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Université Libre de Bruxelles

Ecole Interfacultaire de Bioingénieurs

Année académique 2010-2011

CHIM-F317 : Compléments de chimie analytique

Méthode de dosage des protéines dans le lait et autres

produits alimentaires

Baudoux Lewis

Marotte Milan

Polak Nicolas

Tarelkin Yegor

Van Leeckwyck Robin


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Introduction

Après la première manipulation, qui consistait en un dosage complexométrique du fer(III), la

deuxième manipulation était un peu plus inhabituelle. Une liste de manipulations possibles nous

était présentée, et chaque groupe d’étudiants devait choisir parmi cette liste celle qu’il désiraiteffectuer. Nous avons donc opté pour un dosage de protéines dans plusieurs produits laitiers.

Comme aucun mode opératoire nous était fourni, la première partie de cette deuxième manipulation

fut la recherche du mode opératoire. Après quelques consultations sur le net, notre choix se porta

sur la méthode de Kjeldahl. Les assistants approuvèrent la méthode, et le dispositif requis pour la

manipulation fut mis en place.

Le dosage des protéines par cette méthode se fait en une série d’étapes. Tout d’abord, une certaine

masse de la substance dont on veut connaître le contenu en protéines est pesée et chauffée en

présence d’acide sulfurique et du sulfate de potassium. Ensuite, l’ajout progressif d’une base forte

fait virer le pH, et l’ammonium sous phase gazeuse qui s’échappe de la solution est refroidi et

récupéré sous phase liquide dans une solution d’acide borique qui sera titré. A l’aide de tableaux de

conversion, il est possible de connaître la quantité initiale en protéines.

Cependant, cette méthode connaît quelques inconvénients. La manipulation requiert une certaine

habitude avant d’obtenir des rendements de récupération d’ammonium élevés. De plus, le montage

du dispositif dans lequel a lieu la distillation est conséquent et donc peu maniable. Enfin, cette

méthode nécessite des acides forts et des bases fortes, ainsi que des températures élevées, ce qui

n’est pas sans risque.

Matériel et méthode

Plusieurs méthodes existent pour doser les protéines au sein d'un échantillon mais la méthode

utilisée au laboratoire sera celle de Kjeldahl (1). Il faut savoir que les protéines sont composées

d'acides aminés et que ces acides aminés sont eux-mêmes composés d'atomes. Ces atomes sont

surtout du carbone, de l'oxygène, de l'hydrogène et de l'azote (il y en a d'autres mais en plus petites

proportions). On peut définir la proportion de chaque atome au sein de chaque acide aminé et la

proportion de chaque acide aminé au sein d'une certaine protéine. De cette manière, en connaissant

le type de protéine présente dans le lait (ou autre produit organique), la proportion de tel ou telatome sera connue dans l'ensemble des protéines. Par souci de facilité, l'atome qui sera dosé dans

cette méthode est l'azote. Elle va être précisément décrite par la suite ce qui permettra d'énoncer

plus clairement le matériel adéquat. Cette méthode peut se diviser en trois parties : une première de

minéralisation, une seconde de distillation et enfin une troisième de dosage, par titrage, de la

solution.

1° Minéralisation de l'azote organique

Cette partie permet de transformer l'azote organique en azote minéral. A l'aide d'une pipette, une

certaine quantité de lait (ou autre produit organique) sera prélevée et ajoutée dans un ballon de

distillation (voir figure 1). On y ajoute ensuite 25ml d'acide sulfurique à haute concentration (H2SO4


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,18M). La réaction sera de transformer l'azote sous forme amine (NH2) en azote sous forme

d'ammonium (NH4+) car le milieu est fortement acide. Le milieu acide permet à l'azote de rester sous

forme d'ammonium (donc soluble) et non sous forme ammoniaque (NH3), qui s'échapperait sous

forme de gaz hors du ballon. A cette solution sera ajouté du sulfate de potassium (K2SO4). Ce réactif

permet une élévation de température conséquente durant la phase de chauffage. La proportion de

sulfate de potassium à ajouter est d'un gramme par ml d'acide sulfurique. Cette solution est ensuite

chauffée (entre une heure et demi et deux heures) par un bec bunzen pour permettre à tout l'azote

de se minéraliser. Il faudra veiller à ce que la solution reste bien liquide pendant le chauffage car

certains échantillons (comme le pâté) sont fort secs, l'azote minéralisé colle au paroi et le rendement

est alors moins bon. La solution, noire, deviendra plus translucide (tout en gardant cette coloration

noire-brune).

