CONVERGENCE - Waters Corporation · chromatography would be convergence with classical liquid chromatography.”1「超高圧GC の最も興味深い特性の一つは、従来のLC

[ ビギナーズガイド ]

CONVERGENCECHROMATOGRAPHY

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

Beginner’s Guide to Convergence

Chromatographyコンバージェンスクロマトグラフィー

ビギナーズガイド

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

Copyright © 2014 Waters Corporation

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Waters Corporation

34 Maple Street

Milford, MA 01757

Library of Congress Control Number: 2014935136

Printed in the USA

March 2014

Waters, ACQUITY, ACQUITY UPLC, ACQUITY UPC2, UPLC, UPC2, UltraPerformance LC, SunFire, Viridis and The Science of What’s Possible are registered trademarks of Waters Corporation.

UltraPerformance Convergence Chromatography are trademarks of Waters Corporation.

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715004472 TC- SIG

[ 目次 ]

目次

コンバージェンスクロマトグラフィーの基本原理 .................................................................1 ラボの選択性を飛躍的に拡大するクロマトグラフィー ........................................................1 ワークフローの合理化 .................................................................................................................3 幅広いアプリケーションと選択性 ............................................................................................4 基本原理：超臨界流体クロマトグラフィー ............................................................................7

コンバージェンスクロマトグラフィーの可能性を実現 ....................................................... 11 実現させた技術 .......................................................................................................................... 11 技術革新 ...................................................................................................................................... 12 溶媒コントロール技術（ポンプ）........................................................................................... 15 サンプル注入 .............................................................................................................................. 18 光学検出 ...................................................................................................................................... 20 圧力のコントロール .................................................................................................................. 22 システム全体のパフォーマンス ............................................................................................... 25

コンバージェンスクロマトグラフィーの使用方法 .............................................................. 26 コンバージェンスクロマトグラフィーを使用するために ................................................. 26 専門用語 ...................................................................................................................................... 26 コンバージェンスクロマトグラフィーで分析できるサンプルの種類 ............................. 27 コンバージェンスクロマトグラフィーの共溶媒 ................................................................. 28 コンバージェンスクロマトグラフィーの添加剤 ................................................................. 30 コンバージェンスクロマトグラフィーのサンプル希釈液 ................................................ 32 圧力と温度、密度 ...................................................................................................................... 34 推奨スクリーニングプロトコール ......................................................................................... 36

[ 目次 ]

コンバージェンスクロマトグラフィーによる問題解決例 .................................................... 40 新たなアプリケーション .......................................................................................................... 40 簡易化 .......................................................................................................................................... 41 異なる技術の組み合わせ‐脂質分析 ..................................................................................... 41 異なるLC分析法の組み合わせ‐脂溶性ビタミン ................................................................ 44 サンプル調製時間の短縮 .......................................................................................................... 45 類似構造を有する化合物の分離 .............................................................................................. 48 キラル分離 ................................................................................................................................... 48 位置異性体と構造類縁体 ........................................................................................................... 50 相補性 ........................................................................................................................................... 55

結論 .................................................................................................................................. 60

参考文献 ............................................................................................................................61

[ 図のリスト ]

図のリスト

図1：相補的な3つのクロマトグラフィー法 ..............................................................................1図2： ACQUITY UPC2®システム ...................................................................................................2図3：さまざまなサンプル前処理の例 ........................................................................................3図4： UPC2システムを使用した高速キラルスクリーニングにおけるCCの性能 .................5図5：順相LCの代替法としてのCCの性能 ....................................................................................6図6：物質の状態変化を表す相図 ................................................................................................7図7：カラムの選択性 ....................................................................................................................8図8：効率性と粒子径、必要となる背圧の関係 ..................................................................... 11図9： HPLCからUPLCへ、SFCからUPC2への進化を示すvan Deemterカーブ ................... 13図10： ACQUITY UPC2システムの流路図 .................................................................................... 14図11： ACQUITY UPC2のソルベントマネージャと SFC 向けにリモデリングしたHPLCポンプの比較 ....................................................... 15図12：移動相の正確かつ精密な混合（アイソクラティック） ............................................. 16図13：移動相の正確かつ精密な混合（グラジエント） .......................................................... 17図14： ACQUITY UPC2 BSM ............................................................................................................ 18図15： ACQUITY UPC2 サンプルマネージャと SFC 向けにリモデリングしたHPLCインジェクターとの比較 .................................. 19図16：パーシャルループインジェクションの繰り返し精度と再現性を示すクロマトグラフ .......................................................................................... 19図17：パーシャルループインジェクションにおけるインジェクターの直線性 ................. 20図18：物質の屈折率 ...................................................................................................................... 21図19：メトクロプラミド中の不純物プロファイリング例 .................................................... 21図20： ACQUITY UPC2 システムの圧力制御 ................................................................................ 23図21：アクティブ・スタティック制御バルブ連結BPRが必要に応じて保持時間を微調整し、システムの安定した性能を維持 ..................... 24図22： ACQUITY UPC2 コンバージェンスマネージャ ................................................................ 24図23： 5 µm カラムと 1.7 µmカラムの比較 ............................................................................... 25図24：塩基性化合物とその物理的・化学的特性 ...................................................................... 27図25：分配係数Pの算出方法 ....................................................................................................... 27図26：アイソクラティック分離における共溶媒の濃度変化が与える影響 ........................ 28図27：グラジエント分離における共溶媒の影響 ..................................................................... 29

[ 図のリスト ]

図28：グラジエント分離における共溶媒混合の効果 ............................................................. 30図29：添加剤の濃度変化がピーク形状に与える影響 ............................................................. 31図30：添加剤の種類が塩基性化合物のピーク形状と保持時間に与える影響 .................... 32図31： CCのピーク形状に与えるサンプル希釈液の影響 ....................................................... 33図32：保持時間に与える圧力（密度）の影響 ......................................................................... 34図33：保持時間と選択性に与えるカラム温度（密度）の影響 ............................................ 35図34：目的の分析種がCCで分析できるかどうかを判断するための手順 ............................ 36図35： CCの推奨スクリーニング条件 ........................................................................................ 37図36： CCにおけるピーク形状の改善方法 ................................................................................ 38図37： CCにおける保持時間の改善方法 .................................................................................... 39図38： CCにおける選択性の改善方法 ........................................................................................ 39図39： MS検出器を接続したACQUITY UPC2システムで分析したマウスの心臓抽出液の包括的な脂質プロファイル ..................................................................... 42図40： MS検出器を接続したACQUITY UPC2システムによる遊離脂肪酸（FFA）、トリアシルグリセロール（TG）およびコレステロールエステル（CE）のターゲット分析 43図41：ビタミン類10種の標品をCCの同一条件で分析したクロマトグラム ...................... 45図42：粉ミルクのビタミンA、D、E分析の一般的サンプル前処理ワークフロー .................. 46図43：粉ミルクのビタミンA、D、E分析にCCを用いた場合のサンプル前処理ワークフロー 47図44： CCによる血漿中のワルファリンエナンチオマーの分離 ........................................... 49図45： CCと順相 LCによるワルファリンのエナンチオマー分離 .......................................... 50図46： CCによるジメトキシ安息香酸（DMBA）の位置異性体の分離 .................................... 51図47：非抱合（遊離）ステロイドの構造 .................................................................................... 51図48： CCによるステロイド9種類の分離 ................................................................................. 52図49：硫酸化エストロゲンの構造 ............................................................................................. 53図50： CCによる10種類の硫酸化エストロゲンの分離 .......................................................... 54図51：抱合型エストロゲン向けのUSP法に基づく10種類のエストロゲンのGC-FID分離 54図52： ACQUITY UPLC®とACQUITY UPC2を用いてメトクロプラミドと関連物質を分離し、 CCの相補性を実証 .............................................................................................................. 56図53：ヒト血漿から抽出したクロピドグレルをタンパク質沈殿後に MS検出器（MRMモード）を接続した逆相LC / ACQUITY UPC2システムで分析 ....... 57

[ 表のリスト ]

