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Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Energía Renovable
ESTUDIO DEL GEN hycE Y LA ESTRUCTURA DE
LA ENZIMA [NiFe]-HIDROGENASA DE
Escherichia coli
Tesis que presenta:
Q.I. Angela Francisca Ku González
En opción al título de:
MAESTRO EN CIENCIAS EN ENERGÍA RENOVABLE
Mérida, Yucatán, México
Febrero 2012
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de
Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en
contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados,
dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la
Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de Investigación.
Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los
productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo
correspondiente a dicha información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de
Investigación Científica, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este
trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se
regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley
de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.
Mérida Yucatán, México al 13 de febrero de 2012
____________________________
Q.I. Angela Francisca Ku González
EL PRESENTE TRABAJO FUE REALIZADO EN LA UNIDAD DE BIOQUÍMICA Y
BIOLOGÍA MOLECULAR DE PLANTAS DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN
CIENTÍFICA DE YUCATÁN A.C., BAJO LA DIRECCIÓN DEL DR. ENRIQUE
CASTAÑO DE LA SERNA.
____________________________
Dr. Oscar A. Moreno Valenzuela Director Académico
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
AGRADECIMIENTOS
A la dirección general del CICY.
A la dirección académica del CICY.
A la dirección de la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas por
su autorización y apoyo para desarrollar este proyecto de tesis.
A mi director de tesis, Dr. Enrique Castaño de la Serna.
A mi comité tutoral y revisores, Dra. Virginia A. Herrera Valencia, Dra. Laura
Solís Ramos, Dra. Ruby Valdéz Ojeda, Dra. Ana Luisa Ramos Díaz. Les
agradezco infinitamente su tiempo, paciencia y sobre todo su aporte científico.
A mis compañeros de laboratorio, compañeros de la segunda generación ER y
amigos de toda la vida por su ayuda y estar siempre apoyándome.
Y a todas las personas que de alguna forma contribuyeron a la realización de
este trabajo.
DEDICATORIA
A mi querida y gran familia, especialmente y con mucho amor a mis hijos, José,
Mónica, Héctor e Iván.
i
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
1 CAPITULO 1. ANTECEDENTES........................................................................................4
1.1 El hidrógeno como vector energético ..................................................................... 4
1.2 Métodos de producción de hidrógeno .................................................................... 5
1.3 Producción biológica de hidrogeno ........................................................................ 6
1.4 Las enzimas hidrogenasas ..................................................................................... 8
1.5 El biohidrógeno ..................................................................................................... 12
1.6 Distribución de las hidrogenasas.......................................................................... 12
1.7 Biocatálisis de las hidrogenasas .......................................................................... 14
JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 19
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................ 20
OBJETIVOS PARTICULARES .................................................................................................. 20
HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 21
2 CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 22
2.1 Diseño experimental ............................................................................................. 22
2.2 Alineamiento de secuencias de aminoácidos. ................................................... 24
2.3 Análisis de estructura de la enzima [NiFe]-hidrogenasa ..................................... 24
2.4 Diseño de oligonucleótidos ................................................................................... 25
2.5 Material biológico .................................................................................................. 27
2.5.1 Cepas de Escherichia coli. ............................................................................ 27
2.6 Extracción de ADN genómico. .............................................................................. 28
ii
2.7 Reacción de PCR con oligos diseñados para amplificar al gen que codifica
para la [NiFe]-hidrogenasa. ............................................................................................. 29
2.8 Clonación del fragmento amplificado. .................................................................. 30
2.9 Extracción de ADN plasmídico. ............................................................................ 31
2.10 Digestión de plásmidos ......................................................................................... 32
2.11 Subclonación en un plásmido de expresión con una etiqueta de histidina ......... 32
2.12 Análisis del perfil de expresión de proteínas totales y extracto purificado de
una clona de E. coli BL21 putativamente transformada con pET 15b-hidrogenasa:6
his-tag. ............................................................................................................................. 34
3 CAPITULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................... 36
3.1 Análisis in silico de secuencias de [NiFe]-hidrogenasas ..................................... 36
3.2 Análisis de la estructura tridimensional de la subunidad grande de la enzima
[NiFe]-hidrogenasa .......................................................................................................... 38
3.3 Obtención de ADN genómico de E. coli. .............................................................. 42
3.4 Obtención de un amplicón con los oligos diseñados para amplificar al gen
hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa................................................. 44
3.5 Obtención del plásmido de expresión pET 15b-hidrogenasa y transformación
de E. coli cepa BL21........................................................................................................ 48
3.6 Patrón de expresión de proteínas totales y de extracto purificado de las
clonas obtenidas de E. coli.............................................................................................. 49
CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 54
PERSPECTIVAS ......................................................................................................................... 55
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 63
iii
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Ventajas y desventajas de los principales métodos de producción de
hidrogeno por procesos biológicos [32]. ................................................................................ 7
Tabla 2. Grupos homólogos del gen hidrogenasa que codifica para [NiFe]-
hidrogenasas en Proteobacteria [4] ..................................................................................... 10
Tabla 3. Números de accesión de las secuencias de aminoácidos de las enzimas
[NiFe]-hidrogenasa seleccionadas para este estudio. ...................................................... 24
Tabla 4. Secuencias de oligonucleótidos sintetizados ..................................................... 27
Tabla 5. Genotipos de cepas de E. coli utilizadas en este estudio. ................................ 28
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Métodos de producción de hidrogeno para la industria [13]. ............................ 5
Figura 2. Modelo propuesto de la síntesis del sitio activo de la [NiFe]-hidrogenasa 3 en
E. coli.. ..................................................................................................................................... 11
Figura 3. Estructuras de los sitios activos, (a) [NiFe] hidrogenasa, (b) [FeFe]
hidrogenasa. ........................................................................................................................... 14
Figura 4. Estructura atómica de los sitios catalíticos de [FeFe]-hidrogenasa y [NiFe]-
hidrogenasa. ........................................................................................................................... 15
Figura 5. Estructura de la hidrogenasa unida a membrana de R. eutropha.. ............... 16
Figura 6. Cofactores metálicos unidos a membrana. La malla azul representa la
densidad de electrones en estudios de cristalografía de rayos X.. ................................. 17
Figura 7. Arquitectura del grupo proximal [4Fe-3S]. .......................................................... 18
Figura 8. Secuencia de nucleótidos del ge hycE de la enzima [NiFe] hidrogenasa E.
coli K12.. .................................................................................................................................. 26
Figura 9. Vector de clonación pCR 2.1 TOPO (Invitrogen). ............................................ 30
Figura 10. Mapa del vector de expresión pET-15b. ........................................................... 33
Figura 11. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de microorganismos que
contienen la [NiFe]-hidrogenasa.. ........................................................................................ 38
v
Figura 12. Modelo estructural molecular de la enzima [NiFe]-Hidrogenasa. ................. 39
Figura 13. Modelo propuesto para mutagénesis dirigida de la enzima [NiFe]-
hidrogenasa de E. coli.. ......................................................................................................... 40
Figura 14. Modelo estructural de la enzima [NiFe]- hidrogenasa. .................................. 41
Figura 15. Electroforesis de ADN genómico de E. coli...................................................... 43
Figura 16. Electroforesis del producto de PCR gradiente de temperatura con oligos
hidrogenasa 2o.. ...................................................................................................................... 45
Figura 17. Electroforesis del producto de PCR con los oligos H2° diseñados para
amplificar al gen hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa. .................... 46
Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa 1% de la minipreparación de clonas
positivas con ADN plasmídico de hidrogenasa. ................................................................. 46
Figura 19. Electroforesis en gel de agarosa 1% del producto de PCR de hidrogenasa
con los oligos H3o, ................................................................................................................. 47
Figura 20. Electroforesis de la minipreparación de clonas del vector de expresión pET
15b-hidrogenasa:6 his-tag.. .................................................................................................. 49
Figura 21. Patrón de proteínas de dos clonas de pET 15b: hidrogenasa ...................... 51
Figura 22. Purificación de proteínas por columna de níquel de la clona 1 de E. coli
BL21 ......................................................................................................................................... 52
vi
ANEXO
Anexo 1. Articulo de divulgación aceptado en la revista Ciencia de la Academia
Mexicana de Ciencias. ................................................................................................ 56
vii
ABREVIATURAS
ADN Acido Desoxirribonucleico
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
H2asa enzima hidrogenasa
pb pares de bases
kDa kilodaltones
CO ligando carboxil
CN ligando ciano
Tm temperatura de fusión
viii
RESUMEN
La producción de biohidrógeno es una alternativa energética debido a que su uso
ofrece varias ventajas como vector energético. Sin embargo, el bajo rendimiento en su
producción es una limitante actualmente. Una forma de obtener este energético es
mediante el uso de organismos vivos. En este sentido numerosos microorganismos se
han identificado tales como E. coli y Clostridium spp, los cuales a través de la
actividad enzimática de proteínas tales como la enzima hidrogenasa tienen la
capacidad para producir hidrógeno. Se han identificado tres tipos de estas enzimas,
los cuales se clasifican en función al metal en el sitio activo que poseen, [FeFe]-
hidrogenasa, [NiFe]-hidrogenasa e [Fe]-hidrogenasa libre de metales. La función
catalítica de estas enzimas reside en la formación de H2 a partir de protones o de la
oxidación de protones. Se ha reportado en una cepa de E. coli top ten (Invitrogen) un
rendimiento de 2.014 mol de H2/mol de glucosa. Por lo que se espera obtener mayores
rendimientos en la producción de hidrógeno en la sobreexpresión de la enzima en
cepas de E. coli. En este trabajo, se decidió estudiar al gen hycE de la subunidad
grande de la [NiFe]-hidrogenasa debido a su participación en la inserción del níquel en
el sitio activo de la enzima. El estudio in silico de la secuencia de aminoácidos
predicha para la cual codifica este gen, permitió identificar dominios estructurales que
podrían permitir futuros estudios de mutagénesis de este gen con el fin de ampliar sus
aplicaciones biotecnológicas para la producción de hidrógeno a gran escala en E. coli.
Por lo tanto, se sintetizaron los oligonucleótidos correspondientes de acuerdo con la
secuencia de nucleótidos reportadas en GenBank. Se amplificó por PCR un fragmento
de aproximadamente 1700 pb con los oligos específicos para este gen. El fragmento
de PCR se clonó en un vector de expresión con etiqueta a histidina, el cual se utilizó
para la transformación de células de E. coli BL21. Posteriormente se realizó la
extracción de proteínas totales, la cual fue analizada mediante electroforesis en gel de
acrilamida con tinción de azul de Coomassie y se realizó la purificación de extracto
mediante una columna de Ni-agarosa, donde se observó una banda de masa
molecular aparente de 55 kDa, como la esperada para la subunidad grande de la
[NiFe]-hidrogenasa.
ix
ABSTRACT
Biohydrogen production is an alternative energy source because its use offers several
advantages as an energy carrier. However, the low yield in production is currently a
limitation. One way of obtaining this energy is through the use of living organisms. In
this sense have identified numerous microorganisms such as E. coli and Clostridium
spp, which through the enzymatic activity of proteins such as the enzyme hydrogenase
have the capacity to produce hydrogen. We have identified three types of these
enzymes, which are classified according to the metal in the active site they own,
[FeFe]-hydrogenase, [NiFe]-hydrogenase and [Fe]-hydrogenase metal free. The
catalytic function of these enzymes is the formation of H2 from protons or proton
oxidation. Has been reported in a strain of E. coli top ten (Invitrogen) yielding 2.014 H2/
mol of glucose. As expected higher yields in production of hydrogen in the
overexpression of the enzyme in strains of E. coli. In this paper, we studied the gene
hycE of the large subunit of [NiFe]-hydrogenase because of their involvement in the
insertion of nickel into the active site of the enzyme. The study of the in silico predicted
amino acid sequence which encodes for this gene, identified structural domains that
could allow for future mutagenesis studies of this gene in order to extend their
biotechnological applications for hydrogen production on a large scale in E. coli.