Figure 1 : Ballon de distillation (2)

2° Distillation

Une fois tout l'azote minéralisé, le ballon de distillation est ajouté au montage de distillation. Le

principe est alors bien simple. Une photo aurait du être ajoutée au rapport mais un incident nous

obligea à ranger le matériel plus tôt que prévu sans avoir pu faire de photos. La figure 2 illustre le

montage permettant la distillation. Il faut dans un premier temps veiller à ce que le montage soit

étanche pour optimiser le rendement (le gaz produit ne doit pas s'échapper). Du côté gauche, un

ballon rempli d'eau sera maintenu en ébullition pendant toute l'opération. L'eau évaporée pousseraalors le gaz formé dans le ballon du milieu vers le côté droit et non vers le haut de la colonne

centrale. Encore une fois, cela permet de récolter tout l'azote libéré sous forme d'ammoniaque.


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Figure 2 : Montage de distillation (3)

Au centre se trouve le ballon dans lequel se trouve l'azote minéralisé. Tout en haut de cette colonne

centrale, nous pouvons observer un réservoir contenant de l'hydroxyde de sodium (NaOH) fortconcentré (dilué à 50%, donc 500g par litre d'eau). Une fois l'eau entré en ébullition, ce petit

réservoir peut être ouvert au goutte à goutte. Le NaOH tombe alors dans la solution d'acide

sulfurique. Le pH de cette solution va peu à peu augmenter. Cette augmentation de pH permet la

transformation du NH4+ en NH3 gazeux qui va se diriger vers la droite du montage. On ajoute la NaOH

goutte à goutte car la réaction acide fort - base forte est fort réactive. Il faut le rajouter en excès pour

être sûr de transformer tout l'ammonium en ammoniaque. Une précaution devra être prise. En effet,

il faut veiller à laisser un fond de NaOH dans le réservoir car si celui-ci se vide, le montage n'est plus

étanche et le NH3 peut s'échapper par ce petit trou.

A droite du montage se trouve un erlenmeyer contenant une solution d'acide borique à 4% (donc40g par litre d'eau). Cet acide est donc présent en excès. Le conduit menant le gaz dans l'erlenmeyer

est à double paroi, de l'eau passant entre la première et la deuxième paroi pour refroidir le gaz dans

ce conduit et donc permettre sa condensation. L'erlenmeyer ne contient que 50ml de cette solution

ainsi que quelque gouttes d'indicateur coloré (judicieusement choisi en fonction de sa zone de

virage). Le tube conduisant le NH3 plonge dans cet erlenmeyer et une réaction se passe :

NH3 + H3BO3 --> NH4+ + H2BO3

-

Le bout doit bien plonger dans la solution sous peine de perdre du NH3 dans l'air ambiant. Cette

équation permet de lier le nombre de moles d'ammoniaque au nombre de moles d'acide borique.

Petit à petit, l'indicateur coloré va virer vers une autre couleur. Le pouvoir tampon de l'acide borique

n'est pas très fort.

3° Titrage

Une fois la distillation terminée, un titrage est fait au chlorure d'hydrogène (HCl, 0,1M). On ajoute

alors un certain volume de cette solution. Ce volume correspond au volume d'acide nécessaire pour

que la solution reprenne sa couleur initiale.


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Par calcul stoechiométrique, on peut dire que le nombre de moles ajouté pour que la solution

reprenne sa coloration initiale est égal au nombre de moles de NH 3 piégé dans cette solution. Ce

nombre de moles de NH3 étant lui-même égal au nombre de moles de NH 2 présent dans la solution

initiale.

Le matériel requis est donc le suivant :

pipette

erlenmeyer

matras

montage de distillation

bec bunzen

burette

balance

Résultats

Une première manipulation a été faite avec de l'urée (CO(NH2)2) afin de nous habituer à cette

méthode (qui peut s'avérer dangereuse). La quantité d'urée prélevée est de 15ml provenant d'une

solution où 4g d'urée a été diluée dans un litre d'eau. La masse molaire de l'urée est de

60,0553g/mol. En utilisant les formules : n(mole)=m(kg)/M(g/mol), on obtient un nombre de moles

d'urée de 0,00199 moles. Le volume d'HCl (0,1M) nécessaire pour le titrage est de 22,9ml ce qui, par

la formule C(mol/L)=n(mole)/V(L), donne un nombre de mole de NH3 équivalent à 0,00229mole. On

sait que deux moles de NH3 proviennent d'une mole d'urée. On obtient donc, d'après notre méthode,que le nombre initial de moles d'urée est de (0,00229/2)=0,001145moles.

En comparant les deux résultats, nous obtenons un rendement de 57,54% (0,001145/0,00199), ce

qui n'est vraiment pas mauvais pour une première expérimentation. Il est à noter que l'urée est bien

plus facile à décomposer en NH4+ que d'extraire l'azote contenu dans les protéines de produits

alimentaires.

Des analyses ont ensuite été faites sur du lait normal et du lait de soja. Leur contenu en protéines est

respectivement de 33g par litre et de 30g par litre.

