Crioconservaciòn de Sepas Bacteriana1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE LABORATORIO CLINICO E HISTOPATOLOGICO

CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA I

ENSAYO DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO # 09

TEMA: CRIOCONSERVACIÒN DE CEPAS MICROBIANAS ÙTILES EN EL LABORATORIO CLÌNICO

GRUPO # 02

INTEGRANTES:

BONIFAZ ANDREA MOLINA JHONNATAN RUIZ VANESSA VELASCO DAISY

DOCENTE: ING. FELIX FALCONI

FECHA DE LA PRÀCTICA: 08/12/2015

FECHA DE ENTREGA: 15/12/ 2015

PERÍODO ACADÉMICO: OCTUBRE 2015- FEBRERO 2016

RIOBAMBA – ECUADOR

1414CRIOCONSERVACIÒN DE SEPAS BACTERIANAS GRUPO 2

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZOFACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

Carrera De Laboratorio Clínico E Histopatológico

CALIFICACION DEL ENSAYO DE INVESTIGACION BASADO EN LA PRACTICA DE LABORATORIO

Asignatura: Microbiología I Semestre: Tercero Período: Octubre 2015 – febrero 2016.Docente: Ing. Félix Falconi O.

Participación de los estudiantes del grupo en la redacción del informe.

Grupo N°: 02 Fecha de la práctica: 08/12/2015 Fecha de entrega: 15/12/2015

Cod. APELLIDOS/NOMBRES SECCIONNOTA x

SECCIONNOTA FIRMA

VELASCO DAISY

PORTADA /2

/10RESUMEN /4

BITACORA /4

BONIFAZ ANDREA

INTRODUCCION /3

/10DESARROLLO (1era parte) /5

BIBLIOGRAFIA (Las 1eras

5)/2

MOLINA JHONATAN

DESARROLLO (2era parte) /5

/10BIBLIOGRAFIA (Las 2das

5)/2

ANEXOS /3

RUIZ VANESSA

DESARROLLO (3era parte) /5

/10CONCLUSIONES /3

BIBLIOGRAFIA (Las 3eras

5)/2

Nota: 1) Parea el desarrollo se reparten de acuerdo al número de objetivos planteados, que no deberían ser menos de 3.2) Los Anexos incluye la presente hoja, Bitácoras, Presentación de tablas referenciales, fotografías que no correspondan a materiales y métodos o Resultados, fotografías referenciales, u otros que aporten al desarrollo del tema.

Firma:________________________________

TERCER SEMESTRE LABORATORIO CLINICO E HISTOPATOLOGICO


RESUMEN

Las cepas microbianas se definen como el conjunto de bacterias del mismo género y especie que

posee la misma información genética con igualdad, es decir proviene de un mismo antecesor

común, en cuanto a sus caracteres biológicos, se las llama cepas o colonias puras de bacterias.

La necesidad de los cultivos de referencia parte de demostrar una "trazabilidad". Para que

ello se lleve a cabo, se diseña y se sigue un protocolo documental a fin de que se

mantenga un buen uso y manejo de dichos cultivos, siendo la conservación de cepas bacterianas

que se obtiene bajando el ritmo o estas se paralizan y evitan el crecimiento de las células

microbianas, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por

evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aun así no se puede descartar algún cambio

originado por el método preparatorio en sí mismo.

Para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiología se

necesita que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante

el proceso de conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-

80% de las células, y por último, que estas células permanezcan genéticamente estables.

Utilizamos Agar en medio de cultivo sólido (TSA) estafilococos aureus del cual la dilación fue 1

en 10000000 en donde aplicamos el glicerol el cual cumple su función de evitar la destrucción de

las células, formando espículas. Y Agar caldo medio de cultivo líquido (TSB)



BITACORA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZOFACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

Carrera De Laboratorio Clínico E Histopatológico

BITACORA DE TRABAJO DE INVESTIGACION BASADO EN LA PRACTICA DE LABORATORIO.