Therefore, the corresponding oligonucleotides were synthesized according to the
nucleotide sequence reported in GenBank. Was amplified by PCR an approximately
1700 bp fragment with oligonucleotides specific for this gene. The PCR fragment was
cloned into an expression vector with a histidine tag, which was used for transformation
of cells of E. coli BL21. Subsequently extraction was performed for total protein, which
was analyzed by acrylamide gel electrophoresis with Coomassie blue staining was
performed and the extract by purification of a Ni-agarose column, where there was a
band of apparent molecular mass of 55 kDa, as expected for the large subunit of
[NiFe]-hydrogenase.
1
INTRODUCCIÓN
El uso generalizado de combustibles fósiles ha derivado en numerosos beneficios a
las sociedades industrializadas, en consecuencia las necesidades energéticas
mundiales han crecido exponencialmente en los últimos años. Esto ha propiciado que
las reservas actuales de combustibles fósiles se agoten vertiginosamente, lo cual ha
conducido a la búsqueda de nuevas fuentes energéticas renovables.
El uso excesivo de combustibles fósiles es una de las principales causas del
calentamiento global y la lluvia ácida, que afectan el clima del planeta, la vegetación y
los ecosistemas acuáticos. En este contexto el uso de energías limpias están en
proceso de investigación y desarrollo en diversos países generando importantes
avances en los procesos por los cuales se obtienen [1].
Los sistemas que utilizan energías producidas a partir de biomasa son ejemplos
típicos de sistemas de energía renovable. La biomasa, en los países en desarrollo,
proviene de la leña, residuos animales, residuos agrícolas y se usa principalmente
para actividades que son esenciales para la supervivencia [2].
Uno de los pocos combustibles limpios que se pueden obtener de la biomasa es el
hidrogeno (H2), debido a que su único subproducto de combustión es el agua.
Además, puede ser producido a partir de materias primas renovables tales como
residuos orgánicos de desechos industriales, entre otros. Cuando éste se genera a
partir de un sistema biológico se denomina biohidrogeno. Por lo tanto, áreas dentro de
la biotecnología se encuentran orientadas a los bioenergéticos.
Las enzimas hidrogenasas (H2asa) se han identificado en diferentes Phylum tales
como Arqueas y bacterias como Escherichia coli, por mencionar algunos. Esta
proteína tiene un papel muy importante en el metabolismo energético, ya que cataliza
la reacción reversible entre el hidrogeno (H2) y el protón. Teniendo como paso
limitante para la reacción su inactivación en presencia de oxigeno en sistemas
aerobios [3].
En los últimos años, se han desarrollado investigaciones para producir análogos
sintéticos de estas enzimas H2asa. Una de las razones principales es que las H2asas
2
pueden catalizar la reducción de electrones del H2, lo cual conduce a la generación de
energía limpia.
Las hidrogenasas son principalmente metaloenzimas que están divididas en tres
clases dependiendo del metal que contienen en su sitio catalitico, [FeFe]-hidrogenasa,
[NiFe]-hidrogenasa e [Fe]-hidrogenasa libre de metales [4].
[FeFe] y [NiFe]-hidrogenasas son las enzimas mas estudiadas a la fecha, ya que la
mayoría de las hidrogenasas en microorganismos pertenecen a una de estas dos
clases de enzimas, excepto las hidrogenasas libres de metales que fueron
descubiertas en algunos metanógenos. La mayoría de las [FeFe]-hidrogenasas
monoméricas están más involucrados en la evolución de H2, y tienen alta sensibilidad
al oxígeno (O2) y monóxido de carbono (CO) irreversiblemente inactivadas después
de la exposición al O2 [4,5].
La enzima [NiFe]-hidrogenasa está compuesta por dos subunidades y está
involucrada en la oxidación de H2, también cataliza reacciones reversibles [6,7]. Estas
enzimas son menos activas que las [FeFe]-hidrogenasas entre 10 ~ 100 veces, pero
mucho más tolerantes al O2 y CO además de ser reversible. Esta propiedad es una
ventaja significativa para la aplicación biotecnológica de hidrogenasas en la
producción de biohidrógeno, ya que no es necesario proteger el proceso de la
producción de O2 [5]
Considerando la complejidad de las hidrogenasas en cuanto a su función,
localización, estructura y sitios activos, es de esperarse que sean necesarios muchos
genes para la biosíntesis de estas enzimas. En el caso de la [Fe]-hidrogenasa no se
han identificados genes putativos. Al contrario, la frecuente agrupación genómica de
los genes implicados en síntesis y maduración de [NiFe]-hidrogenasa ha facilitado su
identificación [4].
El uso de técnicas de ingeniería genética permitirán que se sobreexprese la [NiFe]-
hidrogenasa en una cepa de E. coli top ten el cual ha sido reportado un rendimiento
de 2.014 mol de H2/mol de glucosa [8].
3
La sobreexpresión de esta enzima en un sistema biológico para aplicaciones
biotecnológicas es un paso importante para diseñar un sistema continuo de obtención
de hidrogeno.
Dado que la subunidad grande de la enzima [NiFe]-hidrogenasa participa en la
incorporación del níquel a la molécula de esta enzimas, el presente trabajo se enfocó
en el estudio del gen hycE que codifica para esta proteína, así como en el estudio de
la estructura de la enzima [NiFe]-hidrogenasa. Se analizó in sílico la secuencia de
aminoácidos de la enzima y se identificaron dominios estructurales que podrían
permitir futuros estudios de mutagénesis de este gen con el fin de ampliar sus
aplicaciones biotecnológicas para la producción de hidrógeno a gran escala en E. coli.
Además, se clonó un fragmento de 1700 pb usando oligos específicos para la
amplificación de este gen, el cual se clonó en un vector de expresión para la
transformación de E. coli BL21. Se analizaron la proteínas de las clonas
transformadas y se observó una banda de masa molecular aparente de 55 kDa, como
la esperada para nuestra proteína de interés.
4
1 CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES
1.1 El hidrógeno como vector energético
El hidrógeno (H2) es el biocombustible más prometedor debido a que su uso deriva en
varios beneficios tanto socio-económicos como ambientales. Contiene la mayor
cantidad de energía por unidad de peso que cualquier otro combustible conocido (142
KJ / g, o 61.000 Kcal / Kg) y se puede transportar para uso doméstico o consumo
industrial a través de medios convencionales aunque también el almacenamiento y
transporte es un tema de interés por los diversos materiales propuestos
recientemente para brindar seguridad.
El H2 es ahora universalmente aceptado como energía ambientalmente segura,
renovable y una alternativa ideal para sustituir los combustibles fósiles, ya que no
contribuye al efecto invernadero. Puede ser utilizado para combustión directa en un
motor de combustión interna o como combustible para una celda de combustible [9].
La demanda de hidrógeno no es exclusiva como fuente de energía ya que es
ampliamente utilizado en la industria química, de alimentos y en la producción de
derivados electrónicos, entre otros. Esto genera una creciente necesidad de producir
hidrógeno de una manera sostenible y económicamente viable. Se ha reportado una
demanda de más de 50 millones de toneladas anuales, con un crecimiento de más del
10 % anual [9].
La industria de los fertilizantes y el petróleo son los principales usuarios de H2 con el
50% y 37% respectivamente. Las ventas de H2 han aumentado en un 6% anualmente
en los últimos cinco años ya que está estrechamente relacionado con el aumento del
uso de H2 en las refinerías [9].
5
1.2 Métodos de producción de hidrógeno
Los métodos que se usan actualmente no son lo suficientemente eficientes y
económicamente viables para suplir las necesidades mundiales de hidrógeno. La
obtención convencional se caracteriza por altos costos energéticos del proceso; entre
estos métodos están: la oxidación parcial no catalítica de combustibles, vapor
reformante de metano, procesos de membrana, oxidación selectiva de metano,
deshidrogenación oxidativa, procesos electroquímicos y petroquímicos [10].
Sin embargo, los métodos antes mencionados no son los únicos; en los últimos años
se ha planteado una novedosa forma de obtener hidrógeno, la cual es conocida como
“tecnología verde” y no es más que su producción a partir de sistemas biológicos.
Esto se realiza a partir de la conversión de compuestos por diversas especies
celulares. Esta biotecnología incluye: biofotólisis directa, biofotólisis indirecta, reacción
de intercambio gaseoso (water-shift-reaction), fermentación oscura y foto-
fermentación [11, 12].
En la actualidad el hidrógeno se produce en un 40% del gas natural, el 30% de los
aceites pesados y nafta, un 18% de carbón, y el 4% por electrólisis (Figura 1) [13].
Figura 1. Métodos de producción de hidrogeno para la industria [13].
Producción de Hidrogeno
Gas natural
Aceites pesados y nafta
Carbón
Electrólisis
Otros
6
1.3 Producción biológica de hidrogeno
La producción de biohidrógeno se lleva a cabo a partir de biomasa y ha sido
ampliamente estudiada en años recientes puesto que ha generado gran atención
debido a sus características como fuente de energía limpia y sustentable para el
futuro [14].
Los microorganismos producen hidrógeno principalmente por dos rutas: fotosíntesis y
fermentación. La fotosíntesis es un proceso dependiente de la luz, incluyendo
biofotólisis directa, biofotólisis indirecta y fotofermentación. Mientras que la
fermentación anaerobia es un proceso que no depende de la luz por lo que también
se le conoce como fermentación oscura. La fermentación anaerobia consiste en la
descomposición de compuestos orgánicos bajo condiciones anóxicas (el oxígeno no
se utiliza como aceptor de electrones). Los sustratos son degradados por oxidación
que provee la energía necesaria para el crecimiento de la biomasa [15, 16].
Los carbohidratos son las fuentes de carbono preferidas para los procesos de
fermentación. Las ecuaciones que representan este método se muestran a
continuación [17]:
C6H12O6 + 2H2O 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2
C6H12O6 CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2
La producción fermentativa de hidrógeno es realizada por microorganismos
fermentativos como: los anaerobios estrictos; cepas de Clostridium [18]; termófilos
[19], anaerobios facultativos; cepas de Enterobacterias [20, 21], Escherichia coli [22] y
especies de Citrobacterias [23] o cultivos mixtos [24].
Los procesos dependientes de la luz o bien métodos fotosintéticos son aquellos que
involucran la transformación de la energía solar en hidrógeno debido a la actividad
metabólica de la bacteria fotosintética o microalgas, pero en la práctica son difíciles de
aplicar debido a la baja eficiencia de utilización de la luz y las dificultades en el diseño
de los reactores para producción de hidrógeno [25].
La fermentación anaerobia utiliza una variedad de fuentes de carbono como
compuestos orgánicos, desperdicios de bajo costo o sustratos celulósicos o
7
celobiosos [26, 27, 28, 29, 30, 31]. Los rendimientos de producción de hidrógeno son
usualmente más altos en procesos fotosintéticos sin embargo el oxígeno que
evoluciona durante la fotosíntesis inhibe la enzima hidrogenasa responsable de la
producción de hidrógeno [32]. Los microorganismos fermentativos en cambio, no
presentan problemas con el oxígeno ya que la mayoría de los procesos son
anaerobios (cualquier oxígeno residual es consumido al inicio).
Tabla 1. Ventajas y desventajas de los principales métodos de producción de hidrogeno por
procesos biológicos [32].
Proceso Microorganismo Ventajas Desventajas
Biofotólisis directa Alga verde Producción de H2
directo de agua y luz solar.
Requiere grandes cantidades de luz.
El oxigeno puede ser peligroso para el sistema.
Baja eficiencia fotoquímica.
Biofotólisis indirecta
Cianobacterias Producción de H2 a partir de agua.
Habilidad de fijar nitrógeno atmosférico.
Las hidrogenasas consumidoras de H2 deben ser removidas para detener la degradación.
El O2 tiene un efecto inhibitorio en la nitrogenasa.
Fotofermentación Bacteria fotosintética Puede utilizar diferentes materiales de desecho.
