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Come studiamo le celluleCome studiamo le cellule
�� Osserviamo le cellule al microscopio per Osserviamo le cellule al microscopio per
ricavarne delle informazioni morfologichericavarne delle informazioni morfologiche
(e non solo)(e non solo)
Microscopi dirittiMicroscopi diritti
Microscopio rovesciatoMicroscopio rovesciato
•A luce trasmessa in campo chiaro
•A contrasto di fase o a contrasto
interferenziale
•A fluorescenza
Microscopia
Microscopia in campo chiaroMicroscopia in campo chiarocellule non colorate (IgrOv fissate in cellule non colorate (IgrOv fissate in
paraformaldeide)paraformaldeide)
HL60HL60
Microscopia in campo chiaroMicroscopia in campo chiarocellule SaOs colorate (cellule adese)cellule SaOs colorate (cellule adese)
Microscopia in campo chiaroMicroscopia in campo chiarocellule Jurkat coloratecellule Jurkat colorate
Contrasto di fase e contrasto Contrasto di fase e contrasto
interferenzialeinterferenziale
Rat-1 fibroblasti di ratto 20 X
Cos-7 fibroblasti di rene di scimmia trasfettati con SV40
Si basa sul fenomeno dell'Si basa sul fenomeno dell'interferenzainterferenza luminosa.luminosa.
Il preparato viene illuminato da un fascio Il preparato viene illuminato da un fascio
luminoso suddiviso a livello del condensatore in luminoso suddiviso a livello del condensatore in
due porzioni di fase differente e con diverso due porzioni di fase differente e con diverso
angolo di incidenza. angolo di incidenza.
Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla
porzione di luce che attraversa il campione, porzione di luce che attraversa il campione,
andandosi a ricombinare con la luce non andandosi a ricombinare con la luce non rifrattarifratta
renderrenderàà visibili componenti trasparenti ma di visibili componenti trasparenti ma di
indice di rifrazione differente da quello del indice di rifrazione differente da quello del
mezzo. mezzo.
Microscopio a contrasto di faseMicroscopio a contrasto di fase
In campo biologico, la maggior parte dei In campo biologico, la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua.di acqua.
Tuttavia le radiazioni luminose una volta Tuttavia le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un oltrepassata una componente o un organelloorganellocellulare, subisconocellulare, subiscono dei cambiamenti di fase dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassataoltrepassata. .
�� Tramite la microscopia a contrasto di fase si Tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione reali di quella che è l'organizzazione cellulare. cellulare.
�� La tecnica in questione fu messa a punto dal La tecnica in questione fu messa a punto dal fisico olandese fisico olandese FrederikFrederik ZernikeZernike ((FritsFritsZernikeZernike) negli) negli anni cinquantaanni cinquanta e gli valse e gli valse ilil Premio NobelPremio Nobel per laper la fisicafisica nelnel 19531953..
Microscopia a fluorescenzaMicroscopia a fluorescenza
Cos-7 Cellule trasformate di rene di scimmia.
Immagine a falsi colori
DNA rosso mitocondri blu F-actina verde
Microscopia di fluorescenza Immagine a falsi coloriNetwork di microtubuli rosso F-actina verdeDNA blu
Cos-7 Cellule trasformatedi rene di scimmia.
Cos-7 Cellule trasformatedi rene di scimmia.
Microscopia di fluorescenza Immagine a falsi colorimitocondri giallo F-actina rossoDNA verde
Perche’Perche’ nella microscopia a nella microscopia a
fluorescenza si vedono fluorescenza si vedono cosi’cosi’ tanti tanti
dettagli?dettagli?
