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中國文化大學生物科技研究所
碩士論文
番茄 NBS 抗病基因家族之分子演化
研究
指導教授 黃士穎 博士
林冠宏 博士
研 究 生 柯金伶
中華民國 98 年 6 月
番茄 NBS 抗病基因家族之分子演化研究
摘要
植物之抗病基因(R gene)是ㄧ個大基因家族(gene family) 這些
抗 病 基 因 序 列 在 蛋 白 質 結 構 上 主 要 含 有 核 苷 酸 鍵 結 區
(Nucleotide-binding site domainsNBS)及C端 leucing的重複區(leucine
rich repeatsLRR) N-ter 端前之序列分成兩大類 TIR 區(Toll and
interleukin-1 receptor genes) 及 CC 區 或 LZ 區 (coil-coiled or
leucine-zipper)而 NBS 及 CC(TIR)兩區則分別與 R gene 蛋白之構形
及訊息傳導有關相對於 LRR 區之被動式演化而言NBS 及 CC(TIR)
兩區為植物的主動式演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域
目前對番茄許多病害的抗病基因家族之分子演化並不清楚因此
本研究利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族選殖並定序這些 RGAs
(resistance gene analogs)發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構以 branch-site-model A 模式偵測其ω值發現共同遭受到正向選
汰壓力的胺基酸位點多數不在功能性 motif 中推測可能是這些功能
性 motif 不允許被置換以避免其抗病之功能喪失證明了這些功能性
motif 扮演著對抗病功能性之關鍵角色
關鍵字 R geneRGAsnon-TIR-NBS-LRR正向選汰壓力
1
Molecular evolution of the NBS domain of resistance gene analogs in
Solanum Lycopersicum
Abstract
The plant disease resistance genes (R gene) is a large gene family
and these disease-resistant gene sequences in the protein structure
contains nucleotide bond domain (Nucleotide-binding site domains NBS)
and C-leucing the repeat (leucine rich repeats LRR) N-ter-terminal
sequence is divided into two major categoriesTIR domain (Toll and
interleukin-1 receptor genes) and CC or LZ domain (coil-coiled or
leucine-zipper) NBS and CC (TIR) are involved with configuration and
message transduction or R proteinrespectively Compared with the LRR
area in terms of passive evolution NBS and CC (TIR) are active domain
related to plant evolutionThe NBS domain is a highly and functionally
conserved region
At present molecular evolution of the disease resistance gene
family in tomato is not clear The objectives of this study were to use of
NBS as the core sequence in investigating disease resistance gene
familyand to clone and sequencing these RGAs (resistance gene
analogs) Resistance genes found were non-TIR-NBS-LRR The majority
sites of amino acid under positive selection were not located on
conserved sites motifs according to the ω value by branch-site-model
mode These results indicate that the conserved motif was not allowed to
be substituted avoiding from losing function of disease resistance
Thereforthe conserved motif plays a key role on disease resistance
2
Key words R geneRGAsnon-TIR-NBS-LRRpositive selection
3
壹前言
植物在生長過程中常會受病原微生物的侵襲為了抵抗這些生物
性病原菌所造成的危害植物與病原菌在長期的共同演化和相互選擇
過程中逐漸形成了組織障礙非寄主抗病和小種專一性等一系列複
雜的抗病防禦機制來保護自己目前已經成功的從植物中分離出許多
不同類型之抗病基因(resistance geneR gene)在植物的抗病反應中
扮演重要的角色Gene for gene theory(Flor1971)主要是由植物抗病
基因識別相應的病原菌無毒基因並激活植物體內抗病信號進而抵
禦病原菌的侵襲感染從目前已被定序成功的 30 多種植物抗病基因
來看(Hulbert et al2001)對於抗病基因家族的產物結構進行分析
發現其具有相似的功能性區域在結構上具有高度的保守性其在抗
病基因與病原菌無毒蛋白相互作用以及植物內部免疫信號傳導中起
著相當重要之作用而抗病基因之所以都以「家族」的方式存在亦
即抗病基因之間或多或少具有親屬關係並擁有類似的結構
生物的演化可以藉由基因的重組或重複(gene duplication)來產生
新的基因為一演化上重要關鍵機制隨著時間的演化來累積突變以
增加生物基因組成之多樣性基因重複可以使原有的一份基因保有原
來的功能使另外一份多出來的基因可以自由突變而有不同之演化命
運為植物抗病的專一性和多樣性提供了重要的遺傳基礎
4
番茄(Solanum Lycopersicum)為主要蔬菜之一具有高食用和
經濟價值但其病害種類繁多除了生長條件如溫度營養造成的各
種生理病害外由各種病原菌如病毒細菌真菌和線蟲等引起的病
毒病也超過 100 種以上(Jones et al1991 )因此經常造成產量嚴重損
失導致供應不穩定其中四種較為常見的毒素病分別為番茄捲葉病
毒病(tomato leaf curl virusTOLCV)番茄嵌紋病毒病(tomato mosaic
virusTOMV)青枯病(bacterial wiltBW)以及萎凋病(fusarium wilt
FUS)TOLCV 可導致葉片捲曲抑制番茄植株生長若早期感染會
導致嚴重產量損失近年來此病已成為世界性番茄減產的主要病害之
一屬於病毒感染的毒素病TOMV 主要病徵多出現在葉片上葉
片呈現黃綠不均的現象葉片受害後表面呈現凹凸不平皺縮或畸
型新葉顏色變淡黃葉片縮小或變細有如細繩狀植株矮小受害
嚴重者生長停頓甚至於枯死也屬於病毒感染的毒素病BW 為細
菌性維管束病害土壤為主要感染源土中病原細菌由根部傷口侵入
植株發病初期下位葉的葉柄先呈現下垂而後葉片漸次萎凋同時
莖部也常出現不定根橫切被害莖部可見維管束褐變以手擠壓有
乳白色黏性的菌液溢出植株快速萎凋而漸枯死為其典型病徵FUS
為真菌病原菌之厚膜孢子發芽後發芽管直接侵入根尖或根部傷口
番茄苗期罹病會造成幼苗迅速萎凋死亡較大植株罹病常延遲至結
5
果期才發病首先葉脈透化及偏上生長並由下位葉開始向上逐漸黃
化萎凋初期病徵往往只出現於植株的一側剝開莖部縱切面可見
維管束明顯褐變隨後葉柄下垂整株枯死屬真菌性維管束病害(陳
正次2007)
本文中針對抗病基因中最主要之 NBS-LRR gene family 進行研
究本研究以番茄(Lycopersicon esculentum)為材料供試材料由
前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員所提
供 之 七 種 番 茄 抗 病 品 種 ( 品 系 ) H24( 抗 捲 葉 病 毒 病 )
CL5915-93-1-0-3( 不抗捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病)
利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族將這些 RGAs (resistance gene
analogs)進行序列分析比較 RGAs 分群之間的多樣性及演化關係
根據至 NCBI 比對的結果發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構的抗病基因並以 TOPALi25 軟體之 Neighbor joining 的方式建構
親緣關係樹狀圖來確定序列間的親緣關係是否有基因重複的現象發
生使核苷酸序列發生插入缺失的情況以導致功能上產生的變化
在本研究中以密碼子發生非同義置換與同義置換之比值(ω)來判斷其
6
是否受到正向選汰作用的依據以偵測密碼子所受到的選汰壓力以及
正向選汰的位置作為抗病基因功能性演化的證據
7
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
番茄 NBS 抗病基因家族之分子演化研究
摘要
植物之抗病基因(R gene)是ㄧ個大基因家族(gene family) 這些
抗 病 基 因 序 列 在 蛋 白 質 結 構 上 主 要 含 有 核 苷 酸 鍵 結 區
(Nucleotide-binding site domainsNBS)及C端 leucing的重複區(leucine
rich repeatsLRR) N-ter 端前之序列分成兩大類 TIR 區(Toll and
interleukin-1 receptor genes) 及 CC 區 或 LZ 區 (coil-coiled or
leucine-zipper)而 NBS 及 CC(TIR)兩區則分別與 R gene 蛋白之構形
及訊息傳導有關相對於 LRR 區之被動式演化而言NBS 及 CC(TIR)
兩區為植物的主動式演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域
目前對番茄許多病害的抗病基因家族之分子演化並不清楚因此
本研究利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族選殖並定序這些 RGAs
(resistance gene analogs)發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構以 branch-site-model A 模式偵測其ω值發現共同遭受到正向選
汰壓力的胺基酸位點多數不在功能性 motif 中推測可能是這些功能
性 motif 不允許被置換以避免其抗病之功能喪失證明了這些功能性
motif 扮演著對抗病功能性之關鍵角色
關鍵字 R geneRGAsnon-TIR-NBS-LRR正向選汰壓力
1
Molecular evolution of the NBS domain of resistance gene analogs in
Solanum Lycopersicum
Abstract
The plant disease resistance genes (R gene) is a large gene family
and these disease-resistant gene sequences in the protein structure
contains nucleotide bond domain (Nucleotide-binding site domains NBS)
and C-leucing the repeat (leucine rich repeats LRR) N-ter-terminal
sequence is divided into two major categoriesTIR domain (Toll and
interleukin-1 receptor genes) and CC or LZ domain (coil-coiled or
leucine-zipper) NBS and CC (TIR) are involved with configuration and
message transduction or R proteinrespectively Compared with the LRR
area in terms of passive evolution NBS and CC (TIR) are active domain
related to plant evolutionThe NBS domain is a highly and functionally
conserved region
At present molecular evolution of the disease resistance gene
family in tomato is not clear The objectives of this study were to use of
NBS as the core sequence in investigating disease resistance gene
familyand to clone and sequencing these RGAs (resistance gene
analogs) Resistance genes found were non-TIR-NBS-LRR The majority
sites of amino acid under positive selection were not located on
conserved sites motifs according to the ω value by branch-site-model
mode These results indicate that the conserved motif was not allowed to
be substituted avoiding from losing function of disease resistance
Thereforthe conserved motif plays a key role on disease resistance
2
Key words R geneRGAsnon-TIR-NBS-LRRpositive selection
3
壹前言
植物在生長過程中常會受病原微生物的侵襲為了抵抗這些生物
性病原菌所造成的危害植物與病原菌在長期的共同演化和相互選擇
過程中逐漸形成了組織障礙非寄主抗病和小種專一性等一系列複
雜的抗病防禦機制來保護自己目前已經成功的從植物中分離出許多
不同類型之抗病基因(resistance geneR gene)在植物的抗病反應中
扮演重要的角色Gene for gene theory(Flor1971)主要是由植物抗病
基因識別相應的病原菌無毒基因並激活植物體內抗病信號進而抵
禦病原菌的侵襲感染從目前已被定序成功的 30 多種植物抗病基因
來看(Hulbert et al2001)對於抗病基因家族的產物結構進行分析
發現其具有相似的功能性區域在結構上具有高度的保守性其在抗
病基因與病原菌無毒蛋白相互作用以及植物內部免疫信號傳導中起
著相當重要之作用而抗病基因之所以都以「家族」的方式存在亦
即抗病基因之間或多或少具有親屬關係並擁有類似的結構
生物的演化可以藉由基因的重組或重複(gene duplication)來產生
新的基因為一演化上重要關鍵機制隨著時間的演化來累積突變以
增加生物基因組成之多樣性基因重複可以使原有的一份基因保有原
來的功能使另外一份多出來的基因可以自由突變而有不同之演化命
運為植物抗病的專一性和多樣性提供了重要的遺傳基礎
4
番茄(Solanum Lycopersicum)為主要蔬菜之一具有高食用和
經濟價值但其病害種類繁多除了生長條件如溫度營養造成的各
種生理病害外由各種病原菌如病毒細菌真菌和線蟲等引起的病
毒病也超過 100 種以上(Jones et al1991 )因此經常造成產量嚴重損
失導致供應不穩定其中四種較為常見的毒素病分別為番茄捲葉病
毒病(tomato leaf curl virusTOLCV)番茄嵌紋病毒病(tomato mosaic
virusTOMV)青枯病(bacterial wiltBW)以及萎凋病(fusarium wilt
FUS)TOLCV 可導致葉片捲曲抑制番茄植株生長若早期感染會
導致嚴重產量損失近年來此病已成為世界性番茄減產的主要病害之
一屬於病毒感染的毒素病TOMV 主要病徵多出現在葉片上葉
片呈現黃綠不均的現象葉片受害後表面呈現凹凸不平皺縮或畸
型新葉顏色變淡黃葉片縮小或變細有如細繩狀植株矮小受害
嚴重者生長停頓甚至於枯死也屬於病毒感染的毒素病BW 為細
菌性維管束病害土壤為主要感染源土中病原細菌由根部傷口侵入
植株發病初期下位葉的葉柄先呈現下垂而後葉片漸次萎凋同時
莖部也常出現不定根橫切被害莖部可見維管束褐變以手擠壓有
乳白色黏性的菌液溢出植株快速萎凋而漸枯死為其典型病徵FUS
為真菌病原菌之厚膜孢子發芽後發芽管直接侵入根尖或根部傷口
番茄苗期罹病會造成幼苗迅速萎凋死亡較大植株罹病常延遲至結
5
果期才發病首先葉脈透化及偏上生長並由下位葉開始向上逐漸黃
化萎凋初期病徵往往只出現於植株的一側剝開莖部縱切面可見
維管束明顯褐變隨後葉柄下垂整株枯死屬真菌性維管束病害(陳
正次2007)
本文中針對抗病基因中最主要之 NBS-LRR gene family 進行研
究本研究以番茄(Lycopersicon esculentum)為材料供試材料由
前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員所提
供 之 七 種 番 茄 抗 病 品 種 ( 品 系 ) H24( 抗 捲 葉 病 毒 病 )
CL5915-93-1-0-3( 不抗捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病)
利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族將這些 RGAs (resistance gene
analogs)進行序列分析比較 RGAs 分群之間的多樣性及演化關係
根據至 NCBI 比對的結果發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構的抗病基因並以 TOPALi25 軟體之 Neighbor joining 的方式建構
親緣關係樹狀圖來確定序列間的親緣關係是否有基因重複的現象發
生使核苷酸序列發生插入缺失的情況以導致功能上產生的變化
在本研究中以密碼子發生非同義置換與同義置換之比值(ω)來判斷其
6
是否受到正向選汰作用的依據以偵測密碼子所受到的選汰壓力以及
正向選汰的位置作為抗病基因功能性演化的證據
7
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
Molecular evolution of the NBS domain of resistance gene analogs in
Solanum Lycopersicum
Abstract
The plant disease resistance genes (R gene) is a large gene family
and these disease-resistant gene sequences in the protein structure
contains nucleotide bond domain (Nucleotide-binding site domains NBS)
and C-leucing the repeat (leucine rich repeats LRR) N-ter-terminal
sequence is divided into two major categoriesTIR domain (Toll and
interleukin-1 receptor genes) and CC or LZ domain (coil-coiled or
leucine-zipper) NBS and CC (TIR) are involved with configuration and
message transduction or R proteinrespectively Compared with the LRR
area in terms of passive evolution NBS and CC (TIR) are active domain
related to plant evolutionThe NBS domain is a highly and functionally
conserved region
At present molecular evolution of the disease resistance gene
family in tomato is not clear The objectives of this study were to use of
NBS as the core sequence in investigating disease resistance gene
familyand to clone and sequencing these RGAs (resistance gene
analogs) Resistance genes found were non-TIR-NBS-LRR The majority
sites of amino acid under positive selection were not located on
conserved sites motifs according to the ω value by branch-site-model
mode These results indicate that the conserved motif was not allowed to
be substituted avoiding from losing function of disease resistance
Thereforthe conserved motif plays a key role on disease resistance
2