La eficiencia de conversión es baja 1-5 %
El O2 es un fuerte inhibidor de la nitrogenasa.
Fermentación anaerobia
Bacteria fermentativa Una gran variedad de fuentes de carbono pueden ser el sustrato.
Produce metabolitos como ácido butírico, láctico y acético como subproductos.
Es un proceso anaerobio no tiene limitaciones por O2.
Bajos rendimientos en la producción.
A mayor rendimiento la fermentación de hidrogeno es termodinámicamente desfavorable.
La mezcla de gases contiene CO2 que debe separarse.
8
Por lo tanto, la producción de hidrógeno fermentativo tiene más ventajas desde la
aplicación o uso de la actividad de la enzima hidrogenasas que la producción de
hidrógeno fotosintético y tiene un mayor potencial para aplicaciones prácticas [33]. La
Tabla 1 presenta las principales ventajas y desventajas de los métodos biológicos de
producción de hidrógeno.
1.4 Las enzimas hidrogenasas
Las hidrogenasas fueron descritas por Stephenson y Stickland en 1931 como enzimas
bacterianas que catalizan la oxidación reversible del hidrógeno según la siguiente
reacción: 2H + 2e- → H2 [34].
Son metaloenzimas que se clasifican según el metal que contenga en su sitio activo,
[NiFe]-hidrogenasa, [FeFe]- hidroegnasa y [Fe]-hidroegnasa [35].
El anaerobio facultativo Escherichia coli posee tres isoenzimas [NiFe]-hidrogenasas.
Dos de estas isoenzimas (hidrogenasas 1 y 2) están unidos a la membrana. La
hidrogenasa 1 es sintetizada bajo condiciones fermentativas, cataliza la oxidación de
hidrógeno y se ha sugerido que está involucrada en el reciclaje de hidrogeno. La
hidrogenasa 2 se sintetiza en altos niveles cuando las células crecen en glicerol y
fumarato y es responsable de generar energía. La hidrogenasa 3 es parte del
complejo formato hidrogenilasa que cataliza la conversión de formato en dióxido de
carbono e hidrogeno. Los genes que codifican a la hidrogenasa 3 forman parte del
operón hyc ubicado en la región del cromosoma 58/59-min de E. coli. La
secuenciación de este operón reveló que el gen hycE codifica a la subunidad grande
de la hidrogenasa 3 [36, 37].
La actividad de la hidrogenasa se encontró posteriormente en numerosos procariotas
aerobios y anaerobios. La función fisiológica de la hidrogenasa en la mayoría de los
procariotas es la oxidación del gas hidrógeno y reducción de aceptores de electrones
[38, 39].
9
Otra función es producir hidrógeno que permita mantener el pH intracelular y el
potencial redox en los niveles adecuados. Aunque las hidrogenasas catalizan una
reacción simple, lo hacen en muchos contextos metabólicos y por lo tanto asumen
diversas funciones [38].
En las bacterias fermentativas del tipo Clostridium, la reducción de protones en
dihidrógeno por hidrogenasas es un medio para la eliminación del exceso de
equivalentes reductores. Varios microorganismos pueden utilizar H2 como una fuente
de electrones ya sea aeróbico o anaeróbicamente (por ejemplo, los metanógenos, los
reductores de sulfato y las bacterias fotosintéticas).
Los fijadores de nitrógeno por lo general contienen hidrogenasas que reciclan el H2
producido por la nitrogenasa. Estas funciones son a menudo asociadas con diferentes
localizaciones celulares como el desprendimiento de hidrógeno principalmente en el
citosol, mientras que la absorción es generalmente periplásmatica o localizada en
membrana. Sin embargo, la hidrogenasa citoplasmática bidireccional también media
la captación de H2. Algunas bacterias contienen dos o más diferentes hidrogenasas,
localizadas en diferentes compartimentos celulares.
La multiplicidad de H2asas en tales organismos refleja la importancia de H2 en su
metabolismo y también asegura una rápida y eficiente respuesta a variaciones en las
necesidades energéticas de acuerdo a las cambiantes condiciones de crecimiento. El
hidrógeno transmembranal de ciclo redox conduce a la formación de gradientes de
protones transmembranales que se han sugerido como reductores de sulfato por
redundancia de hidrogenasas en algunos casos. [4]
En Proteobacteria, los genes de la hidrogenasa que codifican para la captación H2
están agrupados, ya sea en el cromosoma o en un megaplásmido. Los genes por lo
general son denominados alfabéticamente de acuerdo a su orden en el grupo (Tabla
2).
10
Tabla 2. Grupos homólogos del gen hidrogenasa que codifica para [NiFe]-hidrogenasas en
Proteobacteria [4]
B.
japonicum
R.
eutropha
E. coli
H2asa
1 2 3
T.roseopersicina
H2asa H2asa
1 2
Pseudomonas
hydrogenovora
Características o
función
hupS hoxK hyaA hybO hyaG hupS hydS hupS Subunidad pequeña
hupL hoxG hyaB hybC hycE hupL hydL hupL Subunidad grande
hupC hoxZ hyaC hybB hupC hupC Citocromo b
hypA hypA1 hybF hypA Inserción Ni,
maduración de
GTPasa, donador Ni
hypF hypF1 hypF Síntesis de CO y
CN
El gen estructural que codifica para la subunidad pequeña (28-35 kDa) ha sido
nombrado S o K (pequeño o klein) (por ejemplo, hupS, hoxK, hydS), mientras que la
subunidad grande (45-70 kDa), ha sido designado L o G (Grande o gross), por
ejemplo, hupL hoxG hydL,). Los genes estructurales (hup o hox), están involucrados
en la maduración de la enzima heterodimérica.
En la Figura 2 se describen los cuatro paso de la síntesis del sitio activo de la
hidrogensa 3 en E. coli, en el paso I el grupo preformado Fe(CN)2CO es transferido a
HypC. En el paso II, HypC libera el grupo Fe(CN)2CO al precursor de la subunidad
grande de hidrogenasa pre-HycE. En el paso III, el complejo HypA-HypB-SlyD libera
el niquel al precursor que contiene Fe. En el paso IV, la proteasa especifica HycI
romperá el C-terminal para completar el cierre del sitio activo [37].
11
Figura 2. Modelo propuesto de la síntesis del sitio activo de la [NiFe]-hidrogenasa 3 en E. coli.
En el paso tres se sugiere la incorporación de níquel al sitio activo [37].
Otro conjunto de proteínas, codificados por los genes hyp (“p” por pleiotrópicos), está
involucrado en la inserción de Ni, Fe, CO y CN en el sitio activo. Por último, estos
grupos de genes de la hidrogenasa también comprenden genes regulatorios que
controlan la expresión de los genes estructurales.
La secuenciación de la región 58-59 minutos de mutantes de E. coli reveló la
presencia de un operón con cinco genes llamados hypABCDE (para los genes de
hidrogenasas pleiotropicamente) Un sexto gen hyp, hypF fue encontrado en otro sitio
cromosomico [40].
La maduración de la [NiFe] hidrogenasa 3 de E. coli se inicia con la unión del sitio
activo de hierro y sus ligandos diatómicos. El procesamiento proteolítico (división
endoproteolítica del C-terminal) de la subunidad grande se logra sólo después de la
correcta incorporación de Fe (CO) (CN) 2 y Ni. Se ha demostrado que tal
Paso I Paso II Paso VI
Paso III
12
procesamiento proteolítico no ocurren en un mutante de E. coli que tiene una deleción
en el hypF gen [41]. A partir de la observación de que la proteína HypF contiene una
secuencia característica motivo de la o-carbamoiltransferasas. El grupo de Böck ha
demostrado recientemente que el carbanil fosfato se requiere para la síntesis de la
centro activo de [NiFe]-hidrogenasas y sugirió que es el fuente de los ligandos CO y
CN al átomo de Fe. No se conoce si la inserción de los ligandos diatómicos tiene lugar
en la subunidad grande o primero en alguna proteína y posteriormente a la subunidad
grande [42].
1.5 El biohidrógeno
La producción biológica de hidrógeno utiliza microorganismos para convertir la
biomasa o la energía solar en hidrógeno bajo condiciones suaves de presión y
temperatura [4].
La producción de hidrógeno por microalgas verdes es un proceso dependiente de luz
[5] en el que las hidrogenasas, que son las enzimas que catalizan la reacción de
reducción de protones (H+) a H2 [6], están acopladas vía ferredoxina a la cadena de
transporte de electrones fotosintética. Las cianobacterias también son capaces de
producir hidrógeno por acción de enzimas hidrogenasas, pero en un proceso
acoplado a la fijación de nitrógeno [7]. Otras bacterias liberan hidrógeno durante
procesos fermentativos de desechos orgánicos. Finalmente, basados en los
complejos procesos metabólicos mencionados anteriormente, se han desarrollado
rutas sintéticas in vitro para la producción de H2. En estos sistemas multienzimáticos,
la hidrogenasa tiene una función primordial en el proceso. Esta propuesta resulta
prometedora en términos de control y eficiencia sobre los sistemas microbiológicos,
pero rescatando las ventajas de la biocatálisis [8]
1.6 Distribución de las hidrogenasas
La disponibilidad de numerosas secuencias de hidrogenasas de una amplia gama de
organismos genera nuevas oportunidades para el análisis de la distribución de estas
enzimas en todos los ámbitos de la vida. Es de particular interés la presentación de un
13
creciente número de secuencias completo de genomas, que permiten un inventario
completo de genes de codificación de H2asa en un número considerable de los
organismos [4].
Los organismos caracterizados incluyen: las algas verdes siendo los únicos
organismos eucariotas para el cual la actividad de la hidrogenasa ha sido bien
establecida. Esta hidrogenasa puede considerarse una enzima reversible o de doble
uso in vivo, ya que las algas verdes pueden producir o consumir hidrógeno después
de su adaptación anaeróbica. Dos hidrogenasas de algas verdes han sido purificadas
a homogeneidad. La hidrogenasa de Chlamydomonas reinhardtii parece consistir en
una subunidad individual con un peso molecular de 48 kDa, cuya secuencia N-
terminal no muestra homología significante a cualquier otra hidrogenasa [43]; La
hidrogenasa de Scenedesmus obliquus consta de dos subunidades con peso
molecular de 55 kDa y 36 kDa respectivamente [44]. Esta enzima es extremadamente
sensible al oxígeno. Chlorococcum littorale es una nueva especie de alga verde
marina unicelular que pueden crecer rápidamente a muy altas concentraciones de
dióxido de carbono [45, 46]. La producción de hidrógeno por esta alga se ha
observado asociada con el fotosistema II [47] y la descomposición de carbohidratos
endógenos bajo condiciones anaeróbicas en oscuridad [48].
Algunos microorganismos, como la β-proteobacteria Ralstonia eutropha, que crecen
en ambientes aerobios poseen [NiFe]-hidrogenasas tolerantes al oxígeno que son
capaces de metabolizar hidrógeno en condiciones aerobias. Las hidrogenasas
insensibles a oxígeno son de interés para fines biotecnológicos, por ejemplo, como
catalizadores en celdas de combustible o en la producción biológica de hidrógeno [49,
50].
La - proteobacterium Ralstonia eutropha alberga tres diferentes [NiFe] hidrogenasas
tolerantes a oxígeno que permiten al organismo el uso de hidrógeno como la única
fuente de energía en presencia de oxígeno. La hidrogenasa unida a membrana (MBH)
orientada periplasmáticamente está conectada a la cadena respiratoria vía citocromo
tipo-. La hidrogenasa soluble (SH) es una enzima citoplasmática que reduce
directamente NAD+ a expensas del hidrógeno. La tercera deshidrogenasa
(hidrogenasa regulatoria sensible a H2 [RH]) de R. eutropha no está involucrada en la
conservación de energía, sino que actúa como un sensor de hidrógeno en una H2-
14
cascada de señales dependiente de activación de transcripción de genes hidrogenasa
[51].