Asignatura: Microbiología I Semestre: Tercero Período: Octubre 2015 – febrero 2016Docente: Ing. Félix Falconí O.NOMBRE DEL ESTUDIANTE: DAISY VELASCO Grupo N°: 2 Fecha: 08 -12-2015

PRACTICA N°: 09

TEMACrioconservación de cepas microbianas útiles en el laboratorio clínico

PROBLEMATIZACIÒN

Hoy en día no se logra realizar una perfecta conservación bacteriana debido a que existen varios procesos y son la mayoría poco favorables y no dan los resultados esperados.

HIPÒTESIS

La técnica de la crioconservaciòn de cepas microbianas no da resultados favorables.

OBJETIVO GENERAL

Comprender el proceso de la técnica de crioconservaciòn de cepas microbianas

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Preparar las cepas microbianas a crioconsservaciòn.

Aplicar la técnica de crioconservaciòn de cepas microbianas para estafilococos aureus.

Determinar la calidad de crioconservaciòn

MATERIALES Y MÈTODOS

Materiales:

Puntillas de la micro pipeta

Tijeras

Porta tubos cónicos

Tubos cónicos de 1,5 mm

Bandeja para el hielo

Mechero

Glicerol

Hielo triturado



Equipos:

Micro pipeta

Centrífuga

Vibrador de muestras

Autoclave

Muestra:

Estafilococos aurios

Métodos:

TSA TSB

RESULTADOS

Observamos en los tubos cónicos una formación color blanquecina, que se obtiene bajando el ritmo, estas se paralizan y evitan el crecimiento de las células microbianas obteniendo la conservación de las cepas bacterianas.

CONCLUSIONES

Realizamos la preparación de las cepas microbianas por la crio conservación, ya que esto nos

ayudara a que la morfología de los microorganismos no sufra muchos cambios.

Mediante las características y aspectos generales de la conservación de microorganismos,

aplicamos la técnica de crioconservacion de las cepas para estafilococos aurios.

Determinamos la calidad que debe tener la crioconservacion de las cepas microbianas, los

distintos parámetros y normas que se deben cumplir para realizar este procedimiento en los

distintos laboratorios de Microbiología.

INTRODUCCIÓN

La congelación bacteriana es un método físico químico que permite conservar microorganismos

viables por un tiempo sin sufrir cambios genotípicos. En este proceso se involucra el agua como

microambiente



y es ella la que cambia su estado de líquido a sólido; de otro lado, la bacteria inmersa en este

medio debe adaptarse a las condiciones de este nuevo ambiente, transformar la velocidad de su

metabolismo, conservar su viabilidad y evitar que los cristales de hielo formados por el cambio

de temperatura del agua le ocasione algún daño.

En el proceso de adaptación bacteriana inducido por la congelación, es significativa la reducción

en la velocidad metabólica, a tal punto que su metabolismo se hace imperceptible, pero suficiente

para mantener el microorganismo vivo. Algunas de estas adaptaciones son: la producción de

enzimas resistentes al frio, sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas, el aumento de

la concentración de ·ácidos grasos en la cadena de fosfolípidos de la membrana celular, esta

última, para que contienen el estado semifluido de la membrana y evitar la congelación

Es el proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente

entre -80 ºC y -196 ºC (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones

vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por

mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones

bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.

Es el proceso mediante el cual se enfrían y almacenan células, órganos o tejidos para preservar

sus cualidades ante posibles reacciones biológicas. Para ello, su preservación debe ser a

temperaturas criogénicas (bajas). Ya que la congelación incontrolada de células puede crear

formaciones de hielo intracelular nocivos para las mismas, hay formas para evitarlas. Uno de

ellos es la congelación controlada a través de congeladores programables que utilizan nitrógeno

líquido para ello.

DESARROLLO 1

CRIOCONCERVACION


https://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno

https://es.wikipedia.org/wiki/Punto_de_ebullici%C3%B3n

https://es.wikipedia.org/wiki/Congelaci%C3%B3n

https://es.wikipedia.org/wiki/Tejido_biol%C3%B3gico

https://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula


1.1.1.1 ¿Qué es la crioconservación?

La crioconservación es la técnica de congelación de las células reproductoras que emplea medios

especiales de la conservación en el nitrógeno líquido a la temperatura de -196 °C. Con este

método es posible conservar las células reproductoras durante muchos (incluso decenas) de años.

