0

CLINICAL SCIENCE SESSION

SITOSOL FOSFOLIPASE A2 ALFA MEMPERKUAT

EKSPRESI AWAL SIKLOOKSIGENASE-2, STRES

OKSIDATIF, DAN FOSFORILASI MAP KINASE SETELAH

ISKEMI CEREBRAL PADA TIKUS

Oleh :

Hajri Yansyah, S. Ked (0618011017)

Ricky Pebriansyah, S. Ked (0818011091)

Pembimbing :

dr. Roezwir Azhary, Sp. S

KEPANITERAAN KLINIK NEUROLOGI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG

RSUD. DR. H. ABDUL MOELOEK BANDAR LAMPUNG

27 Juli 2012

1

Jurnal Neuroinflammation © Kishimoto dkk. 2010

10.1186/1742-2094-7-42

Penelitian

SITOSOL FOSFOLIPASE A2 ALFA MEMPERKUAT EKSPRESI AWAL

SIKLOOKSIGENASE-2, STRES OKSIDATIF, DAN FOSFORILASI MAP

KINASE SETELAH ISKEMI CEREBRAL PADA TIKUS

Koji Kishimoto †, Rung-Li Chi †, Zhang Jian, Judith A Klaus, Kathleen K Kibler, Sylvain Doré, Raymond C Koehler, dan Adam Sapirstein *

Departemen Kedokteran Anestesiologi dan Gawat Darurat, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA.

Abstrak

Latar belakangEnzim sitosol fosfolipase A2 alpha (cPLA2α) telah terlibat dalam perkembangan cedera cerebral setelah iskemi dan reperfusi. Studi sebelumnya pada hewan pengerat menunjukkan bahwa cPLA2α meningkatkan cedera yang luas secara perlahan dan gangguan sawar darah otak berjam-jam setelah reperfusi. Dalam studi ini kami meneliti peran cPLA2α pada cedera iskemik cerebral awal.

MetodeOklusi ateri cerebral medial (MCAO) dilakukan pada tikus cPLA2α + / + dan cPLA2α-/ - selama 2 jam diikuti dengan 0, 2, atau 6 jam reperfusi. Tingkat cPLA2α, siklooksigenase-2, morfologi neuronal, dan reactive oxygen species (ROS) pada hemisfer yang mengalami iskemik dan kontralateral nya dievaluasi dengan cahaya dan mikroskop fluoresensi. Konten PGE2 dibandingkan antara genotipe dan hemisfer setelah MCAO dan 6 jam reperfusi. Aliran darah cerebral regional diukur selama MCAO dan fosforilasi MAPKs relevan dalam homogenat protein otak yang diukur dengan analisis Western setelah 6 jam reperfusi.

HasilProtein cPLA2α neuronal meningkat 2 kali lipat segera setelah MCAO dan levelnya kembali seperti sebelum MCAO setelah 2 jam reperfusi. Induksi Siklooksigenase-2 neuronal dan konsentrasi PGE2 lebih besar pada cPLA2α + / + dibandingkan dengan cPLA2α-/ - iskemik korteks. Pembengkakan saraf di daerah iskemik secara signifikan lebih besar pada cPLA2α + / + daripada otak cPLA2α-/ - (+ / +: 2,2 ± 0,3 kali lipat peningkatan vs - / -: 1,7 ± 0,4 kali lipat peningkatan; P <0,01). Peningkatan reactive oxygen species setelah 2 jam iskemia juga secara signifikan lebih besar dalam inti iskemik cPLA2α + / + dibandingkan cPLA2α-/ - (+ / +: 7,12 ± 1,2 kali lipat vs - / -: 3,1 ± 1,4 kali lipat; P <0,01). Setelah 6 jam korteks iskemik reperfusi pada cPLA2α + / +, tetapi tidak pada cPLA2α-/ -, memiliki gangguan morfologi neuron dan penurunan konten PGE2. Fosforilasi dari MAPKs-p38, ERK 1/2, dan MEK 1/2 signifikan lebih besar pada cPLA2a + / + daripada cPLA2α-/ - iskemik korteks 6 jam setelah reperfusi.

KesimpulanHasil ini menunjukkan bahwa cPLA2α memodulasi respon molekular dan cedera paling awal setelah iskemia cerebral dan memiliki implikasi untuk penggunaan klinis potensi inhibitor cPLA2α.

2

Latar Belakang

Fosfolipase A2 (PLA2) enzim yang menghidrolisis asam lemak bebas dari posisi

kedua (sn-2) dari membran glycerophospholipids dan menambah cedera

neurologis stres oksidatif (ditinjau oleh Muralikrishna [1]). Komponen sitosol

fosfolipase A2α (cPLA2α, juga dikenal sebagai PLA2 grup IVA) adalah anggota

dari superfamili PLA2 yang lebih besar dan memiliki sifat unik yang mungkin

mengatur pembentukan eicosanoid dalam jalur sinyal sel. cPLA2α berada di

sitosol tetapi translocates ke membran intraseluler dalam menanggapi perubahan

fisiologis Ca2+ [2]. cPLA2α memiliki preferensi yang kuat untuk hidrolisis asam

arakidonat (AA) yaitu sumber utama pengaturan, AA intraseluler [3], dan diatur

oleh fosforilasi protein kinase yang bergantung pada beberapa asam amino [4].

Sebelumnya, kami telah menunjukkan bahwa cPLA2α adalah efektor utama dari

cedera neurologis setelah iskemia serebral dan reperfusi (I / R) dengan

menunjukkan bahwa tikus cPLA2α -/- memiliki cedera stroke yang kurang

signifikan daripada tikus liar tipe littermate (+ / +) setelah iskemik cerebral

regional sementara [5]. Kehadiran cPLA2α di neuron [6] dan sifat biokimia nya

yang menyarankan untuk dapat memainkan peran regulasi utama dalam sinyal

neurologis pada iskemia dan penyakit neurologis lainnya [7,8].

cPLA2α juga memiliki peran dalam regulasi enzim yang memetabolisme hilir AA

ke eicosanoids [9,10], yang merupakan mediator penting dari cedera neurologis

akut dan kronis pada stroke [11]. Peran COX-2 adalah sangat baik dieksplorasi

dalam cerebral I / R dan erat berkorelasi dengan cPLA2α. Penghambatan atau

penghapusan gen COX-2 menurun sedangkan COX-2 overekspresi meningkatkan

cedera saraf setelah MCAO [12-14]. Pada tikus ekspresi cPLA2α tampaknya

diperlukan untuk mempertahankan metabolisme basal normal dan ekpresi yang

diinduksi COX-2 di otak [10,15]. cPLA2α yang diturunkan dari asam arakidonat

juga erat dipasangkan dengan enzim 5-lipoxygenase [16] dan dalam model gerbil

iskemia serebral global 15 menit reperfusi menyebabkan translokasi 5-LO pada

membran neuron dan mengakibatkan peningkatan kadar leukotrien C4 [ 17].

cPLA2α menguatkan peningkatan permeabilitas sawar darah-otak setelah iskemia

transien [7], dan eicosanoids memberikan kontribusi pada respon inflamasi

3

berikutnya [18]. Eicosanoids, terutama prostaglandin (PG), dan AA sendiri juga

dapat berkontribusi langsung pada excitotoxicity awal yang mendahului

neuroinflamasi [19-23]. Laboratorium kami dan orang lain menemukan bahwa

cPLA2α dapat memiliki efek langsung dan awal terhadap excitotoxicity in vitro

[19,24,25].

