BIOTECNOLOGÍA PARA TODOS:

Socialización de conceptos, aplicaciones y beneficios

Conceptos básicos de la tecnologíade ADN recombinante

ADN recombinante

Una molécula de ADN híbrida formada por la unión de

dos secuencias de ADN provenientes de dos

organismos distintos.

2

Vector de clonación

ADN de interés

ADN

recombinante

Molécula de ADN recombinante. Tomado de

http://www.slideshare.net/mrtangextrahelp/18a-cloning

● Aislamiento de la secuencia de ADN de interés (ADN genómico,ADNc o ADN copia o bien un ADN obtenido mediante PCR).

● Unión de la secuencia de ADN de interés a un vector declonación.

● Introducción de la molécula de ADN recombinante en unacélula huésped que puede ser procariota (bacterias) oeucariota (levaduras).

Creación ADN recombinante

● Identificación y purificación de los clones queposeen la molécula de ADN recombinante deinterés.

● Crecimiento y amplificación de las células huéspedque incorporaron el ADN recombinante de interés.

Creación ADN recombinante

Creación ADN recombinante

Pasos básicos en la creación de una molécula de ADN recombinante. Tomado de

http://www.zo.utexas.edu/faculty/sjasper/images/20.1.gif

Clonación depende de las endonuclesas de

restricción.

Enzimas que cortan la molécula de ADN en sitios

específicos denominados: sitios de restricción

(secuencias de 4 – 8 pares de bases).

Mecanismo de defensa de las bacterias contra la

infección por fagos.

• Bacterias metilan su propio ADN.

Enzimas de restricción

Reconocen secuencias de ADN palindrómicas.

Producen cortes en las dos cadenas.

Enzimas de restricción:

Extremos cohesivos o pegajosos (EcoRI)

Extremos romos (Hind II)

Enzimas de restricción

Enzimas de restricción

Modo de acción de las enzimas de restricción. Tomado dehttps://biologiamolecularinteractiva.wordpress.com/about/enzimas-de-restriccion/

Enzima de

restricción

Enzima de

restricción

Extremos cohesivos

Secuencia

específica

Enzimas de restricción

corte corte

Extremos romosExtremos cohesivos

Sitio reconocimiento

EcoRI

Sitio reconocimiento

SmaI

A B

Enzimas de restricción

Mecanismo de acción de las enzimas de restricción: (a) extremos cohesivos y (b) extremos romos. Tomado y

modificado de http://synbio101.org/genetic-engineering/2-3-the-restriction-enzymes-as-molecular-scissors/

Molécula de ADN que vehiculizará al fragmento de

interés y permitirá su multiplicación.

Componentes:

• Un origen de replicación.

• Un gen marcador.

• Sitio de clonación múltiple o sitio de restricción

múltiple: segmento corto de ADN con muchos

sitios de restricción distintos.

Vector de clonación

Vecto

r c

lon

ació

n

Sitio múltiple

de clonación

Gen marcador

( por ejemplo selección a antibióticos)

Origen de replicación

Diagrama básico de un vector de clonación bacteriano (plásmido). Tomado y

modificado de http://oregonstate.edu/instruct/bb331/lecture04/FigF6.html

Móleculas de ADN circular, doble banda, extracromosómicos.

Ventajas como vector de clonación:

• Tamaño pequeño.

• Circulares.

• Replicación independiente del ADN cromosómico.

• Presencia múltiples copias en la células bacteriana.

• Presencia de genes de resistencia a antibióticos.

Transferencia a la célula hospedera por transformación

utilizando choque de calor o electroporación.

Plásmidos

Estos vectores se caracterizan por poseer las secuencias

regulatorias (promotor, terminador, secuencias de unión

al ARNr) que permitan la adecuada expresión del gen de

interés.

Asimismo, poseen un sitio de replicación, un sitio de

clonación múltiple (MCS) y un gen marcador que permita

la selección de las células que incorporaron el vector.

Vector de expresión

Vecto

r e

xp

resió

npromotor

MCS

terminador

Origen de replicación

Gen de

selección

Diagrama básico de un vector de expresión. Tomado y modificado dehttp://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/constitutive_gene_expression_lactococcus.html

Paso 1: restricción y ligación del ADN

Plasmido recombinante

ADN ligasa

ADN de interés

Corte conEcoRI

Corte conEcoRI

Sitios de corte

Vector declonación

Paso 2: Introducción del ADN en una célula hospedera

Vector de

clonación

ADN de interés

Transformación

Transformación Transformación

Crecimiento en el medio con

el antibiótico

Ligación del ADN

de interés

Ligación del vector

de clonación

No hay crecimiento en el

medio con el antibiótico

Paso 3: Selección de las células transformadas

Paso 4: Identificación de las células transformadas

Secuenciación

Hibridación

PCR

Fragmento de ADN original

Nucleótidos

Cebadores

Desnaturalización Annealing Extensión

Desnaturalización (94-96 ºC)

Annealing (35 ºC a 60 ºC)

Elongación (72 ºC)

PCR

Esquema general de la reacción en cadena de la polimerasa. Tomado y modificado dehttps://zh.wikipedia.org/wiki/%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%93%BE%E5%BC%8F%E5%8F%8D%E5%BA%94

Electroforesis

Técnica de electroforesis: separación de moléculas según su tamaño en unamatriz porosa. Tomado y modificado dehttp://www.bio.utexas.edu/faculty/sjasper/bio212/biotech.html

Construcción artificial de un ácido nucleico

bicatenario por el apareamiento de bases

complementarias de dos ácido nucleicos

monocatenarios.

Sonda: fragmento determinado de ADN o ARN

marcado química o radioactivamente y que es

utilizada para localizar secuencias de ácidos

nucleicos.

Hibridación

Southern blot

Enzimas de restricción ADN

electroforesisTransferencia a la mebrana

Sonda marcada radioactivamente

Hibridación Detección

Esquema general de la técnica Southern blot. Tomado y modificado dehttp://www.biotechacademy.dk/Undervisningsprojekter/Gymnasialeprojekter/genteknologi/teori/4genteknologisketools/southern-blot

Northern blot

Esquema general de la técnica Northern blot. Tomado y modificado dehttps://vimeo.com/channels/563554/69633383

Muestra

ARN

electroforesis

Transferencia a la

mebrana

Sondas marcadas

radioactivamente

hibridación

Detección

Western blot

Esquema general de la técnica Western blot. Tomado y modificado dehttp://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotFinal.gif

Membrana de nylon con las proteínas

Proteína Anticuerpo primario

Anticuerpo

secundario

Detección de la señal

Secuenciación química de ADN

Secuenciación química del ADN desarrollada por Maxam y Gilbert . Tomado ymodificado de http://pt.slideshare.net/suryasaha/sequencing-32243702

Corte de las bases

nitrogenadas en

Secuenciación de ADN

Secuenciación del ADN desarrollada por Sager. Tomado y modificado dehttp://www.geopaloma.com/biologia_2b/unidades/ejercicios/act14biointema6.htm

Aplicaciones

Insulina recombinante Vacunas recombinantes

Plantas transgénicas Animales transgénicos

Bacterias transgénicas