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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
ASOCIACION PARA EL DESARROLLO SOSTENIDO –ASODIS-
FACULTAD DE AGRONOMIA -FAUSAC-
INFORME FINAL
UTILIZACIÓN DE LA PROPAGACIÓN IN VITRO COMO HERRAMIENTA
PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE CRISANTEMO
PROYECTO FODECYT No. 60-2006
ING. AGR. ALFREDO CABRERA MORALES
Investigador Principal
GUATEMALA, ENERO DEL 2011.
ASODIS
2
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT-.
3
RESUMEN 5
ABSTRACT 6
PARTE I 7
I.1 INTRODUCCIÓN 7
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 9
1.2.1 Antecedentes en Guatemala 9
I.2.2 Justificación del trabajo de Investigación 11
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS 12
I.3.1 Objetivos 12
I.3.1.1 General 12
I.3.1.2 Específicos 12
I.3.1.3 Hipótesis 12
I.4 METODOLOGIA 13
I.4.1 Localización 13
I.4.1.1 Fase de laboratorio 13
I.4.2 Las Variables 13
I.4.3 Bajo materiales 15
I.4.4 Fase de campo 16
I.4.5 Fase de cultivo in vitro 16
I.4.6 Regeneración de cultivares de crisantemo (Chrysanthemun
Morifolium Ramat) Organogenesis directa. 17
I.4.7 Regeneración de cultivares de crisantemo (Chrysanthemum
morifolium Ramat ) oraganogenesis indirecta 17
I.4.8 Germinacion de embriones de cultivares de crisantemo
(Chrysanthemum morifolium Ramat). 17
I.5 Bajo método 18
I .5.1 Elaboración de medio 18
I.5.2 Inoculación de explantes 19
I.5.3 Análisis de variable 19
PARTE II 20
II.1 MARCO TEÓRICO 20
PARTE III 35
III.1 RESULTADOS 35
III.1.1 EMBRIOGENESIS DIRECTA 35
III.1.1.1 crisantemo variedad shasta 35
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad shasta 35
b. Fase de invernadero crisantemo variedad shasta 35
c. Fase de campo crisantemo variedad shasta 36
III.1.1.2 Crisantemo variedad Estandar 37
a. Fase de laboratorio variedad estandar 37
b. Fase de invernadero variedad estandar 38
c. Fase de campo crisantemo variedad estandar 38
III.1.1.3 Crisantemo variedad polar 39
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad polar 39
b. Fase de invernadero crisantemo variedad polar 40
c. Fase de campo crisantemo variedad polar 40
4
III.1.2 EMBRIOGENESIS INDIRECTA 41
III.1.2.1 Crisantemo variedad shasta 41
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad shasta 41
b. Fase de invernadero crisantemo variedad shasta 42
c. Fase de campo variedad shasta 42
III.1.2.2 Crisantemo variedad estandar 43
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad estandar 43
b. Fase de invernadero crisantemo variedad estandar 44
c. Fase de campo crisantemo variedad estandar 44
III.1.2.3 Crisantemo variedad polar 45
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad polar 45
b. Fase de invernadero crisantemo variedad polar 46
c. Fase de campo crisantemo variedad polar 46
III.1.3 Forma tradicional 47
a. Fase de campo crisantemo variedad shasta 47
b. Fase de campo crisantemo variedad estandar 48
c. Fase de campo crisantemo variedad polar 48
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 50
III.2.1 Crisantemo variedad shasta fase de laboratorio 50
III.2.2 Crisantemo variedad shasta fase de campo 50
III.2.3 Crisantemo variedad estandar fase de laboratorio 51
III.2.4 Crisantemo variedad estandar fase de campo 51
III.2.5 Crisantemo variedad polar fase de laboratorio 52
III.2.6 Crisantemo variedad polar fase de campo 52
PARTE IV. 53
IV.1 CONCLUSIONES 53
IV.2 RECOMENDACIONES 54
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54
IV.4 ANEXOS 58
PARTE V INFORME FINACIERO 66
5
RESUMEN
Guatemala tiene cultivos ornamentales de interés comercial, utilizados para la
exportación así como para el consumo interno, los cuales son propagados por
procedimientos asexuales, lo que repercute en bajas tasas de propagación, calidad del
material reproductivo no certificado, presencia de patógenos que son transmitidos por el
material vegetativo.
La utilización de la técnica del cultivo de tejidos in vitro es una alternativa
mediante la cual se obtienen plantas de calidad, libres de enfermedades y tasas de
propagación eficientes. En el proyecto titulado utilización de la propagación in vitro como
herramienta para mejorar la producción de crisantemo se valido y adapto la tecnología de
la técnica del cultivo in vitro, a partir de organogenesis directa e indirecta, se evaluó la
factibilidad de su uso, así como el comportamiento productivo de las plantas en condiciones
de campo. Los cultivares de crisantemo (Chrysanthemum morifolium Ramat), estudiados
fueron, shasta, polar y estándar, los cuales tienen importancia para la economía de
Guatemala de acuerdo a la demanda y los precios obtenidos en el mercado. Además los
métodos tradicionales de propagación no satisfacen la demanda de calidad de las plantas en
cuanto a la fitosanidad, altas tasas de multiplicación y que conserven las características
del material original para evitar la erosión genética.
De acuerdo a los resultados obtenidos de las variables de respuesta se tomaron
datos en las tres variedades en estudio: shasta, polar y estándar, propagadas de la forma
tradicional y a través de la técnica in vitro, para lo cual se establecieron a nivel de campo
realizando diversos ensayos. A nivel de laboratorio se logro la propagación de las
variedades en estudio tanto por organogenesis directa (yemas) y por organogenesis
indirecta (lamina foliar). Logrando una tasa de propagación exponencial muy alta.
Concluyendo que las variedades de crisantemo en estudio se pueden propagar tanto por
embriogenesis directa e indirecta obteniendo pilones de alta calidad.
6
USE OF IN VITRO PROPAGATION AS A TOOL FOR IMPROVING THE
PRODUCTION OF CHRYSANTHEMUM
Summary
Guatemala has ornamental crops of commercial interest, used for export and for
domestic consumption, which are propagated by asexual procedures, which impacts on low
rates of spread, quality of reproductive material is not certified, the presence of pathogens
that are transmitted by the plant material.
The use of the technique of in vitro tissue culture is an alternative means of which
are derived from plants quality, disease-free and efficient propagation rates. In the project
entitled ¨ use of in vitro propagation as a tool to improve the production of chrysanthemum
are valid and I can adapt technology to the technique of in vitro culture, from direct and
indirect organogenesis, assessed the feasibility of their use, as well as the productive
performance of the plants under field conditions. The cultivars of chrysanthemum
(Chrysanthemum morifolium Ramat), were studied, Shasta, Polar and Stand, which are of
importance to the economy of Guatemala agreed to the demand and prices obtained in the
market. Besides traditional methods of propagation do not meet the demand for quality of
the plants in terms of plant protection, high rates of proliferation and retain the
characteristics of the original material to avoid genetic erosion.
According to the results of response data were taken in three varieties under study:
Shasta, Polar and Standard, propagated the traditional way and through the in vitro
technique. Which were established at field level conducting various tests. At the level of
achievement laboratory is the spread of the varieties under study by both direct
organogenesis (buds) and indirect organogeneis (leaf lamina). Delivering an exponential
rate of spread very high. Concluding that the varieties of Chrysanthemum in the study can
spread both by direct and indirect embryogenesis getting pylons of high quality.
7
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
Guatemala posee diversidad de climas aptos para el establecimiento de especies con
interés económico y con potencial para ser utilizadas en la floricultura. Una especie que
posee gran demanda por los consumidores locales como flor de corte es el crisantemo. El
crisantemo presenta diversidad de variedades que presentan características deseables por el
consumidor como el color de la flor; blanca, amarilla, magenta, rosado. Por su forma; que
puede ser, forma de trompeta, tipo araña, tipo chomin. Por su porte el cual se refiere a
tallos largos. La durabilidad se refiere a la cantidad de días que esta se conserva sin perder
su vistosidad como la shasta la cual puede durar hasta 20 días en florero después de
cortada. Estas características hacen que el crisantemo sea preferente frente a otras especies.
De acuerdo a las entrevistas realizadas a los productores se logro detectar que
existen tres variedades que presentan demanda local como flor cortada, estas variedades
son: shasta, estandar y polar. Con estas especies los productores tienen preferencias para la
producción, sin embargo la principal limitante para su reproducción, es la disponibilidad
de material sano para su propagación.
Uno de estos problemas que causa limitantes en la producción de estas variedades
es la propagación vegetativa para obtener plantas de calidad en cuanto a sanidad, esto
debido a que no se cuentan con planes modernos de propagación que garanticen la sanidad
con lo cual se diseminan microorganismos causantes de enfermedades como los géneros de
bacterias de: Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas cichorii, hongos de los géneros:
Ascochyta (Mycosphaerella), Alternaria o Stemphylium, Botrytis cinerea, Fusarium
oxysporum, Erysiphe cichoracearum, Pythium, Verticillium, Rhizoctonia solani, virus
como el viroide de la mancha clorótica del crisantemo (Chrysanthemum chlorotic mottle
viroid), Viroide del enanismo del crisantemo (Chrysanthemum stunt viroid) (Moorman
2001). Además de nematodos como los del genero: Paratylenchus que es considerado el
8
de mayor importancia por su abundancia y diseminación en la zonas productoras de este
cultivo, Aphelenchoides ritzema-bosi o Aphelenchoides fragariae (Crozzoli 1989).
Actualmente no se cuentan con metodologías modernas de propagación que
contribuyan a la obtención de plantas de calidad, sanas y rejuvenecidas sin embargo con la
implementación de la técnica de cultivo de tejidos vegetales in vitro se contribuirá con la
modernización de la propagación de variedades del crisantemo teniendo como resultado la
obtención de plantas de calidad y en cantidades sustentables. Con la obtención de plantas
sanas se repercutirá en la aplicación de menos productos químicos en el procedo de
producción con lo cual se obtendrán flores de corte de calidad y en cantidades suficientes
para abastecer los mercados con demanda y a la vez se creara oportunidades de
comercialización para competir con otros mercados que abastecen la demanda local e
internacional de flor de corte.
En el presente estudio se planteo como principal objetivo validar y adaptar la
tecnología in vitro para propagar cultivares de crisantemo. Como resultado se logro
obtener vitroplantulas de las variedades shasta, estandar y polar por los métodos de
embriogenesis directa e indirecta, logrando la multiplicación exponencial de dichas
variedades, a las cuales se les indujeron raíz a cada vitroplantula para luego aclimatarlas y
ser probadas a nivel de campo.
Con el establecimiento de metodologías de propagación in vitro se obtendrán
plantas libres de enfermedades como bacterias; Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas
cichori, hongos de los géneros Ascochyta, Alternaria o Stemphylium, virus como viroide de
la mancha clorótica del crisantemo (Chrysanthemum chlorotic mottle viroid), Viroide del
enanismo del crisantemo (Chrysanthemum stunt viroid) (Moorman W., G. 2001). Al
emplear esta técnica de propagación se contribuirá con la obtención de flores de calidad
utilizando menos insumos, esto debido que la contaminación de los esquejes enraizados
provenientes de las plantas madres causa limitantes en la producción de variedades de
interés comercial.
9
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes en Guatemala
Una de las principales causas que limitan la producción de las variedades de
crisantemo es la propagación para obtener plantas sanas y en grandes cantidades esto
debido a que no se cuentan con planes modernos de propagación con lo cual se diseminan
microorganismos causantes de enfermedades como bacterias, Erwinia chrysanthemi,
Pseudomonas cichorii, hongos de los géneros Ascochyta (Mycosphaerella), Alternaria o
Stemphylium, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Erysiphe cichoracearum, Pythium,
Verticillium, Rhizoctonia solani y virus como viroide de la mancha clorótica del crisantemo
(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid), Viroide del enanismo del crisantemo
(Chrysanthemum stunt viroid) (Moorman W., G. 2001). Además de nematodo como los
del genero Paratylenchus que es considerado el género de mayor importancia por su
abundancia y diseminación en la zonas productoras de este cultivo, Aphelenchoides
ritzema-bosi o A. fragariae (Crozzoli 1989).
