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CITOGENETICA MOLECULAR
• Blgo. Luís Carlos Lizárraga Vargas
Limitaciones de la Citogenética Convencional :
Alternativa : Citogenética Molecular
1. FISH (Hibridación in situ con fluorescencia)• Requiere saber lo que se busca• Tener la sonda adecuada
2. Otras técnicas:• Requieren equipos muy sofisticados y apoyo
informático SKY (Cariotipo espectral multicolor, multifish) CGH (Hibridación Genómica Comparada)
• Requiere metafases• No siempre la calidad de las metafases es optima• Resolución limitada (en el mejor de los casos 2-5 Mb
)
Estrategias
Estas estrategias diagnósticas pueden ser resumidas en:
A. Hibridación ( Southern blots,, hibridación “in situ”,etc.).
B. Amplificación de material genético del organismo patógeno (PCR, LCR, etc.)
Ensayos de Hibridación
De Ácidos Nucleicos.
• Southern blot.• Hibridación in situ (FISH)• Microarray
Hibridación de
ácidos nucleicos
Hibridación molecular: Desnaturalización y Renaturalización.
Desnaturalización: la doble hélice de ADN se disocia en dos hebras separadas (por calor o pH ≥ 13)
Renaturalización o hibridación molecular: reconstitución de la doble cadena de acuerdo al principio de complementariedad de bases nitrogenadas. Las cadenas complementarias se mantienen unidas por puentes de hidrógeno → interacciones débiles: las afecta el pH, Tº, concentración salina.
Dos características importantes de estas técnicas :
Especificidad de la reacción dada por la complementariedad de la sonda.
La sonda puede encontrar la secuencia complementaria en una mezcla de millones de moléculas relacionadas pero no complementarias
TÉCNICA CITOGENETICA MOLECULARES
FISH
Hibridación in situ con fluorescencia (FISH)
La técnica de hibridación in situ está basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleídos para hibridizarse entre sí.
La técnica de FISH permite la detección y localización de secuencias específicas de ADN sobre cromosomas, células o tejidos
Metafase- FISH Interfase-FISH
FISH de metafaseLa FISH se usa sobre células en metafase
para detectar microdeleciones específicas más allá de la capacidad de resolución de la citogenética de rutina.
Síndromes de microdeleción actualmente diagnosticables mediante FISH
Síndrome del maullido (cri-du-chat) Síndrome de KallmanSíndrome de Miller-Dieker Síndrome de Williams
Se ha hibridado con una sonda "de pintado" para el cromosoma 4. Uno de los cromosomas 4 de este paciente era anormal, pero era difícil determinar con la citogenética de rutina si tenía una pequeña deleción terminal en 4q o si era el resultado de una reordenación más compleja. Puesto que ambos cromosomas 4 son fluorescentes en toda su longitud y no hay material fluorescente en ningún otro cromosoma,
esto sugiere que la anomalía es una deleción terminal pequeña. La metafase siguiente es del mismo paciente y confirma este diagnóstico.
Esta metafase se ha hibridado con una sonda diseñada para la parte terminal del cromosoma 4q. Puesto que sólo hay una señal verde, se confirma que en uno de los cromosomas 4 falta material del extremo terminal del brazo q. Este caso es un buen ejemplo de cómo la citogenética de rutina y la FISH pueden usarse conjuntamente para diagnosticar con exactitud anomalías cromosómicas sutiles
FISH de interfase
La FISH se puede usar sobre células en interfase para determinar el número de copias de uno o varios cromosomas.
La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede realizar muy rápidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las células.
PRUEBA DE ANEUPLOIDÍA
- Núcleos en interfase procedentes de células de fluido amniótico
-Sondas de DNA diseñadas para los cromosomas 13, 21
El núcleo de la izquierda se ha hibridado con sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo).
El núcleo de la derecha se ha hibridado con sondas para los cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo).
RESULTADO ?
MUESTRA A UTILIZAR
Muestras de citogenética: núcleos desnudos Improntas
Tejido parafinadoTejido fresco
1- Sondas de Ácidos Nucleicos.
Sondas de AN: son fragmentos de ADNsc puros y homogéneos que permiten detectar una determinada secuencia blanco en una muestra, mediante su complementariedad de bases.
Marcadas radioctivamenteMarcadas no radioctivamente ( Digoxigenina)
MARCAJE Y DETECCIÓN
• Preparación de la sonda. Una sonda es un segmento de ADN marcado con biotina o fluoresceína , que es complementario a la secuencia de ADN
La FISH utiliza tres tipos de sonda:
Sondas específicas de un locus:para la detección de translocaciones, deleciones o
amplificaciones
– sondas de fusión– sondas split
Sondas alfoides o centroméricas:
para la detección de alteraciones numéricas con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el número correcto de cromosomas o si tiene un cromosoma extra
Sondas para cromosomas completos:
son colecciones de sondas de un tamaño reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma.
