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Chemilumineszenz – eine universelle Detektionsmethode in
der HPLC für stickstoffhaltige Substanzen
Dr. Christian Langfermann AMI Arzneimitteluntersuchungsinstitut-Nord GmbH, Bremen, Germany
E-Mail: [email protected]
DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald
Gliederung
• Systemvoraussetzungen • Einsatzzweck • Prinzip der Chemilumineszenz • Eigenschaften • Response-Regeln (Literatur) • Leistungsfähigkeit (Linearität, Präzision,
Selektivität, Richtigkeit) • Beispiele
DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald
Antek 8060 CLND Quant NQAD QT-500
NQAD
CLND
CLND:Chemiluminescence Nitrogen Detector NQAD: Nano Quantity Analyte Detector
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Systemvoraussetzungen
• Gasversorgung – Argon / Helium: 50 ml/min / 4-5 bar – Sauerstoff: 300 ml/min / 4-5 bar
• HPLC – Neues System – Gereinigtes System, wenn stickstoffhaltige Eluenten
(Acetonitril) verwendet wurden • Ersatz des Degassers
– Mobile Phasen: Kein Stickstoff (kein Acetonitril, Ammoniumsalze), flüchtig
• A/D Wandler
DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald
Einsatzzweck
• Quantitative Bestimmung stickstoffhaltiger Substanzen (Wirkstoff/Verunreinigungen) – Keine spezifische Referenzsubstanz – Kein Chromophor erforderlich
• Identitätsnachweis parallel durch
– HPLC/MS (Ionenfalle/TOF), GC/MS – Referenzstandards für qualitative Zwecke
DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald
Prinzip der Chemilumineszenz
• Definition: Emission von Licht im sichtbaren Bereich durch eine chemische Reaktion
• Versprühen des HPLC-Eluenten mit Sauerstoff • Pyrolyse aller Probenbestandteile mit Sauerstoff
bei 1050°C • Quantitative Oxidation der stickstoffhaltigen
Bestandteile zu NO • Oxidation des NO in der Detektorzelle mit Ozon
zu NO2* (angeregter Zustand)
• Emission von Licht bei Rückkehr in den Grundzustand
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Prinzip der Chemilumineszenz
Membrantrockner
Ofen 1050°C Pyrolyse
R-N + O2 ’ NO + H2O +CO2
und andere Oxide
HPLC
Ar, O2 Abfall Reaktor
NO + O3 ’ NO2
* ’ NO2
Ozon- Generator
O3
Photo- multiplier
Vakuum- Pumpe
Daten-Aufnahme
H2O
* : angeregter Zustand
hν
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Eigenschaften des Detektors
VORTEILE – Sehr empfindlich für alle stickstoffhaltigen Substanzen – Auch für flüchtige Substanzen geeignet – Signalhöhe unabhängig von der Zusammensetzung
der mobilen Phase – Gradientenkompatibel – Lineares Signal – Kein Chromophor erforderlich – Kalibration mit anderen stickstoffhaltigen Substanzen
möglich, wenn Referenzsubstanzen nicht verfügbar sind
DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald
Eigenschaften des Detektors
NACHTEILE – Sehr empfindlich für alle stickstoffhaltigen Substanzen – Keine stickstoffhaltigen HPLC-Eluenten (Acetonitril,
Ammoniumsalze…) – Sauberes Arbeiten (Stickstoff ist überall) – Response bei benachbarten Stickstoffatomen im
Molekül nicht equimolar
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Response (Literatur)
• Signal proportional zur Menge an NO • Azogruppen werden nicht detektiert • N-N-Bindungen ergeben ca. ~ 50 % Signal
-N=N- ’ N2
2 -N-N- ’ 2 NO + N2
-N- ’ NO
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Gliederung
• Systemvoraussetzungen • Einsatzzweck • Prinzip der Chemilumineszenz • Eigenschaften • Response-Regeln (Literatur) • Leistungsfähigkeit (Linearität, Präzision,
Selektivität, Richtigkeit) • Beispiele
DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald
Linearität
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
10 15 20 25 30 35
N
NN
N
CH3
O
CH3
CH3O
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
1 2 3 4 5
r = 0,99989
2 4 6 8 1
m V
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
A D C 1 B , A n t e k C L N D ( 2 0 0 1 1 1 0 2 \ C L N D 0 0 0 2 . D )
5.6
21
Coffein
µg/ml N
DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald
Linearität
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
10 15 20 25 30 35
NH2
O
O
N CH3
CH3
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
1 2 3 4 5
r = 0,99990
2 4 6 8 1
m V
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
A D C 1 B , A n t e k C L N D ( 2 0 0 1 1 1 0 2 \ C L N D 0 0 0 8 . D )
7.9
77
Procain
µg/ml N
DPhG Fachgruppensymposium Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik 10.10.2012 Greifswald
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
10 15 20 25 30 35
Linearität
N
NN
N
CH3
O
CH3
CH3O
r = 0,99934
NH2
O
O
N CH3
CH3
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
µg/ml N
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Präzision (Sechsfach-Injektion Procain)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
1 2 3 4
CLND DAD
%
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Langzeitstabilität (Procain)
• ~90 Injektionen in 70 Stunden • Kein Trend • RSD 0,94 %
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 20 40 60 80
Are
a C
LN
D
Injection
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Selektivität
• PDE-5 Hemmer in pflanzlicher Matrix
• Selektiv für stickstoff-haltige Substanzen 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
m A U
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
3 0 0
3 5 0
D A D 1 A , S ig = 2 1 0 ,1 0 R e f = 4 5 0 ,1 0 0 ( 3 1 0 1 1 1 0 1 \C L N D 0 0 1 6 .D )
3.9
97 4
.573
9.3
04
10.