La renovación del stock de plantas madres mediante el cultivo in vitro proveniente
de meristemos, provoca el rejuvenecimiento y limpieza sanitaria de las plántulas
resultantes. Esta tarea es realizada por empresas especializadas, que poseen las
instalaciones necesarias para tal fin, y que pueden ser propagadores oficiales o las mismas
firmas productoras de la genética de las variedades que se comercializan.
En nuestro país, no existen empresas que reúnan dichas características, a pesar que
existe producción de esquejes de crisantemo, estos no poseen los estándares de calidad
como sistema radicular bien desarrollado, porte del esqueje adecuado para un mejor
crecimiento, esquejes fisiológicamente maduros que los hacen tener una vejez prematura y
por lo consiguiente botones florales poco desarrollados. Estos son algunos de los aspectos
que son necesarios para asegurar una producción de flores de calidad que hagan rentable y
que dicho producto adquiera demanda por parte de los consumidores tanto a nivel local
como internacional. Por otra parte, la importación de materiales libres de patógenos resulta
beneficioso debido que incrementa la calidad de los materiales en cuanto al
10
rejuvenecimiento de las plantas. Sin embargo este cambio en la renovación de las
plantaciones produce un incremento sustancial de los costos de producción con la
consecuente pérdida de rentabilidad. Sin embargo, se podría mejorar la situación de los
productores de flores, con la puesta en marcha de un sistema de producción de esquejes,
partiendo de variedades liberadas y multiplicándolas in vitro a fin de limpiar y rejuvenecer
los clones (Pierik, 1990).
11
I.2.2 Justificación del trabajo de Investigación
En Guatemala el cultivo de flor utilizada para corte, en los últimos años se ha
incrementando tanto en unidad de área como en especies y variedades cultivadas
especialmente de crisantemo, esto debido que existen áreas que cuentan con condiciones
bioclimaticas que presentan algunos lugares como; San Pedro Sacatepéquez, San Juan
Sacatepéquez, San José Pinula municipios del Departamento de Guatemala. Santa Lucia
Milpas Altas, San Miguel Dueñas, Antigua Guatemala municipios del departamento de
Sacatepéquez (Cardona N., E., A. 1991).
A pesar que la flor de corte como el crisantemo (Chrysanthemum morifolium
Ramat) a tomado auge debido a la preferencia de los consumidores, el número de
productores también se ha incrementado. Sin embargo en el proceso de reproducción y
cultivo de las variedades no existen técnicas de cultivo modernas que ayuden a incrementar
la producción y a la vez mejorar la calidad de la flor.
Con el empleo de técnicas modernas de propagación como lo es el cultivo de
tejidos in vitro utilizando la órganogénesis directa (multiplicación por yemas axilares) e
indirecta (multiplicación por tejido foliar) se puede propagar variedades de interés
comercial en grandes cantidades que satisfagan la demanda de acuerdo a las exigencias de
los productores de crisantemo. A la vez se puede obtener material libre de
microorganismos, lo cual garantiza la calidad de las plantas con lo cual se obtendrán
mejores rendimientos y flores de mejor calidad. Esto les permitirá acceder a nuevos
mercados tanto nacionales como extranjeros con lo que podrán mejorar la economía
familiar.
12
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
Validar y adaptar la tecnología del cultivo in vitro para la propagación vegetativa de
cultivares de crisantemo (Chrysanthemum morifolium Ramat) de interés económico
en Guatemala con problemas fitosanitarios de propagación.
I.3.1.2 Específicos
I.3.1.2.1 Determinar la tasa regenerativa de cultivares de crisantemo
(Chrysanthemum morifolium Ramat) a partir de organogénesis
directa e indirecta.
I.3.1.2.2 Evaluar la adaptación y endurecimiento de plántulas a nivel de
invernadero provenientes de laboratorio.
I.3.1.2.3 Evaluar la adaptación, resistencia a enfermedades y la precocidad
en cuanto a su productividad a nivel de campo. Respecto a la
propagación tradicional.
I.3.1.3 Hipótesis
La multiplicación in vitro es una alternativa de propagación para diversos
cultivares de crisantemo (Chrysanthemum morifolium Ramat) que garantiza
la sanidad de las plantas, fidelidad a las características varietales, mayores
tasas de multiplicación respecto a las metodologías de propagación
convencionales. Por lo tanto, es una alternativa viable para la modernización
y mejoramiento de la competitividad en el cultivo de diversos cultivares.
13
I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Localización
1.4.1.1 Fase de laboratorio
La investigación se desarrolló en el laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales de la Subarea de Manejo y Mejoramiento de Plantas, Área Tecnológica de
la Facultad de Agronomía de la Universidad de San Carlos de Guatemala, esta
ubicada en las coordenadas 14o 58‟ 52‟‟ N y 90
o 55‟ 35‟‟ W así como en el
invernadero ubicado en el centro experimental docente de Agronomía (CEDA) el
cual se localiza en las coordenadas 14o
58‟ 26‟‟ N y 90o 55‟ 30‟‟ W
. se ubica a 1500
MSNM. Con un clima templado la mayoría del tiempo.
I.4.2 Variables
Para establecer la respuesta de cada uno de los cultivares en estudio durante
la fase de cultivo in vitro se midieron las siguientes variables.
Oxidación: Se observo cada unidad experimental para determinar la
presencia de oxidación por fenoles, a los 5, 15, y 30 días después de
inoculados los explantes.
Contaminación: se determino a los 5, 10 y 20 días después de sembrados los
explantes para ello se observo cada unidad experimental.
Germinación de embriones: se determino el porcentaje de germinación.
Crecimiento: se determino cuanto creció el explante durante los días en que
permaneció en el tubo de ensayo.
Número de brotes por cada explante: se determino cuantos brotes formo
cada explante en un término de 30 días.
14
Altura de la planta: se determino cuanto crece desde el inicio en que esta
emitió raíces dentro del tubo de ensayo hasta el final del enraizamiento y se
expreso en centímetros.
Enraizamiento de la planta:
- Se tomo el tiempo en que la plántula enraízo.
- Se tomo el número de raíces por planta.
Para establecer la respuesta de cada una de los cultivares en estudio para la fase de
aclimatación se midieron las siguientes variables.
Sobrevivencia de las plantas: se realizaron tres lecturas:
- Etapa inicial: cuando las plantas fueron sembradas en las bandejas.
- Etapa media: cuando las plantas habían permanecido 5 días dentro del
invernadero.
- Etapa final: después de 20 días de haber permanecido en el
invernadero.
Daños: Se observo y determino la susceptibilidad de las plantas a
enfermedades por hongos, bacterias, insectos, tolerancia a químicos.
Tiempo: Se determino el tiempo en que la planta alcanzo la altura
deseable para ser trasladada al campo.
Para establecer la respuesta de cada una de los cultivares en estudio para la
fase de establecimiento y evaluación a nivel de campo se midieron las siguientes
variables.
Sobrevivencia de las plantas: se realizaron tres lecturas:
- Etapa inicial: Cuando las plantas fueron establecidas en los surcos.
15
- Etapa media: Cuando las plantas hayan permanecido 15 días después de
establecidas en los surcos.
- Etapa final: Después de 30 días de haber permanecido en los surcos.
Daños: Se realizaron monitoreos constantes desde la siembra en el
campo hasta que finalizo el ciclo fenológico.
Tiempo en floración: se tomaron los días en que las plantas emitieron el
primer botón floral, así como el número de flores.
Rendimientos: se observo y determino cuantas flores producieron las
plantas.
Fitosanidad: se observo la susceptibilidad de las plantas al ataque de
microorganismos e insectos.
Altura: Se determino la altura en centímetros, desde el establecimiento
en el campo hasta que finalizo el ciclo fenológico.
Biomasa total: Se expreso en porcentaje de la materia orgánica.
Calidad de la flor: para esta variable se midió lo siguiente; durabilidad
después del corte, tamaño de la flor, frondosidad y sensibilidad a
condiciones adversas.
I .4.3 Bajo materiales
Las variedades de crisantemo se colectaron en los municipios de San Pedro y San
Juan Sacatepéquez del departamento de Guatemala en donde se realizaron los monitoreos
y colectas de los materiales de interés, también se establecieron los ensayos de plántulas
16
procedentes del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales ubicado en la Facultad de
Agronomía de la Universidad de San Carlos de Guatemala, ubicada en la zona 12 del
departamento de Guatemala. Para realizar los trabajos de laboratorio se utilizaron
instrumentos como balanza analítica, potenciómetro, autoclave, horno de convección,
cuarto de incubación, cuarto de siembra. Instrumentos de laboratorio como pinzas, bisturís,
cristalería como beakers, erlen meyers, cajas petri, probetas.
Como parte complementaria de la investigación también se realizaron pruebas de
establecimiento de plantas a nivel de campo, de las variedades: shasta, Polar, Standard,
además se monitorearon plantas ya establecidas por los floricultores a manera de
comparación. Para obtener plantas a nivel de laboratorio se utilizaron reguladores de
crecimiento como el ANA, IBA Y el BAP. Así como los componentes del medio basal
Murasihge and Skoog 1962.
I.4.3 Fase de campo
Se visitaron áreas productoras de crisantemo, en el municipios de San Juan
Sacatepequez el cual se ubica en las coordenadas 14o 43‟ 04‟‟ N y 90
o 38‟ 34‟‟ W se
encuentra a 1845 MSNM, presenta un clima templado en la mayor parte del tiempo, con
una temperatura de 15 a 23 grados centígrados. Este municipio pertenece departamento de
Guatemala, los cultivares de crisantemo se seleccionaron de acuerdo al interés comercial de
los productores, en el estudio se estudiaron los cultivares shasta, estándar y polar para lo
cual se seleccionaron las plantas mas robustas, sanas.
I.4.4 Fase de cultivo in vitro
Se implemento la técnica de regeneración de plántulas por organogénesis directa e
indirecta, con el objeto de obtener plántulas de los cultivares de crisantemo
(Chrysanthemum morifolium Ramat) en estudio.
17
I.4.5 Regeneración de cultivares de crisantemo (Chrysanthemum morifolium
Ramat) Organogenesis directa.
Se seleccionaron cultivares de plantas seleccionadas y establecidas asépticamente a
nivel de invernadero, se escogieron yemas axilares, estas se colocaron en una solución
preservante-desinfectante por un tiempo de 24 horas. En la campana de flujo laminar se
disectaron brotes de un centímetro de longitud, y se sembraron en medios de cultivo para la
inducción de brotes, el medio de cultivo a utilizado fue el medio básico Murashige y Skoog
1962 al 75 por ciento de sales de su concentración normal. Suplementado con 3% de
sacarosa, 0.7% de agar con un pH de 5.8. Adicionado con 1.4 mg/Lt de BAP. (Chagas E.,
A. Et al 2004).
I.4.7 Regeneración de cultivares de crisantemo (Chrysanthemum morifolium
Ramat) organogenesis indirecta (embriogenesis somática).
Cultivares de crisantemo. shasta, estándar y polar fueron establecidos
asépticamente a nivel de invernadero de los cuales se escogieron hojas jóvenes, estas se
colocaron en una solución preservante-desinfectante por un tiempo de 12 horas. En la
campana de flujo laminar se disectaron las hojas formando cuadros de 2 centímetros, y se
sembraron en medios de cultivo para la inducción de callos, el medio de cultivo a utilizar
fue el medio básico Murashige y Skoog (1962).
1.4.8 Germinación de embriones de cultivares de crisantemo
(Chrysanthemum morifolium Ramat).
Los embriones obtenidos en la fase de embriones somáticos a partir de discos
foliares, se sometieron al medio basal Murashige y Skoog (1962). Con las dosis de
reguladores de crecimiento de 250 Mg/Lt de acido naftalanacetico (ANA), 250 Mg/Lt
de bencil amino purina (BAP), 250 Mg/Lt acido giberelico (GA3) (ver anexo)
18
I.5 Bajo método
I.5.1 Elaboración de medio.
