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Cours Histologie Et Immunohistochimie
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5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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Mthodes danalysemorphologique destissusAurlie PAGNON-MINOT, phD
Novotec _ 13, 15 rue Jacques Monod 69007 [email protected]
Certificat RB8 Biotechnologie et Ingnierie biomdicale Master M1 Recherche Biomdicale
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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HISTOLOGIE :
Association des cellules pour former des tissus
Un tissu se dfinit par la structure
lagencement des cellules
la prsence ou non de matriel extracellulaire
Ensemble coopratif de cellules diffrencies formant une association
territoriale, fonctionnelle et biologique
Histologie cellulaire Histologie tissulaire
5 !m
K
F
F
50 !m
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1 mm 10 !m 1 !m 10 nm 1 nm
Macroscopie
Microscopie
photoniqueMicroscopie
lectronique
Microscopieforce atomique
! Rsolution de lanalyse structurale
HISTOLOGIE :
Association des cellules pour former des tissus
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Que faire dun prlvement tissulaire ?
Analyse qualitative ousemi-quantitative
Analyse quantitative
Tissus
Hybridation in situ
Immunohistochimie
Immunofluorescence
Coloration
Analyse structurale
Analyse ultrastructurale
MEB
MET
RT-PCR
PCR quantitative
Western-Blot
ELISA
Structuregnrale
gnes
protines
protines
gnes
protines
protines
gnes
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Prlvement
Tissulaire
(biopsies / pices dexrses)
Immunohistochimie/
ImmunofluorescenceColorations histologiques
standards
Hybridation in situ
Examen Microscopie
lectronique
Microscopie optique
standard
Organigramme de traitement des prlvements tissulaires
Fixation
Microtomie
conglation
Microtome
InclusionInclusion ou non en OCT
Ultramicrotomie
Chimique
Rsinesplastiques
Physique
Physique
paraffine
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! La dure minimale de la technique est de deux troisjours, mais elle est en fait trs variable selon :
- la taille des prlvements : certaines pices opratoires ncessitent 2 3 jours de fixation.
- la nature des prlvements : osseux ou calcifis ncessite unedcalcification pralable (qq heures plusieurs semaines)
- les colorations spciales, ncessaires de nombreux diagnostics,peuvent durer plusieurs jours.
- l'urgence de certains diagnostics, qui impose de raccourcir aumaximum les diffrentes tapes des techniques.
Traitement des prlvements tissulaires
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.Prlvements tissulaires"La biopsie est le prlvement dun fragment de tissu. Elle permet lexamendune partie (partielle) ou de la totalit (exrse) dune lsion. Elle est faite :
!Sous contrle de la vue, au bistouri ou avec diverses pinces!A laiguille ou trocard dans les organes profonds.
"La pice opratoire est le rsultat dun acte chirurgical avec rsection dun ouplusieurs organes. Son tude comporte un bilan macroscopique des lsions(nombre, sige, aspect), qui peuvent faire l'objet de photographiesmacroscopiques, et la ralisation des prlvements ncessaires lexamen.
" Lautopsie(ou ncropsie) est un examen fait sur un individu/animal dcdpour prciser les lsions responsables des symptmes observs, tablir lescauses mdicales et/ou juger ventuellement des effets de traitements appliqus.
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. Fixation : accs des anticorps lantigne 1/3" Evite :
. La dcomposition post-mortem
. La digestion enzymatique" Prserve larchitecture des tissus/cellules
" Immobilise les tissus/cellules dans un tat aussi proche que possible de ltat initial.
Points critiques :
La fixation doit se faire aussi vite que possible :. Immdiatement pour les biopsies. #2h pour les pices opratoires
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. Fixation : accs des anticorps lantigne 2/31. Fixation physique : conglation
Tissu plong dans un liquide refroidissant (isopentane 130C) ou dans de lacarboglace
! Avantages :- maintien de la ractivit de l Ag (fixation idale)- tat proche du vivant- maintien en place des constituants solubles
_ prservation dorganites sensibles la pression osmotique
! Inconvnients :_ peu pratique (azote liquide)_ moins bonne morphologie
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. Fixation : accs des anticorps lantigne 3/32. Fixation chimique :
!Les agents prcipitants: Alcool thylique, actoneModification structure tertiaire des protines : effet dnaturant
! Avantage : - Antignicit prserv! Inconvnients : - Altrations morphologiques
- Dshydratation simultane
!Les agents pontants: Formol, liquide de BouinImmobilisation par des liens intra et intermolculaires! Avantages : - Structures mieux prserves: bonne morphologie
- Meilleure immobilisation des protines! Inconvnients : - Dnaturation + svre des Ag
- Masquage des Ag
Points critiques :Dure de fixation : minimum 24h ( temprature ambiante ou 4C selon le fixateur)Volume de fixateur : 10 fois le volume de la biopsie/pice opratoire.