Key words R geneRGAsnon-TIR-NBS-LRRpositive selection
3
壹前言
植物在生長過程中常會受病原微生物的侵襲為了抵抗這些生物
性病原菌所造成的危害植物與病原菌在長期的共同演化和相互選擇
過程中逐漸形成了組織障礙非寄主抗病和小種專一性等一系列複
雜的抗病防禦機制來保護自己目前已經成功的從植物中分離出許多
不同類型之抗病基因(resistance geneR gene)在植物的抗病反應中
扮演重要的角色Gene for gene theory(Flor1971)主要是由植物抗病
基因識別相應的病原菌無毒基因並激活植物體內抗病信號進而抵
禦病原菌的侵襲感染從目前已被定序成功的 30 多種植物抗病基因
來看(Hulbert et al2001)對於抗病基因家族的產物結構進行分析
發現其具有相似的功能性區域在結構上具有高度的保守性其在抗
病基因與病原菌無毒蛋白相互作用以及植物內部免疫信號傳導中起
著相當重要之作用而抗病基因之所以都以「家族」的方式存在亦
即抗病基因之間或多或少具有親屬關係並擁有類似的結構
生物的演化可以藉由基因的重組或重複(gene duplication)來產生
新的基因為一演化上重要關鍵機制隨著時間的演化來累積突變以
增加生物基因組成之多樣性基因重複可以使原有的一份基因保有原
來的功能使另外一份多出來的基因可以自由突變而有不同之演化命
運為植物抗病的專一性和多樣性提供了重要的遺傳基礎
4
番茄(Solanum Lycopersicum)為主要蔬菜之一具有高食用和
經濟價值但其病害種類繁多除了生長條件如溫度營養造成的各
種生理病害外由各種病原菌如病毒細菌真菌和線蟲等引起的病
毒病也超過 100 種以上(Jones et al1991 )因此經常造成產量嚴重損
失導致供應不穩定其中四種較為常見的毒素病分別為番茄捲葉病
毒病(tomato leaf curl virusTOLCV)番茄嵌紋病毒病(tomato mosaic
virusTOMV)青枯病(bacterial wiltBW)以及萎凋病(fusarium wilt
FUS)TOLCV 可導致葉片捲曲抑制番茄植株生長若早期感染會
導致嚴重產量損失近年來此病已成為世界性番茄減產的主要病害之
一屬於病毒感染的毒素病TOMV 主要病徵多出現在葉片上葉
片呈現黃綠不均的現象葉片受害後表面呈現凹凸不平皺縮或畸
型新葉顏色變淡黃葉片縮小或變細有如細繩狀植株矮小受害
嚴重者生長停頓甚至於枯死也屬於病毒感染的毒素病BW 為細
菌性維管束病害土壤為主要感染源土中病原細菌由根部傷口侵入
植株發病初期下位葉的葉柄先呈現下垂而後葉片漸次萎凋同時
莖部也常出現不定根橫切被害莖部可見維管束褐變以手擠壓有
乳白色黏性的菌液溢出植株快速萎凋而漸枯死為其典型病徵FUS
為真菌病原菌之厚膜孢子發芽後發芽管直接侵入根尖或根部傷口
番茄苗期罹病會造成幼苗迅速萎凋死亡較大植株罹病常延遲至結
5
果期才發病首先葉脈透化及偏上生長並由下位葉開始向上逐漸黃
化萎凋初期病徵往往只出現於植株的一側剝開莖部縱切面可見
維管束明顯褐變隨後葉柄下垂整株枯死屬真菌性維管束病害(陳
正次2007)
本文中針對抗病基因中最主要之 NBS-LRR gene family 進行研
究本研究以番茄(Lycopersicon esculentum)為材料供試材料由
前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員所提
供 之 七 種 番 茄 抗 病 品 種 ( 品 系 ) H24( 抗 捲 葉 病 毒 病 )
CL5915-93-1-0-3( 不抗捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病)
利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族將這些 RGAs (resistance gene
analogs)進行序列分析比較 RGAs 分群之間的多樣性及演化關係
根據至 NCBI 比對的結果發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構的抗病基因並以 TOPALi25 軟體之 Neighbor joining 的方式建構
親緣關係樹狀圖來確定序列間的親緣關係是否有基因重複的現象發
生使核苷酸序列發生插入缺失的情況以導致功能上產生的變化
在本研究中以密碼子發生非同義置換與同義置換之比值(ω)來判斷其
6
是否受到正向選汰作用的依據以偵測密碼子所受到的選汰壓力以及
正向選汰的位置作為抗病基因功能性演化的證據
7
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
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進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
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表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
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生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
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物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
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參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
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葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
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7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
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將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
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六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
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4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
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Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
Key words R geneRGAsnon-TIR-NBS-LRRpositive selection
3
壹前言
植物在生長過程中常會受病原微生物的侵襲為了抵抗這些生物
性病原菌所造成的危害植物與病原菌在長期的共同演化和相互選擇
過程中逐漸形成了組織障礙非寄主抗病和小種專一性等一系列複
雜的抗病防禦機制來保護自己目前已經成功的從植物中分離出許多
不同類型之抗病基因(resistance geneR gene)在植物的抗病反應中
扮演重要的角色Gene for gene theory(Flor1971)主要是由植物抗病
基因識別相應的病原菌無毒基因並激活植物體內抗病信號進而抵
禦病原菌的侵襲感染從目前已被定序成功的 30 多種植物抗病基因
來看(Hulbert et al2001)對於抗病基因家族的產物結構進行分析
發現其具有相似的功能性區域在結構上具有高度的保守性其在抗
病基因與病原菌無毒蛋白相互作用以及植物內部免疫信號傳導中起
著相當重要之作用而抗病基因之所以都以「家族」的方式存在亦
即抗病基因之間或多或少具有親屬關係並擁有類似的結構
生物的演化可以藉由基因的重組或重複(gene duplication)來產生
新的基因為一演化上重要關鍵機制隨著時間的演化來累積突變以
增加生物基因組成之多樣性基因重複可以使原有的一份基因保有原
來的功能使另外一份多出來的基因可以自由突變而有不同之演化命
運為植物抗病的專一性和多樣性提供了重要的遺傳基礎
4
番茄(Solanum Lycopersicum)為主要蔬菜之一具有高食用和
經濟價值但其病害種類繁多除了生長條件如溫度營養造成的各
種生理病害外由各種病原菌如病毒細菌真菌和線蟲等引起的病
毒病也超過 100 種以上(Jones et al1991 )因此經常造成產量嚴重損
失導致供應不穩定其中四種較為常見的毒素病分別為番茄捲葉病
毒病(tomato leaf curl virusTOLCV)番茄嵌紋病毒病(tomato mosaic
virusTOMV)青枯病(bacterial wiltBW)以及萎凋病(fusarium wilt
FUS)TOLCV 可導致葉片捲曲抑制番茄植株生長若早期感染會
導致嚴重產量損失近年來此病已成為世界性番茄減產的主要病害之
一屬於病毒感染的毒素病TOMV 主要病徵多出現在葉片上葉
片呈現黃綠不均的現象葉片受害後表面呈現凹凸不平皺縮或畸
型新葉顏色變淡黃葉片縮小或變細有如細繩狀植株矮小受害
嚴重者生長停頓甚至於枯死也屬於病毒感染的毒素病BW 為細
菌性維管束病害土壤為主要感染源土中病原細菌由根部傷口侵入
植株發病初期下位葉的葉柄先呈現下垂而後葉片漸次萎凋同時
莖部也常出現不定根橫切被害莖部可見維管束褐變以手擠壓有
乳白色黏性的菌液溢出植株快速萎凋而漸枯死為其典型病徵FUS
為真菌病原菌之厚膜孢子發芽後發芽管直接侵入根尖或根部傷口
番茄苗期罹病會造成幼苗迅速萎凋死亡較大植株罹病常延遲至結
5
果期才發病首先葉脈透化及偏上生長並由下位葉開始向上逐漸黃
化萎凋初期病徵往往只出現於植株的一側剝開莖部縱切面可見
維管束明顯褐變隨後葉柄下垂整株枯死屬真菌性維管束病害(陳
正次2007)
本文中針對抗病基因中最主要之 NBS-LRR gene family 進行研
究本研究以番茄(Lycopersicon esculentum)為材料供試材料由
前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員所提
供 之 七 種 番 茄 抗 病 品 種 ( 品 系 ) H24( 抗 捲 葉 病 毒 病 )
CL5915-93-1-0-3( 不抗捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病)
利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族將這些 RGAs (resistance gene
analogs)進行序列分析比較 RGAs 分群之間的多樣性及演化關係
根據至 NCBI 比對的結果發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構的抗病基因並以 TOPALi25 軟體之 Neighbor joining 的方式建構
親緣關係樹狀圖來確定序列間的親緣關係是否有基因重複的現象發
生使核苷酸序列發生插入缺失的情況以導致功能上產生的變化
在本研究中以密碼子發生非同義置換與同義置換之比值(ω)來判斷其
6
是否受到正向選汰作用的依據以偵測密碼子所受到的選汰壓力以及
正向選汰的位置作為抗病基因功能性演化的證據
7
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
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區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
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位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
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不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
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進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
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Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
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表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
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生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
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物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
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參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
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葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
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7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
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將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
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六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
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八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
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4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
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以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
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Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
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隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
壹前言
植物在生長過程中常會受病原微生物的侵襲為了抵抗這些生物
性病原菌所造成的危害植物與病原菌在長期的共同演化和相互選擇
過程中逐漸形成了組織障礙非寄主抗病和小種專一性等一系列複
雜的抗病防禦機制來保護自己目前已經成功的從植物中分離出許多
不同類型之抗病基因(resistance geneR gene)在植物的抗病反應中
扮演重要的角色Gene for gene theory(Flor1971)主要是由植物抗病
基因識別相應的病原菌無毒基因並激活植物體內抗病信號進而抵
禦病原菌的侵襲感染從目前已被定序成功的 30 多種植物抗病基因
來看(Hulbert et al2001)對於抗病基因家族的產物結構進行分析
發現其具有相似的功能性區域在結構上具有高度的保守性其在抗
病基因與病原菌無毒蛋白相互作用以及植物內部免疫信號傳導中起
著相當重要之作用而抗病基因之所以都以「家族」的方式存在亦
即抗病基因之間或多或少具有親屬關係並擁有類似的結構
生物的演化可以藉由基因的重組或重複(gene duplication)來產生
新的基因為一演化上重要關鍵機制隨著時間的演化來累積突變以
增加生物基因組成之多樣性基因重複可以使原有的一份基因保有原
來的功能使另外一份多出來的基因可以自由突變而有不同之演化命
運為植物抗病的專一性和多樣性提供了重要的遺傳基礎
4
番茄(Solanum Lycopersicum)為主要蔬菜之一具有高食用和
經濟價值但其病害種類繁多除了生長條件如溫度營養造成的各
種生理病害外由各種病原菌如病毒細菌真菌和線蟲等引起的病
毒病也超過 100 種以上(Jones et al1991 )因此經常造成產量嚴重損
失導致供應不穩定其中四種較為常見的毒素病分別為番茄捲葉病
毒病(tomato leaf curl virusTOLCV)番茄嵌紋病毒病(tomato mosaic
virusTOMV)青枯病(bacterial wiltBW)以及萎凋病(fusarium wilt
FUS)TOLCV 可導致葉片捲曲抑制番茄植株生長若早期感染會
導致嚴重產量損失近年來此病已成為世界性番茄減產的主要病害之
一屬於病毒感染的毒素病TOMV 主要病徵多出現在葉片上葉
片呈現黃綠不均的現象葉片受害後表面呈現凹凸不平皺縮或畸
型新葉顏色變淡黃葉片縮小或變細有如細繩狀植株矮小受害
嚴重者生長停頓甚至於枯死也屬於病毒感染的毒素病BW 為細
菌性維管束病害土壤為主要感染源土中病原細菌由根部傷口侵入
植株發病初期下位葉的葉柄先呈現下垂而後葉片漸次萎凋同時
莖部也常出現不定根橫切被害莖部可見維管束褐變以手擠壓有
乳白色黏性的菌液溢出植株快速萎凋而漸枯死為其典型病徵FUS
為真菌病原菌之厚膜孢子發芽後發芽管直接侵入根尖或根部傷口
番茄苗期罹病會造成幼苗迅速萎凋死亡較大植株罹病常延遲至結
5
果期才發病首先葉脈透化及偏上生長並由下位葉開始向上逐漸黃
化萎凋初期病徵往往只出現於植株的一側剝開莖部縱切面可見
維管束明顯褐變隨後葉柄下垂整株枯死屬真菌性維管束病害(陳
正次2007)
本文中針對抗病基因中最主要之 NBS-LRR gene family 進行研
究本研究以番茄(Lycopersicon esculentum)為材料供試材料由
前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員所提
供 之 七 種 番 茄 抗 病 品 種 ( 品 系 ) H24( 抗 捲 葉 病 毒 病 )
CL5915-93-1-0-3( 不抗捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病)
利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族將這些 RGAs (resistance gene
analogs)進行序列分析比較 RGAs 分群之間的多樣性及演化關係
根據至 NCBI 比對的結果發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構的抗病基因並以 TOPALi25 軟體之 Neighbor joining 的方式建構
親緣關係樹狀圖來確定序列間的親緣關係是否有基因重複的現象發
生使核苷酸序列發生插入缺失的情況以導致功能上產生的變化
在本研究中以密碼子發生非同義置換與同義置換之比值(ω)來判斷其
6
是否受到正向選汰作用的依據以偵測密碼子所受到的選汰壓力以及
正向選汰的位置作為抗病基因功能性演化的證據
7
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
番茄(Solanum Lycopersicum)為主要蔬菜之一具有高食用和
經濟價值但其病害種類繁多除了生長條件如溫度營養造成的各
種生理病害外由各種病原菌如病毒細菌真菌和線蟲等引起的病
毒病也超過 100 種以上(Jones et al1991 )因此經常造成產量嚴重損
失導致供應不穩定其中四種較為常見的毒素病分別為番茄捲葉病
毒病(tomato leaf curl virusTOLCV)番茄嵌紋病毒病(tomato mosaic
virusTOMV)青枯病(bacterial wiltBW)以及萎凋病(fusarium wilt
FUS)TOLCV 可導致葉片捲曲抑制番茄植株生長若早期感染會
導致嚴重產量損失近年來此病已成為世界性番茄減產的主要病害之
一屬於病毒感染的毒素病TOMV 主要病徵多出現在葉片上葉
片呈現黃綠不均的現象葉片受害後表面呈現凹凸不平皺縮或畸
型新葉顏色變淡黃葉片縮小或變細有如細繩狀植株矮小受害
嚴重者生長停頓甚至於枯死也屬於病毒感染的毒素病BW 為細
菌性維管束病害土壤為主要感染源土中病原細菌由根部傷口侵入
植株發病初期下位葉的葉柄先呈現下垂而後葉片漸次萎凋同時
莖部也常出現不定根橫切被害莖部可見維管束褐變以手擠壓有
乳白色黏性的菌液溢出植株快速萎凋而漸枯死為其典型病徵FUS
為真菌病原菌之厚膜孢子發芽後發芽管直接侵入根尖或根部傷口
番茄苗期罹病會造成幼苗迅速萎凋死亡較大植株罹病常延遲至結
5
果期才發病首先葉脈透化及偏上生長並由下位葉開始向上逐漸黃
化萎凋初期病徵往往只出現於植株的一側剝開莖部縱切面可見
維管束明顯褐變隨後葉柄下垂整株枯死屬真菌性維管束病害(陳
正次2007)
本文中針對抗病基因中最主要之 NBS-LRR gene family 進行研
究本研究以番茄(Lycopersicon esculentum)為材料供試材料由
前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員所提
供 之 七 種 番 茄 抗 病 品 種 ( 品 系 ) H24( 抗 捲 葉 病 毒 病 )
CL5915-93-1-0-3( 不抗捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病)