La expresión en bacterias recombinantes BL21 de la [Ni Fe] hidrogenasa 1 produce
12.5 ml H2/(h. L) en 400 ml de glucosa contenido en un medio de cultivo en
condiciones microaerobias, agregando formato para activar el complejo FHL [62].
También la enzima [Fe Fe] hidrogenasa se ha investigado debido a sus altos niveles
en la producción de hidrógeno, con la desventaja que es en procesos anaerobios,
como catalizador para aplicaciones sintéticas por expresión heteróloga y su
inmovilización sobre electrodos en celdas electroquímicas [63].
1.7 Biocatálisis de las hidrogenasas
Como se ha mencionado antes las enzimas hidrogenasas se clasifican de acuerdo a
la composición del sitio activo como [NiFe], [FeFe], y [Fe] ahora denominada libre de
metales. [35].
Las estructuras disponibles para [FeFe] y [NiFe]- hidrogenasa, (Figura 3) han
mostrado una compleja arquitectura del sitio activo del hidrógeno, además de los
metales, unidos a la cisteína los ligandos diatómicos tales como el CO y CN- [3].
Figura 3. Estructuras de los sitios activos, (a) [NiFe] hidrogenasa, (b)[FeFe] hidrogenasa. X:
ligando indeterminado productor de oxigeno, Y: CH2 o NH [3]
15
Las hidrogenasas suelen ser sensibles a la inhibición por oxígeno. Particularmente la
[FeFe]-hidrogenasa es irreversiblemente inactivada por éste, mientras que no afecta
la integridad estructural de la [NiFe]-hidrogenasa, sin embargo de forma reversible
inactiva su función catalítica. Se ha demostrado por diferentes técnicas
espectroscópicas que el oxígeno se une entre el níquel y el hierro [52]. En la Figura 4
se muestra la estructura tridimensional de los metales presentes en la enzima.
Figura 4. Estructura atómica de los sitios catalíticos de [FeFe]-hidrogenasa y [NiFe]-
hidrogenasa. (A) representación del átomo de la [FeFe]-hidrogenasa H-cluster, 2Fe-centro y
(B) [NiFe]-hidrogenasa. Colores para identificar posiciones: Fe (marrón), Ni (verde), C (azul), S
(amarillo), N (azul), O (rojo) y H (blanco) [53].
De acuerdo con el modelo actual propuesto por Fritsch et al. [54] (Figura 5) estos
cofactores funcionan como un interruptor electrónico, según la naturaleza de la
molécula de gas que se acerca al sitio activo (Figura 6).
16
Figura 5. Estructura de la hidrogenasa unida a membrana de R. eutropha. La cinta azul
muestra la subunidad grande y la verde la subunidad pequeña. Las estructuras de esferas y
barras de abajo representan el arreglo espacial de los cofactores [54].
Sirven como aceptor de electrones en la oxidación H2 y como un donador de
electrones en el ataque del O2 en el sitio activo. Esta doble función es apoyada por la
capacidad de un nuevo grupo de hierro-sulfuro para adoptar de tres estados redox a
potenciales redox fisiológicos.
17
Figura 6. Cofactores metálicos unidos a membrana. La malla azul representa la densidad de
electrones en estudios de cristalografía de rayos X. a) densidad de electrones en el centro
activo. B) cluster proximal coordinado por 6 cisteinas. C) cluster medio coordinado por tres
residuos de cisteína. D) cluster distal coordinado por tres cisteínas y una histidina [54].
18
Figura 7. Arquitectura del grupo proximal [4Fe-3S]. a) Modelo esquemático y estructural del
grupo y sus ligandos en la subunidad pequeña de hidrogenasa unida a membrana. B) grupo
proximal de [Ni Fe] hidroegenasa de D. vulgaris sensible a oxigeno [54].
La segunda función estructural es una amplia red de cavidades de agua que pueden
actuar como canales para facilitar la extracción de agua producida en el sitio activo
[NiFe]. Estos descubrimientos tienen un impacto en el diseño de catalizadores
biológicos y químicos de conversión H2 que son capaces de producir H2 en presencia
de aire, Figura 7.
19
JUSTIFICACIÓN
Debido a la crisis energética de los hidrocarburos y los problemas que estos
ocasionan al medio ambiente, se requieren formas de energía cada vez más limpias y
que sean de fuentes renovables. El hidrógeno se ha propuesto como una fuente
viable y sostenible de energía que requiere ser estudiada. La actividad de enzimas
tales como la [FeFe] y [NiFe]-hidrogenasas presente en numerosos microorganismos,
permite que se empleen manipulaciones genéticas para estudiar la función de genes
involucrados en la producción de hidrógeno, como el gen hycE, el cual está
involucrado en la inserción del níquel en la enzima [NiFe]-hidrogenasa. El estudio de
este gen proporcionará información importante que pudiera utilizarse posteriomente
para incrementar la producción de biohidrógeno en microorganismos como E. coli.
20
OBJETIVO GENERAL
Estudiar al gen hycE y la estructura de la enzima que codifica a la enzima [NiFe]-
hidrogenasa en Escherichia coli.
OBJETIVOS PARTICULARES
Realizar el análisis in silico de secuencias de la enzima [NiFe]-hidrogenasa en
diferentes especies bacterianas.
Analizar in silico la estructura tridimensional de la enzima [NiFe]-hidrogenasa
de Escherichia coli.
Clonar el gen hycE de la [NiFe]-hidrogenasa en un plásmido de expresión con
etiqueta de histidina.
Evaluar el perfil de proteínas totales y extracto purificado de E. coli cepa BL21
conteniendo el gen hycE.
21
HIPÓTESIS
El gen de la enzima hidrogenasa hycE se encuentra presente en las bacterias
productoras de hidrógeno reportadas hasta la fecha. Dado que se ha reportado que la
bacteria Escherichia coli es capaz de producir hidrógeno, debe ser posible el estudio
in silico de estos genes, así como el estudio estructural de la proteína correspondiente
a la hidrogenasa en la cepa BL21 de E. coli.
22
2 CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Diseño experimental
Para el desarrollo experimental del trabajo se diseñó el siguiente diagrama general.
23
En la primera parte del trabajo se realizó el análisis in silico de las secuencias de
nucleótidos que codifican para la [NiFe]-hidrogenasa en microorganismos en
microorganismos reportados como productores de hidrógeno, tanto de bacterias
metanogénicas, acetogénicas y reductoras de nitrato y sulfato, arqueas anaerobias,
protozoarios, hongos y algunas algas verdes que contienen a la enzima hidrogenasa.
Por otra parte, se realizó un análisis in silico de la estructura de la proteína
correspondiente a la [NiFe]-hidrogenasa con base en la estructura tridimensional de la
proteína obtenida por cristalografía de rayos X reportados por Fritsch et al [54].
Con base al alineamiento de las secuencias de nucleótidos de genes que codifican
para la [NiFe]-hidrogenasa en bacterias se diseñaron oligonucleótidos para amplificar
un fragmento de ADN que corresponde al gen hycE de la enzima [NiFe]-
hidrogenasa.
Se utilizaron los oligonucleótidos antes mencionados y ADN genómico como plantilla
para las reacciones de PCR y se obtuvo un amplicón de aproximadamente 1700 pb.
Este se clonó primero en un vector de clonación TOPO y posteriormente fue
subclonado en un plásmido de expresión con etiqueta de histidina pET 15b para
obtener el plásmido pET15b-hidrogenasa:6 his-tag.
Se utilizó el plásmido antes mencionado para la transformación de células bacterianas
de E. coli cepa BL21 y se seleccionaron clonas que crecieron en medio de selección
con antibiótico.
Se realizó una extracción de proteínas totales y se observó su perfil mediante una
electroforesis y tinción con azul de Coomasie. Finalmente, el extracto proteico se pasó
a través de una columna de Ni-agarosa y se observó el perfil de proteínas eluidas
mediante una electroforesis y una tinción con plata.
24
2.2 Alineamiento de secuencias de aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos de las enzimas [NiFe]-hidrogenasa reportadas en
diversos microorganismos fueron obtenidos de la base de batos Genbank. En la Tabla
3 se enlistan los microorganismos de los cuales fueron obtenidas estas secuencias
asi como sus números de accesión correspondientes. Estas fueron alineadas usando
el programa ClustalW2 (www.ebi.ac.uk). Se seleccionaron aquellas secuencias
reportadas en la literatura [60].
Tabla 3. Números de accesión de las secuencias de aminoácidos de las enzimas [NiFe]-
hidrogenasa seleccionadas para este estudio.
Microorganismo No. Accesión [NiFe]-hidrogenasa
Salmonella enterica NP461770
Citrobacter rodentium YP003366594
Escherichia coli K12 CAA35550
Klebsiella pneumoniae YP002920914
Enterobacter radicincitans CBB97125
2.3 Análisis de estructura de la enzima [NiFe]-hidrogenasa
Para realizar este análisis se utilizó el programa Cn3D-4.1, el cual es una
herramienta para visualizar la secuencia y estructura de una proteína determinada
[61]. Este programa también nos da las opciones de resaltar con color las regiones
25
de interés proporcionando mayor información de la enzima reportada de [NiFe]-
hidrogenasa por la técnica de cristalografía de rayos X. Se utilizó la secuencia de
aminoácidos de la subunidad grande hycE de la enzima y se visualizó en la estructura
de la enzima de E. coli No. Accesión CAA35550.1 de la secuencia de aminoácidos:
MSEEKLGQHYLAALNEAFPGVVLDHAWQTKDQLTVTVKVNYLPEVVEFLYYKQGGWLSVLFG
NDERKLNGHYAVYYVLSMEKGTKCWITVRVEVDANKPEYPSVTPRVPAAVWGEREVRDMYG
LIPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNNVVPIGPL
HVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRVCGICGFAHST
AYTTSVENAMGIQVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSGFMQFFRVRETSMK
MAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKDDMIQTRQLAQQMRREVQELVDVLLSTPNMEQRTVGIG
RLDPEIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMEVHSEQGCDVISRLKVRINEVYT
ALNMIDYGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGDDIHWSMTGDNQKLYRWRCRAAT
YANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTVVDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKN
S PLK
2.4 Diseño de oligonucleótidos
Con base a los datos analizados en cuanto a la secuencia y estructura de la enzima
se decidió diseñar oligonucleótidos para amplificar el fragmento que corresponde al
gen hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa, ya que se observó que
presenta varias ventajas para posteriores experimentos en las cuales se podrían
mutar aminoácidos específicos que están relacionados a la incorporación de Ni o Fe a
la enzima, y por su posición en la parte externa de la molécula es más probable que
sean llevados a cabo. Para esto se sintetizaron tres pares de oligonucleótidos de
acuerdo a la secuencia con número de accesión X17506 reportado para E. coli K12
como se ve en la Figura 8, con las letras marcadas con color rojo se indican la región
que se tomó de la parte inicial y la final para hacer la secuencia sentido (Forward) y
antisentido (Reverse).
26
Figura 8. Secuencia de nucleótidos del ge hycE de la enzima [NiFe] hidrogenasa E. coli K12.
En color rojo se indican las secuencias de los oligonucleotidos Forward (1- 20) y Reverse
(1661-1681).
Se seleccionó la secuencia que corresponde al gen hycE del operón hyc
A,B,C,D,E,FG,H,I, de 1700 pb aproximadamente, se sintetizaron los oligonucleótidos
5´-3´ y 3´-5´(IDT, Integrated DNA technologies) que corresponden a la subunidad
grande de la enzima [NiFe]-hidrogenasa como se muestran en la Tabla 4. En color
rojo se marcan las secuencias de las enzimas de restricción Nde I (CATATG) y Bam
HI (GGATCC) mas dos aminoácidos que se agregaron a la secuencia del gen en
H1°. En el oligo H2° son solo la secuencia del gen. En el oligo H3° se muestra en
color verde estas mismas secuencias más las que corresponden a las enzimas de
restricción pero sin el par de aminoácidos.