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Bouin
Formol tamponn
Ethanol
MET MEB
IMAGERIE CELLULAIRE & TISSULAIRE :
INFLUENCE DU FIXATEUR
Bouin
Formoltamponn
Ethanol
MO MET MEB
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Liquide de Bouin
Dure darchivage 20 ans
Liquidede Bouin
Dure darchivage 6 mois
IMAGERIE CELLULAIRE & TISSULAIRE :
Influence de la dure de fixation
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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Type dantigne Tissu fix Tissu
congel
Ag extra
cellulaire +/- +
Ag membranaire Svt - +
Ag intra cellulaire + +
IMAGERIE CELLULAIRE & TISSULAIRE :
Influence de la fixation
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. Inclusion :" Donne aux pices anatomiques fixes, la consistance ferme, ncessaire la
coupe.
!Imprgnation des tissus par une substance qui durcit secondairement :paraffine, epon, spurr, mthacrylate.Les rsines tant hydrophobes, le prlvement doit pralablement tre dshydrats(immersion dans des bains dalcool). Les tissus fixs suivant cette mthode ne peuvent pastres utiliss pour dtecter les antignes labiles
!Fixation et inclusion peuvent tre remplaces par la conglation (examensextemporans, tudes de structures qui peuvent tre altres par une fixation). Les tissusfrais peuvent tre inclus dans un compos dO.C.T. . Cette technique solidifie les tissuspermettant des coupes trs minces. Les tissus non fixs et congels ont une antignicitexcellente, mais une prservation morphologique mdiocre.
Points critiques :
La temprature de ltape denrobage ne doit pas tre suprieure 58C $risque de sousvaluation du marquage
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Prparations tissulaires (histologiques)
1. Coupes :" Microtome : coupes de 3 8 %m dpaisseur." Cryostat : coupes de 3 20 %m dpaisseur. Permet dobtenir un diagnostic
rapide ou de pallier aux problmes de fixation menaant lintgrit desconstituants cellulaires. Morphologie des tissus non-optimale.
" Ultra- ou cryo-microtome : coupes de 0.02 0.1 %m dpaisseur.
2. Dpt des coupes sur une lame de verre ou sur des grilles(ME)3. Coloration/IHC/IF/ISH/Imprgnation mtallique4. Montage des lames
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! Les colorations : premires tapes du processus permettant lexamenmicroscopique des tissus pour mieux identifier certains constituants de la cellule.
! Les diffrentes tapes de la coloration :
!Dparaffinage (xylne ou OTTIX ; xylne-thanol)La paraffine est insoluble dans leau et lalcool, mais soluble dans leshydrocarbures tels que le xylne
!Hydratation!Coloration proprement dit (routine ou spciale)!Dshydratation (thanol)!claircissement (tolune / xylne).
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
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! Les colorations classiques : permettent de mettre en vidence la structure gnraledes tissus.
"Hmatoxyline/Eosine (HE)
"Hmatoxyline/Eosine/Safran
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
collagne...................................................roseplemuscle..................................................... rose fonc
Cytoplasme acidophile...............................rougebasophiles.................................................pourpre
noyaux......................................................bleurythrocytes.......................................... Rouge cerise
collagne............................................jaune orang
muscle................................................rosecytoplasme..........................rosenoyaux................................................bleu
rythrocytes.........................................rouge
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! Les colorations spciales : sont ralises pour prciser des structures, dessubstances, des constituants (lipides, glucides, protines, acides nucliques,mtaux, etc).
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
Gordon Sweet Trichrome de Goldner Bleu de Toluidine
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! Mise en vidence des fibres conjonctives : Trichrome de MassonCette coloration met en videnceles fibres de collagne. Cettemthode est trs populaire. Utiledans ltude de la pathologie ducoeur (infarctus), foie (cirrhose ) , rein(fibrose glomrulaire)
Rsultats :Noyau , chromatine et nuclole....bleu fonc noirCytoplasme rouge
Globule rouge rouge
Collagne bleu ou verte
(Variante Goldner)
Coloration habituellement utilise pour observer lastructure de los (inclusion en rsine MMA) : colorationverte de los.
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
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! Mise en vidence des fibres de collagne et rticuline : Rouge de picroSiriusCette coloration met en videnceles fibres de collagnes.
Rsultats :Noyau , cytoplasmetransparent/rose ple
Collagne rouge
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
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! Mise en vidence des fibres lastiques : VerhoeffElle met en vidence le rseau de fibres lastiques. Cette
coloration est utile dans le cadre des diagnostics de lsionsdgnratives congnitales ou acquises (vergetures, lastose
solaire), de vascularite (peut tre demande pour mettre envidence la limitante lastique des
vaisseaux), dartrite temporale.
