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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI SIENA

Facoltà di Medicina e Chirurgia

Scuola di Specializzazione in Genetica Medica

Indirizzo Clinico

CONSULENZA GENETICA E

CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE

DELLA

SINDROME DA MICRODUPLICAZIONE

Xq28

Relatore: Chiar.ma Prof.ssa ALESSANDRA RENIERI

Tesi di Specializzazione di: Dott.ssa MARZIA POLLAZZON

Anno Accademico 2009-2010

2

Al mi’ babbo e

al mi’ cittino

3

INDICE

1.Introduzione pag. 4

1.1 Esperienza personale pag. 4

1.2 Introduzione alla sindrome da microduplicazione Xq28 pag. 20

2.Materiali e metodi pag. 34

2.1 array-CGH pag. 35

2.2 MLPA pag. 39

2.3 FISH pag. 40

3.Risultati pag. 43

3.1 Caso 1 pag. 44

3.2 Caso 2 pag. 45

3.3 Caso 3 pag. 46

3.4 Risultati analisi molecolare pag. 47

3.5 Consulenza genetica pre- e post-test pag. 49

4.Discussione pag. 50

5.Referenze pag. 58

6.Pubblicazioni correlate pag. 66

4

INTRODUZIONEINTRODUZIONEINTRODUZIONEINTRODUZIONE

5

Durante la frequenza della Scuola di Specializzazione in Genetica Medica presso

l’UOC Genetica Medica dell’Università di Siena, diretta dalla Prof. Alessandra Renieri,

mi sono particolarmente dedicata alla genetica clinica. In particolare, ho partecipato

attivamente a più di 700 consulenze genetiche.

La consulenza genetica è il processo comunicativo attraverso il quale i pazienti

affetti da una malattia geneticamente determinata, o i loro familiari, ricevono

informazioni relative alle caratteristiche della malattia stessa, alle modalità di

trasmissione, al rischio di ricorrenza e alle possibili terapie, incluse le opzioni

riproduttive che sono pertinenti alla loro condizione. Il processo conoscitivo ed

informativo della consulenza genetica è guidato dal genetista consulente e coinvolge le

fasi di comprensione della storia medica personale e familiare del consultando, inclusa

la diagnosi, il decorso della malattia e il rischio di ricorrenza nei suoi familiari. Serve

inoltre per comprendere come e quanto l’eredità contribuisca alle manifestazioni

cliniche della malattia, per valutare l’eventuale rischio di ricorrenza nella famiglia e,

pertanto, organizzare azioni preventive e raggiungere una più cosciente pianificazione

familiare. La consulenza non è mai direttiva, non potendo e non dovendo influenzare le

possibili decisioni del probando o della famiglia. Le sessioni di acquisizione dei dati,

comunicazione dei risultati e valutazioni del rischio globale dovrebbero porre i

richiedenti nella migliore condizione per effettuare scelte consapevoli.

La diagnosi precisa della condizione in esame costituisce premessa

fondamentale e necessaria per poter effettuare la migliore consulenza genetica. In alcuni

casi la diagnosi può essere esclusivamente clinica, ovvero basata sulla valutazione del

medico specialista insieme ai dati derivati da indagini strumentali, in assenza di indagini

genetiche a disposizione per la conferma. In altri casi la diagnosi è raggiungibile tramite

l’impiego di test genetici. A volte diagnosi che precedentemente erano solo cliniche,

grazie all’avanzare delle metodiche di laboratorio, hanno la possibilità di essere

confermate da indagini genetiche.

A volte la consulenza genetica si articola in più sedute o sessioni, generalmente

una pre-test ed una post-test genetico. Durante la prima valutazione, il consulente

genetista valuta la motivazione della richiesta di consulenza, raccoglie l’anamnesi

familiare del probando tramite la compilazione dell’albero genealogico in almeno tre

generazioni e considerando soprattutto i componenti familiari che potrebbero essere

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affetti dalla stessa condizione, e registra l’anamnesi personale del probando, valutando

cartelle cliniche e documentazioni sanitarie. In alcune condizioni, soprattutto nelle

consulenze dismorfologiche, possono essere richieste fotografie del probando a diverse

età e documentazioni cliniche e fotografie di familiari. Un momento cruciale della

consulenza genetica è l’osservazione del paziente, che talvolta termina con una visita

medica. Al termine della prima consulenza genetica potranno essere richieste ulteriori

visite specialistiche per confermare o escludere altri eventuali segni minimi della

malattia nel probando e nei suoi familiari e verranno spiegati gli eventuali test genetici

disponibili per la condizione in esame. Prima di sottoporsi a un test genetico, è

necessario che al consultando vengano spiegati i rischi, i limiti e le conseguenze di tali

esami e che venga raccolto il consenso informato firmato dallo stesso o dal tutore nei

casi di minori o di pazienti incapaci di intendere e volere. Dalle prime valutazioni,

inoltre, verrà determinato il rischio genetico, ossia la possibilità che una condizione

patologica a base genetica presente nel probando si verifichi nuovamente in altri

membri appartenenti alla stessa famiglia. Il calcolo del rischio si basa sulla modalità di

trasmissione della malattia, e quindi sulla posizione del probando all’interno della

famiglia, sui dati strumentali e di laboratorio disponibili. Una miglior definizione del

rischio si ottiene alla conclusione del test genetico avviato. In alcune situazioni,

soprattutto quando il risultato dell’indagine genetica potrebbe avere un significativo

impatto emotivo sul consultando, la consegna del referto avviene in un secondo incontro

di consulenza genetica, per la spiegazione del risultato. In tali situazioni ci si può

avvalere della collaborazione di un consulente psicologo. Al termine di ogni sessione è

importante chiarire dubbi o concetti non compresi da parte del consultando.

Le categorie di pazienti che normalmente si rivolgono ad un Centro di Genetica

Medica sono:

• a rischio di patologia a trasmissione mendeliana

• a rischio di anomalia cromosomica

• genitori di un bambino con deficit intellettivo e dismorfismi

• coppie con aborti spontanei ricorrenti o morte neonatale

• familiari con storia di tumore eredofamiliare

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ESPERIENZA CLINICA PERSONALE

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CONSULENZE GENETICHE PRECONCEZIONALI E PRENATALI

Ho partecipato attivamente a consulenze genetiche preconcezionali e prenatali

(Tabella 1).

Le consulenze preconcezionali sono rivolte principalmente a coppie infertili, in

attesa di sottoporsi a tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA), o con

poliabortività. Lo scopo della consulenza è valutare l’opportunità di avviare indagini

genetiche per la definizione dell’eziologia dell’infertilità o della poliabortività. In

particolare, nei protocolli per PMA viene raccomandata l’esecuzione di analisi del

cariotipo, ricerca di microdelezioni del cromosoma Y e ricerca di mutazioni a carico del

gene CFTR, responsabile di forme classiche ed attenuate di fibrosi cistica. In alcuni casi

si valutano coppie per la valutazione del rischio di ricorrenza di una patologia genetica

che segrega all’interno della famiglia. In questi ultimi casi è fondamentale la

disponibilità di documentazione relativa ad indagini genetiche effettuate sui parenti

affetti.

La consulenza genetica prenatale è rivolta a coppie a rischio di malattia genetica

(cromosomica o molecolare) al fine di acquisire informazioni riguardanti il rischio di

ricorrenza della condizione nella gravidanza in corso per una consapevole scelta

relativamente all’esito della gravidanza stessa (prosecuzione od interruzione). Viene

valutata con la coppia la possibilità di procedere con metodiche di diagnosi prenatale

non invasiva (ecografia, test di screening) e/o invasiva (villocentesi/amniocentesi),

considerando rischi, limiti e benefici di entrambe. In particolare, per la diagnosi

prenatale invasiva devono essere soddisfatte due condizioni: 1) la malattia che si intende

diagnosticare deve essere identificabile in utero mediante un test specifico e 2) devono

sussistere fattori di rischio genetico per la gravidanza di entità tale da giustificare un test

prenatale invasivo. L’indicazione principale per consulenza genetica prenatale è

rappresentata dall’età materna avanzata (età al parto pari o superiore a 35 anni), che

correla con un rischio aumentato di cromosomopatia nella prole. Altre indicazioni sono

rappresentate da:

� precedente figlio con patologia cromosomica

� genitore portatore di un riarrangiamento cromosomico bilanciato

9

� genitori portatori di una mutazione responsabile di una malattia autosomica

recessiva o madre portatrice eterozigote di una mutazione responsabile di malattia

X-legata

� genitore portatore di una mutazione responsabile di patologia autosomica

dominante

� precedente figlio con difetto di chiusura del tubo neurale

� aumento del rischio di cromosomopatia nel feto (>1:250), per positività a test di

screening

� malformazioni ecografiche fetali e/o ritardo di crescita intrauterino (IUGR).

Un successivo colloquio post-test viene previsto per la consegna di una risposta

positiva, che attesti la presenza di un feto affetto da patologia (per es. aneuploidia

cromosomica).

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Tabella 1. Consulenze preconcezionali, consulenze per anomalie dei cromosomi sessuali e consulenze prenatali

MALATTIA NUMERO DI CONSULENZE CONSULENZE PRECONCEZIONALI 108 Infertilità di coppia e PMA 57 Azoospermia 4 CBAVD 1 POF 3 Poliabortività 24 Precedente feto malformato 4 Pregressa morte fetale 2 Terapia farmacologica 2 Rischio di ricorrenza retinite pigmentosa 1 Rischio di ricorrenza albinismo 1 Rischio di ricorrenza β-talassemia 3 Rischio di ricorrenza sindrome di Lesch-Nyhan 1 Rischio di ricorrenza sindrome di Goldenhar 1 Rischio di ricorrenza marcatore cromosomico 1 Rischio di ricorrenza fibrosi cistica 1 Rischio di ricorrenza ritardo mentale 1 Rischio di ricorrenza DMD 1 ANEUPLOIDIE CROMOSOMI SESSUALI 5 Sindrome di Klinefelter 3 Sindrome di Turner 1 Sindrome 47, XYY 1 CONSULENZE PRENATALI 164 EMA 123 Portatori di β-talassemia 1 Test di screening positivo 15 Malformazione fetale ecografica 2 Feto con anomalia cromosomica 5 Teratogeni 2 Precedente figlia con sindrome di Rett 1 Precedente figlio con cromosomopatia 2 Precedente figlio con malformazioni 1 Traslocazione cromosomica in familiari 1 Rischio di ricorrenza malattia di Tay-Sachs 1 Rischio di ricorrenza retinoblastoma 1 Rischio di ricorrenza fibrosi cistica 3 Rischio di ricorrenza sclerosi tuberosa 1 Rischio di ricorrenza anomalia cromosomica 1 Rischio di ricorrenza SMA 1 Rischio di ricorrenza ipoacusia 1 Rischio di ricorrenza epidermolisi bollosa 1 Ovodonazione 1 TOTALE 277

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CONSULENZE GENETICHE ONCOLOGICHE

Mi sono inoltre occupata di consulenza genetiche oncologiche, rivolte ad

individui affetti da patologia tumorale e/o con storia familiare positiva per casi ereditari

di specifici tumori (tumore della mammella e dell’ovaio, tumori dell’intestino), che

desiderino conoscere le possibilità diagnostiche e terapeutiche per se stessi e/o la

valutazione del rischio genetico della prole (Tabella 2). L’analisi genetica non è

proponibile a tutti i casi di neoplasia, ma solo in casi selezionati, ad esempio soggetto

affetto da plurimi tumori primitivi o tumori eredofamiliari.

Dato che la UOC Genetica Medica di Siena si occupa di retinoblastoma, anche a

scopo di ricerca, ho effettuato consulenze genetiche anche relative a tale tipo di tumore,

in forma sporadica o familiare. In tale ambito, ho valutato in consulenza genetica due

gemelle affette da sindrome da microdelezione 13q14, caratterizzata da retinoblastoma

associato a ritardo psicomotorio e dismorfismi.

Nell’ambito della consulenza genetica si valuta la possibilità di avviare analisi

molecolari nell’affetto ed in familiari non affetti, ma a rischio di sviluppare il tumore

(consulenza genetica presintomatica). E’ importante spiegare al paziente i possibili

risultati del test, con le ripercussioni sulla prognosi e sulle misure preventive attuabili,

ed i suoi limiti (falsi negativi, espressività variabile). Particolare attenzione deve essere

rivolta ai pazienti che richiedono l’effettuazione dell’indagine molecolare

presintomatica, per valutare il rischio di avere ereditato la specifica mutazione che

segrega nella famiglia, e pertanto il rischio di sviluppare una neoplasia. Questo tipo di

consulenze viene svolto alla presenza di un collega psicologo, affinchè il paziente possa

prendere le sue decisioni relativamente all’iter in maniera consapevole, indipendente e

volontaria. Date le implicazioni psicologiche delle consulenze presintomatiche, i test

vengono effettuati su soggetti maggiorenni, per garantire l’autonomia di scelta

individuale. Un’eccezione è rappresentata dalla poliposi del colon familiare (FAP), in

cui l’indagine può essere effettuata in soggetti dai 12 anni in su, dato che sono possibili

misure preventive di provata efficacia.

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Tabella 2. Consulenze di Genetica Oncologica

MALATTIA NUMERO DI CONSULENZE

Sindromi tumorali familiari con carcinoma del colon: 5 Sindrome di Lynch 3

Poliposi adenomatosa del colon 1 Sindrome di Peutz-Jeghers 1

Sindrome tumorale familiare di mammella ed ovaio 2 Carcinoide gastrointestinale 1 Carcinoma midollare della tiroide-MEN2A 1 Retinoblastoma 7 Melanoma 1 Schwannomatosi 1 Sindrome di Gorlin 1 Sindromi mielodisplastiche 1 Neurofibromatosi 4 Familiarità per tumori 2 Presintomatiche 10 TOTALE 36

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CONSULENZE GENETICHE PER PATOLOGIE NEUROLOGICHE

Ho effettuato consulenze genetiche relative a patologie neurologiche, in

particolare dell’età adulta, quali polineuropatie ereditarie, distrofia facioscapolomerale

(FSHD), corea di Huntigton e malattia di Parkinson (Tabella 3). Nel caso di pazienti

sintomatici, l’analisi molecolare permette di definire la diagnosi e di escludere le altre

patologie che entrano in diagnosi differenziale. La terapia rimane sintomatica, e

pertanto l’esito dell’indagine molecolare non influenza il trattamento. Per quanto

riguarda l’effettuazione del test genetico in pazienti asintomatici ed a rischio di

sviluppare la patologia, in quanto parenti di un affetto, ho seguito l’iter previsto dalle

attuali linee guida, adottate anche dalla UOC Genetica Medica di Siena. Sono previsti

almeno quattro incontri, alla presenza del genetista e dello psicologo. Il paziente valuta

con lo psicologo la sua volontà di conoscere se ha ereditato la predisposizione alla

patologia, con i rischi e benefici che ne conseguono. Le ripercussioni interessano

soprattutto l’ambito personale, in particolare le scelte riproduttive e lavorative. Basti

pensare, ad esempio, alle conseguenze di una diagnosi di corea di Huntigton, una

malattia neurodegenerativa caratterizzata da disturbi psichiatrici, disordini motori e

deficit cognitivi ad insorgenza tardiva ed a penetranza elevata. In questo caso, gli

individui che ereditano l’allele espanso svilupperanno quasi sicuramente una malattia

devastante, con la possibilità a loro volta di trasmettere la predisposizione alla prole.

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Tabella 3. Consulenze per malattie neurologiche

MALATTIA NUMERO DI CONSULENZE

Polineuropatie ereditarie (CMT/HNPP) 16 Distrofia facioscapolomerale (FSHD) 8 Altre distrofie muscolari:

Distrofia dei cingoli 4 Titinopatia 4

Corea di Huntington 5 Malattia di Alzheimer 2 Malattia di Parkinson 5 Paraparesi spastica 2 Atassia 3 Distonia 1 Presintomatiche 4 TOTALE 54

Pubblicazioni correlate:

Pollazzon M, Suominen T, Penttilä S, Malandrini A, Carluccio MA, Mondelli M,

Marozza A, Federico A, Renieri A, Hackman P, Dotti MT, Udd B. The first Italian

family with tibial muscular dystrophy caused by a novel titin mutation. J Neurol. 2010

Apr;257(4):575-9

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CONSULENZE GENETICHE PER ALTRE PATOLOGIE

Durante gli anni della Scuola di Specializzazione ho partecipazione a consulenze

genetiche riguardanti patologie a carico di diversi organi ed apparati, quali rene, occhio,

cute, connettivo, apparato cardio-vascolare, scheletrico e respiratorio (Tabella 4).

Fondamentale è risultata la collaborazione con specialisti di altre discipline mediche,

per il miglior inquadramento della patologia.