利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族將這些 RGAs (resistance gene
analogs)進行序列分析比較 RGAs 分群之間的多樣性及演化關係
根據至 NCBI 比對的結果發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構的抗病基因並以 TOPALi25 軟體之 Neighbor joining 的方式建構
親緣關係樹狀圖來確定序列間的親緣關係是否有基因重複的現象發
生使核苷酸序列發生插入缺失的情況以導致功能上產生的變化
在本研究中以密碼子發生非同義置換與同義置換之比值(ω)來判斷其
6
是否受到正向選汰作用的依據以偵測密碼子所受到的選汰壓力以及
正向選汰的位置作為抗病基因功能性演化的證據
7
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
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進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
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物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
果期才發病首先葉脈透化及偏上生長並由下位葉開始向上逐漸黃
化萎凋初期病徵往往只出現於植株的一側剝開莖部縱切面可見
維管束明顯褐變隨後葉柄下垂整株枯死屬真菌性維管束病害(陳
正次2007)
本文中針對抗病基因中最主要之 NBS-LRR gene family 進行研
究本研究以番茄(Lycopersicon esculentum)為材料供試材料由
前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員所提
供 之 七 種 番 茄 抗 病 品 種 ( 品 系 ) H24( 抗 捲 葉 病 毒 病 )
CL5915-93-1-0-3( 不抗捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病)
利用 NBS 為核心序列之抗病基因家族將這些 RGAs (resistance gene
analogs)進行序列分析比較 RGAs 分群之間的多樣性及演化關係
根據至 NCBI 比對的結果發現抗病基因皆屬於 non-TIR-NBS-LRR 結
構的抗病基因並以 TOPALi25 軟體之 Neighbor joining 的方式建構
親緣關係樹狀圖來確定序列間的親緣關係是否有基因重複的現象發
生使核苷酸序列發生插入缺失的情況以導致功能上產生的變化
在本研究中以密碼子發生非同義置換與同義置換之比值(ω)來判斷其
6
是否受到正向選汰作用的依據以偵測密碼子所受到的選汰壓力以及
正向選汰的位置作為抗病基因功能性演化的證據
7
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
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2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
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區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
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位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
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不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
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進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
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Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
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表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
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生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
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物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
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參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
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將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
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八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
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4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
是否受到正向選汰作用的依據以偵測密碼子所受到的選汰壓力以及
正向選汰的位置作為抗病基因功能性演化的證據
7
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
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區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
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位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
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不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
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進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
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Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
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表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
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生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
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物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
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參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
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將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
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六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
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八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
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以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
貳前人研究
一植物的抗病基因(plant disease resistance geneR gene)
植物的抗病基因 (R gene)是指植物用來避免中斷或阻擋病原體
侵入與擴散以減輕發病和損害的功能性基因R gene 可以用來對抗
病毒細菌菌類和蟲害植物在受到這些病原菌的刺激時會產生一
些不同的機制來對抗是植物本身的某些結構障礙和化學成分具有抗
病功能其結構上的障礙就像增厚細胞壁角質層蠟質層木栓層
還有特殊的氣孔結構等(Burdon 1987Baker et al 1997 Bent 1996
Ellis et al 2000 )利用化學物質來抗病是植物產生一些對病原菌有害
的二次代謝物或是可以分解病原體的酵素破壞病原菌的功能另
外植物本身產生過敏反應當植物受到病原體入侵時被入侵的部
位或組織會迅速壞死而使病原體無法向外擴散
除了目前已經被 cloning 出來的植物抗病基因外還有許多與上
述 R gene 相似的抗病基因類似序列在高等植物中這種具有抗病
的功能性基因還沒有明確的被識別出來但卻發現許多在結構和功能
性上很類似抗病基因的序列稱之為類抗病基因 resistance gene
analogues (RGAs) (Timmerman-Vaughan GM et al 2000) R gene 的
種類有很多種不同的 R gene 會產生不同的抗病機制以 R gene 的
8
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
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Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
柒參考文獻
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
保守性架構和功能性區域的不同植物抗病基因轉譯的蛋白質大致分
成五大類分別為
1 NBS-LRR(Nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat)此類植物
病害抵抗基因的蛋白質結構上主要包括核苷酸鍵結區和富含白胺酸
重複的胞內受體蛋白(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat
NBS-LRR) NBS domains 是核苷酸鍵結區位於 N 端 LRR 為
leucing rich repeats 為 Leucing 的重複區位於 C 端LRR 最顯著的
架構就是重複數量不等的 LRR因為架構模式很不規則多樣性較
高所以可以用來辨識不同的病原體也因為具有重複架構的特性
因此有利於基因間或基因內的重組亦可能會導致 LRR 數目的增加
或減少LRR 存在於多種功能不同的蛋白中與蛋白質之間的相互
作用及信號傳導有密切關係NBS-LRR 是抗病基因中最主要也是最
大量的區域因此常用在抗病基因的研究上且因為包含了一些非常
保守的區域所以常被利用在植物抗病基因的辨識與分類根據植物
病害基因 NBS 前端(N 端)之蛋白質結構分成兩大類(附 Fig1)(Meyer
et al1999)
(1) N-ter 為 TIR 區(Toll and interleukin-1 receptor genes)這類的抗病
基因在 N 端包含了一個 TIR 的類似區域與果蠅 Toll 蛋白及哺乳動
物細胞介白素 1 號受體胞外有相似的區域此區域在植物的抗病系統
9
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
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進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
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物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
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將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
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Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
信號傳導中透過對病原物的結合將信號傳遞給傳導因子後獲得
由細胞質向細胞核內運輸的能力並與各免疫回應基因的啟動子相結
合引起免疫回應的表達從而對病原物產生抗性TIR 目前只有在
雙子葉植物和裸子植物中有發現
(2) N-ter 為 CC 區或為 LZ 區(coil-coiled or leucine-zipper)在 N 端為
一螺旋捲曲的結構non-TIR 目前只有在單子葉和雙子葉植物中被發
現而未見於裸子植物(Pan et al2000Goff et al2002)
LZ 存在於一些寡聚蛋白中許多 DNA 結合蛋白就含有 LZLZ
結構為每 7 個胺基酸殘基構成一個重複第 7 位置上的殘基為
isoleucine(異白氨酸)它在蛋白質二級結構中形成 α-helix 的疏水結
構在交互作用的力量之下兩個 LZ 中的異白氨酸殘基聚合成多聚
體形成類似拉鍊的結構進而有利於蛋白質的聚合並促進蛋白質之
間的特異相互作用推測 R gene 中存在的 LZ 可能在抗病回應信號傳
導中與病原物產生的保守區域架構特異性結合有關
NBS 及 CC 兩區分別與 R gene 蛋白之構形及訊息傳導有關相
對於 LRR 區之被動式(passive)演化而言NBS 及 CC 兩區為植物的
主動式(initiative)演化且 NBS 具有高度保守的功能性區域在本研
究中主要是探討抗病基因的 non-TIR-NBS-LRR 區域這些基因序列
10
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
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進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
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表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
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參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
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葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
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4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
在結構上有一些功能性區域的特徵可用來判別是否為病害抗病基
因
2 eLRR-TM (extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
receptor)為胞外富含白胺酸重複的跨膜受體蛋白例如 CF2CF5
CF4 及 CF9
3 eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane
protein kinase)為胞外富含白胺酸跨膜蛋白激酶例如 Xa21
4 STK(serine-threonine kinase)為絲氨酸及酥胺酸激酶
5 CC-TM(coiled-coil plus transmembrane receptor)是不同於上述四類
的抗病基因如擬南芥抗白粉病基因 RPW8為一螺旋捲曲架構的跨
膜受體不同的抗病基因的受體蛋白在植物細胞中的分佈不同其中
eLRR-TM eLRR-TM-pkinaseCC-TM 等帶有跨膜蛋白架構的抗病
基因產物位在細胞膜上而 NBS-LRR 和 STK 等帶有 NBS 結構的抗
病基因產物則分佈在細胞質中(Dangl and Jones2001)
NBS 區域是 NBS-LRR 基因中最保守的部份其基因產物架構特
點是在 N-端具有保守性目前已被發表的 motif 有以下 5 個區域
1 磷酸結合環(P-loop)又稱為 Kinase-1 區域與 ATP 與 GTP 之磷酸
結合其共同保守的序列為 GM(GP)GxGKTT(aT)其中 x 為任意氨
基酸a 為疏水氨基酸
11
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
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表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
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生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
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參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
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葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
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7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
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將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
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六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
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3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
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八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
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4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
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Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
2 Kinase-2為 4 個疏水性胺基酸殘基後面緊跟著一個帶負電荷的天
門冬胺酸酶(aspartic protease)在植物中此一區域的 flanking regions
具有高度保守的胺基酸序列 K(KR)xaaaaDDV(WD)在 TIR 的抗
病基因產物 Kinase-2 最後一個氨基酸殘基為天門冬氨酸(D)而在
non-TIR-NBS-LRR 或其他種類抗病基因則為色氨酸(W)
3 Kinase-3與 DNA 的嘌呤或核糖結合有關通常含有一個精氨酸殘
機(R)其保守區為 SRaaaT(TS)R
4 GLPL其共同序列為 GLPL(AG)LK為一個高度保守之下游疏水
性區域
5 MHDV 其共同序列為 MHD(LRW)(LVA)(PS)有時會產生置
換情形
LRR 出現在對於病原體誘發物 recognition 的主要反應之中在
易感病植物中有細胞防衛的功能在細胞生長抗病反應過程中也有
recognition 作用(Warren et al1998)NBS-LRR 對於不同病原體的識
別是植物抗病的基礎LRR 分成兩大類一類位於細胞外而另一類
則位於細胞質內比較分析細胞質內 NBS-LRR 與胞外 LRR 的蛋白
序列發現它們在重複數和架構上都有明顯的區別從重複數上看
胞外 LRR 的重複數一般較高可達 38 個重複且絕大多數重複的架
構相當完整而胞內 LRR 的重複數一般約有 14 個重複特異性識別
12
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
區域位於 LRR 區抗病基因的 LRR 區域多樣性較高有利於細胞識
別不同病原體無毒基因的蛋白在結構上細胞質內的 LRR在第
10 個位置上常由半胱氨酸(C)取代天門冬胺酸(D)在 LRR 抗病基因