1.1.1.2 ¿Qué es la vitrificación?

La vitrificación es una técnica moderna de crioconservación durante la cual sucede el

enfriamiento brusco de las células reproductoras hasta la temperatura de -196 °C en cuestión de

segundos. Durante el enfriamiento se utilizan los medios que contienen altas dosis de substancias

crioprotectoras que protegen las células frente los daños.

1.1.1.3 ¿Qué es posible congelar?

La crioconservación clásica posibilita la conservación de los embriones y muestras de esperma.

La congelación avanzada ultra rápida (vitrificación) permite también la conservación del óvulo.

(1)

1.1.1.4 ¿Cómo se realiza la congelación?

La congelación, o también vitrificación, se realiza mediante una técnica moderna en un sistema

cerrado que utiliza un soporte interno y envoltorio externo. Los embriones entran prácticamente

de inmediato al estado congelado. En comparación con la congelación lenta gracias a este

sistema se consiguió aumentar la tasa de éxito del tratamiento de infertilidad con los embriones

congelados casi alcanzando el nivel de la tasa de éxito de los embriones frescos. La congelación

de los óvulos transcurre de manera similar a la congelación de los embriones, vitrificación. (1)

La congelación de los espermatozoides es en comparación con lo descrito anteriormente un

proceso relativamente más sencillo y consiste en mezclar el semen o espermatozoides procesados

con el medio congelante en cierta proporción y su siguiente colocación en el vapor de nitrógeno

líquido. (1)

MIRCROAMBIENTE

En la naturaleza se encuentra una gran diversidad de ambientes que no cumplen con condiciones

Óptimas para el desarrollo de organismos superiores, sin embargo, encontramos organismos



microscópicos perfectamente adaptados. El tamaño se constituye en una ventaja ya que por ser

organismos tan pequeños, su ambiente también lo es, y por lo tanto esto le otorga versatilidad

para que en espacios y tiempos muy reducidos las condiciones fisicoquímicas cambien y les

permite adaptarse y desarrollarse (2)

El ambiente que rodea a un ser vivo es un mundo complejo que incluye componentes bióticos

(otros organismos vivos) y abióticos (compuestos no vivos); este espacio para los

microorganismos bacterianos ha sido denominado microambiente; la interacción que surge en

estos espacios es muy dinámica, la mayoría de las comunidades vivas que lo componen

establecen relaciones de cooperación pero también de antagonismo que conlleva a cambios

permanentes en los procesos de adaptación de las poblaciones bacterianas (3)

La bacteria se relaciona con el microambiente que la rodea a través de movimientos, si se rodea

de una sustancia química, la sustancia atrae la bacteria si es favorable para ella; si no le es

favorable, la respuesta es alejarse de el. Estos movimientos dirigidos hacia una molécula señal se

denominan taxias y están controlados por mecanismos moleculares. Esto le permite reconocer

sus espacios favorables, modificarlos si puede, adaptarse o alejarse de ellos. (4)

DESARROLLO 2

Técnicas de crioconservación para cepas microbianas

Conservación por congelación o crioconservación

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a

temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no

disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las

células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación

desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y además

existe el peligro de que algún fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante

el almacenamiento. También resulta ser el método más molesto para realizar el envío de las cepas. Los

cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método son

los siguientes:

1. Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de la

fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en



su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible

alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos

pleomórficos e incluso en algunos más sencillos.

2. Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de congelación bien

estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones

de la temperatura sean rápidas, tanto para la congelación como para la descongelación, por lo que

para descongelar conviene poner las células a 37ºC.

3. Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos

cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que

tiene una temperatura de –195ºC, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una

temperatura de –140ºC.

En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los más

aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de –70ºC. Aquellos que sólo alcanzan

temperaturas entre –20ºC y –40ºC, como ocurre con la mayoría, no son aconsejables, entre otras

cosas porque debido a la gran concentración de solutos que existen en la suspensión celular, su

punto de congelación baja. El daño que se produce en las células es debido a que a estas

temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se añade un crioprotector no

iónico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el

aumento de la concentración iónica.

Para la conservación en armarios congeladores, las células se almacenan en criotubos (tubos de

plástico esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente), preparando lotes

de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión.