Tabella 4. Consulenze per altre malattie

MALATTIA NUMERO DI CONSULENZE

MALATTIE RENALI 7 Malattia cistica midollare/nefronoftisi 1 Nefropatia familiare 1 Rene policistico 1 Sindrome di Alport 3 HANAC 1 MALATTIE OCULARI 10 CFEOM 2 Atrofia ottica 2 Ptosi palpebrale 1 Retinite pigmentosa 2 Malattia di Stargardt 1 Sindrome di Goldmann-Favre 1 Albinismo 1 MALATTIE DERMATOLOGICHE 11 Lipomatosi 1 MERFF 1 Lipodistrofia di Dunnigan 1 Sindrome di Job 1 Miopatia e dermatopatia 1 Collagenopatia 1 Malattia di Darier 1 Epidermodisplasia verruciforme di LL 1 Cutis laxa 1 Acne inversa 2

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MALATTIE REUMATOLOGICHE 2 Sindrome di Marfan 2 MALATTIE CARDIOVASCOLARI 11 Cardiomiopatia dilatativa 5 QT lungo 1 Dissecazione arteriosa 4 Anomalia valvolare cardiaca 1 MALATTIE SCHELETRICHE 10 Split hand/foot 3 Pachidermoperiostosi 1 Ipoplasia mandibolare 1 Camptodattilia 1 Sublussazione vertebrale 1 Sindrome di Currarino 1 Rachitismo ipofosfatemico 2 MALATTIE RESPIRATORIE 2 Deficit α1-antitripsina 1 Fibrosi cistica 1 ALTRE Emocromatosi 9 Ipoacusia 2 Pancreatite cronica 3 Sindrome di Gilbert 2 OEIS complex 1 Pubertà precoce 1 Sindrome di Kallmann 1 Labioschisi 1

Sindrome da deficit di 21-idrossilasi 1

TOTALE 74

Pubblicazioni correlate:

Gaudiano C, Malandrini A, Pollazzon M, Murru S, Mari F, Renieri A, Federico A.

Leukoencephalopathy in 21-beta hydroxylase deficiency: Report of a family. Brain Dev.

2010 May;32(5):421-4

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CONSULENZE GENETICHE DISMORFOLOGICHE

Nell’ambito della mia attività mi sono occupata soprattutto di consulenze post-

natali riguardanti l’inquadramento di pazienti in età pediatrica con un quadro clinico

caratterizzato da deficit intellettivo e/o disturbo pervasivo dello sviluppo associati o

meno ad anomalie fisiche maggiori/minori (MCA/MR, multiple congenital

anomalies/mental retardation) (Tabella 5). Un primo obiettivo della consulenza genetica

consiste nel riconoscimento di sindromi genetiche note, per l’avvio di specifici test

genetici. Sulla base dell’esito dell’indagine genetica si ha un inquadramento eziologico

del quadro clinico ed una miglior definizione dei rischi riproduttivi della patologia nella

famiglia. Nella maggior parte dei casi la diagnosi genetica non influenza la terapia, ma

può modificare il follow-up pediatrico. Ad esempio, ho seguito un paziente affetto da

emiipertrofia e dismorfismi faciali inquadrato nel corso della consulenza genetica in

sindrome di Beckwith-Wiedemann. L’indagine genetica ha permesso di confermare tale

sospetto diagnostico. E’ stato pertanto fatto presente ai genitori che nei pazienti con

sindrome di Beckwith-Wiedemann si suggerisce uno stretto monitoraggio pediatrico

fino a 6 anni di età, in particolare per l’identificazione precoce di eventuali neoplasie

(tumore di Wilms, epatoblastoma, neuroblastoma e rabdomiosarcoma), che compaiono

con frequenza aumentata rispetto alla popolazione pediatrica generale. Sono pertanto

state suggerite: - ecografie addominali (con valutazione di reni, surreni, fegato,

pancreas) ogni 3 mesi fino agli 8 anni di età (ecografie renali annuali da continuare fino

all’età adolescenziale); - dosaggio di alfafetoproteina plasmatica e degli indici di

funzionalità epatica ogni 2-3 mesi fino a 5 anni di età; - valutazione ogni 1-2 anni

dell’escrezione urinaria di calcio e trimestralmente delle catecolamine urinarie; -

controlli cardiologici in caso di interventi chirurgici.

Tra le sindromi genetiche note mi sono occupata in particolar modo di sindrome

di Rett, una patologia di cui l’UOC Genetica Medica di Siena è un centro di riferimento

nazionale ed internazionale. La sindrome di Rett (RTT) è una severa patologia

neurologica, che colpisce prevalentemente le femmine. E’ caratterizzata da uno sviluppo

psicomotorio apparentemente normale nei primi 6-18 mesi di vita (I stadio) e successiva

comparsa di una regressione, con perdita delle abilità precedentemente acquisite (II

stadio). In questa fase, inoltre, compaiono microcefalia, o regressione della crescita

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della circonferenza cranica, ipotonia, atteggiamenti simil-autistici (isolamento,

autolesionismo), stereotipie manuali (prevalentemente mani incrociate tra loro o

movimenti mani-bocca) e bruxismo. Successivamente (III stadio) si manifestano

disprassia/aprassia manuale, stereotipie manuali tipo lavaggio, che diventano

predominanti nell’arco della giornata ed alterazioni EEGrafiche accompagnate da

episodi convulsivi. La postura diventa cifoscoliotica e se la paziente riprende la capacità

deambulatoria, il cammino è atassico. In questa fase si manifesta un interessamento del

sistema neurovegetativo, con estremità fredde (fino alla cianosi), reflusso

gastroesofageo, stipsi e disturbi del respiro (apnea, iperventilazione). Nel IV stadio

l’atrofia e la debolezza muscolare diventano più importanti, al punto da determinare

perdita della deambulazione, mentre le crisi convulsive si diradano. Sulla base del

fenotipo clinico, è possibile identificare diverse varianti di sindrome di Rett 1-3:

- forma classica

- variante Zappella (precedentemente nota come PSV), con recupero del

linguaggio successivamente alla fase di regressione

- variante con convulsioni ad esordio precoce, con comparsa di numerosi spasmi

infantili tra la prima settimana ed i primi 5 mesi di vita

- forma congenita, caratterizzata da un periodo di regressione molto precoce,

intorno ai 6 mesi di vita, o dall’apparente assenza di regressione

- “forme fruste”, con regressione tardiva (1-3 anni), uso delle mani parzialmente

conservato, rare stereotipie, minor coinvolgimento del sistema motorio

- variante a regressione tardiva, di rarissima osservazione.

Dal punto di vista genetico, esiste una buona correlazione tra fenotipo clinico ed

alterazione genetica responsabile. Infatti, circa l’80% delle pazienti con forma classica

di sindrome di Rett presenta un’alterazione a carico del gene MECP2, primo gene

descritto nella patogenesi della sindrome di Rett nel 1999. Solo il 40% delle pazienti

con sindrome di Rett atipica, invece, presenta una mutazione causativa nel suddetto

gene. La variante con convulsioni ad esordio precoce è determinata da una mutazione a

carico del gene CDKL5. Recentemente presso il nostro laboratorio, il gene FOXG1 è

stato identificato come responsabile della variante congenita, sebbene il fenotipo clinico

causato da mutazioni a carico di tale gene si stia ampliando 4. Tale identificazione è

stata resa possibile dall’iniziale identificazione di una microdelezione del braccio lungo

19

del cromosoma 14 in una paziente con fenotipo clinico Rett-like 5. Lo studio dei geni

compresi nella microdelezione ha permesso di considerare il gene FOXG1B come

nuovo gene candidato per tale patologia 5. In una fase successiva è stata effettuata

l’analisi mutazionale del gene in un gruppo di pazienti presenti nella biobanca della

Genetica Medica di Siena (http://www.biobank.unisi.it/Elencorett.asp) con diagnosi

molecolare negativa per i geni MECP2 e CDKL5 6. In due pazienti con diagnosi clinica

di variante congenita è stata identificata una mutazione in FOXG1B, confermando che il

gene è responsabile di tale fenotipo 4. Durante la consulenza genetica rivolta a pazienti

con sospetta sindrome di Rett ho contribuito all’inquadramento diagnostico, valutando

l’analisi molecolare più appropriata, ed ho illustrato alle famiglie il nostro progetto di

ricerca avente come oggetto le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) 7. Tali cellule

vengono ottenute dai fibroblasti da biopsia cutanea di pazienti affette, successivamente

messe in coltura e differenziate in neuroni tramite vettori virali. Oltre ad osservare le

alterazioni conformazionali dei neuroni e delle sinapsi nervose che rispecchiano la

situazione a livello del sistema nervoso delle pazienti, sarà possibile valutare l’effetto di

micromolecole e farmaci introdotti nella coltura. Il fine ultimo consiste nell’utilizzo di

specifiche molecole nella terapia delle pazienti affette, principalmente per sopperire alla

carenza della proteina alterata.

Nei casi di MCA/MR nei quali non è stato possibile porre uno specifico sospetto

diagnostico e per la conferma di una sospetta sindrome da

microdelezione/microduplicazione cromosomica, abbiamo effettuato l’analisi di array-

CGH, disponibile presso il nostro laboratorio. In seguito al recente impiego della

tecnica di array-CGH in una casistica di 84 pazienti affetti da disturbo pervasivo dello

sviluppo (ASD, autism spectrum disorders) in assenza di anomalie congenite, è stato

possibile individuare sindromi emergenti da microdelezione/microduplicazioni e regioni

di suscettibilità all’autismo, che possono intervenire come cofattori nello sviluppo del

quadro clinico. Tramite l’utilizzo della tecnica di array-CGH in pazienti con MCA/MR

abbiamo evidenziato CNVs (Copy Number Variants) associate a patologia nel 16% dei

pazienti analizzati 8. Tra queste sono comprese: la sindrome con cromosoma 14 ad

anello con delezione in corrispondenza dei punti di rottura cromosomici, la sindrome da

microdelezione 22q11.2 (o sindrome Velocardiofaciale), la sindrome da microdelezione

13q14, caratterizzata da retinoblastoma e ritardo psicomotorio, la sindrome di Smith-

20

Magenis, la sindrome da microdelezione 1qter e la sindrome da microduplicazione

Xq28.

Nell’iter della mia formazione specialistica ho effettuato con particolare

interesse le consulenze dismorfologiche, tra cui ho dedicato particolare interesse e

approfondimento alla sindrome da microduplicazione Xq28, attraverso l’esame di tre

casi. Tale patologia rappresenta un quadro emblematico dell’attività svolta durante il

mio periodo di formazione specialistica.

Tabella 5. Consulenze dismorfologiche

NUMERO DI

CONSULENZE

Sindrome di Rett:

forma classica 30 variante Zappella 2 fenotipo Rett-like 7

Sindrome di Angelman 1 Sindrome degli spasmi infantili 9 Sindromi da instabilità cromosomica 1 Sindromi dello spettro Noonan 6 Disturbi della migrazione neuronale 3 Sindromi da overgrowth 11 Craniostenosi 1 Pseudodeficit arilsulfatasi 1 Sindrome di Pitt-Hopkins 1 Sindrome di Mowat-Wilson 1 Sindrome di Pallister-Killian 1 Sindrome di Turner 1 Sindrome X-fragile 1 Sindrome da deficit di creatina 1 Deficit intellettivo e/o anomalie fisiche associate 208 Sindromi note da microdelezioni/microduplicazioni (del1qter; ring14 con delezione; del22q11.2; del13q14; del17p11.2) 8 Sindromi da microduplicazione Xq28 3 Nuovi sindromi da microdelezione/microduplicazione (del9p24/dup17p13; del8q22; del21q22; del9q27; del16p11.2; del7q33; del20p13; dup17q12; del18q21; del21q21) 11 Sindromi con riarrangiamenti cromosomici di suscettibilità 10

TOTALE 318

21

Pubblicazioni correlate:

Ariani F, Hayek G, Rondinella D, Artuso R, Mencarelli MA, Spanhol-Rosseto A,

Pollazzon M, Buoni S, Spiga O, Ricciardi S, Meloni I, Longo I, Mari F, Broccoli V,

Zappella M, Renieri A. FOXG1 is responsible for the congenital variant of Rett

syndrome. Am J Hum Genet. 2008 Jul;83(1):89-93

Mencarelli MA, Katzaki E, Papa FT, Sampieri K, Caselli R, Uliana V, Pollazzon M,

Canitano R, Mostardini R, Grosso S, Longo I, Ariani F, Meloni I, Hayek J, Balestri P,

Mari F, Renieri A. Private inherited microdeletion/microduplications: Implications in

clinical practice. Eur J Med Genet. 2008 Sep-Oct;51(5):409-16

Pollazzon M, Grosso S, Papa FT, Katzaki E, Marozza A, Mencarelli MA, Uliana V,

Balestri P, Mari F, Renieri A. A 9.3 Mb microdeletion of 3q27.3q29 associated with

psychomotor and growth delay, tricuspid valve dysplasia and bifid thumb. Eur J Med

Genet. 2009 Mar-Jun;52(2-3):131-3

Artuso R, Mencarelli MA, Polli R, Sartori S, Ariani F, Pollazzon M, Marozza A, Cilio

MR, Specchio N, Vigevano F, Vecchi M, Boniver C, Bernardina BD, Parmeggiani A,

Buoni S, Hayek G, Mari F, Renieri A, Murgia A. Early-onset seizure variant of Rett

syndrome: Definition of the clinical diagnostic criteria. Brain Dev. 2010 Jan;32(1):17-

24

Uliana V, Grosso S, Cioni M, Ariani F, Papa FT, Tamburello S, Rossi E, Katzaki E,

Mucciolo M, Marozza A, Pollazzon M, Mencarelli MA, Mari F, Balestri P, Renieri A.

3.2 Mb microdeletion in chromosome 7 bands q22.2-q22.3 associated with overgrowth

and delayed bone age. Eur J Med Genet. 2010 May-Jun;53(3):168-70

Katzaki E, Morin G, Pollazzon M, Papa FT, Buoni S, Hayek J, Andrieux J, Lecerf L,

Popovici C, Receveur A, Mathieu-Dramard M, Renieri A, Mari F, Philip N. Syndromic

mental retardation with thrombocytopenia due to 21q22.11q22.12 deletion: Report of

three patients. Am J Med Genet A. 2010 Jul;152A(7):1711-7

Artuso R, Papa FT, Grillo E, Mucciolo M, Yasui DH, Dunaway KW, Disciglio V,

Mencarelli MA, Pollazzon M, Zappella M, Hayek G, Mari F, Renieri A, Lasalle JM,

Ariani F. Investigation of modifier genes within copy number variations in Rett

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22

Mencarelli MA, Tassini M, Pollazzon M, Vivi A, Calderisi M, Falco M, Fichera M,

Monti L, Buoni S, Mari F, Engelke U, Wevers RA, Hayek J, Renieri A. Creatine

transporter defect diagnosed by protonNMR spectroscopy in males with intellectual

disability. Am J Med Genet A. 9999:1–7 [Epub ahead of print]

23

INTRODUZIONE ALLA

SINDROME DA MICRODUPLICAZIONE

Xq28

24

Le sindromi da microduplicazione della porzione distale del braccio lungo del

cromosoma X presentano diverse caratteristiche cliniche a seconda del sesso del

probando, dell’estensione del riarrangiamento e del contenuto genico della porzione

duplicata. La sindrome è determinata dalla microduplicazione della porzione terminale

del braccio lungo del cromosoma X, visibile in alcuni casi all’analisi del cariotipo o, più

frequentemente, ad analisi di citogenetica molecolare (FISH ed array-CGH). La

sindrome da microduplicazione Xq28 è caratterizzata da severo ritardo psicomotorio,

difficoltà di alimentazione, ritardo di crescita, ricorrenti infezioni respiratorie, ipotonia

assiale, anomalie genitali e caratteristiche facciali peculiari (faccia ampia con guance

piene, epicanto, naso appuntito, orecchie grandi e dismorfiche, bocca piccola tenuta

aperta ed anomalie del palato). E’ una frequente causa di deficit intellettivo sindromico

nei maschi (cariotipo 46,XY), in quanto la disomia strutturale parziale del cromosoma

X si traduce in disomia funzionale. Le femmine, invece, a causa del fenomeno

dell’inattivazione preferenziale del cromosoma X alterato, sono normalmente

asintomatiche. La microduplicazione Xq28 può essere determinata da una duplicazione

intracromosomica, da una traslocazione sbilanciata tra i cromosomi X ed Y

(traslocazione X/Y) o tra un cromosoma X ed un autosoma (traslocazione X/autosoma)

o da un piccolo cromosoma ad anello. Nelle femmine, la mancanza di compensazione di

dose sul cromosoma X, con conseguente quadro clinico patologico, può derivare da una

serie di meccanismi, quali una inattivazione preferenziale del cromosoma X non

alterato, la presenza di un punto di rottura che separa un tratto del cromosoma X dal

centro di inattivazione in cis (XIC) od un effetto posizionale su geni a distanza dai punti

di rottura cromosomici. La prevalenza della microduplicazione non è conosciuta. Circa

140 pazienti maschi sono riportati in letteratura con duplicazioni nella regione Xq28

comprendenti MECP2, di questi 40 presentano riarrangiamenti evidenti alla citogenetica

tradizionale ed i rimanenti presentano una duplicazione criptica; le femmine

sintomatiche descritte sono rare, circa una decina. Le microduplicazioni riportate hanno

dimensioni variabili tra 0.1 e 4 Mb e la maggioranza delle duplicazioni

intracromosomiche hanno dimensioni comprese tra 0.3 e 2.3 Mb. La minima regione

critica (MCR) contiene il gene MECP2, che risulta il gene più importante sensibile

all’effetto di dose e che è il principale responsabile del fenotipo della duplicazione

distale Xq. Il rischio di ricorrenza è trascurabile nei casi di insorgenza “de novo” del

25

riarrangiamento, mentre è significativo se è presente un riarrangamento strutturale in

uno dei genitori (più frequentemente una duplicazione intracromosomica ereditata dalla

madre). La qualità di vita è influenzata in particolar modo dalle infezioni ricorrenti.

