根l物ウイル ス の 遺伝子診 断 491

植物ウイルスの遺 伝 子 診断

独立行政法人農業技術研究機構九州沖縄農業研究セ ン タ ー 花 田 薫

は じ め に

植物 ウ イ ル ス は世界 中 で 950 種以 ヒ が知 ら れて お り ，

我 が 国 で も 300 種以 ヒ が発 生 し て い る 。 植物 ウ イ ル ス

は ， そ の遺伝子の種類か ら DNA ウ イ ル ス と RNA ウ イ

ル ス に 大別 さ れ る o ほ と ん ど が RN A ウ イ ル ス で 90%

以上 を し め て い る こ と は ， 植物 ウ イ ル ス の大 き な特徴で

あ る 。 従来， 植物 ウ イ ル ス は形態 ・ 宿主域 ・ 特定 の植物

で の 病徴 ・ 媒介者 な ど の 性質 に 基づ い て 大 き く 分 類 さ

れ， 血清学的な性質 で同 定 さ れ て 命名 さ れて き た 。 最近

に な っ て ， 植物 ウ イ ル ス の遺伝子解析 は 急速 に進み， こ

れ ま で純化精製が困難 な た め に 性状が未確定で研究が進

ま な か っ た ウ イ ル ス の 多 く に つ い て も ， そ の遺伝子構造

が明 ら か に さ れ多 く の新知見が報告 さ れ て き て い る 。 そ

れ に伴 っ て ， ウ イ ル ス や ウ イ ロ イ ド で決 定 さ れた 塩基配

列 を利 用 し た 遺伝子診断技術が急速 に 進 ん で き て お り ，

個々 の病原 に つ い て 遺伝子診断法が確立 さ れ て き た 。 こ

こ で は PCR を利 用 し た 遺伝子診 断 の 利 用 法 と そ の 現状

に つ い て 紹 介 す る 。

I 遺伝子診断の特徴

遺伝子レ ベル で の 解析 が早 く か ら 進ん で い る 植物 ウ イ

ル ス で は ， 耐 熱 性 の DNA ポ リ メ ラ ー ゼ を 使 用 し た

PCR の発明後， 早 く か ら 遺伝子診断 の 利 用 が検討 さ れ

て き た 。 D NA ウイ ル ス で は PCR の み で遺伝 子 を 増 幅

で き る が， RNA ウ イ ル ス で は ， PCR の前 に 逆 転 写

(RT)反応 を行 っ て RN A か ら D NA を 合成 す る 反 応 が

必要な の で， R T- PCR と呼 ばれて い る 。

ウ イ ル ス や ウ イ ロ イ ド の遺伝子診断 は， 検出 感度が高

い の が大 き な 特徴 で あり ， そ の操 作 も 比較的 に簡易 迅速

な手法で あ る 。 し か し ， そ こ に 至 る ま での種々 の 条件設

定 が極 め て重 要で、 あ る 。 条件設定 が不十分 で あ る と ， 非

特異反応 のた め に感染 し て い な い株 を感染 し て い る と 判

定 し た り ， 逆に 感染 し て い る のに検出 で き な か っ た り す

る 場合 もあ る 。 再現性の高 い遺伝子診断 を行う に は ， 他

の手法 を 用 い て あ ら か じ め比較検討 を行 っ て お き ， 確実

な 条件 を 設定 し て お く 必要 が あ る 。

Diagnosis of Plant Viruses by PCR and RT-PCR. By

Kaoru H^N^D^ ( キー ワ ー ド : PCR， RT- l'CR， プラ イ マー)

