare i tessutiEmbrionali e extraembrionali
Multipotenti: blastocistiPossono formare i tessuti embrionali
Multipotenti:adulteProducono cellule di una famiglia Correlata. Ex: ematopoietiche
Unipotenti: adulteproducono un solo tipo cellulare
Le cellule staminali embrionali (ES) di topo presentano il vantaggio di poter essere mantenute in coltura e la totipotenza preservata grazie alla presenza, nel mezzo di coltura, del fattore LIF (Leukemia Inhibitor Factor). In queste condizioni le cellule ES possono essere manipolate geneticamente e, grazie alla ricombinazione omologa, un frammento di DNA esogeno può essere integrato in un preciso sito del genoma (Jasin et al., 1996).
intervento sperimentale volontario di inserimento di un gene esogeno nel genoma di una specie animale o vegetale. Knock inIl gene può appartenere alla stessaspecie o può derivare da specie differenti.
quando il gene esterno è:
• integrato nel suo genoma;
• espresso correttamente (in genere si usa un gene che codifica una data proteina)e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale;
• integrato nella linea germinale e per conseguenza trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie.
Transgenesi
Organismo transgenico
Jaenisch 1974: topi mutanti, frammenti di DNA di SV40 iniettati nella cavità celomatica di blastocisti murina mantenuti nel topo adulto.
Gordon e Ruddle 1980: topi transgenici. Questi ricercatori sono stati i primi amettere a punto la tecnica di microiniezione del DNA ricombinante all'interno dello zigote (ovulo fertilizzato ) e a dimostrare la trasmissione del transgene alla progenie da parte degli animali ottenuti con questa tecnica.
Palmiter e Brinster nel 1982: ceppo di topi transgenici ottenuti microiniettando il gene dell’ormone della crescita umano. Questo esperimento ha prodotto unceppo di topi molto più grandi dei loro omologhi non transgenici, dimostrandoche era possibile modificare non solo il genotipo ma anche il fenotipo degli animalimutati.
• Microiniezione del DNA nell’ovocita fertilizzato
• Microiniezione di cellule staminali nell’ovocita fertilizzato
• Nuclear Transfer di cellule staminali trasformate in vitro
• Mediata da retrovirus
• Mediata da spermatozoi
Metodi per ottenere un animale transgenico
Pronucleo maschile
Pronucleo femminile
Ovulofertilizzato
Pipetta difissaggio
Pipetta diiniezione
Transgene
Femmina che ha subito l’impianto
Fondatore transgenico
•Prelievo dopo 15-20h dalla fecondazionedegli zigoti dalla femmina e microiniezionedel DNA nel pro-nucleo maschile
• Impianto dopo 24h di coltura in una pseudo-madre
• Analisi sui nati a 3 settimane su DNAestratto dalla coda
• Efficienza del 10%
Microiniezione del DNA nell’ovocita fertilizzato
Ricombinazione casuale, raramente omologa
Blastocistidonatrice
Massacellulareinterna
Cellule ES
coltura
Transgene
Transfezione
Arricchimento incellule transfettate
Microiniezione nella blastocisti
Blastocistiricevente
Impianto
Fondatoretransgenico
Cellule staminali da blastocisiti transfettate con il transgene associatoa resistenza antibiotica
Dopo selezione trasferite in blastocisti riceventi
Impianto in madri pseudogravide
Progenie mosaico (chimere)
Selezione del fondatore transgenico
Microiniezione di cellule staminali nell’ovocita fecondato
Ricombinazione omologa
Selezione delle cellule staminali transgeniche
HB1 Neor TG HB2 TK
HB1 TG HB2cromosoma
transgene
Neor :Resistenza al G418
TK :sensibilità al gancyclovir
HB1 TG HB2cromosoma
ricombinazione omologa
Ricombinazione omologa
Le cellule sono selezionate in positivo con il G418 e non avendo il gene per la TK sono resistenti al Gancyclovir
Neor
Selezione delle cellule staminali transgeniche
HB1 Neor TG HB2 TK
HB1 TG HB2 cromosoma
transgene
Neor :Resistenza al G418
TK :sensibilità al gancyclovir
HB1 TG HB2cromosoma
ricombinazione eterologa
Ricombinazione eterologa
X
X TK