Di sini, kami menguji pengaruh I/R serebral regional transien pada ekspresi

cPLA2α dan, pada gilirannya, efek cPLA2α pada ekspresi siklooksigenase, (COX)-

2, level PGE2 dan reactive oxygen species (ROS) pada tahap awal dari kaskade

kematian sel. Kami membuat oklusi arteri serebral medial (MCA) transien

(MCAO) pada tikus cPLA2α + / + dan cPLA2α-/ - dan meneliti efek dari cPLA2α

pada tahap awal cedera neurologis pada 0, 2, dan 6 jam reperfusi. Kami kemudian

mengkorelasikan ekspresi cPLA2α dengan generasi ROS dan fosforilasi dari

MAPKs yang relevan. Hasil kami menunjukkan bahwa cPLA2α berkontribusi

terhadap cedera I / R segera setelah iskemia.

Metode

Bahan

Jika tidak dinyatakan lain, semua persenyawaan dibeli dari Perusahaan Sigma-

Aldrich (St Louis, MO). Untuk immunomicroscopy anti cPLA2α (P505) dibeli

dari Abcam Inc (Cambridge, MA). Anti-cPLA2α kelinci (N-216) dan antibodi

anti-β-aktin dari Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Alexa Fluor 488

dan 568 keledai anti-kelinci IgG dan NeuroTrace 435/455 Nissl Stain (NT) dibeli

dari Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).

Perawatan Hewan

Semua percobaan dilakukan sesuai dengan pedoman dari Institut Kesehatan

Nasional dan disetujui oleh Komite Penggunaan dan Perawatan Hewan Institusi

Universitas Johns Hopkins. Tikus cPLA2α + / - adalah pemberian dari Takao

Shimizu (Tokyo University) dan disuplai oleh Jim Clark (Wyeth Pharmaceutical,

Cambridge, MA). Tikus ditempatkan di fasilitas dengan siklus cahaya diurnal 12-

jam dengan kebebasan untuk mendapatkan makanan dan air. Semua tikus

4

percobaan diproduksi dengan mengkawini tikus cPLA2α + / - jantan dan betina yang

diproduksi dan dipelihara dalam galur C57BL/6J.

Iskemi Cerebral Focal

Iskemia fokal transien diinduksi oleh MCAO pada mencit cPLA2α- / - dan

cPLA2α+ / + littermates usia 10-14 minggu dengan berat badan antara 20-28 g.

Anestesi dilakukan dengan ventilasi isoflurane spontan pada O2 30%. Sebuah

keping pemanas yang dikontrol secara termostatik dan cahaya inframerah

digunakan untuk menjaga suhu rektal 37,5 ± 0,5 ° C selama semua tahap operasi.

MCAO sisi kiri dan operasi palsu dilakukan sebagaimana telah dijelaskan

sebelumnya [5]. Setelah 2 jam MCAO, tikus itu kembali dianestesi ulang, sutura

oklusif dilepas, dan tikus ditempatkan dalam lingkungan temperatur yang

terkendali.

Dalam percobaan untuk mengukur stres oksidatif, 10 mg / kg dihydroethidium

(HE) disuntikkan ke dalam vena jugularis pada awal permulaan MCAO. Tikus

menjalani 2-jam MCAO dengan pemantauan terus menerus aliran darah serebral

(CBF) dengan laser Doppler flowmetry, dan pada 0 atau 2 jam reperfusi, tikus

dibunuh, perfusi tetap, dan otak diambil.

Penilaian CBF Regional

CBF regional (rCBF) diukur pada 60 menit iskemia pada tikus dari masing-

masing genotipe dan strain, dengan menggunakan autoradiografi [14C]-

iodoantipyrine ([14C]-IAP), sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya [26].

MCAO dilakukan seperti dijelaskan di atas, dengan tambahan penempatan kateter

arteri dan vena femoralis. Pada 60 menit MCAO, tekanan darah arteri, pH, PaCO2,

dan PaO2 diukur, dan 4 μCi dari [14C]-IAP diberikan lewat infus secara intravena.

Bagian otak koronal (20 μm) dipotong pada cryostat yang diarahkan ke film

BioMax (Kodak, Rochester, NY) selama 10 hari dengan standar [14C]. Dari

masing- masing tikus, kita digitalkan tiga gambar autoradiographic dari lima

posisi yang sesuai dengan bagian koronal di +2, +1, 0, -1, dan -2 mm dari bregma.

Regio yang sesuai dengan inti arteri serebral anterior (ACA) dan daerah MCA

5

digambarkan dalam korteks ipsilateral dan kontralateral, dan intensitas sinyal

ditentukan (ImageJ versi 1,36, NIH, di Bethesda, MD). rCBF dihitung seperti

telah dijelaskan sebelumnya [26], dan pengukuran di tiga irisan koronal berturut-

turut dirata-ratakan pada setiap posisi untuk menghasilkan nilai-nilai rCBF

absolut pada setiap regio.

Analisis Mikroskopi Fluoresensi dan Image Digital Kuantitatif

Anestesi terminal berikutnya, tikus diperfusi dengan garam fisiologis 3 × berat

badan / volume, diikuti dengan paraformaldehyde 4% dalam PBS, dan setelah

pencampuran dalam paraformaldehyde 4% dan sukrosa 15%. Untuk

imunofluoresensi, 30 μm bagian koronal diblok dan dipadamkan dengan H2O2

0,5% dalam serum keledai normal 0,3% dalam PBS dan diinkubasi dengan

antibodi primer semalam pada 4° C. Sampel diinkubasi dengan antibodi sekunder

diikuti dengan pengobatan DAB. Slide diwarnai dengan reagen Nissl fluoresensi

untuk memungkinkan identifikasi neuron utuh dengan adanya substansi Nissl

[27].

Bagian otak koronal diperiksa dengan mikroskop confocal LSM510 META

(Zeiss, Thornwood, NY). NT, Alexa Fluor 488, dan Alexa Fluor 568 tertarik

dengan dioda laser 405 nm, Argon laser 488 nm, dan helium-neon laser 561 nm,

masing-masing. Emisi terdeteksi melalui 420-480 nm, 505-530 nm, dan 565-595

nm band-pass filter, masing-masing. HE divisualisasikan melalui eksitasi pada

561 nm dan emisi pada 610 nm. Seorang penyidik buta tentang genotipe dan

hemisfer menggunakan perangkat lunak Image J untuk mengukur fluoresensi

cPLA2α total pada perbesaran rendah (10 ×) gambar yang diperoleh dari bagian

otak yang mewakili tikus cPLA2α +/+ dan cPLA2α-/ - .

Untuk analisis resolusi tinggi, dua gambar yang mewakili minat di bidang kortikal

diperoleh dari masing-masing tiga bagian otak per tikus, dan dua z-planes dari

ketebalan optik ~ 2 μm dipisahkan dengan sampel 8 μm. Level ambang batas

fluoresensi ditetapkan untuk memungkinkan pengenalan neuron individu pada

irisan tanpa saturasi sinyal dan konstan untuk analisis semua irisan. Regio-regio

6

anatomis yang sesuai dengan inti iskemik dan penumbra diidentifikasi dengan

bagian berwarna Nissl fluoresensi. Fluoresensi di atas ambang batas diukur dalam

120-130 neuron untuk tiap tikus secara tidak tumpang tindih, regio dipilih secara

acak dengan photomicrographs yang diperoleh dengan menggunakan perbesaran

100 ×. Area pixel total dinormalisasi ke analisis area total dan jumlah neuron dan

dinyatakan dalam satuan unit yang berubah-ubah.