De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Esto también se

puede evitar empleando tubos con criobolas (bolas de tipo abalorio que se impregnan con la

solución celular a congelar), ya que para tomar una muestra basta con emplear una o varias

bolitas sin necesidad de descongelar el resto. Este método no se debe emplear para la

conservación de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el género bacteriano

Clostridium, ya que al estar las células en una superficie hay un mayor contacto con el oxígeno y

puede afectarse la viabilidad.

4. Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir

en las células microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos compuestos que se

pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a

una concentración del 15 al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche



descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elección influye

el tipo de microorganismo que se quiera conservar.

DESARROLLO 3

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD PARA LA CRIOCONSERVACIÓN DE LAS CEPAS

MICROBIANAS

Los microorganismos son esenciales en el trabajo de numerosos laboratorios; se utilizan para la obtención

de medicamentos, elaboración de alimentos como el pan, queso, licores y más; fabricación de solventes y

reactivos, e investigaciones en general.

La biotecnología, una ciencia que crece cada vez más, nos ha obligado a buscar formas de mantener los

cultivos microbianos de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables. (1)

La conservación de las cepas microbianas no es tarea fácil, ya que se debe garantizar la

viabilidad, preservar los niveles de su productividad inicial y salvaguardar la pureza genética del

cultivo sin perder ninguna de sus propiedades bioquímicas; por lo que es indispensable que

elijamos la técnica correcta en función al tipo de cultivo, susceptibilidad del microorganismo al

proceso de conservación y tiempo de preservación. (1)

El método de conservación que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos 70% de las

células por un periodo de tiempo considerable, sin alterar la información genética en las células.

De acuerdo a la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC por sus siglas en inglés)

se deben elegir al menos dos métodos para garantizar la seguridad y minimizar la posibilidad de

pérdida o deformaciones. Sin embargo, en casos como las líneas celulares, donde sólo se puede

utilizar la congelación, se recomienda guardar duplicados en diferentes congeladores. (1)

Es muy importante que los organismos de uso biotecnológico sean mantenidos en una forma que permita

conservar sus propiedades. Los procedimientos seguidos por las colecciones de recursos microbianos

deben asegurar la calidad del producto brindando materiales de referencia que permitan obtener

resultados reproducibles. Las colecciones deben aplicar el control de la calidad y medidas de



aseguramiento para mantener esas condiciones teniendo en cuenta las necesidades de los usuarios y la

disponibilidad de los recursos. (2)

Existen un gran número de modelos nacionales e internacionales para los Sistemas de Aseguramiento de

Calidad que pueden ser utilizadas por las colecciones de cultivos, entre ellas están las ISO 9000 y las

normas para la acreditación. No existe un Sistema de Acreditación diseñado particularmente para

colecciones de cultivos pero los anteriormente mencionados pueden ser aplicados. (2)

Stevenson y Jong (1992) reportaron la necesidad de controlar la calidad y normalizar el trabajo de las

colecciones de cultivo, para incrementar la calidad de las colecciones y de esta manera asegurar que se

ofrece el servicio que se requiere para la ciencia e industria, garantizando materiales de referencia estables

para el futuro. En el mundo existen algunas normas generales para las colecciones, como por ejemplo, los

lineamientos de la WFCC para el establecimiento y operación de las colecciones de microorganismos

(Hawksworth et al., 1990); el proyecto de normas para las colecciones miembros de la red de información

microbiana para Europa (MINE) (Hawksworth y Schipper, 1989); y las normas para bancos de

germoplasmas. Organización de alimentos y agricultura de Naciones Unidas, Roma, Instituto de Recursos

Genéticos de Plantas Internacional, Roma.