Se preparó la cantidad de medio basal de según la cantidad deseada, para lo cual se
siguió la siguiente metodología. En un beacker se colocó agua desmineralizada estéril, se
agregó al recipiente una barra magnética y se colocó sobre el agitador magnético el cual
estuvo en constante agitación, se agregaron el componentes del medio basal de acuerdo a
la cantidad deseada, el orden fue el siguiente:
a) Macro nutrientes; NH4NO3, KNO3 MgSO4(7H2O), KH2PO4,
CaCl2(2H2O)
b) Micronutrientes A; MnO4(4H2O), ZnSO4(7H2O), H3BO3,
NaMoO4(2H2O), KI
c) Micronutrientes B; CoCl2(6H2O), CuSO4(5H2O)
d) Hierros, Na2EDTA, FeSO4(7H2O)
e) Vitaminas; tiamina
f) Myo inositol
g) Reguladores de crecimiento, cantidades de acuerdo a evaluar según la
fase del experimento ver anexo de protocolos.
h) Se agregó antioxidante según necesidad.
j) Se aforó la solución.
k) Se midió el pH el cual estuvo a 5.7 para ello se utilizó solución de ácido
clorhídrico o hidróxido de sodio 0.1 N.
l) Se agregó agar (8.0 gr/Lt).
m) Se calentó en horno microondas hasta disolver el agar.
n) La solución se distribuyó en las unidades experimentales consistiendo en
frascos de 100 ml de capacidad o tubos de ensayo 20 X 150 mm.
ñ) Cada frasco o tubo de ensayo se rotulo según tratamiento.
o) Todas las unidades experimentales se esterilizaron en autoclave durante
25 minutos a una presión de 1.05 kg/cm cuadrado a una temperatura de
120 º C.
19
p) Las unidades experimentales se colocaron en el cuarto de incubación
hasta su utilización.
I.5.2 Inoculación de explantes
Los explantes dentro de la campana de flujo laminar se desinfectaron
superficialmente, realizándoles un lavado con agua desmineralizada estéril, seguidamente
se sumergieron por 3 minutos en alcohol etílico al 70%, se les realizo un segundo lavado
para eliminar restos de alcohol en el tejido vegetal, seguidamente se colocaron en cloro al
3% por 3 minutos, seguidamente se les realizo un ultimo lavado con agua desmineralizada
estéril.
Los explantes después de ser desinfectados superficialmente se cortaron de acuerdo
al siguiente criterio, laminas foliares tejido foliar 1 centímetro cuadrado, yemas un
centímetro de longitud.
I.5.3 Análisis de variables
Para el análisis de las variables se utilizo una estadística descriptiva de los cambios
observados en los explantes en experimentación. Auxiliándose con tablas, porcentajes,
medias, de los datos obtenidos de las variables de respuesta según los materiales en
experimentación.
20
PARTE II
II.1 MARCO TEORICO
Según Gómez (2,001) el crisantemo (Chrysanthemum morifolium Ramat), es una de
las flores cultivadas más antiguas, la cual ha jugado un papel significativo en la cultura y
en la vida, tanto China como Japonesa, a pesar de las muchas especies de este género,
sólo el Crisantemo morifolium Ramat se cultiva en cantidad para ser utilizada como flor de
corte, teniendo interés por su gran valor comercial, siendo la variación del color de la flor
su máxima atracción así como la durabilidad de post cosecha.
El genero Chrysanthemum pertenece a la familia de las Asteraceas o de la familia de
las compuestas y engloba flores de las mas antiguas que han sido cultivadas. El
crisantemo que actualmente cultivan los horticultores son híbridos complejos y la mayoría
de las especies de donde se han generado los cultivares actuales son originarias de China:
Chrysanthemum indicum, Chrysanthemum morifolium y la margarita Chusan (especie
desconocida). Actualmente la mejora para la obtención de híbridos comerciales se basa en
la forma, en el color, así como en su adaptación para la producción de flores durante todo
el año, incidiendo siempre en la calidad y durabilidad de sus flores después de haberlas
cortadas.
El crisantemo a nivel de países productores es actualmente, la principal flor de
corte, por ejemplo en el mercado brasileño ocupa el primer lugar sobre otras especies de
flor, esto debido a su enorme variación de colores y formas, a su alta durabilidad pos
cosecha y a la facilidad de cultivo. La comercialización de esa especie ornamental depende
directamente del tamaño y de la calidad en cuanto a la sanidad de sus hojas, tallos y flores.
A nivel mundial Holanda es el primer país exportador de flores del mundo. Durante 1989,
ocupó el segundo lugar en las ventas con un 18% del total de la "flor cortada". En
Colombia, segundo exportador mundial de flores, el crisantemo suponía en 1,987 el
segundo producto de exportación detrás del clavel con más de 682 millones de tallos. Esta
demanda se debe a su buena duración como flor cortada y a la amplia gama de colores y
21
formas de la flor que presenta el surtido varietal. Además como planta en maceta es una
de las especies más vendidas por ser una planta de fácil cultivo y por la durabilidad de sus
flores.
El mercado productor internacional ha identificado dos características como factores
claves en la satisfacción de los consumidores de crisantemo: calidad y longevidad de las
flores. Ambos factores pueden ser mejorados por un adecuado manejo de la producción,
especialmente con la aplicación de formulas de fertilización nitrogenada.
Las mutaciones inducidas pueden ser vistas como una herramienta en el
mejoramiento genético convencional o como un potencial alternativo en ciertos aspectos
específicos del cultivo. La mutación del cultivo también podría ser el método de ampliar y
proveer la variabilidad genética entre las variedades. La palabra crisantemo fue
denominado por Carolus Linnaeus de dos prefijos griegos, "Chrys" que significa dorado (el
color de las flores originales), y "anthemon" que significa flor. Es una planta ornamental
cultivada en todo el mundo y comercialmente valiosa debido a los numerosos híbridos
existentes en el mercado, los cuales son bastante apreciados por su inflorescencia, rica en
colores, formas, durabilidad y fragancias. Florecen en varias formas, y pueden ser
parecidas a las margaritas, pompones o botones. Las flores del crisantemo entran una
variedad inmensa de formas y tamaños.
Los crisantemos cuentan con una amplia gama de colores y de formas que la hacen
muy atractivas para el consumidor. Además del tradicional amarillo, otros colores
populares son blancos, púrpuras, y rojos. Estos son muy populares verlos en ramilletes y
en arreglos florales. La morfología de la flor nos presenta que cada cabezuela del
crisantemo es realmente un grupo de muchas flores, la cual compone un grupo central de
flores cortas y de un disco rodeadas por anillos de flores más largas que el rayo.
Los crisantemos se pueden clasificar en nueve categorías según el tipo y el arreglo
floral: Incurvó, Reflejó, Intermedio, Anémonas que son similares a las sencillas, pero con
flores concéntricas tubulares y alargadas. El color de las flores radiales y concéntricas
22
puede ser las mismas o diferir en forma o tamaño. Los individuales, acá se incluyen los
Pompones: que presentan una forma globular, constituidos por flores radiales cortas y
uniformes, las cuales no presentan flores concéntricas. Existe otro grupo cómo los rocíos,
las arañas, cucharas, cañones, los encantos y las cascadas. Por ejemplo, el crisantemo
"reflejado" consiste en flores de rayo que curvan hacia abajo en una forma aglutinada. El
"cañón" tiene flores tubulares de rayo que parten del centro de la cabeza.
Dentro de las variedades de crisantemos utilizadas en los cultivos europeos, para
flor de corte, podemos distinguir: Crisantemos estandard o de bola grande, esto debido a la
forma, la cual desarrolla un solo botón floral. Crisantemos cascada tipo spray o tipo
margarita, esta se obtiene cuando se elimina la inflorescencia terminal en el momento en
que el color empieza a aparecer en las flores radiales. Tipo galleta o decorativo y tipo
araña, a los crisantemos de cascada o multiflora se les quita siempre el botón central, para
tener una floración conjunta de los laterales, de igual forma puede hacerse con los
estandard (Gomez et al 2001).
Los cultivares pueden dividirse en dos grupos de acuerdo a su respuesta ante la
temperatura de crecimiento y la longitud del día (fotoperíodo):
Crisantemos de floración veraniega o temprana: aquellos que florecen en respuesta
a temperaturas cálidas, mayores o iguales a 15 ºC, independientemente de la longitud del
día (termopositivos). La temperatura de 15 ºC es la media de las temperaturas diurna y
nocturna, con temperaturas diurnas que no excedan los 25 ºC y nocturnas superiores a 10
ºC.
Crisantemos de todo el año: son aquellos que responden al fotoperíodo,
concretamente a días cortos, y en menor medida a las temperaturas. Manipulando la
longitud del día pueden obtenerse flores en cualquier época del año. Se subdividen en
grupos de respuesta, de acuerdo con el número de semanas necesarias entre la iniciación de
la yema floral y la floración real: la mayoría de las flores para corte se obtienen de los
cultivares de 10 a 12 semanas.
23
Los crisantemos se pueden clasificar en varios cultivares según la respuesta de la
floración a la temperatura:
Cultivares de termocero: Estos muestran poca inhibición floral entre los 10 ºC y los
27 ºC. La floración se produce rápidamente a 15.5 ºC. Estos son los más adecuados para
la floración de todo el año.
Cultivares termopositivos: La floración se inhibe por debajo de los 15.5 ºC. Las
yemas florales se pueden iniciar pero no se desarrollan más allá de un estado de cabezuela a
bajas temperaturas. Si se mantiene la temperatura apropiada, estos cultivares pueden
utilizarse para floración durante todo el año.
Cultivares termonegativos: la floración se inhibe por encima de los 15º C. las
temperaturas inferiores pueden retardar la floración (10º C), pero no inhiben la iniciación.
Deberán cultivarse solamente cuando las temperaturas nocturnas puedan ser controladas a
15.5 ºC ó ligeramente por debajo. Una de las limitantes es que se deberá evitar el cultivo
en verano.
Los crisantemos son fáciles de cultivar y prosperan muy bien en la intemperie y en
el invernadero. Su producción en invernadero es más eficiente ya que se puede controlar la
humedad relativa, la humedad del suelo, la temperatura y la luminosidad. A cielo abierto
estos factores no pueden controlarse, lo cual puede favorecer la interacción de las plantas
con los patógenos, bajo esta condición, la marchites del crisantemo es un problema serio ya
que se presenta durante todo el año y se acentúa en la época de lluvia o cuando los riegos
son frecuentes y pesados.
Los crisantemos se reproducen por división de raíces, cortes y semillas. También
pueden emplearse estaquillas obtenidas a partir de los brotes que se desarrollan en la base
de esquejes de tallo cuando alcanzan un tamaño adecuado. En este caso, una vez
recolectados los esquejes lo más adecuado es someterlos a un tratamiento de agua caliente
(48 º C durante 6 minutos ó 43.5 ºC durante 20 minutos), debido que con la aplicación de
24
este método se pueden controlar nemátodos, plagas y enfermedades. Inmediatamente los
esquejes se mojan con agua fría para obtener un rápido enfriamiento y hacer más efectivo el
tratamiento. Se empaquetan de forma ordenada sujetándolos fuertemente utilizando para
ello un film plástico y se coloca aserrín limpio o material similar entre los esquejes. Los
extremos básales de los esquejes y de las estaquillas se sumergen en ácido indolbutírico
(IBA) para intensificar y promover el desarrollo de raíces. El enraizamiento normalmente
se lleva a cabo en invernadero y, preferiblemente, en bandejas de propagación, aunque
muchos cultivadores utilizan bancos, los cuales deben ser desinfectados constantemente,
con vapor o formol (preferiblemente con vapor), al terminar la temporada de propagación.
El tipo de sustrato ideal para enraizar debe ser poroso, pudiendo emplear perlita,
vermiculita, arena o mezclas de turba y arena, en relación 1:2, turba aserrín y arena o partes
iguales, etc. Al obtener esquejes enraizados se pretende fomentar el desarrollo de raíces
cortas, gruesas, con el medio de crecimiento adherido cuando se levantan para facilitar el
transporte del esqueje y garantizar raíces completas. A este sustrato puede añadírsele un
fertilizante de liberación controlada enriquecido con calcio, ya que éste es necesario para un
buen desarrolló y crecimiento de las raíces. El contenido total de sales disuelta en el agua o
suelo no afecta al enraizamiento esto por debajo de 15 meq/litro, pero en un alto porcentaje
del sodio (> 67 %) causará la raíz roja en los esquejes.