Le cellule sono selezionate in positivo con il G418, ma negativamente per la presenza della timidina chinasi
Neor
Topo marroneColore marrone A/AES ricombinanti
Topo neroColore nero a/aImpianto delle ES
Progenie chimerica:Possibili gameti:A/X A/X* a/X
X, gene normaleX*, transgene
Incrocio di un topo chimerico con untopo nero, a/a, X/X
Si originano topi neri e topi marroni
Analisi dei topi marroni per individuaregli eterozigoti
Incrocio tra eterozigoti per ottenereomozigoti
A/A, X/X* x A/A, X/X*
Nuclear transfer di cellule trasformate in vitro
Clonazione
Cellule staminale trasfettate e selezionte
Nuclei delle cellule microiniettati in un ovocitaAnucleato
Embrione impiantato nella pseudo-madre
Nati tutti transgenici
Efficienza bassa 1/centinaia
Trasfezione
ICM
Neo introne esone
Selezione cellule
Ovuloenucleazione
nucleo
Nuclei purificati
Fusione attivazione
Coltura embrione in vitro
Impianto
Topo transgenico
• Embrioni prelevati a 4-8 cellule
• Infezione con un retrovirus reso non patogenocon alcune parti sostituite con il gene di interesse
• Impianto nella pseudo-madre
• Alto numero di nati a mosaico
• Possibili danni associati al retrovirus
Transgenesi mediata da retrovirus
Transgenesi mediata da spermatozoi
Interazione spontanea DNA/spermatozoo
Fecondazione
Selezione della prole sullaanalisi del DNA prelevato da coda o orecchio
Knock out
Eliminazione di un gene o delezione di 1 o + esoni
Eliminazione di una proteina o di un dominio funzionale
Gene targenting Topo Knock out
Ricombinazione omologa Produzione di una proteina mutataEspressione della proteina abolita
Studiare la funzione di un gene e della sua proteina
Riprodurre in un modello animale uno stato di malattia
Targeting genico
Topo
Vettore contenente il transgene e i marker
Cellule staminali
Ricombinazione omologa:
Il DNA da inserire contiene parecchie kbasi omologhe al genoma di topo
In lievito la ricombinazione omologa avviene nel corretto locus con frequenza molto alta
Nei mammiferi la ricombinazione omologa nel corretto locus avviene con frequenza molto bassa. Southern blot e PCR per lo screening dei cloni.
Knock-out convenzionale
Ricombinazione omologa nellecellule staminali embrionali. (topo marrone)
Selezione con G418 e gancyclovir
Iniezione delle cellule transgenichein una blastocisiti e impianto in una madre pseudogravida. (topo nero)
Progenie chimerica
Incrocio di eterozigoti per ottenereomozigote
Knock-out e ricerca di base
Knock-out con fenotipo normale: ipotesi che altre proteine compensino la perdita della proteina abolita
Knock-out con fenotipo inducibile da stress:la funzione genica è associataalla comparsa di stress ambientali o a eventi patologici. Ex: knock-out peril recettore dell’interferone I da fenotipo normale, ma mostra aumentata suscettibilità alle infezioni virali rispetto ai controlli.
Knock-out con fenotipo letale: geni necessari per lo sviluppo embrionale che non consentono di ottenere topi adulti
Knock-out condizionale
Transgenesi in cui il knockout di un gene può essere controllato temporalmente e spazialmente
Transgenesi binaria: transgene effettore e transgene target. Il transgene effettore non influisce sull’espressione dei geni endogeni in quanto agisce solo sul transgene target
Fase 1 Costruzione di knockin per il transgene target (espresso correttamente sino all’excisione)
Fase 2 Costruzione di knockin per il transgene effettore
Fase 3 Incrocio tra i due knockin per ottenere il knockout condizionale
2 tipi di transgenesi binaria
1, effettore:fattore di trascrizione
Il costrutto del transgene effettore è costituito da un promotore tessutospecifico(TSP) che regola la produzione di una proteina chimerica costituita dal repressore della Tetraciclina di E. coli (tetR) e dal dominio di transattivazione di VP16 (herpes simplex). Questa proteina tTA ha due domini uno lega la tetraciclina, l’altro una sequenza di 19bp nell’operone per la tetraciclina nel transgene attivandolo.
