CRIOBIOLOGIA

STUDIO DELLA VITA A

BASSE TEMPERATURE

CRIOPRESERVAZIONE

• Le cellule umane e animali possono essere criopreservate in azoto liquido a -196°C per più di 10 anni senza significativi cambiamenti delle loro caratteristiche biologiche

• Le cellule vitali possono essere recuperate in qualsiasi momento

Metodica

•Raccogliere le cellule fresche oppure in fase logaritmica della loro crescita nel caso di linee cellulari

•Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità

•Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il sovranatante

•Preparare il medium di congelamento: medium di coltura al 20% FBS e 10% di DMSO

•Risospendere il pellet nel medium di congelamento rapidamente ed in ghiaccio

•Distribuire 1ml nelle appropriate criovials opportunamente siglate

•Dare inizio al processo di congelamento

Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità

•Risospendere la sospensione cellulare in un eguale volume di Trypan Blue (20l sospensione cellulare + 20 l Trypan);•Consentire alla sospensione di

scorrere per capillarità all’interno della camera;•Effettuare la conta delle cellule

non colorate e di quelle colorate.

Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità: NOTE

•Il Trypan Blue è un colorante che è in grado di colorare in blu le cellule necrotiche;•La percentuale di vitalità è calcolata mediante la seguente formula:N° di Cell. Vitali/N° di Cell. Blu + Cell. Vitali X 100•La [ ] cellulare è calcolata mediante la seguente formula:N° Cell. Vitali (media 3 Quadranti) X 10.000 X 2

Punti Critici

•Il congelamento e lo scongelamento non migliorano lo status quo delle cellule

•Gli agenti crioprotettivi possono essere Dimetilsulfossido (DMSO) o Glicerolo; proteggono le cellule dai danni indotti dalla formazione dei cristalli di ghiaccio durante il criocongelamento

•La lunga esposizione a temperatura ambiente al DMSO può danneggiare irreversibilmente le cellule

•Non è necessario sterilizzare il DMSO poiché in forma pura è letale per i batteri

“Risospendere il pellet nel medium di congelamento rapidamente ed in ghiaccio”

Punti Critici

Se la velocità di raffreddamento è troppo bassa , la cellula è esposta a [ ] crescenti di soluti cellulari dovute alla

formazione di ghiaccio nel mezzo di soluzione

ALTA [ ] SOLUTI

VARIAZIONI DI pH

DISIDRATAZIONE

> PRESSIONE OSMOTICA

Punti Critici

Se la velocità di raffreddamento è troppo alta , si avrà la formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione

che all’interno della cellula

DANNO MECCANICO

CRISTALLI INTERNI CRISTALLI ESTERNI

DISTRUZIONE DELLA MEMBRANA CELLULARE

ESISTE LA VELOCITA’ IDEALE?

•Il raffreddamento deve essere lento in modo tale da evitare la formazione di ghiaccio!

•Il raffreddamento deve essere nello stesso tempo rapido in modo tale da non danneggiare la cellula per disidratazione!

OTTIMIZZAZIONE DELLA VELOCITA’ NEL VALORE DI

-1°C/MINUTO

QUALE SISTEMA UTILIZZARE PER LE LINEE CELLULARI CONTINUE?

•Utilizzo di freezer meccanici programmabili, ma sono molto costosi!!!

•Utilizzo di contenitori di polistirolo seguito da trasferimento prima a -20°C e poi a -80°C

•Utilizzo dei contenitori CRIOSTEP

LA VELOCITA’ DI RAFFREDDAMENTO DI -1°C/MINUTO

Contenitori Nalgene

Isopropanolo

Trasferimento in Tanica Criogenica

Fase di Vapori di Azoto Liquido

Immediato trasferimento delle criovials a -80°C per almeno 4 ore

Trasferimento in Tanica Criogenica

Fase Liquida di Azoto

CRIOPRESERVAZIONE

Vantaggi

• Si riduce il rischio di contaminazione microbica

• Si riduce il rischio di cross-contaminazione

• Si riduce il rischio di drift genetico e morfologico

• Si possono utilizzare linee cellulari a ben precisi passaggi

• Notevole riduzione di costi e tempo

BANCA del CORDONE OMBELICALE

Perché si costituiscono le

Banche di Cordone Ombelicale?

Che cosa è un Cordone Ombelicale?