Rsultats :Noyaux gris noir
Fibres lastiques noir
Cytoplasme..selon contre-colorationGlobules rouges selon contre-coloration
Collagneselon contre-coloration
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
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! Mise en vidence des glucides : Periodic Acid Schiff (PAS)L a c o l o r a t i o n P A S m e t e n v i d e n c e l e s
mucines (pith. bordures en brosse), les membranesbasales, le glycogne ainsi que les filaments et spores
mycliens.Dans les tumeurs indiffrencies, cette
coloration est utile pour orienter le diagnostic vers
une origine glandulaire (adnocarcinome). Elle estdemande dans le diagnostic de pathologiesdu foie et rein.
Rsultats :Noyauxbleu
Glycogne violet
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
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! Mise en vidence des lipides : Red OilLa coloration Red Oil se fait sur descoupes congeles avec un montageaqueux. Elle est surtout demande pour
observer la statose (microvsicules ou
macrovsicules de statose).
RsultatsLipides rougeNoyauxbleu
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
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! Mise en vidence des dpts de calciumVon Kossa : Les sels de calcium sont transforms en
sels dargent rduits ensuite en forme mtallique,
indiquant les sites de calcification.
Rsultats :Sels de calcium: noir
Noyaux: bleu
Rouge alizarin: Met en vidence le calcium tissulaire.
Rsultats :
Sels calcium: orange-rougeFond: vert
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
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! Mise en vidence des pigments et prcipitsLa coloration de Perls: Elle tudie le mtabolisme du
fer. Elle est utile dans certaines pathologies
hpatiques. Caractrise danciennes cicatrices.
Rsultats :Sels ferriquesBleu
Noyaux et cytoplasmeRos
Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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! Objectif:Mettre en vidence et localiser lchelon tissulaire, cellulaire ou sub-
cellulaire toutes sortes dantignes, rvls par leurs anticorps spcifiques.
! Principe :Le complexe antigne-anticorps est rvl par ladjonction de molcules
enzymatiques sur lesquelles on fait agir un substrat spcifique (microscopie en
lumire blanche) ou de fluochromes (microscopie en lumire ultra-violette) ou
de corps opaques aux lectrons (microscopie lectronique). transmission
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence
L'immunohistochimie est ne la fin des annes 1930 - dbut des annes 1940 : pour la premirefois en effet des anticorps marqus avec un traceur fluorescent, la fluorescine, taient utiliss pourrvler des antignes cellulaires (Coons et coll., 1941). Depuis, limmunohistochimie a connu un
immense essor.
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Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :mthodes
Une immunoraction est compose de trois lments principaux :
1. l' chantillon marquer (tissu, cellule, organite subcellulaire, virus ...) contenantl'antigne tudier ;2. un anticorps dirig contre l'antigne recherch : il reconnait un motif (pitope) de cetantigne ;3. le systme rvlateur qui permet de visualiser l'immunoraction.
Les diffrents composantsd une imm unoraction
La qualit des rsultats dpend de l'utilisation judicieuse de ces trois lments.
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. Immunofluorescence!sur tissus congels
!observations : - Microscope photonique (filtres spcifiques)
- Microscope confocal
Immunoenzymologie :!sur tissus congels et/ou fixs
!observations : - Microscope photonique (lumire blanche)
- Microscope confocal
- Microscope lectronique transmission
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :mthodes
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Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :mthodes
! ATTENTION !!
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Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :diffrents tapes
Dparaffinage
Prtraitement :dmasquage antignique
Anticorps primaire
Anticorpssecondaire
Inhibition desproxydases
Contre-coloration
Rvlation
IHC
IF
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Accs des anticorps lantigne : dmasquageantignique , permabilisation des membranes
. Dmasquage enzymatique
!Hyaluronidase (protine de la matrice extracellulaire)!Trypsine!Pronase
!Pepsine
. Dmasquage la chaleur!tampon citrate/four micro-onde!tampon EDTA
!bain-marie ++!tuve
. Permabilisation des membranes :!dtergent non ionique : Triton X-100
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Les anticorps primaires polyclonaux et monoclonaux
. Anticorps polyclonaux
!AvantagesPlusieurs anticorps contre un seul antignePlus sensible
Fixation moins critique
!InconvnientsSpcificit moindre : reconnait diffrents dterminants dun mme antigneAffinit et spcificit variable en fonction des lots.
. Anticorps monoclonaux
!AvantagesMono-spcifique (1 pitope)Affinit homogne
!InconvnientsRalisation plus difficile
Plus grande sensibilit la fixation
Les anticorps sont les ractifs essentiels des ractions immunohistochimiques : sans bonsanticorps, pas d'immunoraction.
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Production danticorps par des animaux
hyper-immuniss
ANTICORPS POLYCLONAUX
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Technique des hybridomes
ANTICORPS
MONOCLONAUX
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Milieu HATHypoxanthineAminoptrineThymidine
Laminoptrine bloqueune voie mtabolique quipeut tre contourne par
lutilisationdhypoxanthine et dethymidine sauf par lescellules du mylome
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Les anticorps secondaires
. Immunofluorescence
Utilisation dAc anti-Ig de lapin ou souris coupls un chromogne fluorescent(Fluorescine, Rhodamine, Rouge Texas.).