PANORAMICA STORICA

Mutazioni a carico del gene MECP2 (methyl-CpG binding protein 2) causano la

sindrome di Rett nelle femmine, mentre nei maschi determinano una severa

encefalopatia od altri disordini dello sviluppo psicomotorio sindromici o non sindromici

legati al cromosoma X 9,10. La sindrome di Rett è caratterizzata da uno sviluppo post-

natale normale fino a 6-18 mesi di vita, con successiva regressione, caratterizzata da

perdita delle abilità precedentemente acquisite (linguaggio, deambulazione). I

movimenti finalizzati delle mani si riducono e compaiono stereotipie manuali lungo la

linea mediana, tra le quali movimenti tipo lavaggio. Elementi aggiuntivi sono

rappresentati da microcefalia acquisita o regressione della crescita della circonferenza

cranica, deficit intellettivo, epilessia e comportamento autistico. Le alterazioni a carico

del gene MECP2 responsabili di sindrome di Rett sono numerose e caratterizzate

principalmente da sostituzioni di singole basi e mutazioni frameshift. Più recentemente

sono state riscontrate grandi delezioni intrageniche o contenenti il gene MECP2,

localizzato nella regione cromosomica Xq28, particolarmente ricca di geni correlati con

deficit intellettivo e malattie neurologiche 11-15.

Il primo paziente con disomia della regione Xq28 viene riportato in letteratura

nel 1994 16.

Il fenotipo sindromico associato alla microduplicazione Xq28 è successivamente

descritto da Pai et al. e Lubs et al. 17 ,18.

Nel 2005 nel lavoro di Meins et al. viene descritto un bambino di 8 anni con

severo ritardo psicomotorio e microduplicazione Xq28 19. Per la prima volta viene

dimostrato che la sindrome di Rett può essere determinata non solo da perdita di

funzione del gene MECP2, ma anche da un’aumentata dose di tale gene. Il bambino,

infatti, presenta caratteristiche cliniche riconducibili a sindrome di Rett: ritardo

26

psicomotorio con regressione delle abilità motorie, comportamento autistico, epilessia

ed estremità fredde.

Sanlaville et al. hanno rivisto il fenotipo associato alla duplicazione Xq28 nei 17

pazienti precedentemente descritti ed in due nuovi pazienti, 16 maschi e 3 femmine in

totale 20. Si delinea un fenotipo clinico comune caratterizzato da severo ritardo

psicomotorio, microcefalia, ritardo di crescita, ipotonia, genitali ipoplasici, difficoltà di

alimentazione e frequenti infezioni respiratorie. Vengono inoltre considerati i possibili

meccanismi patogenetici della disomia funzionale della regione Xq28. La disomia può

risultare da traslocazioni Xq-Yq, riarrangiamenti Xq-Xp o traslocazioni X-autosoma.

In seguito, Cheng et al. e Van Esch et al. descrivono microduplicazioni Xq28 in

famiglie con ritardo psicomotorio legato all’X (XLMR) 21,22. Tali microduplicazioni

hanno dimensioni variabili ed includono in ogni caso analizzato i geni MECP2 ed

L1CAM (L1 cell adhesion molecule), in aggiunta ad ulteriori 7 geni. Tutti i maschi

descritti presentano severo ritardo psicomotorio, linguaggio verbale assente, disturbi

neurologici progressivi (spasticità ed epilessia), lievi dismorfismi facciali, severe

infezioni respiratorie ricorrenti e morte prima dei 25 anni di età (per complicanze

infettive e/o deterioramento neurologico). Tramite studi di espressione è stato

evidenziato il ruolo del gene MECP2 nel fenotipo neurologico di questi pazienti. Nello

studio su tre pazienti maschi condotto da Smyk et al. viene confermato che MECP2 è il

gene maggiormente implicato nello sviluppo neurologico dei pazienti 23.

Friez et al. hanno rivalutato le famiglie precedentemente riportate, dimostrando

una inattivazione del cromosoma X sfavorevole nelle femmine affette che non

presentavano una traslocazione alla base della disomia 24.

Un modello per la spiegazione del meccanismo di formazione del

riarrangiamento è stato fornito da Bauters et al. 25. Viene descritto un modello a due

stadi, in cui inizialmente parte della regione Xq28 è inserita vicino al locus MECP2, in

seguito si ha una replicazione indotta dalla rottura con invasione dello strand del

normale cromatide fratello.

La più piccola duplicazione terminale del braccio lungo del cromosoma X viene

descritta da Velinov 26. Si tratta di una duplicazione di 2.15 Mb che comprende il gene

MECP2 ma non il gene L1CAM. Il paziente presenta ritardo psicomotorio, mentre non

presenta i tratti dismorfici dei pazienti precedentemente descritti, epilessia e frequenti

27

infezioni respiratorie. Gli autori concludono, pertanto, che i geni prossimali ad IRAK1,

che non sono duplicati nel paziente descritto, possono essere considerati responsabili

delle manifestazioni cliniche addizionali presenti nei pazienti con le duplicazioni più

estese.

Il ruolo del gene IRAK1 nella microduplicazione viene rivalutato nel lavoro

Prescott et al. 27. Tale gene viene correlato alla suscettibilità alle infezioni, che

diminuiscono dopo la prima infanzia. Dagli autori viene anche riscontrato un ridotto

livelli di anticorpi sierici, a testimonianza dell’alterata funzionalità del sistema immune.

Il gene FLNA contenuto nella regione viene correlato alla distensione vescicale

ed alla pseudo-ostruzione intestinale 28.

Lugtenberg et al. hanno stimato una frequenza della microduplicazione Xq28

pari all’1% dei pazienti con ritardo mentale legato all’X (XLMR) ed al 2% dei pazienti

maschi con encefalopatia severa 29.

Recentemente Carvalho et al. ha riconfermato che in un terzo dei casi è presente

un riarrangiamento complesso 30.

Il fenotipo neurologico viene descritto da Echenne: linguaggio limitato od

assente, severo deficit intellettivo (QI<40), epilessia polimorfica e farmacoresistente

con frequenti crisi di tipo mioclonico-astatico, rallentamento del ritmo di base all’esame

EEGrafico e ritardo di mielinizzazione 31.

Il gruppo di Vandewalle et al. ha cercato di definire lo specifico ruolo dei geni

contenuti nella regione Xq28 nel determinare il fenotipo della microduplicazione 32.

Particolare importanza viene data al gene GDI1, altamente espresso a livello cerebrale,

in particolar modo nell’ippocampo, e pertanto possibile gene candidato per lo sviluppo

del fenotipo neurologico della sindrome.

Bartsch et al. descrivono 4 pazienti maschi con microduplicazione ereditata dalla

madre sana e raccomandano l’utilizzo di iniezioni di tossina botulinica per il trattamento

di contratture delle articolazioni maggiori, considerate una delle problematiche

principali di tali pazienti 33.

Una femmina con microduplicazione Xq28 e fenotipo Rett-like viene descritta

da Auber et al. 34. Si tratta della terza femmina descritta con tale microduplicazione,

originata, come nelle precedenti, da una traslocazione sbilanciata, in questo caso

coinvolgente i cromosomi X e 17.

28

Un successivo articolo riporta la più piccola duplicazione nella regione Xq28

riportata in un femmina, coinvolgente il gene MECP2 e parte del gene IRAK1. La

paziente presenta deficit intellettivo ed ansietà, in assenza di segni e sintomi associati.

In particolare non sono presenti dismorfismi né comportamento autistico. Gli autori

suggeriscono, pertanto, di ricercare la microduplicazione in femmine con deficit

intellettivo 35.

Gli aspetti neuroradiologici vengono valutati nel lavoro di Reardon et al 36.

Viene descritto un fenotipo degenerativo progressivo cerebellare nei tre maschi più

adulti di una casistica di 7 pazienti ed in una femmina. Tali cambiamenti

neuroradiologici potrebbero costituire una caratteristica fondamentale della sindrome.

Nel più recente articolo relativo alla microduplicazione Xq28 vengono descritte

due femmine con fenotipo patologico a causa di un’inattivazione casuale del

cromosoma X, in assenza di un riarrangiamento complesso 37.

Grazie ad una collaborazione internazionale abbiamo recentemente descritto

cinque femmine affette, ampliando le conoscenze relative al fenotipo neurologico, che

può essere severo quanto quello nei maschi (Bijlsma et al. in preparazione).

29

PATOGENESI

Nei maschi (46,XY), la disomia strutturale si traduce sempre in una disomia

funzionale. La disomia strutturale può essere determinata da una duplicazione

intracromosomica, da una traslocazione sbilanciata tra i cromosomi X ed Y, tra le

regioni Xq ed Xp o tra il cromosoma X ed un autosoma 16,38-44. Nelle femmine (46,XX),

la disomia può risultare da un pattern casuale di inattivazione del cromosoma X, con

inattivazione del cromosoma X normale, da un punto di rottura che separa un segmento

del cromosoma X dal centro di inattivazione dell’X (XIC) o da un piccolo cromosoma

ad anello [r(X)] costituito da una porzione del cromosoma X che non contiene XIC 45.

Recentemente è stato riportato un nuovo meccanismo patogenetico, costituito da

inserzione e duplicazione della regione Xq28 in un autosoma, in una paziente affetta 35.

Duplicazioni intracromosomiche (Fig.1):

sono il meccanismo principale alla base della disomia funzionale nei maschi.

Nella maggior parte dei casi sono ereditate e trasmesse tramite madri eterozigoti sane.

In questa condizione le madri eterozigoti presentano un rischio di trasmettere la

duplicazione alla prole pari al 50% per ogni gravidanza. I figli maschi che ereditano la

duplicazione risulteranno affetti, le figlie femmine saranno per lo più portatrici

eterozigoti asintomatiche, ma potranno risultare affette a seconda del loro pattern di

inattivazione. Le dimensioni delle duplicazioni sono variabili ed è pertanto variabile il

contenuto genico. La diagnosi prenatale è consigliata per escludere un mosaicismo

criptico o germinale nella madre (coesistenza di una popolazione di ovociti con la

duplicazione e di una popolazione di ovociti normale), pari a circa l’1%.

Nelle femmine, le duplicazioni intracromosomiche del cromosoma X sono

generalmente associate ad un pattern di inattivazione favorevole, con inattivazione del

cromosoma X duplicato e pertanto il fenotipo è normale. Esiste, tuttavia, la possibilità

di sbilanciarsi nella prole. Sono descritti rari casi di pazienti femmine con inattivazione

random del cromosoma X ed un quadro clinico patologico 35-37. In quest’ultima

situazione l’inattivazione random del cromosoma X potrebbe essere attribuita alla

costituzione di un mosaicismo post-zigotico. Sul piano clinico, le duplicazioni familiari

30

con inattivazione random dell’X sarebbero legate ad un fenotipo più lieve (Bijsma et al.

in preparazione).

Il possibile meccanismo patogenetico delle duplicazioni è la ricombinazione tra

segmenti ripetuti intersparsi Alu. Tale ricombinazione sembra avvenire tramite “non-

homologous end joining (NHEJ)”, un complesso meccanismo a due step nel quale

all’inizio parte della regione Xq28 è inserita vicino al locus MECP2 e successivamente

si verifica una replicazione indotta dalla rottura con invasione del filamento del

cromatide normale nell’altro 25,32,46,47. Un meccanismo simile è stato precedentemente

descritto per la regione 8p23, ed è ipotizzabile nei casi di riarrangiamenti non ricorrenti 48.

Traslocazioni:

più raramente le duplicazioni risultano da traslocazioni sbilanciate tra un

cromosoma X ed il cromosoma Y [t(X;Y)] o tra un cromosoma X ed un autosoma

[t(X;A)].

La maggior parte delle traslocazioni t(X;Y) origina “de novo” e circa 6 casi sono

stati riportati in maschi con severo deficit intellettivo 16,20,23,38.

Le t(X;A) sono rari riarrangiamenti, con frequenza di 1-3/10.000 nati vivi e sono

frequentemente associate ad infertilità. Hanno il rischio di sbilanciarsi nella prole,

dando un fenotipo patologico (Fig.2). Sono state osservate in maschi e femmine, e

coinvolgono generalmente il braccio corto di un cromosoma acrocentrico o la porzione

distale di un altro cromosoma (generalmente i cromosomi 4, 10, 13, 21, 22).

Solitamente lo sbilanciamento dell’autosoma è assente o molto limitato e non ha

impatto sul fenotipo. Diverso è l’effetto, nelle femmine, determinato dal cromosoma X

traslocato sull’autosoma, che, separato dal centro di inattivazione del cromosoma X

(XIC), non può essere inattivato con conseguente disomia funzionale. Alcune t(X;A),

anche se bilanciate, possono risultare in una disomia funzionale Xq se è inattivato il

derivativo X o se si ha un pattern random di inattivazione del cromosoma X.

31

Piccoli cromosomi X ad anello [r(X)]:

se non contengono il centro di inattivazione dell’X funzionale (XIC) non

vengono inattivati. A seconda del contenuto genico possono essere responsabili di

disomia funzionale.

Inserzione e duplicazione in un autosoma:

si tratta di un meccanismo recentemente descritto 35. La paziente presenta un

fenotipo lieve associato ad inserzione e duplicazione di un piccolo segmento della

regione Xq28 vicino alla porzione telomerica del cromosoma 10. La porzione inserita

sull’autosoma non è soggetta ad inattivazione e si determina, pertanto, disomia.

In tutti i casi, soprattutto nelle forme da traslocazione, l’indagine molecolare

deve essere estesa ad entrambi i genitori per definire il rischio di ricorrenza, che risulta

significativo nel caso in cui uno dei due genitori, di solito la madre, presenta un

riarrangiamento strutturale.

32

Figura 1. Rappresentazione schematica della modalità di trasmissione della duplicazione Xq nella prole maschile ed in quella femminile. Il riquadro verde indica il cromosoma X attivo, mentre il riguardo rosso indica il cromosoma X inattivo. a) feto maschile con fenotipo normale; b) feto maschile con disomia funzionale Xq, e pertanto con fenotipo patologico; c) feto femminile con inattivazione del cromosoma X duplicato, e pertanto con fenotipo normale; d) feto femminile con attivo il cromosoma X duplicato, e pertanto con fenotipo patologico. (Immagine modificata da Sanlaville et al. 45 e HC net)

33

Figura 2. Rappresentazione schematica della modalità di trasmissione della t(X;A). Il riquadro verde indica il cromosoma X attivo, mentre il riguardo rosso indica il cromosoma X inattivo. a) feto maschile con fenotipo normale; b) feto maschile con traslocazione bilanciata; c) feto maschile con traslocazione sbilanciata che determina disomia funzionale dell’X; d) feto maschile con traslocazione sbilanciata che determina monosomia parziale dell’X e parziale trisomia dell’autosoma; e) feto femminile normale; f) feto femminile con traslocazione bilanciata; g) feto femminile con traslocazione sbilanciata che determina parziale monosomia dell’autosoma e disomia funzionale dell’X; h) feto femminile con traslocazione sbilanciata che determina monosomia parziale dell’X e trisomia parziale dell’autosoma; i) traslocazione bilanciata, con inattivazione di der(X) e conseguente disomia funzionale. Fenotipo normale: a, b, e, f. Fenotipo patologico: c, d, g, h, i. (Immagine modificata da Sanlaville et al. 45 e HC net)

34

QUADRO CLINICO

Le manifestazioni cliniche dipendono dal sesso del probando e dal contenuto

genico del segmento cromosomico duplicato. Esse comprendono:

- Ritardo di crescita pre- e postnatale, con microcefalia

- Severa difficoltà di alimentazione, con reflusso gastroesofageo

- Dismorfismi: chiusura precoce delle fontanelle, facies arrotondata ed ipotonica,

guance piene, epicanto, naso appuntito, orecchie grandi e dismorfiche, bocca

piccola tenuta aperta, anomalie del palato

- Ritardo psicomotorio con severo deficit intellettivo e linguaggio assente

- Infezioni respiratorie ricorrenti (polmoniti)

- Ipotonia assiale

- Spasticità

- Crisi convulsive

- Anomalie dei genitali (genitali ipoplasici, ipospadia e/o criptorchidismo)

- Anomalie delle dita di mani e piedi (riportate in alcuni pazienti)

La maggior parte delle femmine eterozigoti per la duplicazione presentano una

inattivazione del cromosoma X alterato e sono, pertanto, asintomatiche. Tuttavia, sono

stati descritti casi di femmine portatrici con sintomi neuropsichiatrici, quali depressione,

ansia e comportamenti autistici, unitamente ad anomalie endocrinologiche

(ipotiroidismo, irregolarità mestruali e diabete), malattie autoimmuni e bassa statura 21,49.