Ogni molecola fluorescente emetteOgni molecola fluorescente emette
luce, se opportunamente eccitata. E’ come se luce, se opportunamente eccitata. E’ come se
legassimo delle lampadine alle strutturelegassimo delle lampadine alle strutture
che vogliamo evidenziare che vogliamo evidenziare
CosCos--7 marcate per7 marcate per
evidenziare i mitocondrievidenziare i mitocondri
in fluorescenza in fluorescenza
SaosSaos marcate per evidenziare i mitocondrimarcate per evidenziare i mitocondri
in microscopia a campo chiaroin microscopia a campo chiaro
Limite di risoluzione del microscopioLimite di risoluzione del microscopio
�� Dipenda dalla lunghezza d’onda della “luce” Dipenda dalla lunghezza d’onda della “luce”
utilizzata per illuminare il preparatoutilizzata per illuminare il preparato
�� Il cosiddetto criterio di Il cosiddetto criterio di AbbeAbbe limita infatti la limita infatti la
risoluzione massima a circa 0.5 λ/(n sin θ) per risoluzione massima a circa 0.5 λ/(n sin θ) per
un sistema ottico avente apertura numerica n sin un sistema ottico avente apertura numerica n sin
θ, che impieghi luce di lunghezza d’onda λ. θ, che impieghi luce di lunghezza d’onda λ. Per Per
luce nello spettro visibile essa si attesta sui luce nello spettro visibile essa si attesta sui
0.2 ÷ 0.4 µm0.2 ÷ 0.4 µm..
Tipi di Coltura di Cellule “in vitro”Tipi di Coltura di Cellule “in vitro”
Coltura Primaria Coltura SecondariaColtura Primaria Coltura Secondaria
Coltura Primaria
●Coltura preparata direttamente da un tessuto:le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitrodopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita)Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo
Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a l ungo termine
Ciclo vitale di Cellule Primarie
●●Isolamento di ceppi clonaliIsolamento di ceppi clonali:: il programma genetico della senescenza è stato il programma genetico della senescenza è stato
annullato attraverso mutazioni spontanee o indotteannullato attraverso mutazioni spontanee o indotte
●● Derivazione: Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di
colture primarie non tumorali colture primarie non tumorali
Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle ceLe cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerosellule cancerose
VantaggiVantaggi: : cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibilcellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati i con risultati
meno variabili delle colture primariemeno variabili delle colture primarie
SvantaggiSvantaggi:: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellularenon riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare
Linea Cellulare Continua
Coltura PrimariaColtura Primaria
Coltura a breve termineColtura a breve termine Coltura a lungo termineColtura a lungo termine
< 10 < 10 duplicazioniduplicazioni 5050--60 60 duplicazioniduplicazioni
Coltura SecondariaColtura Secondaria
Linea Cellulare ContinuaLinea Cellulare Continua
>1>15050--200 duplicazioni200 duplicazioni
Linea Cellulare ContinuaLinea Cellulare Continua
�� Capacità di crescere indipendentemente Capacità di crescere indipendentemente
dall’organismo da cui è derivatadall’organismo da cui è derivata
�� Crescita ininterrotta per oltre un annoCrescita ininterrotta per oltre un anno
�� ImmortaleImmortale
Le prime Linee Cellulari ContinueLe prime Linee Cellulari Continue
1952, 1952, JohnsJohns HopkinsHopkins
UniversityUniversity 1963, University of 1963, University of
IbadanIbadan
HELA RAJI
Osserviamo le coltureOsserviamo le colture�� Le cellule devono essere coltivate in appositi Le cellule devono essere coltivate in appositi
recipienti.recipienti.
Le cellule devono essere coltivate Le cellule devono essere coltivate
in appositi terreniin appositi terreni
Diversi tipi di terreni adattiDiversi tipi di terreni adatti
alle diverse linee cellularialle diverse linee cellulari
Siero animale, di solitoSiero animale, di solito
Siero Fetale Bovino (FCS)Siero Fetale Bovino (FCS)
Altri supplementi: antibiotici, Altri supplementi: antibiotici, glutaminaglutamina
ecc.eccecc.ecc..