共 有 的 序 列 可 概 括 為 ldquo LxxLxxLxLxx(xC)xxxxaxxxaxx
(Kajava1998Evdokimov et al2001)在這一架構中保守的白氨酸
殘基形成疏水的核心而其它非保守的氨基酸殘基暴露於馬蹄形外圍
而形成了一個受體結合表面植物 R gene 中保守的白氨酸形成疏水
的區域是與病原體無毒基因編碼蛋白配體結合的架構而非保守區決
定了與病原體配體結合的特異性推測是植物與病原體軍備競賽
(arms race)的結果而使我們能夠從分子的層面上來解釋 Gene for
gene theory 的相互作用(Flor1971)
植物抗病基因的 NBS 區域被認為與傳遞信號有關在 NBS 中
的基因序列如 P-loop 可與 ATP 及 GTP 結合同時 NBS 能激活 kinase
或 G-protein使細胞產生防禦反應NBS 前端架構會激活下游的基
因因此 NBS-LRR 蛋白並不僅由單獨的功能結構區域所組成而是
由不同區域共同演化而形成的而且訊號的感應和傳導需要分子之間
的相互作用Mondragon-Palomino 等人(2002 年)以阿拉伯芥基因組內
之 NBS-LRR 基因家族序列進行分析後發現有 70的 positively
selected sites 位於 LRR 區然而卻有 30的 positively selected sites
13
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
位於 CC(TIR)區分別與 R gene 蛋白之構形與訊息傳導有關因此
相對於 LRR 區之被動式演化而言CC(TIR)及 NBS 兩區為植物主動
式演化
二抗病基因的作用機制-基因對基因學說(gene for gene hypothesis)
Flor 在 1956 年根據亞麻對亞麻鏽菌的特異抗性的研究中提出
基因對基因學說(gene for gene hypothesis)其內容為病原體與寄主的
關係分成親合性和不親合性兩種類型親合性與不親合性的病原體分
別為含毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr)親合性與不親合植物寄主分
別含有感病基因(r)與抗病基因(R)當帶無毒基因(A)之病原菌與帶抗
病基因(R)的寄主作用時兩者即會表現不親合而寄主表現抗病性
其它 3 種組合則會表現親合即寄主感病(見附表 1)這一學說說明
了對應於寄主每一個決定抗病性的基因病原體方面也就存在了一個
決定致病性的基因也就是在寄主與病原體的交互關係中任何一方
的每一個基因都只有在另一方相對應的基因存在和作用下才可以被
鑑定出來也構成了現今病原體無毒基因與植物抗病基因的理論基
礎複雜的抗病機制是植物與其病原體在長期的演化中相互適應的結
果當病原體發展出不同類型不同程度的致病性時植物也會相對
應的產生了不同類型不同程度的抗病性使寄主和病原體交互之間
產生了強而有力的選汰壓力寄主的抗病性與病原體的致病性之間
14
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
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表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
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參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
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葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
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六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
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4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
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Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
不論是在單基因對單基因系統或多基因對多基因系統中皆會存在著
基因對基因的關係但兩種系統的表現會出現很大不同單基因對單
基因系統的抗病性表現常會因為病原體突然的變異而使寄主無法與
之對抗而死亡較無法穩定持久而多基因對多基因系統的抗病性表
現則能較穩定持久
Tang 等人(1996 年)對於 Pto-avrPto 的研究和 Jia 等人(2000 年)對
Pita-avrPita 的研究都提供了基因對基因學說的直接證據而 Nimchuk
等人(2001 年)的研究也證明了無毒基因 AVRPto 蛋白透過細菌致病分
泌系統Ⅲ進入植物細胞並與 PTO 蛋白直接結合經過基因轉殖之
後發現只要在帶有抗病基因 PTO 的番茄中導入無毒基因 AVRPto
該植物就會出現超敏感反應(hypersensitive reaction)(Yu et al1998)
近年來許多已被選殖成功的植物抗病基因中絕大部分皆可找到
NBS 與 LRR 的功能 domain能夠辨識病原菌(elicitorAvr protein)進
而保衛植物使植物僅在具有少數的 NBS-LRR 基因下就可以防禦
多樣的病原菌
三基因的複製(gene duplication)與演化上之關聯
基因重複序列對於演化的重要性在 1970 年首先被 Ohno 學者
所提出大多數的基因並非單獨存在染色體中而是由許多序列相似
及功能相近的基因組成一個基因家族基因家族的產生是由於細胞
15
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
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表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
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表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
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【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
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【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
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附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
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附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
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附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
進行減數分裂前染色體會先被複製再分離至兩個子細胞中而在
分裂的過程中有部份的 DNA 片斷可能會進行互換(crossing over)因
此造成基因的複製然而每次形成基因的複製時DNA 序列都會有
一些微小的改變故而增加這些基因結構的樣式而目前普遍相信這
些基因的複製序列不僅提高也造就了基因體(genome)與生物表現型
的複雜性
基因的演化過程中以旁向性同源基因(paralogous genes)而言
由一個共同祖先在分化以前產生了功能上的分歧 (functional
divergence)此類型基因因為發生基因複製而產生不同的後代稱為
paralogous genes而如果是共同祖先的直接後代發生基因複製稱之為
直向性同源基因(orthologus genes)是由種化(speciation)而來gene
duplication被認為是產生新基因的重要機制並可以增加生物基因多
樣性使生物的基因能夠有新的組合一般認為藉由基因複製的衍
生可以使基因產生新的表現方式造成具有新功能的基因(Lynch
and Force2000)而R gene與植物病原生物互相作用也會造成染色體
基因數變化與增加生物基因多樣性由NBS功能性區域的引子對普遍
存在的染色體表示同源的番茄的genomic序列對病原生物基因的
race specific具有抗性(Pan et al2000)
16
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
Gene duplication 在演化過程中基因複製被認為是產生新基因
的重要機制因時間而累積突變的過程使基因朝向三種演化 phase(附
圖 2)一種是只擁有祖先一部分的功能(subfunctional)一種是在演化
篩選的過程中功能漸漸失去(non-functionalization)最終變成不具有
功能的偽基因(pseudogene)最後一種則是在 gene duplication 演化
中藉由一些有害或有利突變的累積而產生一些新的功能最後變成
一個新的基因(neo-functionalization)這也是基因能夠長時間存在的
主要模式 (Yang et al2008)
四自然環境下之選汰壓力(natural selection)
Reciprocal selection 是在自然環境下植物與其病原體在長期共
同演化中相互適應過程中軍備競賽(arms race)下的結果構成複雜的
抗病機制所謂軍備競賽是指植物寄主和病原體像在舉行軍備競賽一
般藉著不斷產生的遺傳變異做為軍備更新這樣的競爭通常會加速
物種突變速率突變的部份容易被保留下來這便稱為正向選汰
(positive selection)這樣子的結果亦造成 R gene 在結構上演化成一種
固定的模式(Teshima et al2006)
平衡選汰(balancing selection)是依靠自然選汰的力量來維持整個
族群的遺傳多型性(genetic polymorphisms)使兩個或兩個以上的外
17
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
表型發生頻率趨於穩定不會看到單一個外表型態 (observable
phenotypic)其主要力量分為(Frank S A1993)
1 Heterozygote advantage (overdominance) 異質結合(heterozygote
genotype Aa) 會 比 同 質 結 合 (homozygote) 的 dominant(AA 或
recessive(aa)任何一種結合對環境適應力來的更具優勢
2 Frequency dependent selection 又稱為 dynamic selection可分為
A Positive selection (即 directional selection) 是 natural selection 中最
主要的模式其 genotype 是 one-to-one 的機制針對一個對偶基因
(allele)出現的頻率會往一個方向改變而達成 alleles fixation(allele=0
或 1)的 homozygous genotype
B Negative selection(即 purifying selection)靠 natural selection 的力
量維持整個 population 的 genetic polymorphisms使兩個或兩個以
上的 phenotypic forms 發生頻率趨於穩定
Gos-Gesseca 等人(2008 年)進行阿拉伯芥基因組內之 NBS-LRR
基 因 家 族 序 列 分 析 後 發 現 NBS-LRR 基 因 具 有 較 高 的
non-synonymous 變異而造成序列多樣性 然而對 synonymous 的
分析目前沒有報告提供證據是受長期的平衡選汰壓力或為 selective
sweeps 與先前的檢測 R gene 比對沒有證據說明抗病基因和主要
作用變化是受族群間的高分化支配因此他們建議在沒有對應的病原
18
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
生物時R gene 受長期的平衡選汰壓力或為地方適應也許在某些情
況下是造成 R gene 高的序列多樣性的重大起因 與 R gene 對比序
列變化的分析和分化顯示了高族群分歧
五偵測基因序列之選汰壓力
在演化的過程中可以藉由比較 DNA 序列間的取代關係來偵測
是否發生適應演化而 DNA 序列在演化上的選拔分成兩種情
形 (i)Ks(synonymous nucleotide substitutions) 或為 dS(synonymous
nucleotide substitutions)同義置換 意指 DNA 的序列變異並不會影響
最後所轉譯出的蛋白質序列 (ii)Ka(non-synonymous nucleotide
substitutions)或為 dN(non-synonymous nucleotide substitutions)非同義
置換則是指 DNA 的序列變異也會使所轉譯出的蛋白質序列生改
變而 Ka 及 Ks 則分別代表每個 codon 位置的取代情形利用非同
義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對於序列做選汰壓力偵測侷
限於基因的某個區域且針對單一個 nucleotide site 做選拔將取代的
情形以比值ω= Ka Ks 表示這個比例可以判斷是否有選汰壓力作用
於這個蛋白質編碼基因而演化速率ω值有三種可能性(Rose et
al2004)
1 若ω>1則表示序列受到正向選汰(positive selection)胺基酸的
變化留下的機會高於同義置換所有突變會趨於有利的突變以利於生
19
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
物適應環境
2 若ω<1則表示序列受到純化選汰(purifying selection 或 negative
selection)若胺基酸的變化是有害的將會減少這些胺基酸留下來的
機會即會淘汰一些不利的突變而保留有利(正向)或者不會構成影
響之突變
3 若ω=1則表示演化是中性的(neutral)同義置換與非同義置換
被固定的機率相等
20
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
參材料與方法
一植物材料
由前亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)番茄育種組陳正次研究員
提供七種番茄抗病品種 (品系 )之種子 H24(抗捲葉毒素病 )
CL5915-93-1-0-3( 不 抗 捲 葉 毒 素 病 抗 番 茄 嵌 紋 病 毒 病 )
CLN2777A(抗番茄捲葉病毒病 抗番茄嵌紋病毒病抗番茄青枯
病)BL986(抗番茄青枯病)L390(不抗青枯病)CLN2764A(抗半身
萎凋病抗番茄嵌紋病毒病抗青枯病) BL734(不抗半身萎凋病) (見
附表 2)
二種子及葉片樣本處理
1 將7種品系之番茄種子先浸泡後將種子暗處理讓種子發芽後
移盆到72格穴盤放入生長箱栽種生長箱(chang kuang growth
chamber-M285207)溫度設定在日溫23度(16小時)夜溫18度(8小
時)濕度80每隔2天使用獅馬葉肥(1)施肥一次待1個月後
取7個品種(品系)單株之葉片
2 將葉面多餘水分吸乾後以75酒精噴灑消毒葉片
3 將葉片擦乾並秤取03g備用
4 將秤好的葉片置於研缽中加入液態氮將葉片急速冷凍乾燥將
21
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
葉片研磨成粉
5 將葉粉置於15ml的離心管中放入-20冰箱中保存待用以備
抽DNA
三DNA 的萃取
在本研究中DNA的萃取方式採用Bioman之EasyPure Genomic DNA
Spin Kit (Plant)其方法及步驟如下
1 使用新鮮和乾淨的植物組織 50-100mg(粉末狀)將葉粉置於 15ml
的離心管中
2 加入 400ul GP1 buffer有時會加入 GPX1以去除多醣類加入
RNaseA(每 10 mg 用 1 ul)去 RNA兩者在使用前不能混合
3 將離心管置於水浴槽 65下 10 分鐘在此期間每 5 分鐘震盪一
次離心管
4 待降溫後加入 100 ul GP2 buffer 震盪使其混合均勻
5 離心管置於 4冰浴 3-20 分鐘將 Filter Column 與 2ml Collection
tube 結合把先前離心管的溶液加入 Filter Column
6 將離心管放入離心機(eppendorf 公司 centrifuge 5415D)離心轉速
13000rpm 離心 3 分鐘此時 DNA 跟一些雜質一起沈澱在管底
倒掉上清液留下層液
22
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
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附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
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附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
7 丟棄 Filter Column小心轉移留在 Collection tube 中的下清液至
新的離心管中
8 加入 600-650 ul GP3 buffer (15 倍於前溶液) 將 GD Column 與
2ml Collection tube 結合將離心管溶液混合吸出至 GD Column
9 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 2 分鐘倒掉下
層液(廢液)再重覆一次這個步驟裝回 GD Column 與 2ml
Collection tube此時 DNA 黏附在 GD Column
10 加入 400ul W1 buffer 到結合的 GD Column 與 2ml Collection tube
中
11 將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒倒掉下層
液(廢液)
12 加入600-650 ul Wash buffer到結合的GD Column與2ml Collection
tube 中將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm 離心 30 秒
倒掉下層液(廢液)再離心一次
13 如果要去掉溶液中的雜質可加入 400 ul 96-100酒精到結合的
GD Column 與 2ml Collection tube 中將離心管放入離心機離心
轉速 13000rpm 離心 30 秒
14 使用新的離心管與GD Column結合待DNA沈澱吹乾後加入 100
ul ddH2O或加熱至 65的Elution buffer等待 3 分鐘使DNA溶出
23
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
將離心管放入離心機離心轉速 13000rpm離心 30 秒GD Column
移除將其放入-20保存
四DNA 定量及稀釋
以eppendorf公司的Biophotometer(ag 22331 Hamburg)測定萃取
DNA產物的濃度OD280及純度(OD260OD280)並以ddH2O(或TE Buffer)
溶解的DNA原液依先前測定的濃度再以ddH2O(或TE Buffer)稀釋為
20ngul的DNA稀釋液供日後的PCR擴增用原液及稀釋液皆保存
於-20冰箱中
五設計引子
本研究中之primer設計是參考 Fourmann等人在2001年設計出
的退化性引子RGA以選殖抗病基因序列因目的是要擴增出大量
的抗病基因中NBS區域使所得到序列為R-gene本身的片段或者是類
抗病基因(RGAs)故設計引子序列是建立在P-loop和GLPL(NBS區域
保守的domain請見附圖3引子的序列及煉合溫度請見附表3)其中
B1為P-loopINV1為kinase-2INV2為kinase-3aB2為GLPL而deg
F及deg R分別是從B1及B2所設計而來的(Fourmann et al 2001)所得
之序列長度約為500bp
24
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
六聚合酶連鎖反應
將 PCR 反應試劑以微量滴管(pipetman)依序加入已標示完整
的 02ml PCR 用薄壁微量離心管中將裝有 30μl 的微量離心管輕
彈以幫助藥劑混合均勻再以轉速每分鐘 13000rpm 離心約 1 到 2 分
鐘目的為確定微量離心管管壁沒有 PCR 反應試劑殘留否則會影
響 PCR 反應的結果將裝有 PCR 反應試劑的離心管放入 eppendrof
公司加熱迴圈機(Mastercycler gradient)中進行 PCR 反應加熱循環機
所進行的反應主要分成三個部份第一是先將 DNA 的雙股螺旋變性
打開(denaturation)再來使 DNA 與引子結合(annealing)最後進行
DNA 的延伸反應(extention)加熱循環 PCR 反應試劑請見附表 4 加
熱循環 PCR 擴增程序請見附表 5
七電泳膠片製備及電泳分析
1 配置1 SeaKem LE agarose的電泳膠片以06g之SeaKem LE
Agarose粉末 (Sigma)溶解於60ml之1X電泳緩衝液 (05X TBE
buffer)於燒杯中將燒杯放入微波爐中加熱至SeaKem LE agarose
粉末完全溶解為止加熱期間需不時的將燒杯取出攪拌使其受
熱均勻
2 加入5的Ethidium bromide (EtBr10mgml)染色劑染色並攪拌
使其混合均勻
25
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
3 在尚未凝固前輕輕倒入電泳膠片模型盒中注意勿使其氣泡產
生並保持膠片的水平
4 放入25孔之電泳梳(comb)於模型中待電泳膠凝固後備用
5 取5μl PCR product solution混合1μl裝填染劑(5X loading dye
伯昂生技公司) 得樣本總體積6μl之填充樣本並使其混合均