Avantages : - permet facilement les doubles marquages- vite les problmes lis aux peroxydases endognes
Inconvnients : - fadding ou photobleaching (dcroissance plus ou moins rapide
de la fluorescence en fonction du temps). Des milieux de montages spciauxpermettent d'liminer l'effacement du marquage
- recouvrement des spectres des fluorochromes
. Immunohistochimie
Utilisation dAc anti-Ig de lapin ou souris coupls des enzymes :- la peroxydase- la phosphatase alcaline
Novotec
Aggrcan
Les rvlateurs
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Les rvlateurs1. La fluorescence
Principe dabsorption -Emission
Avantages : - Protocoles rapides- Grande sensibilit- Colocalisations possibles- Confocal
Inconvnients : - Montage aqueux #disparait au cours du temps- Sensibilit la lumire : stockage 4C- Extinction du signal sous UV- Microscope spcialement quip, chambre noire- Marche mal en paraffine
Les rvlateurs
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Substances fluorescentes : Fluoresceine (FITC), Rhodamine, Texas Red, Alexa ,
Couleur $Absorptionde la lumire par une molcule aromatique (benzme etdrivs)
Coloration visible observe correspondant la couleur complmentaire de la couleurabsorbe :
!Vert 510 570nm = rouge!Jaune 570 600nm = bleu
!Orang-rouge 600 _ 750 nm =bleu-vert
Les rvlateurs1. La fluorescence
Les rvlateurs
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Les rvlateurs2. Les Marqueurs enzymatiques
. Les enzymes :
!HRP : peroxydase de raifort!Phosphatase alcaline!Plus rarement : -galactosidase
. Les substrats = chromogne
Les rvlateurs
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Les rvlateurs2. Les Marqueurs enzymatiques
. Les avantages:
!Visualisation aise, microscopie optique!Grande sensibilit!Diffrentes couleurs et contre-colorations
!Stables si dshydrats!Double marquage avec vision simultane (sauf si [Ag1] >> [Ag2]
et colocalisation)
. Les inconvnients
!Protocoles longs!Pas de colocalisation
!Contraste insuffisant si [Ag] faible!Substrats potentiellement carcinognes!Diffusion du prcipit (prcision)
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Anticorps spcifiques de la matrice extracellulaire :
Collagne de type IV
Magnification : x20
Y
X
IHC IF
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Anticorps dirigs contre des protines intracellulaires
Keratin 6
Novotec
Ki67
Novotec
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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biotine
anticorps II biotinyl
avidine
complexeABC
ABC
chromogne
anticorps I
biotine
tissu
anticorpsII
phosphatase
anticorps anti-
phosphatase
APAAP
AG
tissu
chromogne
anticorps I
Couplage de lanticorps secondaire avec un complexe :
peroxydase-anticorps anti-peroxydase (PAP),
enzymatique (Alcalin Phosphatase Anti Alcalin Phosphatase, dite technique APAAP)
avidine-biotine conjugu un systme de rvlation
AG
PAP
tissu
anticorps I
anticorps II
proxydase
chromogne
AG
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Amplification du signal
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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. Avantages :
- Liaison biotine-streptavidine irrversible (covalente)
_ Amplification considrable possible
. Inconvnients :
_ Augmentation du bruit de fond
_ Biotines endognes
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Amplification du signal
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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! Sassurer que la technique a fonctionn "Importance des contrles
1. Spcificit du marquage, bruit de fond ?
Fixation non spcifique de lanticorps primaire ou secondaire
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Analyse de la technique
Solutions :- Blocage des sites aspcifiques : BSA
- Pr-incubation avec un srum isotypique de lanticorps secondaire- Utilisation de dtergents (Tween) #enlve les interactions non spcifiques
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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! Sassurer que la technique a fonctionn "Importance des contrles
2. Chromogne = substrat denzymes endognes : proxydase
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Analyse de la technique
Solutions :- Pr-incubation avec un inhibiteur de proxydase endognes "H2O2.
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Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Les contrles
1. Les contrles positifs!Incubation de lAc sur un tissu renfermant obligatoirement lAg.!Utilisation dun autre anticorps primaire fonctionnant sur le mme
tissu.
2. Les contrles ngatifs
!sans incubation avec lAc spcifique : omission
!Incubation avec le srum correspondant lanticorps primaire!Incubation de lAc sur un tissu ne renfermant pas lAg.