Los crisantemos no son específicos de ninguna temporada estos son adaptables a
cualquier época del año. Las plantas del crisantemo pueden ser cultivadas en cualquier
clase de suelo, pero ellos requieren un tiempo soleado con un incremento de temperatura
para un mejor desempeño y obtención de mejores botones florales. Cuando se cultivan
crisantemos en el mismo lugar de forma consecutiva el incremento de plagas en el suelo se
incrementa con lo cual debe recurrirse a la desinfección del suelo, ya sea por vapor, o con
un tratamiento químico consistente en la aplicación de un fumigante que controle la
mayoría de los patógenos del suelo o a patógenos específicos, tales como Verticillum
alboatrum. Antes de la desinfección del suelo, se retira el rastrojo del cultivo anterior o se
muele finamente y se incorpora al suelo con una cultivadora rotatoria.
25
Los crisantemos tienen un período largo para florecer dependiendo de la variedad o
especie que se cultive. La longitud del día es crítica para la iniciación y desarrollo floral la
cual es de 14.5 horas, basada en las horas de crepúsculo normal que son una hora más
largos que el período de sol a sol. Por encima de este valor, las plantas quedaran en estado
vegetativo, es decir, se inhibe la formación de yemas florales a favor de la excesiva
ramificación o formación foliar. Cuando se quieren obtener días largos se puede manipular
la longitud del día con la aplicación de luz artificial, a media noche, de modo que ningún
período nocturno sobrepase las seis horas. Pueden emplearse distintos tipos de lámparas,
que proporcionan distintos espectros luminosos, por lo que la intensidad luminosa requerida
es variable:
Existe una gran gama de lámparas que pueden suplementar las necesidades de
luminosidad. Las lámparas de mercurio a alta presión y las de sodio a baja presión, aunque
suponen un mayor coste de instalación, reducen los costes de funcionamiento, debido a un
menor consumo energético, e iluminan una amplia área. Se colocan a una separación de 5
metros y a 3 - 4 metros por encima del ápice de la planta. Con estas lámparas la
intensidad de luz requerida es de unos 200 lux con lo cual se garantiza la luminosidad
requerida por las plantas para promover un adecuado desarrollo de la planta y obtener
botones florales de calidad.
Las lámparas incandescentes se colocan con reflectores en líneas por encima de la
planta. Se puede emplear dos tipos de potencias diferentes: 100 Watios y 150 Watios,
siendo preferibles las de 150 Watios, debido que así se reduce el número de unidades a
colocar, y se puede aumentar el espacio para los trabajadores entre el suelo y las plantas.
En este caso la intensidad luminosa requerida es de 110 lux lo cual garantiza una adecuada
luminosidad para las plantas.
Las semillas o esquejes del crisantemo son sembradas en las áreas que las que se
experimentan lluvias bajas durante la estación lluviosa. Generalmente, los semilleros de
Crisantemo son trasplantados después de un mes de sembrados para ser enraizados. Pero a
veces, las semillas también pueden ser sembradas directamente in situ. Las plantas o
26
esquejes enraizados de crisantemo florecen después de tres meses de haber sido sembradas.
El crisantemo (Chrysanthemum morifolium Ramat), como especie para flor de corte se
encuentra entre los tres cultivos ornamentales mas importante a nivel mundial, con un
enorme valor económico y cultural. Las variedades comerciales se propagan
vegetativamente por esquejes y estaquillas o por medio de la técnica in vitro a partir de
meritemos para obtener plantas sanas (Modesto J., C. Et al 2004).
En Guatemala el cultivo de flor de corte en los últimos años se ha ido
incrementando tanto en unidad de área como en especies y variedades cultivadas
especialmente de crisantemo, debido que existen áreas que cuentan con condiciones
bioclimaticas favorables para el establecimiento de plantaciones. Entre estos lugares se
pueden mencionar a; San Pedro Sacatepéquez, San Juan Sacatepéquez, San José Pinula
municipios del Departamento de Guatemala. Santa Lucia Milpas Altas, San Miguel
Dueñas, Antigua Guatemala municipios del departamento de Sacatepéquez (Cardona N.,
E., A. 1991).
Además de su importancia ornamental el crisantemo posee compuestos
antimicrobianos como las fitoanticipinas y las fitoalexinas, compuestos como los
isoprenoides, identificándose al Pyrethrum, Tanacetum y Parthenium (Vásquez G. Et al
2003). Posee gran demanda dentro del mercado consumidor siendo una de las flores más
populares del mundo, juntamente con las rosas, claveles y gerberas (Farias M., F. Et al
2005). Como flor de corte existe diversidad de variantes de acuerdo al mercado
consumidor, existe tanto el estándar (un solo tallo) como los de ramillete (pompón y
spider), los cuales tienen una larga vida de postcosecha. La producción para flor de corte,
requiere de la provisión continua, en tiempo y forma de material inicial, de excelente
calidad fisiológica y sanitaria (Reid S., M. Et al 2004).
A partir del decenio de los ochenta el crisantemo se ha impuesto como una de las
flores más importantes en la floricultura con una demanda creciente en todos los mercados.
La actual demanda mundial de flores cortadas se concentra principalmente en tres regiones:
Europa Occidental, América del Norte y Japón. Europa representa el 70 % y Estados
27
Unidos el 21 % de la importación mundial de flores cortadas respectivamente. Le siguen a
Estados Unidos, Alemania y Reino Unido. También importan flores de corte Francia,
Japón y Holanda. Así el consumo de crisantemo va en aumento solo en Estados Unidos de
América para el año 1999 importo crisantemos pompom con un valor de US$ 70,597
miles representando un 12% del total de flor de corte, en Holanda las diversas variedades
de crisantemo fueron el segundo lugar en las ventas de las subastas durante el 2001 y en
España ocupo el tercer lugar, que le arrebató la posición a la rosa. (Montecinos B., P.
2003).
Los crisantemos cultivados tienen como origen el cruce entre el Dendranthema
indicum var. Procumbens del Norte de china y el Dendranthema zawadskii var. Latilobum
procedente del centro de China. El nombre actual es (Chrysanthemum morifolium Ramat
Híbridos) (Herreros D. 1995). Con lo cual existen diversos cultivares que pueden
emplearse tanto para flor de corte, como para plantas con flor en maceta (Cassia et al
2003). A pesar de existir diversidad de cultivares no existen parámetros en cuanto a su
cultivo existiendo una limitante en cuanto a estándares de selección, producción y
comercialización, que satisfagan la demanda del mercado mundial.
Con el objeto de identificar nuevas variedades o para establecer el origen de los
parientes cercanos de crisantemo se ha aplicado la técnica RAPDs, la cual ha revelado una
elevada diversidad entre las variedades con un nivel de similitud siempre menor del 80 por
ciento. Utilizando el análisis morfométrico de las hojas de crisantemo reveló diferencias
estadísticamente significativas entre variedades. (Aguiar S., R., B. Minami K. 1999).
En la multiplicación del crisantemo existen diversos métodos convencionales y el
material de propagación a utilizar se extrae de plantas que se mantienen en desarrollo
vegetativo, a los cuales se les aplica en su extremo basal una sustancia promotora del
enraizamiento antes de ser establecidos en sustratos ligeros con buen drenaje y aireación en
invernadero o cubiertas de plástico. El crisantemo comercialmente es propagado
asexualmente por esquejes obtenidos de plantas madres y enraizadas en camas de arena. La
propagación de plantas por medio de estacas es una práctica bastante utilizada en la
28
producción comercial de flores y plantas ornamentales. En el caso del crisantemo la
multiplicación se efectúa mediante estacas herbáceas de plantas madres que muchas veces
no son seleccionadas con lo cual se obtienen progenies poco desarrollados y enfermos.
Los sustratos más utilizados para el enraizamiento de estacas de crisantemo son
principalmente mezclados a base de turba con otros productos como perlitas, vermiculita y
arena. En diferentes países productores de crisantemo han establecido diferentes métodos
y sustratos para la multiplicación de crisantemo. En Brasil se emplea cáscara de arroz
carbonizada. En Cuba existen experiencias sobre la producción de plántulas de hortalizas
mediante la técnica de cepellones, sin embargo en flores de cortes existe poca información
al respecto en ambientes controlados, con alta humedad relativa, alta temperatura y baja
intensidad lumínica (Cardona N., E., A. 1991), teniendo el inconveniente que si no se parte
de material sano se facilita la aparición de enfermedades producidos por hongos, bacterias,
nemátodos y virus (Camargo R. et al 2000).
Debido a que es una de las plantas más importantes económicamente dentro del
sector ornamental, los principales países proveedores como Colombia, Ecuador la producen
comercialmente mediante técnicas de cultivo in vitro (Yacer A., et al 2000). La
producción de flores para corte de crisantemo requiere de la provisión continua, en tiempo
y forma, de material inicial de excelente calidad fisiológica y sanitaria. Los esquejes de
crisantemo (material inicial) provienen de plantas madres libres de infecciones sistémicas y
con una genética seleccionada por sus cualidades estéticas y productivas (Dole & Wilkins,
1999). Dichas cualidades, solo pueden mantenerse en el tiempo, mediante el cultivo de
plantas madres en instalaciones adecuadas y con cuidados rigurosos del estado sanitario.
No obstante, es necesario la renovación permanente del stock de plantas mediante su paso
por cultivo in vitro, debido al envejecimiento fisiológico de los clones, que se manifiesta en
una disminución en la producción de esquejes y en la pérdida de sensibilidad al
fotoperíodo. Esto último ocasiona que el cultivo de esquejes provenientes de clones
envejecidos florezca en condiciones no inductoras de día largo, con la consecuente pérdida
de calidad de la producción de flores. (Fides, 1990).
29
Debe tomarse en cuenta que si no existe un plan de manejo adecuado en cuanto a la
propagación vegetativa, fitosanidad, fertilidad, calidad de producción, manejo post cosecha.
La flor no alcanzara los estándares de calidad, por lo que es necesario tomar en cuenta
aspectos como fertilización, implementación de programas fitosanitarios, sistemas de riego
por goteo. El crisantemo es una de las pocas flores que se pueden regar por aspersión, ya
que generalmente el riego se interrumpe cuando se abren los botones florales. Los suelos se
deben mantener cerca de la capacidad de campo, ya que los crisantemos presentan una gran
área foliar y ocupan el suelo con sus raíces.
Los crisantemos son muy exigentes en nutrientes, especialmente, en nitrógeno y
potasio. Durante los dos primeros meses de crecimiento es muy importante mantener
niveles altos de nitrógeno para obtener flores y plantas de calidad, ya que si durante este
período se produce una deficiencia moderada, de este nutriente, no se logrará recuperar la
calidad de la flor que se haya perdido, incluso con aplicaciones posteriores de nitrógeno.
Además, durante los primeros 80 días las plantas crecen rápidamente y hay grandes
requerimientos de nitrógeno, los sistemas radiculares no están expandidos por todo el suelo
y la eficiencia en la recuperación de nitrógeno es baja. Sin embargo, la eficiencia aumenta
con el tiempo y durante los últimos 20 días solamente la inflorescencia crece rápidamente y
los nutrientes minerales se transportan desde las hojas.
En un ensayo sobre fertilización orgánica en crisantemo se empleo la turba rubia a
la que se añadió 10% de gallinaza de pollo de engorde con cama de aserrín de madera al
cultivo de crisantemo la cual mejoró la calidad en cuanto al número total de flores de una
manera extraordinaria. En pruebas realizadas en Brasil encontraron que una planta de
crisantemo del cultivar Susuki, extrajo 1600 mg de K, 269 mg de Calcio, 231 mg de P, 116
mg de Fe, 113 mg de Mg, 91 mg de S, 23 mg de Mn, 14 mg de Zn, y 0.79 mg de Cu, en un
periodo de crecimiento de 140 días, con lo cual demostraron la importancia de suplementar
las plantas con fertilizantes granulados que contenga formulas completas para obtener un
mejor desarrollo y flores de primera calidad (Gonzáles P., Bertsch F. 1988).
30
En cuanto a las plagas y enfermedades producidos por los microorganismos, la
producción de crisantemo se ve seriamente afectada por el ataque de hongos patógenos,
debido que requiere de grandes cantidades de fungicidas, lo cual incrementa los costos a
nivel económico y ecológico (Hodson E. Et al. 2002). Se pueden presentar problemas
como la aparición de contaminación de aguas subterráneas por metales pesados por huso
excesivo de fertilizantes (Saraiva da Costa et al 2004). Toxicidad por amonio excesivo de
N-NH4 y de N-NO3 (Bugarín et al 1998). Presencia de poblaciones de nemátodos que
afectan directamente al crisantemo como los del genero: Paratylenchus que es
considerado el género de mayor importancia por su abundancia y diseminación en la zonas
productoras de este cultivo, Aphelenchoides ritzema-bosi o A. fragariae (Crozzoli 1989).
