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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZOcircNIA - INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
LUCIANO RICARDO BRAGA PINHEIRO
Dissertaccedilatildeo apresentada ao programa
Integrado de Poacutes-graduaccedilatildeo em
Biologia Tropical e Recursos Naturais
do convecircnio INPAUFAM como
requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
mestre em CIEcircNCIAS BIOLOacuteGICAS
aacuterea de concentraccedilatildeo em Geneacutetica
Conservaccedilatildeo e Biologia Evolutiva
Manaus _ AM
2007
EXPRESSAtildeO GEcircNICA DIFERENCIAL EM TAMBAQUIS Colossoma macropomum
(Cuvier 1818) EXPOSTOS AO PETROacuteLEO E A HIPOXIA
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZOcircNIA - INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
LUCIANO RICARDO BRAGA PINHEIRO
Orientadora Vera Maria Fonseca de Almeida-Val Dr ordf
Co-orientador Seacutergio Ricardo Nosawa Dr
Fonte financiadora Projeto Piatam III (FINEPPetrobras) FAPEAM PRONEX
(CNPq-FAPEAM)
Dissertaccedilatildeo apresentada ao programa
Integrado de Poacutes-graduaccedilatildeo em
Biologia Tropical e Recursos Naturais
do convecircnio INPAUFAM como
requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
mestre em CIEcircNCIAS BIOLOacuteGICAS
aacuterea de concentraccedilatildeo em geneacutetica
conservaccedilatildeo e Biologia Evolutiva
Bolsista FAPEAM
Manaus - AM
2007
EXPRESSAtildeO GEcircNICA DIFERENCIAL EM TAMBAQUIS Colossoma macropomum
(Cuvier 1818) EXPOSTOS AO PETROacuteLEO E A HIPOXIA
ii
Dedico este trabalho a Analucia Braga
esta que eacute ao mesmo tempo matildee pai e
amiga a pessoa que priorizou a minha
felicidade em detrimento da dela aquela
que faz do meu sucesso suas maiores
conquistas Amo-te muito
iii
Agradecimentos
Agrave Profa Dra Vera Maria Fonseca de Almeida-Val minha orientadora
pela oportunidade confianccedila e amizade Esta que por vezes deixou
de lado a condiccedilatildeo imparcial da academia e me abraccedilou como uma
substituta da minha matildee
Ao Dr Seacutergio Ricardo Nozawa meu co-orientador sua esposa e
colega Mocircnica Nozawa pela paciecircncia e co-orientaccedilatildeo Por terem
sentado agrave bancada comigo e resolvido questotildees que claramente
haviam chegado ao meu limite intelectual
Ao Dr Adalberto Luiacutes Val pelo apoio infra-estrutura e fomento para o
meu projeto de dissertaccedilatildeo sem o qual natildeo seria possiacutevel sua
conclusatildeo
Agrave Dra Gislena Carvalho pela atenccedilatildeo e boa vontade em me atender e
esclarecer minhas inuacutemeras duacutevidas aleacutem da colaboraccedilatildeo na
qualificaccedilatildeo
Agrave minha grande amiga Herciacutelia que nas horas de dificuldade sempre
me estendeu a matildeo Agradeccedilo por ouvir com toda paciecircncia minhas
reclamaccedilotildees ateacute aquelas injustificadas
Ao meu eterno amigo e professor Alexandre Luna Cacircndido aquele
que me fez entrar em contato com a Biologia Molecular e nunca
deixou de acreditar nos seus alunos
iv
Aos companheiros de trabalho e amigos do GCBEV e LEEM
Pessoas maravilhosas muitos dos quais foram meus parceiros de
riso e choro Em especial a Maria de Faacutetima que muito me ajudou no
final dos experimentos me dando apoio quando precisei
Ao Centro Universitaacuterio Nilton Lins Manaus por fornecer o espaccedilo
laboratorial de forma incondicional complementando meus trabalhos
do INPA
Agrave minha famiacutelia que graccedilas a Deus deposita em mim uma confianccedila
inabalaacutevel
Ao Francisco de Assis dos Santos parceiro de conversa e um
grande divisor de aacuteguas na minha vida acadecircmica Antes de
conhececirc-lo nem ao menos sabia o significado do termo mestrado
Agrave minha matildee Pessoa que me orgulha com sua caracteriacutestica
batalhadora e por ser humana e maravilhosamente compreensiva
A Deus eterno pai e senhor
v
Ficha catalograacutefica
Pinheiro Luciano Ricardo Braga
Expressatildeo gecircnica diferencial em TambaquisColossoma macropomum (Cuvier
1818) expostos ao petroacuteleo e a hipoxia
xi - 66p
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA)
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) 2007
1 Expressatildeo gecircnica 2 Petroacuteleo 3 DD RT-PCR 4 Amazocircnia 5Peixes
ldquo permitida a coacutepia total ou parcial deste documento desde que citada a fonte ndash o autorrdquo
vi
RESUMO