Imunoblotting

Untuk analisis Western, antibodi primer termasuk COX-2 (1:1000, Cayman

Chemical Co Ann Arbor, MI), cPLA2α (1:500), phospho-cPLA2α (1:500),

ERK1/2 dan phospho-ERK1 / 2 (1:1000), MEK1 / 2 dan phospho-MEK1 / 2

(1:1000), p38 MAPK dan phospho-p38 MAPK (1:1000) (semua dari Cell

Signalling Technology, Inc Danvers, MA). Sampel protein dipisahkan dengan

elektroforesis dan ditransfer ke membran PVDF. Immunocomplexes

divisualisasikan dengan peningkatan deteksi chemiluminescence ditingkatkan

(Amersham Life Science).

Fraksi subselular dibuat dari jaringan otak dihomogenkan dengan Dounce (20

stroke) pada 10 × v / w dari buffer lisis es dingin (2 mM EGTA dalam PBS

dengan inhibitor protease), dan volume 1/10 larutan benzonase (pengenceran

1:50). Sampel secara perlahan dikocok-kocok dengan es selama 20 menit dan

disentrifugasi pada 800 × g selama 10 menit pada suhu 4 ° C. Volume supernatan

100 μm disentrifugasi pada 100.000 × g selama 45 menit pada suhu 4 ° C.

Supernatan mengandung fraksi sitosol. Fraksi nuklir pellet dihabiskan dalam 0,7

w / v buffer lisis CHAPS, disonikasi selama 10 detik dan diinkubasi pada es

selama 30 menit. Konsentrasi protein diukur dengan uji Bradford yang

dimodifikasi. Protein lisat sel (25 μg per sampel) yang diselesaikan secara

elektroforesis pada gel gradien Tris-HCl poliakrilamida 4-15% (Biorad, Hercules,

CA) dan ditransfer ke membran PVDF. Setiap membran diperiksa dan dilepaskan

berurutan untuk phospho-cPLA2α, cPLA2α, dan β-aktin. Untuk immunodetection

rutin protein hemisfer kortikal dihomogenisasikan dalam 5 × v / w buffer, dan 10

μg homogenat mentah digunakan untuk SDS-PAGE.

7

Immunoassay Enzim Prostaglandin E2 (PGE2)

Jaringan kortikal ditimbang dan dihomogenisasi melalui Polytron dalam 10 ml /

mg jaringan basah dingin PBS dengan 10 ug / ml indometasin dan diinkubasi pada

es selama 10 menit. Solusi homogenat dicampurkan ke volume aqueous etanol

40% dan diasamkan dengan asam asetat glasial hingga pH 3.0, diinkubasi selama

5 menit pada suhu kamar, dan disentrifugasi pada 2.500 × g selama 10 menit.

Supernatan ini dikondisikan pada kolom HLB Oasis (Waters Corp, Milford, MA),

dicuci dengan asam format 0,03%, lalu ethanol aqueous 15%/ asam format 0.03%

diikuti dengan eter petroleum. PGs dielusi dengan etil asetat dan diuapkan sampai

kering di bawah nitrogen. Eluant dilarutkan dalam 300 uL buffer assay, dan

konsentrasi PGE2 ditentukan dengan ELISA sesuai dengan instruksi dari

pabriknya (Assay Desain, Ann Arbor, MI.). Untuk setiap ekstraksi dan ELISA

hasilnya dinormalisasi dalam kelompok untuk memperhitungkan variasi dalam

efisiensi ekstraksi lipid.

Analisis Statistik

Tes yang memerlukan sampel multiple yang diperlukan dari tikus tunggal

dianalisis melalui rata-rata sampel antar tikus dan kemudian melakukan annalysis

statistik antar individu. Untuk penelitian dimana beberapa titik waktu

dibandingkan seluruh genotipe dan analisis hemisfer dilakukan pengukuran

berulang ANOVA dan perbandingan post-hoc antara genotipe yang dibuat dengan

uji Newman-Keuls. Perbandingan relatif konsentrasi PGE2 setelah MCAO antara

genotipe dan hemisfer dilakukan dengan 2-way ANOVA diikuti dengan pengujian

Bonferroni antara genotipe menggunakan GraphPad Prism versi 5.03 (GraphPad

Software, San Diego California). Analisis densitometri dengan menggunakan uji t

berpasangan. Untuk semua prosedur; P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Data dinyatakan sebagai nilai mean ± s.d.

Hasil

Untuk menguji pengaruh ekspresi cPLA2α pada kaskade peristiwa molekuler dan

seluler secara in vivo setelah serebral I / R, kami memberi perlakuan pada tikus

8

cPLA2α + / + dan cPLA2α-/ - hingga 2 jam dari MCAO diikuti dengan tidak ada (0),

2, atau 6 jam reperfusi dan memeriksa ekspresi cPLA2α menggunakan

imunofluoresensi sekaligus dengan pewarnaan Nissl. Kami mengamati

peningkatan substansial pada tingkat pewarnaan cPLA2α pada tikus cPLA2α+/ +

setelah 2 jam MCAO dan tidak ada reperfusi. Intensitas fluoresensi rata-rata

cPLA2α pada hemisfer iskemik cPLA2α + / + adalah 1,9 kali lipat lebih besar dari

hemisfer kontralateral (P <0,01). Seperti yang diharapkan, pewarnaan non-

spesifik dalam hemisfer cPLA2α-/ - nyaris tak terdeteksi dan tidak berubah karena

iskemia. Kami kemudian menggunakan pencitraan resolusi tinggi untuk

menunjukkan pola ekspresi seluler cPLA2α setelah MCAO dalam inti iskemik dan

daerah penumbra. Kami mengamati imunofluoresensi cPLA2α pada tingkat yang

sangat rendah pada tikus cPLA2α + / + setelah operasi sham (Gambar 1A a-d).

Setelah 2 jam iskemia, imunofluoresensi itu nyata meningkat dalam neuron dan

sel non-neuron dari hemisfer yang iskemik (Gambar 1A e-f) tetapi tidak berubah

pada hemisfer kontralateral (Gambar 1A g-h). Namun, setelah 2 jam reperfusi,

cPLA2α lebih rendah dalam neuron pada penumbra (Gambar 1A i) dan hampir

tidak ada dalam neuron dari zona iskemik (Gambar 1A j). Pewarnaan Nissl

menunjukkan hilangnya neuron di inti iskemik setelah 2 jam reperfusi (Gambar

1A j). Enam jam setelah reperfusi, imunofluoresensi cPLA2α tidak dapat

dibedakan dari tikus yang mengalami operasi palsu (data tidak ditunjukkan).

Tikus cPLA2α- / - mengalami pewarnaan latar belakang yang non spesifik dan

minimal (Gambar 1A m-x). Fosforilasi cPLA2α juga menunjukkan peningkatan

pada otak cPLA2α + / + setelah 2 jam iskemia dan kemudian menurun seiring waktu

perjalananya mirip dengan cPLA2α unphosphorylated (Gambar 1B).

9

Gambar 1. cPLA2α meningkat karena iskemia pada neuron cPLA2α + / + . A: immunofluorescence cPLA2α (hijau) dan fluoresensi pewarnaan Nissl (biru) pada irisan otak dari tikus cPLA2α + / + dan cPLA2α-/ - setelah operasi palsu, 2-jam MCAO, atau 2-jam MCAO dan 2-jam reperfusi. Gambar dari daerah inti iskemik dan penumbra dari hemisfer ipsilateral dan kontralateral dari tiap genotip ditampilkan. B: immunofluorescence dari Ser505-terfosforilasi cPLA2α (hijau) pada tikus cPLA2α+ / + yang mengalami operasi palsu (a-d), 2 jam MCAO (e-h) atau 2 jam MCAO dan 2 jam reperfusi (i-l). Fluoresensi pewarnaan Nissl neuron adalah warna biru. Gambar representatif, n = 3 tikus dari genotipe masing-masing. IPSI, ipsilateral; Contra, kontralateral.