CORDONE OMBELICALE

•E’ una formazione anatomica che mette in comunicazione la placenta con il feto

•E’ costituito da: due arterie ombelicali, una vena ombelicale e dalla sostanza gelatinosa chiamata “Gelatina di Wharton”

•Dalla placenta origina il sangue arterioso ossigenato che in senso centrifugo raggiunge il feto e da questo origina il sangue venoso non ossigenato

•Subito dopo la nascita, il cordone viene reciso a circa 10 cm dal piano cutaneo del neonato e chiuso

•Dopo la recisione del cordone, i vasi ombelicali si trombizzano rapidamente ed il moncone del cordone si essicca assumendo un colorito bruno-nerastro

Come si colleziona il Sangue Cordonale?

Due Tecniche di Raccolta

1)Raccolta del sangue cordonale mentre la placenta è ancora in utero

2)Raccolta del sangue cordonale dopo l’allontanamento della placenta

Vantaggi della I Tecnica

•Il volume della raccolta è maggiore se il cordone è chiuso rapidamente

•Il volume della raccolta è consistente se la raccolta viene effettuata repentinamente

Svantaggi della I Tecnica

•Può interferire negativamente con l’importante processo di “secondamento”

•La tecnica di raccolta descritta non è sempre attuabile nella sala parto

Vantaggi della II Tecnica

•La raccolta può essere effettuata da personale paramedico

Svantaggi della II Tecnica

•Basso numero di cellule raccolte

•Aumentato rischio di contaminazioni batteriche e formazione di coaguli

Perché si utilizzano le cellule cordonali?

Il sangue cordonale contiene

Cellule Staminali

Possono essere utilizzate per trattare un ampio numero di patologie maligne e non maligne.

Patologie Maligne

•Leucemia Acuta Linfoblastica

•Leucemia Acuta Mieloide

•Leucemia Mieloide Cronica

•Neuroblastoma

•Anemia Refrattaria con Eccesso di Blasti

Patologie Non-Maligne

•Anemia di Fanconi

•Anemia Severa Aplastica

•Talassemia

•Immunodeficienza Combinata Severa

•Sindrome di Lesch-Nyhan

Cord Blood

Contiene cellule staminali che si autorinnovano, mantenendo il pool delle cellule staminali stesse, e cellule progenitrici più mature.

Il numero totale di queste cellule è maggiore rispetto a quello presente nel midollo adulto.

Classificazione delle Cellule Staminali

•TOTIPOTENTI

•PLURIPOTENTI

•MULTIPOTENTI

•OLIGOPOTENTI

•UNIPOTENTI

Wagers e Weissman

Cell, Vol 116, pp 639-648, 2004

Cellule Staminali Multipotenti

Esse sono in grado di dare origine ad un “subset of cell lineages”

A tutt’oggi le cellule staminali ematopoietiche multipotenti sono

quelle più studiate e caratterizzate sia biologicamente che

funzionalmente.

CURT CIVIN

Nel 1984 scopre

l’antigene CD34

ANTIGENE CD34

Rappresenta il marcatore delle cellule staminali che si

autorinnovano nonché dei progenitori ematopoietici “più a

valle”

CD34CD90C-kit

Flt3 -Flk2

•Il CD90, il CD133 ed il CD34 sono antigeni della cellula staminale;•Il CD90 è possibilmente coinvolto nelle interazioni cellula-cellula;•Il CD133 è una proteina Prominin-like;•Il C-kit o CD117 è il recettore per il fattore di crescita Stem Cell Factor;•Flt3-Flk2 o CD135 è il recettore per Flt3 ligand ad attività tirosin-chinasica.

HLA-DR-

CD133

BANCAGGIO DI SANGUE CORDONALE

Fasi

•Deteminazione del volume di sangue da crioconservare;

•Preparazione delle provette da dedicare ai vari test: Emocromo, Determinazione del gruppo sanguigno, Tipizzazione HLA, Esami di biochimica clinica e Conta assoluta di cellule CD34;

•Preparazione della soluzione crioprotettiva;

•Inizio della fase di congelamento.

Deteminazione del Volume di Sangue da Crioconservare

•Determinare il peso in gr. della sacca di raccolta;

•Determinare il peso lordo della sacca di raccolta contenente il sangue cordonale;

•Determinare il peso netto sottraendo la tara al peso lordo;

•Il peso espresso in grammi=Volume espresso in ml

•Il peso netto corrisponderà pertanto al volume totale di sangue da crioconservare.