Hongos de los géneros; Ascochyta (Mycosphaerella), Alternaria o Stemphylium, Botrytis
cinerea, Fusarium oxysporum, Erysiphe cichoracearum, Pythium, Verticillium, Rhizoctonia
solani. Bacterias como; Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas cichori. Virus como el;
viroide de la mancha clorótica del crisantemo (Chrysanthemum chlorotic mottle viroid),
Viroide del enanismo del crisantemo (Chrysanthemum stunt viroid) (Moorman W., G.
2001). La presencia de insectos dañinos como: la mosca blanca Bemisia argentifolii
(Modesto J., C. Et al 2004). De Aphis gossypii el cual presenta una amplia distribución
mundial que afecta a cultivos bajo invernadero de importancia económica como el
crisantemo, que afecta tanto en regiones de clima templado como tropical (Soglia M., C.
Et al 2003). A los problemas ocasionados por los microorganismos y de plagas se
presentan alternativas como el cultivo en hidroponía lo cual facilitaría el manejo adecuado
en cuanto a producción, incrementado densidades de población, y en el rendimiento hasta
de un 24% (Bugarín et al 1998). Además de la adquisición de esquejes y plantas de
cultivos certificados libres de patógenos (Moorman W., G. 2001).
Para la aplicación de la biotecnología moderna en un programa de mejoramiento es
indispensable contar con un sistema de regeneración in vitro eficiente. Para ello se
desarrollan protocolos que puedan ser reproducibles y efectivos, en cuanto a la obtención
de más brotes por explante.
31
La implementación de técnicas modernas de propagación como el huso de la
micropropagacion puede brindar plantas fieles al tipo y en grandes cantidades, a través de
la evaluación de sistemas de regeneración in vitro de plantas de crisantemo vía
organogenesis o embriogenesis somática. Además brinda la renovación del stock de
plantas madre mediante el cultivo in vitro proveniente de meristemas, el cual provoca el
rejuvenecimiento y limpieza sanitaria de las plántulas resultantes.
Una forma de evitar problemas fitosanitarios es la propagación de crisantemo
mediante cultivo in vitro de ápices meristemáticos. Dicha forma de propagación es eficiente
para recuperar clones libres de patógenos específicos, y conveniente para producir plantas
madre con una genética seleccionada por sus cualidades estéticas y productivas. La
regeneración de crisantemo por cultivo de tejidos en diferentes variedades, se ha logrado al
utilizar medios básales, diferentes reguladores del crecimiento y concentraciones, aditivos
como antioxidantes y otros. La organogénesis se desarrolla a partir de una gran variedad de
explantes como tallos (nodal e internodal), yemas axilares, hojas, ápices o meritemos
apicales, protoplastos, raíces, pedicelos y floretes. El cultivo de crisantemo mediante el
cultivo in vitro ha permitido inducir una gran variación somaclonal, y generalmente el tallo
es el que presenta mayor capacidad de regeneración (Hodson E. Et al. 2002).
Partiendo de segmentos nodales fueron cultivados en el medio MS con un 75% de
su concentración original, suplementado con 1.4 mg/Lt de BAP sin la presencia de ANA
fue obtenido una tasa de multiplicación de 2.45 brotes por explante (Chagas E., A. Et al
2004).
A partir de ápices de tallo cultivadas in vitro se obtuvieron plantas de crisantemo,
las cuales se trasladaron a invernadero con radiación solar reducida a 50% y humedad
relativa alta, bajo una cubierta cerrada de polietileno transparente e iluminación
incandescente de 100 watts por cuatro horas en las noches. La adaptación de las plantas fue
del 95% y el mayor crecimiento se logro en sustrato de broza.
32
A través de la organogenesis directa a partir de segmentos nodales se obtuvo
elongación y enraizamiento de crisantemo (Chrysanthemum morifolium Ramat) utilizando
el medio MS con la adición de 4.83 µM y BAP 4.44-µM, y a través de la organogenesis
indirecta con el huso del 2,4-D (2.26 µM) y el medio de cultivo MS se indujo la formación
de embriones somáticos partiendo de discos foliares de crisantemo (Chrysanthemum
morifolium Ramat ), el medio de cultivo utilizado en la germinación de los embriones fue
el Mum B sin reguladores (Hodson E. Et al. 2002).
Actualmente las variedades comerciales de crisantemos se propagan
vegetativamente por esquejes o estaquillas o empleando técnicas modernas como la
propagación in vitro. O a partir de meristemos para obtener plantas sanas principalmente
libres de virus. La organogenesis es un proceso que comprende el desarrollo de vástagos o
raíces directamente de los explantes o a partir de un callo desarrollado previamente
(proceso al cual se le llama regeneración indirecta). Murashige and Skoog 1962 describió
los factores relacionados con el explante (edad fisiológica y ontogénica, el tamaño y el
tejido u órgano del que es extraído) y con la planta madre (estado fisiológico) que depende
de la época del año en que se realiza el cultivo. Estos factores deben ser considerados para
la inducción exitosa de la organogénesis.
La regeneración de crisantemo por cultivo de tejidos en diferentes variedades, se
ha logrado al utilizar medios básales, diferentes reguladores de crecimiento y concentraciones,
aditivos como antioxidantes y otros. La organogénesis se desarrolla a partir de una gran
variedad de explantes como tallos (nodal e internodal), yemas axilares, hojas, ápices o
meristemos apicales, protoplastos, raíces, pedicelos y floretes. El empleo de esta tecnología
es de gran importancia para efectos de programas de mejoramiento, que tenga como
objetivo obtener plantas con nuevas características mediante ingeniería genética.
La regeneración indirecta de brotes adventicios vía callo se obtiene a partir de
tallo, pétalo y ápice, sin embargo, este tipo de regeneración puede resultar en variantes
somaclonales y la formación de quimeras, mientras que la regeneración directa de hoja y
tallo puede eliminar tales efectos. El cultivo de Chrysanthemum morifolium, ha permitido
33
inducir una gran variación somaclonal. Generalmente el tallo ha mostrado mayor
capacidad de regeneración que la hoja.
Utilizando secciones de meritemos de las variedades de crisantemo multiflora
(Dendranthema x grandiflorum Kitam) “Sumy Lemans”, “Relinda blanca”, “Lilac
Remco”, “Redok”, “Breeze”, “Bari” y “Require” estudiadas se colocaron en tubos de
cultivo de 10 x 1,2 cm conteniendo 10 ml de medio basal de Murashige & Skoog (1962)
sin reguladores de crecimiento, mas 3% de sacarosa y 7 grm/Lts de agar. El pH del medio
fue ajustado a 5.7- 5.8. Los tubos fueron incubados en una cámara de incubación a una
temperatura de 22 1º C, con una intensidad luminosa de 40μmol.m-2
.s-1
y un fotoperíodo
de 16 horas, al cabo de 40 días las plántulas desarrolladas se cortaron en secciones nodales
y se colocaron en frascos de 250 ml, con 30 ml del mismo medio de cultivo estéril, a
razón de 5 explantes por frasco, con la finalidad de multiplicarlas. Las plántulas fueron
subcultivadas 4 veces hasta alcanzar el número de plántulas deseadas (Avila et al. 1998).
Aplicando la biotecnología se desarrollo un protocolo en cuanto a la obtención de
más brotes por explante, de regeneración por organogenesis directa para dos variedades de
crisantemo Dendrathema X Grandiflorum kitam Indianápolis y Texana, se evaluó el efecto
del tipo de explante (hoja o tallo), distintos niveles y combinaciones de las auxinas acido
Naftalanacetico (ANA) y acido indolacetico (AIA) y la citocinina Benzilaminopurina
(BAP). La variedad Indianápolis mostró un mayor porcentaje de brotes por explante en
medio de Murashige y Skoog (MS) con dos miligramos por litro de BAP y un miligramo
por litro de AIA. En cambio la variedad Texana requirió 3 miligramos por litro de BAP y
1.8 litros de AIA. En ambas variedades el alargamiento de los brotes y la inducción de
raíces se obtuvieron en el medio MS al 100 y 50% de sus sales y sin hormonas (Sandoval
V., et al 2007).
Se probo la regeneración in vitro de once cultivares de crisantemo (Dendranthema
grandiflora tezvelev) a partir de meritemos apicales. Con el objetivo de inducir la
regeneración de plántulas in vitro de 11 cultivares regionales de crisantemo. Se sembraron
meristemos apicales de cada variedad en el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962, más
3 % de sacarosa, 6,5 g/l de agar y un pH de 5,7-5,8. Se evaluaron doce combinaciones
34
posibles producto de cuatro dosis de ana (0,01; 0,02; 0,03 y 0,04 mg/l) por tres dosis de K
(0,5; 1,0 y 1,5 mg/l). La tasa de multiplicación varió de 1:8 hasta 1:29 dependiendo del
cultivar.
La fase de aclimatación ex vitro para el crisantemo es una de las mas criticas, se
debe utilizar como sustrato peat moss combinado con alta humedad relativa y la exposición
de las plantas a dos horas diarias de luz (durante la noche) por tres semanas (21 días)
permitió que las plantas se desarrollaran adecuadamente hasta una altura de 12
centímetros cuando se transfirieron a macetas. (Contreras V.C, Et al 2009).
35
PARTE III
III.1 RESULTADOS
III.1.1 EMBRIOGENESIS DIRECTA
III.1.1.1 Crisantemo variedad shasta
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad shasta
Cuadro 1. Resumen variedad shasta fase de establecimiento a nivel de laboratorio
Variables de respuesta 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias 30 días
Oxidación 0% 0% 0% 0% 0%
Contaminación 5 % 5 % 5% 5% 5%
Crecimiento 0.6 Cm 2.5 Cm 4.8 Cm 6.0 Cm 7.3 Cm
Numero de brotes por explante 1 1 1 1
Altura de la planta -------- 2.5Cm ------ ------ 4.8Cm
Enraizamiento de la planta ------- ------ 40% 100 % -------- Fuente FODECYT 60-2006
Figura 1. Plantas de crisantemo variedad shasta obtenidas por embriogenesis directa
Fuente FODECYT 60-2006
b. Fase de invernadero crisantemo variedad shasta
Cuadro 2. Resumen variedad shasta fase de establecimiento a nivel de invernadero
Variables de respuesta inicio media Etapa final
Sobrevivencia 100% 100% 100%
Daños 0 % 0 % 0%
Tiempo de endurecimiento ----------- --------- 25 días Fuente FODECYT 60-2006
36
Figura 2. a Aclimatación de plantas de crisantemo variedad shasta obtenidas por embriogenesis directa
b Pilón de crisantemo variedad shasta proveniente de laboratorio.
a b
Fuente FODECYT 60-2006
c. Fase de campo crisantemo variedad shasta
Cuadro 3 Resumen variedad shasta fase de establecimiento a nivel de campo
Variables de respuesta Inicio 15 días 60 media Etapa final 85 días
Sobrevivencia 100% 100% 97% 97%
Daños por insectos 0% 0% 0% 0%
Tiempo en floración ------ -------- ---------- 85 días
Rendimiento ------ -------- ---------- 100%
Fitosanidad 100% 100% 97% 97%
Altura 6.0 cm. 12.0 cm. 25.0 cm. 38.8 cm.
Biomasa total ------ ------- ---------- 158.7 grms
Calidad de la flor ------ ------- ---------- Normal Fuente FODECYT 60-2006
El cuadro 3 nos muestra que se obtuvo un 97 % de sobrevivencia en las plantas
obtenidas por embriogenesis directa de la variedad shasta establecidas a nivel de campo
con un 97 % de fitosanidad, y el tiempo de floraron fue de 85 días con un rendimiento del
100 % y una altura promedio de planta de 38.8 centímetros con una calidad de flor normal.