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. Objectif : Dtecter une squence dacides nucliques (ARN) dintret dans une prparation
cellulaire ou tissulaire
HYBRIDATION IN SITUEtude de la distribution histologique et cytologique
d un acide nuclique
. Principe :Hybridation entre une sonde et un fragment dARN :
$acide nuclique marqu : sonde
$acide nuclique recherch : squence-cible
sonde squence-cible
AP
ARNm
Sonde ARN couple de ladigoxignine
Substrat (NBT/BCIP)
Prcipit color
Anticorps anti-DIG coupl laphosphatase alcaline
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1.Partie Biologie Molculaire :Synthse des sondes
HYBRIDATION IN SITU
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HYBRIDATIONIN SITU
Les diffrentes sondes
. Nature des sondes :
!ADNc double brin!ADNc simple brin!ARN
!Oligonuclotides
. Spcificit : choix de la squence
Dterminer laide des banques de squences (Pubmed) et des logicielsdalignements (ClustalW)
* Introns/Exons, homologie, squences codantes/non codantes
* Taille de la sonde : Compromis entre une bonne stabilit de lhybride(taille suffisante) et une bonne pntration dans les tissus (petite taille).
HYBRIDATION IN SITU
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ADNc dj clon dans un plasmide
Amplifies par PCR
Avantages :
- Stabilit, obtention en grande quantit possibleInconvnients :
- Ncessite sa dnaturation avant utilisation- Possibilit de rhybridation sur elle-mme- Squence longue (prtraitements, Tm leve) donc bruit de fond
RT-PCR(fibroblastes en culture)
Col I
GAPDH
Amorce spcifique / ARN
Col I (491pb) / GPDH (453pb)
HYBRIDATIONIN SITU
Les sondes ADNc double brin
HYBRIDATION IN SITU
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HYBRIDATIONIN SITULes sondes ADNc simple brin
. Obtention par PCR asymtrique
Avantages:
- Stabilit des sondes ADN
- Ne ncessite pas de dnaturation- Pas dhybridation intersonde- Marquage lors de la synthse par PCR
HYBRIDATION IN SITU
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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HYBRIDATIONIN SITU
Les sondes ARN
Produit PCR clon dans un plasmide contenant deux promoteurs virauxdARN polymerases
Avantages :
- Grande quantit
- Marquage au cours de la synthse
- Sondes trs marques sens + anti-sens- Hybridation trs stable (ARN-ARN)
Inconvnients :
- Hybridation haute temprature
- Grande taille de la sonde: pntration difficile- Sensible aux Rnases: prparation et stockage plus dlicats
HYBRIDATION IN SITU
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HYBRIDATIONIN SITU
Les sondes
oligonuclotidiques
ADN monocatnaires de synthse dont la squence est complmentaire delacide nuclique cible.
Rgles pour choisir un oligo :!Squence complmentaire de lacide nuclique recherch!Choisir dans la squence codante
!Taille comprise entre 20 et 50 nuclotides!Pourcentage de GC #50-55%!Pas de squences rptes ni palindromiques!Pas de G aux extrmits!Pas de squence poly T
Avantages :- Choix prcis de la squence hybrider : trs spcifique- Stabilit- Facilit dutilisation- Bonne pntration dans les tissus- Pas dassociation possible entre les molcules de sondes- peu onreuxInconvnients :- Sondes peu marques
-Dtermination de la temprature dhybridation dlicate- La squence choisie peut tre difficile daccs (structure secondaire, masquage par des protines)
HYBRIDATION IN SITU
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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Etude des gnes dintrt /dtermination des amorces
Amplification par PCR des gnesdintrt et purification
Ligation dans un vecteur de clonage ettransformation bactrienne
Extraction ADN plasmidique
Digestion plasmidique etpurification
Synthse des sondes etpurification
Etape 1
Etape 2
Etape 3
Etape 4
Etape 5
Step 6
Point cl
Etude de la distribution histologique et cytologiqued un acide nuclique : ralisation des sondes
Optionnelselon lessondesutilises
Procedures of RNA probesh i
HYBRIDATION IN SITU
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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# Find the sequences of interest genes in bankshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/ !Homo sapiens collagen, type I, alpha 1 (COL1A1), mRNA (NM_000088, 5927 bp)
!Mus musculus collagen, type I, alpha 1 (Col1a1), mRNA (NM_007742, 4709 bp)
# Performed to alignment with a specific software :ClustalW
http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalwan.html
1stSTEP : Primers design to specific gene amplification
(For example : human pro-"1(I))
2. Probes length between 300 and 800
bp (optimal ~ 500 bp).
3. Primers with a hybridization temperature
(50C
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HYBRIDATIONIN SITU
Techniques de marquage des sondes
Agent de marquage :
!marquage radioactif 32P, 35S, 3H "sondes chaudesAttention : les sondes radioactives prsentent de nombreux inconvnients:1. ncessit de se protger contre le rayonnement mis, maniement des sondes inconfortable2. dcroissance rapide du 32P, d o besoin de marquer les sondes frquemmentAvantage: grande sensibilit
!marquage froid : Le nuclotide portant le marqueur est incorpor directement, aucours de la synthse du fragment dADN.