SONDAS CENTROMÉRICAS (CEP)
SONDAS DE LOCUS ESPECÍFICO (LSI)
SONDAS PAINTING (WCP)
SONDA TELOMÉRICA (TEL)
TIPOS DE SONDAS
Centromérico
Locus específico
Pintado cromosómico
TIPOS DE SONDAS
FISH CONVENCIONAL
Sondas “Dual-fusion”Patrón normal
Núcleo en interfase
Cromosomas en metafase
Sondas “Dual-fusion”Translocación recíproca
Núcleo en interfase
Cromosomas en metafase
Sondas “Break-appart”Patrón normal
Núcleo en interfase
Cromosomas en metafase
Sondas “Break-appart”Translocación recíproca
Núcleo en interfase
Cromosomas en metafase
Detección de Trisomía y Determinación del sexo
Sondas para cromosomas 13,18,21,X,Y.
APLICACIONES
46,XYDeterminación de probable cariotipo.
Verde = X
Rojo = Y
APLICACIONES
X- e Y-sondas centroméricas
Oncología
Sondas de locus únicos( deleción o amplificación)
P58 CLK-1 Locus (1p36). D7S486 (7q31). Retinoblastoma (13q14). P53 (17p13.1). Her-2/ neu (17q11.2-q12).
APLICACIONES
No Amplificado
AmplificadoFISH / HER 2
Oncología
bcr/abl translocación t(9;22)(q34;q11.2). IGH/CCND1 translocación t(11;14)
(q13;q32). PML/RARA translocación t(15;17)
(q22;q21.1). TEL/AML1 translocación t(12;21)(p13;q22).
APLICACIONES
FISH normal FISH ABL/BCR
ABL 9q34 ABL 9q34
BCR 22q11
BCR 22q11
Fusión ABL/BCR
LMC – SONDA DE FUSIÓN t9;22(q34;q11)
Normal Translocación en Bcl2
Bcl 2Bcl 2Split
Break appart - Translocaciones
Translocación en Bcl2
protooncogén Bcl-2 (B-cell lymphoma 2),
FISHVentajas:
Puede ser aplicada a células en células en división como en no división.
La técnica es confiable. (sensibilidad ↑ y especificidad ↑)
Desventajas:
No puede detectar pequeñas mutaciones. Omite Inversiones. Sondas no están comercialmente disponibles
para todos las regiones cromosómicas.
Cariotipación espectral ( SKY)
SKYVentajas:• Mapeo de puntos de quiebre cromosómicos.• Detección de translocaciones sutiles.• Caracterización de rearreglos complejos.
Desventajas:• Equipos muy costosos.• La técnica es laboriosa.• Específico, pero no como método de screening.
Hibridación Genómica comparativa ( CGH)
CGH
Ventajas: Requiere sólo DNA genómico tumoral. Puede ser aplicado a tejidos frescos o
congelados, Detección de pérdidas y ganancias
genómicas por hibridación competitiva de ADN tumoral y normal de referencia
Desventajas:
• no detecta inversiones
CITOGENÉTICA• Requiere células en división• Requiere tejido fresco• Permite detectar alteracionesde todo el genoma• Bajo coste económico
FISH• No requiere células en división• Permite estudiar material parafinado • Solo aporta información de la sonda que se utiliza• Moderado coste económico
CITOGENÉTICA CONVENCIONAL vs FISH
Beneficios médicos tras el conocimiento de la estructura de cada gen humano
1. Diagnóstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad
2. Marco de trabajo para el desarrollo de nuevas terapias, además de nuevas estrategias para la terapia génica
16 de Febrero de 2001Celera Genomics
15 de Febrero de 2001Consorcio público internacional
Proyecto genoma humanoLa secuencia del genoma es un atajo valioso: ayuda a los científicos a encontrar los genes más fácil y rápidamentey sienta las bases para averiguar la función de los genes identificados
Gracias por su atención
Se deshidrata los portaobjetos sumergiéndolos en una serie de soluciones con etanol 70% 80% y 95% durante 2 min T º ambiente
El DNA cromosómico se desnaturaliza sumergiendo las laminas en solución formamida al 70% en2 SSC (citrato de sodio salino como amortiguación) a 72ºC durante 2 minutos
Para parar la reacción se sumerge las laminas en una serie de soluciones con etanol 70% 80% y 95% durante 2 min T º-20ºC
1º Fase DESNATURALIZACION DEL
DNA CROMOSOMICO
LA sonda debe de estar incubada por 2 horas y desnaturalizada trascurrido ese tiempo se coloca la sonda sobre la superficie del portaobjeto.