27
Tabla 4. Secuencias de oligonucleótidos sintetizados
Nombre Secuencia de nucleótidos
Forward H1o 5´-AACATATG TCTGAAG AAAAATTAGG-3´
Reverse H1o 3´-TTATTTCAGCGGCGAGTTT GGATCCAA-5´
Forward H2o 5´-ATGTCTGAAG AAAAATTAGG-3´
Reverse H2o 3´-TTATTTCAGC GGCGAGTTT-5´
Forward H3o 5´-CATATG ATGTCTGAAG AAAAATTAGG-3´
Reverse H3o 3´-TTATTTCAGC GGCGAGTTT GGATCC-5´
2.5 Material biológico
2.5.1 Cepas de Escherichia coli.
La bacteria seleccionada para la amplificación del gen de la enzima [NiFe]-
hidrogenasa fue E. coli debido a su fácil manipulación en el laboratorio. En la Tabla 5
se describen las cepas de que se utilizaron en los experimentos de PCR.
28
Tabla 5. Genotipos de cepas de E. coli utilizadas en este estudio.
Cepa Genotipo
BL21 E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(λS)
DH5α endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG
Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK
+), λ
JM109 endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14-
[F' traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15] hsdR17(rK-mK
+)
XL1-Blue endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+
lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK
+)
TOP10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG
recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ
2.6 Extracción de ADN genómico.
Se obtuvo ADN genómico de E. coli de cinco diferentes cepas comerciales: top 10, JM
109, BL21, DH5, Xl-blue, mediante el método CTAB/ fenol /cloroformo [55]. Este
método consistió en resuspender un asa de colonias de una placa de agar en 500 µl
de agua hasta una perfecta homogeneización, se agregaron 30 µl de SDS al 10 %,
se mezcló bien y se adicionaron 3 µl de proteinasa K (20 mg/ml) se incubó 60 minutos
a 37 ºC, se añadieron 100 µl de NaCl 5 M, se mezcló y se añadieron 80 µl de
CTAB/NaCl, se mezcló volteando el tubo e incubó durante 10 minutos a 65 ºC. Se
añadió un volumen de la solución fenol/cloroformo: alcohol isoamilico (25/24:1), se
mezcló volteando el tubo y se centrifugó 5 minutos a 8,000 rpm. Se extrajo la fase
superior procurando no tocar la interfase. Se añadió RNAsa a una concentración final
de 50 µg/ml y se incubó durante 30minutos a 37 ºC. Se extrajo con igual volumen de
cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Se centrifugó y se extrajo la fase superior.
29
Tomando en cuenta el volumen que se recuperó, se precipitó con 0.1 volumen de
acetato de sodio y 2 volúmenes de etanol frío, a -20º C toda la noche ó a -80º C por 1
hora. Se centrifugó a 12,000 rpm durante 20 minutos. Se retiró el etanol y se secó la
pastilla a 37 ºC. Se resuspendió en 50 µl de agua y se almacenó a -20 ºC.
2.7 Reacción de PCR con oligos diseñados para amplificar al gen que codifica
para la [NiFe]-hidrogenasa.
Para obtener el fragmento de las secuencias sintetizadas se utilizó la técnica de PCR
(reacción en cadena de la polimerasa) con la cual se amplificaron las secuencias de
ADN del gen hycE de [NiFe]-hidrogenasa. La cual se basa en hibridar los oligos
diseñados a partir mediante la actividad de la enzima Taq polimerasa. Para amplificar
un fragmento del gen de esta enzima se utilizaron los pares de oligos denominados
hidrogenasa H1º, H2º y H3º (Tabla 4). De estos oligos el primer par contiene
nucleótidos adicionales al inicio de la secuencia que codifican para un sitio de
restricción. También se realizaron amplificaciones con gradiente de temperatura para
buscar las condiciones ideales de hibridación de ADN.
Se hicieron mezclas de reacción para PCR de 25 µl conteniendo 2.5 ml de buffer 10X
para PCR (Invitrogen), 2 µl MgCl2 (50 mM), 1 µl de dNTPs (10 mM), 1 µl de cada uno
de los oligos Forward H y Reverse H (20 pm/l), 15.5 µl de agua destilada
desionizada esteril y 1 µl de la enzima Taq polimerasa (1U/pmol).
Se usó el siguiente programa de PCR : desnaturalización 95 oC por 30 s, seguido de
30 ciclos a 95 oC por 30 s, 55 oC por 30 s y 72 oC por 2 min; y una extensión final de
72 oC durante 15 min.
Los productos de PCR se verificaron en un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro
de etidio.
.
30
Figura 9. Vector de clonación pCR 2.1 TOPO (Invitrogen).
2.8 Clonación del fragmento amplificado.
Los fragmentos amplificados fueron ligados mediante una reacción al vector TOPO
TA (Cloning kit for sequencing, Invitrogen) como se describe a continuación: 3 l
producto de PCR, 1 l del vector TOPO, 1 l solución de sales (1.2 M NaCl; 0.06 M
MgCl2), 1 l agua estéril, 6 l volumen final, 15 min a temperatura ambiente. El
fragmento ligado se almacenó a -20 oC hasta su uso.
En la Figura 9 se muestra el mapa del plásmido TOPO (Invitrogen) de 3,900 pb, el
cual se utilizó para clonar el fragmento generado con la PCR, en negrillas se observa
el sitio de inserción para el producto de PCR.
31
Se obtuvieron células químicamente competentes de las cepas comerciales Top ten y
DH5 por el método de cloruro de calcio. El cual consistió en crecer toda la noche
hasta saturación el cultivo bacteriano a 37 oC a 200 rpm. Se tomó un inoculo de 1ml y
se creció en 100 ml de medio LB por 2.5 horas a 37 oC a 200 rpm hasta alcanzar una
OD600 0.5 se centrifugó y se resuspendió la pastilla en CaCl2 100 mM, se centrifugó
nuevamente y se resuspendió en un volumen de 860 l de Cacl2 100 mM y 140 l de
glicerol, se hicieron alícuotas se congelaron en nitrógeno liquido y se guardaron a -
80oC hasta su uso.
La transformación se realizó por choque térmico utilizando células competentes Top
ten (Invitrogen) en un tubo conteniendo las células top ten se adicionó 3 µl de la
reacción de ligación la cual consiste en 3 µl de producto de PCR, 1 µl de sales (NaCl
1.2 M, MgCl2 0.06 M ), 1 µl vector TOPO (Invitrogen). Esta reacción se mantuvo 30
min en hielo, posteriormente se incubó a 42 oC durante 90 segundos en un baño
seco, inmediatamente se puso en hielo y se agregó 1 ml de medio LB. Enseguida se
incubó una hora a 37 oC en agitación a180 rpm. Por último, se sembraron en cajas
petri con medio de selección LB con ampicilina (100µg/ml) y se incubaron toda la
noche en una estufa a 37 oC.
2.9 Extracción de ADN plasmídico.
Se tomaron pequeñas muestras de las colonias de E. coli top ten transformadas que
crecieron en el medio con antibiótico, se inocularon en 3 ml de medio liquido LB con
ampicilina (100µg/ml) toda la noche a 37 oC a 180 rpm. Posteriormente se tomaron
1.5 ml de este cultivo en tubos ependorff de 1.5 ml y se centrifugaron a 4000 rpm
durante 10 min, se descartó el sobrenadante y la pastilla fue resuspendida en 100μl
del buffer 1(Tris HCl 50 mM pH 8.0; EDTA 10 mM; sacarosa 50 mM). Se añadió 100μl
del buffer 2 (NaOH 0.2N; SDS 1%), se mezcló por inversión e incubó a temperatura
ambiente durante 5 min.
Seguidamente se añadió 300μl del buffer 3 (Acetato de potasio 3.5 M, pH 5.5), se
mezcló por inversión e incubó en hielo durante 15 min. Luego se centrifugó a 10,000
rpm, durante 10 min. El sobrenadante que contiene el DNA plasmídico se transfirió a
un nuevo tubo para agregar 100 ml de fenol:cloroformo (1:1) y se mezcló por
32
inversión. Se centrifugó a 10,000 rpm por 5 min. La fase acousa se transfirió a un
nuevo tubo y se agregó 0.7 volumen de isopropanol e incubó a -20 oC 30 min
Posteriormente se centrifugar a 14 000 por 10 min, se eliminó el sobrenadante y se
procedió a lavar el precipitado con 1000 l de etanol al 70 %, se centrifugó y eliminó el
sobrenadante para posteriormente secar y resuspender la pastilla de ADN en agua
estéril. Para verificar la integridad del ADN plasmídico se realizó una electroforesis en
un gel de agarosa al 1%, a 70 volts durante 30 min.
2.10 Digestión de plásmidos
Para verificar la presencia del inserto en el plásmido, se realizó una reacción de
restricción enzimática utilizando 2 µl de ADN plasmídico de cada clona con el inserto
de hidrogenasa, 1 µl de la enzima Eco RI (Invitrogen), 3 l de buffer React 3 (10X)
(Invitrogen) y 24 µl de agua para un volumen final de 30 µl. Se incubó a 37 oC durante
2 horas.
2.11 Subclonación en un plásmido de expresión con una etiqueta de histidina
Se obtuvo un plásmido pET15b-hidrogenasa:6 his-tag, mediante la subclonación del
fragmento amplificado con los oligonucleótidos específicos para el gen hycE en un
vector de expresión que contiene una etiqueta de 6 histidinas llamado pET15b el cual
mide 5,708 pb.
La reacción de ligación consistió de: 4 l de buffer de ligación 5X, 1 l de enzima T4
ligasa 5 U/l (Invitrogen), 5 l de pET-15b, 5 l del inserto, 5 l agua, a temperatura
ambiente toda la noche.
La etiqueta de histidinas del vector pET 15b le confiere la ventaja de permitir la
purificación de la proteína por columna de afinidad en un solo paso, lo que permite
obtener la proteína de manera más rápida y más pura. El vector pET-15b contiene
un extremo N-terminal His • Tag ® secuencia seguida por un sitio de trombina y tres
sitios de clonación. Los sitios únicos se muestran en el mapa (Figura 9). La secuencia
33
está numerada por convención pBR322, por lo que la región de expresión T7 se
invierte en el mapa circular. La región de clonación/expresión de la cadena codificante
es transcrito por la T7 RNA polimerasa. Este plásmido contenido en la bacteria E. coli,
se purificó antes de su uso en la ligación de una maxi preparación para obtener el
ADN plasmídico por columna de intercambio aniónico y se hizo una reacción de
digestión con las enzimas NdeI y Bam HI a 37oC durante 4 horas. Para verificar la
ligación del inserto se realizaron reacciones de digestión y de PCR.
Figura 10. Mapa del vector de expresión pET-15b.
34
2.12 Análisis del perfil de expresión de proteínas totales y extracto purificado
de una clona de E. coli BL21 putativamente transformada con pET 15b-
hidrogenasa:6 his-tag.
El patrón de expresión de las proteínas se realizó con la extracción de proteínas
totales de las clonas que se seleccionaron como positivas las cuales fueron inducidas
con IPTG 0.5 mM durante 1 hora a temperatura ambiente, se tomaron 2 ml de un
cultivo bacteriano crecido a 37 oC toda la noche en medio de cultivo LB. La pastilla
obtenida se resuspendió en buffer de extracción (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl; 1 mM
EDTA; 10% glicerol; 1 mM mercaptoetanol; 200 mM fenilmetil sulfonil (PMSF) 1%
PVP) disuelta con el uso de un homogenizador durante 30 segundos en hielo tres
veces. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford. Las
proteínas totales fueron separadas en un gel desnaturalizante al 10% por
electroforesis. La electroforesis se realizó con base en el sistema discontinuo
propuesto por Laemmli. Se ensambló el equipo de electroforesis (ProteanR plus
Dodecell, de Bio-rad) según las instrucciones del fabricante. Previamente los cristales
se limpiaron con etanol al 70% (v/v) ya que se encuentran en contacto directo con el
gel y evitar manchas. Se preparó la solución para los geles de poliacrilamida SDS-
PAGE (10% con 0.75 mm de espesor), se vertió en los cristales, se agregó
isopropanol y se dejó polimerizar por 30 min. Se preparó en gel concentrador y se
corrió a 100 voltios durante 2 horas.