Le femmine sintomatiche per inattivazione casuale del cromosoma X o per

traslocazione presentano un quadro clinico variabile di ritardo psicomotorio da lieve-

moderato a severo ed associato o meno a caratteristiche cliniche riscontrate nei maschi

affetti.

35

ASPETTI TERAPEUTICI

Al momento attuale il trattamento della sindrome da microduplicazione Xq28 è

solamente sintomatico e pertanto i pazienti sono trattati sulla base delle manifestazioni

cliniche, indipendentemente dalla diagnosi genetica. La terapia è multidisciplinare e

deve prestare particolare attenzione alla difficoltà di alimentazione ed alle infezioni

ricorrenti. La difficoltà di deglutizione, il reflusso gastroesofageo e la costipazione

richiedono una valutazione dell’alimentazione nell’infanzia. La precoce introduzione di

nutrizione parenterale può limitare il ritardo di crescita post-natale e può prevenire la

malnutrizione 20. Le infezioni rappresentano la problematica che richiede il più attento

monitoraggio nel tempo e spesso richiedono l’esclusione di una diagnosi di fibrosi

cistica. In particolare, rappresentano la principale causa di morte 50. Si segnala, infatti,

che almeno il 40% dei maschi con la microduplicazione della regione Xq28 muoiono

prima dei 25 anni di età a causa di infezioni respiratorie e tale dato può essere

sottostimato a causa della giovane età dei pazienti riportati. Le infezioni devono

pertanto essere trattate in maniera tempestiva tramite l’utilizzo di antibiotici. L’uso degli

antibiotici in maniera preventiva durante l’inverno sembra determinare un beneficio 24.

Le malformazioni fisiche associate, invece, non contribuiscono significativamente alla

morbidità associata alla sindrome.

Ogni paziente dovrebbe, inoltre, ricevere un supporto educativo e riabilitativo.

La comunicazione aumentativa dovrebbe essere introdotta il prima possibile per

prevenire le limitazioni legate al linguaggio limitato/assente. A causa della spasticità

può essere impiegata la terapia fisica per aiutare a mantenere un corretto movimento

articolare, prevenendo le contratture secondarie e prolungando la capacità di

deambulazione. In alcuni casi viene suggerita l’iniezione di tossina botulinica (Botox)

per il trattamento delle forme severe di contratture articolari 33.

La terapia anticonvulsivante deve essere impiegata con le stesse indicazioni e

modalità della popolazione generale. Fondamentali sono EEGrammi di controllo.

In alcuni pazienti è riportato il riscontro di anomalie cardiache strutturali,

soprattutto nei casi di duplicazione del gene FLNA. E’ pertanto indicato effettuare una

valutazione cardiovascolare 24,51. In alcuni casi con duplicazione del gene FLNA sono

36

inoltre riportate coaugulopatie, per cui è importante associare una valutazione

ematologica 14,52,53.

Importante è una precoce valutazione oftalmologica nei casi frequenti di

strabismo od ambliopia 54.

Con l’avanzare dell’età è frequente il ricorso alla tracheostomia. Tra i più

anziani maschi affetti in vita, per esempio, nel 2009 è stato descritto un paziente di 33

anni che a 30 anni ha subito tracheostomia a causa della spasticità 55. Tale paziente

presentava, inoltre, infezioni ricorrenti ed epilessia. Inoltre, 4 pazienti su 5 oltre i 15

anni riportati da Friez hanno richiesto la tracheostomia 24.

Una via terapeutica potenziale è rappresentata dalla terapia genica. Attualmente

è in studio presso diversi Centri italiani ed esteri la funzione del gene MECP2,

utilizzando come modello la sindrome di Rett. E’ ipotizzabile la modificazione del

fenotipo clinico riportando alla normalità i livelli di espressione di MeCP2 o

normalizzando i livelli di espressione delle proteine che interagiscono con MeCP2 a

livello del Sistema Nervoso Centrale (SNC).

37

MATMATMATMATERIALI E METODIERIALI E METODIERIALI E METODIERIALI E METODI

38

Ai pazienti ed ai loro genitori è stato effettuato prelievo di sangue periferico (5-

10 cc in EDTA), con successiva estrazione del DNA tramite QIAamp DNA Blood Maxi

Kit (Qiagen). L’analisi di array-CGH è stata condotta inizialmente nel DNA del

probando, e successivamente l’alterazione è stata confermata tramite metodica di

MLPA nella paziente 1, mentre nei altri due pazienti è stato utilizzato come metodo di

conferma un secondo esperimento indipendente di array-CGH. In seguito, il

riarrangiamento è stato ricercato nel DNA dei genitori tramite metodica di MLPA (nella

famiglia 1) e con un esperimento di array-CGH (nelle famiglie 2 e 3), al fine di definire

l’origine “de novo” od ereditata. Nel caso della paziente 1, per definire il meccanismo

patogenetico dell’alterazione, è stata successivamente condotta analisi tramite metodica

FISH con sonda specifica della regione Xq28, anche nel sangue di entrambi i genitori.

ARRAY-CGH

La tecnica Comparative Genomic Hybridization (ibridazione genomica

comparativa) (CGH) è stata introdotta nel 1992 da Kallioniemi 56.

Il principio della tecnica si basa su una ibridazione in situ modificata che sfrutta

la competizione tra due campioni di DNA genomico (test e controllo), ibridati

contemporaneamente in quantità equimolari su un vetrino su cui sono fissati cromosomi

normali in metafase (CGH convenzionale) o sull’array su cui si trovano immobilizzate

le sequenze omologhe di DNA (array-CGH). La tecnica di CGH convenzionale è una

tecnica di rilevazione che consente di analizzare l’intero genoma del soggetto che si

vuole esaminare, grazie ad un unico esperimento in grado di identificare anomalie del

corredo genetico, quali riarrangiamenti sbilanciati, ovvero delezioni e duplicazioni

cromosomiche.

La tecnica di array-CGH, è stata sviluppata sostituendo i cromosomi delle

metafasi di riferimento con una matrice su cui sono disposti (spottati) cloni BAC

(cromosomi artificiali batterici), PAC (cromosomi artificiali di fago P1) o sequenze di

oligonucleotidi, corrispondenti a loci specifici di ogni singolo cromosoma, fino a

comprendere l’intero genoma umano. L’utilizzo di tali cloni, infatti, permette

l’immediata correlazione tra l’eventuale alterazione sospettata in un paziente e una

precisa posizione del riarrangiamento nel genoma, grazie alla scomparsa di un segnale

corrispondente al clone contenente la sequenza deleta, o viceversa, all’aumento di

39

segnale dovuto ad una duplicazione della sequenza. La risoluzione genomica dell’array-

CGH dipende dalla lunghezza dei cloni utilizzati e dalla distanza tra un clone e l’altro.

Pertanto, l’utilizzo di tali cloni permette di superare il limite principale della CGH

convenzionale, che è la bassa risoluzione.

Gli array ad oligonucleotidi sono stati introdotti per rilevare i polimorfismi di

singoli nucleotidi (SNP) 57. Questo tipo di array contiene sonde da 21–25

oligonucleotidi, sintetizzate usando un metodo fotolitografico. Ogni SNP è

rappresentato sull’array da più sonde differenti, che si legano ad entrambi i filamenti di

DNA 57,58. Nel 2004, Bignell et al., ottimizzarono un metodo per utilizzare gli SNP-

array nell’analisi delle variazioni del numero di copie, usando una diversa strategia nella

preparazione del campione da analizzare 57. La piattaforma di SNP-array permette

l’identificazione di delezioni/duplicazioni, ma mostra una maggiore variazione nella

capacità di rilevamento e un più basso segnale rispetto agli array a BAC 57,59,60. Il

vantaggio di questo approccio è la possibilità di correlare il numero di copie e lo stato

allelico a livello dei loci selezionati. Successivamente, sono stati sviluppati array ad

oligonucleotidi, contenenti sonde più lunghe (60-70 nucleotidi). L’utilizzo di tali sonde

aumenta la specificità di ibridazione e può rilevare, in modo riproducibile, alterazioni

cromosomiche comprendenti delezioni in singola copia e in omozigosi, con una

risoluzione estremamente alta 61-63. Attualmente sono disponibili in commercio array ad

oligonucleotidi che coprono l’intero genoma, con una risoluzione di circa 6,5 kb.

Le differenze tecniche tra le diverse piattaforme utilizzate nell’array-CGH

possono essere sostanzialmente riassunte in due caratteristiche: la grandezza delle

sequenze genomiche disposte sull’array e la copertura del genoma. La flessibilità nella

creazione di microarray specifici per ampi tratti del genoma, per i cromosomi, o per

determinati loci, e la possibilità di coprire il genoma umano con una risoluzione

estremamente alta, rendono l’array-CGH ideale per le applicazioni in genetica clinica

come l’identificazione dei geni malattia, la correlazione genotipo-fenotipo e l’analisi di

anomalie cromosomiche sconosciute.

Negli ultimi anni i microarray per CGH vengono preferiti sempre più a quelli

cromosomici, per identificare particolari squilibri, in differenti tipi di tumore 64,65.

Attualmente, i metodi array-CGH vengono sempre più impiegati per l’analisi di pazienti

con fenotipi complessi. Una delle prime applicazioni dell’array-CGH è stato lo

40

screening dei riarrangiamenti subtelomerici, a causa di numerosi studi che riportavano

squilibri subtelomerici in pazienti con ritardo dello sviluppo 66-69. Di grande importanza

è l’indagine sull’intero genoma per individuare la presenza di delezioni

submicroscopiche o duplicazioni in pazienti con ritardo mentale e caratteristiche faciali

peculiari. In uno studio, comprendente 90 pazienti, sono state identificate aberrazioni

submicroscopiche in circa il 21% dei casi 20. La capacità risolutiva degli array-CGH può

essere di particolare importanza nell’identificazione di specifici loci causa di malattia e

in sindromi malformative sporadiche, per le quali altri metodi di mappaggio non sono

applicabili. Nel 2005, Vissers et al., usando questo approccio, scoprirono che la

sindrome CHARGE è dovuta ad aploinsufficienza del gene CHD7, dimostrando

l’efficacia dell’array-CGH nel localizzare i geni causa di malattia 70. Gli array tiling

path sono molto utili nel mappare e nel rilevare l’estensione di aberrazioni in specifici

segmenti, permettendo accurati studi nella correlazione genotipo-fenotipo 71,72. Nel

2003, Yu et al., utilizzarono questo tipo di array per meglio definire pazienti con la

sindrome da delezione 1p36 73. Tale array, contenente 10 Mb della regione terminale 1p,

permise di classificare correttamente i pazienti sulla base delle loro alterazioni

cromosomiche 73. Infine, l’array-CGH ha consentito di conoscere la variazione normale

del genoma umano: esso, infatti, ha rivelato un inaspettato livello di variazione, dovuto

a differenze nel numero di copie tra gli individui. Le potenziali difficoltà nel

differenziare le variazioni nel numero di copie ereditate, che causano fenotipi anormali

dalle varianti rare, non correlate ad alterazioni cliniche, possono rappresentare un limite

nell’uso della CGH basata sui microarray per guidare la consulenza genetica.

I principi di base dell’array-CGH assomigliano a quelli dell’ibridazione

genomica comparativa tradizionale. I campioni di DNA da testare e DNA di controllo

sono differentemente marcati, con fluorocromi rossi (Cy5) e verdi (Cy3),

successivamente coprecipitati in presenza di Cot-1 DNA per bloccare le sequenze

ripetitive e co-ibridizzati sull’array (Fig. 3a). Si tratta di una competizione comparativa

in cui si legherà in proporzione più DNA da testare in ogni locus se sarà maggiore il

numero di copie presenti in quel locus rispetto al numero di copie presenti nel DNA

genomico di controllo. Viceversa se ne legherà meno se sarà minore il numero di copie

presenti in quel locus rispetto al numero di copie presenti nel DNA genomico di

controllo. La fluorescenza è rilevata mediante uno scanner a laser (Fig. 3b), grazie al

41

quale si acquisisce un’immagine per entrambi i fluorocromi. In seguito, le immagini

sono quantificate con metodo digitale mediante software specifici, che quantificano

l’intensità di fluorescenza emessa per ogni sonda (Fig. 3c), calcolando quanto il

rapporto tra i segnali emessi dal campione e dal DNA di riferimento devia dai valori

attesi. Dato che le misurazioni possono essere riferite direttamente alle posizioni sul

genoma, è possibile definire, con precisione, i punti di rottura (breakpoints) dei

riarrangiamenti eventualmente presenti. La risoluzione dell’esperimento dipende dalla

risoluzione dell’array. La sovrapposizione dei due segnali corrispondenti ai due

fluorocromi, nel caso di un soggetto normale produce un valore di intensità di

fluorescenza uguale a 1, poiché il rapporto tra i 2 fluorocromi è pari a 1. La

rappresentazione grafica fornita dal software trasforma questo valore in logaritmo.

Quindi i cloni in cui è avvenuta una normale ibridazione tra DNA di controllo e DNA

test si trovano lungo la linea grafica dello 0. L’elaborazione finale del programma

produce uno schema in cui è possibile vedere la distribuzione dei segnali di

fluorescenza dei cloni nell’intorno del valore “zero” ad indicare un uguale dosaggio

della regione del DNA test e del DNA di controllo. Cloni che si discostano da questa

linea di “zero” verso +0.58, dove il rapporto tra i 2 fluorocromi è di 3/2, sono indicativi

di una regione duplicata e cloni che si discostano verso –0.80, dove il rapporto tra i 2

fluorocromi è 1/2, sono indicativi di una delezione. Si considerano possibili delezioni o

duplicazioni quando si discostano dal valore di “zero” almeno 3 sonde (Fig. 3d).

42

Figura 3. Rappresentazione schematica di un esperimento array-CGH.

(a) I DNA test e di controllo sono differentemente marcati, coprecipitati e ibridizzati su un array. Dopo le procedure di lavaggio, i vetrini sono analizzati attraverso uno scanner (b) e viene determinata l’intensità di fluorescenza di ogni sonda (c). Dopo la trasformazione dell’immagine e la normalizzazione dei dati, i rapporti in log2 delle sonde sono tracciati come funzione della posizione cromosomica. Le sonde con un valore uguale a zero rappresentano un uguale rapporto dell’intensità della fluorescenza tra il test e il controllo. Ogni punto rappresenta una singola sonda individuata sull’array. (d) Ideogramma visualizzato dal software. La regione cromosomica appare duplicata poiché il rapporto di fluorescenza delle sonde presenti è di 3/2.

MLPA

La metodica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

permette di rilevare i cambiamenti del numero di copie presenti nel DNA in esame. Il

principio su cui si basa tale tecnica è l’amplificazione simultanea di sonde ibridizzate su

regioni target 74,75. Ciascuna sonda MLPA è costituita da un oligonucleotide sintetico e

un oligonucleotide derivato da DNA fagico M13.

L’oligonucleotide sintetico contiene una sequenza universale all’estremo 5’ e

una regione complementare alla sequenza target all’estremo 3’. L’altro oligonucleotide

contiene una regione complementare alla sequenza target all’estremo 5’, una sequenza

sintetica detta stuffer di lunghezza variabile e una sequenza universale all’estremo 3’. In

PPAAZZIIEENNTTEE CCOONNTTRROOLLLLOO

MMIIXX

IIBBRRIIDDAAZZIIOONNEE

SSCCAANNSSIIOONNEE

DDEELLEEZZIIOONNEE DDUUPPLLIICCAAZZIIOONNEE

((bb)) SSCCAANNNNEERR AA LLAASSEERR

((cc)) AARRRRAAYY

((aa)) ((dd)) IIDDEEOOGGRRAAMMMMAA

43

seguito all’ibridazione, i due oligonucleotidi vengono uniti dall’enzima ligasi. Dal

momento che le sonde contengono estremità 3’ e 5’ universali possono essere

amplificati contemporaneamente con una sola coppia di primers e in un’unica reazione

di PCR. La sequenza stuffer fornisce una diversa lunghezza a ciascuna sonda (Figura 4).