Se coloca un cubreobjeto de vidrio y se sella.
La hibridación se realiza en una cámara húmeda introducida en una estufa a 37 ºC en oscuridad durante 72 horas.
2° Fase HIBRIDACION
Tras la hibridación, se examina el portaobjetos al microscopio con luz
fluorescente. Las señales fluorescentes indican la presencia de ADN cromosómico complementario, la ausencia de tales señales implica
que no hay ADN cromosómico complementario.
3° Fase DETECCCION DE LA SEÑAL DE HIBRIDACION
Síndrome Di George/VCF
22q11.2 TUPLE 1Orange
22q13 ARSAGreen
Normal Deletado
Síndrome Prader Willi/Angelman
Síndrome Miller-Dieker
15p11.2 Green15q11-q13 Orange
15q22 Orange
17p13.3 Orange
17q21.1 Green
Normal Deletado
TÉCNICAS: CG, SB, PCR vs FISH
CITOGENÉTICA
FISH
Requiere células en división Requiere tejido fresco Permite detectar alteracionesde todo el genoma Bajo coste económico
No requiere células en división Permite estudiar material parafinado o congelado Solo aporta información de la sonda que se utilizaModerado coste económico
COMPARATIVA: Citogenetica vs FISH
COMPARATIVA: FISH vs PCR
FISH PCRMayor especificidad: menos falsos negativos y menos falsos positivosRequiere un número mínimo de célulasRequiere un microscopio de fluorescencia
Elevada incidencia de falsosnegativos: puntos de rotura variables Elevada sensibilidad: falsos positivos
COMPARATIVA: CISH vs FISH
CISH FISHNo requiere microscopio de fluorescenciaMayor estabilidad de la sondaEl patólogo está más habituadoMayor tiempo de procesadoVisualiza 1-2 colores
Requiere microscopio de fluorescenciaHasta el momento, poca experiencia del patólogoPermite trabajar con 2-4 sondas de distinto colorMenor tiempo de procesadoMayor sensibilidad
CRITERIOS DE VALORACIÓN
Valorar la FISH en la zona tumoral
Analizar 500 núcleos para sondas centroméricas y 200 núcleos para sondas específicas de locus
Nunca valorar células solapadas
Establecer en una primera etapa los niveles de corte de cada sonda a partir de muestras control
Cariotipo Espectral Multicolor (SKY)
• Hibridación in situ con sondas específicas de cada cromosoma (El aparato es capaz de diferenciar 24 colores).
• Identificación unívoca del material cromosómico reordenado en translocaciones y marcadores complejos
Caso 3226 Bandeo GTG Cariotipo 47,XX,+marMultiple FISH Cariotipo 47,XX,+der(22q)
Caso 7947 (Hospital Clínico Universidad de Chile)Cariotipo parcial con multiple BAND cromosoma 2 : del(2)(q31q33),r(2)(q31q33),cromosoma 2 normal e ideograma del cromosoma 2.
SKY o M-FISH(cariotipo espectral o
multicolor FISH)
CROSS SPECIES COLOR BANDING: RxFISH
Hibridación Genómica Comparada (CGH)
• Detección de pérdidas y ganancias genómicas por hibridación competitiva de ADN tumoral y normal de referencia
MULTICOLOR BANDING FISH
Secuenciación de ADN
ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCCAGTGACTTTGTCCAAC GTCCAACAGTTACCAAGTGACTTTGTCCAC TTTTGCCCAGTGACTTTGTCCA ACGGCCTAAGCGTTTTTTTT
ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIÓN DEL CROMOSOMA
Secuenciación de genomas
Secuenciación automática
• Detección de mutacionesMétodo de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)
• Secuenciación de ADNs fósiles Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría están dañadas o degradadas)
• Diagnóstico de enfermedades genéticasDiagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos defecundación in vitro
• Identificación de especies y control de cruces entre animales Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro
• Secuenciación de genomas Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)
Aplicaciones de la secuenciación de ADN
UTILIDADEsta técnica es especialmente útil para
mapear genes o localizar anormalidades cromosómicas
Es muy importante destacar que no es una técnica de búsqueda de nuevas alteraciones cromosómicas, sino que detecta únicamente aquello que buscamos. El resto del genoma permanece oculto.
Esta técnica complementa perfectamente a la citogenética convencional en todas aquellas situaciones en las que no ha sido posible realizar un cariotipo.
Al disponer de metafases de poca calidad, o no haber obtenido metafases, o bien en los casos en los que las alteraciones cromosómicas asociadas a un diagnóstico son crípticas no visibles a la resolución del microscopio óptico