Untuk memvalidasi hasil percobaan imunofluoresensi, tikus cPLA2α + / + menjadi

sasaran hingga 2-jam MCAO dan tidak ada reperfusi, atau operasi palsu. Setelah

euthanasia, korteks ipsilateral dan kontralateral diambil untuk ekstraksi protein.

Kami melakukan fraksinasi subselular pada protein kortikal dan sasaran ini untuk

analisis Western blot dengan menggunakan antibodi anti-cPLA2α dan anti-

phospho-cPLA2α. Antibodi anti-cPLA2α memperkenalkan kedua bentuk

terfosforilasi dan unphosphorylated dari cPLA2α dan ini mengarah ke

pembentukan suatu doublet pada imunoblot. Pita atas doublet ini adalah bentuk

phospho-cPLA2α dan ini dikonfirmasi dengan antibodi anti-phospho-cPLA2α.

10

Konsisten dengan temuan imunofluoresensi, dalam 2 jam iskemia terjadi

peningkatan total phospho-cPLA2α dalam fraksi sitosol ipsilateral jika

dibandingkan dengan fraksi sitosol kontralateral (non-iskemik) (Gambar 2).

Tingkat ekspresi total dan phospho-cPLA2α dalam fraksi membran tidak berbeda

antara hemisfer ipsilateral dan kontralateral. Hal ini menunjukkan bahwa cPLA2α

tidak terkait dengan membran selular setelah 2 jam MCAO.

Gambar 2. cPLA2α meningkat pada hemisfer iskemik setelah iskemia fokal. A: Suatu

Western blot yang mewakili fraksi protein otak cPLA2α+ / + (25 μg setiap jalur) dari hemisfer non-

iskemik (kontralateral) dan iskemik (ipsilateral). Membran yang sama terpajan antibodi dan

dikembangkan secara berurutan untuk phospho-cPLA2α, cPLA2α, dan aktin, dan. Panel di sebelah

kiri mewakili kontrol positif- cPLA2α rekombinan manusia (rh cPLA2α) dan protein limpa tikus

dan kontrol negatif, protein otak cPLA2α-/ -. Antibodi ditujukan terhadap pengenalan cPLA2α baik

cPLA2α yang terfosforilasi maupun nonphosphorylated. B, C: Analisis Densitometri dari Western

Blot untuk jumlah cPLA2α (B) (n = 5 percobaan) dan (C) phospho-cPLA2α (n = 5 percobaan). *

P <0,05 ipsilateral dibandingkan dengan kontralateral.

Pewarnaan Nissl mengilustrasikan bahwa I/ R menyebabkan gangguan jauh lebih

besar pada morfologi neuron piramidal kortikal pada tikus cPLA2α + / + daripada

tikus cPLA2α-/ - . Neuron di daerah inti dan penumbra diperbesar segera setelah 2

jam iskemia (0 jam reperfusi) dan setelah 2 jam reperfusi (Gambar 3A dan Tabel

1). Ekspresi cPLA2α dikaitkan dengan pembengkakan saraf yang lebih besar pada

11

kedua titik waktu. Setelah 6 jam reperfusi, struktur saraf pada hemisfer ipsilateral

cPLA2α + / + hampir sepenuhnya terganggu dengan penurunan dramatis pada

jumlah neuron (Gambar 3B, a). Struktur dan jumlah neuron pada otak tikus

cPLA2α-/ -, bagaimanapun, tetap utuh (Gambar 3B, c).

Gambar 3. Neuron dalam inti iskemik dari tikus cPLA2α -/- dilindungi dari cedera. A: Pembengkakan Neuronal diukur melalui ambang densitometri dalam otak tikus cPLA2α + / + dan cPLA2α-/ - setelah 2 jam MCAO, 2-jam MCAO dan 2 jam reperfusi, atau bedah palsu, n = 3 tikus / kondisi; * P <0,01, uji-t tidak berpasangan membandingkan cPLA2α + / + ke - / - pada kondisi yang sama. B: pewarnaan Nissl dari otak cPLA2α + / + dan cPLA2α-/ - setelah 2 jam MCAO dan 6 jam reperfusi. Neuron Vacuola (panah) dan kondensasi nuklir (panah) terlihat di inti iskemik tikus cPLA2α + / +. IPSI, ipsilateral; Contra, kontralateral; C, inti iskemik; P, penumbra.

12

Tabel 1. Ukuran neuron cPLA2α + / + dan - / - MCAO, reperfusi, atau operasi palsu

Ukuran neuron relatif ditentukan dalam fluresensi bagian otak dengan pewarnaan Nissl melalui ambang batas densitometri. Bagian dari hemisfer ipsilateral dan kontralateral dicocokkan untuk kedudukan tikus yang menjadi sasaran hingga 2 jam MCAO, MCAO dan 2 jam reperfusi atau operasi palsu. Data adalah indeks rata-rata jumlah piksel dalam neuron untuk setiap kondisi. * P <0,01 untuk + / + dibandingkan dengan - / - dari kondisi yang sama.

cPLA2α mengatur ekspresi COX-2 di otak [10,15] dan blokade PLA2 nonspesifik

mencegah induksi COX-2 setelah iskemia fokal transien [28]. Kami menguji

pengaruh penghapusan cPLA2α pada ekspresi COX-2 setelah I / R. Dalam korteks

ipsilateral dari tikus cPLA2α + / +, COX-2 imunofluoresensi secara substansial lebih

besar dari pada tikus kontrol yang dioperasi palsu segera setelah iskemia (Gambar

4A a-b dibandingkan dengan i-j) lalu meningkat lagi 2 jam setelah reperfusi

(Gambar 4A e-f). Sebaliknya, COX-2 tidak meningkat pada korteks ipsilateral

dari tikusn cPLA2α-/ - (Gambar 4A m-n) dan hanya sedikit peningkatan setelah 2

jam reperfusi (Gambar 4A q-r).

13

Gambar 4. cPLA2α mengatur level COX-2 pasca iskemik. Immunofluorescence COX-2 (hijau) dan Fluoresensi pewarnaan Nissl (biru) pada irisan otak tikus cPLA 2 α + / + dan cPLA 2 α - / - setelah 2 jam MCAO, 2-jam MCAO dan 2-jam reperfusi, atau operasi palsu. Gambar regio inti iskemik dan regio penumbra dari hemisfer ipsilateral dan kontralateral dari setiap genotipe yang akan ditampilkan. Gambar representatif, n = 3 tikus dari genotipe masing-masing. IPSI, ipsilateral; Contra, kontralateral.

PGE2 diproduksi oleh aktivitas enzim COX yang terkoordinasi dan synthases PGE

pada AA. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa kadar PGE2 menjadi

meningkat setelah MCAO terjadi pada hipokampus tikus [29]. Kami

membandingkan kadar PGE2 pada korteks tikus cPLA2α + / + dan - / - segera setelah

2 jam iskemia dan tidak ada reperfusi (Gambar 5A) atau setelah 6 jam reperfusi

(Gambar 5B). Berdasarkan persetujuan dengan hasil sebelumnya tidak ada

perbedaan yang signifikan antara level basal PGE2 pada korteks cPLA2α + / + dan - / -

[10]. Namun, 2 jam MCAO mengakibatkan peningkatan yang signifikan pada

konsentrasi PGE2 dari kedua korteks kontralateral dan ipsilateral cPLA2α +/+.

Sebaliknya kadar PGE2 tidak berubah karena iskemia pada korteks cPLA2α -/- .