- direct : nuclotide modifi par un fluorophore : Fluoresceine, Cy5, Cy3,
Rhodamine, Texas red,
- indirect : nuclotide marque par un reporter qui sera repr par unemolcule affine : la digoxygnine
Selon la nature de la sonde :
* ADNc : random priming ou PCR
* ARN : transcription in vitro
* Oligonuclotide : 3 tailing
HYBRIDATION IN SITU
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HYBRIDATIONIN SITU
Techniques de marquage des sondes :Random priming
(longation damorce au hasard)
HYBRIDATION IN SITU
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HYBRIDATIONIN SITU
Techniques de marquage des sondes : PCR
+ nuclotide(s) marqu(s)
HYBRIDATION IN SITU
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HYBRIDATIONIN SITU
Techniques de marquage des sondes :ARN
transcription
Produit PCR du gne dintrt clon dans un plasmide contenant deuxpromoteurs viraux
Aprs squenage et linarisation du plasmide, T7/T3 RNAtranscription avec nuclotides marqus
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1.Partie Histologie :La technique dhybridation in situ
HYBRIDATIONIN SITU proprement dit
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p p
Les principales tapes
Prtraitement tissulaireAccs de la sonde : protinase K
Pr-hybridationDiminution de laccrochage non
spcifique
Hybridationentre la sonde et la squence
nuclotidique dintrt
Lavages(supprimer lhybridation non
spcifique)
Rvlation
Facteurs influenant lhybridation : nature des
acides nucliques, composition en base GC,
longeur de la sonde, force ionique, pH de la
solution, prsence dagent stabilisant comme
le formamide, quantit de cibles en prsence,
dure de la raction.
HYBRIDATIONIN SITU proprement dit
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Fixation des tissusConservation de la morphologie
Fixateurs prcipitants ou fixateurs aldhydiques
Tissu fraisConglation rapide
Efficacit de lhybridation
Coupes des tissusParaffine : prservation des structures morphologiques
Cryostat : sensibilit
p p
La prparation du matriel biologique
La prparation des tissus la technique dhybridation in situ estessentielle. Elle doit seffectuer obligatoirement en condition RNAsefree : matriels autoclaver, port de gants, tampon strile,
HYBRIDATIONIN SITU proprement dit
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Tampon dHybridation :
pH compris entre 5 et 7
Temprature dhybridation :
Pour les sondes ADNc : hybrider entre 37C et 42C (50% formamide)Pour les sondes ARNs : hybrider entre 50C et 70C
Limitation du bruit de fond :
Sperme de saumon
ARNtDenhardt
Augmentation de lefficacit dhybridation : sulfate de dextran
p p
Lhybridation
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Dilution de la sonde :
Sonde radioactive : 1nMSonde non radioactive : 10 mM
Incubation :
La nuit , en chambre humide
p p
Lhybridation
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Lavages :
Elimination de la sonde non hybride, dure et stringence adapter
Reprage des hybrides :
Sondes radioactives : autoradiographieSondes non radioactives : ractions ICC
p p
Lavages et reprage des hybrides
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- les ARNs faiblement concentrs dans le cytoplasme des cellulesne sont pas dtects.
- les ARNs peuvent tre masqus par des protines qui leur sontassocies.
p p
Problmes lis lHIS
Problmes techniques :
- choix du tampon et de la temprature de dnaturation.- choix de la temprature dhybridation- travailler en condition RNAse free
Problmes de visualisation :
-sondes sur un plan focal diffrent : utilisation dumicroscope confocal
HYBRIDATIONIN SITU proprement dit
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contrle de la qualit de la sonde : tissu + et tissu
contrle du matriel : hybridation avec sonde htrologue
hybridation avec sonde sens
p p
Contrle de la spcificit dhybridation
HYBRIDATIONIN SITU proprement dit
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p p
Hybridation in situ in toto
In toto sur desembryons depoissons zbre(PAGNON-MINOT et al., 2008)
Sur coupes congelesdembryons de poissons zbre(PAGNON-MINOT et al., 2008)
HYBRIDATIONIN SITU proprement dit
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Peau humaine
Magnification : x63
Hybridation in situ sur coupe paraffine
Collagne de type I
HYBRIDATIONIN SITU proprement dit
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ISH
X
d
eCol1a1
IF
X
de
d
e
X
Collagen I Collagen I
IHC
Hybridation in situ sur coupes paraffine
HYBRIDATIONIN SITU
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$Technique sensibleet semi-quantitative.$ Qui rpond aux questions : O, quand et comment ?$ Hybridation in situ+ IHC = techniques complmentaires:
- HIS : localisation des ARNs transcrits- IHC: localisation des protines traduites
$ Hybridation in situ + PCR quantitative = Techniques complmentaires- HIS : localisation des ARNs transcrits = semi-quantitative- PCRq : Expression des ARNs transcrits = quantitative
Conclusions
La Microscopie : observation des marquages
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! Les marquages peuvent tre observs de nombreuses faons :
" Microscope photonique/optique : 3 systmes de lentilles (condenseur, objectif,oculaire) ; grandissement maximum x1500.