37
Figura 3. Plantas de crisantemo variedad shasta obtenidas por embriogenesis directa en
el inicio de la floración
Fuente FODECYT 60-2006
III.1.1.2 Crisantemo variedad estandar
a. Fase de laboratorio variedad estándar
Cuadro 4.Resumen crisantemo variedad estándar fase de establecimiento a
nivel de laboratorio
Variables de respuesta 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias 30 días
Oxidación 0 0 0 0 0
Contaminación 2% 2% 2% 2% 2%
Crecimiento 0.4 Cm 1.5 Cm 3.5 Cm 5.2 Cm 6.8Cm
Numero de brotes por explante 1 1 1 1 --------
Altura de la planta ------- 1.5Cm -------- ------- 5.3Cm
Enraizamiento de la planta 0 % 30 % 60% 94% -------- Fuente FODECYT 60-2006
Figura. 4 Yema axilar de crisantemo variedad estandard, presentando un
sistema radicular bien definido.
Fuente FODECYT 60-2006
38
b. Fase de invernadero crisantemo variedad estandar
Cuadro 5 Resumen crisantemo variedad estandard fase de establecimiento a nivel de
invernadero
Variables de respuesta Inicio Media Etapa final
Sobrevivencia 100 % 100% 100 %
Daños por insectos 0 % 0% 0 %
Tiempo de endurecimiento ------------- ----------- 30 días Fuente FODECYT 60-2006
Figura 5. Plantas de crisantemo variedad estándar, obtenidas por organogenesis
directa, debidamente aclimatadas, listas para ser trasladadas a campo definitivo.
Fuente FODECYT 60-2006
c. Fase de campo crisantemo variedad estandar
Cuadro 6. Resumen crisantemo variedad estandard fase de establecimiento a nivel de campo
Variables de respuesta Inicio % Media % Etapa final %
Sobrevivencia 100 100 100
Daños 0 0 0
Tiempo en floración ------- -------- 80 días
Rendimiento ------- -------- 100
Fitosanidad 100 100 100
Altura 6 cm. 12.5 35.6 cm.
Biomasa total ------ ------- 165,7 grms
Calidad de la flor ------- ------- Normal Fuente FODECYT 60-2006
El cuadro 6 nos muestra que se obtuvo un 100 % de sobrevivencia en las plantas
obtenidas por embriogenesis directa de la variedad estándar establecidas a nivel de campo,
39
con un 100 % de fitosanidad, y el tiempo de floraron fue de 80 días con un rendimiento del
100 % y una altura promedio de planta de 35.6 centímetros con una calidad de flor normal.
Figura 6. Plantas de crisantemo variedad estandard 72 días después de la siembra.
Fuente FODECYT 60-2006
III.1.1.3 Crisantemo variedad polar
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad polar
Cuadro7. Resumen crisantemo variedad polar fase de establecimiento a nivel de laboratorio
Variables de respuesta 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias 30 días
Oxidación 0 0 0 0 0
Contaminación 2% 3% 3% 3% 3%
Germinación de embriones 0% 0% 10% 14% 16%
Crecimiento 0.3 Cm 0.8 Cm 1.8Cm 2.5Cm 4.8Cm
Numero de brotes por explante 1 1 1 1 1
Altura de la planta ---------- 0.8 Cm ------ ------- 4.0 Cm
Enraizamiento de la planta 0% 0% 15 % 34% 60% Fuente FODECYT 60-2006
Figura 7. Yemas axilares de crisantemo variedad polar, presentando indicios de formación de
raíces, en los primeros cinco días de inoculado el explante.
Fuente FODECYT 60-2006
40
b. Fase de invernadero crisantemo variedad polar
Cuadro 8. Resumen crisantemo variedad polar fase de establecimiento a nivel de invernadero
Variables de respuesta Inicio Media Etapa final
Sobrevivencia 100% 100% 100%
Daños 0% 0% 0%
Tiempo de endurecimiento ------------ --------- 25 días Fuente FODECYT 60-2006
Figura 8. Aclimatación de plantas de crisantemo variedad polar obtenidas por
embriogenesis directa
Fuente FODECYT 60-2006
c. Fase de campo crisantemo variedad polar
Cuadro 9. Resumen crisantemo variedad polar fase de establecimiento a nivel de campo
Variables de respuesta Inicio % Media % Etapa final %
Sobrevivencia 100 100 100
Daños 0 0 0
Tiempo en floración -------- ------- 98 días
Rendimiento -------- ------- 100
Fitosanidad 100 98 95
Altura -------- --------- 34. 6 cm
Biomasa total -------- -------- 158 grm
Calidad de la flor -------- --------- Normal Fuente FODECYT 60-2006
Se obtuvo un 100 % de sobrevivencia en las plantas obtenidas por embriogenesis
directa de la variedad polar establecidas a nivel de campo con un 95% de fitosanidad, y el
tiempo de floraron fue de 98 días con un rendimiento del 100 % y una altura promedio de
planta de 34.6 centímetros con una calidad de flor normal.
41
Figura 9. Plantas de crisantemo variedad polar 45 días después
de la siembra.
Fuente FODECYT 60-2006
III.1.2 EMBRIOGENESIS INDIRECTA
III.1.2.1 Crisantemo variedad shasta
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad shasta
Cuadro 10. Resumen crisantemo variedad shasta fase de establecimiento a nivel de laboratorio
Variables de respuesta 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias 30 días
Oxidación 0 % 0% 0% 0% 0%
Contaminación 0% 0% 0% 0% 0%
Germinación de embriones 0% 0% 40% 70% 95%
Crecimiento 0.7Cm 1.2Cm 3.5Cm 5.6Cm 7.8Cm
Numero de brotes por explante 1 1 1 1 1
Altura de la planta ------ 1.2Cm -------- ------- 6.6Cm
Enraizamiento de la planta ------- 34% 45% 60% 90% Fuente FODECYT 60-2006
Fig 10. Planta de crisantemo obtenida por embriogenesis
indirecta variedad Shasta
Fuente FODECYT 60-2006
42
b. Fase de invernadero crisantemo variedad shasta
Cuadro 11. Resumen crisantemo variedad shasta fase de establecimiento a nivel de
invernadero
Variables de respuesta Inicio Media Etapa final
Sobrevivencia 100% 100% 100%
Daños 0% 0% 0%
Tiempo de endurecimiento ---------- -------- 20 días Fuente FODECYT 60-2006
Fig 11. Aclimatación de plantas de crisantemo variedad shasta obtenidas por
embriogenesis indirecta
Fuente FODECYT 60-2006
c. Fase de campo crisantemo variedad shasta
Cuadro 12. Resumen crisantemo variedad shasta fase de establecimiento a nivel de campo
Variables de respuesta Inicio % 15 dias % 60 media % Etapa final 90 dias %
Sobrevivencia 100 % 100% 100% 100%
Daños 0% 0% 0% 0%
Tiempo en floración --------- ------------ -------- 90 días
Rendimiento --------- ----------- -------- 100
Fitosanidad 100 % 100 % 96 % 96 % sanidad
Altura 8.33 cm 10.67 cm 23.00 cm 34.33 cm
Biomasa total ---------- ------------ ------- 153.33 grms
Calidad de la flor ---------- ------------ -------- Normal Fuente FODECYT 60-2006
La variedad shasta obtenida por embriogenesis indirecta presento un 100 % de
sobrevivencia, no existieron daños ocasionados por insectos u hongos, y el tiempo de
floración fue de 90 dias, con un 96 % de fitosanidad de las plantas con una media de altura
de tallo de 34.33 centímetros.
43
Figura 12. Plantas de crisantemo variedad shasta establecidas a nivel de campo
obtenidas por embriogenesis indirecta
Fuente FODECYT 60-2006
III.1.2.2 Crisantemo variedad estándar
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad estandar
Cuadro 13. Resumen crisantemo variedad estándar fase de establecimiento a nivel de
laboratorio
Variables de respuesta 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias 30 días
Oxidación 0 0 0 0 0
Contaminación 4% 4% 4% 4% 4%
Germinación de embriones 0% 0% 0% 40% 95%
Crecimiento 0.5Cm 1.2Cm 2.8 Cm 4.2Cm 6.6Cm
Numero de brotes por explante 1 1 1 1 1
Altura de la planta 1.2Cm ------ ------- 5.4Cm
Enraizamiento de la planta 0% 0% 35% 55% 88% Fuente FODECYT 60-2006
Figura 13. Planta de crisantemo variedad estándar
obtenida por organogenesis indirecta
Fuente FODECYT 60-2006
44
b. Fase de invernadero crisantemo variedad estandar
Cuadro 14. Resumen crisantemo variedad estándar fase de establecimiento a nivel de
invernadero
Fuente FODECYT 60-2006
fig. 14 Plantas de crisantemo obtenidas por organogenesis indirecta variedad estándar,
aclimatadas en invernadero
Fuente FODECYT 60-2006
c. Fase de campo crisantemo variedad estandar
Cuadro 15. Resumen crisantemo variedad estandar fase de establecimiento a nivel de campo
Variables de respuesta Inicio Media Etapa final 72 dias
Sobrevivencia 97 % 97 % 97 %
Daños 3 % 3 % 3 %
Tiempo en floración ----------- --------- 72 dias
Rendimiento ----------- --------- 100%
Fitosanidad 100% 100% 100 %
Altura 5 cm 14.3 30 cm
Biomasa total ------------ --------- 160.4 grms
Calidad de la flor ------------ ---------- Normal Fuente FODECYT 60-2006
Para la variedad estándar se obtuvo un 97 % de sobrevivencia de las plantas
mientras que daño de plantas por hongos e insectos un 3 % y el tiempo de floración fue de
Variables de respuesta Inicio Media Etapa final
Sobrevivenica 100 % 100% 100 %
Daños por insectos 0 % 0% 0 %
Tiempo de endurecimiento ------------- ----------- 25 días
45
72 dias después de trasplantadas al campo, con una media de altura de tallo de 30
centímetros.
Figura 15. Plantas de crisantemo variedad estándar establecidas a nivel de campo,
obtenidas por embriogenesis indirecta.
Fuente FODECYT 60-2006
III.1.2.3 Crisantemo variedad polar
a. Fase de laboratorio crisantemo variedad polar
Cuadro 16. Resumen crisantemo variedad polar fase de establecimiento a nivel de laboratorio
Variables de respuesta 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias 30 días
Oxidación 0% 0% 0% 0% 0%
Contaminación 0% 0% 0% 0% 0%
Germinación de embriones 0% 0% 10% 14% 16%
Crecimiento 0.4Cm 1.2Cm 2.6Cm 4.2Cm 7.8Cm
Numero de brotes por explante 1 1 1 1 1
Altura de la planta ------- 1.2Cm ------- ------- 6.6Cm
Enraizamiento de la planta ------- ------- 28% 60% 75% Fuente FODECYT 60-2006
Figura 16. Planta de crisantemo variedad polar obtenida por embriogenesis indirecta
Fuente FODECYT 60-2006
46
b. Fase de invernadero crisantemo variedad polar
Cuadro 17. Resumen crisantemo variedad polar fase de establecimiento a nivel de invernadero
Variables de respuesta Inicio Media Etapa final
Sobrevivencia 100% 100% 100%
Daños 0% 0% 0%
Tiempo de endurecimiento ------------ --------- 30 días Fuente FODECYT 60-2006
Figura 17. Plantas de crisantemo de la variedad polar, mostrando el desarrollo
y crecimiento a los 8 días después de trasplantadas en el invernadero.
Fuente FODECYT 60-2006
c. Fase de campo crisantemo variedad polar
Cuadro 18. Resumen crisantemo variedad polar fase de establecimiento a nivel de campo
Variables de respuesta Inicio % Media % Etapa final %
Sobrevivencia 100 97 97
Daños por insectos 0 3 3
Tiempo en floración --------- -------- 90 dias
Rendimiento --------- -------- 100
Fitosanidad 100 100 90
Altura --------- --------- 36 cm
Biomasa total ---------- --------- 160 grm
Calidad de la flor ---------- --------- Normal Fuente FODECYT 60-2006
La sobrevivencia de las plantas para la variedad polar fue del 97 % donde el daño
por insectos no influyo significativamente obteniéndose un 3 % con un rendimiento del 100
47
%, mientras que el tiempo en la cual las plantas florearon fue de 90 días, con una altura de
planta de 36 centímetros.