Setelah 6 jam reperfusi konsentrasi PGE2 pada corteks iskemik cPLA2α + / + secara

signifikan lebih rendah daripada korteks cPLA2α-/ - atau korteks kontralateral dari

salah satu genotipe (Gambar 5B).

14

Gambar 5 Konsentrasi PGE2 kortikal setelah MCAO dan reperfusi tergantung pada cPLA2α. PGE2 diukur dalam homogenat kortikal dari hemisfer ipsilateral dan kontralateral setelah A: 2 jam MCAO atau operasi palsu dan B: 2 jam MCAO dan 6 jam reperfusi. Hasil dinormalisasi untuk setiap ekstraksi lipid dan uji. * P <0,05; ** P <0,01 n = 3 - 4 setiap kondisi.

Kami juga mengevaluasi peran ekspresi cPLA2α dalam generasi ROS

menggunakan probe HE fluoresensi. Peningkatan ROS pada hemisfer iskemik

tikus cPLA2α + / + secara signifikan lebih besar daripada tikus cPLA2α -/- setelah

iskemia tanpa reperfusi (Gambar 6A, 0 h) (+ / +: 7,12 ± 1,2 kali lipat peningkatan

vs - / -: 3,10 ± 1,4 kali lipat peningkatan, P <0,01) dan juga 2 jam setelah iskemia

(Gambar 6A dan Tabel 2). Tingkat ROS pada hemisfer kontralateral tidak berbeda

dari tingkat tikus yang dioperasikan palsu.

Untuk menentukan apakah perbedaan tingkat ROS antara tikus cPLA2α + / + dan

cPLA2α-/ - dihasilkan dari perbedaan pada respon vaskular selama iskemia, rCBF

15

diukur dengan teknik injeksi [14C]-IAP. Daerah kortikal yang sesuai dengan ACA

dan MCA dibatasi pada bagian otak koronal. MCAO menyebabkan penurunan

aliran darah yang signifikan pada kedua area ACA dan MCA, relatif terhadap sisi

kontralateral pada setiap genotipe (Gambar 6B). CBF sedikit lebih rendah di area

ACA ipsilateral pada regio anterior otak cPLA2α -/- daripada regio yang sama pada

otak cPLA2α +/+. Pengurangan aliran darah pada tingkat yang sama pada ACA

diukur di daerah anterior korteks kontralateral dari tikus cPLA2α-/ -. Oleh karena

itu, perbedaan rCBF antara genotipe selama iskemia tidak memperhitungkan

penurunan intensitas HE, COX-2, atau kehilangan neuron pada tikus cPLA2α -/-.

Gambar 6. Stres oksidatif lebih besar pada tikus cPLA2α + / + daripada tikus cPLA2α - / - setelah MCAO. A:. ROS diukur pada tikus cPLA2α + / + dan cPLA2α - / - yang disuntik dengan dihydroethidium (HE) segera sebelum MCAO atau setelah operasi palsu. Intensitas pewarnaan HE di bagian otak dari titik waktu yang ditunjukkan diukur dengan densitometri. IPSI, ipsilateral; Contra, kontralateral, n = 3 tikus / kondisi dengan 120-130 neuron dihitung / tikus; † P <0,01 B: CBF diukur pada mencit dengan autoradiografi [14 C]-IAP di area ACA dan MCA. setiap korteks pada 60 menit MCAO. Sumbu kiri menunjukkan posisi (dalam mm) dari setiap regio relatif

16

terhadap bregma, dan sumbu kanan menunjukkan rCBF absolut (ml/100g / menit); 24 irisan dari n = 4 tikus / grup. * P <0,01 dan † P <0,05 dibandingkan dengan regio yang sama pada tikus cPLA2α + / + .

Tabel 2. Stres oksidatif pada kortex cPLA2α + / + dan cPLA2α - / - setelah MCAO, MCAO dan reperfusi, atau operasi palsu

Aktivasi protein kinase, termasuk p38 MAPK, MEK1 / 2, dan ERK1 / 2, telah

terlibat dalam kematian neuronal dan kelangsungan hidup setelah reperfusi

serebral [30] dan telah dikaitkan dengan aktivitas cPLA2α [7]. MCAO diikuti oleh

6 jam reperfusi menyebabkan peningkatan kadar p38 MAPK terfosforilasi yang

secara signifikan lebih tinggi pada hemisfer iskemik dari tikus cPLA2α + / +

daripada tikus cPLA2α-/ - (Gambar 7A). Fosforilasi protein MEK1 / 2 dan ERK1 / 2

juga secara signifikan lebih besar pada hemisfer iskemik cPLA2α + / + daripada

tikus cPLA2α-/ - (Gambar 7B).

17

Gambar 7 Aktivasi MAPK setelah reperfusi adalah tergantung pada cPLA2α. A: ekspresi relatif dari MAPK p38 terfosforilasi (P-p38) diukur pada cPLA 2 α + / + dan cPLA 2 α - / - setelah MCAO dan 6 jam reperfusi.. Perwakilan Western Blot membran tunggal yang ditampilkan di atas kuantifikasi dari tiga percobaan. Level P-p38 diukur dengan densitometri dan dinyatakan sebagai rasio P-p38 per p38 total relatif terhadap rasio P-p38per p38 total pada tikus cPLA 2 α + / + yang dioperasikan palsu B:. Perwakilan Western Blot dari MEK1 / 2 dan ERK1 / 2 yang ditampilkan. Tingkat relatif terfosforilasi MEK1 / 2 (P-MEK1 / 2) dan ERK1 / 2 (P-ERK1 / 2) dihitung seperti yang dijelaskan di A. Dalam semua kasus, aktin digunakan sebagai kontrol untuk loading. I, ipsilateral; C, kontralateral; s / R dan s / L, korteks sisi kanan dan kiri tikus yang dioperasikan palsu (n = 3 dari 3 tikus). # P <0,01; † P <0,05.

Diskusi

Enzim cPLA2α memperkuat cedera saraf pada binatang, baik cedera akut dan

kronis, dan kemungkinan juga memodulasi cedera langsung dan juga proses

inflamasi. Dalam penelitian kami sebelumnya, kami mendalilkan bahwa

pengurangan ukuran infark pada tikus cPLA2α-/- dihasilkan dari pengurangan

cedera yang luas secara perlahan ke penumbra. Dalam penelitian sekarang ini,

18

kami mengukur pelepasan (ekspresi) cPLA2α setelah I/R dan membandingkan

dengan pelepasan COX-2, tingkat PGE2 dan pembentukan ROS di otak dari tikus

cPLA2α+/+ dan cPLA2α-/- pada waktu yang berbeda setelah reperfusi (0-6 jam).

Yang penting, titik-titik waktu awal mendahului influx terbesar dari sirkulasi sel

inflamasi dan gangguan sawar darah otak pada eksperimen stroke. Hasil penelitian

kami menunjukkan bahwa iskemia pertama kali menginduksi pelepasan cPLA2α

dan ini berkorelasi dengan pelepasan(ekspresi) COX-2 dan pembentukan ROS

(seperti ditunjukkan oleh intensitas HE). Secara keseluruhan, hasil kami

menunjukkan bahwa cPLA2α memainkan peran penting secara in vivo pada awal

peristiwa toxic setelah I/R.