Determinazione dell’Emocromo

Rappresenta uno dei test più importanti della fase di pre-congelamento

Determina il numero di cellule mononucleate da congelare che in media è rappresentato da

circa 500x10E6 cellule totali

Determinazione delle Cellule CD34

Applicazione della Metodica in Citometria a Flusso

Determina il valore assoluto delle cellule CD34+ (0,1-0,5%) che risulta di vitale

importanza ai fini trapiantologici.

Determinazione del numero di eritroblasti.

Conta Assoluta

Esecuzione dell’Esame Emocromocitometrico

La strumentazione è inaffidabile al di sotto di un numero di GB inferiore a 100/l ovvero

100.000/ml

E’ necessaria una metodologia in grado di effettuare una conta di eventi rari

SOLUZIONE DEL PROBLEMA

Citometria a Flusso

CITOMETRO A FLUSSO

PROTOCOLLO GRATAMA JW et al,

J. Immunol. Methods, 2000

Anne M. Brocklebank and Rosemary L. Sparrow

Cytometry, 2001

Esecuzione del Saggio di Conta e Diapositive

P. Mirabelli

BC05A582 11.03.05.001

0 200 400 600 800 1000SSC-Height

Linfociti

like

Eritroblasti

Monociti like

Granulociti-like

BC05A582 11.03.05.001

0 200 400 600 800 1000SSC-Height

BC05A582 11.03.05.001

0 200 400 600 800 1000SSC-Height

R1

R3

Cellule Vitali 7-AAD Negative

Cellule Morte

7-AAD positive

Biglie

BC05A582 11.03.05.001

0 200 400 600 800 1000SSC-Height

Analisi delle cellule vitali

BC05A582 11.03.05.001

0 200 400 600 800 1000SSC-Height

BC05A582 11.03.05.001

0 200 400 600 800 1000SSC-Height

R5

Nuvola di cellule CD34+

Numero eventi biglie : 6672

Numero eventi cellule vitali: 179634

Numero eventi cellule CD34+: 229

Percentuale di cellule CD34+ = 229 / 179634 = 0.13%Valore assoluto di cellule CD34 = 229 (Eventi CD34+) / 6672 (Eventi biglie) x 49208 (Numero di biglie Troucount presente nella provetta) / 2 (Volume finale presente nella provetta da acquisire) x 20 (Fattore di diluizione ottenuto diluendo 100ul di sangue cordonale in 2 ml di Lisante Cloruro d’ammonio) =

16889 cellule CD34/ml

SIMPLIFIED SCHEME OF STEM CELL DIFFERENTIATION

hematopoietic stem cell myeloid blast

CD34

CD90

CD133

CD117

VEGFR

CD105

ALDH

ABCG2

erythroid

CDCP1

ABCB1

CD318

M. Goodell

2001

ABC transporters involved in drug resistance

Gene Protein/alias Drug effluxed

ABCA2 ABCA2 Doxo, VP16, vinblastine

ABCB1 MDR1 Colchi, doxo, VP16

ABCC1 MRP1 Doxo, dauno, vincristine

ABCC2 MRP2 Vinblastine, cisplatinum

ABCC3 MRP3 MTX, VP16

ABCC4 MRP4 6-MP, 6-TG

ABCC5 MRP5 6-MP, 6-TG

ABCC6 MRP6 VP16

ABCC11 MRP8 5-FU

ABCG2 CDw338 Mitoxantrone, imatinib, Hoechst

Dean, 2005

Preparazione della soluzione crioprotettiva

Essa è costituita da:

•80% di Destrano, una soluzione fisiologica;

•20% di Dimetilsulfossido, l’agente crioprotettivo.

Il volume della soluzione crioprotettiva è pari a quello della sospensione di cellule cordonali

da criopreservare

Inizio della Fase di Congelamento

•Addizionare la soluzione crioprotettiva alla sospensione cellulare cordonale avendo cura di lavorare in ghiaccio;

•Preparazione delle aliquote di sangue cordonale già diluito in soluzione criopreotettiva;

•Preparazione delle aliquote-pilota per potere eseguire test di controllo;

•Avviare la vera e propria fase di congelamento.