Posteriormente se realizó la tinción con solución de Coomasie 15 min en agitación
suave, se lava con agua el exceso de colorante y se destiñe con una solución de
acido acético 10% y metanol 45% en agitación suave y realizando cambios de
solución cada15 min. 2 o 3 veces. Por último se digitalizó el gel en un escáner.
La purificación de las proteínas de realizó por medio de una columna de níquel. Se
crecieron las clonas seleccionadas toda la noche en 3 ml de medio de cultivo LB mas
ampicilina (100 g/ml). Se inocularon 2 ml de este cultivo en 200 ml de medio LB mas
ampicilina hasta alcanzar una D.O. 0.6, se adicionó IPTG 0.5 mM durante 1 hora a 37
oC. Se centrifugó 5000 rpm 5 min, se descartó el medio y se resuspendió la pastilla
en 50 ml de buffer (100 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, EDTA 1
mM) y Lisozima 100 l (0.1g/ml) se sonicó 3 veces en un politrón 30 segundos cada
vez, se centrifugó nuevamente a 5000 rpm 5 min y se apartó 1 ml del sobrenadante
35
que son las proteínas totales (Input) y el resto se incubó con la suspensión agar-
níquel durante 1 hora a 4 oC, posteriormente se centrifugó a 1000 rpm 5 min, se
eliminó el sobrenadante (se apartó para correr como proteínas no incorporadas FT) se
lavó la pastilla con el buffer dos veces y se eluyeron las proteínas de las esferas de
níquel con 500 l del mismo buffer mas 250 mM de Imidazol por centrifugación a 1000
rpm durante 5 min 3 veces.
Posteriormente se cargaron las fracciones proteicas en un gel de poliacrilamida al
10% y por electroforesis se separaron las proteínas, por último se realizó una tinción
con nitrato de plata.
Se lavó el gel con agua y se hidrató durante 20 min con etanol al 30% (v/v)
Posteriormente los geles se pre-trataron con una solución al 0.02% (p/v) de tiosulfato
de sodio por 1.5 min, en oscuridad, inmediatamente los geles fueron lavados con
agua por un minuto con tres cambios cada 20 s. Luego los geles se incubaron en una
solución de nitrato de plata al 0.2% (p/v) y formaldehido al 0.03% (v/v) por 20 min en
oscuridad. Después del periodo de incubación, la solución de plata fue eliminada y se
lavó con agua dos veces por 20 s. Después se llevó a cabo el revelado con una
solución de carbonato de sodio al 6% (p/v), formaldehido al 0.019% (p/v) y 0.4 mM de
tiosulfato de sodio. Después de adquirir la intensidad de tinción deseada se eliminó la
solución reveladora y la reacción fue detenida con una solución de EDTA al 1.5%.
36
3 CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Análisis in silico de secuencias de [NiFe]-hidrogenasas
Las secuencias de aminoácidos correspondientes a la subunidad grande de la enzima
[Ni Fe] hidrogenas, fueron obtenidas del Genbank y se ha identificado secuencias
similares para diferentes especies las cuales se ha reportado que producen
hidrógeno. Se realizó una alineación de estas secuencias en el programa CLUSTAL
W 1.83 [56]. En la Figura 10, se puede observar que estas secuencias comparten
sitios catalíticos y dominios conservados, lo que sugiere que pueden ser los sitios
probables para hacer mutaciones e incrementar la eficiencia de esta enzima en la
producción de hidrógeno Maeda et al [57] demostraron un incremento en la
producción de hidrógeno al realizar mutaciones en cuatro cisteínas de E. coli (Cys241,
Cys244, Cys531 y Cys534) marcadas en rojo en las secuencias de la Figura 10. En los
rectángulos verdes se señalan los dominios conservados correspondientes al
complejo 1 de la NADH deshidrogenasa y la superfamilia NiFeSe hidrogenasa [54].
37
Salmonella MSEEKLGQQYLAALHQAFPGVVLDEAWQTKDQLTITVKVNYLPEVVEFLYYQQGGWLSVL 60
Citrobacter MSEEKLGQQYLAALHQAFPGVVLDEAWQTKDQLTITVKVNYLPEVVEFLYYKQGGWLSVL 60
Escherichia MSEEKLGQHYLAALNEAFPGVVLDHAWQTKDQLTVTVKVNYLPEVVEFLYYKQGGWLSVL 60
Klebsiella MSEEKIGQHYLAALHQAFPGVVLDEAWQTKDQLTVTVKVNYLPEVVEFLYYKQGGWLSVL 60
Enterobacter MSEEKIGQHYLAALHEKFPGVVLDEAWQTKDQITLTVKVNYLPEVVEFLYYQQGGWLSVL 60
*****:**:*****:: *******.*******:*:****************:********
Salmonella FGNDERQLCGHYAVYYVLSMEQGTKCWITVRVEVDANKLEFPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120
Citrobacter FGNDERQLCGHYAVYYVMSMEQGTKCWITVRVEVDANKLEFPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120
Escherichia FGNDERKLNGHYAVYYVLSMEKGTKCWVTVRVEVDANKPEYPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120
Klebsiella FGNDERKLNGHYAVYYVLSMEQGTKCWITVRVEVDANKPEYPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120
Enterobacter FGNDERKLNGHFAVYYVLSMEQGVKCWITVRVEVDALKPEYPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120
******:* **:*****:***:*.***:******** * *:*******************
Salmonella MYGLIPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNN 180
Citrobacter MYGLIPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNN 180
Escherichia MYGLIPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNN 180
Klebsiella MYGLVPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGTKKNN 180
Enterobacter MYGLVPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNN 180
****:************************************************** ****
Salmonella VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240
Citrobacter VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240
Escherichia VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240
Klebsiella VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240
Enterobacter VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIVDADYRMFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240
**************************:*****:***************************
Salmonella CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIQVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSG 300
Citrobacter CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIVVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSG 300
Escherichia CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIQVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSG 300
Klebsiella CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIVVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSG 300
Enterobacter CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIVVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFVGFDSG 300
********************** *******************************.*****
Salmonella FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKEDMIQTRQLAQQMRRDVQELV 360
Citrobacter FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKEDMIQTRQLAQQMRRDVQELV 360
Escherichia FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKDDMIQTRQLAQQMRREVQELV 360
Klebsiella FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKEDMIQTRQLAQQMRRDVQELV 360
Enterobacter FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDMLKDDMVQTRALAQQMRRDVMELV 360
************************************:**:**:*** *******:* ***
Salmonella DMLLSTPNMEQRTVGIGRLDPEIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMEVH 420
Citrobacter DMLLSTPNMEQRTVGIGRLDPEIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMEVH 420
Escherichia DVLLSTPNMEQRTVGIGRLDPEIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMEVH 420
Klebsiella DMLLSTPNMEQRTVGIGRLDPQIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMTVH 420
Enterobacter DVLMSTPNIEQRTVGIGRLDPQIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFAGYGLLPMTVH 420
*:*:****:************:***************************.******* **
Salmonella SEQGCDVISRLKVRINEVYTSLNMIDFGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGD 480
Citrobacter SEQGCDVISRLKVRINEVYTALNMIDFGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGD 480
Escherichia SEQGCDVISRLKVRINEVYTALNMLDYGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGD 480
Klebsiella SEQGCDVISRLKVRINEVYTALNMIDFGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFSEAPRGD 480
Enterobacter SEQGCDVISRLKVRINEVLTALNMIDFGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGD 480
****************** *:***:*:**************************:******
Salmonella DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540
Citrobacter DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540
Escherichia DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540
Klebsiella DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540
Enterobacter DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540
************************************************************
Salmonella VDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKNSPLK 569
Citrobacter VDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKNSPLK 569
Escherichia VDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKNSPLK 569
Klebsiella VDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKNSPLK 569
Enterobacter VDVRKKRSKVVPYKELERYGIERKNSPLK 569
******:************.*********
38
Figura 11. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de microorganismos que contienen la
[NiFe]-hidrogenasa. Las letras marcadas con un asterisco representan aminoácidos idénticos;
las letras marcadas con puntos representan aminoácidos con propiedades similares. Los
dominios conservados están marcados en rectángulos verdes. Las flechas indican cisteínas
importantes.
3.2 Análisis de la estructura tridimensional de la subunidad grande de la
enzima [NiFe]- hidrogenasa
Para realizar este análisis se utilizó como modelo la estructura de la [NiFe]-
hidrogenasa de E. coli, obtenida por cristalografía de rayos X (Figura 11), que está
bastante conservada en diferentes especies, por lo que se usó como base para
analizar la estructura y sitios de unión a los metales que contiene esta proteína [58].
39
Figura 12. Modelo estructural molecular de la enzima [NiFe]-Hidrogenasa. La flecha amarilla
indica el sitio activo de la enzima [58].
En la Figura 12 se observa la imagen amplificada de los aminoácidos cercanos a los
sitios catalíticos o en los sitios de unión a los metales de las enzimas que podrían
mejorar la producción de hidrogeno. Fritsch et al. [54], propusieron la transferencia
de agua a la superficie cerrada por puentes de sal formada entre Arginina 88 y
residuos de glutamato, Glu 107 y Glu 308. También identificaron dos rotámeros de
glutamina 308 que indica una apertura transitoria, por lo tanto, los datos estructurales
son compatibles con una traslocación controlada de moléculas de agua
probablemente acompañado de protones, apoyando el modelo de que las
hidrogenasas tolerantes a O2 forman agua como un subproducto durante la
40
conversión catalítica de H2 en presencia de O2 . Estas modificaciones han generado
algunas mutantes que han elevado la producción de hidrogeno de 0.3 mol/mg
proteína/hora hasta 9 mol/mg proteína/hora.
Figura 13. Modelo propuesto para mutagénesis dirigida de la enzima [NiFe]-hidrogenasa de E.
coli. Las esferas representan al hierro, níquel y magnesio.
Se ha demostrado que la activación de hidrógeno está mediada por el centro de
níquel y que los grupos sulfuro-hierro probablemente están involucrados en la
transferencia de electrones entre el sitio activo, la superficie molecular y de los
interlocutores redox de la enzima, como los citocromos y ferredoxinas [59].
41
En la Figura 13 se señala en color amarillo claro (cinta) la subunidad grande de la [Ni
Fe] hidrogenasa de E. coli de nuestro interés y se puede observar que su posición
espacial en la molécula está en una región expuesta por lo que se podrían realizar
con mayor facilidad las modificaciones de algunos aminoácidos para mejorar su
actividad catalítica como han propuesto algunos autores [54].
Figura 14. Modelo estructural de la enzima [NiFe]- hidrogenasa. La cinta en color amarillo
claro representa la secuencia del gen hycE. A y B son la misma estructura rotando la
molécula.
A
B
42
Al ser esta proteína, importante para la incorporación del níquel a la molécula y estar
ubicada espacialmente en una región externa se puede sugerir que la mutación de los
aminoácidos cercanos a este sitio podría tener resultados positivos en la producción
de hidrógeno.
Si consideramos que la distancia entre los átomos del centro activo y los ligandos
metálicos unidos a ellos tienen una función clave en la actividad y tolerancia al
oxígeno en la mayoría de las hidrogenasas, entonces es posible proponer un modelo
para futuros estudios de mutagénesis dirigida.
Las comparaciones de secuencias, los datos estructurales y las propiedades
espectroscópicas indican que, aunque las hidrogenasas no están filogenéticamente
relacionadas, poseen algunas similitudes notables en la arquitectura molecular del
sitio activo, es decir, la presencia de cianuro y/o de carbono como ligandos de los
metales. Las enzimas [NiFe]-hidrogenasas son de gran interés biotecnológico en
relación a su uso potencial en celdas de combustible. Estudios realizados con [NiFe]-
hidrogenasa de la proteobacteria Ralstonia eutropha H16 se obtuvieron células
mutantes de hypX- y mostraron un retardamiento en su crecimiento en condiciones
normales aeróbicas, lo que demuestra que la tolerancia al oxígeno de la enzima
requiere la función de HypX. Por tanto, se sugiere que el ligando CN es importante
para la tolerancia al oxígeno [5].