Figura 18. Establecimiento a nivel de campo de plantas de crisantemo variedad polar
obtenidas por embriogenesis indirecta
Fuente FODECYT 60-2006
III.1.3 Forma tradicional
a. Fase de campo crisantemo variedad shasta
Cuadro 19. Crisantemo variedad shasta establecida de forma tradicional
Variables de respuesta Inicio 15 días 60 días media Etapa final 60 días
Sobrevivencia 100% 90 % 85% 60%
Daños 5% 12% 25% 40%
Tiempo en floración ----- -------- ---------- 110 dias
Rendimiento ----- -------- ---------- 80%
Fitosanidad 10% 15% 30 60%
Altura 8.0Cm 22.0Cm 32.0Cm 40 cm
Biomasa total ------ ---------- --------- 160 grm
Calidad de la flor -------- --------- --------- Regular Fuente FODECYT 60-2006
El cuadro 19 muestra que la variedad shasta propagada de forma tradicional se
obtiene un 60% de sobreviviencia con un 40% de daños, mecánicos, insectos, hongos, y por
toxicidad de algunos elementos por el huso excesivo de fungicidas.
48
b. Fase de campo crisantemo variedad estándar
Cuadro 20. Crisantemo variedad estándar establecida de forma tradicional
Variables de respuesta Inicio 15 días 60 media Etapa final 120 días
Sobrevivencia 100% 75% 75% 75%
Daños 8% 12% 18% 25%
Tiempo en floración -------- ---------- ---------- 120 dias
Rendimiento ------- ---------- ---------- 85 %
Fitosanidad 10 20 40% 60%
Altura 10Cm 22Cm 35Cm 55 cm
Biomasa total --------- -------- --------- 170 grm
Calidad de la flor -------- -------- --------- Regular Fuente FODECYT 60-2006
El cuadro 20 muestra que la variedad estándar propagada de forma tradicional por
los floricultores se obtiene un 75 % de sobreviviencia con un 25 % de daños ocasiones por
hongos, insectos, así como por el huso excesivo de fungicidas e insecticidas los cuales
causan fototoxicidad de elementes en las plantas. Y el tiempo en el cual las plantas
formaron botones flores fue de 120 días, obteniéndose un rendimiento del 85%, con una
calidad de flor regular.
c. Fase de campo crisantemo variedad polar
Cuadro 21. crisantemo variedad polar establecida de forma tradicional
Variables de respuesta Inicio 15 días 60 media Etapa final 90 días
Sobrevivencia 100% 80% 80% 75%
Daños 3% 12% 16% 20%
Tiempo en floración -------- --------- -------- 115 dias
Rendimiento -------- --------- -------- 90%
Fitosanidad 20% 30% 45% 75%
Altura 8Cm 18Cm 35Cm 50 cm
Biomasa total -------- -------- --------- 140 grm
Calidad de la flor -------- -------- ---------- Buena Fuente FODECYT 60-2006
El cuadro 21 muestra que la variedad polar propagada de forma tradicional por los
floricultores, en el cual obtienen un 75 % de sobreviviencia con un 20 % de daños
ocasiones por hongos, insectos, así como por el huso excesivo de fungicidas e insecticidas
49
los cuales causan fototoxicidad de elementes en las plantas. Y el tiempo en el cual las
plantas formaron botones flores fue de 115 días, obteniéndose un rendimiento del 90%, con
una buena calidad de flor.
Figura. 19 a Esquejes utilizados en la propagación tradicional del crisantemo
b Siembra de los esquejes enraizados en campo definitivo-
a b
Fuente FODECYT 60-2006
50
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
III.2. 1 Crisantemo variedad shasta fase de laboratorio
Al establecer la variedad Shasta a nivel de laboratorio se observo que no existió
oxidación de los explantes, la contaminación se observo en un 5 %, obteniéndose un buen
crecimiento de las vitroplantulas. A los treinta días de sembrados los explantes en los tubos
de ensayo se obtuvo una altura promedio de 4.8 centímetros por planta. El enraizamiento
se observo en un cien por ciento con lo cual se observo que la variedad responde al
establecimiento in vitro.
III .2.2 Crisantemo variedad shasta fase de campo
Los resultados nos muestran que existe diferencia de propagación de las plantas
obtenida por laboratorio de cultivo de tejidos y de la forma de propagación tradicional
empleada por los floricultores, Por el método de embriogenesis indirecta, se obtuvo un
100 % de sobrevivencia de las plantas con un tiempo de floración de 110 dias, con una
altura de tallo de 34.33 centímetros en el cual se obtuvo un 96% de fitosanidad de las
plantas, con lo cual por este método se obtuvieron plantas precoses en cuanto a la floración.
Obteniéndose flores de buena aceptación para la comercialización del mercado local, por su
fitosanidad,
Sin embargo al comparar los resultados anteriores con el método tradicional
podemos observar que los resultados son mejores al emplear técnicas de propagación de
cultivos de tejidos debido que se obtienen plantas sanas las cuales se reflejan en la
sobrevivencia de las plantas y en el rendimiento
las plantas provenientes de laboratorio por el método de embriogenesis indirecta
presentan un mayor porcentaje de sobreviviencia para la variedad shasta se obtuvo un 100
% para la variedad estándar un 97 % y para la variedad polar el porcentaje de
sobreviviencia fue de un 97 %en cuanto al daño por enfermedades y daños por insectos,
además el tiempo de floración en algunas plantas se observo que se acorta debido que un
promedio normal es de 90 dias y plantas provenientes de laboratorio por organogenesis
51
directa florearon a partir de los 85 días, lo cual favorece a la producción cuanto al
porcentaje.
III.2. 3 Crisantemo variedad estándar fase de laboratorio
La oxidación no afecto a los explantes de crisantemo de la variedad Estandard. La
contaminación se observo en un 4%. Obteniéndose un 40% de germinación de los
embriones a los veinte días de inoculados en los medios de cultivo. A los 30 días se obtuvo
la mayoría de germinación de embriones con un 95% y la altura optima de la planta se
alcanzo a los 30 días con una longitud de 6.6 Cm, obteniéndose un 88% de enraizamiento
de las plantas a los 30 días.
III .2.4 Crisantemo variedad estandar fase de campo
En la fase de campo para la variedad Estandard se obtuvo un 100 % de
sobrevivencia en las plantas obtenidas por embriogenesis directa con un 100 % de
fitosanidad, y el tiempo de floraron fue de 80 dias con un rendimiento del 100 % y una
altura promedio de planta de 35.6 centímetros con una calidad de flor normal. Mientras que
por el método de embriogenesis indirecta se obtuvo un 97 % de sobrevivencia de las
plantas mientras que daño de plantas por hongos e insectos un 3 % y el tiempo de floración
fue de 72 dias después de trasplantadas al campo, con una media de altura de tallo de 30
centímetros. Para la forma tradicional de propagación se observa que existe una gran
diferencia, debido que se obtuvo un 75 % de sobreviviencia con un 25 % de daños
ocasiones por hongos, insectos, así como por el huso excesivo de fungicidas e insecticidas
los cuales causan fototoxicidad de elementes en las plantas. Y el tiempo en el cual las
plantas formaron botones flores fue de 120 días, obteniéndose un rendimiento del 85%, con
una calidad de flor regular. Con lo cual se observa que se necesita mas tiempo para obtener
flor existiendo perdidas por el ataque de insectos y enfermedades ocasionadas por hongos y
bacterias esto por utilizar material contaminado o suelo infectado por hongos o bacterias.
52
III.2. 5 Crisantemo variedad polar fase de laboratorio
La oxidación ni la contaminación se observo en los explantes de la variedad Polar.
La cantidad de embriones germinados fue muy bajo y a los 30 días se observo únicamente
un 16 %, el crecimiento de la planta alcanzo 6.6 centímetros con un 75% de plantas
enrizadas lo cual nos indica que en termino de 30 días los explantes responden
adecuadamente en la formación de plantas.
III.2. 6 Crisantemo variedad polar fase de campo
Plantas provenientes por el método de embriogenesis directa establecidas en el
campo se obtuvo un 100 % de sobrevivencia, con un 95% de fitosanidad, y el tiempo de
floración fue de 98 dias con un rendimiento del 100 % y una altura promedio de planta de
34.6 centímetros con una calidad de flor normal. Mientras que la sobreviviencia de las
plantas obtenidas por embriogenesis indirecta fue del 97 % donde el daño por insectos no
influyo significativamente obteniéndose un 3 % con un rendimiento del 100 %, mientras
que el tiempo en la cual las plantas florearon fue de 90 días, con una altura de planta de 36
centímetros. De acuerdo a los datos obtenidos de la variedad polar propagada por la forma
tradicional por los floricultores, se obtiene un 75 % de sobreviviencia con un 20 % de
daños ocasiones por hongos, insectos, así como por el huso excesivo de fungicidas e
insecticidas los cuales causan fototoxicidad de elementes en las plantas. Y el tiempo en el
cual las plantas formaron botones flores fue de 115 días, obteniéndose un rendimiento del
90%, con una buena calidad de flor. Con lo cual se demuestra que la existencia de material
contaminado y propagado posteriormente influye directamente sobre el rendimiento y
calidad de la flor, repercutiendo directamente en los costos de producción.
53
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES
V.1.2 La tasa regenerativa de propagación de las variedad Shasta, Estandard y Polar
obtenidas por organogenesis directa e indirecta es del 100 %. Difiriendo de las
tasa de propagación obtenidas de la forma tradicional la cual oscila entre un 80 %.
V.1.1 En la adaptación y endurecimiento de la planta se obtiene un 100 % de
sobrevivencia, a nivel de invernadero como en el campo definitivo.
V.1.3 El 100% de las plantas de la variedad Shasta, Estandard y Polar evaluadas son
resistentes a enfermedades prevenientes de laboratorio las cuales presentan
cierta precocidad en cuanto a floración.
V.1.4 Es posible obtener plantas de crisantemo libres de microorganismos que afecten a la
planta, mediante el saneamiento y selección de clones prometedores in vitro.
V.1.5 La utilización de plantas de crisantemo provenientes de cultivos in vitro reducen los
costos de inversión en plaguicidas debido a la sanidad y precocidad de cultivo que
estas presentan.
V.1.6 La multiplicación in vitro es una alternativa de propagación para diversos cultivares
de crisantemo (Chrysanthemum morifolium Ramat) que garantiza la sanidad de las
plantas, fidelidad a las características genotípicas y fenotípicas, mayores tasas de
multiplicación respecto a las metodologías de propagación convencionales. Por lo
tanto, es una alternativa viable para la modernización y mejoramiento de la
competitividad en el cultivo de diversos cultivares de crisantemo.
Por lo tanto la Hipótesis se acepta
54
V. 3 RECOMENDACIONES
V.2.1 Tecnificar el cultivo del crisantemo a nivel de campo, partiendo de plantas de buena
calidad, libres de enfermedades, par obtener máximos rendimientos.
V.2.2 Utilizar alternativas y métodos de cultivo como el empleo de la hidroponía
utilizando plantas libres de microorganismos y de calidad.
V.2.3 Utilizar sistemas de riego modernos como micro aspersores o riego por goteo.
V.2.4 Incorporar al sistema productivo de los productores de San Juan Sacatepequez y San
Pedro Sacatepequez nuevas variedades de crisantemos que presenten variaciones en
color forma y porte de la planta a las tradicionales existentes como la shasta, polar y
estándar con el fin de satisfacer la demanda de nuevos productos a los
consumidores.
55
IV. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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56
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13. Farias M., F. Saad C., J. (2005) Crescimento e qualidade de crisântemo cultivado em
vaso sob ambiente protegido. Horticultura Brasileña Vol. 23 No. 3.
14. Fides. (1990) Fides Mum manual for all year round chrysanthemums. Ed. Fides
Holland BV, De Lier.
15. Gómez O., V. Aray M. Yira A. (2001) Inducción de mutantes para el color de la flor
en crisantemos (Dendranthema grandiflora (Ram.) Tzvelev) mediante
radiaciones gamma. UDO Agrícola 1, No. 1 56-63.
16. Gonzáles P., Bertsch F. (1988) Absorción de nutrimentos por el crisantemo
(Chrysanthemum morifolium Ramat.) var. Super white durante su ciclo de vida en
invernadero. Agronomía costarricense 13 (1):51-61.
17. Herreros D. L. M. (1995) Cultivo del crisantemo. Instituto Canario de Investigaciones
Agrarias, cuaderno de divulgaciones 3/95 No. 8 P. 31.