" Microscope optique avec systme additionnel :- microscope contraste de phase,- polarisant,- pipolarisation
" Microscope fluorescence ou confocal" Microscope lectroniqueGnralits :
Sources lumineuses : lumire visible, ultra-violette, rayon X ou faisceau dlectrons
Pouvoir sparateur : il = 0.1mm ; lumire visible = 0.2 %m ; lumire ultra-violette =0.1 %m ; lectrons = 0.1 nm
p q g
Le microscope optique simple et systmes
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additionnels
Principe : Le microscope optique est un instrument d'optique munid'un objectif (lentille 1) et d'un oculaire (lentille 2) qui permet de grossir l'image d'un
objet de petites dimensions (ce qui caractrise son grossissement) et de sparer lesdtails de cette image (et son pouvoir de rsolution) afin qu'il soit observable parl'il humain.
Le microscope optique simple et systmes
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additionnels
Les dpts colors des ractions immunoenzymatiques ou les dpts rouges, verts ou
noirs, d'or et d'argent collodaux s'observent l'aide d'un microscope optique ordinaire(microscope en fond clair).
Des systmes additionnels permettent de mieux voir les ractions de faible intensit oufaiblement contrastes :&contraste de phase et contraste interfrentiel&
vido-microscopie: le signal est amplifi lectroniquement.& pi-polarisation, utilise dans le cas de faibles marquages l'or et l'argent. Laprparation est claire travers l'objectif par une lumire polarise : le mtal rflchit
et dpolarise la lumire. Lobservation se fait travers un filtre polariseur crois ; lemarquage apparait sous forme de points brillants comme on peut le voirsur la figure ci-dessous :
Cellules vgtales marques par unanticorps anti-tubuline ; rvlationpar un anticorps secondairemarqu lor collodal et amplifi largent. A gauche, observation enfond clair, droite mme champobserv en pipolarisation.
Le microscope fluorescence
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Le microscope fluorescence
Principes :
La fluorescence est la proprit que possdent certains corps d'mettre dela lumire aprs avoir absorb des photons de plus haute nergie. Lamicroscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par dtection
de cette lumire mise.
Le microscope fluorescence
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Le microscope fluorescence
Ce sont des microscopes prvus pour tre quips d'une ou plusieurs sourcesde lumire (lampe arc, lampe au xnon, laser, LED) et de filtres permettant deslectionner les longueurs d'onde d'excitation et dmission des traceursfluorescents utiliss.
Ce type de microscope la faveur des immunohistochimistes pour plusieurs raisons :
! la simplicit et la rapidit des marquages fluorescents : pas dtape de rvlation oud'intensification ncessaire comme dans les techniques immunoenzymatiques ou l'orcollodal ;
! la grande sensibilitde nombreux traceurs fluorescents, bien meilleure que lestraceurs enzymatiques ;
! le contraste lev des images ;!un vaste choix de traceurs de couleurs diffrentes ;
Le microscope fluorescence
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Le microscope fluorescence
Les inconvnients :
!un prix dachat et un cot de fonctionnement plus levs
!la difficult que l'on avait d'obtenir de bonnes photographies
argentiques noir et blanc (N&B) ou en couleur cause de la luminosit souvent
faible du signal.
!l'affaiblissement du marquage fluorescent au cours du temps. Lespathologistes qui ont l'obligation d'archiver les rsultats de leurs analyses
prfrent utiliser des marqueurs enzymatiques donnant des dpts colorsstables dans le temps.
Le microscopie confocal
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Le microscopie confocal
Principes :
Le microscope confocal, ou microscope balayage laser, est un microscope fluorescence particulier
Un microscope confocal est un systme pour lequel l'illumination et la dtectionsont limites un mme volume de taille rduite.L'image confocale (ou coupe optique) est ensuite obtenue par le dplacement dece point de focalisation de la lumire d'excitation dans les trois dimensions del'chantillon XYZ.
Le microscopie confocal
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Fibroblaste
Le microscopie confocal
Marquage des fibres musculaires rapides dans
des embryons de poisson-zbre
Le microscope lectronique transmission
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Principe :
Analyser la structure dune cellule ou dun tissu grce un microscope lectroniqueAnalyser la structure et lorganisation cellulaire au sein dun tissu ...