勻剩餘的PCR product solution暫置於-20冰箱保存
6 本研究採用的DNA size marker為100 bp DNA Ladder(伯昂生技公
司)可標記的條帶為100200300400500600700800
10001500及2000 bp
7 分別將已製備完成的DNA樣本以及DNA size marker按照排列的
順序逐一的加入電泳膠片的膠片孔(well)再將已填充完畢的
電泳膠片放入MT-108(伯昂生技公司)電泳槽中在電泳槽中注入
05X電泳緩衝溶液(TBE buffer)並使緩衝溶液淹過膠片在倒入
緩衝溶液的過程務必非常小心勿使填充在膠片孔中的樣本因緩
衝溶液倒入時不小心被沖出而影響到電泳之結果電泳條件設
定為110伏特(V)電泳時間為60分鐘電泳的結果可以將PCR樣
本的條帶與DNA size marker做比較並粗略的判別擴增序列是否
正確
26
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
八T-A cloning
本研究採用 yTA 轉殖載體試劑組及 ECOS 勝任細胞(益生生技
公司)進行 cloning
(一)接合作用(Ligation)
將PCR放大的產物分別與yTA vector接合由於放大後之PCR
產物 3rsquo端含有 Polymerase(A)藉由 A=T 配對的原理可專一的與 5rsquo
含有 T 之載體接合Ligation 反應試劑包含以下成分3μl 之 PCR
product(PCR product 與載體莫爾比例為 31)1μl 之 ligation bufferA
1μl 之 ligation bufferB2μl 之 yTA vector 及 1μl 之 T4 DNA ligase
並加入 disterilled water 至最終體積 10μl(附表 6)並將 ligation 反應試
劑輕混勻並注意勿使試劑產生氣泡接合反應物於 4靜置隔夜
可使 yTA 載體銜接 insert DNA 達到最高效率
(二)轉型作用(transformation)及 colony PCR
將與 PCR 產物接合好之載體轉形至勝任細胞(competent cell)
中經培養後便可得到一個個單一之菌落並以 PCR 的方式確認
PCR product 是否成功的與載體接合
1 以酒精燒玻璃棒以滅菌
2 將冷凍的勝任細胞(50μl)取出置於冰上解凍
3 立刻加入 2μl 的 ligation mixture 至勝任細胞中並混合均勻
27
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
4 立刻以 42水浴 45 秒後再以手指彈打以幫助混合均勻
5 冰浴 20 分鐘後以無菌之玻棒塗佈在 4 ~ 室溫之選擇性培養基(含
有 50μgml Ampicilin100μl 01M IPTG 及 20μl 50mgml X-Gal)上
6 立即將培養皿移至 37培養箱內避光生長培養 11-16 小時
7 經培養後可以用已滅菌的牙籤點取單一菌落進行挑選有轉入
載體的勝任細胞菌落為白色無轉入者為藍色但亦有可能出現偽
陽性
8 將Colony PCR的反應試劑以 pipettement依序放入微量離心管中混
合均勻將挑選好的單一菌落取部份放入混合均勻的反應試劑中稍
加以攪動混合以 M13 引子進行 colony PCR(primer 序列及煉合溫
度請見附表 7Colony PCR 反應試劑請見附表 8Colony PCR
program 設定請見附表 9)同時亦可將部份的 clones 加入含有
50μlml的 ampicillin之LB(Luria-Bertani agar)培養液中進行液態菌
體培養將 colony PCR 的產物進行電泳鑒別將條帶大小符合的
clones 菌液送交定序便可以得到分離的單一組成序列
9 Colony PCR 電泳完成後將膠片放入電泳照相系統 (UV
Transilluminator + Gel Docvumentation systemUVPDigiGel 公司
modelDGIS-8)因 EtBr 會鍵結在 DNA 之 Major groove 上且 EtBr
對紫外光敏感故會在 DNA 片段大小的位置上呈現感光拍照後
28
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
以照片形式存檔(bmp)使用後之膠片集中去毒性後丟棄
九資料分析
(一) DNA 序列整理與比對
經過選殖及將完成之產物送交Tri-I Biotech(源資生技公司台
北台灣)進行核苷酸序列分析定序後得到的DNA序列以Reverse
complement網站(httpwwwbioinformaticsorgsmsrev_comphtml)將
兩端定序的DNA的一股作Reverse complement以Vector NTI軟體把
序列的兩端接合在一起接成一條完整的序列上網至隸屬於美國
國家醫學圖書館(National library of Medicine)位於美國國家衛生院
(National Institute of Heath)院區之網站NCBI (National Centor for
Biotechnology Information)資源中心的 BLAST 進行序列比對(Basic
Local Alignment Search Tool)以確認為R gene本身的片段或者是類抗
病 基 因 (RGAs) 的 NBS 抗 病 基 因 序 列 並 於 BCM search
Launcher(Baylor College of Medicine Search Launcher)網站將DNA序
列轉譯成胺基酸序列之後再找出正確的ORF(open reading frame)
屏除不具功能性的pseudogene在這個網站中一共會出現六個讀碼
框找到正確的ORF並確定其真正有功能的胺基酸序列長度
(二) 序列之排序
將正確之 DNA 序列利用 ClustalX 軟體(Thompson et al1994
29
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
Thompson et al1997) 進行多序列間相互差異之排序 (Multiple
Alignment)ClustalX 軟體會在適合的位置插入空隙(gap)此將會使
相似性高且長度相同之核苷酸得以被排序在一起DNA 在做 PCR 擴
增時Taq polymerase error 會使 DNA 的序列產生錯誤錯誤率在 1
以上(Okuyama et al2005Clarke et al2001)此外亦可能因為連
續多次出現重複鹼基造成 DNA 雙股螺旋中的一股上的鹼基不能正
確地與另一股上相對位置上的鹼基配對(slipped strand misparing)等各
種錯誤狀況(Walsh et al1996Murray et al1993)因此排序後須以
人為的方式進行檢查在做分析之前要先將這些錯誤的變異點找出
來並且去訂正定序時發生異常的序列使用 DAMBE 軟體(Data
Analysis in Molecular Biology and Evolution 410)將排序後的胺基酸
序列做 Unique sequence把排序後的序列相同的歸在同一條拿掉
重複的序列
(三) 親緣關係分析
因抗病基因是一種變異性大的基因故先將核苷酸胺基酸序列
以 ClustalX 軟體排序再使用 TOPALi25 軟體之 NJ 親緣關係法
(Neighbor-joining methods)建構樹狀圖在本研究中將 DNA 及胺基
酸依照排序和樹狀圖的結果序列皆為 nonTIR-NBS-LRR分類成
ABCDE 五大群其中 A 又分為 A1-A5 五小群並進行 bootstrap
30
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
隨機重複取樣 1000 次以驗證親緣關係樹之可信度
(四) 序列的多型性變化之軟體分析
使 用 DnaSP450 軟 體 (DNA sequence polymorphism) 進 行
KaKs-sliding window 將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例及 πaπs-sliding-window隨機取兩條序列
看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量以分析序列的多型性
變化及進行 McDonald-Kreitman test 看各分群的 fixed differences 和
shared polymorphic 在 synonymous nucleotide substitutions sites 和
non-synonymous nucleotide substitutions sites 的變異進行序列變異程
度分析及估算分群間之序列分歧距離當 fixed diffrernces 和 shared
polymorphic的 ratio偏離到一定程度則R gene受到正向選汰(positive
selection)
(五) 序列之演化分析-選汰壓力檢測(selective constraint analysis)
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體進行選汰壓力檢測測試抗病基
因在演化過程中經過何種選汰壓力此軟體主要是測量序列資料的演
化模式包括偵測正向選汰(positive selection)判定序列演化的取
代模型(substitution models)還有測量非同義置換(non-synonymous
substitution)與同義置換(synonymous substitution)的頻率等利用
PAML 軟體中的 codeml 程式可偵測受 positive selection 的胺基酸位
31
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
置在進行模式的選汰壓力模擬時必須要考慮 codon 的取代情形
除掉 3 個終止密碼(stop codon)因此在使用這個程式之前必須先
取得要分析的序列檔和樹檔首先以 ClustalX 軟體排序後輸出 Phylip
檔或者利用 DnaSP 450 軟體先進行轉檔將 fasta 的序列檔案形式轉
成 Phylip 形式再以 PHYLIP 363 軟體之 dnaml 子程式建構
PAML(Phylognenetic Analysis by Maximum Likelihood)軟體所需之
newick format最後進行 PAML 41 軟體中控制檔的設定
使用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml偵測在演化
過程中其序列間之非同義置換(Ka)與同義置換(Ks)之比值ω對 NBS
抗病基因序列進行選汰壓力檢測若ω>1則表示序列受到正向選
汰壓力的影響(positive selection) 若ω<1則表示序列受到純化選
汰壓力的影響(purifying selection 或 negative selection)
進行LRT(Likelihood Ratio Test)檢測在每個模式計算結果中
皆可得到一個ln值帶入LRT公式 2lnL=2[InL1-InL0]以兩倍模式
間maximum likelihood差值來計算因為此計算所得之數值會符合於
卡方分布(X2)以檢測不同模式演算的結果是否有顯著差異在進行
模式的選汰壓力模擬時必須考慮codon的取代情形除掉 3 個終止
密碼假設codon取代的情形符合了馬可夫模式(Markov model)意
指一個codon位置發生取代時不會影響另一個codon位置的取代
32
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
(六) 正向選汰壓力之分析(positive selection analysis)
利用 PAML 41 (Yang1997)軟體的子程式 codeml 所偵測受正向
選汰的胺基酸位置主要利用 null model 模式假設所有支系依造同
一速率ω演化而 free ratio model 模式則是假設每個不同支系位置都
有其各自之ω值將 free ratio model 模式所偵測到的結果跟 null
model 模式進行 LRT 檢測以了解該序列所受不同選汰壓力的狀況
是否顯著null model 模式為最基本的運算原則上只要ω>1即
表示序列受到正向選汰但是通常在 null model 模式下的ω值都不會
大於 1而 Branch-site model 則是用來偵測序列中發生的正向選汰位
置本研究採用 Branch-site model A 模式null model 為其背景模式
PAML 的分析結果會因為樹形(拓墣 topology)差異而有不同
而 且 它 也 能 夠 計 量 特 定 分 支 (branch) 的 演 化 情 形 依 據
duplication 事件對不同分支假設不同的ω則經由 duplication
所產生的兩個分支應該有不同的選汰壓力(ω)
33
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
肆結果
一序列比對及 ORF 比對分析
本研究之番茄抗病品種(品系)得到 NBS 抗病基因片段大小為
500bp(圖 1)將 cloning 所得一共 159 條正確 NBS 抗病基因序列之
DNA 序列(543 個鹼基)轉譯成胺基酸序列(181 個 aa)之後再進行
ORF(open reading frame)的長度分析找出正確的讀碼框152 條序
列超過 120bp為真正有功能的胺基酸長度沒有超過 120bp 的有 7
條屏除不具功能性的 pseudogene 後得到 152 條序列在 ORF 比
對後發現NBS-LRR 抗病基因序列片段長度約為 150 個胺基酸
二進行 NBS 的保守區域分析及建立序列親緣關係圖
在屏除不具功能性的 pseudogene 後將 cloning 得到的 152 條序
列進行 NBS 的保守區域分析進行胺基酸 NBS 結構之比較發現在
Kinase-2 保守區域序列結構 K(KR)xaaaaDDV(WD)中最末個胺基酸
皆為色胺酸(W)序列屬 nonTIR-NBS-LRR 類型經過 DAMBE410
軟體分析後胺基酸序列做 unique sequence拿掉重複的序列一共得
到 119 條序列將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見圖
3)依照排序及 NJ(Neighbor-joining methods)親緣關係樹狀圖的結果
依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群其中 A 又分
34
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
為 A1-A5 五小群 DNA 及胺基酸排序及樹狀圖的分類結果相同
以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型的甘藷 RGA 序列作為番
茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類老鼠的 APAF-1 作為外群
對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀圖此 gene 在被子植物和
裸子植物之前就有了以 bootstrap 隨機重複取樣 1000 次驗證親緣關
係樹的可信度各支系上的數字為 bootstrap 值與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(Chen et al 2007) (圖 4)NCBI 比對及
ClustalX 排序結果相對照後發現NBS 抗病基因序列明顯分成
TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 兩大類型而本研究之番茄
RGAs 序列皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型ABCDE 五大群不
同分群間的序列有極多變化A1-A5 五小群間的序列變異則較小
在 ABCDE 五大群不同分群間的序列有明顯的差異序列分
群的情況亦相吻合本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多
ABCDE 五大群不同分群間序列變異程度高表示由此推測
序列在演化上有 gene duplication 的現象發生
35
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
三分析序列的多型性變化及分群之間遺傳距離分析 (Genetic
distance)
在 NBS 抗病基因序列的遺傳距離部份以親緣關係樹狀圖依
RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群間A 群的
五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間A 群 A1-A5 五小群間及
RGAs 序列不同抗病品系之間三個部份進行分析根據圖 5 以
DnaSP450 軟體進行 KaKs-sliding window 分析以親緣關係樹狀圖
依 RGAs 序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群之間進行
KaKs sliding window分析結果顯示 GroupA對 GroupD 在 165-175bp
之間KaKs 平均為 345在 383bp KaKs 平均為 29GroupD 對
GroupE 在 308bp KaKs 為 57GroupB 對 GroupE 在 388-398bp
之間 KaKs 平均為 465GroupC 對 GroupE 在 406bp KaKs 為
51再以 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間進行 KaKs
sliding window 分析在 163 bp GroupA1 對 GroupDKaKs 為 65
在 310 bp GroupA3 對 GroupDKaKs 為 45在 389bp GroupA1
對 GroupBKaKs 為 79 GroupA2 對 GroupBKaKs 為 32GroupA4
對 GroupBKaKs 為 38A 群的五小群中 A1A2 及 A4在 389bp
對 GroupBKaKs 大於 1將兩兩序列互比看 non-synonymous 與
synonymous 之間的比例顯示這些功能性 motif 為決定抗病性的重要
36
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
關鍵而 A 群的五小群(A1-A5)與其他 BCDE 之間比 AB
CDE 五大群間 KaKs 來的大顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰
(positive selection)的貢獻為大最後再以 A 群 A1-A5 五小群間進行
KaKs sliding window 分析 GroupA2 對 GroupA3在 100bp KaKs
為 491在 188bp KaKs 為 51GroupA3 對 GroupA4在 100bp
KaKs 為 779在 390-400bp 之間 KaKs 平均為 107GroupA1
對 GroupA3在 367bp KaKs 為 203A 群的五小群(A1-A5)之間
在 100bp RNBS-A 保守區域上發生序列的多型性變化可能原因為 A
群內的 P-loop 保守區域核苷酸變異較大所造成
以 DnaSP450 軟體對親緣關係樹狀圖依 RGAs 序列間的歧異
程度分類成 ABCDE 五大群進行πaπs-sliding window 分析
隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之間的數量結果
顯示 GroupAA1B 在 200bp360bp 及 480bpπaπs 比值大於 1 (圖
6)而 GroupA 的π值特別高代表 GroupA 受到很強的 selection以
DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行 KaKs-sliding
window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)在 200bpKaKs
大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力卻不比依 AB
CDE 五大分群來的顯著以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列
各分群進行 Dxy 分析結果顯示在 non-synonymous 各分群間的 Dxy
37
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
差異比在 synonymous 的差異大 GroupA 對 non-synonymous 的貢獻
為大(圖 8)再以 t-test two tailed 計算三角矩陣之間的差異 P 值
為 00006表示各分群間有顯著差異P 值小於 0001 表示越不可能
隨機發生 synonymous 大於 non-synonymous 的情況以 DnaSP450
軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析
fixed diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果
顯示GroupB對其他分群及GroupA5對其他分群有較顯著的胺基酸變
異(表 1)綜合以上分析這些功能性 motif 為決定抗病性的重要關
鍵推測 NBS 區域可能有受到正向選汰(positive selection)的位置
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析(圖 9)
結果顯示 Group A 在 Allelic Frequency(i)為 1 時 觀測值的
Frequency(ξi)沒有超過期望值很多則表示 Group A 在近代發生的
演化較少而且 Allelic Frequency(i)為 40 時Frequency(ξi)值有上
升的驅勢推測 Group A 的演化在很久之前就有了結果顯示 Group
A 為正向選汰(positive selection)Group BA1A3在 Allelic
Frequency(i) 為 1 時 Frequency(ξi)超過期望值很多表示 Group
BA1A3 為近代發生的演化結果顯示 Group BA1A3 為正向
選汰(positive selection)對 total RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析
(圖 10)在 Allelic Frequency(i) 為 21 時 Frequency(ξi)超過期望值