Figura 4. Principio della tecnica MLPA. A) Rappresentazione schematica di una sonda MLPA. Gli oligonucleotidi sintetici contengono la sequenza riconosciuta dal primer universale Y (in nero), mentre il frammento derivato da M13 contiene la sequenza specifica per il primer universale X (in nero) e la sequenza stuffer (in grigio scuro). La sequenza target è indicata di grigio chiaro. B) Ibridazione della sonda MLPA con il DNA. Il DNA genomico è denaturato e le due parti di ogni sonda MLPA sono ibridizzate sulla sequenza di riferimento. C) Reazione di ligazione. Solo le sonde perfettamente appaiate vengono legate da una ligasi termostabile. D) Reazione di PCR. Tutte le sonde legate sono amplificate tramite PCR utilizzando un’unica coppia di primers (X e Y). Il prodotto di amplificazione di ciascuna sonda ha una lunghezza caratteristica, per cui ciascun frammento è riconoscibile in seguito a separazione mediante elettroforesi capillare.

FISH

La tecnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) si basa sul principio della

complementarietà dei due filamenti del DNA 76. Il DNA di una sonda molecolare nota

subisce un processo di “marcatura”, la quale si avvale di un sistema enzimatico che

funziona come un “taglia e cuci”: il DNA della sonda nota viene infatti

simultaneamente “tagliato” dall’enzima DNAsi, e “ricucito” dall’enzima DNA

polimerasi, in presenza, tra il pool dei nucleotidi trifosfato, di un nucleotide

Esone A Esone B

Y

X Y

X

A

B

Primer Y

Oligonucleotide sintetico

Sequenza da ibridizzare

Primer X

Sequenza stuffer

Oligonucleotide derivato da M13

Ligazione

Esone A Esone B

Ligazione

A B

C D

44

direttamente fluorescente o di uno specifico nucleotide contenente una molecola

reporter, come la biotina, che sarà poi riconosciuta da uno specifico anticorpo

fluorescente, per esempio anti-biotina. Successivamente viene denaturato (reso a

singolo filamento) sia il DNA della sonda nota, sia il DNA cromosomico oggetto di

studio, e quindi i due DNA vengono ibridati (Fig.5). Se la sonda nota trova il suo

complementare sul cromosoma testato, l’ibridazione ha luogo e ne verrà rilevato il

segnale al microscopio a fluorescenza.

Il segnale sui cromosomi è doppio, uno per cromatidio, dal momento che il

cromosoma metafasico ha duplicato il proprio DNA, anche se spesso si evidenzia un

solo segnale per cromosoma, data la vicinanza dei due cromatidi. Se la sonda non trova

il suo complementare sul DNA cromosomico testato, l’ibridazione non avviene e non si

rileverà alcun segnale al microscopio a fluorescenza.

Le sonde molecolari utilizzate per le analisi FISH possono essere di varia

grandezza, in base al microrganismo in cui sono inserite. Sono disponibili cosmidi, che

contengono inserti di circa 40 kb, BAC (Bacterial Artificial Chromosome), che sono i

più diffusi e contengono inserti di circa 200 kb, e YAC (Yeast Artificial Chromosomes),

oggi in disuso, che contengono inserti di circa 500 kb. Possono essere utilizzati come

sonde FISH anche prodotti di PCR (Polymerase Chain Reaction) a grandezza

prestabilita. La diagnosi condotta tramite tecnica FISH è ritenuta affidabile quando le

sonde molecolari sono di dimensioni superiori a 40 kb. Con sonde più piccole, infatti, il

segnale fluorescente è troppo debole e spesso poco distinguibile da un artefatto tecnico

di fondo, che può creare segnali di falsa ibridazione. Vengono evidenziate, pertanto,

anomalie quantitative tra 4-6 Mb e 40 kb.

Le sonde molecolari utilizzate nelle analisi FISH possono essere di vario tipo:

sonde α satelliti centromeriche (spesso cromosoma-specifiche), sonde painting

cromosoma-specifiche, che illuminano la cromatina (spesso solo l’eucromatina) di un

intero cromosoma e sonde locus-specifiche, utilizzate nella diagnosi delle sindromi da

microdelezione o nell’analisi dei telomeri.

45

Figura 5. Illustrazione delle varie fasi della tecnica FISH.

46

RISULTATIRISULTATIRISULTATIRISULTATI

47

Nella nostra casistica di circa 630 pazienti affetti da ritardo psicomotorio e/o

anomalie fisiche maggiori/minori associate (MCA/MR), analizzati tramite metodica di

array-CGH, abbiamo identificato cinque pazienti con microduplicazione della regione

Xq28 (3 maschi e 2 femmine). Di questi, mi sono occupata personalmente di tre

pazienti, due maschi ed una femmina, descritti in questa tesi.

CASO 1

CARATTERISTICHE CLINICHE (Fig.6):

Femmina di 8 anni e 4 mesi

Nata da taglio cesareo per presentazione podalica alla 39esima settimana di gravidanza

Parametri auxologici alla nascita nella norma

Ritardo psicomotorio: posizione seduta a 10 mesi, deambulazione atassica a 24 mesi,

lallazione a 4 anni, linguaggio verbale assente

Moderato deficit intellettivo

Difficoltà di alimentazione e deficit di crescita

Infezioni ricorrenti delle basse vie aeree (bronchiti, polmoniti) dai 7 mesi di vita

Stipsi nei primi mesi di vita

Ipotiroidismo

Carattere socievole

Movimenti distonici della testa e del collo

Microcefalia, faccia rotondeggiante, epicanto, fessure palpebrali down-slanting, ptosi

palpebrale bilaterale, denti piccoli e spaziati, solco palmare unico, alluce valgo, cute

marmorata

ESAMI STRUMENTALI:

EEG “Rallentamento del ritmo di fondo”

RMN encefalo “Aspetto immaturo della sostanza bianca superficiale, soprattutto a

carico dei lobi frontali”

INDAGINI GENETICHE:

Analisi del cariotipo: 46,XX

48

Figura 6. Caso 1 all’età di 6 anni e 4 mesi.

CASO 2

CARATTERISTICHE CLINICHE (Fig.7):

Maschio di 13 anni e 5 mesi

Nato da parto eutocico a termine

Sofferenza perinatale

Parametri auxologici alla nascita nella norma

Ritardo psicomotorio: deambulazione instabile a 3 anni, linguaggio verbale assente

Grave deficit intellettivo

Eteroaggressività

Tre episodi convulsivi febbrili

Infezioni ricorrenti delle basse vie aeree (bronchiti, polmoniti)

Decelerazione della crescita della circonferenza cranica, scafocefalia, sinophris,

sopracciglia spesse ed arcuate, strabismo, punta nasale bulbosa, spina auricolare a

sinistra e pit retroauricolare a destra, estesa area ipercromica a livello addominale e

piccole aree ipercromiche caffè-latte a livello delle braccia e del dorso

ESAMI STRUMENTALI:

EEG alternativamente normali ed alterati, con saltuarie onde puntute

RMN encefalo “alterato segnale della sostanza bianca retro e sopratrigonale

bilateralmente, modica dilatazione dei trigoni dei ventricoli laterali, ampi spazi

subaracnoidei della volta e della base”

INDAGINI GENETICHE:

Analisi del cariotipo: 46,XY

Analisi gene FMR1: normale

49

Figura 7. Caso 2 all’età di 6 anni e 4 mesi.

CASO 3

CARATTERISTICHE CLINICHE (Fig.8): Maschio di 6 anni

Nato da taglio cesareo per diabete gestazionale

Lunghezza e COF alla nascita superiori alla norma

Ritardo psicomotorio: controllo parziale del tronco a 15 mesi, deambulazione atassica

acquisita oltre i 2 anni, lallazione raggiunta a 3 anni, linguaggio verbale acquisito a 3

anni e mezzo e limitato a poche parole e 2-3 frasi

Grave deficit intellettivo

Rigurgiti frequenti nel I anno e scialorrea

Ipotonia

Infezioni ricorrenti delle alte vie aeree (laringiti) nei primi 3 anni di vita

Iperattività

Stereotipie manuali lungo la linea mediana

Decelerazione della crescita della circonferenza cranica, bozze frontali prominenti,

sopracciglia arcuate, epicanto bilaterale, naso appuntito con punta nasale piccola ed ali

del naso ipoplasiche, guance piene, bocca piccola con labbra sottili, solco palmare unico

ESAMI STRUMENTALI:

EEG “rallentamento del ritmo più evidente nel sonno sulle derivazioni posteriori di

destra, mioclonie ipniche”

RMN encefalo “limitato pallore della sostanza bianca periventricolare posteriore”

INDAGINI GENETICHE:

Analisi del cariotipo: 46,XY

Analisi gene FMR1: normale

50

Figura 8. Caso 3 all’età di 4 anni e 3 mesi.

RISULTATI ANALISI MOLECOLARE

La paziente 1 presenta una microduplicazione della regione Xq28 di circa 2.10

Mb di dimensioni, ad insorgenza “de novo”. L’analisi condotta tramite metodica FISH

con sonda specifica della regione Xq28 ha evidenziato una traslocazione

t(X;22)(q28;p13), assente nei genitori (Fig.9,10). I risultati delle analisi sono, pertanto:

ArrayCGH: 46,XX.arr Xq28 (152.417.785.- 154.494.590)X3 dn

FISH: 46,XX.ish der(22),t(X;22)(q28;p13) dn

Figura 9. Rappresentazione schematica della traslocazione sbilanciata t(X;22)(q28;p13) evidenziata tramite metodica FISH nella paziente 1. Nel box a contorno viola è contenuto il derivativo del cromosoma 22, con la duplicazione della regione Xq28 traslocata in posizione p13. I due cromosomi X ed un cromosoma 22 sono inalterati. (Immagine modificata da HC net)

51

Nel paziente 2 è stata riscontrata una microduplicazione Xq28 di circa 308 kb di

dimensioni, ereditata dalla madre (Fig.10). Il risultato delle analisi risulta pertanto:

ArrayCGH: 46,XY.arr Xq28 (152,850,692-153,158,679)X2 mat

Anche nel paziente 3 è stata evidenziata una microduplicazione Xq28 ereditata

dalla madre, di dimensioni pari a circa 340 kb (Fig.10). Il risultato delle analisi risulta

pertanto: ArrayCGH: 46,XY.arr Xq28 (152,843,855-153,186,834)x2 mat

Figura 10. Punti di rottura delle duplicazioni dei pazienti 1,2,3 e della sindrome nota da microduplicazione Xq28 riportata da Van Esch et al. 50. In alto è riportata la rappresentazione schematica delle bande di cromatina del cromosoma X. Con il contorno rosso è evidenziata la regione Xq28 di interesse, amplificata più in basso con le distanze riportate in Mb. Al centro della figura, le barre blu paragonano la posizione ed i punti di rotture delle duplicazioni dei tre pazienti e della duplicazione nota. In basso sono riportati i geni contenuti nelle rispettive regioni cromosomiche duplicate. In rosso sono cerchiati i geni MECP2 ed IRAK1, contenuti nella minima regione critica (MCR) della duplicazione presente nei tre pazienti riportati. (Immagine modificata dal sito DECIPHER)

52

CONSULENZA GENETICA PRE-TEST

Durante la consulenza genetica pre-test mi sono occupata della raccolta

dell’anamnesi familiare, con compilazione dell’albero genealogico, e personale dei tre

pazienti, della valutazione della loro documentazione clinica e della visita

dismorfologica.

Ho descritto ai genitori il tipo di analisi molecolare indicata, i suoi limiti e le sue

ripercussioni per il paziente stesso e per i familiari. Mi sono pertanto occupata della

raccolta del consenso informato firmato da parte dei genitori.

CONSULENZA GENETICA POST-TEST

Al completamento delle indagini genetiche in programma, ho rivisto le famiglie

per la consegna dei referti e la spiegazione dei risultati.

Ho informato i genitori che il risultato delle analisi molecolari effettuate

unitamente alla concordanza tra il quadro clinico presentato dai figli e quello riportato

in letteratura, ha permesso di porre negli stessi una diagnosi specifica. Tale diagnosi

giustifica gli elementi clinici presentati e permette di porre l’attenzione su alcune

problematiche da monitorizzare nel tempo (difficoltà di alimentazione, epilessia,

infezioni). Ho più volte spiegato che, tuttavia, la terapia non viene modificata dalla

diagnosi, ma rimane sintomatica ed identica a quella di pazienti con sintomatologia

simile indipendentemente dalla diagnosi.

Fondamentale è la spiegazione delle ripercussioni dei risultati sulla famiglia, in

particolare su eventuali future gravidanze e sui familiari. E’ stato definito il rischio di

ricorrenza dell’alterazione in eventuali future gravidanze, molto basso (~1%) nei casi di

insorgenza “de novo” e pari al 50% nei casi ereditati. E’ stata, inoltre, illustrata la

possibilità di organizzare la diagnosi prenatale invasiva per la ricerca della specifica

alterazione su villi coriali o liquido amniotico nella futura prole. Sono state poste le

diverse ipotesi relative alla previsione del fenotipo della prole a seconda del sesso. Nelle

forme ereditate sono stati coinvolti anche altri familiari, in particolare in un caso una

nonna materna, per estendere l’analisi e valutare il rischio di ricorrenza nella linea

materna.

53

DISCUSSIONEDISCUSSIONEDISCUSSIONEDISCUSSIONE

54

Uno dei più frequenti riarrangiamenti delle regioni telomeriche dei cromosomi

associate a ritardo psicomotorio con anomalie maggiori/minori (MCA/MR) è

rappresentato dalla microduplicazione della regione Xq28 77. La delezione nella regione

Xq28, che causa perdita di funzione del gene MECP2, è associata alla sindrome di Rett,

che colpisce nella quasi totalità soggetti femminili. Una spiegazione della prevalenza

della malattia nei soggetti femminili potrebbe essere la letalità nei maschi emizigoti 78.

Una seconda spiegazione è attribuita alla quasi esclusiva presenza di mutazioni in

cromosomi X trasmessi dal padre 79. Rari casi di fenotipo Rett classico in maschi sono

stati descritti in presenza di mosaicismo somatico o di cariotipo 47,XXY 80-84. Le

duplicazioni della stessa regione che causano un’aumentata dose di MECP2 sono state

associate a ritardo psicomotorio prevalentemente in soggetti maschili 22,51. Le femmine

con microduplicazione Xq28 sono per lo più portatrici asintomatiche, a causa

dell’inattivazione preferenziale del cromosoma X riarrangiato. Risultano invece affette

in caso di: inattivazione casuale del cromosoma X, riarrangiamenti Xq-Xp, traslocazioni

X-autosoma.

Oltre 100 individui affetti sono stati descritti nella letteratura e si è delineata,

pertanto, una nuova sindrome, clinicamente riconoscibile 54. Le caratteristiche principali

della sindrome da microduplicazione Xq28 sono rappresentate da: ritardo psicomotorio

X-legato, deficit intellettivo di grado severo-profondo, linguaggio verbale assente o

limitato, ipotonia infantile, lievi dismorfismi (brachicefalia, ipoplasia medio facciale,

sella nasale depressa, narici anteverse, orecchie grandi). Sono inoltre presenti in diversa

combinazione: infezioni ricorrenti, spasticità progressiva a carico soprattutto degli arti

inferiori, atassia, comportamento autistico, epilessia focale o generalizzata e disfunzioni

vescicali. L’ipotonia neonatale progredisce verso la spasticità, come si verifica in altre

sindromi con ipotonia legate all’X (sindromi di Pelizaeus-Merzbacher e di Allan-

Herndon-Dudley), e deve far considerare in diagnosi differenziale la sindrome di

Prader-Willi 40,41,44,85,86. In alcuni pazienti è descritta una regressione clinica, con perdita

delle abilità precedentemente acquisite. Tale elemento clinico accomuna la sindrome

con il disturbo pervasivo dello sviluppo e con la sindrome di Rett. In alcuni casi la

regressione coincide con la comparsa delle crisi convulsive, sebbene il controllo

dell’epilessia non riporti al recupero totale, poiché molti casi di epilessia sono

farmacoresistenti. Nella casistica di Ramocki sono riportati movimenti anomali in tutti i

55

9 soggetti maschi esaminati 49. Tali movimenti comprendono movimenti coreiformi a

carico di arti superiori, testa o lingua e movimenti stereotipati lungo la linea mediana.