Produit Quantité

prélevée (ml)

Volume titrant

(ml)

Facteur de

conversion

Quantité de

protéine (g/L)

Rendement

(%)

Lait 10 6,4 6,38 5,7 17,7

Lait 10 12,9 6,38 11,5 34,8

Lait de soja 10 12,6 6,25 11,0 36,66

Lait de soja 10 13,8 6,25 12,1 40,3

Pour obtenir le nombre de moles de NH3 titré, nous utilisons la même formule que précédemment,

en multipliant le volume par la concentration d'HCl (0,1M). Pour obtenir la quantité d'azote contenuinitialement, on multiplie le nombre de moles par la masse molaire (qui est de 14g/mol). Ceci nous


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donne la quantité d'azote dans l'échantillon initiale. On multiplie cette valeur par 100 pour obtenir la

quantité d'azote dans un litre de lait et non 10ml.

Des moyennes ont été faites et il s'avère que la quantité d'azote au sein d'une protéine avoisine les

16% (d'où le facteur 6,25, inverse de 16%). (4)

Conclusion

Après plusieurs expériences, force est de constater que les rendements de nos expériences sont très

médiocres. En effet, il suffit de comparer le rendement d'extraction de l'urée à celui d'extraction des

produits alimentaires pour s'apercevoir que les rendements sont plus faibles. Il est donc important

de préciser qu’il n’est pas aisé d’extraire l’azote contenu dans les protéines de produits alimentaires.

La partie de la méthode qui n'est pas entièrement sous notre contrôle est celle de minéralisation. Il

n'est pas facile de voir si tout l'azote a été minéralisé. Malgré ces faibles rendements, il est à noter

qu'au fur et à mesure de l'avancée des expériences, nos rendements sont croissants. Certes, le

dernier rendement obtenu (de 40%) n'est pas un grand rendement, mais cela signifie que la

manipulation est de mieux en mieux maîtrisée par les étudiants. Il est donc certain que si un

malheureux accident n'avait pas interrompu notre manipulation, un rendement supérieur à 50%

n'aurait pas été impossible.

Il semble aussi important de signaler que cette méthode n'est pas la seule pour quantifier les

protéines au sein d'un échantillon. Car sans l'étiquette nous disant la réelle quantité de protéine, il

nous aurait été impossible de connaître le rendement de nos manipulations. En laboratoire, les

scientifiques doivent veiller à ce que chacune des trois étapes soit la plus optimale possible. Uneminéralisation complète doit être faite. Le montage de distillation doit être parfaitement étanche et

tout le NH4+ contenu dans le ballon doit être transformé en NH 3 gazeux. Le titrage doit être des plus

précis possible. Une dernière chose est importante. Le facteur qui permet de convertir la quantité

d'azote à la quantité de protéine n'est qu'une approximation. L'idéal aurait été de qualifier chaque

protéine au sein de l'échantillon, de les quantifier et ainsi obtenir une quantité de protéinique la plus

proche de la réalité.

Néanmoins, cette expérience nous a permis de travailler presqu’entièrement par nous-mêmes. Une

seule question était posée, à nous d'y répondre en trouvant un protocole d'expérience et de

l'appliquer. La méthode de Kjeldahl nous est maintenant familière et le travail de chercheur a déjàmoins de secrets pour nous.

Discussion

Les sources d’erreurs potentielles étaient nombreuses et diverses. Le montage de distillation était

très difficile à manipuler et pouvait causer beaucoup de fuites ce qui faussait tout à fait notre

mesure. Il nous est aussi arrivé de vider le contenu de NaOH dans le ballon créant ainsi un trou par

lequel le NH3 pouvait s'échapper. Un peu en aval de l’expérience, on a vu également que tout NH4+

n’était pas transformé facilement en NH3 et qu’il fallait chauffer le mélange réactionnel tout en

prenant le risque que le récipient explose.


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L'accident, même si peu intéressant au niveau de ce rapport, nous a appris qu'il fallait être très

prudent vis-à-vis des manipulations faites en laboratoire. Le débit d'eau a été augmenté au sein du

tuyau de refroidissement, il s'est donc détaché du montage et a aspergé le ballon contenant l'acide

sulfurique. Pour éviter de salir notre table de travail, l'un de nous a essayé de récupérer ce tuyau.

Malheureusement, le contact entre l'eau froide et le ballon chaud a créé un choc thermique. Le

ballon s'est brisé et une partie de son contenu s’est répandu sur la main de l'étudiant, causant de

graves brûlures. Cet accident aurait pu être évité mais il semble que le ballon de distillation ait été

fragilisé lors d'une manipulation précédente. Nous ne savions pas que même si le ballon ne

présentait aucune marque d'usure, il fallait le jeter.

Bibliographie

(1) http://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9thode_de_Kjeldahl

(2) http://www.verrerie-laboratoire.com/Ballons_Kjeldahl.asp

(2) http://witraze-katani.com/kjeldahl-distillation-assembly&page=6

(4) Mariotti F, Tomé D, Mirand PP. Converting nitrogen into protein--beyond 6.25 and Jones’ factors.

Crit Rev Food Sci Nutr. 2008, 48, 177-84.

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