A exploraccedilatildeo de petroacuteleo na Bacia Amazocircnica jaacute eacute uma realidade As condiccedilotildees
de pH sedimentos precipitados vegetaccedilatildeo oxigenaccedilatildeo e vazatildeo neste ambiente satildeo
tatildeo peculiares que eacute difiacutecil avaliar com precisatildeo quais os reais impactos de um
vazamento de oacuteleo em aacuteguas interiores na Amazocircnia Neste trabalho o Tambaqui
peixe endecircmico da Bacia Amazocircnica foi avaliado como alternativa de biomarcador de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo Por meio da teacutecnica de DD RT-PCR investigamos o
padratildeo de expressatildeo gecircnica em juvenis de Tambaquis expostos a concentraccedilotildees
subletais e o dobro da concentraccedilatildeo letal de oacuteleo cru nos intervalos de tempo de 3 6
e 12 horas sendo este uacuteltimo tempo o periacuteodo proposto para recuperaccedilatildeo sob
condiccedilotildees de normoacutexia e hipoacutexia Apoacutes os experimentos os animais foram
sacrificados e o fiacutegado imediatamente congelado em nitrogecircnio liacutequido para posterior
extraccedilatildeo do RNA A siacutentese da fita complementar de cDNA foi feita por 3 iniciadores
poli-T ancorados com nucleotiacutedeos terminais CG ou A A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo se
deu combinando os iniciadores poliT com outros 5 iniciadores heteroacutelogos de 13
nucleotiacutedeos O produto amplificado foi revelado em gel de agarose 25 e corado
com brometo de etiacutedium sendo as bandas diferencialmente expressas eluiacutedas e
clonadas com Ecoli com Vetor P-gen easy sistem para posterior sequumlenciamento e
comparaccedilatildeo com bancos puacuteblicos de ESTacutes Foram identificados 4 genes (i) RAG2
(recombination-activating genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR
(glutathione reductase) e (iv) CFTR Os trecircs uacuteltimos estatildeo amplamente reportados
como agentes do processo de desintoxicaccedilatildeo enquanto que o primeiro eacute um
regulador na formaccedilatildeo de ceacutelulas do sistema imune RAG2 e ERK tambeacutem estatildeo
envolvidos em mecanismos de apoptose celular (morte programada da ceacutelula) GR no
processo antioxidante em condiccedilotildees de estresse ambiental e CFTR como regulador
de Caacutelcio em bracircnquias de peixes O meacutetodo de DD RT-PCR mostrou-se eficiente no
processo de identificar vias bioquiacutemicas que habilitem organismos da Bacia
Amazocircnica como biomarcadores de poluiccedilatildeo ambiental causada por petroacuteleo
1
ABSTRACT
Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH
along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and
floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict
all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the
effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species
Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes
between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations
twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours
under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed
and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then
extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with
terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T
primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was
visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium
bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash
Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with
ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating
genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e
(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first
regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell
apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress
exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is
an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the
responses of fish to petroleum exposure
2
IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZOcircNIA - INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
LUCIANO RICARDO BRAGA PINHEIRO
Orientadora Vera Maria Fonseca de Almeida-Val Dr ordf
Co-orientador Seacutergio Ricardo Nosawa Dr
Fonte financiadora Projeto Piatam III (FINEPPetrobras) FAPEAM PRONEX
(CNPq-FAPEAM)
Dissertaccedilatildeo apresentada ao programa