Tra i tre pazienti descritti in questa tesi, il paziente 3 presenta movimenti stereotipati

degli arti superiori lungo la linea mediana, mentre il paziente 1 ha mostrato in occasione

della rivalutazione clinica movimenti distonici della testa e del collo, assenti alla prima

valutazione. Reardon et al ha descritto tre pazienti, due maschi ed una femmina, con

alterazioni degenerative progressive cerebellari visibili sul piano clinico e

neuroradiologico a partire dai 9 anni di età, ed assenti a precedenti valutazioni 36. La

valutazione a diverse età della nostra paziente 1 femmina ha similmente mostrato un

peggioramento della sintomatologia neurologica, sebbene non sia stato possibile

visionare RMN encefalo a diverse età per la ricerca delle alterazioni descritte (riduzione

del volume della sostanza bianca, dilatazione dei ventricoli e riduzione degli emisferi

cerebellari). Una nuova caratteristica del fenotipo della sindrome da microduplicazione

del gene MECP2 viene delineata nel lavoro di Budisteanu M. et al. 87. Il paziente

descritto presenta in aggiunta alle caratteristiche cliniche tipiche, ipercinesia. Tale

caratteristica viene posta in contrasto con l’ipoattività, più frequentemente riscontrata

nei pazienti affetti, ed accomuna il paziente descritto al nostro paziente 3.

Le dimensioni della regione Xq28 duplicata sono normalmente variabili da 0.3 a

4 Mb, sebbene in circa il 5% dei pazienti maschi affetti sia riportata una duplicazione di

almeno 8 Mb, evidenziabile all’analisi del cariotipo. Non esiste un riarrangiamento

ricorrente e pertanto in ogni paziente variano le posizioni dei punti di rottura e

l’estensione del riarrangiamento. Dai dati della letteratura emerge che la gravità del

fenotipo non è dipendente dalle dimensioni del riarrangiamento, in quanto fenotipi

severi si riscontrano anche in pazienti con minime microduplicazioni. Considerando i

pazienti riportati in questa tesi, i pazienti maschi (pazienti 2 e 3) hanno un fenotipo più

grave rispetto alla paziente femmina (paziente 1) pur avendo un riarrangiamento molto

più piccolo (308 e 340 kb vs 2.10 Mb). Risulta pertanto rilevante il ruolo dei geni

contenuti nella regione riarrangiata per l’esplicazione del fenotipo. Negli studi di

correlazione genotipo-fenotipo è stato dimostrato che la minima regione critica (MCR)

della duplicazione coinvolge i geni MECP2 ed IRAK1 29,30,51,54. Il gene MECP2 (methyl

CpG binding protein 2; OMIM:300005) rappresenta il principale gene dosaggio-

sensibile che contribuisce al fenotipo neurologico e il suo ruolo è così fondamentale che

56

la sindrome da microduplicazione Xq28 può essere indicata come “sindrome da

duplicazione del gene MECP2”. Il gene IRAK1 (interleukin-1 receptor-associated kinase

1; OMIM:300283) è coinvolto nella risposta immune e può pertanto contribuire alla

suscettibilità alle infezioni presente nella sindrome 88,89. Mutazioni in IRAK1 causano

immunodeficienza, mentre non è noto il ruolo causativo di duplicazioni dell’intero gene.

Di recente, grazie ad una collaborazione internazionale, lo studio della

microduplicazione in cinque femmine ci ha permesso di restringere la minima regione

critica al solo gene MECP2, attribuendo un ruolo patogenetico relativamente alle

infezioni ricorrenti al gene MECP2 stesso e non al gene IRAK1, non compreso nella

duplicazione di una paziente con frequenti polmoniti (Bijlsma et al., in preparazione).

Ad oggi non è conosciuto il meccanismo che correla il livello di espressione di MeCP2

e la funzionalità del sistema immune; meglio conosciuta è la funzione di MECP2 a

livello del SNC. La proteina MeCP2 è espressa nei neuroni maturi ed il suo livello

aumenta nella vita post-natale, durante l’infanzia, testimoniando che la sua funzione è

critica nei neuroni maturi, dopo che sono stati coinvolti nella sinaptogenesi 90. Il SNC è

altamente sensibile ai livelli di espressione di MeCP2 e pertanto il livello e la funzione

di tale proteina sono strettamente regolati. L’iperespressione di MeCP2 determina un

fenotipo neurologico post-natale nel topo e si può pertanto concludere che mutazioni

gain-of-function e duplicazioni di MECP2 siano alla base di patologie

neurocomportamentali nell’uomo quali varianti della sindrome di Rett ed autismo 91,92. I

meccanismi di danno indotti dall’iperespressione di MeCP2 a livello del SNC possono

essere diversi. La proteina MeCP2 iperespressa potrebbe sequestrare proteine con le

quali interagisce. In alternativa, MeCP2 iperespressa potrebbe non essere strettamente

regolata a causa della disproporzione con i livelli degli enzimi modificatori. Infine, si

potrebbe alterare l’espressione di altri geni, tramite la repressione di geni o la

repressione di bersagli in maniera incontrollata.

La duplicazione di ulteriori geni nella regione Xq28, l’interruzione di alcuni geni

nei punti di rottura e l’effetto posizionale su geni a distanza possono contribuire a

sviluppare o modificare il fenotipo. E’ noto, infatti, che anche geni siti fino a 10 Mb dai

breakpoints possono contribuire allo sviluppo di un fenotipo 93.

Considerando la minima regione critica dei nostri tre pazienti descritti, essa

corrisponde alla microduplicazione del paziente 2 (chrX: 153,197,498-153,505,485), ed

57

a conferma delle precedenti osservazioni, i geni MECP2 ed IRAK1 sono compresi.

All’interno della regione sono contenuti inoltre i seguenti 10 geni: NAA10, RENBP,

HCFC1, TMEM187, MIR718, OPN1LW, TEX28P2, OPN1MW, TEX28P1, OPN1MW2.

In corrispondenza dei punti di rottura si interrompono 2 geni, ARHGAP4 e TEX28, la

cui funzione non è attualmente nota.

Considerando il riarrangiamento presente nella nostra paziente 1, che

rappresenta il più esteso riarrangiamento identificato nella nostra casistica, esso

comprende 59 geni in aggiunta a MECP2 ed IRAK1. Tra questi 59 geni, alcuni risultano

espressi nel cervello: ATP2B3, PNCK, SLC6A8, PDZD4, FLNA, ATP6AP1, GDI1 e

RAB39B. I geni SLC6A8 (solute carrier family 6, member 8; OMIM:300036) e FLNA

(filamin A;OMIM:300017) sono geni conosciuti come causativi di deficit intellettivo.

Alcuni lavori hanno, inoltre, associato il gene FLNA ai disturbi gastrointestinali

assimilabili alla pseudo-ostruzione cronica intestinale, potendo giustificare la stipsi

presente nei pazienti affetti 94. In un paziente affetto la duplicazione del gene FLNA è

stata inoltre associata a disfunzione vescicale 28. Recentemente GDI1 è stato considerato

un gene candidato per il deficit intellettivo in maschi affetti provenienti da 4 diverse

famiglie 32. E’ stata inoltre notata la sua correlazione con la microcefalia, presente in 5

casi sui 8 considerati, con duplicazione del gene 29. Precedentemente tale gene era già

considerato responsabile di XLMR non sindromico 95. Geni che possono essere

responsabili di infezioni ricorrenti oltre ad IRAK1 sono: BCAP31, NEMO e GAB3.

NEMO (NF-KAPPA-B essential modulator; OMIM:300248) è responsabile di una

sindrome caratterizzata da immunodeficienza ed incontinentia pigmenti 96. I rimanenti

due geni sono coinvolti nei meccanismi immunitari.

Alcune regioni cromosomiche sono soggette a microdelezioni e

microduplicazioni reciproche. Poiché si determina in entrambi i casi una condizione

patologica con deficit intellettivo, si evidenzia che le funzioni molecolari controllate da

tali regioni risultano danneggiate sia in delezione che in duplicazione. Ne sono esempi

la regione 17q11.2 (sindrome di Smith-Magenis in delezione, sindrome di Potocki-

Lupski in duplicazione), la regione 7q11.23 (sindrome di Williams in delezione,

sindrome da duplicazione 7q11.23), la regione 15q11q13 (sindrome di

Angelman/Prader-Willi in delezione, sindrome da duplicazione 15q11q13), la regione

22q11.2 (sindrome VeloCardioFaciale in delezione, sindrome da duplicazione 22q11.2).

58

Una situazione simile si verifica nella regione Xq28, in cui alterazioni in loss-of-

function determinano la sindrome di Rett, mentre alterazioni gain-of-function

determinano la sindrome da duplicazione di MECP2. Dal punto di vista clinico, le

caratteristiche comuni tra le due sindromi sono rappresentate da: deficit intellettivo,

disturbi comportamentali, autismo, epilessia, ansietà, stereotipie, anomalie del respiro,

ridotto controllo motorio. La sovrapposizione di sintomi neurologici in presenza di

meccanismi molecolari opposti è legata al coinvolgimento di molecole coinvolte nei

processi cognitivi e comportamentali che partecipano a meccanismi omeostatici

altamente regolati 97. L’incapacità di mantenere l’omeostasi neuronale a livello

molecolare può determinare risultati comuni a diverse vie, quali deficit intellettivo,

epilessia ed autismo. I disturbi neurocomportamentali, infatti, non sono cellula-specifici,

ma coinvolgono il network neuronale, potendo confluire su vie comuni ad altre forme di

deficit intellettivo e potendo determinare uno stesso risultato tramite vie alternative. Una

correlazione è stata notata tra il numero di copie del gene MECP2 e la gravità del

quadro clinico: i pazienti con il gene triplicato hanno un fenotipo più grave di quelli con

il gene duplicato 51.

Al momento attuale non è conosciuta la sindrome reciproca da microdelezione

Xq28, con breakpoints sovrapponibili. In OMIM è riportata una sindrome da

microdelezione Xq28 di dimensioni inferiori, da delezione dei geni contigui ABCD1

(ATP-binding cassette sub-family D, member 1; OMIM:300371) e BCAP31 (B-cell

receptor-associated protein 31; OMIM:300398) 98. I tre pazienti descritti presentano

ipotonia neonatale profonda, difficoltà di alimentazione, colestasi epatica e disturbi

sensoriali (ipoacusia in 2 e deficit visivo in un paziente). In due casi la microdelezione

risulta ereditata dalla madre sana. I casi di delezione dell’intero gene MECP2 sono rari,

probabilmente perché data la funzione della proteina, il fenotipo clinico è così grave da

risultare incompatibile con la vita, o compatibile con una sopravvivenza limitata 99.

Nella maggioranza dei casi di microduplicazione Xq28 nei maschi il

riarrangiamento risulta ereditato dalla madre sana. I casi ad insorgenza “de novo” sono

più frequenti nelle femmine, nell’ambito di disomia funzionale originata da una

traslocazione X-Y o X-autosoma 20,23,28. E’ pertanto fondamentale nell’ambito della

consulenza genetica effettuare l’analisi per la specifica alterazione anche nella madre.

Nell’ambito di un riarrangiamento evidenziato in una paziente femmina è inoltre

59

indispensabile effettuare analisi tramite FISH della regione Xq28 nella probanda e nei

genitori, al fine di ricercare una eventuale traslocazione, che modifica il rischio di

ricorrenza della coppia per eventuali future gravidanze. Anche nei casi ad insorgenza

“de novo” può essere proposta alla coppia la diagnosi prenatale invasiva

(villocentesi/amniocentesi), per la ricerca della specifica alterazione anche nelle

successive gravidanze. Non è infatti escludibile a priori la possibilità di mosaicismo

germinale, cioè di più spermatozoi od ovociti alterati nei genitori. La sola valutazione

ecografica prenatale non è sufficiente ad effettuare la diagnosi, dato che gli elementi

patologici riscontrati in alcune gravidanze sono aspecifici: IUGR, aumento dell’α-

fetoproteina, arteria ombelicale unica, dilatazione delle anse intestinali e della cisterna

magna 21,28. Un’altra opzione, non attuabile in Italia, ma solo all’estero, consiste nella

selezione degli embrioni tramite diagnosi diagnosi genetica preimpianto (PGD), con

successivo impianto tramite metodiche di fecondazione assistita (PMA) di soli embrioni

che non presentano la microduplicazione.

Nell’ambito delle consulenze dismorfologiche è importante considerare la

sindrome da microduplicazione Xq28 in tutti i casi di ipotonia infantile, ritardo

psicomotorio con linguaggio assente o limitato, comportamento autistico, infezioni

ricorrenti, progressiva spasticità ed epilessia, soprattutto in caso di un soggetto

maschile. In alcuni casi può essere riportata una regressione. Indispensabile è, pertanto,

l’impiego dell’analisi di array-CGH, che rappresenta attualmente il miglior test

diagnostico per la diagnosi molecolare della sindrome, poiché definisce la posizione,

l’estensione ed il contenuto genico della duplicazione. Una piattaforma array-CGH

specifica del cromosoma X rappresenterebbe un potente strumento per l’identificazione

di aberrazioni submicroscopiche nelle famiglie con ritardo mentale legato all’X

(XLMR) 50,66. Nell’infanzia, prima che le caratteristiche facciali peculiari possano

diventare evidenti, la sindrome entra in diagnosi differenziale con la sindrome α-

talassemia con ritardo mentale legata all’X (ATRX), caratterizzata da dismorfismi

facciali caratteristici, anomalie genitali, severo ritardo psicomotorio, deficit intellettivo

ed ipotonia. La diagnosi molecolare permette di distinguere le due patologie.

Per quanto riguarda la prognosi, è importante ribadire che la duplicazione di

MECP2 ha penetranza del 100% nei maschi, ma il fenotipo è variabile principalmente a

causa dei diversi geni contenuti. Le femmine sono sintomatiche nei casi di inattivazione

60

casuale del cromosoma X o per traslocazione X-autosoma. Le femmine affette devono

essere considerate al pari dei maschi affetti e devono, pertanto essere programmati

simili controlli clinici strumentali nel tempo.

Al fine di mettere in contatto le famiglie con figlio affetto da microduplicazione

Xq28 con altre famiglie aventi la stessa patologia in famiglia, risulta utile fornire i

riferimenti di un’associazione di genitori, reperibili al sito WEB

http://www.mecp2duplication.com/cms/.

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128

Xq28 duplications including MECP2 in five females: expanding the phenotype to

severe mental retardation

E.K. Bijlsmaa*

, A. Collinsb, F.T. Papa

c, M.I. Tejada

d, P. Wheeler

e, E.A.J. Peeters

f, A.C.J. Gijsbers

a, C.A.L.

Ruivenkampa, J.M. van der Kamp

a, M. Kriek

a, M. Losekoot

a, J. Crolla

g, M. Pollazzon

c, M. Mucciolo

c, E.

Katzaki c, V. Disciglio

c, M.I. Ferreri

h, A. Marozza

c, M.A. Mencarelli

c, C. Castagnini

c, L. Dosa

c, F. Ariani

c,

F. Maric, R. Canitano

i, G. Hayek

i, M.P. Botella

j, B. Gener

k, M. Mínguez

l, A. Renieri

c

Abstract

Duplications leading to functional disomy of chromosome Xq28, including MECP2 as the critical

dosage-sensitive gene, are associated with a distinct clinical phenotype in affected males,

characterized by severe mental retardation delay, infantile hypotonia, progressive neurologic

impairment, recurrent infections, bladder dysfunction, and absent speech.

Affected females with Xq duplications including MECP2 are rare. Only recently submicroscopic

duplications of this region on Xq28 have been recognized in four females, all in combination with

random or disturbed X-chromosome inactivation (XCI). Based on this small series, it was concluded

that in females with MECP2 duplication and random XCI, the typical symptoms of affected boys are

not present. We present clinical and molecular data on a series of five females with an Xq28

duplication including the MECP2 gene and compare them with the previously reported cases of small

duplications in females. The collected data indicate that the associated phenotype in females varies

and may be as severe as seen in affected males.

Key words

MECP2 duplication, Xq28 duplication, X-inactivation, mental retardation in females, IRAK1

129

Introduction

Duplications leading to functional disomy of chromosome Xq28 are associated with a distinct

clinical phenotype in affected males, characterized by severe mental retardation delay, infantile

hypotonia, progressive neurologic impairment, recurrent infections, bladder dysfunction, and absent

speech (see [1] and [2] for reviews). This complex of features is known as the Xq28 microduplication

syndrome or Lubs syndrome and was first described by Pai et al. and Lubs et al., followed by many

others [3,4]. The reported Xq28 duplications vary in size and location, however the majority are

intrachromosomal duplications ranging from 0.3 to 2.3 Mb. Alternatively, duplications may be the

result of another mechanism, such as rearrangements between Xq and Xp, or between Xq and the Y

chromosome [5]. The methyl-CpG binding protein (MECP2) gene on Xq28 is supposed to be the

critical dosage-sensitive gene responsible for the severe phenotypes observed in patients with a

duplication. In males, over 140 cases of Xq28 duplications including MECP2 have been described to

date [5-24].