PCR を 用 い た 遺伝子診 断 は ， 確 実 に 行 え ば大 き な 利

点 を も っ優れ た 診 断 法 で あ る 。 特 に 抗血清診断法 と 比較

し た 場合の遺伝子診断の利点 と し て は 次 の こ と が挙 げ ら

れ る 。 ① プ ラ イ マ ー さ えあ れ ば， 原理的 に はと、 ん な ウ イ

ル ス で も 検出 可能 で あ る 。 各 ウ イ ル ス に 対 す る抗血清 を

一つ ずつ作製す る の は 大変 な 仕事 で あ り ， ま ず ウ イ ル ス

の純化精製か ら 始 め る 必要 が あ る o 純化が困難 な ら そ こ

で 中 断 し て し ま う 。 PCR で は ， プ ラ イ マ ー セ ッ ト を も

っ て い れ ば診断 を す ぐ に 行 え る わ け で， 各種の ウ イ ル ス

に対す る プ ラ イ マ ー を も っ て お く こ と は ， 各種 ウ イ ル ス

の抗血清 を保有 し て い る の と 同 じ く ら い の 価値 が あ る 。

②共通す る 配列部分 を プ ラ イ マ ー と し て 用 い るこ と で，

奥 な っ た 種の ウ イ ル ス で も 同時に検出 で き る 。 ③逆 に特

定 の ウ イ ル ス や分 離株 に の み特異的 な 配列部分 を プ ラ イ

マ ー と す れ ば， 特 定 の も の だ け を 検出 で き る 。 ④ RT

PCR や PCR に よ っ て 増幅 さ れた DNA 断 片 を 制 限酵素

で 処 理 す る ( RFLP と呼 ぶ) こ と で， 検出 さ れ た ウ イ

ル ス の類似性 を 知 るこ と がで き る 。 ⑤ 必 要 な ら 増幅断片

の塩基配列 を決 定 し て ， 既知の も の と 比較 で き る 。 @血

清学的手 法 で は 検出 で き な い ウ イ ロ イ ド な ど の検出 がで

き る 。 ⑦ ほ か の手 法 で は 検出 で き な い低濃度 の ウ イ ル ス

を検出 で き る 。

H 遺伝子診断の具体的手法

植物 ウ イ ル ス の 遺伝子診断 の た め に は， い く つ か の 基

本的な技術が必要 と な る 。 そ れ ら は ， 鋳 型 と す る た め の

核 酸 の 抽出 法， プ ラ イ マ ー， PCR また は RT- PCR の

反応 ， そ し て 検出 法 で あ る 。 一般的 な原理や実験法 に つ

い て は， 他 の 参 考 書 を 参 照 さ れ た い (島本 ・ 佐々 木，

1 997 な ど) 。 こ こ で は ， 特 に 植物 ウ イ ル ス に つ い て 具体

的 に 説明 す る 。

1 鋳型の抽出

( 1 ) DNA ウ イ ル ス

ジェ ミ ニ ウ イ ル ス で は DI':LI.八I 'OI

�92 til'(物1\;Ij 泌 節目径 約 IIリ (20D I "1'.)

ナトリウムをJlJいる刀法が報特されている。;'.K1:t繁殖伯

作物で のパドナウイルスでは， 1符líJI'ìí:主にSOSやPVP

などを添加するとよし、。

( 2) RNAウイJレスとウイロイド

l) 植物からのImAれ1111:タバコ など多くの革本植物では， 自宅Mちにはアルカリtl:

の緩衝液にill5己斉1)とSDSを添加|したもの をJIJい， フェ

ノールなどのタンパク'['I変性剤で処f'l'して遠心分離後，

エタノ�Jレなどで核般を沈殿させ遠心で集め洗浄してJ;tz

以後， 作成Þii7.kにとかしたもの をRT-PCRに)IJい る。

SDSやフェノールの除去のためクロ ロ フォjレムなどの

利用は有効である。

一般に栄長繁鎚十1:植物は般化防索や多私Irgtiなどを多く

合むために， In'-PCRに利川可能なImAを111川げる

ことはl示liJ!fÊ弘、ことが多し、。

サツマイモからRT-PCRに{火えるRNAのlIiJl/'，は納

物ウイルスc1sl�NAの羽11出などで円lし当る CF 11セ/レロ

ース粉末を平IJ)Jjすることで比l絞的問幼にできる(大白・

花旺1， 1996)。 また， DNA 111liUのために考楽された/j

法(DEI.I川山l、et al.. 1983)を附易にした方法が以近佐藤ら(2000)によって報告されているが， ジャガイモ})�

-茅やザツマイモからもRNAを9J'i./I寺11\1でnn使に111111\でき

る。

手えが国のキクにはキクわし3化ウイロイドが， カンキツ

にはエクソコーティスなど8在Eウイロイドが発生してお

り， その診断にはRT-PCRがm'i使で迅速である。 これ

らの相物からのRNAの十11111\には， ショ1);IrやPVPの力LI

川が有効でーあり， CF-llやïlH!l>iのキットの平1)川も有効

である。

2) RFLPと弱713株特異的RT-PCR嶋中高DNA断)tーを適当なi1iIJl�民間f索で切断して， 大きさ

の�j:�なる DNA断)'1ができてくる:I�Jfìには， RFLPによ

って系統や特殊な株を特定できる。 サツマイモ�I紋モザ

イクウイjレスの4系統に共通な プライマー をnJ いた

RT-PCRによってサツマイモからDNAI折片を明11問後，

制限醇索で処JIHをし電気泳動すると， 系統によって断j十

の大きさが]'Itl工ることそ利川して系統を特定することが

できるなど多くのよL体例がある。 また， わず、かな数の�!IJ{

l占月c�IJのみJ'�とよる弱毒株と強汚株を|ズ別世るような場介

には， その災なる1";/1分を利mして作製したプライマーを

HJいたRT PCl�によって両株を識JJI)できる。

3 ) 媒介ノ1"物からの検出へのヰIJJTj

アブラムシが伝搬1るジャガイモ葉巻ウイルスやトリ

ステザウイルスのアブラムシからの!日I感度検1'1\， 似虫{:Li

染普1:のGIゆ

一一一 2

ナジラミ伝染七|のジェミニウイノレスのコサジラミからの

検川などがl口、 いじI�やPCI�によって可能なことが桜

fりされており， 従米のエライザ辺、より1�':j!\L�J互でーあること

が11M認されている。 イスラエjレ の TYL CVが特定のコ

ナジラミ 系統によって経1JI'I{i、染されると いう判f11も

PCI�をJlJし、た許制11な検討の結占IH�iられたものである。

また， �I'永続{i;搬'1'1ーの ウイルスでÐ U!t�介虫から!とT

PCI�で検1/'，ïlJíìg伝ことが報刊されている。

(:3) プライマープライマーには， あるウイルスの判定の系統にのみ特

�'�I'J':Jなもの， 在r特典的ならの， 彼数のウイルス種に共通

なもの， ウイ/レスMの全体に共通ならの， 科のほとんど

のウイlレスをf9W\Ï 'Jíìgなものがある。i設近になって検討

が進んできた平Ij)IJtl:が山いとJLlわ れる属や科など111M!.ムい

検11:に布川なものについて桁介する。

1) ジェミニウイ/レスSL)LCVのウイ/レスDNAは， gí/l�jは一般的にわ効と

JUわれていたβea11伊Idell 111山;aic uims 1 11来の共通プライマーではj件帆できず， ほとんど{火われていなかったが

BIW川:\ ancl Mλ!山，.\^'(1994)が号案したßMプライマーで)，;り|偏され ることが判lりjした(ÜNI'I、1 ancl H.\�，\1l、1998， 1災1- 1)。 その後， こ の13Mプライマーは， 我がI:tl

でグG�I:.しているほとんどのジェミニウイルスの検1/\に利

川できることがわかった。 純イ七精製が|木I�qfなものが多い

ジェミニウイルスであるが， Bl\jプ ラ イ マ ー に よる

PCI� J'，'I/lvïiiH物 をダイレクトシーケンスするか， その

RL�LPによって， 対象としている のがどのジェミニウ

Ml 2 3 4 56 M

図 I !t辿 プライγ ー (ßiVI プライマー)をJJJt、たPCRに よ る ジ ェミニウイ Jレス(日I'LC\.) の 検:J:Wlj

(O:\lll(l and 11，\:\.\1川199Hより)1\-1: A/Jlincllll， 1�5. 1火山1\.111;K プ ライマー の Jti函プライγ-H Iし(j: 1l�1 プライγ ー

刷物ウイル スの.ìli伝子診断 ‘193

イルスであるかを簡単に判別できる。 この手法によっ

て， 我が国のSPLCVが全く新しいジェミニウイルスで

あることが判明した。

2) ポティウイjレス

ポティウイルス科には植物ウイルスでは披多の数の脱

が女f]られており， その検出および同Æに，1-;ティウイ/レス

共通プライマーを利fIJしたRT-PCRをJlJいることは般

めて有mである。 G[IlBS引1c1 M.\仁川、:

494 植 物 防 疫 第 55 巻 第 1 1 号 ( 2001 年)