Integrado de Poacutes-graduaccedilatildeo em
Biologia Tropical e Recursos Naturais
do convecircnio INPAUFAM como
requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
mestre em CIEcircNCIAS BIOLOacuteGICAS
aacuterea de concentraccedilatildeo em geneacutetica
conservaccedilatildeo e Biologia Evolutiva
Bolsista FAPEAM
Manaus - AM
2007
EXPRESSAtildeO GEcircNICA DIFERENCIAL EM TAMBAQUIS Colossoma macropomum
(Cuvier 1818) EXPOSTOS AO PETROacuteLEO E A HIPOXIA
ii
Dedico este trabalho a Analucia Braga
esta que eacute ao mesmo tempo matildee pai e
amiga a pessoa que priorizou a minha
felicidade em detrimento da dela aquela
que faz do meu sucesso suas maiores
conquistas Amo-te muito
iii
Agradecimentos
Agrave Profa Dra Vera Maria Fonseca de Almeida-Val minha orientadora
pela oportunidade confianccedila e amizade Esta que por vezes deixou
de lado a condiccedilatildeo imparcial da academia e me abraccedilou como uma
substituta da minha matildee
Ao Dr Seacutergio Ricardo Nozawa meu co-orientador sua esposa e
colega Mocircnica Nozawa pela paciecircncia e co-orientaccedilatildeo Por terem
sentado agrave bancada comigo e resolvido questotildees que claramente
haviam chegado ao meu limite intelectual
Ao Dr Adalberto Luiacutes Val pelo apoio infra-estrutura e fomento para o
meu projeto de dissertaccedilatildeo sem o qual natildeo seria possiacutevel sua
conclusatildeo
Agrave Dra Gislena Carvalho pela atenccedilatildeo e boa vontade em me atender e
esclarecer minhas inuacutemeras duacutevidas aleacutem da colaboraccedilatildeo na
qualificaccedilatildeo
Agrave minha grande amiga Herciacutelia que nas horas de dificuldade sempre
me estendeu a matildeo Agradeccedilo por ouvir com toda paciecircncia minhas
reclamaccedilotildees ateacute aquelas injustificadas
Ao meu eterno amigo e professor Alexandre Luna Cacircndido aquele
que me fez entrar em contato com a Biologia Molecular e nunca
deixou de acreditar nos seus alunos
iv
Aos companheiros de trabalho e amigos do GCBEV e LEEM
Pessoas maravilhosas muitos dos quais foram meus parceiros de
riso e choro Em especial a Maria de Faacutetima que muito me ajudou no
final dos experimentos me dando apoio quando precisei
Ao Centro Universitaacuterio Nilton Lins Manaus por fornecer o espaccedilo
laboratorial de forma incondicional complementando meus trabalhos
do INPA
Agrave minha famiacutelia que graccedilas a Deus deposita em mim uma confianccedila
inabalaacutevel
Ao Francisco de Assis dos Santos parceiro de conversa e um
grande divisor de aacuteguas na minha vida acadecircmica Antes de
conhececirc-lo nem ao menos sabia o significado do termo mestrado
Agrave minha matildee Pessoa que me orgulha com sua caracteriacutestica
batalhadora e por ser humana e maravilhosamente compreensiva
A Deus eterno pai e senhor
v
Ficha catalograacutefica
Pinheiro Luciano Ricardo Braga
Expressatildeo gecircnica diferencial em TambaquisColossoma macropomum (Cuvier
1818) expostos ao petroacuteleo e a hipoxia
xi - 66p
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA)
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) 2007
1 Expressatildeo gecircnica 2 Petroacuteleo 3 DD RT-PCR 4 Amazocircnia 5Peixes
ldquo permitida a coacutepia total ou parcial deste documento desde que citada a fonte ndash o autorrdquo
vi
RESUMO
A exploraccedilatildeo de petroacuteleo na Bacia Amazocircnica jaacute eacute uma realidade As condiccedilotildees
de pH sedimentos precipitados vegetaccedilatildeo oxigenaccedilatildeo e vazatildeo neste ambiente satildeo
tatildeo peculiares que eacute difiacutecil avaliar com precisatildeo quais os reais impactos de um
vazamento de oacuteleo em aacuteguas interiores na Amazocircnia Neste trabalho o Tambaqui
peixe endecircmico da Bacia Amazocircnica foi avaliado como alternativa de biomarcador de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo Por meio da teacutecnica de DD RT-PCR investigamos o
padratildeo de expressatildeo gecircnica em juvenis de Tambaquis expostos a concentraccedilotildees
subletais e o dobro da concentraccedilatildeo letal de oacuteleo cru nos intervalos de tempo de 3 6
e 12 horas sendo este uacuteltimo tempo o periacuteodo proposto para recuperaccedilatildeo sob
condiccedilotildees de normoacutexia e hipoacutexia Apoacutes os experimentos os animais foram
sacrificados e o fiacutegado imediatamente congelado em nitrogecircnio liacutequido para posterior
