Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC)

IntroducereCromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC [112]) acoperă azi, în proporţieaproximativ 80%, analiza substanţelor moleculare: organice, organo-metalice şi anorganice inclusiv compuşii foarte polari sau labili termic pecum şi compuşii cu masă moleculară ridicată (naturali sau sintetici). De aceea, împreună cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important în analizele chimice moderne. Deşi eficacitatea coloanelor nu o egalează încă pe cea din GC, prin faptul că se poate modifica, pe lângă faza staţionară, şi faza mobilă, cromatografia de lichide (LC) face posibile separări şi analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masă a transformat, în ultimul timp, această metodă în principalul mijloc de analiza a compuşilor moleculari naturali sausintetici, constituind unul din pilonii pe care s-a dezvoltat biochimia şi biotehnologia modernă.

Metoda constituie o evoluţie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloană clasică, care servea în primul rând la izolarea preparativă a compuşilor naturali. Prin introducerea pompelor şi în consecinţă, lucrându-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze staţionare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze staţionare sferice, cu diametre 2-5µm), în coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, începând cu anul 1969, la configuraţia actuală (fig. 1). Se poate observa că din rezervoarele conţinând unul sau mai mulţi solvenţi pompa (sau pompele), alimentează coloana cu eluent (de regulă un amestec de doi sau mai mulţi solvenţi). În imediata vecinătate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass.

În coloana aflată într-o etuvă termostat, are loc separarea propriu-zisă. Efluentul coloanei intră într-un detector de unde componentul, dacă este separat complet, poate fi colectat şi izolat, cu ajutorul unui colector de fracţiuni. Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct în memoria unui calculator. În esenţă, un cromatograf analitic HPLC are structura din fig. 2 unde nu s-a mai prezentat colectorul de fracţiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemănarea cu GC singura deosebire majoră constituind-o sursa de eluent - pompa. Pompe pentru HPLC

Pompa este considerată una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece permite realizarea unui debit constant al eluentului prin întreg sistemul: injector, coloană, detector mărind deosebit de mult viteza separării.

Într-un cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe, fiecare furnizând o presiune care poate atinge 20mii kPa (cca. 200atm). Presiunea deosebită este necesară deoarece coloana are o umplutură de fineţe mare şi, în lipsa presiunii, debitul ar fi nepractic de mic.Există în uz două tipuri principale de pompe, clasificate astfel în funcţie de debit: pompe cu presiune constantă (şi debit variabil) şi pompe cu debit constant.Pompele cu presiune constantă sunt mai simple (a se citi ieftine) şi nu prezintă pulsaţiiîn funcţionare (care nu ar permite obţinerea unei linii de bază netede). Acestea, prezintădezavantajul că debitul trebuie frecvent modificat pentru a se menţine cât mai constant, ceea ce la separări de durată pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul se modifică continuu. Se înţelege că orice modificare de debit (datorită viscozităţii sau temperaturii eluentului şi a structurii umpluturii) afectează timpul de retenţie şi totodată semnalul detectorilor, în majoritate sensibili la concentraţie.Pompele cu debit constant nu mai prezintă dezavantajele de mai sus. De-a lungul timpului s-au selecţionat două variante: pompele cu piston (alternative) şi pompele de tip seringă (cu deplasare pozitivă). La primele, cele mai utilizate, mişcarea du-te-vino a pistoanelor şi a supapelor cu bilă permit o funcţionare indefinită dar presupun existenţa unor atenuatoare de pulsaţii - dispozitive care să elimine micile variaţii de debit. Acestea constau dintr-o alternanţă de mai multe rezistenţe, de exemplu tuburi subţiri şi capacităţi - care pot fi incinte cu pereţi elastici, fie chiar manometre.Pompele cu presiune constantă, asemănătoare cu o seringă dar având o capacitate maimare, pompează continuu pe toată durata separării, pistonul deplasându-se cu o viteză liniară constantă dar după fiecare cursă este necesară oprirea debitului şi reumplerea cu solvent a corpului pompei.Deşi solvenţii utilizaţi se degazează pentru a se reduce efectele corozive ale oxigenului, datorită presiunilor ridicate la care se lucrează, coroziunea este totuşi deosebită.

De aceea aceste pompe (corpul, cilindrii, garniturile şi supapele) se execută din materiale rezistente la coroziune: safir, agat, teflon sau aliaje speciale.

Sisteme de introducere a probei

În cazul HPLC injecţia probei trebuie făcută într-un timp cât mai scurt, pentru a nu deranja regimul dinamic al eluentului prin coloană şi detector. Dificultatea provine de lapresiunea ridicată la care lucrează coloana (20mii kPa). Sistemul cel mai utilizat în cromatografele de lichide este ventilul cu 6 căi, numit şi ventil de introducere a probei,prevăzut cu bucle interschimbabile (fig. 3).

Deoarece eluentul aderă la pereţi, pentru completa îndepărtare a sa în momentul alimentării buclei cu probă, este necesară injectarea prin buclă a unui volum de cel puţin de trei ori volumul acesteia, înainte de comutarea pe analiză. Bucla lucrează în două etape. Etapa A (fig. 3-A) în care bucla este umplută cu probă cu ajutorul unei seringi sau în alt mod. Apoi are loc comutarea pe analiză (fig. 3-B) când prin rotire cu 60°, în direcţia acelor de ceasornic, manual sau automat, bucla este parcursă de eluentul de la pompă şi conţinutul acesteia este antrenat în coloană. Volumul probelor pentru coloane obişnuite

(25cmx4.6mm) este de 10-50µl.Evident aceste ventile sunt confecţionate din materiale rezistente la coroziune şi la solvenţi (oţel inoxidabil, tantal, teflon etc).