Perubahan tingkat protein cPLA2α yang kita amati setelah MCAO, walaupun

signifikan, tetapi kecil. Alasannya adalah kecilnya perbandingan banyaknya

cPLA2α dengan PLA2s lain di dalam otak. Kedua, protein yang digunakan untuk

analisis Western dibuat dari sampel jaringan yang mencakup daerah di mana

tingkat cPLA2α tidak mungkin berubah. Ini akan mengurangi efek iskemi yang

diamati pada ekspresi cPLA2α. Data yang diterbitkan sebelumnya mendukung

induksi cPLA2α neuron setelah iskemia. Alexandrov dan rekan mengidentifikasi

domain sensitif dari hipoksia pada regio 5'-untranslated dari gen cPLA2α manusia

yang menginduksi mRNA cPLA2α di dalam sel endotel mikrovaskuler otak.

Sejumlah penelitian melaporkan ekspresi cPLA2α dalam sel glial dan ekspresi

mRNA di neuron, dan sebuah studi terbaru menunjukkan bahwa pelepasan

cPLA2α dalam neuron pada model tikus yang berpenyakit Alzheimer. Setelah

iskemia transient luas, induksi terakhir cPLA2α hanya ditemukan dalam sel glial.

Peneliti lain mencatat peningkatan segera aktivitas PLA2 dalam beberapa menit

setelah I/R serebral yang luas. Iskemia serebral transien pada tikus menunjukkan

bahwa aktivitas cPLA2α meningkat 1 hari setelah reperfusi tetapi kadar protein

dan phospho-cPLA2α tidak meningkat sampai 3 hari setelah reperfusi. Perubahan

cPLA2α yang terjadi dalam hitungan jam sampai hari setelah iskemia mungkin

berhubungan dengan cedera sekunder dan peradangan.

19

Dalam kultur sel, anoksia kimiawi dan peningkatan kalsium intraseluler

menyebabkan cPLA2α berpindah ke inti sel dan membran lainnya. Pada percobaan

iskemia kami dengan imunofluoresensi dan subselular fraksinasi tidak

menyebabkan translokasi cPLA2α ke membran. Ada beberapa penjelasan untuk

kurangnya asosiasi membran cPLA2α. Dalam model iskemia gerbil global, 5-LO

tidak berpindah ke inti sampai beberapa menit setelah reperfusi. Demikian pula,

reoksigenasi setelah terjadinya iskemia menjadi penentu utama dari aliran Ca2+

intraseluler (ditinjau oleh Szydlowska dan Tymianski). Dengan demikian, adalah

mungkin bahwa perpindahan cPLA2α ke membran selular beberapa menit setelah

reperfusi. Percobaan lanjutan menguji periode reperfusi segera yang akan

diperlukan untuk menggambarkan sinyal intraseluler dari aktivasi cPLA2α dan

translokasi di neuron.

Bagaimana mungkin cPLA2α mempengaruhi cedera saraf pada waktu yang

mendahului neuroinflamasi ? Mekanismenya termasuk peningkatan aksi dan

sintesis PG, modulasi respon eksitotoksik dan peningkatan stres ROS telah

dipaparkan sebelumnya.

Peningkatan cPLA2α terkait pada level PGE2 di korteks cPLA2α+/+ setelah MCAO

adalah konsisten dengan dalil-dalil ini. Dalam inti iskemik, kami menemukan

bahwa induksi neuron COX-2 ditunda dan penurunan pada tikus cPLA2α-/- dan

bentuk neuron cPLA2α-/- juga dipelihara. Aktivitas Basal COX-2 cerebral dan

tingkat protein menurun secara signifikan pada tikus cPLA2α-/- , dan kami

sebelumnya menemukan bahwa respon korteks COX-2 dan PGE2 terhadap

lipopolisakarida yang dilemahkan pada cPLA2α-/- . Efek sistemik dari MCAO

dapat menjelaskan peningkatan PGE2 pada kedua hemisfer setelah MCAO

unilateral. Beberapa penelitian laboratorium menunjukkan bahwa penandaan

PGE2 melalui reseptor EP1 atau EP3 memperburuk cedera awal Stroke, mungkin

melalui peningkatan respon kalsium. Kunz dan kawan-kawan mengamati bahwa

perubahan morfologi awal pada neuron merupakan bagian dari cedera terminal

dan menunjukkan bahwa cedera tersebut berhubungan dengan pelepasan COX-2

serta bergantung pada PGE2 dan reseptor EP1 tetapi tidak bergantung pada

20

pembentukan ROS. Miettinen dan para penulis memang menggunakan inhibitor

PLA2 non-spesifik untuk memperbaiki kedua kelainan dan induksi COX-2 setelah

MCAO transien dan menyarankan bahwa neuron yang melepaskan cPLA2α lebih

sensitif terhadap kerusakan iskemik. Aktivitas neuron yang terkoordinasi pada

cPLA2α dan COX-2 menghasilkan eicosanoids setelah iskemia yang mungkin

digpasangkan ke reseptor saraf G-protein-coupled pada proses keracunan.

Metabolisme hasil AA dalam generasi superoksida, dan analisis kinetik yang rinci

dari lemak otak menunjukkan penurunan penggabungan AA pada fosfolipid otak

tikus cPLA2α-/-. Penargetan cPLA2α ke retikulum endoplasma memperburuk stres

oksidatif dalam sel kultur. Pada tikus, iskemia global transient menyebabkan

pelepasan asam lemak bebas yang cepat dari korteks yang berkorelasi dengan

peningkatan aktivitas cPLA2α selama periode iskemia. Sangat mungkin bahwa

korteks iskemik dari tikus cPLA2α-/- memiliki rangsangan pembentukan AA yang

lemah dan karena itu pembentukan ROS berkurang. cPLA2α berkontribusi pada

pembentukan ROS melalui jalur AA-dependent dan COX-2 independen.

AA yang dibentuk oleh cPLA2α juga memiliki potensi untuk mempengaruhi

eksitotoksisitas glutamate secara signifikan. Penerapan inhibitor cPLA2α pada

kultur hipokampus secara signifikan melindungi neuron piramidal dari kehilangan

glukosa-oksigen, dan inhibitor PLA2 mengurangi pelepasan asam amino dari

permukaan korteks setelah oklusi 4 pembuluh darah tikus. Dalam kultur neuron,

AA menguatkan respon kalsium untuk menstimulasi NMDA. Selain itu, kami

melaporkan bahwa aktivitas cPLA2α menyebabkan peningkatan kematian neuron,

perluasan cepat potensial aksi, dan meningkatkan transien Ca2+ setelah terekspos

NMDA dalam neuron CA1 irisan akut hippocampal. Oleh karena itu, adalah

mungkin bahwa I/R mengaktifkan cPLA2α, menyebabkan pelepasan berlebihan

AA, yang menguatkan proses eksitotoksisitas.

Interaksi antara cPLA2α dan jalur MAP kinase memiliki kepentingan potensial

pada cedera otak I/R. Data kami menunjukkan bahwa cPLA2α meningkatkan

pembentukan ROS melalui MCAO (Gambar 7) sementara yang lain menunjukkan

21

bahwa stres oksidatif pada stem cell embryonic tikus menyebabkan MAPK

tergantung terfosforilasi dari cPLA2α. Interaksi ini memiliki potensi untuk

membentuk siklus umpan balik positif dimana cPLA2α-dependent ROS

meningkatkan aktivasi kinase yang menyebabkan aktivasi lebih lanjut dari

cPLA2α. Kami memeriksa tingkat fosforilasi MAPK setelah 6 jam reperfusi

karena beberapa alasan. Pertama, hasil kami menunjukkan cedera saraf sesuai

waktu tersebut. Kedua, Alessandrini dan kawan-kawan menunjukkan bahwa

secara in vivo I/R serebral mengaktifkan kinase dan penghambatan MEKs yaitu

berefek neuroprotektif. Ketiga, mirip dengan hasil kami, 2 jam MCAO diikuti

dengan reperfusi pada tikus menyebabkan fosforilasi ERK1/2 di kedua korteks

ipsilateral dan kontralateral setelah 6 jam reperfusi. Terakhir, Nito dan kawan-

kawan menunjukkan bahwa fosforilasi p38 dan aktivitas memuncak setelah 2 jam

MCAO dan 6 jam reperfusi. Penurunan cPLA2α-dependent ROS dapat

menjelaskan mengapa p38 MAPK dan protein MEK1/2-ERK1/2 kurang

terfosforilasi pada otak cPLA2α-/- (Gambar 7). Stres oksidatif mengaktifkan p38

MAPK di neuron, yang kemudian mengaktifkan caspases 8 dan 9 dan

menyebabkan apoptosis neuron. Dengan demikian interaksi cPLA2α dengan p38

MAPK mungkin memperkuat cedera iskemik, seperti penghambatan aktivitas p38

pada tikus menurunkan fosforilasi cPLA2α dan melemahkan cedera stroke.