extraccedilatildeo do RNA A siacutentese da fita complementar de cDNA foi feita por 3 iniciadores
poli-T ancorados com nucleotiacutedeos terminais CG ou A A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo se
deu combinando os iniciadores poliT com outros 5 iniciadores heteroacutelogos de 13
nucleotiacutedeos O produto amplificado foi revelado em gel de agarose 25 e corado
com brometo de etiacutedium sendo as bandas diferencialmente expressas eluiacutedas e
clonadas com Ecoli com Vetor P-gen easy sistem para posterior sequumlenciamento e
comparaccedilatildeo com bancos puacuteblicos de ESTacutes Foram identificados 4 genes (i) RAG2
(recombination-activating genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR
(glutathione reductase) e (iv) CFTR Os trecircs uacuteltimos estatildeo amplamente reportados
como agentes do processo de desintoxicaccedilatildeo enquanto que o primeiro eacute um
regulador na formaccedilatildeo de ceacutelulas do sistema imune RAG2 e ERK tambeacutem estatildeo
envolvidos em mecanismos de apoptose celular (morte programada da ceacutelula) GR no
processo antioxidante em condiccedilotildees de estresse ambiental e CFTR como regulador
de Caacutelcio em bracircnquias de peixes O meacutetodo de DD RT-PCR mostrou-se eficiente no
processo de identificar vias bioquiacutemicas que habilitem organismos da Bacia
Amazocircnica como biomarcadores de poluiccedilatildeo ambiental causada por petroacuteleo
1
ABSTRACT
Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH
along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and
floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict
all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the
effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species
Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes
between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations
twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours
under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed
and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then
extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with
terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T
primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was
visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium
bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash
Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with
ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating
genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e
(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first
regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell
apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress
exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is
an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the
responses of fish to petroleum exposure
2
IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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69
Dedico este trabalho a Analucia Braga
esta que eacute ao mesmo tempo matildee pai e
amiga a pessoa que priorizou a minha
felicidade em detrimento da dela aquela
que faz do meu sucesso suas maiores
conquistas Amo-te muito
iii
Agradecimentos
Agrave Profa Dra Vera Maria Fonseca de Almeida-Val minha orientadora
pela oportunidade confianccedila e amizade Esta que por vezes deixou
de lado a condiccedilatildeo imparcial da academia e me abraccedilou como uma
substituta da minha matildee
Ao Dr Seacutergio Ricardo Nozawa meu co-orientador sua esposa e
colega Mocircnica Nozawa pela paciecircncia e co-orientaccedilatildeo Por terem
sentado agrave bancada comigo e resolvido questotildees que claramente
haviam chegado ao meu limite intelectual
Ao Dr Adalberto Luiacutes Val pelo apoio infra-estrutura e fomento para o
meu projeto de dissertaccedilatildeo sem o qual natildeo seria possiacutevel sua
conclusatildeo
Agrave Dra Gislena Carvalho pela atenccedilatildeo e boa vontade em me atender e
esclarecer minhas inuacutemeras duacutevidas aleacutem da colaboraccedilatildeo na
qualificaccedilatildeo
Agrave minha grande amiga Herciacutelia que nas horas de dificuldade sempre
me estendeu a matildeo Agradeccedilo por ouvir com toda paciecircncia minhas
reclamaccedilotildees ateacute aquelas injustificadas
Ao meu eterno amigo e professor Alexandre Luna Cacircndido aquele