En el caso de los laboratorios de microbiología existen un grupo de normas más específicas como las de

Buenas Prácticas de Laboratorio, las normas británicas 5750, los servicios nacionales de medición

(NAMAS). A pesar de que existen publicaciones sobre el mantenimiento de las colecciones de cultivo

que brindan información a través de protocolos y procedimientos, es necesario elaborar y establecer

normas (Hawksworth y Kirsop, 1988; Kirsop y Kurtzman, 1988; Kirsop y Doyle, 1991; Smith y Onions,

1994), pues no existe ningún esquema de acreditación diseñado específicamente para las colecciones de

cultivos. (2)

Aseguramiento de la Calidad en las Colecciones de Cultivos Microbianos 18/30 Estas normas abarcan

solamente el almacenamiento de semillas auténticas que pueden sobrevivir a la desecación, y cuya

longevidad de la semilla es mejorada con la reducción de la humedad y la temperatura de

almacenamiento. Las colecciones de recursos microbianos pueden beneficiarse con la aplicación de

normas similares (Smith, 1996 y Day, 1998). (2)

Algunas colecciones de cultivos de cultivos microbianos trabajan en el establecimiento de un sistema de

aseguramiento de calidad para garantizar confianza a sus clientes en el servicio brindado, y así mismo

desarrollan manuales de procedimientos de laboratorio como reflejo de esos sistemas de calidad, como es

el caso de la Colección de Cultivos Nacional del Reino Unido (UKNCC). (3)



Los siguientes requisitos aparecen contenidos en todas las normas revisadas, y deben constituir los

requisitos mínimos para el aseguramiento de calidad de las colecciones de cultivos:

• Documentación

• Identificación y autenticidad de las cepas

• Pureza

•Monitoreo de viabilidad

• Estabilidad de las propiedades de las cepas

• Estandarización de las condiciones de crecimiento

• Metodologías y protocolos de preservación estandarizados

• Mantenimiento de los equipos

• Normas para el suministro e intercambio de cepas

•Seguridad a largo plazo

•Control de las condiciones ambientales

• Auditorías

• Cumplimiento de las legislaciones

• Personal y entrenamiento. (3)

CONCLUSIONES:

En esta práctica pudimos realizar la preparación de las cepas microbianas por la crio

conservación, ya que esto nos ayudara a que la morfología de los microorganismos no sufra



muchos cambios.

Mediante las características y aspectos generales de la conservación de microorganismos,

aplicamos la técnica de crioconservacion de las cepas para estafilococos aurios.

Determinamos la calidad que debe tener la crioconservacion de las cepas microbianas, los

distintos parámetros y normas que se deben cumplir para realizar este procedimiento en los

distintos laboratorios de Microbiología.

ANEXOS:

/

BIBLIOGRAFÍA:


Trituración del hielo para ser colocado en el la cubeta base del

porta tubos cónicos.

Centrifuga para los tubos cónicos.


2 Bibliografía

1. http://www.reprofit.cz/es/ivf/kryokonzeravace-oocytu.

2. Madigan M, Martinko J, Parker Brock. BiologÌa de los. microorganismos. Novena

ediciÛn, Editorial Prentice hall. Madrid 2004. 62p

3. Smalla K, Sobecky P. The prevalence and diversity of mobile genetic elements in bacterial

communities of different environmental habitats: insights gained front different methodological

approaches. FEMS Microbiology ecology. 2002;42:165 ñ 175

4. Pettersson M, Baath E. Temperature-dependent changes in the soil bacteria community in

limed and unlimed soil. FEMS Microbiology ecology. 2003;(45) : 13 - 21.

5. http://www.sobrecelulasmadre.com/crioconservacion.html. /// /

3 BibliografíaMCLELLAN, J. D. (1995). "Cryopreservation and freeze-drying protocols". New Jersey and Totowa:

Humana Press.

unlp. (s.f.). Recuperado el 13 de 12 de 2015, de http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/ingenieriabioquimicaIyII/seminario3.doc.

4 Bibliografía

1. Malik, K.A. [En línea] Education Committee, 5 de 12 de 1992.

http://www.metrixlab.mx/no-cat/preservacion-de-microorganismos/.

2. Nakase, T. [En línea] The Netherlands. pp, 23 de 5 de 1996. http://www.monografias.com/trabajos-

pdf/colecciones-cultivos-microbianos/colecciones-cultivos-microbianos.pdf.

3. Packer, Doyle. [En línea] 30 de Febrero de 2008.

https://Fcatedras.quimica.unlp.edu.ar%2FingenieriabioquimicaIyII

%2Fseminario3.doc&usg=AFQjCNH1xyoQp2efunTjkbs-86SjkkeVxg.





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