Medium di ColturaMedium di Coltura
●●I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i
componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellulecomponenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule
●●I piI piùù comuni terreni base di coltura:comuni terreni base di coltura:
--MEM:MEM: Minimum Minimum EssentialEssential MediumMedium
--DMEM:DMEM: DulbeccoDulbecco’’s modification of MEMs modification of MEM
--RPMI:RPMI: Roswell Park Memorial Roswell Park Memorial InstituteInstitute
Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per lDifferiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la a
concentrazione di glucosioconcentrazione di glucosio
acquaacqua
Medium di ColturaSali inorganici
▪ Cloruro di calcio anidro▪ Solfato di magnesio anidro▪ Cloruro di potassio▪ Nitrato di potassio▪ Cloruro di sodio▪ Fosfato di sodio bibasico▪ Bicarbonato di sodio
Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo
Sali inorganiciSali inorganici
Nutrienti a basso peso molecolareNutrienti a basso peso molecolare
Medium di ColturaZuccheri
Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonioper le biosintesi
Glucosio
Medium di ColturaVitamine
BiotinaPantotenatoAcido folicoInositoloNicotinamidePiridossinaRiboflavinaTiaminaVitamina B12
Agiscono come catalizzatori o come substratiper facilitare o controllare alcune funzionimetaboliche
Medium di ColturaAmminoacidi-isomeri L
AlaninaArgininaAsparaginaAcido asparticoCisteinaGlutaminaAcido glutamicoGlicinaIstidinaIsoleucina
LeucinaLisinaMetioninaFenilalaninaProlinaSerinaTreoninaTriptofanoTirosinaValina
Necessari per la sintesi delle proteine
Medium di ColturaMedium di Coltura
�� Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di
essere utilizzato, viene essere utilizzato, viene complementatocomplementato con:con:
�� GlutamminaGlutammina ((aaaa essenziale molto labile)essenziale molto labile)
�� AntibioticiAntibiotici (penicillina/streptomicina)(penicillina/streptomicina)
�� Siero Siero (supplemento più comune delle colture (supplemento più comune delle colture
cellulari)cellulari)
SIEROSIERO�� Miscela complessa di proteine ed elementi Miscela complessa di proteine ed elementi
fondamentali per la crescita fondamentali per la crescita in vitroin vitro della maggior della maggior
parte delle celluleparte delle cellule
�� Fattori di crescita:Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGFPDGF, EGF, IGF
�� Fattori di adesione:Fattori di adesione: fibronectinafibronectina, , vitronectinavitronectina
�� Altri elementi: Altri elementi: trasferrinatrasferrina, albumina, colesterolo, acidi , albumina, colesterolo, acidi
grassi e grassi e glucorticoidiglucorticoidi, elementi minerali , elementi minerali
Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino
(FBS)(FBS)
Allestimento e Allestimento e
propagazionepropagazione
1.1. Controllo della coltura al prelievo Controllo della coltura al prelievo dall’dall’incubatoreincubatore: : colorecolore e e torbidita’torbidita’..
1.1. Osservazione della fiasca al microscopio Osservazione della fiasca al microscopio rovesciato: valutazione della rovesciato: valutazione della densita’densita’ cellulare, cellulare, della presenza di cellule staccate o con della presenza di cellule staccate o con morfologie strane. morfologie strane.
SaosSaos 2 A DIVERSA CONFLUENZA2 A DIVERSA CONFLUENZA
HLHL--60 trattate con una sostanza che le differenzia in 60 trattate con una sostanza che le differenzia in
macrofagimacrofagi. A) HL. A) HL--60 non differenziate B) 60 non differenziate B)
differenziatedifferenziate
HL60 differenziate in cellule aderentiHL60 differenziate in cellule aderenti
ContaminazioniContaminazioni
�� BatteriBatteri
�� FunghiFunghi
�� LievitiLieviti
�� MicoplasmiMicoplasmi
Contamination
• Happens to even the best…
• Fungal – yeast
• Bacterial
• Mycoplasma - filterablebacteria which will passacross 0.2 µm filter. Bigproblem. It is treated withcephalosporin antibiotics.Can take over laboratories.
http://web.uct.ac.za/depts/biomed/Cellculture_05-1.ppt
HL60 infettate da HL60 infettate da micoplasmimicoplasmi
marcate con un colorante per il DNA marcate con un colorante per il DNA
Antibiotici?Antibiotici?
Da usare con discernimentoL’utilizzo continuo puo’ creare forme di
antibiotico resistenza
Molto usati cocktail di Penicillina e
streptomicina o gentamicina e
fungizone