38
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
很多表示演化是在之前發生的結果顯示 RGAs 為平衡選汰
(balancing selection)
四選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 codeml 分析結果顯示在 null model
模式對番茄 RGAs 序列各分群做分析所得的 ln 值為-475112
Kappa(transitiontransversion)為 221ω值小於 1在 free ratio model
模式對番茄RGAs序列各分群做分析所得的 ln值為-465231Kappa
為 237且大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1(表
2)可得知各個支系的位置有受到不同程度的選汰壓力
五正向選汰壓力分析
利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml 來進行正向選汰壓力的偵
測分析在 null model 及 Branch-site model A 模式(Text 2)對 Group A
做分析在 null model 模式所得的 ln 值為-480381Kappa 為 232
ω值等於1在Branch-site model A模式所得的 ln值為-478654Kappa
為 230ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間之比較檢測顯示
Branch-site model of null model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL
值為 3453再利用貝式理論 (Bayes theorem)分析方法之 Bayes
Empirical Bayes analysis(BEB)來計算每個序列位置之機率值當機率
值大於 90時便可確定此序列位置顯著的受到正向選汰壓力之影
39
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
響在 Group A 之抗病基因序列受到正向選汰壓力且極為顯著的胺
基酸位點分別有第 33 個(S)第 53 個(M)第 61 個(C)第 104 個(F)
第 142 個(L)第 152 個(Y) (表 3)受到正向選汰壓力的胺基酸位點
位於 P-loop 與 Kinase-2 之間的區域以及 Kinase-2 與 Kinase-3 之間
與 Kinase-3 與 GLPL 之間的區域其在 4 個功能性區域之外界於
P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的
R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰壓力
在 Group B 部份 Branch-site model of null model 模式所得的 ln
值為-480799Kappa(transitiontransversion)為 232ω值等於 1
Branch-site model of null model A 模式所得的 ln 值為-481018Kappa
為 232ω值也等於 1進行 LRT 來作模式間比較檢測顯示 null
model 與 Branch-site model A 模式間 2ΔlnL 值為 440再利用貝式
理論(Bayes theorem)分析方法之 BEB 計算每個序列位置之機率值
在Group B之抗病基因序列受到正向選汰壓力的胺基酸位點為第 121
個(E) 機率值為 935機率值大於 90受到正向選汰壓力的胺
基酸位點位於 Kinase-3 與 GLPL 的區域Group B 序列受到正向選汰
壓力之影響 (表 4)
40
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
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表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
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【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
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附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
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附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
伍討論
一植物 NBS-LRR 抗病基因專一性分析
本研究之番茄七個抗病品種(品系)針對不同抗病品種(品系)進
行分析以對番茄之幾種病源之抗病性分析是否有抗病專一性 NBS
基因結果顯示不同抗病品種(品系)之間無明顯抗病及不抗病專一性
NBS 基因之分群將此七個品種(品系)之 DNA(見圖 2)及胺基酸(見
圖 3)依照排序及樹狀圖的結果依序列間的歧異程度分類成 AB
CDE 五大群而這五大群中除 CE 為單一序列歸群AB
D 三群都含有兩種以上的抗不同病源之抗病品種(品系)不同抗病品
種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很
久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗
病基因序列的多樣性以 TIR-NBS-LRR 和 non-TIR-NBS-LRR 類型
的甘藷 RGA 序列作為番茄 RGAs 對照組以同源類似的基因人類
老鼠的 APAF-1 作為外群對照建構 Neighbor-Joining 之親緣關係樹狀
圖此 gene 在被子植物和裸子植物之前就有了與甘藷之
non-TIR-NBS-LRR 歸在同一分群表示 NBS-LRR 抗病基因演化出來
已經很久了APAF-1 是古老的 gene family而 NBS-LRR 抗病基因
在外群 APAF-1 演化之後(見圖 4)藉由 gene duplication 產生新的基
因利用染色體複製出另外一套基因隨著時間的演化漸漸將突變
41
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
累積而使基因產生了不同的演化命運增加基因組成的多樣性和複
雜度基因 gene duplication 會朝向三種演化 phase(附圖 2) 唯有產
生新的功能才是基因能夠長久存在最主要的模式(Yang et al2008)
二植物抗病機制探討及 NBS 保守功能性之組成分析
在本研究中所選殖出之抗病基因其架構上在 kinase-2 的功能性
domain 中發現最後一個胺基酸皆為色胺酸(W)無例外發生證明
所選殖出之抗病基因皆為 non-TIR-NBS-LRR此外由於 NBS-LRR
種類之抗病基因在保守區域外的相似性相當的低故使其基因序列的
變化極大極為分歧但儘管 non-TIR-NBS-LRR 的每個類型之抗病基
因間結構差異甚大但是在 NBS 幾個高度保守的功能性區
域P-loopkinase-2kinase-3 及 GLPL 仍會以高度相似性的序列存在
著(Warren et al1998)依據上網至 BCM 進行胺基酸序列 ORF 的比
對以檢視序列的完整轉譯長度結果發現有少數的抗病基因可能
因為單一鹼基的插入或是缺失的情況而提早終止變成不具功能的偽
基因(Yang et al2008)
三植物 NBS 抗病基因突變演化之趨勢
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 KaKs-sliding
window 分析將兩兩序列互比看 non-synonymous 與 synonymous 之
42
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
間的比例顯示 A 群對 RGAs 受到正向選汰(positive selection)的貢
獻為大以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window 分析 結果顯示其中唯有抗青枯病品系(BW)
在 200bpKaKs 大於 1(圖 7) 但不同抗病品系受到正向選汰壓力
卻不比依 ABCDE 五大分群來的顯著
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行πaπs-sliding
window 分析隨機取兩條序列看 non-synonymous 與 synonymous 之
間的數量結果顯示 GroupA 的π值特別高(圖 6)代表 GroupA 受到
很強的 selection
以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列各分群進行 Dxy 分析結
果顯示在 Non-synonymous 各分群間的 Dxy 差異比在 synonymous 的
差異大對於基因的位點所承受的選汰壓力在非同義置換
(Non-synonymous)比同義置換(synonymous)來的顯著而 GroupA 五
小群對 non-synonymous 的貢獻為大 (圖 8)故推測非同義置換
(Non-synonymous)大於同義置換(synonymous)可以增進抗病基因在演
化上所產生的變異
對番茄 RGAs 各分群進行 McDonald-Kreitman test 分析當 fixed
diffrernces 和 shared polymorphic 的 ratio 偏離到一定程度結果顯示
GroupB 對其他分群及 GroupA5 對其他分群有較顯著的胺基酸變異
43
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
(表 1)NBS-LRR 基因具有較高的 non-synonymous 變異而造成序列
多樣性(Gos-Gesseca et al2008)推測可能受到正向選汰(positive
selection)
對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析結果顯
示 Group A 在近代發生的演化較少推測 Group A 的演化在很久之
前就有了Group A 為正向選汰(positive selection)Group BA1
A3 為近代發生的演化也為正向選汰(positive selection)(圖 9)對 total
RGAs 進行 Frequency Spectrum 分析(圖 10)分析結果顯示演化是在之
前發生的RGAs 為平衡選汰(balancing selection)
RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族群
分歧(Gos-Gesseca et al2008)造成 RGAs 為平衡選汰(balancing
selection)的原因也可能為 NBS-LRR 抗病基因演化出來已經很久了
在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成 NBS-LRR 抗病基因
序列的多樣性 selective constraints 維持著 functional gene 的重要性
(Gos-Gesseca et al2008)以上方法是針對整體之 NBS 抗病基因序列
進行分析無法測得某一些特定胺基酸位點上所遭受之不同程度的選
汰壓力顯示的結果無法單獨的分析各個支系受到的演化壓力或者是
單獨胺基酸位置的演化趨勢故在本研究中再以 PAML 軟體來加以
44
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
輔佐探討在 NBS 抗病基因中各個胺基酸位點在不同程度壓力下之真
正演化的模式
四植物 NBS 抗病基因之選汰壓力之探討
在本研究中之 KaKs 分析non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番
茄 RGAs 各分群以 PAML 軟體進行 free ratio model 最適模式檢測
大部份分支之ω值皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支
系的位置有受到不同程度的選汰壓力(Frank S A1993)結果發現在
每一類群中皆呈現多樣的選汰壓力在功能性上的演化遭受了侷限的
壓力從各個支系中所測得的ω值可知有大部份的支系皆受到了
selective constraints(ω值<1)尤其有部份支系ω值為 00001(表 2)
顯示了這些支系受到了強烈的 selective constraintsKaKs 之取代速
率趨近於 0這樣的結果顯示在抗病基因序列中大部份的非同義置換
皆無法被保留下來也許是有害的也許是不利於抗病性之演化突
變或者是這些取代置換的發生會導致個體無法長久生存而遭受淘
汰所以在選汰壓力的選拔之下這些置換會被移除而不允許序列被
取代置換特別是在一些具有功能性的胺基酸區域若這些位置遭受
取代則可能造成基因的功能喪失而使得植物感病甚至死亡(Teshima
et al2006)然而在少數的分支上所測得之ω值大於 1顯示在
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因中的某些胺基酸位點正受正向選汰
45
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
壓力之作用由此結果可知在各個的支系之間有著差異性且發生了獨
立的演化關係抗病基因的演化壓力並無明顯因抗不同種病之品種區
隔上的差別推測可能是有少數特定的胺基酸位置同時遭受多樣選汰
壓力下的結果(Rose et al2004)
五植物 NBS 抗病基因之正向選汰壓力之探討
以 PAML 軟 體 執 行 Branch-site model A 模 式 以 分 析
non-TIR-NBS-LRR 類型抗病基因番茄 RGAs 序列胺基酸位置之間是
否受到正向選汰及受到選汰壓力的胺基酸位置之功能(圖 1112)此
證明正向選汰的壓力確實有作用於 NBS 類型的抗病基因胺基酸序列
的少數特定位置這種基因在比例上有相對較高的核苷酸變異所以
與其他基因相比其基因所製造出來的胺基酸序列也會有很大的變
化雖然在整個 NBS-LRR 抗病基因的演化過程中僅有少部份的胺
基酸受到正向選汰壓力但這些正向選汰之位點有可能會造成胺基酸
關鍵性的變化進而使基因的功能受到影響(Teshima et al2006)在
non-TIR-NBS-LRR 五大群中除 CE 為單一序列歸群AB 兩群
在 LRT 檢測模式下的 2ΔlnL 值皆為顯著受到正向選汰(positive
selection)壓力P 值皆小於 00001(表 345)表示受到正向選汰的壓
力非常明顯以此分析結果得知在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在功能性區域之外的序列保守程度相當的
46
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
低但在功能性區域上卻呈現非常高度的保守性其中唯有 Group A
在 4 個功能性區域之外界於 P-loop 與 Kinase-2 的 R-NBS-A 區域
以及界於 Kinase-3 與 GLPL 的 R-NBS-C 區域皆有受到了正向選汰
壓力 (圖 11) 比對後發現所偵測到正向選汰之胺基酸皆屬於
R-NBS-A 及 R-NBS-C 區域可能產生的胺基酸置換故更加強證明了
NBS-LRR 抗病基因序列的功能性區域 P-loopKinase-2Kinase-3
GLPL 為高度保守且相似性極高的區域NBS-LRR 是抗病基因中最
主要且最為重要的類型在許多的高等植物中皆證實了在 NBS-LRR
區域中會經歷多樣性的正向選汰壓力尤其是在 NBS 區域內的核苷
酸變化扮演著決定其抗病功能性的重要角色(Mondragon-Palomino
et al2002)在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生
以避免功能性的改變甚至喪失其功能而導致植物感病甚至死亡也
解釋了 NBS 中功能性區域序列會呈現高度保守之原因(Teshima et
al2006)
NBS domain 因為有 ATP-binding 的功能所以有較強的 selective
constraints也因此可找到較多 motifs(Mondragon-Palomino et
al2002)而 LRR 為受到強的正向選汰(positive selection)壓力的
domain結構上 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域多為α-helix
的疏水結構多數的α-helix 較為易適應的相對的 motif 的區域則
47
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
多為β-sheet解釋了 motifs 與 motifs(intermotifs)之間的區域較多
KaKs>1 的情況(Mondragon-Palomino et al2002)
本文中針對抗病基因中最主要之NBS-LRR類型進行研究利用
這個模式物種的研究可以對其他相關的野生種作為研究的模型基
礎確認NBS抗病基因的多樣性提供未來栽培作物在選殖抗病品系
的參考與應用
48
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
陸結論
綜合上述研究結果可知
1 在本研究之番茄七種不同抗病品種(品系)之間番茄 RGAs 序列
皆屬 non-TIR-NBS-LRR 類型不同抗病品種(品系)group 在一起
無明顯之抗病及不抗病品種(品系)之間的專一性 NBS 基因
2 依序列間的歧異程度分類成 ABCDE 五大群不同抗病
品種(品系)會 group 在一起顯示 NBS-LRR 抗病基因演化出來已
經很久了在抗病品種(品系)之育種之前就已經存在造成
NBS-LRR 抗病基因序列的多樣性
3 本研究之番茄 RGAs 序列 NBS 抗病基因變化多ABCD
E 五大群不同分群間序列變異程度高由此驗證序列在演化上有
gene duplication 的現象發生
4 GroupA 五小群對 non-synonymous 的貢獻為大推測 Group A 的
演化在很久之前就有了
5 RGAs 為平衡選汰(balancing selection)是造成 R 基因序列多樣性
的重大起因與 R 基因對比序列變化的分析和分化顯示了高族
群分歧
6 在 branch site model of free ratio model 模式大部份分支之ω值
皆小於 1只有少部份分支大於 1可得知各個支系的位置有受
49
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
到不同程度的選汰壓力
7 在本研究中NBS 區域有偵測出許多正在承受著正向選汰的位
置但非位於功能性區域中在 NBS-LRR 抗病基因中之所以變
異極大的原因可能是因為在 NBS-LRR 抗病基因序列的功能性
區域之外的序列保守程度相當的低但在功能性區域上卻呈現非
常高度的保守性且相似性極高指出了這些功能性區域正是決定
抗病性的重要關鍵最後會受到強烈的功能限制而慢慢的被固定
下來在這些功能性區域中不允許有非同義置換的情況發生以
避免功能性的喪失若這些位置遭受取代則可能造成基因的功
能喪失而使得植物感病甚至死亡
50
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
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650ndash659
Yang ZH Wong WSW Nielsen R(2005) Bayes empirical Bayes inference
of amino acid sites under positive selection Molecular Biology and
Evolution 22 1107-1118
Yahiaoui N Brunner S Keller B(2006) Rapid generation of new powdery
mildew resistance genes after wheat domestication Plant Journal 47
85-98
Yang ZH(2007) PAML 4 Phylogenetic analysis by maximum likelihood
Molecular Biology and Evolution 24 1586-1591
Yang SH Zhang XH Yue JX Tian DC Chen JQ(2008) Recent
duplications dominate NBS-encoding gene expansion in two woody
species Molecular Genetics and Genomics 280 187-198
61
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Plant Biology 3 285-290
Zhang LQ Peek AS Dunams D Gaut BS(2002) Population genetics of
duplicated disease-defense genes hm1 and hm2 in maize (Zea mays ssp
mays L) and its wild ancestor (Zea mays ssp parviglumis) Genetics
162 851-860
Zhang JZ(2004) Frequent false detection of positive selection by the
likelihood method with branch-site models Molecular Biology and
Evolution 21 1332-1339
Zhou T Wang Y Chen JQ Araki H Jing Z Jiang K Shen J Tian D
(2004) Genome-wide identification of NBS genes in japonica rice
reveals significant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR genes
Molecular Genetics and Genomics 271 402-415
Zhang JZ Nielsen R Yang ZH(2005) Evaluation of an improved