18. Hodson E. Cancino G., Forefro A. (2002) Regeneración in vitro de tres variedades de
Crisantemo (Dendranthema grandiflora) vía organogénesis y embriogénesis Somática unidad de biotecnología vegetal. Servicio nacional de aprendizaje de
Colombia.
19. Modesto J., C. Fenille R., C. (2004) Controle químico da mosca-branca (bemisia
argentifolii hemiptera: aleyrodidade) em crisântemo (Dendranthema morifolium)
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20. Montecinos B., P. (2003) Estudio de mercado para flores de corte. Cámara de
comercio de Santiago de Chile. Universidad de Santiago de Chile.
21. Moorman W., G. (2001) Enfermedades del crisantemo (Chrysanthemum diseases).
Departamento de fitopatología Buckhout Laboratory University Park. The
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22. Murashige, T., Skoog, F. (1962) A revised Medium for rapid Growth and Bioassays
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23. Pierik, R.L. (1990) Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ed.3 Cap. 12. mundi
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24. Reid S., M. Dodge L. (2004) Crisantemo, recomendaciones para mantener la calidad
post cosecha. Postharves technology. Department of Environmental
Horticulture, University of California.
25. Sandoval V., et al (2007) Regeneración directa in vitro del crisantemo Dendrathema
X Grandiflorum kitam a partir de segmentos de tallos. Universidad autónoma de
Chapingo Mexico 24(3):219-227, 2008.
26. Saraiva da Costa, A., C. Ferreira, L., Sandir D., O. Goncalves A., M. Grillo, Abeche,
R. A. (2004) Acumulo de Zn, Fe e Pb em plantas de crisantemo apos cultivo
em substrato contendo doses de residuo industrial de galvanoplastia. Acta
Scientiarum Agronomy, Maringa, volumen 26 No. 4:407-411.
27. Soglia M., C. Paes B., H., V. Rodríguez M., M., S. Sampaio. M., V. (2003) Fecundidade e longevidade de Aphis gossypii Glover, 1877 (Hemiptera,
Aphididae) em diferentes temperaturas e cultivares comerciais de crisantemo
(Dendranthema grandiflora Tzvelev) Rev. Bras. Entomol. Vol. 47 No.
28. Vásquez G., L., M. Lozoya G., E. López P., M. (2003) Compuesto antifúngico en
pared Celular de crisantemo (Dendranthema grandiflora Tzvelev.) Facultad
de Ciencias Agrícolas, UAEM. CINVESTAV-Unidad Irapuato.
29. Yacer A., E. Revilla B., M. (2000) eestudió de la variabilidad genética originada en el
cultivo in vitro de crisantemo. Universidad de Oviedo, Área de Fisiología
vegetal.
58
IV.4 ANEXOS
59
IV. 4 ANEXOS
IV.4.1 Boletas empleadas en las distintas fases de la investigación.
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
BOLETA ELABORACION DE MEDIOS
No. o clave de boleta: 1
Investigación: Enraizamiento de crisantemo variedad shasta
Medio basal utilizado: MS
Concentración medio basal: 100%
Persona encargada:
Volumen preparado: 500 ml
Medio reconocido por la clave: Cris
Recipiente utilizado: Tubos de ensayo
Revisado por: Alfredo Cabrera Morales
No.
COMPONENTES DE
SOLUCIONES
SOLUCION
CONCENTRADA
CANTIDAD AGREGAR NOTAS
ML ul %
1 Macronutrientes 10 X 50
2 Micronutrientes A 1000X 500
3 Micronutrientes B 5000 X 100
4 KI 1000 X 500
5 CaCl2 . 2H2O 100 X 5
6 Fe 100 X 5
7 Myo inositol 100 X 5
8 Vitaminas 100 X 5
9 IBA
10 ANA 2.5 Mg/Lt 5
11 2,4-D
12 2,4, 5T
13 MCPA
14 Picloram
15 BAP
16 Kinetina
17 GA3 0.05 Mg/Lt 100
18 Acido Cítrico
19 Acido ascórbico
20 PVP
21 Carbon activado
22 Sucrosa 30 Gr/Lt
23 Agar 7%
24 PH. 5.7
Fuente: FODECYT 60-2006
60
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
BOLETA ELABORACION DE MEDIOS
No. o clave de boleta: 2
Investigación: Enraizamiento de crisantemo variedad estandar y polar
Medio basal utilizado: MS
Concentración medio basal: 100%
Fecha de siembra especie vegetal :
Persona encargada:
Volumen preparado: 500 ml
Medio reconocido por la clave: Cris
Recipiente utilizado: Tubos de ensayo
Revisado por: Alfredo Cabrera Morales
No.
COMPONENTES DE
SOLUCIONES
SOLUCION
CONCENTRADA
CANTIDAD AGREGAR NOTAS
ML ul %
1 Macronutrientes 10 X 50 2 Micronutrientes A 1000X 500
3 Micronutrientes B 5000 X 100 4 KI 1000 X 500
5 CaCl2 . 2H2O 100 X 5 6 Fe 100 X 5
7 Myo inositol 100 X 5 8 Vitaminas 100 X 5
9 IBA 10 ANA 2 Mg/Lt 4
11 2,4-D 12 2,4, 5T
13 MCPA 14 Picloram
15 BAP 16 Kinetina
17 GA3 0.05 Mg/Lt 100 18 Acido Citrico
19 Acido ascórbico 20 PVP
21 Carbon activado 22 Sucrosa 30 Gr/Lt
23 Agar 7 % 24 PH. 5.7
Fuente: FODECYT 60-2006
61
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
BOLETA ELABORACION DE MEDIOS
No. o clave de boleta: 3
Investigación: Brotación de yemas axilares de shasta, estandar y polar
Medio basal utilizado: MS
Concentración del medio basal: 50%
Persona encargada:
Volumen preparado: 500 ml
Medio reconocido por la clave: Yemas
Recipiente utilizado: Tubos de ensayo
Revisado por: Alfredo Cabrera Morales
No.
COMPONENTES DE
SOLUCIONES
SOLUCION
CONCENTRADA
CANTIDAD AGREGAR NOTAS
ML ul %
1 Macronutrientes 10 X 50
2 Micronutrientes A 1000X 500
3 Micronutrientes B 5000 X 100
4 KI 1000 X 500
5 CaCl2 . 2H2O 100 X 5
6 Fe 100 X 5
7 Myo inositol 100 X 5
8 Vitaminas 100 X 5
9 IBA
10 ANA
11 2,4-D
12 2,4, 5T
13 MCPA
14 Picloram
15 BAP
16 Kinetina
17 GA3 2.0 Mg/Lt 4
18 Acido Citrico
19 Acido ascórbico
20 PVP
21 Carbon activado
22 Sucrosa 15 Gr/Lt
23 Agar 7
24 PH. 5.7
Fuente: FODECYT 60-2006
62
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
BOLETA ELABORACION DE MEDIOS
No. o clave de boleta: 4
Investigación: Mantenimiento de plantas madres de crisantemo variedad shasta, estandar
y polar
Medio basal utilizado: MS
Concentración del medio basal: 50%
Fecha de siembra especie vegetal : 5/10/2007
Persona encargada:
Volumen preparado: 500 ml
Medio reconocido por la clave: Cris.
Recipiente utilizado: Tubos de ensayo
Revisado por: Alfredo Cabrera Morales
No.
COMPONENTES DE
SOLUCIONES
SOLUCION
CONCENTRADA
CANTIDAD AGREGAR NOTAS
ML ul %
1 Macronutrientes 10 X 50
2 Micronutrientes A 1000X 500 3 Micronutrientes B 5000 X 100
4 KI 1000 X 500 5 CaCl2 . 2H2O 100 X 5
6 Fe 100 X 5 7 Myo inositol 100 X 5
8 Vitaminas 100 X 5 9 IBA
10 ANA 11 2,4-D
12 2,4, 5T 13 MCPA
14 Picloram 15 BAP
16 Kinetina 17 GA3
18 Acido Citrico 19 Acido ascórbico
20 PVP 21 Carbon activado
22 Sucrosa 15 Gr/Lt 23 Agar 7
24 PH. 5.7 Fuente: FODECYT 60-2006
63
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
BOLETA ELABORACION DE MEDIOS
No. o clave de boleta: 5
Investigación: formación de embriones a partir de hojas de crisantemo variedad shasta
Medio basal utilizado: MS
Concentración del medio basal: 100%
Persona encargada:
Volumen preparado: 500 ml
Medio reconocido por la clave: FEC
Recipiente utilizado: Frascos de vidrios
Revisado por: Alfredo Cabrera Morales
No.
COMPONENTES DE
SOLUCIONES
SOLUCION
CONCENTRADA
CANTIDAD AGREGAR NOTAS
ML ul %
1 Macronutrientes 10 X 50 2 Micronutrientes A 1000X 500
3 Micronutrientes B 5000 X 100 4 KI 1000 X 500
5 CaCl2 . 2H2O 100 X 5 6 Fe 100 X 5
7 Myo inositol 100 X 5 8 Vitaminas 100 X 5
9 IBA 10 ANA 1.5 Mg/Lt 3
11 2,4-D 12 2,4, 5T
13 MCPA 14 Picloram
15 BAP 4.0 Mg/Lt 8 16 Kinetina
17 GA3 2.5 Mg/Lt 5 18 Acido Cítrico
19 Acido ascórbico 20 PVP
21 Carbon activado 22 Sucrosa 30 Gr/Lt
23 Agar 7 24 PH. 5.7
Fuente: FODECYT 60-2006
64
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
BOLETA ELABORACION DE MEDIOS
No. o clave de boleta: 6
Investigación: formación de embriones a partir de hojas de crisantemo variedades polar y
estándar.
Medio basal utilizado: MS
Concentración del medio basal: 100%
Fecha de siembra especie vegetal:
Persona encargada:
Volumen preparado: 500 ml
Medio reconocido por la clave:
Recipiente utilizado: Frascos de vidrio
Revisado por: Alfredo Cabrera Morales
No.
COMPONENTES DE
SOLUCIONES
SOLUCION
CONCENTRADA
CANTIDAD AGREGAR NOTAS
ML ul %
1 Macronutrientes 10 X 50
2 Micronutrientes A 1000X 500
3 Micronutrientes B 5000 X 100
4 KI 1000 X 500
5 CaCl2 . 2H2O 100 X 5
6 Fe 100 X 5
7 Myo inositol 100 X 5
8 Vitaminas 100 X 5
9 IBA
10 ANA 1.5 Mg/Lt 3
11 2,4-D
12 2,4, 5T
13 MCPA
14 Picloram
15 BAP 4.0 Mg/Lt 8
16 Kinetina
17 GA3 2.5 Mg/Lt 5
18 Acido Cítrico
19 Acido ascórbico
20 PVP
21 Carbon activado
22 Sucrosa 30 Gr/Lt
23 Agar 7
24 PH. 5.7
Fuente: FODECYT 60-2006
65
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
BOLETA ELABORACION DE MEDIOS
No. o clave de boleta: 7
Investigación: Germinación de embriones de shasta, estándar y polar
Medio basal utilizado: MS
Concentración del medio basal: 100%
Fecha de siembra especie vegetal:
Persona encargada:
Volumen preparado: 500 ml
Medio reconocido por la clave:
Recipiente utilizado: Frascos de vidrio
Revisado por: Alfredo Cabrera Morales
No.
COMPONENTES DE
SOLUCIONES
SOLUCION
CONCENTRADA
CANTIDAD AGREGAR NOTAS
ML Ul %
1 Macronutrientes 10 X 50
2 Micronutrientes A 1000X 500 3 Micronutrientes B 5000 X 100
4 KI 1000 X 500 5 CaCl2 . 2H2O 100 X 5
6 Fe 100 X 5 7 Myo inositol 100 X 5
8 Vitaminas 100 X 5 9 IBA
10 ANA 0.2 Mg/Lt 400 11 2,4-D
12 2,4, 5T 13 MCPA
14 Picloram 15 BAP 0.2 Mg/Lt 400
16 Kinetina 17 GA3 0.5 Mg/Lt 1
18 Acido Cítrico 19 Acido ascórbico
20 PVP 21 Carbon activado
22 Sucrosa 30 Gr/Lt 23 Agar 7
24 PH. 5.7 Fuente: FODECYT 60-2006
66
PARTE V INFORME FINANCIERO