Mungkin juga pembentukan AA oleh cPLA2α dapat langsung merangsang

fosforilasi p38 MAPK dan ERK1/2 karena hal ini telah dibuktikan secara seluler.

Secara bersama-sama jalur interaksi ini dapat berpotensi menyebabkan cedera

neurologis awal setelah MCAO.

Kesimpulan

Temuan ini menunjukkan bahwa cPLA2α adalah modulator penting dari peristiwa

molekuler yang terjadi tak lama setelah serebral I/R. Peristiwa ini cenderung

memperkuat kaskade inflamasi, dan kematian sel yang menentukan proses

perkembangan stroke. Data kami menyarankan bahwa administrasi yang lambat

untuk inhibitor cPLA2α mungkin akan memiliki efikasi terbatas dalam mencegah

cedera neurologis yang diproduksi oleh I/R.

22

References

1. Muralikrishna Adibhatla R, Hatcher JF: Phospholipase A2, reactive oxygen

species, and lipid peroxidation in cerebral ischemia. Free Radic Biol Med

2006, 40:376-387.

2. Glover S, de Carvalho MS, Bayburt T, Jonas M, Chi E, Leslie CC, Gelb MH:

Translocation of the 85-kDa phospholipase A2 from cytosol to the

nuclear envelope in rat basophilic leukemia cells stimulated with

calcium ionophore or IgE/antigen. J Biol Chem 1995, 270:15359-15367.

3. Clark JD, Milona N, Knopf JL: Purification of a 110-kilodalton cytosolic

phospholipase A2 from the human monocytic cell line U937. Proc Natl

Acad Sci USA 1990, 87:7708-7712.

4. Kramer RM, Roberts EF, Manetta JV, Hyslop PA, Jakubowski JA: Thrombin-

induced phosphorylation and activation of Ca(2+)-sensitive cytosolic

phospholipase A2 in human platelets. J Biol Chem 1993, 268:26796-26804.

5. Bonventre JV, Huang Z, Taheri MR, O’Leary E, Li E, Moskowitz MA,

Sapirstein A: Reduced fertility and postischaemic brain injury in mice

deficient in cytosolic phospholipase A2. Nature 1997, 390:622-625.

6. Kishimoto K, Matsumura K, Kataoka Y, Morii H, Watanabe Y: Localization of

cytosolic phospholipase A2 messenger RNA mainly in neurons in the rat

brain. Neuroscience 1999, 92:1061-1077.

7. Nito C, Kamada H, Endo H, Niizuma K, Myer DJ, Chan PH: Role of the p38

mitogen-activated protein kinase/cytosolic phospholipase A2 signaling

pathway in blood-brain barrier disruption after focal cerebral ischemia

and reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab 2008, 28:1686-1696.

8. Sanchez-Mejia RO, Newman JW, Toh S, Yu GQ, Zhou Y, Halabisky B, Cisse

M,

Scearce-Levie K, Cheng IH, Gan L, et al: Phospholipase A2 reduction

ameliorates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease.

Nat Neurosci 2008, 11:1311-1318.

9. Fujishima H, Sanchez Mejia RO, Bingham CO, Lam BK, Sapirstein A,

Bonventre JV, Austen KF, Arm JP: Cytosolic phospholipase A2 is essential

for both the immediate and the delayed phases of eicosanoid

23

generation in mouse bone marrow-derived mast cells. Proc Natl Acad Sci

USA 1999, 96:4803-4807.

10. Sapirstein A, Saito H, Texel SJ, Samad TA, O’Leary E, Bonventre JV:

Cytosolic phospholipase A2alpha regulates induction of brain cyclooxygenase-2

in a mouse model of inflammation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol

2005, 288:R1774-1782.

11. Bazan NG: Lipid signaling in neural plasticity, brain repair, and

neuroprotection. Mol Neurobiol 2005, 32:89-103.

12. Doré S, Otsuka T, Mito T, Sugo N, Hand T, Wu L, Hurn PD, Traystman RJ,

Andreasson K: Neuronal overexpression of cyclooxygenase-2 increases

cerebral infarction. Ann Neurol 2003, 54:155-162.

13. Iadecola C, Niwa K, Nogawa S, Zhao X, Nagayama M, Araki E, Morham S,

Ross ME: Reduced susceptibility to ischemic brain injury and N-methyl-

D-aspartate-mediated neurotoxicity in cyclooxygenase-2-deficient mice.

Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:1294-1299.

14. Nogawa S, Zhang F, Ross ME, Iadecola C: Cyclo-oxygenase-2 gene

expression in neurons contributes to ischemic brain damage. J Neurosci

1997, 17:2746-2755.

15. Bosetti F, Weerasinghe GR: The expression of brain cyclooxygenase-2 is

down-regulated in the cytosolic phospholipase A2 knockout mouse. J

Neurochem 2003, 87:1471-1477.

16. Peters-Golden M: Cell biology of the 5-lipoxygenase pathway. Am J Respir

Crit Care Med 1998, 157:S227-232.

17. Ohtsuki T, Matsumoto M, Hayashi Y, Yamamoto K, Kitagawa K, Ogawa S,

Yamamoto S, Kamada T: Reperfusion induces 5-lipoxygenase

translocation and leukotriene C4 production in ischemic brain. Am J

Physiol 1995, 268:H1249-1257.

18. Iadecola C, Gorelick PB: The Janus face of cyclooxygenase-2 in ischemic

stroke: shifting toward downstream targets. Stroke 2005, 36:182-185.

19. Shen Y, Kishimoto K, Linden DJ, Sapirstein A: Cytosolic phospholipase A2

alpha mediates electrophysiologic responses of hippocampal pyramidal

neurons to neurotoxic NMDA treatment. Proc Natl Acad Sci USA 2007,

24

104:6078-6083.

20. Kunz A, Anrather J, Zhou P, Orio M, Iadecola C: Cyclooxygenase-2 does

not contribute to postischemic production of reactive oxygen species. J

Cereb Blood Flow Metab 2007, 27:545-551.

21. Richards DA, Bliss TV, Richards CD: Differential modulation of NMDA-

induced calcium transients by arachidonic acid and nitric oxide in

cultured hippocampal neurons. Eur J Neurosci 2003, 17:2323-2328.

22. Ahmad AS, Saleem S, Ahmad M, Doré S: Prostaglandin EP1 receptor

contributes to excitotoxicity and focal ischemic brain damage. Toxicol Sci

2006, 89:265-270.

23. Kawano T, Anrather J, Zhou P, Park L, Wang G, Frys KA, Kunz A, Cho S,

Orio M, Iadecola C: Prostaglandin E2 EP1 receptors: downstream effectors

of COX-2 neurotoxicity. Nat Med 2006, 12:225-229.