que me fez entrar em contato com a Biologia Molecular e nunca
deixou de acreditar nos seus alunos
iv
Aos companheiros de trabalho e amigos do GCBEV e LEEM
Pessoas maravilhosas muitos dos quais foram meus parceiros de
riso e choro Em especial a Maria de Faacutetima que muito me ajudou no
final dos experimentos me dando apoio quando precisei
Ao Centro Universitaacuterio Nilton Lins Manaus por fornecer o espaccedilo
laboratorial de forma incondicional complementando meus trabalhos
do INPA
Agrave minha famiacutelia que graccedilas a Deus deposita em mim uma confianccedila
inabalaacutevel
Ao Francisco de Assis dos Santos parceiro de conversa e um
grande divisor de aacuteguas na minha vida acadecircmica Antes de
conhececirc-lo nem ao menos sabia o significado do termo mestrado
Agrave minha matildee Pessoa que me orgulha com sua caracteriacutestica
batalhadora e por ser humana e maravilhosamente compreensiva
A Deus eterno pai e senhor
v
Ficha catalograacutefica
Pinheiro Luciano Ricardo Braga
Expressatildeo gecircnica diferencial em TambaquisColossoma macropomum (Cuvier
1818) expostos ao petroacuteleo e a hipoxia
xi - 66p
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA)
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) 2007
1 Expressatildeo gecircnica 2 Petroacuteleo 3 DD RT-PCR 4 Amazocircnia 5Peixes
ldquo permitida a coacutepia total ou parcial deste documento desde que citada a fonte ndash o autorrdquo
vi
RESUMO
A exploraccedilatildeo de petroacuteleo na Bacia Amazocircnica jaacute eacute uma realidade As condiccedilotildees
de pH sedimentos precipitados vegetaccedilatildeo oxigenaccedilatildeo e vazatildeo neste ambiente satildeo
tatildeo peculiares que eacute difiacutecil avaliar com precisatildeo quais os reais impactos de um
vazamento de oacuteleo em aacuteguas interiores na Amazocircnia Neste trabalho o Tambaqui
peixe endecircmico da Bacia Amazocircnica foi avaliado como alternativa de biomarcador de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo Por meio da teacutecnica de DD RT-PCR investigamos o
padratildeo de expressatildeo gecircnica em juvenis de Tambaquis expostos a concentraccedilotildees
subletais e o dobro da concentraccedilatildeo letal de oacuteleo cru nos intervalos de tempo de 3 6
e 12 horas sendo este uacuteltimo tempo o periacuteodo proposto para recuperaccedilatildeo sob
condiccedilotildees de normoacutexia e hipoacutexia Apoacutes os experimentos os animais foram
sacrificados e o fiacutegado imediatamente congelado em nitrogecircnio liacutequido para posterior
extraccedilatildeo do RNA A siacutentese da fita complementar de cDNA foi feita por 3 iniciadores
poli-T ancorados com nucleotiacutedeos terminais CG ou A A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo se
deu combinando os iniciadores poliT com outros 5 iniciadores heteroacutelogos de 13
nucleotiacutedeos O produto amplificado foi revelado em gel de agarose 25 e corado
com brometo de etiacutedium sendo as bandas diferencialmente expressas eluiacutedas e
clonadas com Ecoli com Vetor P-gen easy sistem para posterior sequumlenciamento e
comparaccedilatildeo com bancos puacuteblicos de ESTacutes Foram identificados 4 genes (i) RAG2
(recombination-activating genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR
(glutathione reductase) e (iv) CFTR Os trecircs uacuteltimos estatildeo amplamente reportados
como agentes do processo de desintoxicaccedilatildeo enquanto que o primeiro eacute um
regulador na formaccedilatildeo de ceacutelulas do sistema imune RAG2 e ERK tambeacutem estatildeo
envolvidos em mecanismos de apoptose celular (morte programada da ceacutelula) GR no
processo antioxidante em condiccedilotildees de estresse ambiental e CFTR como regulador
de Caacutelcio em bracircnquias de peixes O meacutetodo de DD RT-PCR mostrou-se eficiente no
processo de identificar vias bioquiacutemicas que habilitem organismos da Bacia
Amazocircnica como biomarcadores de poluiccedilatildeo ambiental causada por petroacuteleo
1
ABSTRACT
Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH
along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and
floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict
all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the
effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species
Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes
between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations
twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours
under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed
and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then
extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with
terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T
primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was
visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium
bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash
Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with
ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating
genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e
(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first
regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell
apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress
exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is
an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the
responses of fish to petroleum exposure
2
IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
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4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
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Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
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A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
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Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
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condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
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baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
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69
Agradecimentos
Agrave Profa Dra Vera Maria Fonseca de Almeida-Val minha orientadora
pela oportunidade confianccedila e amizade Esta que por vezes deixou
de lado a condiccedilatildeo imparcial da academia e me abraccedilou como uma
substituta da minha matildee
Ao Dr Seacutergio Ricardo Nozawa meu co-orientador sua esposa e
colega Mocircnica Nozawa pela paciecircncia e co-orientaccedilatildeo Por terem
sentado agrave bancada comigo e resolvido questotildees que claramente
haviam chegado ao meu limite intelectual
Ao Dr Adalberto Luiacutes Val pelo apoio infra-estrutura e fomento para o
meu projeto de dissertaccedilatildeo sem o qual natildeo seria possiacutevel sua
conclusatildeo
Agrave Dra Gislena Carvalho pela atenccedilatildeo e boa vontade em me atender e
esclarecer minhas inuacutemeras duacutevidas aleacutem da colaboraccedilatildeo na
qualificaccedilatildeo
Agrave minha grande amiga Herciacutelia que nas horas de dificuldade sempre
me estendeu a matildeo Agradeccedilo por ouvir com toda paciecircncia minhas
reclamaccedilotildees ateacute aquelas injustificadas
Ao meu eterno amigo e professor Alexandre Luna Cacircndido aquele
que me fez entrar em contato com a Biologia Molecular e nunca
deixou de acreditar nos seus alunos
iv
Aos companheiros de trabalho e amigos do GCBEV e LEEM
Pessoas maravilhosas muitos dos quais foram meus parceiros de
riso e choro Em especial a Maria de Faacutetima que muito me ajudou no
final dos experimentos me dando apoio quando precisei
Ao Centro Universitaacuterio Nilton Lins Manaus por fornecer o espaccedilo
laboratorial de forma incondicional complementando meus trabalhos
do INPA
Agrave minha famiacutelia que graccedilas a Deus deposita em mim uma confianccedila
inabalaacutevel
Ao Francisco de Assis dos Santos parceiro de conversa e um
grande divisor de aacuteguas na minha vida acadecircmica Antes de
conhececirc-lo nem ao menos sabia o significado do termo mestrado
Agrave minha matildee Pessoa que me orgulha com sua caracteriacutestica
batalhadora e por ser humana e maravilhosamente compreensiva
A Deus eterno pai e senhor
v
Ficha catalograacutefica
Pinheiro Luciano Ricardo Braga
Expressatildeo gecircnica diferencial em TambaquisColossoma macropomum (Cuvier
1818) expostos ao petroacuteleo e a hipoxia
xi - 66p
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA)
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) 2007
1 Expressatildeo gecircnica 2 Petroacuteleo 3 DD RT-PCR 4 Amazocircnia 5Peixes
ldquo permitida a coacutepia total ou parcial deste documento desde que citada a fonte ndash o autorrdquo