表のリスト

表1：主な物質の臨界温度・臨界圧力と特徴 ............................................................................7表2：逆相 / 順相 / コンバージェンスクロマトグラフィーの溶媒選択性 ............................9表3：逆相 / 順相 / コンバージェンスクロマトグラフィーの固定相の選択肢 ................. 10表4： CCの分離能の最適化 ........................................................................................................ 35表5：研究分野と化合物で分類したCCの主なアプリケーション ........................................ 40表6：脂溶性ビタミンと関連物質の一般的な分析条件 ........................................................ 44表7： ACQUITY UPC2システムによるワークフロー簡易化のメリット ............................... 47表8：化学構造が似かよった化合物の分離におけるCCのメリット .................................. 55表9： CCの相補性が分離に与えるメリット ............................................................................ 58

1

[ XxxxXXxxx Xxxx ][ コンバージェンスクロマトグラフィーの基本原理 ]

ラボの選択性を飛躍的に拡大するクロマトグラフィー現在利用されているクロマトグラフィーのうち、ガスクロマトグラフィー（GC）と液体クロマトグラフィー（LC）の 2つが最も汎用的に用いられています。しかし、超臨界流体の制御機構が飛躍的に向上したコンバージェンスクロマトグラフィー（CC: Convergence Chroma-tography）が難しい分離にもルーチン分析にも利用できる実用的なクロマトグラフィー法として注目されるようになりました。

図 1. 相補的な3つのクロマトグラフィー法

この 3種類のクロマトグラフィー法は、これまで改良を重ね、クロマトグラフィーの可能性を拡げてきました。GC は分析の過程でカラムの温度を変化させて分離します。この手法の分離能は高いものの、選択性に限りがあります。選択性は概ね分析種とカラムケミストリー（固定相）との相互作用によって決まり、キャリアーガス（移動相）は不活性です。30年前のキャピラリー GC の創成期には性能が飛躍的に高まりましたが、それ以降は大幅な進歩はありません。

極性レンジが狭く揮発度の要件が厳しい GCは、分離できるサンプルの種類が限られます。そこで GC よりも幅広い化合物を分析するための重要な手法として、LC（特に逆相モード）の評価が確立されました。

GCガスクロマトグラフィー

LC液体クロマトグラフィー

CCコンバージェンスクロマトグラフィー

2

[ コンバージェンスクロマトグラフィーの基本原理 ]

移動相が不活性である GC とは異なり LCでは試料は固定相と移動相の両方に親和性を持ち、固定相と移動相の親和性の違いによって試料を分離します。そのため対象となる化合物の選択性が拡がります。さらに 2004年の Ultra Performance LC ®（UPLC®）の登場によって大きく進歩しました。

コンバージェンスクロマトグラフィー（CC）はクロマトグラフィー分析の選択性をこれまでになく高める、分離科学の新たなカテゴリーです。CC は逆相 LC との相補性が高い技術であり、分析作業全体を合理化する大きな可能性を備えています。CC では超臨界流体を基本とする移動相の比率と密度を操作することにより分離を行います。この移動相は拡散性が高いため、分離効率が高く、また、多様な固定相や移動相（共溶媒）が選べるため、極めて幅広い選択性を提供します。

「コンバージェンスクロマトグラフィー」の用語は、Calvin Giddings教授が提唱した概念を基にしています。1964年、Giddings教授は一つの論文の中で ”One of the most interesting features of ultra high pressure gas chromatography would be convergence with classical liquid chromatography.” 1「超高圧 GCの最も興味深い特性の一つは、従来の LCとの融合（コンバージェンス）が可能だということだろう」と述べています。コンバージェンスクロマトグラフィーは GC のメリットと逆相 /順相 LCのメリットが融合する、この概念を具現化したクロマトグラフィーです。

Giddings教授が提唱した理論を生かし、GCと LCが融合したメリットを発揮するため、ウォーターズは CO2を主な移動相に使う、総合的に設計したクロマトグラフィーシステム、ACQUITY® Ultra Performance Convergence Chromatography™（UPC2®）システム（図 2）を開発しました。このシステムは、クロマトグラフィーの原理、順相 LCの選択性、逆相 LCの使いやすさを兼ね備えています。定評ある低拡散・高効率 UPLC テクノロジーにもとづくACQUITY UPC2システムは、これまでの超臨界流体クロマトグラフィーとコンバージェンスクロマトグラフィーが実現し得なかった信頼性と頑健性、感度、スループットを提供します。

検出器PDA、ELSD、MS

カラムマネージャCM-A、CM-Aux、CM-30S

コンバージェンスマネージャ

サンプルマネージャ

バイナリーソルベントマネージャ

図2. ACQUIT Y UPC 2 システム

3

[ XxxxXXxxx Xxxx ][ コンバージェンスクロマトグラフィーの基本原理 ]

超臨界流体抽出固相抽出

マクロスケール蒸留

ソックスレー抽出

ミクロスケール液液抽出

ワークフローの合理化分離性能とともに重視すべきは、CC がラボのワークフロー全体にどのような影響を与えるかという点です。クロマトグラフィー手順の中で分析前のサンプル調製が最大の課題となることも少なくありません。サンプル前処理後、多くの場合、目的の分析種は逆相 LC に使用できない溶媒に溶解しています。多くの分析種は有機溶媒に溶解しやすいため、有機溶媒で抽出します。そのため、有機溶媒や抽出液を逆相 LCに使用可能な溶媒へ換えるための再調製が必要となります（図 3）。

図3. さまざまなサンプル前処理の例。多くの場合サンプルは有機溶媒に溶解しています。

これに対し、CC では有機溶媒に溶解したサンプル溶液を直接注入することができます。逆相LC ではおそらくは注入前の最も手間のかかる工程となる蒸発乾固や再調製も不要となり、試験全体のコストを大幅に削減します。さらにサンプル調製の時間が短縮されるだけでなく分析が大幅にスピードアップするため、特に複数のシステムを使用している場合は多大な累積効果が期待できます。

4


幅広いアプリケーションと選択性CC は順相 LC と同じ溶出領域を持っていますが、さらに C18などの逆相カラムも使用できる柔軟性を備え、親油性の高い化合物の分析では逆相 LCと同様の保持特性を示します。この幅広い選択性を持つ CC のメリットは明らかです。

CC と逆相 LCの双方で分析できる化合物は全化合物のおよそ 80～ 85%と考えられます。さらに CCは順相 LCで分析される化合物にも使用でき、キラル化合物や立体異性体、ジアステレオマーなどは CCによって分析能が飛躍的に向上します。基本的に有機溶媒に溶解可能なあらゆる化合物は CCの分析対象となり得ます。さらに CCは順相 LCに比べてグラジエント性能も良好であり、検出に紫外線（UV）やフォトダイオードアレイ（ PDA）、エバポレイト光散乱（ELS）が使用できます。

CC のおもな移動相は超臨界状態か亜臨界状態を問わず高密度の CO2です。そのため順相 LCの移動相として必要な、有害な溶媒の使用が抑えられます。また、順相 LCの固定相は水を吸収するため再現性の低さが課題でしたが、CC はこの課題も完全に克服しました。さらにCCの移動相が低極性のため有機溶媒のサンプル溶解液とも混合しやすいというメリットもあります。これらのメリットを持つ CC は現在、高速キラルスクリーニング法、順相 LCの代替法という 2つのアプリケーション分野で特に活用されています。

キラルスクリーニングの例（図 4）では、順相 LCでは 20分かかっていた分析時間がわずか3分、1/7に短縮された上、分離能も向上しました。分析時間の短縮とともに溶媒の消費量も激減するため、大幅なコスト削減が実現しました。

5

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図4. UPC 2システムを使用した高速キラルスクリーニングにおけるCCの性能

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

Rs=1.67順相 LC

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

Rs=2.61UPC2


6


同様にアキラルのアプリケーションでも、CC は順相 LC の代替法として分析時間とコストを大幅に削減します（図 5）。標準的な順相 LC の有機溶媒を CO2が主溶媒である移動相に切り替えることにより、1サンプル分析当たり順相 LC では約 6ドルかかっていたコストをわずか 5セント程度に削減します。CC を順相 LC の代替法として使用した場合、分析時間も短いため、溶媒の購入費・廃棄費の圧縮による全体的な財務面でのメリットは計り知れません。

図5. 順相LCの代替法としての CCの性能

6.23

7

10.8

55

20.8

50

26.6

32

30.8

56

35.8

19

AU

AU

-0.0004

0.0000

0.0004

0.0008

0.0012

0.0016

0.0020

Minutes0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

ACQUITY UPC2

1分析当たりのコスト～$0.05

順相 LC 1分析当たりのコスト～ $5.89

2.26

42.