branch-site likelihood method for detecting positive selection at the
molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
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molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
by Complementary Degenerative Mutations Genetics Society of
America 151 1531ndash1545
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62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
in the Biosciences 8 275-282
Keen NT (1990) Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen
interactions Annual Review of Genetics 24 447-463
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the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through
sequence weightingposition-specific gap penalties and weight matrix
choiceNucleic Acids Res 224673-4680
Thompson JD Gibson TJ Plewniak F Jeanmougin F Higgins DG
(1997) The CLUSTAL_X windows interface flexible strategies for
multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic
59
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and linkage mapping of R-gene analogous DNA sequences in pea
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67-71
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60
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of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWANucleic acids
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nucleotide binding site (NBS) type from Lens species Genome 47
650ndash659
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of amino acid sites under positive selection Molecular Biology and
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mildew resistance genes after wheat domestication Plant Journal 47
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Yang ZH(2007) PAML 4 Phylogenetic analysis by maximum likelihood
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Yang SH Zhang XH Yue JX Tian DC Chen JQ(2008) Recent
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reveals significant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR genes
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Zhang JZ Nielsen R Yang ZH(2005) Evaluation of an improved
branch-site likelihood method for detecting positive selection at the
molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
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molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
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【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
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附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
coefficients from phylogenetic data with applications to mitochondrial
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the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through
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likelihood method with branch-site models Molecular Biology and
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reveals significant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR genes
Molecular Genetics and Genomics 271 402-415
Zhang JZ Nielsen R Yang ZH(2005) Evaluation of an improved
branch-site likelihood method for detecting positive selection at the
molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
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the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through
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multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic
59
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and linkage mapping of R-gene analogous DNA sequences in pea
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changes in intraspecific diversity and allelic cycling of a specialist
defense gene in Zea Genetics 168 425-434
Van der Biezen EA Jones JDG (1998) The NB-ARC domain A novel
signalling motif shared by plant resistance gene products and regulators
of cell death in animals Current Biology 8 R226-R227
Vanderplank JE (1991) The two gene-for-gene hypotheses and a test to
distinguish them Plant Pathology 40 1-3
Van der Hoorn RAL De Wit PJGM Joosten MHAJ (2002) Balancing
selection favors guarding resistance proteins Trends in Plant Science 7
67-71
Van der Vossen E Sikkema A Hekkert BTL Gros J Stevens P Muskens
M Wouters D Pereira A Stiekema W Allefs S (2003) An ancient R
gene from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers
broad-spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato
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of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWANucleic acids
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of NBS-encoding genes in Rosaceae fruit crops Molecular
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variation in nuclear genes of mammals Journal of Molecular Evolution
46 409-418
Yaish MWF Saacuteenz de Miera LE and Peacuterez de la Vega M(2004)
Isolation of a family of resistance gene analogue sequences of the
nucleotide binding site (NBS) type from Lens species Genome 47
650ndash659
Yang ZH Wong WSW Nielsen R(2005) Bayes empirical Bayes inference
of amino acid sites under positive selection Molecular Biology and
Evolution 22 1107-1118
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mildew resistance genes after wheat domestication Plant Journal 47
85-98
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Molecular Biology and Evolution 24 1586-1591
Yang SH Zhang XH Yue JX Tian DC Chen JQ(2008) Recent
duplications dominate NBS-encoding gene expansion in two woody
species Molecular Genetics and Genomics 280 187-198
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molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
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圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
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68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
Nucleic Acids Research 34 W609-W612
Tajima F (1989) Statistical method for testing the neutral mutation
hypothesis by DNA polymorphism Genetics 123 585-595
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59
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protease inhibitor wip1 in Zea and related genera Molecular Biology
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changes in intraspecific diversity and allelic cycling of a specialist
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Van der Biezen EA Jones JDG (1998) The NB-ARC domain A novel
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Van der Hoorn RAL De Wit PJGM Joosten MHAJ (2002) Balancing
selection favors guarding resistance proteins Trends in Plant Science 7
67-71
Van der Vossen E Sikkema A Hekkert BTL Gros J Stevens P Muskens
M Wouters D Pereira A Stiekema W Allefs S (2003) An ancient R
gene from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers
broad-spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato
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Van Ooijen G Mayr G Kasiem MMA Albrecht M Cornelissen BJC
Takken FLW (2008) Structure-function analysis of the NB-ARC
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60
Botany 59 1383-1397
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of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWANucleic acids
research 242807-2812
Xu Q Wen XP Deng XX(2007) Phylogenetic and evolutionary analysis
of NBS-encoding genes in Rosaceae fruit crops Molecular
Phylogenetics and Evolution 44 315-324
Yang ZH Nielsen R(1998) Synonymous and nonsynonymous rate
variation in nuclear genes of mammals Journal of Molecular Evolution
46 409-418
Yaish MWF Saacuteenz de Miera LE and Peacuterez de la Vega M(2004)
Isolation of a family of resistance gene analogue sequences of the
nucleotide binding site (NBS) type from Lens species Genome 47
650ndash659
Yang ZH Wong WSW Nielsen R(2005) Bayes empirical Bayes inference
of amino acid sites under positive selection Molecular Biology and
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Yahiaoui N Brunner S Keller B(2006) Rapid generation of new powdery
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Yang ZH(2007) PAML 4 Phylogenetic analysis by maximum likelihood
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Yang SH Zhang XH Yue JX Tian DC Chen JQ(2008) Recent
duplications dominate NBS-encoding gene expansion in two woody
species Molecular Genetics and Genomics 280 187-198
61
Young ND(2000) The genetic architecture of resistance Current Opinion in
Plant Biology 3 285-290
Zhang LQ Peek AS Dunams D Gaut BS(2002) Population genetics of
duplicated disease-defense genes hm1 and hm2 in maize (Zea mays ssp
mays L) and its wild ancestor (Zea mays ssp parviglumis) Genetics
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Zhang JZ(2004) Frequent false detection of positive selection by the
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Zhou T Wang Y Chen JQ Araki H Jing Z Jiang K Shen J Tian D
(2004) Genome-wide identification of NBS genes in japonica rice
reveals significant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR genes
Molecular Genetics and Genomics 271 402-415
Zhang JZ Nielsen R Yang ZH(2005) Evaluation of an improved
branch-site likelihood method for detecting positive selection at the
molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
Acids Research 25 4876-4882
Timmerman-Vaughan GMFrew TJWeeden NF (2000) Characterization
and linkage mapping of R-gene analogous DNA sequences in pea
(Pisum sativum L) Theor Appl Genet 101241ndash247
Tiffin P Gaut BS (2001) Molecular evolution of the wound-induced serine
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and Evolution 18 2092-2101
Tiffin P Hacker R Gaut BS (2004) Population genetic evidence for rapid
changes in intraspecific diversity and allelic cycling of a specialist
defense gene in Zea Genetics 168 425-434
Van der Biezen EA Jones JDG (1998) The NB-ARC domain A novel
signalling motif shared by plant resistance gene products and regulators
of cell death in animals Current Biology 8 R226-R227
Vanderplank JE (1991) The two gene-for-gene hypotheses and a test to
distinguish them Plant Pathology 40 1-3