3.3 Obtención de ADN genómico de E. coli.
El protocolo reportado para obtener ADN genómico se basa en el uso de CTAB y se
utilizó para las cinco cepas de E. coli, DH5, XL-Blue, BL21, JM109 y Top 10 que
posteriormente se usaron en los ensayos de PCR. El ADN se visualizó por medio de
electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. En la figura 15
se observa la integridad del ADN de alto peso molecular. Aunque debido a que todas
mostraron presencia de ARN se realizó una reacción de digestión con la enzima
RNAsa.
43
M 1 2 3 4 5 6
Figura 15. Electroforesis de ADN genómico de E. coli, M, marcador de peso molecular (1Kb)
cepas 1.DH5α, 2. BL 21, 3. Sin muestra, 4. JM 109, 5. XL-Blue, 6. Top ten.
Con base a los datos analizados en cuanto a la secuencia y estructura de la enzima
se decidió amplificar el fragmento que corresponde al gen hycE de la [NiFe]-
hidrogenasa, ya que se observó que presenta varias ventajas para posteriores
experimentos en las cuales se podrían mutar aminoácidos específicos que están
relacionados a la incorporación de Ni o Fe a la enzima y por su posición en la parte
externa de la molécula es más probable que sean llevados a cabo, para esto se
enviaron a sintetizar tres pares de oligonucleótidos de acuerdo a la secuencia con
número de accesión X17506 reportado para E. coli K12 como se ve en la Figura 12,
con las letras marcadas con color rojo se indican la región que se tomó de la parte
inicial y la final para hacer la secuencia sentido (Forward) y antisentido (Reverse).
El primer par de oligos corresponde a la secuencia del gen más la secuencia de las
enzimas de restricción Bam HI y Nde I y tres nucleótidos extra que se agregaron para
poder identificar el inserto. Al no obtener el fragmento esperado se decidió hacer un
segundo par de oligos sin las secuencias agregadas y posteriormente reamplificar con
el primer par que se tenía. Por último y al no obtener una banda del tamaño esperado
con los oligos anteriores se diseñó un tercer par de oligos sin nucleótidos extras
1018 pb
1636 pb
44
conteniendo solo las secuencias de las enzimas de restricción Nde I y Bam HI en los
extremos 3´ de cada uno.
3.4 Obtención de un amplicón con los oligos diseñados para amplificar al gen
hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa.
Para la obtención del amplicón, se llevaron a cabo reacciones de PCR tomando en
cuenta la temperatura de fusión (Tm) de los oligos sintetizados. Se utilizó el primer
par de oligos (H1o) que contiene las secuencias de las enzimas de restricción pero no
se observó el fragmento esperado de 1700 pb aproximadamente. Por lo que se
realizó otro ensayo a la temperatura (Tm) que arroja el programa gratuito de internet
Appliedbiosystems.com sin resultados positivos y posteriormente un PCR con
gradiente de temperatura sin los resultados esperados. Al no observar ninguna banda
se enviaron a sintetizar los siguientes pares de oligonucleótidos (H2o) pero sin la
secuencia de las enzimas de restricción. Se realizó una PCR con un segundo par de
oligonucleótidos de la hidrogenasa y se observó un barrido de ADN por lo que se
procedió a realizar un gradiente de temperatura para tener una mejor reacción de
amplificación del fragmento.
Se realizó un ensayo de PCR usando un gradiente de temperatura de alineamiento de
60 a 50º C analizando tres puntos solamente (60°C, 56.5°C y 50.7°C) utilizando como
plantilla el ADN genómico de las cinco cepas de E. coli (Tabla 5). En la Figura 16 se
observó la amplificación del fragmento esperado de aproximadamente 1700 pb de
las cinco cepas de E. coli. La línea 1 es top ten; línea 2 es DH5; línea 3 es BL21;
línea 4 es JM109 y línea 5 es BL21. Sin embargo, también se observó amplificación
inespecífica lo cual se presenta como otras bandas de diferentes tamaños. Aunque en
todas las cepas y prácticamente en todas las temperaturas probadas se observa la
banda de interés, se puede observar una mayor intensidad a 56 °C y en las cepas
DH5 y BL21. Debido a la amplificación inespecífica obtenida, se realizó una
reamplificación con el producto de PCR correspondiente a BL21 a 56º C ya que a
esta temperatura hubo una mejor amplificación. En la Figura 17 se observa el
amplicón esperado de 1700 pb. También se puede corroborar que al modificar la
45
temperatura el amplicón fue más específico, pues solo se observa una banda del
tamaño esperado.
Figura 16. Electroforesis del producto de PCR gradiente de temperatura con oligos
hidrogenasa 2o. M Marcador 1 Kb, 1 top 1.0, 2.DH5α, 3.BL21, 4. JM 109, 5.XL-Blue.
M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
10
M 1 2 3 4 5
60 o C 56.5 o C
50.7 oC
1636 pb
1018 pb
1636 pb
1018 pb
46
Figura 17. Electroforesis del producto de PCR con los oligos H2° diseñados para amplificar al
gen hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa.
El producto de PCR se clonó en el vector TOPO (Invitrogen) se transformaron células
competentes top ten contenidos en el kit de clonación por choque térmico y se
seleccionaron las colonias en medio de cultivo con ampicilina posteriormente se
realizó la obtención de ADN plasmídico como se muestra en la Figura 18. Se observó
el marcador de 1 kb (M) y el peso aproximado del plásmido más el inserto de la
hidrogenasa de 5700 pb aproximadamente marcado con la flecha.
Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa 1% de la minipreparación de clonas positivas con
ADN plasmídico de hidrogenasa.
1636 pb
M H2°
1636 pb
1018 pb
1018 pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14 15 16 17 18 19 20
47
Se seleccionaron las clonas de tamaño cercano al esperado y posteriormente se hizo
una digestión con la enzima Eco RI para liberar el fragmento. Dato no mostrado.
Con el ADN plasmídico obtenido de las minipreparaciones se amplificó por PCR
utilizando el tercer par de oligonucleótidos (H3o) los cuales tienen las secuencias de
las enzimas de restricción como se observa en la Figura 19 el fragmento esperado es
de 1700 pb aproximadamente. M es el marcador de peso de 1Kb.
Figura 19. Electroforesis en gel de agarosa 1% del producto de PCR de hidrogenasa con los
oligos H3o,
M marcador 1 Kb, línea 1 producto de PCR.
El producto de PCR se clonó nuevamente en el vector TOPO (Invitrogen), se
transformaron células competentes top ten y se realizó la extracción de ADN
plasmídico, se enviaron a secuenciar cinco clonas a la universidad de Clemson y no
se obtuvieron resultados positivos de la secuencia debido a la calidad del ADN. Dados
estos resultados se hizo un análisis de restricción utilizando las enzimas Nde I y Bam
48
HI para poder ver el fragmento correspondiente a la hidroegensa pero por la poca
cantidad de ADN no se aprecia bien en la foto del gel la banda correspondiente por lo
tanto no se muestra este dato. Se cortó la banda y se eluyó del gel de agarosa, se
precipitó con glucógeno para obtener el ADN del gen de la hidrogenasa y
posteriormente se hizo la ligación al vector de expresión pET15-b.
3.5 Obtención del plásmido de expresión pET 15b-hidrogenasa y
transformación de E. coli cepa BL21.
El vector o plásmido de expresión pET-15b se purificó y se digirió con las enzimas
Nde I y Bam HI, para linealizar el plásmido posteriormente se utilizó para ligar con el
fragmento obtenido del gen hidrogenasa mediante la T4 ligas. Esta reacción se utilizó
para transformar por choque térmico las bacterias. A las colonias que crecieron en el
medio selectivo con ampicilina se les extrajo el ADN plasmídico (Figura 20) y se pudo
observar una banda de aproximadamente 7400 pb que corresponde al tamaño de
pET-15b-hidrogenasa:6his-tag de 5700 pb más 1700 pb del inserto.
49
Figura 20. Electroforesis de la minipreparación de clonas del vector de expresión pET 15b-
hidrogenasa:6 his-tag. M: Marcador de peso molecular de 1 Kb.
En 2010, Kim et al [62] citó que la cepa de E. coli BL21 recombinante que
sobreexpresa al gen de la [NiFe]-hidrogenasa 1 produce 12.5 ml H2/(h-L) en
condiciones de micro-anaerobiosis, mientras que la cepa silvestre no genera gas H2.
Es necesario comprobar si las clonas obtenidas en este trabajo efectivamente
contienen al gen recombinante hycE y si éste está siendo sobreexpesado. De ser así,
estas clonas podrían usarse en ensayos de hidrógeno similares a los antes descritos.
3.6 Patrón de expresión de proteínas totales y de extracto purificado de las
clonas obtenidas de E. coli.
Como resultado del experimento de transformación de E. coli cepa Bl21 con pET-15-
hidrogenasa:6 his-tag, se obtuvieron varias colonias que fueron resistentes al medio
M clona 1 clona 2
1018 pb
1636 pb
50
de selección, por lo que se sugirió que deberían contener el mencionado plásmido. De
estas se seleccionaron dos clonas. Se eligieron las clonas 1 y 2, se obtuvo el extracto
de proteínas totales de cada una. Se obtuvo el perfil de expresión de proteínas totales
en un gel de poliacrilamida al 10% teñido con azul de Coomasie. Se sabe que la
proteína correspondiente a la hidrogenasa es de aproximadamente 55 kDa que
corresponde a la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa [58].
51
Figura 21. Patrón de proteínas de dos clonas de pET 15b: hidrogenasa. Los productos fueron
separados en un gel de poliacrilamida al 10 %, por electroforesis con dodecilsulfato de sodio
(PAGE-SDS) y teñido con azul de Coomassie. La flecha indica la proteína de 55 kDa.
Se puede observar en la figura 21 las proteínas de células BL21 sin transformar, las
clonas positivas y estas mismas proteínas inducidas con IPTG y el marcador de masa
molecular (Fermentas). Como control de carga de las proteínas en el gel se utilizó
tinción con el reactivo de Bradford (dato no mostrado). Se observa un cambio en la
intensidad de la banda que corresponde a la proteína de 55 kDa. Cuando añadimos
el IPTG, se induce el gen de la polimerasa de T7, proteína que transcribe a gran nivel
el gen que hemos clonado.
Posteriormente se utilizó un protocolo de purificación de proteínas para la clona 1
teniendo en cuenta que la secuencia clonada en el vector pET-15b se encuentra en el
Clona 2 Clona 1 Clona 1 Clona 2 Clona 1 BL21 M
+ IP
IPTG
55 kDa
+ IPTG
72 kDa
52
mismo marco de lectura que las 6 histidinas del vector. Esta purificación se realizó a
partir de un cultivo bacteriano utilizando una columna de afinidad de Níquel-agarosa.
Figura 22. Purificación de proteínas por columna de níquel de la clona 1 de E. coli BL21.
Marcador de proteínas, línea 1 proteínas totales, línea 2 proteínas no incorporadas, línea 3
proteínas eluidas de la columna. Electroforesis PAGE-SDS gel de poliacrilamida 10 % teñido
con nitrato de plata.
En la figura 22 se observa una banda de una masa molecular aparente de 55 kDa.
Esta línea corresponde a la clona 1 que fue pasado por una columna de níquel-
agarosa. Posteriormente se eluyeron de la columna con imidazol (linea 3) se observa
una banda mas separada que puede ser la subunidad grande del gen hycE de la
M 1 2 3
55 kDa
72 kDa
53
hidrogenasa de E. coli por su masa molecular de tamaño similar al reportado. El gel
de acrilamida al 10 % se tiñó con nitrato de plata.