587

3.33

9

5.65

8

6.15

6

8.13

4

8.81

3

9.99

2

-0.0004

-0.0002

0.0000

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

0.0010

0.0012

0.0014

0.0016

0.0018

0.0020

Minutes0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

7

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

基本原理：超臨界流体クロマトグラフィーコンバージェンスクロマトグラフィーの基本原理は、超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）です。物質は、ある温度と圧力を同時に越えた時、液体と気体の境界（＝界面）が消失し、どちらとも判別できない超臨界流体になります（図 6）。超臨界流体には、本質的に、拡散性が高く粘性が低いといった気体と液体の両方の性質・メリットがあるため、高速かつ効率的なクロマトグラフィーが可能です。

図6. 物質の状態変化を表す相図

CO2は、超臨界流体の移動相として最も一般的に使われています。CO2は、比較的緩やかな温度と圧力で簡単に物理的状態を制御することができます。他の物質は超臨界状態にするために非常に高い温度や圧力を必要としたり、超臨界状態で活性化するなど移動相として適さない性質を示すため、CO2は超臨界流体として最適な移動相となります（表 1）。

表1. 主な物質の臨界温度・臨界圧力と特徴

1

10

100

1,000

10,000

200

温度 T（K）

固体

液体

超臨界流体

臨界点

三重点気体

250 300 350 400

圧力

P （

bar）

物質名臨界温度（℃）臨界圧力（bar）特徴

CO2 31 74 物理的条件が緩やか

水 374 221 温度・圧力条件が厳しい

メタノール 240 80 温度条件が厳しい

アンモニア 132 111 腐食性

フロン 96 49 環境への悪影響

亜酸化窒素 37 73 酸化剤


8

逆相 LC では、溶出力の弱い移動相として通常、水を使用します。これに対し CC では、CO2を使用します。CO2の溶媒和力は限られているため、異なる共溶媒やモディファイヤーと混合します。

超臨界 CO2を異なる共溶媒と混合することにより、選択性の幅が大きく拡がります（図 7）。逆相 LCは溶解力系列の一部の領域しか使用できませんが、順相 LCと CCは比較的広い範囲に適用できます（表 2）。ただし順相クロマトグラフィーでは、すべての有機溶媒を混和できるわけではなく、混ぜ合わせられない溶媒もあることに注意しなければなりません。しかし CO2は溶解力系列のすべての有機溶媒と混合できるため、溶媒の選択肢が大きく拡がり、分離の選択性も高まります。また順相 LC向け以外の溶媒を用いることで異なる溶出力が得られるという点も重要です。

図7. カラムの選択性。カラムの選択性は、CCを用いた分析法を開発する際にきわめて強力なツールとなり得ます。上の例は、ある医薬品有効成分と関連化合物を同条件の下で、一般的に逆相/順相で用いられる両方の固定相を含む複数の固定相用いて分析したクロマトグラムです。

CCでは、順相 LC向けのあらゆる溶媒を用いて選択性を高めることができますが、多くの場合、その必要はありません。CO2を溶離度の全く異なる有機溶媒と混合するだけで、幅広い固定相が使用できるだけでなく、卓越した選択性を発揮し、さまざまな分離の課題が解決できます。

AU

0.000

0.012

0.024

0.036

0.048

AU

0.000

0.012

0.024

0.036

0.048

AU

0.000

0.012

0.024

0.036

0.048

AU

0.000

0.012

0.024

0.036

0.048

Minutes0.00 0.60 1.20 1.80 2.40 3.00 3.60 4.20 4.80 5.40 6.00

ACQUITY UPC2 Hybrid 2-EP 1.7 µm

ACQUITY UPC2 Hybrid 1.7 µm

G A D (1,2)

C

H F

B

E

G A D

C

H F

B

E

G A

D C

H F

B E

G A

D C

H F*

B

E

ACQUITY UPC2 CSH Fluoro-Phenyl 1.7 µm

ACQUITY UPC2 HSS C18 SB 1.7 µm


9

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

例えば CO2をメタノールと混合すると、移動相の溶離度は 0～ 0.73Eoとなります。このような CCの高い分析力は、先進技術を搭載した ACQUITY UPC2システムの誕生によって実現しました。

表2. 逆相 / 順相 / コンバージェンスクロマトグラフィーの溶媒選択性。CCに用いられる超臨界CO2は、溶離力系列すべての有機溶媒と混合できるため、分析法を開発する上で溶媒の選択肢、分離の選択性が大きく拡がります。

溶離力系列

溶媒溶離度［ Eo ］

極性［ P’］

ペンタン、ヘキサン、へプタン 0 0.1

キシレン 0.22 2.5

トルエン 0.22 2.4

ジエチルエーテル 0.29 2.8

ジクロロメタン 0.30 3.1

クロロホルム 0.31 4.1

アセトン 0.43 5.1

ジオキサン 0.43 4.8

THF 0.48 4.0

MTBE 0.48 2.5

酢酸エチル 0.48 4.4

DMSO 0.50 7.2

アセトニトリル 0.52 5.8

2-プロパノール 0.60 3.9

エタノール 0.68 4.3

メタノール 0.73 5.1

水 10.2

超臨界CO2

弱強

順相

順相クロマトグラフィーの領域

コンバージェンスクロマトグラフィーの領域

逆相クロマトグラフィーの領域


10

表 3では、各クロマトグラフィー法に使用される一般的な固定相を示しています。逆相 / 順相クロマトグラフィーの固定相の選択肢は、CC に比べ限られています（表 3）。大半の逆相クロマトグラフィーの分離は C18を固定相として行われます。極性が高いため全く逆相クロマトグラフィーに使用できない固定相もあります。反対に順相クロマトグラフィーでも移動相との極性が適合しないため使用できない固定相があります。CCではすべてのカラムケミストリーが使用可能であり、選択性が拡がります。

表3. 逆相 / 順相 / コンバージェンスクロマトグラフィーの固定相の選択肢。CCには、逆相 / 順相のいずれの標準的カラムも使用できるため、分析法を開発する上での選択肢が大きく拡がります。

固定相の選択肢

シリカ / BEH

2-エチルピリジン

アミノプロピル

ジオール

アミド

PFP

フェニル

C18 < C8

順相クロマトグラフィーの領域

コンバージェンスクロマトグラフィーの領域

逆相クロマトグラフィーの領域


11

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

実現させた技術UPLC テクノロジーは低拡散システム、粒子径 2 µm以下のカラムケミストリー、優れた圧力耐性により分離能を大きく向上させました。

図8. 粒子径、カラム効率と背圧の関係

LC では、システムの設計改善とカラムの粒子径の低減によって効率をこれ以上向上させることは困難です。この方法で技術を進歩させるには、技術的に大きな壁を乗り越えねばならないためです。例えば粒子径 1.0 µmのカラムは粒子径 1.7 µmのカラムに比べて効率が70%向上します（図 8）。しかし、拡散をさらに抑えながら既存のシステムの耐圧を大幅に強化する必要が生じるため、システムに対する要件は格段に厳しくなります。

そこで本章では、ACQUITY UPC2システムが装置とカラムケミストリーの双方で低拡散性と微小な充塡剤により、性能向上と効率の高い分離を追及し、達成した画期的成果について説明します（図 9）。コンバージェンスクロマトグラフィーは、超臨界流体の拡散性改善とランタイムの短縮、幅広い選択性により、現代の高度な技術をもってしても克服できなかった分離の課題を解決します。

18,000 psi

30,000 psi

130,000 psi

0

50,000

100,000

150,000

200,000

250,000

300,000

350,000

400,000

450,000

500,000

5 µm 3.5 µm 1.7 µm 1.4 µm 1.0 µm

理論段

/メートル

粒子径

1.7 µmよりも効率カラムが70%向上

3.5 µmよりも効率カラムが100%向上

[ コンバージェンスクロマトグラフィーの可能性を実現 ]

12

技術革新 ACQUITY UPC2システムに数々の設計上の技術革新がもたらされた結果、SFC 分野でウォーターズの優位性が明らかになりました。これについて正しく理解するため、まずこれまでの分析 SFC システムの課題を振り返ります（図 9）。