vi
RESUMO
A exploraccedilatildeo de petroacuteleo na Bacia Amazocircnica jaacute eacute uma realidade As condiccedilotildees
de pH sedimentos precipitados vegetaccedilatildeo oxigenaccedilatildeo e vazatildeo neste ambiente satildeo
tatildeo peculiares que eacute difiacutecil avaliar com precisatildeo quais os reais impactos de um
vazamento de oacuteleo em aacuteguas interiores na Amazocircnia Neste trabalho o Tambaqui
peixe endecircmico da Bacia Amazocircnica foi avaliado como alternativa de biomarcador de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo Por meio da teacutecnica de DD RT-PCR investigamos o
padratildeo de expressatildeo gecircnica em juvenis de Tambaquis expostos a concentraccedilotildees
subletais e o dobro da concentraccedilatildeo letal de oacuteleo cru nos intervalos de tempo de 3 6
e 12 horas sendo este uacuteltimo tempo o periacuteodo proposto para recuperaccedilatildeo sob
condiccedilotildees de normoacutexia e hipoacutexia Apoacutes os experimentos os animais foram
sacrificados e o fiacutegado imediatamente congelado em nitrogecircnio liacutequido para posterior
extraccedilatildeo do RNA A siacutentese da fita complementar de cDNA foi feita por 3 iniciadores
poli-T ancorados com nucleotiacutedeos terminais CG ou A A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo se
deu combinando os iniciadores poliT com outros 5 iniciadores heteroacutelogos de 13
nucleotiacutedeos O produto amplificado foi revelado em gel de agarose 25 e corado
com brometo de etiacutedium sendo as bandas diferencialmente expressas eluiacutedas e
clonadas com Ecoli com Vetor P-gen easy sistem para posterior sequumlenciamento e
comparaccedilatildeo com bancos puacuteblicos de ESTacutes Foram identificados 4 genes (i) RAG2
(recombination-activating genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR
(glutathione reductase) e (iv) CFTR Os trecircs uacuteltimos estatildeo amplamente reportados
como agentes do processo de desintoxicaccedilatildeo enquanto que o primeiro eacute um
regulador na formaccedilatildeo de ceacutelulas do sistema imune RAG2 e ERK tambeacutem estatildeo
envolvidos em mecanismos de apoptose celular (morte programada da ceacutelula) GR no
processo antioxidante em condiccedilotildees de estresse ambiental e CFTR como regulador
de Caacutelcio em bracircnquias de peixes O meacutetodo de DD RT-PCR mostrou-se eficiente no
processo de identificar vias bioquiacutemicas que habilitem organismos da Bacia
Amazocircnica como biomarcadores de poluiccedilatildeo ambiental causada por petroacuteleo
1
ABSTRACT
Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH
along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and
floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict
all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the
effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species
Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes
between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations
twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours
under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed
and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then
extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with
terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T
primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was
visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium
bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash
Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with
ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating
genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e
(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first
regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell
apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress
exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is
an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the
responses of fish to petroleum exposure
2
IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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69
Aos companheiros de trabalho e amigos do GCBEV e LEEM
Pessoas maravilhosas muitos dos quais foram meus parceiros de
riso e choro Em especial a Maria de Faacutetima que muito me ajudou no
final dos experimentos me dando apoio quando precisei