…“Dare inizio al processo di congelamento”…

Punti Critici

Congelatore Programmabile

1°C/min

-25°C

5-10°C/min

-100°C

Trasferimento in Tanica Criogenica in Fase di Vapori

Trasferimento in Tanica Criogenica in Fase di Vapori

FASE DI QUARANTENA

E’ necessario esplicare durante questa fase tutti i test atti a validare l’utilizzo del sangue cordonale

a scopi trapiantologici

•Esami microbiologici;

•Studi Funzionali mediante l’applicazione di saggi a colonie.

TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE

QUANTE CELLULE CD34+ CORDONALI E’ NECESSARIO INFONDERE IN UN

ADULTO?

Schema: 1x105/kg sogg. 70kg 70x105

DA UN CORDONE OMBELICALE SI RICAVANO CIRCA 10-20 x 105 cellule totali

Pertanto l’indicazione del C.O. è attualmente limitata all’oncologia pediatrica

Prospettive Future

•Espansione Ex-Vivo;

•Migliorare l’efficienza di Homing;

•Trapiantare più unità di sangue cordonale.

Homing delle Cellule Staminali Ematopoietiche

Con il termine Homing si definisce quel processo biologico che conduce le cellule staminali ematopoietiche trapiantate a raggiungere la loro cavità, ovvero “nicchia” nel midollo osseo.

Le varie fasi di Homing di una cellula staminale ematopoietica prevedono:

1.Rolling sulle cellule endoteliali attraverso il legame con E e P-Selectine;

2.Adesione attraverso VCAM-1 espresso dalle stesse cellule endoteliali;

3.Migrazione trans-endoteliale via VLA-4/VCAM-1 come anche via VLA-4 e VLA-5/Fibronectina.

Fasi di Homing

Perché è importante aumentare l’efficienza di Homing?

•Perché soltanto il circa 5% di progenitori umani CD34+ raggiunge la nicchia midollare dell’ospite!

•La percentuale è leggermente variabile e correla con lo stato del ciclo cellulare delle cellule primitive trapiantate;

•L’attecchimento è massimo in cellule quiescienti.

LIMITA FORTEMENTE L’USO DEL CORD BLOOD

Christopherson et al, Science 2004

Modulation of Hematopoietic Stem cells Homing and Engrafment by CD26

Uno dei protagonisti che limita fortemente l’Homing e quindi l’attecchimento dei progenitori primitivi ematopoietici è la molecola CD26.

CD26 è una DPPIV/Dipeptidilpeptidasi IV che ha la funzione di rimuovere dipeptidi dalla estremità aminoterminale delle proteine.

CXCR4

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1SD

F-1

SDF-

1 SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1:-)

Le cellule stromali producono SDF-1 che attrae le cellule positive per CXCR4.

SDF-

1

Sette domini transmembrana

NH2

HOOC

Struttura generale dei recettori per

chemochineCXCR4

1 2 3 4 5 6 7

CD26

CXCR4

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1SD

F-1

SDF-

1 SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1:-( CD26 cliva SDF-1 bloccando

il meccanismo chemiotattico

SDF-

1

EVIDENZE SPERIMENTALI, Science 2004

•L’espressione endogena di CD26 da parte delle cellule del donatore modulano negativamente l’homing e quindi l’attecchimento;

•L’inibizione dell’attività o la delezione del CD26 migliora sorprendentemente l’efficienza di attecchimento.

Ulteriori studi sono necessari allo scopo di utilizzare nell’ambito clinico inibitori del CD26 nel momento in cui la sorgente staminale ematopoietica è limitata.

CD26

CXCR4

:-)

AMD3100

Diprotin-A

“Mobilizzatore”

“Esaltatore di Homing”

… Il Laboratorio è solo un altro posto per giocare …

Kary Mullis, 1998

Premio Nobel per la chimica nel 1993 per aver scoperto la PCR

La membrana Plasmatica:

Individualità e Socialità della Cellula

(T. Alescio et al.)

1. Isolamento

2. Comunicazione

3. Compartimentazione

4. Integrazione funzionale intracellulare

SIGNIFICATO BIOLOGICO DELLA MEMBRANA

1.ISOLAMENTO

E’ una condizione necessaria a garantire l’individualità del corpo cellulare e la sua

integrità chimica; tale condizione è fondata sulla capacità della membrana di comportarsi come

una vera e propria barriera selettiva.