歴史的に超臨界流体クロマトグラフィーは分析法としての堅牢性が不十分だったため、分離を目的とした分析には多くの課題がありました。この原因はおもに HPLC 装置や GC 装置をSFC 向けにリモデリングしたためです（これまでの分析 SFC やハイブリッド SFC の主流がこれに当たります）。装置のリモデリングでは CO2の密度をコントロールすることはできないため、結果的に移動相の溶媒和力や保持時間が注入ごとに変化してしまいます。また濃度の低い共溶媒や緩やかなグラジエントを正確に用いることも不可能でした。さらにパーシャルループインジェクションの真度や精度が低いため、フルループインジェクションに限定される傾向がありました。

分析 SFC のパフォーマンスに悪影響を与える要因は、気体 / 液体混合物の送液に用いるポンプシステムの信頼性が低い、背圧が制御しにくいなど他にもありました。またシステムの拡散が大きいためバンドが拡散してしまい、充塡剤が細かく効率の良いカラムが使用できず、これらの理由により、スループットも向上しませんでした。

ポンプシステムは SFC 専用に設計されていないため、ベースラインノイズが大きくなりやすく、搭載された検出器も同様に、超臨界流体に特有の屈折率に適応するよう作られていないため、検出されるシグナル /ノイズの問題が増大しました。

そこで超臨界流体の制御を目的に設計された初の分析システムとして ACQUITY UPC2が誕生しました。


13

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図9. HPLCからUPLCへ、SFCからUPC2への進化を示すvan Deemterカーブ。HPLCとSFCは最適な効率がほぼ同等です。線速度を高めると分析時間を短くできますが、効率が変わります。UPLCとUPC2はいずれも分析時間を短縮しても、分離効率が飛躍的に向上していることが示されました。

0

5

10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

線速度（mm/sec）

理論段高（

µm）

HETP: 93：7　CO2 /メタノール 50 ℃、ACQUITY UPC2システム使用50：50　水 /アセトニトリル 30 ℃、ACQUITY UPLC® I-Classシステム使用

Viridis® BEH5 µm、3.0 mm × 50 mmカラム（SFC）

SunFire® C185 µm、2.1 mm × 50 mmカラム（HPLC）

ACQUITY UPC2 BEH1.7 µm、3.0 mm × 50 mmカラム（UPC2）

ACQUITY UPLC BEH C181.7 µm、2.1 mm × 50 mmカラム（UPLC）


14

図10. ACQUIT Y UPC 2システムの流路図

次に、ACQUITY UPC2システムの技術を詳しく理解するため、装置の各モジュールにおける技術革新について解説します（図 10）。

メイクアップポンプ

スプリッター

質量分析計

圧力調整器（アクティブ・スタティック）

ミキサー熱交換器

インジェクション補助バルブ

カラムマネージャ

PDA検出器

インジェクションバルブ

CO2ボンベ共溶媒廃液CO2ポンプ共溶媒ポンプ


15

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

溶媒コントロール技術（ポンプ）システムの流路における最初の課題は、移動相の密度と組成を真度・精度良くコントロールすることでした。リモデリングした H P L C ポンプを使用するためには、CO2を流入前に予圧・予冷する必要があります。一部のシステムでは、この装置はクロマトグラフィーシステムの隣に別ユニットとして搭載されています（図 11）。密度は予圧とポンピングによって変化するため、ポンプからこの装置が離れれば離れるほど移動相の密度コントロールが困難となります。また従来の SFC システムでは、ポンピングのアルゴリズム（内部制御ソフトウェア）は、超臨界流体の性質をもつ多様な移動相ではなく、圧縮された液体用に設計される傾向がありました。その結果、移動相の組成の真度・精度コントロール、保持時間の再現性を確保することが困難でした。また、共溶媒の割合が低い、特に 5%未満の場合は確実に溶媒を調節できないため、共溶媒を操作して保持をコントロールすることが難しく、検出器のベースラインノイズも高まるという別の問題もありました。

図11. ACQUITY UPC 2 のソルベントマネージャとSFC向けにリモデリングしたHPLCポンプの比較

一体型CO2加圧・冷却機構

CO2ボンベ共溶媒CO2ポンプ共溶媒ポンプ

ミキサー

ミキサー

CO2予圧・予冷装置

CO2ボンベ共溶媒HPLC用

CO2ポンプ

SFC向けにリモデリングしたHPLCポンプ■ CO2予圧・予冷装置がポンプから独立している■ CO2が配管中をポンプまで運ばれるため密度調整が困難■ ポンプのアルゴリズムが超臨界流体でなく液体向け■ 共溶媒の割合が低い、特に5%未満の場合に混合精度の維持が困難

ACQUIT Y UPC2ソルベントマネージャ■ CO2加圧・冷却装置をポンプと一体型に統合し、密度コントロールを大幅に改善■ ポンプヘッドを独立して冷却■ 超臨界流体と液体を区別したポンプの制御アルゴリズム■ 共溶媒の割合が低い（5%未満）場合にも正確かつ精密に混合

共溶媒ポンプ


16

これに対し ACQUITY UPC2バイナリーソルベントマネージャ（BSM）は、超臨界流体専用に作られています。加圧装置と完全に一体化しているため密度コントロールに優れ、保持時間の信頼性と再現性が高く、ベースラインノイズを最小限に抑えます。超臨界流体システムでは、移動相の溶媒和力は溶媒の密度によって制御されるため、精密な密度コントロールは再現性を確保するために不可欠です。また圧縮可能な超臨界流体と基本的に圧縮不可能な液体に対するポンプの制御アルゴリズムを区別したことにより、共溶媒の割合が低い場合も異なる移動相を正確に混合し（図 12）、高い再現性でグラジエントプロファイルを作成できるようになりました（図 13）。

図12. 移動相の正確かつ精密な混合（アイソクラティック）。CO2と共溶媒（メタノール）の正確かつ精度良い混合。メタノールは1%から2.5%まで0.5%ずつ増やしました。

分析用の SFC システムは、特にグラジエント分離においてこれほど高度な制御レベルに達したことはありません。ACQUITY UPC2システムは、技術の進化によってポンプ機能や加圧、送液を精度良く制御し、UPLC と同等の再現性を実現しました。

2.5% メタノール混合時




AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00


17

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図13. 移動相の正確かつ精密な混合（グラジエント）。グラジエント分析向けに組成が0.5%異なる溶媒を調製し、10回注入しました。上のクロマトグラムは共溶媒1%から始め、下のクロマトグラムは1.5%から始めました。移動相の正確かつ精度良い供給によって保持時間が極めて規則的に変化している様子がわかります。

ACQUITY UPC2 BSMが採用した体積密度のコントロール法は、質量流量をモデルとし、卓越した精度を発揮します。そのため溶出時間のコントロールが可能となり、溶媒和力の制御性能が優れています。また、ポンプヘッドを独立して冷却することにより、CO2の加圧性能と密度コントロールの双方を改善しました。さらにポンプと統合型の圧縮アルゴリズムは、移動相を極めて効果的で精密に制御するため、液体と気体のどちらの CO2も移動相として使用できます。

図 14は、BSMの内部写真です。共溶媒ポンプは UPLC ポンプですが、CO2ポンプは黒い絶縁カバーに覆われています。ポンプには加圧・冷却機構が統合されているため、絶縁カバーによって流入する CO2の密度がより精密に制御されます。

n=10 RT %RSD:

18

図14. ACQUITY UPC2 BSM。ACQUITY UPC2 BSMは、共溶媒の割合が5%未満であっても正確かつ精度良くCO2と任意の共溶媒を混合します。これを可能にするのは、別々に加圧した共溶媒とCO2を補正するための独立した制御アルゴリズム、および圧力変化と屈折率の影響を補正する機能です。

サンプル注入従来の分析 SFC システムは、少量を注入した場合の再現性の低さが課題であるため、ほとんどの場合、フルループインジェクションを使用しています。毎回、フルループインジェクションを使用すると、当然分析に必要なサンプル量が増えることになります。しかし、パーシャルループインジェクションを使用した場合では、超臨界状態に移動相を保つことが難しいため、正確度・精度・直線性が損なわれてしまい、その結果、定量が困難でした。分析あたりのサンプルロスを少なく抑えるためには小さいサンプルループに手作業で交換する必要があるため、システムの柔軟性が損なわれました。