24. Arai K, Ikegaya Y, Nakatani Y, Kudo I, Nishiyama N, Matsuki N:

Phospholipase A2 mediates ischemic injury in the hippocampus: a

regional difference of neuronal vulnerability. Eur J Neurosci 2001,

13:2319-2323.

25. Brady KM, Texel SJ, Kishimoto K, Koehler RC, Sapirstein A: Cytosolic

phospholipase A2 alpha modulates NMDA neurotoxicity in mouse

hippocampal cultures. Eur J Neurosci 2006, 24:3381-3386.

26. Jay TM, Lucignani G, Crane AM, Jehle J, Sokoloff L: Measurement of local

cerebral blood flow with [14C]iodoantipyrine in the mouse. J Cereb Blood

Flow Metab 1988, 8:121-129.

27. Quinn B, Toga AW, Motamed S, Merlic CA: Fluoro nissl green: a novel

fluorescent counterstain for neuroanatomy. Neurosci Lett 1995,184:169-172.

28. Miettinen S, Fusco FR, Yrjanheikki J, Keinanen R, Hirvonen T, Roivainen R,

Narhi M, Hokfelt T, Koistinaho J: Spreading depression and focal brain

ischemia induce cyclooxygenase-2 in cortical neurons through N-

methyl-D-aspartic acid-receptors and phospholipase A2. Proc Natl Acad

Sci USA 1997, 94:6500-6505.

29. Marcheselli VL, Hong S, Lukiw WJ, Tian XH, Gronert K, Musto A, Hardy M,

Gimenez JM, Chiang N, Serhan CN, Bazan NG: Novel docosanoids inhibit

25

brain ischemia-reperfusion-mediated leukocyte infiltration and pro-

inflammatory gene expression. J Biol Chem 2003, 278:43807-43817.

30. Alessandrini A, Namura S, Moskowitz MA, Bonventre JV: MEK1 protein

kinase inhibition protects against damage resulting from focal cerebral

ischemia. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:12866-12869.

31. Klivenyi P, Beal MF, Ferrante RJ, Andreassen OA, Wermer M, Chin MR,

Bonventre JV: Mice deficient in group IV cytosolic phospholipase A2 are

resistant to MPTP neurotoxicity. J Neurochem 1998, 71:2634-2637.

32. Kalyvas A, David S: Cytosolic phospholipase A2 plays a key role in the

pathogenesis of multiple sclerosis-like disease. Neuron 2004, 41:323-335.

33. Candelario-Jalil E, Gonzalez-Falcon A, Garcia-Cabrera M, Leon OS, Fiebich

BL: Post-ischaemic treatment with the cyclooxygenase-2 inhibitor

nimesulide reduces blood-brain barrier disruption and leukocyte infiltration

following transient focal cerebral ischaemia in rats. J Neurochem 2007, 100:1108-

1120.

34. Yang HC, Mosior M, Johnson CA, Chen Y, Dennis EA: Group-specific

assays that distinguish between the four major types of mammalian

phospholipase A2. Anal Biochem 1999, 269:278-288.

35. Alexandrov PN, Cui JG, Lukiw WJ: Hypoxia-sensitive domain in the human

cytosolic phospholipase A2 promoter. Neuroreport 2006, 17:303-307.

36. Sun GY, Xu J, Jensen MD, Yu S, Wood WG, Gonzalez FA, Simonyi A, Sun

AY, Weisman GA: Phospholipase A2 in astrocytes: responses to oxidative

stress, inflammation, and G protein-coupled receptor agonists. Mol

Neurobiol 2005, 31:27-41.

37. Clemens JA, Stephenson DT, Smalstig EB, Roberts EF, Johnstone EM,

Sharp JD, Little SP, Kramer RM: Reactive glia express cytosolic

phospholipase A2 after transient global forebrain ischemia in the rat.

Stroke 1996, 27:527-535.

38. Rordorf G, Uemura Y, Bonventre JV: Characterization of phospholipase A2

(PLA2) activity in gerbil brain: enhanced activities of cytosolic,

mitochondrial, and microsomal forms after ischemia and reperfusion. J

Neurosci 1991, 11:1829-1836.

26

39. Sheridan AM, Sapirstein A, Lemieux N, Martin BD, Kim DK, Bonventre JV:

Nuclear translocation of cytosolic phospholipase A2 is induced by ATP

depletion. J Biol Chem 2001, 276:29899-29905.

40. Evans JH, Spencer DM, Zweifach A, Leslie CC: Intracellular calcium signals

regulating cytosolic phospholipase A2 translocation to internal

membranes. J Biol Chem 2001, 276:30150-30160.

41. Szydlowska K, Tymianski M: Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell

Calcium 47:122-129.

42. Ahmad M, Saleem S, Zhuang H, Ahmad AS, Echeverria V, Sapirstein A,

Doré S: 1-hydroxyPGE reduces infarction volume in mouse transient

cerebral ischemia. Eur J Neurosci 2006, 23:35-42.

43. Manabe Y, Anrather J, Kawano T, Niwa K, Zhou P, Ross ME, Iadecola C:

Prostanoids, not reactive oxygen species, mediate COX-2-dependent

neurotoxicity. Ann Neurol 2004, 55:668-675.

44. McCullough L, Wu L, Haughey N, Liang X, Hand T, Wang Q, Breyer RM,

Andreasson K: Neuroprotective function of the PGE2 EP2 receptor in

cerebral ischemia. J Neurosci 2004, 24:257-268.

45. Rosenberger TA, Villacreses NE, Contreras MA, Bonventre JV, Rapoport SI:

Brain lipid metabolism in the cPLA2 knockout mouse. J Lipid Res 2003,

44:109-117.

46. Ren G, Takano T, Papillon J, Cybulsky AV: Cytosolic phospholipase A2-

alpha enhances induction of endoplasmic reticulum stress. Biochim Biophys

Acta 1803:468-481.

47. Saluja I, Song D, O’Regan MH, Phillis JW: Role of phospholipase A2 in the

release of free fatty acids during ischemia-reperfusion in the rat cerebral

cortex. Neurosci Lett 1997, 233:97-100.

48. Phillis JW, O’Regan MH: Mechanisms of glutamate and aspartate release

in the ischemic rat cerebral cortex. Brain Res 1996, 730:150-164.

49. Lee SH, Na SI, Heo JS, Kim MH, Kim YH, Lee MY, Kim SH, Lee YJ, Han

HJ: Arachidonic acid release by H2O2 mediated proliferation of mouse

embryonic stem cells: involvement of Ca2+/PKC and MAPKs-induced

EGFR transactivation. J Cell Biochem 2009, 106:787-797.

27

50. Lennmyr F, Karlsson S, Gerwins P, Ata KA, Terent A: Activation of mitogen-

activated protein kinases in experimental cerebral ischemia. Acta Neurol

Scand 2002, 106:333-340.

51. Choi WS, Eom DS, Han BS, Kim WK, Han BH, Choi EJ, Oh TH, Markelonis

GJ, Cho JW, Oh YJ: Phosphorylation of p38 MAPK induced by oxidative

stress is linked to activation of both caspase-8- and -9-mediated

apoptotic pathways in dopaminergic neurons. J Biol Chem 2004,

279:20451-20460.

52. Paine E, Palmantier R, Akiyama SK, Olden K, Roberts JD: Arachidonic acid

activates mitogen-activated protein (MAP) kinase-activated protein kinase 2 and

mediates adhesion of a human breast carcinoma cell line to collagen type IV

through a p38 MAP kinase-dependent pathway. J Biol Chem 2000, 275:11284-

11290.