で， 後 は機械 がや る と いう 機器 も 開発 さ れ て き て い る の

で， 今後 は効率化が図れ る こ と が期待 さ れ る 。

( 2 ) ハ イ プ リ ダイ ゼ ー シ ョ ン

PCR 産物 の 一部 を マ イ ク ロ プ レ ー ト に吸着 さ せ， プ

ロ ー プ と 反 応 さ せ て ， そ の結 果 を 見 る と いう 方法 も 考案

さ れて お り ， 上 の 染色法 よ り 検出 感度 が高 い場合 も あ る

こ と が報告 さ れ て い る 。 多数の検体の結果 の解析 に は こ

の方法が簡易 で あ る が， 少数検体で は手聞がか か る 。

( 3 ) 蛍光 な ど に よ る 超高感度検出 と 定量

既 に い く つ か の機械 が発売 さ れ て い る が， 特 に 定量性

の 高 い も の は 高価 で あ る 。 こ れ に よ る と ， PCR の 初 め

の時期か ら 増幅産 物 を 検出 で き ， 診断 に か か る 時間 も短

縮 で き る ばか り で な く ， どの株 ・ 部位 な ど に ウ イ ル ス が

よ り 多 い の か も 容易 に 判定 で き る の で， そ の 有用性 は 高

く ， 植物 ウ イ ル ス での利 用 は こ れか ら 進 む と 思わ れ る 。

お わ り に

ジェ ミ ニ ウ イ ル ス お よ び ト ス ポ ウ イ ル ス は ， 近年に な

っ て ， 世界中 で流行 し て大 き な被害 を も た ら し て い る 。

こ れ ら の ウ イ ル ス は純化精製が困難で あ る た め に 抗血清

診断 に は 限界 が あ っ た が， 遺伝子診断の お か げで， そ の

診断 は 確実 に 行 え る よう に な っ て き た 。 ま た ， ほ か の ウ

イ ル ス や ウ イ ロ イ ド に 関 し で も 重複 感染 し た 植物か ら ，

l 組の共通 プ ラ イ マ ー や 多 数 の 個 別 プ ラ イ マ ー を 混合 し

て 用 い た 一度 の PCR 反 応 で 多 数の ウ イ ル ス や ウ イ ロ イ

ドを 検出 す る こ と が既 に 可能 と な っ て い る 。 複 数の ウ イ

ル ス の感染の有無の検定 の た め に複 数の プ ラ イ マ ー セ ッ

ト を 用 い る と き は ， 増幅 さ れ て く る D NA の大 き さ が異

な る よう に プ ラ イ マ ー を 設計 し て お け ば， 電気泳動 に よ

っ て ど の ウ イ ル ス が感染 し て い た か も 判 定 で き る 。 ま

た ， 複 製酵素遺伝 子 な ど の 配列 を 利 用 し た 科 を 超 え る

(Super-Family) ウ イ ル ス の 同時検出 用 の プ ラ イ マ ー の

検討 も 行わ れ る で あろう か ら ， 将来 は わず か な数の プ ラ

日三￡玄ヨヨコ0農薬安全使用基準の一部改正について

農林水産省 は ， 食品衛 生法 に 基づ く 「食品， 添加物等

の規格 基準 (f 残留 農薬基準J ) J に 4 農薬が追加 さ れ た

イ マ ー の み を 用 い る こ と で， 植物 ウ イ ル ス に感染 し て い

る か否か を検定 で き る よう に な る こ と が期待 さ れ る 。 こ

こ で は紹介 し な か っ た が， 特 に 果樹の ウ イ ル ス 様病害の

中 で ウ イ ル ス粒 子 の形態や特性が明 ら か で な い ウ イ ル ス

の場合で も ， PCR の利 用 に よ っ て そ の 診 断 や 特性解明

が急速 に 進 ん で き て い る 。 ま た 遺伝子診断 の 高感度性の

ゆ え に ， こ れ ま での抗血清 を 用 い た 手 法 で は 困難 で あ っ

た媒介生物内 で の ウ イ ル ス の 動 態 の 解明， 伝染環 の 解明

な ど の疫学的調査 な ど に も ， 遺伝子診 断 の 技術 は大 い に

役立 つ で あ ろう 。 上 で紹介 し た よう に 検出 の 自 動化や機

械 化 も 一部で進ん で い る 。 こ の よう な情勢の 中 で， ウ イ

ル ス や ウ イ ロ イ ド の PCR を 用 い た 遺伝子診断技術 の利

用 は ま す ま す 広 が っ て い く も の と 思 わ れ る 。 ま た ，

long- PCR の利 用 に よ っ て ， ポ テ ィ ウ イ ル ス の よう な大

き い ゲ ノ ム を も っ ウ イ ル ス の感染性 ク ロ ー ン の 作出 も 容

易 に 行 え る よう に な っ て き て お り ， 遺伝子 の塩基配列 と

遺伝子の機能や病徴 と の 関連解析 の効率化が進 ん で き て

い る 。 今後 は PCR の ， 特 に 検出 段階 で の 迅速 化 ・ 簡易

化， 簡使 な 定量 法 の 開発， 酵素類の格 段の 低価格 化が，

遺伝子診断の さ ら な る利 用 の た め の 重 要 な 課題 で あ る 。

引 用 文 献]) Blm山ON . R. W. and P. G. MARKIIAM (994) : Mol . Bio.

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こ と か ら ， 新 た に こ れ ら 農薬 につ い て「農薬残留 に関 す

る 安全使用基準j を設定 し ， 平成 1 3 年 10 月 1 日 付 け で

改正 し た 。

ア ゾ キ シ ス ト ロ ビ ン 剤， TPN 剤 (殺菌 剤 ) ， フ ル ア

ジ ホ ッ プ剤， フ ル ア ジ ホ ッ プ P 剤 ( 除草剤)

一一一 4 一一一