これに対し ACQUITY UPC2サンプルマネージャはバルブを 2個搭載する、デュアルインジェクションバルブ（図 15）を実用化しました。この設計では、プライマリーサンプルループは排出口に導かれるため、サンプルを大気圧でループに注入しながら移動相の超臨界状態を維持することができます。また補助インジェクションバルブも設計に組み込むことで、サンプル注入ごとの圧力変動とキャリーオーバを抑え、繰り返し精度が良く再現性の高いパーシャルループインジェクションを可能にしました（図 16）。0.1～ 50 µLの範囲で 0.1 µLずつ増やして注入できる（図 17）だけでなく、二つのニードル洗浄オプションによって、サンプルのキャリーオーバがほぼ解消されます。

共溶媒ポンプ CO2ポンプ

溶媒選択バルブ


19

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図15. ACQUIT Y UPC2 サンプルマネージャとSFC向けにリモデリングしたHPLCインジェクターとの比較

図16. パーシャルループインジェクションの繰り返し精度と再現性を示すクロマトグラム

ポンプからカラムへ

ポンプからカラムへ

シリンジ

5 10 15 20

シリンジ

5 10 15 20

廃液へ

サンプル

サンプル

廃液へ

SFC向けにリモデリングしたHPLCインジェクター■ CO2の超臨界状態を維持するにはフルループインジェクションが必要■ パーシャルループインジェクションでは再現性が乏しい■ ループの2～4倍の充塡が必要となりサンプルロスが大きい

ACQUIT Y UPC2サンプルマネージャ■ 補助インジェクションバルブの使用によって正確かつ精度良いパーシャルループインジェクションが可能■ サンプルをループに注入する際に補助インジェクションバルブが液体CO2のニードルへの逆流を防止

10 µLループにパーシャルループインジェクション（3 µL）Replicates n=10 RT %RSD:

20

図17. パーシャルループインジェクションにおけるインジェクターの直線性（1～10 µLの範囲で1 µ Lずつ増加）

光学検出分析 SFCシステムの光学検出にはトラブルが少なくありません。LC用検出器を使用することにより、フローセルの拡散が大きい、ベースラインノイズ、屈折率（RI）の影響という問題が生じます。超臨界流体ではなく液体の溶媒の屈折率の特性に合わせて作られた検出器を超臨界流体に使用すると、ポンプシステムから発せられるノイズが増幅され、ベースラインノイズやベースラインの湾曲が大きくなるためです。逆相 LCに多用されるメタノールや水などの溶媒の屈折率はほぼ同等（図 18）なため、逆相 LCでは屈折率の効果はあまり大きくなりません。しかし SFC では、CO2とメタノール（最も一般的な共溶媒）の RI 値に差があるため、屈折率の範囲が LC よりも広くなります。さらなる問題は密度で、CO2ベースの超臨界流体移動相の屈折率は、グラジエント分析の過程で変化します。

また HPLC のフローセルは拡散性が高いため、微小な充塡剤のカラムや内径（I.D）4.6 mm未満のカラムを使用することもできません。従ってこれらのカラムを使用して効率性や感度が関連するメリットを高めるには、超臨界流体専用の検出器を設計する必要がありました。

20,000

40,000

60,000

80,000

100,000

120,000

0 2 4 6 8 10

ピーク面積

注入量（µL）

Coumarin Flavone Caffeine Thymine Papaverine

R2 = 0.99999

R2 = 0.99994

R2 = 0.99973

R2 = 0.99998

R2 = 0.99998

5 ng

50 ng

[ コンバージェンスクロマトグラフィーの可能性を実現]

21

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図18. 物質の屈折率

ACQUITY UPC2 PDAの検出器は、超臨界流体専用に作られています。サファイアレンズは紫外線波長が低いとエネルギー透過性が損なわれるため、ACQUITY UPC2 PDA 検出器では代わりに圧力要件を満たす強化シリカレンズを使用しました。これによって感度が飛躍的に高まり、ベースラインノイズが低減し、CO2と有機溶媒との屈折率の差による影響が補正されました。またオプティックベンチの温度をコントロールすることで、ベースラインの安定性をさらに高め、屈折率の影響を抑えました。さらにステンレス製の低拡散フローセルによって狭いピーク幅に適応し、10 mmの光路長によって優れた感度を発揮するとともに最適なスペクトル性能を確保しました。その結果、卓越した感度を実現し、超微量の不純物も定量可能になりました（図 19）。

図19. メトクロプラミド中の不純物プロファイリング例

P

O

Q

θ1

θ2

n2v2屈折率光の伝播速度

n1v1

正常分散

界面

入射角

屈折角

屈折率

水 1.333メタノール 1.330CO2 1.000

EP Im

p B

- 0.9

85

EP Im

p D

- 1.5

49 EP

Imp

A -

1.75

2

EP Im

p C

- 2.1

36 メトクロプラミド

- 2.

278

EP

Imp

G - 2

.459

AU

0.000

0.025

0.050

0.075

0.100

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50

metoclopramide

262.0305.9

369.8

385.4

AU

-0.0002

0.0002

0.0006

266.7

298.7

344.8 374.6 395.0AU

-0.00052

0.00000

0.00052

220.7

262.0

303.5

343.6 357.8 373.4 390.2

AU

0.0000

0.0014

0.0028

232.5 272.6 305.9

353.0369.8

387.8

AU

0.00028

0.00084

0.00140

211.3

271.4305.9

AU

0.00

1.20

2.40

211.3

271.4307.1

371.0 386.6

AU

0.0000

0.0012

0.0024

nm220.00 260.00 300.00 340.00 380.00

*Imp B

*Imp D

*Imp A

Imp C

API

Imp G

*Impurities b, d, a, c will have different relative response factors calculated

O

NH

O

NCl

H2N


22

圧力のコントロール超臨界流体をベースにしたシステムにとって、正確に圧力をコントロールできることは最も不可欠な要素の一つです。圧力コントロールは移動相の密度に大きく影響し、従って分析種の溶媒和や保持時間にも深く関与します。従来の SFC システムは、正確かつ精度良い圧力の制御コントロールに課題がありました。その原因は、圧力調整器（BPR）の圧力モニタリングの不備、フィードバックループの反応の遅さ、ステッピングモーターの分解能の低さ、ポンプの圧力と流速の制御能力の低さ、BPR の部品の経時劣化などです。

システムの圧力が高まるにつれ CO2の密度が上昇し、溶媒和力が高まるとともに保持が弱まります。ACQUITY UPC2システムは、革新的なアクティブレギュレーター・スタティックレギュレーター連結の BPR（図 20）によって圧力と密度を綿密に制御します。アクティブレギュレーターとスタティックレギュレーターの 2種によって流量制御の正確性が高まり、保持時間の厳密な制御が可能になります。スタティックレギュレーターは気化に伴う圧変動を抑制することでアクティブレギュレーターの精密な制御が強化され、測定条件のパラメーターのひとつである圧力による保持時間の制御が可能となります（図 21）。また堅牢性をさらに高めるため、スタティックレギュレーターを加温し、凍結を防止しています。


23

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図 20. ACQUITY UPC 2システムの圧力制御。コンバージェンスマネージャが圧力を一定に保ち、設定値からのずれを 5 psi未満に抑えます。この精密な制御によって、保持時間の再現性が向上し、ベースラインが安定します。

psi

1800

2000

2200

2400

2600

2800

3000

3200

3400

3600

3800

Minutes

Minutes

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0

psi

2592

2593

2594

2595

2596

2597

2598

2599

2600

2601

2602

2.76 2.84 2.92 3.00 3.08 3.16 3.24 3.32 3.40 3.48 3.56 3.64 3.72

5 psi


24

図21. アクティブ・スタティック制御バルブ連結のBPRにより、保持時間を厳密に制御することが可能となり、システムの安定性が向上します。

デュアルステージの BPR は、ACQUITY UPC2システムのコンバージェンスマネージャ（CCM）に搭載されています（図 22）。このモジュールには、流入する CO2向けのインライン除粒子フィルターや CO2漏えい検知器、ベントバルブ、圧力開放バルブ、インジェクションサポートバルブも収められています。