Avantage : Augmentation de la rsolution
Limites : Trs fortes contraintes techniques
Taille des chantillons : biais dchantillonnage +++
Choix du fixateur : analyse structurale : glutaraldhyde
analyse molculaire
in situ: paraformaldhyde
Choix du milieu dinclusion : rsines plastiques : rduction de lextractibilit +++
Colorations : Mtaux lourds (citrate de plomb et actate duranyle)
Le microscope lectronique transmission
Le microscope lectronique transmission
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Le microscope lectronique transmission
Analyse des rsultats : analyse qualitative
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Analyse des rsultats : analyse qualitative
Analyse des rsultats : analyse semi-tit ti
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quantitative
-Comptage de structures marques par units desurface
- Apprciation de lintensit de marquage
Foie subnormal Foie cirrhotique
Analyse des rsultats : analyse semi-tit ti
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quantitative
-Compteur + grille (quadrillage) : comptage cellule/cellule
- Sur une zone pralablement choisie (la plus marque, ..)- Sur lensemble de la prparation
Analyse des rsultats : analyseur dimage
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y y g
-Standardisation :
- Mme paisseur de coupe- Mme restauration antignique- Mme condition de marquage : temprature, dilutions, tempsdincubation.
Quantification en analyse dimage :C l i
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Conclusions
-Bien rflchir ce qui doit tre mesur-Russir sa coloration ou son marquage
-Calibrer lanalyseur dimages
Chirurgie
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Analyses macroscopiques
Prlvements des chantillons / biopsies
10 15jours
2 mois 2 ans
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation Novascularisation/vascularisation
Remodelagematriciel
Interactionpiderme/derme
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1. Observations macroscopiques et analyses de la rtractation des implants
J0 Greffe
2M
3M prlvement
0
0,2
0,4
0,6
0,8
11,2
1,4
1,6
0d 7d 14d 28d 91d
Surface
area
Time after grafting (days)
Variation of the surface area of X and Y Bilayer Living
Construct during the healing
Substitut X
Substitut Y
Observations macroscopiques :- Aspect gnral de la cicatrice : transparence, rgularit, - Rtraction/contraction- Vascularisation- Tissu de granulation
!A. Pagnon-Minot et al.,, 2010 _ In situ hybridization to evaluate the wound healing process of a bilayered living cell-based construct (Apligraf) in a nude mice model. TERMIS-EU 2010 Meeting- 13th 17th june 2010- Galway(Ireland). (abstract slectionn pour communication)!A. Pagnon-Minot, C. F. Rousseau, F. Thillou, S. Guerret, D. J. Hartmann, V. Ronfard- In Situ Hybridization to evaluate the wound healing process of a bilayered living cell-based construct (Apligraf) in a nude mice model.Organogenesis Inc. Meeting- 22th-26th August 2008- Canton, Massachussetts (US).
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?Chirurgie
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Analyses macroscopiques
Prlvements des chantillons / biopsies
2 5 jours
Inflammation
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2. Inflammation
Observations :- Clot de fibrine- Dgradation/ncrose- Type de cellules inflammatoires :
. Polynuclaires
. Lymphocytes
. Macrophages/Cellules gantes
J7
J7
J7
HESHES
MTG
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?Chirurgie
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Analyses macroscopiques
Prlvements des chantillons / biopsies
10 15jours
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation
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3. Epithlialisation
X and Y epidermis size evolution
X
YJ0
J28
J14
6M
6MJ7
Involucrin
Involucrin
K6 K6
K6 K6
3M
Couche
spineuse
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?Chirurgie
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Analyses macroscopiques
Prlvements des chantillons / biopsies
10 15jours
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation Interactionpiderme/derme
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4. Jonction dermo-pidermique
JO
Collagne type VIICollagne type IV
J14
3M
Observations :- Continuit/discontinuit de lalame basale
- Rseau matriciel souspidermique
- Composition :"Utilisation de marqueursspcifiques des lames
basales (laminine, collagne
de type IV, collagne detype VII)"Utilisation de marqueursde la jonction dermo-
pidermique (collagne detype V, fibronectine,lastine)
Collagne type IV
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?Chirurgie
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Analyses macroscopiques
Prlvements des chantillons / biopsies
10 15jours
2 mois 2 ans
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation Novascularisation/vascularisation
Interactionpiderme/derme
Exemple de cicatrisation cutane :
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Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de labiodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierietissulaire.
5. Novascularisation/vascularisation
Observations :- Rpartition des no-vaisseaux dans lestissus.
- Expression de facteurs de croissancepar hybridation in situ : Qui, quand etcomment ?
MTG 'SMA
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?Chirurgie
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Analyses macroscopiques
Prlvements des chantillons /biopsies
10 15jours
2 mois 2 ans
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation Novascularisation/vascularisation
Remodelagematriciel
Interactionpiderme/derme
Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de labiodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierie
5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie
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tissulaire.6. Remodelage matriciel
"Analyse structurale
"Analyse ultrastructurale
J7
3M
3M
Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de labiodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierie
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tissulaire.6. Remodelage matriciel
"Analyse gnique"Analyse protique
Collagne de typeIII
J14
Collagne de typeIII
J14