Female patients with an Xq28 duplication are rare. In familial cases with X-linked pedigrees,

female carriers of an Xq duplication are usually asymptomatic, due to skewed X-chromosome

inactivation (XCI) pattern with preferential inactivation of the rearranged chromosome. Until

recently, only three females had been reported with large, cytogenetically visible Xq28 duplications

(Bialer, [25], summarized in [21]). Clinically, these females presented with severe developmental

delay and other features similar to those observed in affected males. In all cases the duplication was

the result of an unbalanced X-autosome translocation, therefore explaining the absence of skewing

of the aberrant X-chromosome and the effect on the phenotype. After introduction of array analysis,

smaller, submicroscopic duplications of this region on Xq28 have been recognized in four females, all

in combination with random or disturbed XCI [26-28]. The patient with a MECP2 duplication

described by Ariani et al. [29] should not be included in this series, as this result was later explained

by a 47,XXX karyotype (F. Ariani, personal communication). Based on this small series, it was

concluded that in females with MECP2 duplication and random XCI, the typical symptoms of affected

boys are not present [27]. Instead, the clinical signs in female patients consist of unspecific mild to

moderate mental retardation, combined with variable symptoms (autistic features, recurrent

infections in early childhood, constipation, and late-onset neurological features).

Here we present clinical and molecular data on a series of five females with an Xq28

duplication including the MECP2 gene and compare them with the previously reported cases of small

duplications in females. In patient 1, a MECP2 duplication was the result of a rare insertion

duplication of a small segment of Xq28 into an autosome. Patients 2 and 3 are functionally disomic

130

for region Xq28 due to an unbalanced X-autosome translocation. The fourth patient is a mildly

affected obligate carrier from an X-linked mental retardation (XLMR) family. She carries a familial Xq

duplication including MECP2, but unlike previously reported carrier females, she showed random X-

inactivation. Patient 5 carries a small intrachromosomal duplication of Xq28, including MECP2. In

contrast to the previously reported series of affected females, our series includes a female patient

with the typical symptoms of affected boys, therefore expanding the phenotypic spectrum of small

Xq28 duplications including MECP2 in females to severe mental retardation.

131

Methods

Patients

Patients were evaluated in a diagnostic setting because of mental retardation (in the family).

Standard karyotyping was performed by G-banding. Genomic DNA was extracted from whole blood

using standard procedures.

Array platforms

The duplication in patients 1 and 5 were characterized by an Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0

(Affymetrix Inc, Santa Clara, California, USA). DNA was processed according to the manufacturer’s

instructions. In patient 1, data analysis was carried out with Genotyping Console 3.0.2.

The duplications in patient 2 and 3 were detected by an Agilent 44K (Agilent, Santa Clara, California,

USA). DNA was processed according to the manufacturer’s instructions. Data analysis was carried out

with Agilent’s Analytics.

The duplication in patient 4 had been previously detected in her son, using an X-chromosome specific

tiling-path array. Both the index patient and the array technique have been previously described

[30].

Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA)

MLPA with a specific kit for Rett syndrome (Salsa P015C, MRC Holland, Amsterdam, The Netherlands)

initially detected the duplication of MECP2 in patient 1. SNP array was performed to characterize the

size of the duplication. Confirmation of the detected CNV of patient 4 was carried out by using the

same MLPA kit for Rett syndrome. Data analysis was performed with GeneMarker software

(Softgenetics, USA).

Fluorescent In Situ Hybridisation (FISH)

FISH analysis was carried out by standard procedures, using BAC clones selected within the

duplicated and deleted regions (patient 1, 2, 5) and TelVision subtelomeric Xq probe (Vysis) (patient

3).

X-inactivation studies

In patients 1, 4, and 5, X-chromosome inactivation was studied using the highly polymorphic small

tandem repeat within the human androgen receptor gene, following the standard technique

published by Allen et al. [31]. Inactivation was considered to be random if the ratio of active to

inactive X was less than 75:25. Extreme skewing of X inactivation was defined as the preferential

inactivation of one X chromosome in 90–95% of cells [32].

132

Results

All patients showed a normal karyotype by G-banding.

Mapping positions are according to the hg18 assembly of the UCSC genome browser.

Case reports

Patient 1 is a 10-year old girl, first born to a 24-year old mother and a 25-year old father. She

was born at term with a birth weight of 3040 g. Apgar scores were 8 and 10 at 1 and 5

minutes, respectively.

It was noted early on that her neuromotor development was slow (rolling over at 10 months of

age, standing and walking a few steps (both with support) at the age of 3.5 years). She

developed no speech.

Her health is severely compromised. She had noisy breathing from birth on and laryngoscopy

at the age of 2.5 years showed laryngomalacia. In infancy she was repeatedly admitted

because of recurrent infections (at 7 years of age she had had several episodes of pneumonia

(13 times), otitis media (five times), and pyelonephritis (twice)). She had surgery for

reimplantation of the right urether. Her deciduous teeth did not fall out spontaneously,

resulting in a double row of teeth, and had to be removed surgically.

At the age of 8 years and 2 months she was operated because of a luxation of the right hip and

a subluxation of the left hip. Afterwards her condition deteriorated, she lost the ability to

crawl and to walk with support. At the age of 8.5 years she developed febrile convulsions,

followed by seizures and she was diagnosed with Lennox-Gastaut type of epilepsy, with a

poor response to medical treatment. She has severe constipation, sleeping problems (refusing

to go back to sleep after waking up in the middle of the night), and feeding problems (unable

to eat solid food). She has a nasogastric tube for fluid, extra feeding and medication.

In the first year of life she made little contact, but this improved gradually and she became a

friendly, sociable girl. She disliked changes in daily routine and loved spinning toys. At 8

years of age she was able to communicate using pictures, she has limited understanding of

sign language. After the hip surgery and development of epilepsy she lost most of these

abilities. Also from that time on, parents noted loss of appetite, loss of energy and reported

her to be increasingly lethargic. She showed a delayed reaction to stimuli. She was

hypersensitive to loud noise and sunlight.

133

Parents are healthy and non-consanguineous. The maternal grandfather developed epilepsy

around the age of 40 years, otherwise the family history is unremarkable.

When first assessed at the age of 17 months, her head circumference was 50.5 cm (+2.3 SDS).

She showed mild dysmorphic features: prominent broad and high forehead, thin curly hair,

telecanthus and epicanthus, thin eyebrows, small nose, full cheeks, open mouth with everted

lower lip, broad alveolar ridges, narrow palate, widely spaced teeth, slightly pointed ears,

short neck and inverted nipples (Fig 1a).

On examination at the age of 3 years and 7 months her height was 98 cm (-0.8 SDS), her

weight 16.4 kg, (+0.7 SDS for height) and her head circumference 52.5 cm (+1.7 SDS). Most

facial features had become more obvious, however her forehead had grown normal and her

philtrum was short and prominent (Fig 1b). She drooled constantly. Neurological examination

showed axial and peripheral hypotonia and brisk tendon reflexes. She had no apparent

breathing abnormalities.

On follow up at the age of 7 years (Fig 1c) she could pull herself up to her knees and stand

with support. She made stereotypic movements with her hands, with preserved hand function.

On follow up at the age of 9 years her height was 128 cm (-1.5 SDS), her weight was 25 kg (-

0.5 SDS for height) and her head circumference 54.5 cm (+1.4 SDS). She had difficulty to sit

unsupported. She had no scoliosis. She had a limitation of 20 degrees in the extension of right

hip and knee, for which she wears nightly splints.

A brain MRI at the age of 10 months showed mildly enlarged ventricles and prominent sulci,

suggestive of mild brain atrophy. MRI was repeated at 4 years of age and showed a Dandy-

Walker malformation and demyelination.

Routine MLPA of the MECP2 gene showed a duplication of this gene. SNP array analysis identified a

279 kb duplication on Xq28 (SNP_A-8289707-> CN_919279) and a 207 kb duplication on

chromosome 3q25.33q26.1. The duplication on Xq28 encloses eight genes including MECP2,

OPN1LW, TEX28P2, OPN1NW, TEX28P1, TEX28, OPN1NW2 and TKTL1. Parental analysis showed that

both rearrangements occurred de novo. X-inactivation analysis unraveled a random-methylation

134

(35:65). Subsequent FISH analysis showed that the X-fragment has been translocated to chromosome

3 and that the duplicated segments are adjacent (Fig. 2a).

Patient 2 is a currently 7-year old girl, born at term after an uneventful pregnancy with a birth

weight of 2940 g. Postnatally, she was diagnosed with laryngomalacia at 3 days of age, which

improved with time.

She presented at the age of 2 years and 8 months with failure to thrive despite a good appetite

(height and weight < -2.0 SDS), microcephaly, and developmental delay. She has had

recurrent urinary tract infections, with no underlying abnormalities.

Her development was moderately delayed, with sitting at the age of 14 months and crawling

at 22 months. She had no speech, although her level of understanding was thought to be better

than her expressed speech. She had some repetitive behaviour (hair pulling, hand flapping,

biting herself). She had sleeping problems (refused to go back to sleep after waking up in the

middle of the night).

On examination she was microcephalic (head circumference 45.6 cm (-2.1 SDS). She had no

apparent dysmorphic features, apart from prominent infraorbital fullness (the appearance is of

very prominent ‘bags’ under her eyes) (Fig). She had repeated chest infections and a

persistent cough.

She was seen for follow up at the age of 4 years and 6 months. She had started to walk at the

age of 3 years and 9 months, she walked with a wide-based gait. She was smiling a lot and

she might use ‘mama, dada, and bye-bye’ appropriately, but had no other words. Her

repetitive behaviour was getting less as her communicating skills had increased. Her sleeping

problems had not responded to melatonin. She was about to start at a normal school, with full

time personal help.

Apart from a marginally elevated TSH, additional investigations were normal, including an

EEG and a brain MRI.

Array CGH analysis showed a 1.69 Mb duplication on chromosome Xq28 and a 1.54 Mb deletion on

chromosome 21q22.3. Confirmatory FISH experiments using tiling path BAC clones, showed that BAC

clones 119A22, 103M23, and 402H20 from the Xq28 region have been translocated to the distal long

arm of one of the chromosomes 21 homologues. FISH analysis with specific clones from the distal

21q region, 162F19 and 71A7, confirmed the telomeric deletion of one of the chromosome 21

homologues. Therefore, this patient carries a cryptic unbalanced translocation between

135

chromosomes X and 21, der(21)t(X;21)(q28;q22.3). Studies of parental chromosomes showed that

the rearrangement is de novo.

Patient 3 is a 6.5-year old girl, first child of non-consanguineous and healthy Caucasian

parents. She was born at term after an uneventful pregnancy by caesarian section, due to

breech presentation. At birth, weight was 2320 g (-1.5 SDS), length 47 cm (-1.0 SDS) and

head circumference 33.5 cm (-0.5 SDS). Apgar scores were 8 and 9 at 1 and 5 minutes,

respectively.

Her development was delayed: sitting at the age of 10 months, walking with ataxic gait at 24

months, babbling at 4 years. She had feeding difficulties and growth deficit. In infancy, she

suffered from constipation. She had several episodes of upper airway infections (bronchitis,

pneumonia, and tonsillitis) since the age of 7 months, as well as nocturnal apnea.

She was evaluated at the age of 5 years. She was moderately interactive and she had a

sociable behaviour. On follow up at the age 6 years and 5 months she showed little interest in

people. She had developed dystonic movements. On physical examination her height was 112

cm (-1.0 SDS) and weight 23 kg (+0.7 SDS). She was microcephalic (head circumference

48.1 cm, <-2.0 SDS), with a round face, up-slanting palpebral fissures, severe bilateral ptosis

of eyelids (also noted in her paternal grandmother), bilateral epicanthic folds, flat and wide

nasal bridge, small and widely spaced teeth, normal hand and foot length, bilateral hallux

valgus, and cutis marmorata. She walked with ataxic gait, did not speak and she made

repetitive movements with her head (stretching upward).

A cerebral CT recorded at the age of 7 months showed a cyst of the septum pellucidum and

cavum vergae. A brain MRI at 2 years and 7 months of age showed an immature aspect of

superficial white matter, mainly in the frontal lobes. An EEG, recorded at the age of 4 years

and 10 months showed slowing down of background rhythm. Endocrinological evaluation

performed for her growth deficit showed hypothyroidism. CD4/CD8 ratio and the study of T-

lymphocyte subpopulations were normal.

Array CGH analysis identified a chromosome X subtelomeric duplication of about 2.10 Mb (Fig. 2b).

Confirmatory FISH experiments showed that the Xq28 region has been translocated to the short arm

of one of the chromosomes 22 homologues. Studies of parental chromosomes showed that the

rearrangement is de novo. The karyotype therefore is 46,XX.ish der(22),t(X;22)(q28;p13)(VAMP7+)dn.

Commento [e1]: please specify what is meant: peripheral, cortical?

136

Patient 4 is a member of an X-linked mental retardation family. The index patient in this

family (Fig. 3, V-1) was included in a Spanish collaborative XLMR study. The duplication

was identified by an X-chromosome array-CGH and previously published (case 5, pedigree E

in Madrigal et al., 2007). Subsequent attempts to study the complete family were in vain. The

family consists of three known affected males in three generations (Fig 3). Three other males

died a few days after birth and were probably also affected. Only one branch of the family

could be studied (III-6; IV-2; IV-3 and the index patient V-1). Clinical data on the index, his

mother and grandmother are presented, clinical data from other family members are scarce,

but confirm X-linked inheritance of severe mental retardation.

Patient 4, mother of the index patient (IV-3, Fig 3) was born to healthy non-consanguineous

parents. Pregnancy and delivery were uneventful. During early childhood she did not show

signs of developmental delay, speech development was normal. She presented with learning

difficulties at school and she could not finish primary school. She is currently rather

impulsive and has a strong character. Her cognitive level is below average (IQ 84) and below

the level in her family (see Suppl. Table I for Wechsler Adult Intelligence Scale (WAIS-III)

results). She lives with her mother.

On physical examination at 26 years of age her height was 162 cm (0 SDS), weight was 68 kg

(+1,5 SDS), and OFC 56.5cm (> +2 SDS). Apart from fifth finger clinodactyly she had no

apparent dysmorphic features (Fig 1g).

Patient 4’s son, the index patient in this family, was born to nonconsanguineous parents. The

mother inhaled cocaine during the first month of pregnancy and smoked 4 cigarettes per day.

Delivery was uneventful at 41 weeks of gestation, Apgar scores were 8 and 9 at 1 and 5

minutes respectively, and birth parameters were in the normal range: weight 3290 g (-0,5

SDS), length: 50 cm (+0,5 SDS) and OCF 35.5 cm (= +1 SDS). Developmental delay was

noted early on and he was first examined at the age of 9 months when he was not able to sit.

At 1 year of age he was diagnosed with gastroesophageal reflux disease. He is prone to mild

respiratory infections and bronchitis.

On physical examination at 3 years and 4 months of age, he showed facial hypotonia,

including an open mouth (Fig 1f). He had no speech. He showed very little interaction and

rarely smiled. Growth parameters were: height 88 cm (< -1.5 SDS), weight 10.4 kg, OFC 48

137

cm (-1,9 SDS). He had clearly increased peripheral muscle tone in lower limbs and axial

hypotonia. He showed several dysmorphic features: a narrow forehead, discrete malar

hypoplasia and full cheeks, thin nose with rather hypoplastic alae nasi, and small mouth. He

showed marked dark rings under the eyes. He had clinodactyly of fifth fingers and slightly

clubbing of fingernails. He had palpable undescended testes.

Electroencephalograms examinations did not reveal any pathology. MRI scan of the brain

showed no evident structural anomalies, but somewhat delayed myelination.

Patient 4’s mother, grandmother of the index case (III-6) is healthy, with a cognitive level

within the normal range (see Suppl. Table I for the results of formal testing). She takes care of

her daughter and grandson. She reported not to be very skillful with her hands and to suffer

from a panic disorder.

On physical examination weight and height were within normal limits, OFC is 56.5 cm

(above 97th centile; > +2 SDS). She had large ears. Apart from clinodactyly of fifth fingers

and hyperextensible interphalangeal joints, no dysmorphic features were present (Fig 1h).

Her son (IV-4) suffered from meningitis when he was 9 days of age. Subsequently he

presented with severe mental retardation, he never developed speech although he was able to

understand simple tasks. He walked independently at the age of 3 years despite ataxic gait. He

presented progressive epilepsy at 11 years of age, had recurrent episodes of severe pneumonia

and died when he was 15 years old due to a complicated respiratory infection.

MLPA confirmed the Xq duplication in the index patient (Fig. 2c) and identified the same

duplication in his mother (patient 4, IV-3) and grandmother (III-6, Fig. 2c). X-inactivation

studies in the mother, patient 4, showed random X-inactivation (63.3:36.7), whereas it

showed skewed X-inactivation in the grandmother (88.2:11.8).

Patient 5 is an 8-year old girl, first born to 29-year old parents. Maternal hypertension

developed at 36 weeks of gestation. The girl was born at 38 weeks of gestation, weighing

3430 gram and with normal Apgar scores.

Apart from eczema, no health problems were noted in the neonatal period. At 6 months of age

hypotonia and developmental delay became apparent. Neurological evaluation at the age of 18

months left this unexplained. Brain MRI and EEG were normal.