Tet-off: Il transattivatore regolato dalla tetraciclina (tTA) non può legare il DNA quando è presente l’induttore
Tet-on: nel sistema inverso (rtTA) tTA lega il DNA solo quando è presente l’induttore.
L’induttore utilizzato è la doxiciclina (Dox), analogo della tetraciclina, attiva rtTA e inattiva tTA in maniera efficiente a dosi al di sotto dei livelli citotossici.
Poiché la Dox può attraversare la placenta nel topo transgenico e regolare efficientemente l’espressione genica durante l’embriogenesi, questi sistemi vengono impiegati per evitare l’espressione di un transgene letale nell’embrione.
EFFETTO REVERSIBILE
Effettore inducibile
hCMV1E1: TSP, attivo in numerosi tessuti
2, effettore: ricombinasi
Ricombinasi Cre e Flp: enzimi che fanno parte della famiglia delle integrasi ricombinasi sitospecifiche. La ricombinasi Cre è presente in natura nel batteriofago P1 ed ha un ruolo nel ciclo lisogenico, in quanto serve per l’integrazione del genoma fagico in quello batterico.
La ricombinasi Flp deriva dal lievito Saccharomyces cerevisiae. Le due ricombinasi sono in grado di riconoscere specifiche sequenze di DNA chiamate rispettivamente sito loxP e sito FRT. Filamenti di DNA fiancheggiati da una coppia di tale siti vengono definiti “floxed” o “fliped”. I siti loxP e FRT sono costituiti da due distinte sequenze palindromiche di 13 nucleotidi ciascuna interrotte da una sequenza asimmetrica di 8 nucleotidi detta “spacer” che conferisce direzionalità al sito.
In base alla direzione ed alla posizione dei siti loxP oppure FRT su un filamento di DNA la ricombinasi Cre oppure Flp è in grado di catalizzare reazioni irreversibili di tre diversi tipi:
Inversione:i siti loxP/FRT si trovanosullo stesso filamento di DNA ed hanno direzioni opposte.
Traslocazione: i siti loxP/FRT si trovano su due filamenti diversi di DNA.
Excisione: i siti loxP/FRT si trovano sullo stesso filamento ed hanno la stessa direzione.
EFFETTO IRREVERSIBILE
Analisi di lineage cellulare
La cre o la FLP sono regolate da un promotore tessuto specifico
Il gene reporter è preceduto da uno STOP fiancheggiato da 2 siti lox o FRT
• se il TSP non è attivato non siha espressione del reporter
• se il TSP è espresso si ha excisione dello STOP e espressione del reporter
• l’irreversibilità della ricombinasifa sì che il transgene si esprima nelle cellule figlie dove il TSP non è più attivo
Verifiche per la corretta espressione dei transgeni
• Effetti di posizione nella linea che esprime la ricombinasi Cre/FLP
Inserzione di più copie del transgene floxato/flippato nel genoma: possibili instabilità cromosomiche, aneuploidia.
• Importante: disponibilità di elementi regolatori della trascrizione che siano in grado di attivare l’espressione della ricombinasi cre in tutta una gamma di tessuti e a stadi diversi dello sviluppo. Attivazione temporale e spaziale dell’espressione della ricombinasi Cre
Utilizzo di vettori, cromosomi artificiali:
Derivazione da lievito: YAC si propagano in lievito contengono alcune MbasiDerivazione da fago P1: PAC si propagano in E. coli contengono sino a 300KbasiDerivazione da batteri: BAC si propagano in E. coli contengono sino a 300kbasi
Molti geni sono essenziali per la vita,lo sviluppo, la fertilità del topo.Il knock-out tradizionale di tali geni non consente la creazione di un topo knock-out
Knock-out condizionale Tecnologia Cre/lox
Pharming
Utilizzo di animali per la produzione di farmaci e sostanze utili all’uomo
Nonostamte sia difficile e costoso i benefici possono essere potenzialmente elevati
Biotech company: soldi e aumento vendite
Persone ordinarie: riduzione del costo dei farmaci
Sostituisce produzione di farmaci in E. coli, lievito, cellule animali:Monitoraggio e campionamento continuoEspansione e strumentazione nuovaModificazione di proteine permesse solo da cellule di mammifero
Animali come bioreattori
Transgenesi utilizzata nella produzione di animali bioreattori
Espressione sperimentale di geni umani in mammiferi:
OVINICAPRINIBOVINISUINICONIGLI
LATTE (caratteristiche migliori per estrazione)SANGUETESSUTI
Previsto uso di somatotropina bovina per aumentare la produzione nei Paesi estraUE.In Europa i trattamenti ormonali sugli animali sono proibiti.