Van der Hoorn RAL De Wit PJGM Joosten MHAJ (2002) Balancing
selection favors guarding resistance proteins Trends in Plant Science 7
67-71
Van der Vossen E Sikkema A Hekkert BTL Gros J Stevens P Muskens
M Wouters D Pereira A Stiekema W Allefs S (2003) An ancient R
gene from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers
broad-spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato
and tomato Plant Journal 36 867-882
Van Ooijen G Mayr G Kasiem MMA Albrecht M Cornelissen BJC
Takken FLW (2008) Structure-function analysis of the NB-ARC
domain of plant disease resistance proteins Journal of Experimental
60
Botany 59 1383-1397
Walsh PFildes MJReynolds R(1996)Sequence analysis and characterization
of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWANucleic acids
research 242807-2812
Xu Q Wen XP Deng XX(2007) Phylogenetic and evolutionary analysis
of NBS-encoding genes in Rosaceae fruit crops Molecular
Phylogenetics and Evolution 44 315-324
Yang ZH Nielsen R(1998) Synonymous and nonsynonymous rate
variation in nuclear genes of mammals Journal of Molecular Evolution
46 409-418
Yaish MWF Saacuteenz de Miera LE and Peacuterez de la Vega M(2004)
Isolation of a family of resistance gene analogue sequences of the
nucleotide binding site (NBS) type from Lens species Genome 47
650ndash659
Yang ZH Wong WSW Nielsen R(2005) Bayes empirical Bayes inference
of amino acid sites under positive selection Molecular Biology and
Evolution 22 1107-1118
Yahiaoui N Brunner S Keller B(2006) Rapid generation of new powdery
mildew resistance genes after wheat domestication Plant Journal 47
85-98
Yang ZH(2007) PAML 4 Phylogenetic analysis by maximum likelihood
Molecular Biology and Evolution 24 1586-1591
Yang SH Zhang XH Yue JX Tian DC Chen JQ(2008) Recent
duplications dominate NBS-encoding gene expansion in two woody
species Molecular Genetics and Genomics 280 187-198
61
Young ND(2000) The genetic architecture of resistance Current Opinion in
Plant Biology 3 285-290
Zhang LQ Peek AS Dunams D Gaut BS(2002) Population genetics of
duplicated disease-defense genes hm1 and hm2 in maize (Zea mays ssp
mays L) and its wild ancestor (Zea mays ssp parviglumis) Genetics
162 851-860
Zhang JZ(2004) Frequent false detection of positive selection by the
likelihood method with branch-site models Molecular Biology and
Evolution 21 1332-1339
Zhou T Wang Y Chen JQ Araki H Jing Z Jiang K Shen J Tian D
(2004) Genome-wide identification of NBS genes in japonica rice
reveals significant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR genes
Molecular Genetics and Genomics 271 402-415
Zhang JZ Nielsen R Yang ZH(2005) Evaluation of an improved
branch-site likelihood method for detecting positive selection at the
molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
Botany 59 1383-1397
Walsh PFildes MJReynolds R(1996)Sequence analysis and characterization
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61
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162 851-860
Zhang JZ(2004) Frequent false detection of positive selection by the
likelihood method with branch-site models Molecular Biology and
Evolution 21 1332-1339
Zhou T Wang Y Chen JQ Araki H Jing Z Jiang K Shen J Tian D
(2004) Genome-wide identification of NBS genes in japonica rice
reveals significant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR genes
Molecular Genetics and Genomics 271 402-415
Zhang JZ Nielsen R Yang ZH(2005) Evaluation of an improved
branch-site likelihood method for detecting positive selection at the
molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
Young ND(2000) The genetic architecture of resistance Current Opinion in
Plant Biology 3 285-290
Zhang LQ Peek AS Dunams D Gaut BS(2002) Population genetics of
duplicated disease-defense genes hm1 and hm2 in maize (Zea mays ssp
mays L) and its wild ancestor (Zea mays ssp parviglumis) Genetics
162 851-860
Zhang JZ(2004) Frequent false detection of positive selection by the
likelihood method with branch-site models Molecular Biology and
Evolution 21 1332-1339
Zhou T Wang Y Chen JQ Araki H Jing Z Jiang K Shen J Tian D
(2004) Genome-wide identification of NBS genes in japonica rice
reveals significant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR genes
Molecular Genetics and Genomics 271 402-415
Zhang JZ Nielsen R Yang ZH(2005) Evaluation of an improved
branch-site likelihood method for detecting positive selection at the
molecular level Molecular Biology and Evolution 22 2472-2479
62
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖目錄
650 bp
500 bp
圖1 PCR product在500bp處有明顯band Clony PCR加上vector後長
度約650bp
63
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
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表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
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附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖2 對番茄RGAs序列之DNA進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次各支系
上的數字為bootstrap值圖左下之bar表示其親緣關係樹狀圖分
支遺傳距離之標準
64
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖3 對番茄RGAs序列之胺基酸進行分群建構NJ(Neighbor-Joining)
之親緣關係樹狀圖以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下
之bar表示其親緣關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
65
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖4 以TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR類型的甘藷RGA序列作
為番茄對照組外群以人類老鼠的APAF-1作為對照建構
Neighbor-Joining之親緣關係樹狀圖各支系上的數字為bootstrap
值以bootstrap 隨機重複取樣1000次圖左下之bar表示其親緣
關係樹狀圖分支遺傳距離之標準
66
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖 5 以 DnaSP450 軟 體 對 番 茄 RGAs 序 列 各 分 群 進 行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析
67
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖 6 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群進行πaπs-sliding
window-Phylogroups 分析
68
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖 7 以 DnaSP450 軟體對番茄 RGAs 序列不同抗病品系進行
KaKs-sliding window-Phylogroups 分析 其中藍色實心抗青枯
病品系(BW)在 200bpKaKs 大於 1
69
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖 8 以DnaSP450軟體對番茄RGAs序列各分群以及在 Synonymous
與 Non-synonymous 分別進行 Dxy 分析在 Non-synonymous 群
與群之間 Dxy 有明顯差異以 T-TEST TWO TAILED 計算 P
值為 00006表示各分群間有顯著差異
70
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖 9 對番茄 RGAs 序列各分群進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值藍色長條圖為觀測值Group A Allelic
Frequency(i)在 1 時 Frequency(ξi)沒有超過期望值很多而且
Allelic Frequency(i)在 40 時Frequency(ξi)值有上升的驅勢
71
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
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附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖 10 對番茄 RGAs119 條序列進行 Frequency Spectrum 分析紅色
折線圖為期望值黑色長條圖為觀測值
72
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
圖 11 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group A 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
圖 12 利用 PAML41 軟體之子程式 Codeml在 Branch-site model A
模式下偵測 Group B 受到正向選汰(positive selection)的胺基酸
位置
73
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
表目錄
表 1 McDonald-Kreitman test
表 2 Free ratio model
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL df P
(tstv) (dNdS)
free-ratio 237 -465231 19761 1 lt00001
null model 221 026 -475112
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值
74
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
表 3 Group A Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 230 100 -478654 3454 1 lt00001
33S(0984)
53M(0945)
61C(0922)
104F(0959)
142L(0924)
152Y(0998)
null model 232 100 -480381
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
表 4 Group B Branch-site model A
Model code kappa omega(ω) InL 2lnL Positively selected sites df P
(tstv) (dNdS) BEB
branch site model A 231595 100000 -481018 4397668 124E 0935 1 lt00001
null model 231603 100000 -480799
Kappa 為 transitiontransversionω為 displacement non-synonymousdisplacement synonymousInL 為 Likelihood Ratio Test2lnL 以兩倍模式間 maximum likelihood 差值BEB 為 Bayes Empirical Bayes analysis
75
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
【附錄】圖目錄
附圖 1 NBS-LRR 結構(Meyer et al1999)
附圖 2 Gene duplication 的三種命運(Force et al1999)
附圖 3 NBS 區域包含了許多保守的 domain本研究之 primer 設計建
立在 P-loop 和 GLPL 區域
76
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
【附錄】表目錄
附表 1 基因對基因學說(gene for gene hypothesis)關係
附表 2 ACRDC Tomato Breeding material
Var name Resistance H24 ToLCVR ( Ty-2) CL5915-93-1-0-3 ToLCV SusToMV
CLN2777A ToLCVR ( Ty-1 amp Ty-2) F-1 ToMV MBW
BL986 BWR L390 BW Sus
CLN2764A FUSR (F-1 amp F-2)ToMVMBW
BL734 FUS sus
ToLCVR= Tomato leaf curl virus resistance ToLCVSus+Tomato leaf curl virus susceptible ToMV = Tomato mosaic virus resistance BWR = Bacterial wilt resistance FUSR= Fusarium wilt resistance MBW =Moderate resistance to bacterial wilt
77
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
78
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
附表 3 引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度
(degC) Size(bp)
deg F 5GGTGGGGTTGGGAA(AG)AC(ATCG)AC3 523 20 deg R 5CAACGCTAGTGG(ATCG)A(AG)(ATCG)CC3 523 18
附表 4 加熱循環 PCR 反應試劑
PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl)
Genomic DNA 20 ngμl 30 Primer pairs 2 μM 50 Taq DNA polymerase 05 U 03 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 30 BSA 30 RNase 10U 15 dNTPs 200μM 60 ddH2O 32 Total volume 300
附表 5 加熱循環 PCR 擴增程序(program)
PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5minStep2 94 1minStep3 523 1minStep4 72 2min Go to Step 2 for 35 cycles Step5 72 5minStep6 4 End
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附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
附表 6 Ligation 反應試劑
Ligation 反應試劑
試劑 劑量(μl) PCR product 30 ligation buffer A 10 ligation buffer B 10 yTampA vector 20 T4 DNA ligase 10 ddH2O 20 Total volume 100
附表 7 Colony PCR 使用引子序列及煉合溫度
引子名 序列組成 溫度(degC) Size(bp)
M13F 5GTTTTCCCAGTCACGAC3 550 17 M13R 5TCACACAGGAAACAGCTATGAC 550 22
附表 8 Colony PCR 反應試劑
Colony PCR 反應試劑 試劑 濃度 劑量(μl) 單一菌落 M13FM13R Primer 02 μM 10 Taq DNA polymerase 05 U 01 10x PCR reaction buffer(TB) 20μl 10 dNTP 02mM 20 RNase 10U 10 ddH2O 40 Total valume 100
79
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80
附表 9 Colony PCR program
Colony PCR 反應 program 步驟 溫度 時間
Step1 94 5min Step2 94 30sec Step3 55 30sec Step4 72 30sec Go to Step 2 for 25 cycles Step5 72 7min Step6 4 Hold
80