315
12.
326
14.
098
14.
699
5 1 0 1 5 2 0 2 5
m V
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
A D C 1 B , A n te k C L N D (3 1 0 1 1 1 0 1 \C L N D 0 0 1 6 .D ) 4
.963
15.
129 CLND
DAD
Hydroxyhomo-sildenafil
Hydroxyhomo-thiosildenafil
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Sensitivität
• 20 ng Coffein on column (entspricht 6 ng Stickstoff) • S/N-Verhältnis 40
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min0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
mV
22.9
22.95
23
23.05
23.1
23.15
23.2
23.25
23.3
ADC1 B, CLND (270812OQ\CLND0007.D)
Are
a: 1
.977
1
0.2
61
Richtigkeit– Kalibration mit Procain Substanzen mit isoliertem Stickstoff
Br
Br
NH2
NH
OH
Ambroxol: 101,4 %
N
NN
N
CH3
O
CH3
CH3O
Coffein: 98,5 %
CH3
NH OH
OH
OH
Dobutamin: 94,4 %
NH
OH
CH3
CH3
Ephedrin: 103,3 %
NH
O
O
CH3CH3
O
OCH3
Cl
Cl
CH3
Felodipin: 94,0 %
N N
O CH3
Fentanyl: 94,0 %
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Richtigkeit– Kalibration mit Procain Substanzen mit isoliertem Stickstoff
Paroxetin: 98,8 % Sertralin: 100,3 % Yohimbin: 98,5 %
Physostigmin: 103,3 % Tadalafil: 94,2 %
O
O
O
NH
F
NH
CH3
Cl
Cl
NH
N
OH
O
O
CH3
N
NONH
O
CH3
CH3
CH3
CH3
NH
N
N
O
O
O
OCH3
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Richtigkeit– Kalibration mit Procain Substanzen mit benachbartem Stickstoff
Phenylbutazon: 93,7 % Theoretisch: 50 %
Phenazon: 87,9 % Theoretisch : 50 %
Candesartancilexetil: 48,8 % Theoretisch : 66,6 %
Sildenafil: 91,6 % Theoretisch : 83,3 %
N N
O O
CH3
NNCH3
CH3
O
N
N
O O
OCH3
OO
O
CH3
NNH
NN
O
CH3
S O
O
NNCH3
NH
N
N
N
O CH3
CH3
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Flunitrazepam
min5 10 15 20 25
mV
20
40
60
80
100
120
140
ADC1 B, CLND (28101102\IDEN0002.D)
15.
222
min5 10 15 20 25
mV
20
40
60
80
100
120
140
160
ADC1 B, CLND (28101102\IDEN0003.D)
15.
181
Kalibrierung mit Nitrazepam
Flunitrazepam
N
N
CH3 O
F
N+O
-
O
N
N
CH3 O
N+O
-
O
• Abgleich Flunitrazepam/Nitrazepam:100,1 % • Flunitrazepam Tabletten: 0,990 mg/Tabl.
(99,0 % der Dekl.)
Flunitrazepam
-12 -10
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
1 2 3 4 5 6 7 8
Residuen
0 200 400 600 800
1000 1200 1400 1600 1800 2000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200
Mes
swer
te
Konz. [mg/ml]
Kalibration
Kalibration Proben Kal.-Gerade
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Telmisartan
2 4 6 8 1 0 1 2
m V
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
A D C 1 A , C L N D ( 0 6 0 3 1 2 0 2 \ G E H A L T 0 8 . D )
2.1
05
2 4 6 8 1 0 1 2
m V
2 4
2 6
2 8
3 0
3 2
3 4
3 6
A D C 1 A , C L N D ( 0 7 0 3 1 2 0 1 \ G E H A L T 1 9 . D )
1.7
15
8.8
97
Kalibrierung mit Coffein
Hydrochloro-thiazid Telmi-
sartan
N
NN
N
O
CH3
O
CH3
CH3
O
OH
NN
N
N
CH3 CH3
CH3
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Telmisartan
0
50
100
150
200
0,000 0,020 0,040 0,060
Mes
swer
te
Konz. [mg/ml]
Kalibration
Kalibration Proben Kal.-Gerade -2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4 5 6 7 8
Residuen
O
OH
NN
N
N
CH3 CH3
CH3
NN
CH3
O OH
O
OH
S
Telmisartan Tabletten: 91,6 % der Deklaration Wiederfindung Eprosartan: 99,6 %
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Eprosartan Telmisartan
JWH 250 / JWH 122
N
O
CH3
O
CH3
JWH-250 0,326 mg/g
N
O
CH3
CH3
JWH-122 0,103 mg/g
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min0 5 10 15 20 25 30 35
mV
20
40
60
80
100
ADC1 B, CLND (CANNA2\GEHALT01.D)
25.
392
26.
508
JWH-250/JWH-122
Wiederfindung JWH-018 99,7 %
N
CH3
O
min1 2 3 4 5 6 7
mV
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
ADC1 B, CLND (CANNA\GEHALT17.D)
3
.7
79
Kalibrierung mit Procain
JWH-250
JWH-122
NH2
ON CH3
CH3O
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Zusammenfassung
• Lineares Signal • Sehr gute Präzision • Robust und stabil • Selektiv für stickstoffhaltige Substanzen • Equimolar für Analyten ohne benachbarte
Stickstoff-Atome • Nicht equimolar für N-N-haltige Verbindungen,
kein einheitlicher Umrechnungsfaktor - Einsatz von ähnlichen Referenzsubstanzen
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