Ex: anti-emorragico antitrombinaIII nella capra (latte) (08-06-2006 1° farmaco transgenico in commercio) alfa-1 antitripsina per terapia respiratoria nella pecora (latte) proteina C-reattiva nei suini Prove cliniche in corso
EX: espressione di un fattore di coagulazione nel latte vaccino
Il gene per il fattore è fuso a un promotore per una proteina del latte
Assicura che li transgene sia espressosolo nel latte
Molte copie di DNA sono microiniettatenel pronucleo maschile di un uovo fecondato
Impianto in una pseudomadre
La microiniezione nel pronucleo ha efficenza molto bassa(15 transgenici su 100 nati)
Microiniezione nel pronucleo
Trasfezione di cellule adulte con il transgene e un gene per selezione antibiotica
Selezione delle cellule resistenti
Il nucleo di tali cellule è trasferito in uovo in cui è stato rimosso il proprio nucleo
Impianto
Poiché tutti gli ovuli contengono il DNA transgenico, il 100% degli animali è transgenico
Nuclear transfer
Ri-differenziamento delle cellule adulte
clonazione
Aspetti negativi della clonazione
Integrazione del transgene nel genoma è:
• rara
• casuale:può inserirsi in regioni che possono esseredeleterie per il gene stesso o per il gene in cui siinserisce
• molti animali nascono con difetti:sotto- sovra-peso, organi interni sottosviluppati o deformati
• nessuna garanzia che i nati transgenici siano sani,esprimano il transgene in grande quantità e neltessuto giusto
Percentuali di successi di clonazioni in diversi animali
Species
Number of oocytes used
Number of live offspring
Notes
Mouse 2468 31 (1.3%) -
Bovine 440 6 (1.4%) 2 died
Sheep 417 14 (3.4%) 11 died within 6 months
Pig 977 5 (0.5%) -
Goat 285 3 (1.1%) -
Yanagimachi, R. 2002. "Cloning: experience from the mouse and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology. 21 March, 187.
Utilizzate cellule adulte
1984 – A live lamb was cloned from sheep embryo cells
1986 – Early embryo cells were used to clone a cow
1993 – Calves were produced by transfer of nuclei from cultured embryonic cells
1995 – Two sheep, named Megan & Morag, were cloned using embryo cells
1996 – Birth of Dolly, the first organism to be cloned from a fully differentiated adult cell
1997 – Transgenic sheep named Polly was cloned containing a human gene
Mammal Cloning Timeline
http://www.cnn.com/2001/WORLD/europe/08/06/clone.critics/index.html
Megan and Morag
Dolly
From: student presentation Aman Arya, Nancy Chen, Dan Perz, Dave Reichert, Ronnie Wong
1998 – 50 mice were cloned in three generations from a single mouse
1998 – 8 calves were cloned from a single adult cow, but only 4 survived to their first birthday1999 – A female rhesus monkey named Tetra was cloned by splitting early embryo cells.
2000 – Pigs and goats reported cloned from adult cells
2002 – Rabbits and a kitten reported cloned from adult cells
Tetra
http://hs.houstonisd.org/hspva/academic/Science/Thinkquest/gail/text/benefits.html
Dolly
Dolly with her first newborn, Bonnie
• Born in July 1996 at the Roslin Institute in Scotland
• First mammal to be cloned from an adult mammal using the nuclear transfer technique
• 277 attempts were made before the experiment was successful
•Dolly died in February 14, 2003 of progressive lung disease at the age of 6; whereas normal sheep can live up to 12 years of age.