図22. ACQUITY UPC 2 コンバージェンスマネージャ

ABPR @ 1980 psi ABPR @ 2000 psi ABPR @ 2020 psi

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

Minutes0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00

2.66 2.70 2.74 2.78 2.82 2.86 2.90 2.94 2.96 3.00 3.04 3.06 3.10

2.8

69

2.8

94

2.9

06

圧力開放バルブ

インジェクションサポートバルブ

ベントバルブ

トランスデューサー

アクティブレギュレーター（BPR）

スタティックレギュレーターおよびヒーター（BPR）

CO2 供給口およびフィルター　


25

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

システム全体のパフォーマンスこのように、ACQUITY UPC2システムは拡散が小さくなり、内径の細いカラムや充塡剤の粒子径が小さなカラムを使用できるようになりました（図 23）。内径の細いカラムによって感度が向上し、溶媒の消費が抑えられ、質量分析に適した流量が実現しました。また粒子径の小さいカラムによって分離効率と分離度が改善しました。

図23. 同じ流量と同じカラムサイズによる 5 µmカラムと 1.7 µmカラムの比較。粒子径を 5 µmから 1.7 µmに低減することにより、効率は約3倍に、感度と分離度は約2倍に向上しました。

カフェイン、カルバマゼピン、ウラシル、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、スルファニルアミド

NUSP(Sulfan) = 19,809

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

1

2

6

4

5

3

5 µm

1.7 µm

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

NUSP(Sulfan) = 6,561


26

コンバージェンスクロマトグラフィーを使用するために本章では、超臨界流体と CCについての専門用語を確認し、ACQUITY UPC2システムで分析できるサンプルや分析種の種類を解説します。また共溶媒や移動相の添加剤、サンプルの希釈液の役割について、および圧力と温度が密度や分離能にもたらす影響についても明らかにします。最後に分析法開発のためのスクリーニング方法を紹介します。

専門用語CCはいくつかの点で逆相 LCに似ていますが、移動相 A（弱溶媒）には水系溶媒ではなく超臨界 CO2を使用します。

移動相A 移動相B

CC ： CO2 CC ：有機溶媒（メタノールなど）

逆相 LC ：水系溶媒（バッファーなど）逆相 LC ：有機溶媒（アセトニトリルなど）

従来の SFC では、共溶媒、モディファイヤー、エントレーナーという用語が用いられますが、それらは移動相 B（強溶媒）を表しています。一般的に共溶媒はメタノールですが、エタノールや 2-プロパノール、アセトニトリル、またはこれらの混合液も使用できます。添加剤は共溶媒に少量加える塩または液体を表し、これらはピーク形状を改善したり分析種を溶解しやすくしたりする働きがあります。また添加剤は、クロマトグラフィーの選択性にも影響を与えることがあります。代表的な添加剤はジエチルアミン、水酸化アンモニウム、ギ酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、少量の水などですが、適切な濃度は添加剤の種類によって異なります。例えば水は 5%を超えると共溶媒の濃度が高い場合に移動相が二相化する恐れがあります。

[ コンバージェンスクロマトグラフィーの使用方法 ]

27

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

コンバージェンスクロマトグラフィーで分析できるサンプルの種類新しい分析法が誕生すると、最初に浮かぶ疑問は「この手法（CC）でどのようなサンプルが分析できるのだろうか？」でしょう。ごく簡単にお答えすると、サンプルが有機溶媒に溶解するのであれば、CCで分析できる可能性があります。ただし、この疑問に簡単に答えることはできず、実験で確認する必要があります。多くのサンプル前処理（液液抽出、固相抽出、タンパク質沈殿など）ではサンプルを有機溶媒に溶解する手順があるため、注入に用いる有機溶媒への溶解性は極めて重要です。また、サンプル溶液は直接 ACQUITY UPC2 システムに注入できるため、多くの逆相 LCで必要となる手間や時間のかかるエバポレートや再調製手順が不要です。これについては第 4章で詳しく説明します。

図24. 塩基性化合物の例とその物理的・化学的特性

分析科学では情報が多ければ多いほど安定した分析法を開発できるため、常にサンプルに関する情報をできる限り収集しなければなりません（図 24）。さまざまな有機溶媒に対する化合物の溶解性について、重要な情報の一つが分配係数 P（通常は log10 Pと表記）です。分配係数（P）とは、化合物が二相の非混和性溶媒に平衡溶解したときの濃度の比であり、一般的に水と 1-オクタノールが使用されます（図 25）。分配係数は、これら 2つの溶媒に対する化合物の溶解度の違いを示すものであり、化合物の親水性または疎水性の程度を表します。

CCでは、目的化合物が ACQUITY UPC2 システムで分析できるかどうかを判断する根拠の一つとして分配係数を用います。経験則では、化合物の log P値が -2から 9であれば CC に適していると考えられます。

図25. 分配係数 Pの算出方法

N

O NH2

カルバマゼピン溶解性： 2-プロパノール（1.0 mg/mL）、水には不溶種類：中性pKa：（弱酸）13.94Log P： 1.875出典：Merck Index、ChemBank、ChEMBLデータベース

分配係数（ P）＝有機溶媒相の分析種の濃度

水相の分析種の濃度


28

コンバージェンスクロマトグラフィーの共溶媒共溶媒には、CO2の溶媒和力を高める、共溶媒自体が強い溶離液として働く、という 2つの役割があります。例えばメタノールからアセトニトリルへなど共溶媒を変更すると、保持時間と選択性の双方に影響を与えます。CCにおける共溶媒の役割は、逆相 LCの強溶媒に似ています。CO2単独の溶解力は、ヘプタン（溶出力の弱い弱溶媒）とほぼと同等です。

第 1章の表 2は、さまざまな有機溶媒の溶出（溶離度）系列を示すものです。ここには CCで最も一般的に使用される共溶媒、アセトニトリル、2-プロパノール、エタノール、メタノールが含まれています。この表の有機溶媒はすべて CO2と混合できるため、幅広い保持時間と溶解力が実現します。

共溶媒を CO2の移動相に混合すると、通常は分析種の保持が弱くなります。共溶媒の濃度を上げると、移動相の極性が変化するため、保持時間がさらに短縮されます。図 26は、アイソクラティック分離における共溶媒の濃度変化が保持時間に与える影響です。溶解力の強い共溶媒（メタノール）の濃度を下げると分析種の保持時間は延びます。これは逆相 LCと同じ現象です。

図26. アイソクラティック分離における共溶媒の濃度変化が与える影響

AU

0.00

0.20

0.40

AU

0.00

0.20

AU

0.00 0.10 0.20 0.30

AU

0.00 0.10 0.20

AU

0.00

0.10

0.20

AU

0.00

0.05 0.10

17% MeOH

15% MeOH

13% MeOH

11% MeOH

9% MeOH

7% MeOH

Minutes 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0


29

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図 27では異なる共溶媒を用い移動相の溶出力を変化させた結果をに示しています。メタノールは最も溶出力が強い共溶媒のため、分析種が最も早く溶出します。2-プロパノールの溶出力はメタノールとアセトニトリルの中間です。アセトニトリルはこの 3種類の共溶媒の中で最も溶出力が弱く、従って分析種を最も強く保持します。溶出力と保持時間の関係性は他のクロマトグラフィーモードでも同様であり、強い溶媒では保持が弱くなり、分析種が早く溶出します。

図27. グラジエント分離における共溶媒の影響

一方、異なる共溶媒を混合して溶媒強度を調整すると、保持時間を変えることができます。図 28は、メトクロプラミドと関連不純物のグラジエント分離において、弱い共溶媒（アセトニトリル）をメタノールに混合した効果を示します。アセトニトリルの濃度が上昇するにつれメタノールの濃度と溶媒の溶出力は低下し、保持時間が長くなります。異なる共溶媒を加えることにより、選択性を変化させ、分離を改善し、ピーク形状をシャープにすることが可能です。