138

Her motor development was delayed (walking around 22 months of age), as was her speech

development (first words around 3 years of age). At the age of 7 years she could speak in 5-

word sentences, though she was at times difficult to understand. She was in a special needs

class. She had difficulties with social interaction and with changes in her environment or

routine. Formal assessment for autism could not diagnose autism spectrum disorder.

When first assessed in a genetics clinic at the age of 22 months, she had a history of recurrent

otitis media. On physical examination, length was 82.2 cm (-0.5 SDS), weight 10.8 kg (-1.0

SDS), and head circumference 47.7 cm (+0.5 SDS). Apart from slight epicanthal folds, there

were no dysmorphic features. The skin revealed scattered patches of eczema. There was

muscular hypotonia.

On follow up at the age of 7 years, she had a history of chronic constipation and chronic ear

infections. On examination, her height was 121.8 cm (-0.5 SDS), her weight was 23 kg (-0.2

SDS), and her head circumference was 53.3 cm (+1.0 SDS). She had no apparent dysmorphic

features.

Family history is unremarkable, her younger sister is doing well without concern for any

delays.

SNP array analysis detected a 107.5 kb duplication on Xq28 and a 824.5 kb duplication on

chromosome 2q23.1-q23.2. FISH experiments with BAC clone 119A22 confirmed the

duplication on the X chromosome. X inactivation studies showed skewing, though not

complete (84:16). Parental analyses showed that mother had neither of the duplications. The

phenotypically normal father carried the 2q23 duplication, testing for the Xq28 region

however was repeatedly inconclusive.

Array data are summarized in Table I and figure 4. Table II provides a summary of the cytogenetic and

phenotypic characteristics of this series of five female patents with a MECP2 duplication. They all had

mental retardation or learning difficulties. Accompanying features were mixed, but speech delay and

recurrent infections were frequent symptoms. Notably, patient 1 had the most features as seen in

affected boys.

139

Discussion

We describe a series of five females carrying a submicroscopic Xq28 duplication involving

MECP2. Though the phenotypic effect of a MECP2 duplication is already well documented in males, it

is a comparatively rare cause of mental retardation in females. In a recent paper only two cases out

of 1,000 unselected patients with mental retardation were identified [27]. Though females with a

large Xq28 duplication have been documented (as the results of an X-autosome translocation, Bialer,

[21,25]), only after introduction of array techniques females with small de novo duplications

including MECP2 have been reported [26-28]. In addition, two affected carrier females in X-linked

families have been reported [15,20]. Our series is compared with published cases in Table II, array

data (if available) are summarized in Figure 4. As can be deduced from Figure 4, the minimal critical

region in this series of females contains only the MECP2 gene, therefore confirming its role in mental

retardation in females.

Previously, it was stated that females with a (de novo) MECP2 duplication lack the typical

symptoms of affected boys, such as seizures, poor speech development, and recurrent infections

([27], Table II). Several females in our series however, do have poor speech development and

recurrent infections. Furthermore, as patient 1 in our series only got seizures after the age of 8 years,

the younger patients with a de novo duplication may still be at risk to develop this symptom.

Compared to the compiled data in affected males with a MECP2 duplication (table II), the course of

the disease in patient 1 is strikingly similar, with regression after the start of seizures. Also, follow-up

of patient 3 indicated regression. Based on our data, we therefore conclude that the associated

phenotype in females with a MECP2 duplication may be as severe as seen in affected males.

In our series, several mechanisms were found that resulted in functional disomy for region

Xq28: X-autosome translocation, duplication (either familial or de novo) on the X-chromosome

combined with random X-inactivation, and insertion duplication into an autosome.

X-autosome translocations

In unbalanced X-autosome translocations, the translocated segments will escape X-

inactivation and cause functional disomy for genes contained within the translocated segments. In

our series, patients 2 and 3 carry an unbalanced X-autosome translocation, as does the case

described by Auber et al. Previously reported X-autosome translocations have been excluded from

the comparison as duplicated regions where either very large (~16 Mb) or undefined (ref). Patients in

this group show various phenotypes, ranging from mild mental retardation in patient 2 to a more

severe clinical course in patient 3, with regression, loss of attention and emerging dystonic and

140

repetitive movements, to a clinical picture that is comparable with the male Xq28 duplication

syndrome in the patient described by Auber et al. [26]. As the concurrent imbalance in these X-

autosome patients is most likely of minor significance (see below), the phenotype is most likely

determined by the Xq duplication. In this small series the size of the Xq duplication seems to

correlate with the severity of the clinical course.

Intrachromosomal Xq duplications; familial and de novo

Our series consists of one female carrying a familial Xq duplication including MECP2. Patient

4 is a mildly affected obligate carrier from an X-linked mental retardation (XLMR) family. Previously

reported cases demonstrated asymptomatic carriers with extreme or complete skewing of one of

their X chromosomes. Unlike previously reported carrier females however, patient 4 showed random

X-inactivation. Taking only her IQ score into account, she is not mentally retarded, yet she has

notable learning difficulties and a striking difference in IQ compared to her mother. We hypothesize

that this difference in performance is caused by the difference in XCI in mother and daughter and

that the clinical features in patient 4 are caused by random X-inactivation. Previous papers lend

support to this view. Recently, Reardon et al. [20] reported a manifesting carrier with skewed X-

inactivation in the ratio of 70:30. She had non-specific developmental delay, without seizures, speech

problems, or recurrent infections. Furthermore, Kirk et al. [15] describe a manifesting carrier with

mild learning disability who had a mosaic X-inactivation pattern: in blood she showed complete

skewing, however in hair roots XCI was random (74:26). It has been suggested that a 70% skewing or

less will lead to manifestation of the disease in female carriers of a familial Xq duplication [20]. Data

on our patient support this hypothesis and indicate that the resulting phenotype is probably mild.

On the other hand, in a recent study focused on clinical and neuropsychiatric phenotype of MECP2

duplication cariers, three out of nine female carriers of a familial MECP2 duplication had IQs in the

low normal range [19]. Female carriers also had psychiatric symptoms, including anxiety, depression,

and compulsion, despite 100% skewing of X-inactivation in blood. In comparison, the phenotype of

patient 4 may fit into the clinical spectrum depicted in that paper, indicating that low normal IQ and

psychiatric symptoms may be part of the clinical spectrum in female carriers, regardless of their XCI

status. Alternatively, as X-inactivation pattern has only been tested in blood, the females with low

scores in Ramocki’s series may in fact have mosaic XCI, leading to tissue-specific dosage alterations,

and probably to poor performance. A final conclusion awaits further studies.

A separate group is formed by patients with a de novo intrachromosomal MECP2 duplication.

It has been suggested previously that in those cases random XCI may be causative for the phenotype

[20]. To date, two females a de novo Xq duplication of this type and random XCI have been reported,

141

revealing a moderate but aspecific mental retardation in childhood and development of neurological

features in the second decade [27]. Also patient 5 in our series this belongs to this category. Although

the parental origin of her Xq duplication could not be established with confidence, it is highly unlikely

that her father is an asymptomatic carrier. We therefore conclude that her Xq duplication is most

probably de novo. As she is symptomatic, we assumed random XCI in her. Analysis in blood however

showed skewed X-inactivation, though not complete (84:16). This may indicate that skewing needs to

be complete to avoid a phenotypic effect of an Xq duplication. The XCI in patients 4’s mother does

not support this presumption, as she is normal functioning despite incomplete skewing (88:12).

Alternatively, the phenotypic effect in patient 5 may be caused by a mosaic XCI pattern, with random

XCI in other tissues.

Insertion duplication into an autosome

Recently, Makrythanasis et al. [28] reported a patient with an insertion duplication of a small

segment of Xq28 into an autosome, causing a short segment on the X-chromosome to escape X-

inactivation. Also the additional copy of MECP2 in patient 1 is inserted into an autosome and

therefore constitutionally active. Yet the clinical course of both patients is completely different: the

patient described by Makrythanasis et al. is mildly affected, whereas the course of the disease in

patient 1 is comparable to that in males, with regression after the start of seizures. We have no

explanation for this discordance, however a difference in expression level may be postulated. It has

been demonstrated in males that a triplicated MECP2 gene resulted in the most severe phenotype

[11]. Also, in mice higher MeCP2 protein levels lead to more severe phenotypes [33]. Therefore, it

may be speculated that the difference in phenotype is caused by different levels of expression, for

instance because the translocated MECP2 gene in patient 1 has been coupled to a strong promotor,

thus enhancing the MeCP2 level.

On the other hand, expression studies in males have shown that MECP2 mRNA levels do not

correlate with disease severity [19]. Alternatively, under the influence of another promotor,

transcription of the translocated MECP2 gene may have been silenced in the patient described by

Makrythanasis [28].

As yet, the various mechanisms do not correspond to a distinct clinical phenotype, only

familial duplications with random X-inactivation seem to result in a mild phenotype (Table II).

In addition to the Xq duplication, three patients in ours series showed an imbalance of

another chromosome region. In patient 5, the additional duplication was inherited from her

phenotypically normal father, therefore indicating a most probably rare polymorphism. In patient 1,

142

a de novo duplication of 3q on the site of the insertion of Xq in the long arm of chromosme 3 was

found. The duplicated region contains one gene, IL12A. To our knowledge no phenotype has been

demonstrated for a duplication of this gene.

As a result of an unbalanced X-autosome translocation, patient 2 is also monosomic for distal 21q.

The contribution of the deleted genes from this region to her phenotype is probably negligible, as

larger distal 21q deletions have been described without phenotypic effect [34]. Interestingly, second

de novo imbalances were also found in previously reported patients (ref, Table II). In both cases, an

association between the additional imbalance and the clinical phenotype was deemed unlikely.

Many authors have stressed the recurrent infections in males with Xq duplications (Table II).

Smyk et al. have suggested that they result from increased IRAK1 dosage [22]. Our data do not

support this hypothesis, as patient 1 is not duplicated for IRAK1, yet has a typical pattern of recurrent

infections as seen in boys with a MECP2 duplication. As none of the other duplicated genes in the

region are associated with recurrent infections, this clinical course suggests that this symptom can be

attributed to duplication of the MECP2 gene.

Bioinformatic analysis in patient 3 allowed to point out the presence of two microRNAs

(miRNAs): mir-718 and mir-1184. Because miRNAs regulate gene expression mainly through

inhibition of target gene translation, we hypothesized that miRNAs may play a role in the modulation

of some genes responsible for phenotype. In order to identify mir-718 and mir-1184 target sites, we

used the bioinformatic algorithm “TargetScan” (http://www.targetscan.org). Mir-718 has not been

annotated to target sites in human. We found 309 putative mRNA targets with higher score for mir-

1184. Among poorly conserved miRNA family putative targets, we found 3 genes: DUSP9, IRAK1 and

MECP2. We excluded direct correlation of mi-1184 and pathological phenotype, because both miRNA

and target genes are duplicated resulting in a negative feedback control. Nevertheless, we cannot

exclude a possible effect elsewhere in the genome.

In summary, an Xq duplication including MECP2 is described in five females with various

grades of developmental delay. With our series of MECP2 duplication carriers we have extended the

spectrum of the associated phenotype in females. We conclude that a duplication of MECP2 may be

associated with a severe phenotype in both males and females. When occurring de novo,

duplications in this region may be associated with a severe clinical outcome in females when

occurring de novo. However, the highly variable clinical presentation makes genetic counseling in

143

terms of prognosis difficult, especially in prenatal cases. It has been postulated that carriers of a

familial MECP2 duplication may express a phenotype if X-inactivation is not completely skewed. Our

date provide additional evidence for this hypothesis. Further studies of more females with a MECP2

duplication are needed to gain better insight in the clinical variability and in the potential pathology

associated with rearrangements in this area.

Acknowledgments

We thank the patients and their families for their kind collaboration. Our special thanks go to patient

1’s mother, for scrutinizing the internet and thus getting us into contact with patients 2 and 5. Also,

we would like to thank prof.dr. Hilde van Esch, for sharing her knowledge about MECP2 duplications

in females and bringing patients 3 and 4 to our attention.

Part of this work is supported by Telethon grant GTB07001C to A.R. and grant from University of

Siena (PAR 2006) to F.M.

144

Legends

Figure 1. Phenotypical characteristics of individuals with an Xq28 duplication including MECP2

a-c. patient 1, aged 1 year and 5 months (a), 3 years and 7 months (b) and 7 years (c). Note facial

hypotonia, large mouth, and widely spaced teeth. d,e. patient 2, aged 2 years and 8 months (d) and 4

years and 6 months (e). f. Index patient in the described XLMR-family, his mother, patient 4 (g) and

grandmother (h). Overall, patients show no common facial features, though patient 2 (c,d) and the

index patient in the described XLMR-family (f) show almost identical prominent infraorbital fullness.

Figure 2. Illustration of Xq duplication of the MECP region

a. FISH analysis in patient 1. The Xq duplication (RP11-333O06; red) is inserted in the long arm of

chromosome 3 (black arrow), coinciding with the 3q duplication (RP11-67F24; green). Control

probes: centromere chromosome 3 (a-sat 3, Cytocell; green) and centromere chromosome X

(pBamX5; red).

b. Array-CGH ratio profile in patient 3. Chromosome X array CGH ratio profile using DNA from the

patient and a reference DNA from a normal female. On the left, the chromosome X ideogram. On the

right, the log2 ratio of the chromosome X probes plotted as a function of chromosomal position.

Each dot represents a single probe (oligo) spotted on the array. Oligos with a value of zero represent

equal fluorescence intensity ratio between sample and reference.

c. MLPA profiles showing an Xq duplication in family 4. Graphical representation of MLPA data (left

panel, index patient; right panel, maternal grandmother), showing the bars of the duplicated Xq

region in red (from SLC6A8 to OPN1MW including all MECP2 exons). In the index, peak values reach

1.50, suggesting a duplication as normal dose is normalized to 0.75. In the grandmother, peak values

of the duplication (bars in red) reach 1.25, as normal dose corresponds to two X chromosomes.

Figure 3. Pedigree of X-linked mental retardation family (previously published as pedigree E in

Madrigal et al., 2007[30]). 49 y, age at last examination; d 15 y, died at the age of 15 years.

Figure 4. Schematic representation of part of the Xq28 region. The location of the duplications of our

five patients and five previously reported females is depicted. Due to missing data, the patient

described by Kirk et al. [15] could not be included.

Colour codes: red, insertion of Xq into an autosome; blue, unbalanced X-autosome translocation;

green, familial Xq duplication; black, de novo intrachromosomal duplication of Xq. Arrow, minimal

145

critical region. Gene content of the region is shown from the UCSC Genome Browser version Human

March 2006 (NCBI36/hg18).

146

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2005.

150

Ringrazio papà, che mi ha sostenuto anche in questa strada, dura ma soddisfacente.

Grazie Davide, per avere condiviso con me anche questa esperienza, accettando momenti belli

e momenti brutti!

Ringrazio le medichesse, prima amiche, e poi colleghe. Ognuna di voi ha rappresentato un

pezzo unico nel puzzle di questi miei 4 anni. Grazie Annabì, avversaria all’inizio, alleata e

“vicina di banco” dopo poco. Grazie Dosola e C, per i consigli e le battute scherzose che

hanno risollevato le mie giornate. Grazie MA, per avere condiviso con me la tua esperienza

lavorativa e non (soprattutto nelle titubanze iniziali). Ringrazio le neofite Chiara e Caterina,

che si sono subito ambientate al clima della stanza condivisa. Ringrazio le amiche biologhe,

in particolare Bra (esperta di tesi cliniche), l’americana Fifì (esperta di dupXq28), Mafi e

Viriola, per avere sopportato le mie infinite richieste ed i miei sfoghi, personali e lavorativi!

Ma a dire la verità tutto lo staff della UOC Genetica mi ha sempre sopportato ed aiutato

degnamente!

Non posso dimenticare le infermiere “Buon Dio” e Clemens, e Stefania “Sorry”, che mi

hanno sempre accolto con il sorriso…

Grazie Doc, che hai dimostrato anche a distanza la tua presenza ed il tuo appoggio, umano e

professionale.

Ringrazio Manuela e Renato, per i loro preziosi consigli.

Grazie a Taty, Luca ed alla mia famiglia di origine (compresa la nonna), per avermi sostenuto

anche a distanza.

Un pensiero unico va alle splendide famiglie ed ai loro Angioletti, che ho avuto la fortuna di

incontrare, e che mi hanno sempre fatto sentire così importante, ma in realtà sono loro che mi

hanno insegnato tante cose…

Questi 4 anni di esperienza lavorativa e personale sono potuti iniziare perché la Professoressa

e Francesca mi hanno dato la possibilità di frequentare questa Scuola, nella splendida

Toscana.

The last, but not the least, thank you very much Emilia, for your precious collaboration. You

have given me interesting ideas about Xq28 microduplication!