Dolly with her surrogate mother
Mammal Cloning allows propagation of endangered species
http://www.howstuffworks.com/cloning.htm/printable
January 8, 2001 Noah, a baby bull gaur, became the first clone of an endangered animal.
Xenotrapianti
Utilizzo di animali transgenici come donatori di organi per trapianti umani
Tentativi con scarso successo con cuore, fegato e reni dei primatiPossibile utilizzo degli organi dei suini:• dimensioni organi simili a quelli dell’uomo• creazione di transgeni che aboliscano il rigetto iperacuto e tardivo (knockout dei geni per molecole di superficie cellulari riconosciute come estranee)• creazione di transgeni che eliminino il rigetto Tmediato
Rischio:Nel maiale sono presenti i retrovirus (PERV, porcine endogenous retrovirus) e i retrotrasposoni.Elementi genetici mobili, che costituiscono quasi il 50% del genoma dei mammiferiPossono staccarsi da un distretto e introdursi in altre zone del genoma con azione mutagena.Tali elemanti si sono introdotti durante l’evoluzione e sono in equilibrio che evita Danni genetici. In caso di xenotrapianto si potrebbe perdere questo equilibrio
Dimostrato il passaggio di retrovirus endogeni di maiale in cellule umane coltivate
Terapia genica
La terapia genica è quell'intervento tendente a modificare localmente la condizione del fenotipo, alterato da una mutazione, attraverso la sostituzione funzionale del gene alterato col corrispondente gene sano.
Interessa solo la linea somatica
Terapia genica
SCID: severe combined immunodeficiency, causata da mutazioni nella proteina γ dei recettori per alcune IL necessarie per lo sviluppo dei linfociti B e T. Gli affetti da SCID sono privi di un sistema immunitariofunzionante.Il gene γIL è sul cromosoma X, quindi in maschi con la mutazione sono affetti, le femmine eterozigoti per la mutazione sono sane ma portatrici
Il ragazzo della bolla di plastica. David Phillip Vetter
Affetto da SCIDVissuto in “bolla di plastica” in condizioni sterili.Nel 1980 gli viene trapiantato il midollo osseo, donatrice la sorella.Dopo mesi insorgono complicanze, febbre, vomito ediarrea. È costretto a uscire dalla bolla.Nel 1984 muore in seguito a molteplici tumori insorti a causa della presenza di Epstein Bar virus non segnalato nel midollo della sorella
September 21, 1971 – February 22, 1984
1990: primo caso di cura di SCID con terpaia genica su di una bambina di 4 anni. Le cellule del sangue messe in coltura e transfettate con il gene corretto e reinfuse nella paziente
Da allora pochi i tentativi con successo dal punto di vista clinico.Le numerose ricerche sono ancora volte alla messa a punto di sistemi efficienti e sicuri di terapia
In vivo: Viene attuata in tutti quei casi in cui le cellule non possono essere messe in cultura o prelevate o reinfuse come quelle del cervello o del cuore e della maggior parte degli organi interni. In questo caso il gene d’interesse viene inserito, tramite un opportuno vettore, nell’organismo direttamente per via locale o sistemica.