2-プロパノール

メタノール

AU

-0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

AU

-0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

AU

-0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

Minutes 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00

アセトニトリル

弱塩基弱酸


30

コンバージェンスクロマトグラフィーの添加剤逆相 LC と同様、CC でもピーク形状や分離能を改善するために添加剤が用いられます。図28では、添加剤のギ酸アンモニウムを 4種類のクロマトグラムのすべての共溶媒混合液に加えました。添加剤は固定相の表面を修飾したりイオン対として作用したりするため、選択性が変化します。塩基性添加剤は、塩基性化合物のピーク形状を改善し、選択性をわずかに変化させる傾向があります。代表的な添加剤とは、水酸化アンモニウム、2-プロピルアミン、トリエチルアミンなどです。同様に酸性の添加剤は、酸性化合物のピーク形状を改善し、選択性を変化させる可能性があります。代表的な酸性添加剤とは、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸などです。図 29は、酸性化合物の分離を示します。この例では、酸性添加剤の濃度が上昇するにつれピーク形状が改善されています。

図28. グラジエント分離における共溶媒混合の効果

AU

0.000

0.010

0.020

0.030

0.040

AU

0.000

0.010

0.020

0.030

0.040

AU

0.000

0.010

0.020

0.030

0.040

AU

0.000

0.009

0.018

0.027

0.036

Minutes0.00 0.60 1.20 1.80 2.40 3.00 3.60 4.20 4.80 5.40

50/50メタノール /






100%メタノール


31

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図29. 添加剤の濃度変化がピーク形状に与える影響

添加剤を変えるとピーク形状及び保持時間は大きく変化する可能性があります（図 30）。これらの塩基性化合物（ベータブロッカー）では、共溶媒であるメタノールに添加剤を加えなければピークとしてほとんど検出されません。酸性化合物の分離（図 29）の場合とは異なり、図 30におけるピーク形状は、ギ酸の添加によって悪化しています。しかしこの強塩基化合物に酢酸アンモニウム（20 mM）を添加した共溶媒を用いると、ピーク形状は劇的に改善されます。またジエチルアミンも同様の効果があるため、塩基性化合物の分析に塩基性添加剤を添加することでピーク形状が改善される傾向があります。

図30. 添加剤の種類が塩基性化合物のピーク形状と保持時間に与える影響

AU

0.00

0.20

0.40

AU

0.00

0.20

0.40

AU

0.00

0.20

0.40

Minutes0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

vanillin

vanillicacid

4-hydroxy-benzalcohol

4-hydroxy-benzaldehyde

メタノールにギ酸を0.5%添加

メタノール



AU

0.00

0.20

AU

0.00

0.10

0.20

Minutes

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00

AU

0.00

0.05

メタノール

メタノールにジエチルアミンを0.2%添加

メタノールに酢酸アンモニウムを20 mM添加

AU

0.00

0.50


32

コンバージェンスクロマトグラフィーのサンプル希釈液サンプル希釈液の溶媒強度は、CCのピーク形状と溶解性に大きく影響する可能性があります。他のクロマトグラフィーモードと同様、CCでもサンプル希釈液は、分析種の溶解性とピーク形状のバランスを保つため、サンプルを溶出系列の最上段（表 2）に近いできる限り弱い有機溶媒で希釈してください。ウォーターズは、溶解性（2-プロパノール）とピーク形状（ヘプタン）のバランスを良好に保つ一般的な希釈液として、ヘプタン /2-プロパノール（90:10）を推奨します。サンプルの含水量はできる限り下げ、可能であれば水分を完全に除去してください。図 31は、中性化合物ブチルパラベンの 7つのクロマトグラムのピークを重ねたものです。注入量が増えるにつれ、ピーク形状に対する希釈液の溶媒強度の影響が顕著になります。強い共溶媒であるメタノールを使用すると、注入量が増えるにつれてピークが前方向にずれます。比較的弱い 2-プロパノールでは、メタノールに比べてピークのずれが少なく、ピークが高くなります。推奨サンプル希釈液である 2-プロパノールとヘプタンの混合剤は、すべての注入量で左右対称のシャープなピークを示します。


33

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図31. CCのピーク形状に与えるサンプル希釈液の影響。ウォーターズは混合比率90：10を推奨しますが、この例では70：30としました。

Minutes

1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 1.3

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AU

A

U

AU

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

希釈液： 70：30 ヘキサン / イソプロパノール

ブチルパラベンのピーク形状に与える希釈液の影響

注入量（µL）0.51.01.52.02.53.04.0

希釈液：イソプロパノール

希釈液：メタノール

0.6


34

圧力と温度、密度自動圧力調整器（ABPR）の設定値を変更すると、超臨界流体の密度が変化するため保持時間に影響を与えます。ABPR の圧力設定を上げると超臨界流体の密度は高まり、保持時間は早くなります。分離能に最も大きく影響するのは移動相の組成ですが、圧力の調節によって密度を変化させることでも分離能を最適化または微調整できます。図 32は、ABPR の設定圧力を変え、他の条件をすべて一定に保った例です。このクロマトグラムに示される通り、ABPR の圧力設定を上げると保持時間は早くなります。

図32. 保持時間に与える圧力（密度）の影響。一般的にABPRの運用範囲は、1500～2200 psi（100～150 bar）です。

カラム温度は、逆相 LCと同様、CCでも選択性と保持時間に影響を与えますが、分析種の種類によってこの影響の大きさは異なります。またカラム温度は、圧力と同じくカラム内の移動相の密度にも影響を与えます。カラム温度が上昇すると、移動相の密度が下がり保持時間は遅くなります（図 33）。CCにおけるカラム温度の保持時間に対する影響は、カラム温度が上昇すると保持時間が早くなる逆相 LCとは反対に現れます。また、図 33の例では 50℃で新たに小さなピークが溶出していることにも注目すべき点です。これは選択性がわずかに変化したためであり、温度の影響は分析種により異なります。

AU

0.000

0.002

AU

0.000

0.002

AU

0.000

0.002

Minutes0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60

1700 psi 117 bar

1900 psi 131 bar

2100 psi 144 bar


35

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図33. 保持時間と選択性に与えるカラム温度（密度）の影響

ピーク形状、保持時間、選択性は共溶媒や添加剤、サンプル希釈液、圧力、温度、固定相などの役割を理解し、これらを幅広く調節することでコントロールできます。本章で説明したパラメーターをすべて組み合わせ、CCの分離能を最適化する方法を表 4にまとめました。ただし、実際のサンプル分離では、各パラメーターの重要性はこの表とは異なる可能性があります。例えば選択性を変化させたい場合、固定相が共溶媒よりも大きく影響を与える場合もあります。また、メタノールをメタノールとアセトニトリルの混合液（50:50）に変更する方がカラムケミストリーを変更するよりも影響が大きいということもあります。

ピーク形状保持選択性

固定相 4 2 1

共溶媒 3 1 2

添加剤 1 4 3

圧力* 3 4

流量* 3 4

温度* 3 3

サンプル希釈液 2

表4. CCの分離能の最適化。（ *）は密度に影響します。1 ＝影響が最大、4 ＝影響が最小。

50 °C

55 °C

60 °C AU

0.000

0.002

0.004

AU

0.000

0.002

0.004

AU

0.000

0.002

0.004

Minutes0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60

60 °C

55 °C

50 °C


36

推奨スクリーニングプロトコール図 34は、目的のサンプルが CCに適合する注入用の溶媒に溶解するかどうかを迅速に判断するための手順です。分析種の log P値が -2～ 9であれば溶解する可能性があります。-2未満であれば水系溶媒にしか溶解しない可能性が高く、その場合 CCでの分析は困難です。

分析種の log P値が不明の場合は、注入の前に適切な有機溶媒に溶解してください。

図34. 目的の分析種がCCで分析できるかどうかを判断するための手順

CCは順相分離のため、メタノールは極めて強い溶媒（反対に逆相 LCでは極めて弱い溶媒）であることに注意してください。従ってサンプルは、ヘプタン /2-プロパノールなどの弱溶媒で溶解（希釈）してください。また、サンプルの溶解性とピーク形状のバランスを維持する必要がありますが、CCにおけるサンプル希釈液のピーク形状への影響は、本章で後述します。

新しいサンプル

化合物の情報を収集: 構造 / pKa /分子量 / Log P

情報がない（有機溶媒に溶ける）

Yes

溶解しない

YesNo

溶解する

-2 < Log P < 9

サンプル調製（1～2 mg/mL）: ■ 希釈液は90:10のヘプタン/ 2-プロパノール（非極性化合物）または2-プロパノール（極性化合物）もしくは同等品

次の溶媒で溶解性をチェック■ メタノール、エタノール■ 塩素系溶剤■ THF■ 5%までを限度に水を添加0.2 mg/mLに調製

分析は困難

90：10のヘプタン/2-プロパノールで0.2 mg/mLに希釈


37

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

サンプル希釈液の選択以外にも、クロマトグラフィーの分析法開発で留意すべきことがあります。例えば、目的の分析種に最適のクロマトグラフィー条件を特定しなければなりません。図 35は、幅広い分析種を円滑に保持・分離させるため一般的に推奨される初期条件です。