Rossmann [36] purificó la subunidad grande HYCE de E. coli demostrando que es un
polipéptido que contiene níquel, el cual está sujeto al procesamiento proteolítico C-
terminal. También, observaron que la formación de sitios activos en [NiFe]
hidrogenasas de bacteria requiere, además de los productos de los genes
estructurales, proteínas auxiliares que son codificadas por los llamados genes hyp. En
E. coli, la función pleiotrópica del gen hyp es particularmente evidente ya que las
mutaciones en la mayoría de los genes de hyp afectan la de actividad de las tres
isoenzimas hidrogenasas de este organismo. Aunque las formas de la subunidad
grande de la hidrogenasa 3 en los mutantes hyp presentan una apariencia idéntica en
la migración en geles de SDS, difieren en dos importantes aspectos. (a) La forma
presente en los mutantes hyp parece estar libre de níquel, mientras que la preforma
de la subunidad grande en el mutante hycH se asocia con el níquel. Esto indica que la
incorporación de níquel en la subunidad grande es un requisito previo para el
procesamiento C-terminal.
54
CONCLUSIONES
Al analizar las secuencias de genes de hidrogenasas de diferentes microorganismos
complementado con el análisis de estructura, se eligió la secuencia del gen hycE
correspondiente a la subunidad grande de la enzima [NiFe]-hidrogenasa 3 de E. coli,
involucrada en la maduración de la enzima y también debido a su tolerancia al
oxígeno lo cual representa una ventaja importante.
Se identificaron dominios estructurales de la enzima [NiFe]-hidrogenasa que podrían
permitir futuros estudios de mutagénesis de este gen con el fin de ampliar sus
aplicaciones biotecnológicas para la producción de hidrógeno a gran escala en E. coli.
Se obtuvo por PCR el fragmento de aproximadamente 1700 pb correspondiente a la
enzima [NiFe]-hidrogenasa.
Se obtuvieron clonas de la construcción pET15b-hidrogenasa:6 hist-tag.
Se obtuvo el patrón de expresión de las proteínas de las clonas obtenidas con el
inserto y se purificaron por afinidad en columna de níquel-agarosa. Se observó la
proteína de 55 kDa de la subunidad grande de la enzima [NiFe]-hidrogenasa.
55
PERSPECTIVAS
La combinación de técnicas como la cristalografía de rayos X, biología molecular y
espectroscópica ha marcado el ritmo acelerado de estudio de las enzimas
hidrogenasas. La comprensión de cómo funcionan estas enzimas es un punto clave
para la creación de dispositivos biomiméticos y biotecnológicos para la producción de
energía. Más de un centenar de hidrogenasas se han caracterizado genética y/o
bioquímicamente. También mediante la comparación de sus secuencias de
aminoácidos, se ha podido identificar subgrupos de clases de las enzimas, para
comparar y correlacionar información bioquímica, genética y fisiológica en relación
con los miembros de los subgrupos, independientemente de su origen y sus diversas
funciones en el metabolismo energético.
Con los resultados obtenidos en el presente estudio es posible sugerir mutaciones en
los sitios catalíticos de la enzima [NiFe]-hidrogenasa 3 de E. coli y se podría utilizar la
generación de mutantes para verificar los cambios en la producción de hidrogeno.
Por otro lado se utilizarán las bacterias que sobreexpresen el gen hycE en celdas de
combustible microbianas para la producción de hidrogeno o el dispositivo biológico
para generar hidrogeno llamado Celda de Electrolisis Microbiana (CEM), el cual es
capaz de electrolizar cualquier sustrato biodegradable, como por ejemplo la materia
orgánica presente en aguas residuales, y convertirla directamente a hidrogeno y CO2
que tiene como principal objetivo convertir la energía química en eléctrica.
Es importante mencionar que se realizará la secuenciación nuevamente de las clonas
que hemos analizado por otros métodos. Para verificar que tenemos clonados el gen
hycE.
56
Anexo 1. Articulo de divulgación aceptado en la revista Ciencia de la
Academia Mexicana de Ciencias.
“El biohidrógeno: la fuente de energía del futuro”
Ángela Ku González y Enrique Castaño de la Serna
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C.
Calle 43 No. 130 Col. Chuburná de Hidalgo., Mérida, Yuc, Méx.
CP 97200. Tel: (52) 999 942 83 30; [email protected].
Palabras clave: biohidrogeno, enzimas, hidrogeno.
57
En la actualidad, la población ve como se acaban lentamente las fuentes de
petróleo, el mayor generador de energía, y también puede palpar el declive
ecológico que ha ocasionado. Generando temor y conciencia ecológica. ¿Cuál
será el futuro? La búsqueda de fuentes alternas de energía volvió a tomar vigor
en los últimos años. Algunas fuentes ya olvidadas como el bioetanol o el biodiesel
después de cien años de abandono empezaron a tomar fuerza. Sin embargo,
nuestra demanda energética exige fuentes de energía alternas. Pero sobre todo
que no compitan con la demanda alimenticia y que no utilicen extensiones
territoriales destinadas a la agricultura. Así mismo, la reciente conciencia
ecológica requiere de fuentes de energía que no causen estragos ecológicos en el
futuro, como la emisión de gases de efecto invernadero. Una solución en un
futuro cercano es el hidrogeno, este gas cuando es producido a partir de un
sistema biológico se le denomina biohidrógeno.
58
El Hidrogeno es el compuesto más abundante en el universo y cuando interactúa
con el oxígeno para formar agua libera una gran cantidad de energía. Siendo el
producto resultante agua pura que puede ser reutilizada para volver a producir
hidrogeno y oxígeno. Para lograr esto, se requiere de un sistema que permita
romper la molécula de agua para obtener hidrogeno y oxigeno. Al igual que un
sistema que permita utilizar los iones de hidrogeno (H+) para producir gas H2.
Existen diversos métodos para lograrlo incluyendo procesos de alta presión con
electrólisis de agua, fotoelectroquímicos y termoquímicos. Los cuales se asocian
bastante con el enfriamiento de reactores nucleares. Pero uno de los más
interesantes es el uso de organismos que realicen el proceso de forma natural.
La realidad es que este proceso lo realizan diariamente las plantas y algas
utilizando la energía solar y sistemas enzimáticos para la producción de azucares
donde el agua junto con el bióxido de carbono y energía se combinan para
producir azucares. En los sistemas de bioetanol se utilizan estos azucares para
producción de alcoholes y en los sistemas de biodiesel requiere de un mayor
proceso bioquímico para que las plantas generen aceites que puedan utilizarse
59
posteriormente para la producción de diesel. Es claro que cada proceso involucra
una pérdida de energía. Por lo cual la eficiencia resultante del proceso decae con
el número de conversiones moleculares. La mayor eficiencia claramente recae
sobre el proceso primario. Algunas algas como las cianobacterias, se han
utilizado durante los últimos años para lograr la producción de hidrógeno. Las
cianobacterias son un grupo grande y diverso de organismos procariotas oxigeno
fototropicos. Es decir, muchos de ellos tienen la habilidad de producir hidrogeno.
Por lo menos 14 géneros de cyanobacteria producen hidrogeno bajo diversas
condiciones de cultivo. Entre estas destacan Cianobacteria Gloeocapsa alpicola
que bajo deficiencias de sulfuro muestran un incremento en la producción de
hidrogeno. Arthrospira (Spirulina platensis) puede producir hidrogeno en
obscuridad y condiciones anaeróbicas. Mientras que la cianobacteria Anabaena
cylindrica, produce hidrogeno y oxígeno simultáneamente en una atmosfera de
argón por 30 días con luz limitada. Las cianobacterias simbióticas con las raíces
de cada una (Cycas revolute) y Zamia furfuracea muestran una gran cantidad de
producción de hidrogeno. Entre ellas destaca Anabaena cylindrica que produce la
mayor cantidad de hidrogeno (30 ml of H2/lit de cultivo /h).
La conversión de agua en hidrogeno y oxigeno requiere de enzimas, en particular
nitrogenasas o hidrogenesas.
Las nitrogenesas se encuentran en los quistes filamentosos de las cianobacterias
cuando crecen en condiciones limitantes de nitrógeno. El hidrogeno es producido
como un subproducto en la fijación de nitrógeno a amoniaco. La reacción
consume ATP (trifosfato de adenosina), que son unidades de energía, y en forma
general sigue esta ecuación.
16 ATP + 16 H2O + N2 + 10H+ + 8e- →Nitrogenasa→ 16 ADP +16 Pi + 2NH4+ +
H2
60
Mientras que las hidrogenasas existen en dos tipos diferentes de cianobacterias.
Una de ellas tiene la habilidad de oxidar el hidrogeno (codificada por el gen
hupSL) y la otra de ser una hidrogenasa bidirecional (codificada por el gen
hoxFUYH) que puede consumir o producir hidrogeno. Las hidrogenasas que
consumen hidrogeno se encuentran en los tilacoides membranales, sacos
aplanados o vesículas, de los quistes de las cianobacterias filamentosas. Es ahí
donde se transfieren los electrones procedentes del hidrogeno para la reducción
del oxigeno por la vía respiratoria y la reacción es conocida como
oxihidrogenación o reacción de Knallgas.
H2 → Hidrogenasa → 2H+ +2e-
El papel de las hidrogenasas bidireccionales es poco claro y se cree que
mantiene el nivel iónico del organismo. Por lo general se asocian a la membrana
del citoplasma y es posible que tengan funciones similares a las de aceptores de
electrones tanto de NADH como H2. Son enzimas que constan de cuatro o cinco
subunidades proteicas, dependiendo de la especie. Donde el gen hoxYH es el
principal y se requiere de proteínas auxiliares conocidas con el término hyp
producto de los genes: hypA-F. Este tipo de hidrogenasas puede ser de utilidad
para la producción futura de hidrogeno.
Uno de los problemas principales es que la producción de hidrogeno mediante
nitrogenasas o hidrogenasas puede ser tan solo en condiciones anaeróbicas
debido a que son altamente sensibles al oxigeno. Puesto que el oxigeno es uno
de los productos de la fotosíntesis los organismos han desarrollado un sistema
espacial y temporal estratégico para proteger las enzimas de ser inactivadas por
oxígeno. Esto incluye: a) Quistes que contienen cámaras separadas que evitan
que el oxigeno producido afecte la actividad de las nitrogenasas utilizando
61
membranas permeables al oxigeno y b) la realización del proceso en periodos
diferentes de luz y obscuridad.
En la actualidad, se han tratado de reproducir celdas que mimeticen los procesos
fotosintéticos para la producción de hidrogeno a partir de agua. El prototipo
existente fue construido por Thomas Mallouk de la universidad de Pensilvania.
Denominado como celda Grätzel utiliza la luz para liberar los electrones de una
molécula de tinción (pigmentos naturales) pero en lugar de ser utilizado para
generar corriente, la celda Grätzel lleva los electrones para la catálisis de la
reacción que a partir del agua produce oxígeno e hidrogeno en una reacción
similar a la de la fotosíntesis. Sin embargo, el proceso para reproducirlo
eficientemente es difícil, ya que muchos de los compuestos de tinción probados
reaccionan fácilmente con sus moléculas antes de llevar a cabo la catálisis. Una
vez generados los compuestos se tendrá que generar módulos a nivel de
nanotecnología para acomodar de manera eficiente las moléculas de tinción y
evitar cortos circuitos. Otro problema a solucionar es la composición química de la
molécula de tinción, que por lo general está basada en Ruthenio u óxido de Iridio,
lo cual puede ser base del problema. Se tendrá que probar si se puede recapitular
el proceso utilizando compuestos de mayor abundancia como lo hacen los
sistemas biológicos. Sin embargo estos sistemas ya tienen una eficiencia del 1%
de conversión energética. Es posible que con la optimización geométrica de las
moléculas de Iridio se pueda lograr un 10% de eficiencia. De ser así se podrían
utilizar estas celdas para la producción masiva del hidrogeno usando luz solar,
convirtiéndolo en atractiva y no contaminante fuente de energía.
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