Ex vivo:In generale, il protocollo adottato nella terapia genica consiste nel prelevare lecellule di interesse dal paziente, a metterle in coltura e a transfettarle o infettarlecon un virus ingegnerizzato con il costrutto contenente il gene normale; Tale procedura è sicuramente la più lunga e la più costosa delle due ma permette di selezionare ed amplificare le cellule d’interesse ed inoltre gode d’una maggior efficienza. E’ attualmente la modalità più utilizzata ma è riservata solamente a quei casi in cui sia possibile prelevare, mettere le cellule in cultura e reinserirle nell'organismo
Metodologie del trasferimento del DNA
Non virali: • Microiniezione in singole cellule del DNA nudo• Liposomi, vescicole sferiche cationiche legano il DNA che a pH neutro è negativo. 0,1% del DNA introdotto è espresso• Polimeri cationici, azione simile a quella dei liposomi• Gene gun, inviano nella cellula particelle microscopiche d’oro o di tungsteno ricoperte da DNA (al momento non esistono studi sull’uomo, ma solo su animali)
Virali:Retrovirus, lentivirus, Adenovirus, herpesvirus attenuati
Virali:
Retrovirus: hanno la capacità di integrare il loro DNA all’interno dei cromosomi delle cellule bersaglio determinando l’inserimento stabile del gene nei cromosomi della cellule infettata e il suo trasferimento a tutte le cellule figlie; i retrovirus infettano solo cellule che stanno proliferando; Lentivirus, come l'HIV: che permettono di trasferire materiale genetico anche in cellule che non proliferano, come le cellule "mature" (es. neuroni, cellule del fegato ) o in cellule particolarmente refrattarie ai retrovirus (es. cellule staminali prelevate del midollo osseo); Virus adenoassociati che integrano il loro DNA nei cromosomi della cellula ospite come i retrovirus, ma hanno rispetto a questi il vantaggio di essere per natura innocui; difficilmente trasportano geni di grandi dimensioni. Adenovirus:che non si integrano nei cromosomi della cellula ospite, ma possono trasportare geni di grosse dimensioni; tuttavia la loro espressione non dura nel tempo. Virus dell’herpes simplex infettano soltanto alcuni tipi di cellule, in particolare i neuroni e sono quindi indicati per la terapia di patologie neurologiche.
I limiti della terapia genica
In questi ultimi anni sono stati messi a punto una varietà di vettori, alcunidei quali in grado di fare esprimere il gene estraneo in uno specifico tipocellulare (come i globuli bianchi, le cellule del muscolo, delle vie respiratorieecc…).
Selettività del bersaglio
Negli studi sulla terapia genica, la maggior parte degli sforzi si concentraoggi sulla ricerca di vettori in grado di trasferire il DNA in modo efficientee di inserirlo stabilmente nelle cellule.
Efficienza di trasferimento
Questo è un problema particolarmente evidente per i vettori virali. Alcunidi questi derivano infatti da virus pericolosi, come l’HIV. E’ quindinecessario che prima dell’utilizzo questi vettori siano privati della virulenzaoriginaria del virus e mantengano invece inalterata la capacità di infettarele cellule bersaglio.
La sicurezza della procedura
La terapia genica risulta praticamente inutile se l’espressione del gene "estraneo" non viene mantenuta per un tempo sufficiente. Le ricerche mirano a sviluppare sistemi che permettono un espressione duratura, in modo da sottoporre il paziente ad un unico trattamento, o al limite a trattamenti ripetuti a distanza di qualche anno.
La reazione immunitariaCome ogni altra sostanza estranea, il prodotto del gene nuovo, il gene stesso e soprattutto il vettore possono scatenare una risposta immunitaria da parte dell’organismo ospite. Questa può portare all’eliminazione delle cellule modificate geneticamente, o all’inattivazione della proteina prodotta dal nuovo gene, annullando quindi tutti gli effetti della terapia. Nello sviluppo delle nuove strategie di terapia genica si cerca di evitare per quanto possibile che il vettore o il gene estraneo producano una reazione immunitaria.
Durata dell’espressione del gene trasferito
Nel 1989 è stata approvata la prima sperimentazione sull’uomo di un protocollo di terapia genica. Da allora, di più di mille protocolli sono stati approvati in tutto il mondo; di questi alcuni si sono conclusi, altri sono in corso. Più del 90% delle sperimentazioni sono in fasi molto precoci del protocollo (fase I o II) (vedi figura1). Queste fasi iniziali permettono di valutare l’eventuale tossicità del trattamento, l’efficacia del trasferimento genico e l’espressione a breve/medio termine del materiale genetico introdotto. E’ nelle fasi successive (dalla III) che si valuta invece in modo più approfondito la reale efficacia del trattamento in funzione della cura. Ad oggi, la FDA americana (Food and Drug Administration), l’ente governativo cui spetta l’approvazione di nuovi trattamenti terapeutici affinché possano essere introdotti nella pratica medica corrente, non ha autorizzato la commercializzazione di nessun prodotto di terapia genica.
Dal 1998 al 2005