図35. CCの推奨スクリーニング条件

他のクロマトグラフィーモード同様、上記の条件がすべての事例に当てはまるとは限りません。また、ピーク形状の改善と選択性・保持時間の調整も可能です。

UPC2スクリーニングカラム: BEHおよびBEH 2-EP

第2選択肢: CSH Fluoro-PhenylおよびHSS C18 SB

グラジエント：2～40 %メタノールで5 分

カラム：1.7 µm、3.0 mm × 100 mm

流量：2.0 mL/min

カラム温度：35 ℃～50 ℃

ABPR：2000 psi（140 bar）

波長：220 nm（補正波長350～450 nm）

弱ニードル洗浄：メタノール / 2 -プロパノール（1:1）

強ニードル洗浄：メタノール

シール洗浄：メタノール

B1：メタノール B2：メタノール / アセトニトリル（1:1） B3：メタノールに 15 mM 酢酸アンモニウムおよび2% ギ酸を添加* B4：メタノールに 0.2 % 水酸化アンモニウムを添加*（ *）はBEHおよびBEH 2-EPカラムのみに適用

初期条件

共溶媒


38

そのような場合のために、ピーク形状と保持時間・選択性を調整するための系統的なアプローチを図 36、37、38で解説します。これらは逆相 LCの場合とそれほど大きな違いはありません。図 36は、ピーク形状の改善プロトコールです。最初の条件は、目的の化合物が主に塩基性であるか酸性であるかにより、それぞれの推奨条件を示しています。酸性化合物は酸性条件下で、また塩基性化合物は塩基性条件下で良好なピーク条件を示す傾向があります。また、ピーク形状を改善するには、添加剤の種類や濃度を変更する、またはカラムケミストリーを変更するなどの方法があります。

図36. CCにおけるピーク形状の改善方法

図 37は、保持時間の改善方法です。他の液体クロマトグラフィー同様、最初の選択肢は異なる（より弱い）共溶媒を使用することです。メタノールは CCに使用できる最も強い共溶媒です。従ってより弱い共溶媒（アセトニトリルまたは他のアルコール類）を使用することで保持時間が遅くなります。また、グラジエント勾配を緩やかにする（共溶媒の最終濃度を下げる、またはグラジエントの時間を延ばす）のも効果的です。さらに異なる共溶媒を混合することも可能です。メタノールの濃度を下げることによって共溶媒全体の溶媒強度が低下し、保持時間が遅くなります。一方、カラム内の移動相の密度を変えることは、SFC と CCに固有の機能です。密度は全体的な保持時間に影響を与え、密度が上昇すると保持時間が早くなります。保持時間を改善するには、ABPRの設定値を下げるか、または温度を上げるか、もしくはその両方によって可能です。最後に、カラムケミストリーの変更も効果的です。

分離しない

分離した

分離した

*添加剤が検出方法に適合するかを確認してください

スクリーニングプロトコールが示す添加剤を使用する酸性化合物: 0.5% ギ酸

塩基性化合物: 0.2%水酸化アンモニウムおよび3.0% 水

分離しない

添加剤を変更する*:塩基性化合物: アルキルアミン類、酢酸アンモニウム

酸性化合物: クエン酸、酢酸

分離しない

添加剤の濃度を上げるまたは20 mM 酢酸アンモニウム / 2% ギ酸を使用する

もしくは2～5%の水を加える

カラムケミストリーを変更する

分離した

適切なクロマトグラフィーとなるよう保持時間または選択性を調整するその後、次の項目を試験する■ 繰り返し再現性■ 直線性（必要に応じて）

初めのスクリーニング

条件に戻る


39

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

図37. CCにおける保持時間の改善方法

図 38は、分離分析における選択性（溶出の順序や保持比）の改善方法です。このアプローチには共溶媒の変更（たとえばメタノールからアセトニトリルへ）も含まれます。アルコールベースのプロトン性共溶媒を非アルコール・非プロトン性共溶媒（アセトニトリルなど）に変更すると、メタノールを他のアルコールベースの共溶媒に変更するよりもはるかに大きな効果が選択性に表れます。共溶媒を混合してメタノールの濃度を下げ、全体的な共溶媒の強度を下げることも可能です。これにより保持が強くなり、選択性が変化する可能性があります。カラム内の移動相の密度を操作することでも全体的な分析種の保持時間を調節できます。この密度の影響は分析種によって異なるため、密度の変更だけで目的の分離を十分最適化できる場合もあります。最後に、この方法では必要に応じてカラムケミストリーの変更も推奨しています。

図38. CCにおける選択性の改善方法

分離しない

分離した

分離した

共溶媒を変更する：アセトニトリル、2-プロパノールなど

分離しない

共溶媒を混合する：90：10、70：30、50：50

分離しない

圧力の設定値を下げる、または温度を上げることで密度を小さくする

分離しない

グラジエント勾配を緩やかに、あるいは水平にする

カラムケミストリーを変更する

分離した

分離した

適切なクロマトグラフィーとなるようピーク形状または選択性を調整するその後、次の項目を試験する■ 繰り返し再現性■ 直線性（必要に応じて）


条件に戻る

分離しない

分離した

共溶媒を変更する、または混合するか、もしくはその両方を試す

分離しない

圧力の設定または温度を変更して移動相の密度を操作する

分離しない

添加剤を変更する*

カラムケミストリーを変更する分離した

分離した適切なクロマトグラフィーとなるようピーク形状または保持時間を調整するその後、次の項目を試験する■ 繰り返し再現性■ 直線性（必要に応じて）


条件に戻る

分離した

*添加剤が検出方法に適合するかを確認してください


40

新たなアプリケーション前述したように CCの選択性の範囲が拡大されたため、この技術は幅広いアプリケーションに利用できるようになりました（表 5）。

化学工業: 食品 / 環境:

有機EL（OLED）ビタミン類

農薬（殺虫剤）殺虫剤

ポリマー添加剤脂質（グリセリド）

界面活性剤食用油

タバコ

医薬品 / ライフサイエンス: 法医学:脂質（プロファイリング）アヘン剤

ビタミン類濫用薬物

天然物ステロイド類

DMPK / バイオアナリシス脂肪酸

反応モニタリング / 医薬品化学抗うつ薬

表5. 研究分野と化合物で分類したCCの主なアプリケーション

CCは、研究分野や厳密な分析種の性質に関わらず、次の 3つの特性により分析課題を解決します。

■■ CCはワークフローを簡易化します。

■■ CCは構造に類似性のある化合物も分離します。

■■ CCは逆相LCとの相補性が高い分離モードです。

次に、これら 3つの特性をより明確にするために、多様なアプリケーションを用いて CCの主なメリットを説明します。

[ コンバージェンスクロマトグラフィーによる問題解決例 ]

41

[ XxxxXXxxx Xxxx ]

簡易化始めのサンプル収集から最終的な分析までのワークフローの簡易化は、全ての分析ラボに多大なビジネスインパクトを与えます。CCは以下に挙げる方法により多くのアプリケーションでワークフローを大幅に簡易化し、コストと時間を削減するだけでなくエラーのリスクを抑え、生産性を向上させます。

■■ 異なる分析技術を組み合わせます（LCとGC）。

■■ 異なる手法を組み合わせます（順相LCと逆相LC）。

■■ サンプル調製の時間を短縮します。

異なる技術の組み合わせ - 脂質分析脂質はさまざまな理由から多くの分野で分析されています。医薬品分野では薬剤の有効性を検証するために被験者を投与群と対照群に分け脂質プロファイルを、臨床研究ではさまざまな疾患や治療効果を示すバイオマーカーとして脂質レベルを研究します。食品分野では栄養や食品の信頼性を検証するため、トリグリセリドなど特定のクラスの脂質をプロファイリングし、化学工業の分野では石油製品（バイオディーゼルなど）の脂肪酸とトリグリセリドを分析します。どの例でも�

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