•Ogni cellula mantiene una composizione chimica diversa da quella dell’ambiente

•Ogni cellula può mantenere la sua individualità genetica e metabolica

•Ogni cellula mantiene l’autonomia eventualmente necessaria per la competizione dalla quale scaturisce il processo evolutivo

2. COMUNICAZIONE

Poiché ogni cellula rappresenta un sistema termodinamico aperto, l’isolamento non può essere assoluto ed i sistemi di comunicazione devono assolvere a 3 compiti:

•Consentire il passaggio selettivo, in direzione definita, di sostanze nutritive e dei prodotti di rifiuto

•Capacità di ricevere dall’esterno stimoli e segnali in maniera tale da evocare gli eventi genetici e metabolici adeguati che configurano risposte cellulari specifiche agli stimoli ricevuti

•Realizzare le connessioni intercellulari dirette ed indirette necessarie ad assicurare la solidarietà funzionale di tutte le componenti dell’organismo

3. COMPARTIMENTAZIONE

E’ una condizione tipica degli eucarioti nei quali l’esistenza di sistemi intracellulari di membrane suddivide il corpo cellulare in una serie di scomparti ciascuno dei quali può acquisire una propria attività specializzata.

NUCLEOLISOSOMI

4. INTEGRAZIONE FUNZIONALE INTRACELLULARE

La membrana plasmatica e le membrane intracellulari svolgono la funzione di supporti utili per ancorare ed ordinare in sequenze spaziali ben definite molecole destinate a svolgere funzioni collegate ed interdipendenti

Quando gli enzimi E1, E2 ecc… si trovano in soluzione nel citoplasma, la loro probabilità di incontro con il rispettivo substrato è proporzionale alle loro concentrazioni. La reazione può avvenire soltanto nel momento in cui i movimenti disordinati di diffusione entro la cellula, conducono all’interazione di substrati ed enzimi.

Se invece gli enzimi E1, E2 ecc… sono strettamente associati l’uno all’altro in un grande complesso multienzimatico, la probabilità che il primo prodotto intermedio, liberato da E1, incontri E2, che si trova nelle immediate vicinanze, risulta molto maggiore.

Un’intelligente strategia biologica è quella di inserire una sequenza di molecole funzionalmente interdipendenti nella compagine di un tratto di membrana plasmatica o intracellulare; questa, quindi, può offrire, nel caso del complesso multienzimatico, la struttura di supporto richiesta per la sua integrazione funzionale.

ORGANIZZAZIONE MOLECOLARE DELLA MEMBRANA

Il modello utilizzato per lo studio della membrana plasmatica è rappresentato dal globulo rosso dei mammiferi per i seguenti motivi:

1. Possono essere ottenuti facilmente mediante un prelievo di sangue periferico

2. Durante il processo di differenziamento elimimano la maggior parte degli organelli ed il nucleo

3. Ottenimento di preparazioni assai pure della membrane plasmatiche stesse

Le Membrane Plasmatiche sono costituite da due classi fondamentali di componenti:

LIPIDI COMPLESSI

PROTEINE

+ MOLECOLE DI ZUCCHERI=

GLICOLIPIDI E GLICOPROTEINE

COMPONENTE LIPIDICA

I Diversi tipi di Lipidi che si ritrovano nelle membrane cellulari possono essere riuniti in due classi fondamentali:

A. Fosfolipidi

B. Sfingolipidi

Gangliosidi

Cerebrosidi

Sfingomieline

C. Colesterolo

A. Fosfolipidi

I fosfolipidi risultano dalla combinazione di una molecola di glicerolo con due molecole di acidi grassi, una di acido fosforico ed un raggruppamento variabile da tipo a tipo di fosfolipide.

B. Sfingolipidi

Gli sfingolipidi sono costituiti da una molecola chiamata sfingosina combinata con una molecola di un acido grasso. A questa struttura di base si aggiunge un gruppo laterale di diverso tipo che conferisce alla molecola la propria individualità; sulla base della natura di questo gruppo si possono identificare le tre diverse sottoclassi (sfingomieline, cerebrosidi e gangliosidi).

C. Colesterolo

E’ presente esclusivamente nelle membrane delle cellule eucariotiche.