Ao Centro Universitaacuterio Nilton Lins Manaus por fornecer o espaccedilo
laboratorial de forma incondicional complementando meus trabalhos
do INPA
Agrave minha famiacutelia que graccedilas a Deus deposita em mim uma confianccedila
inabalaacutevel
Ao Francisco de Assis dos Santos parceiro de conversa e um
grande divisor de aacuteguas na minha vida acadecircmica Antes de
conhececirc-lo nem ao menos sabia o significado do termo mestrado
Agrave minha matildee Pessoa que me orgulha com sua caracteriacutestica
batalhadora e por ser humana e maravilhosamente compreensiva
A Deus eterno pai e senhor
v
Ficha catalograacutefica
Pinheiro Luciano Ricardo Braga
Expressatildeo gecircnica diferencial em TambaquisColossoma macropomum (Cuvier
1818) expostos ao petroacuteleo e a hipoxia
xi - 66p
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA)
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) 2007
1 Expressatildeo gecircnica 2 Petroacuteleo 3 DD RT-PCR 4 Amazocircnia 5Peixes
ldquo permitida a coacutepia total ou parcial deste documento desde que citada a fonte ndash o autorrdquo
vi
RESUMO
A exploraccedilatildeo de petroacuteleo na Bacia Amazocircnica jaacute eacute uma realidade As condiccedilotildees
de pH sedimentos precipitados vegetaccedilatildeo oxigenaccedilatildeo e vazatildeo neste ambiente satildeo
tatildeo peculiares que eacute difiacutecil avaliar com precisatildeo quais os reais impactos de um
vazamento de oacuteleo em aacuteguas interiores na Amazocircnia Neste trabalho o Tambaqui
peixe endecircmico da Bacia Amazocircnica foi avaliado como alternativa de biomarcador de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo Por meio da teacutecnica de DD RT-PCR investigamos o
padratildeo de expressatildeo gecircnica em juvenis de Tambaquis expostos a concentraccedilotildees
subletais e o dobro da concentraccedilatildeo letal de oacuteleo cru nos intervalos de tempo de 3 6
e 12 horas sendo este uacuteltimo tempo o periacuteodo proposto para recuperaccedilatildeo sob
condiccedilotildees de normoacutexia e hipoacutexia Apoacutes os experimentos os animais foram
sacrificados e o fiacutegado imediatamente congelado em nitrogecircnio liacutequido para posterior
extraccedilatildeo do RNA A siacutentese da fita complementar de cDNA foi feita por 3 iniciadores
poli-T ancorados com nucleotiacutedeos terminais CG ou A A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo se
deu combinando os iniciadores poliT com outros 5 iniciadores heteroacutelogos de 13
nucleotiacutedeos O produto amplificado foi revelado em gel de agarose 25 e corado
com brometo de etiacutedium sendo as bandas diferencialmente expressas eluiacutedas e
clonadas com Ecoli com Vetor P-gen easy sistem para posterior sequumlenciamento e
comparaccedilatildeo com bancos puacuteblicos de ESTacutes Foram identificados 4 genes (i) RAG2
(recombination-activating genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR
(glutathione reductase) e (iv) CFTR Os trecircs uacuteltimos estatildeo amplamente reportados
como agentes do processo de desintoxicaccedilatildeo enquanto que o primeiro eacute um
regulador na formaccedilatildeo de ceacutelulas do sistema imune RAG2 e ERK tambeacutem estatildeo
envolvidos em mecanismos de apoptose celular (morte programada da ceacutelula) GR no
processo antioxidante em condiccedilotildees de estresse ambiental e CFTR como regulador
de Caacutelcio em bracircnquias de peixes O meacutetodo de DD RT-PCR mostrou-se eficiente no
processo de identificar vias bioquiacutemicas que habilitem organismos da Bacia
Amazocircnica como biomarcadores de poluiccedilatildeo ambiental causada por petroacuteleo
1
ABSTRACT
Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH
along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and
floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict
all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the
effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species
Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes
between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations
twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours
under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed
and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then
extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with
terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T
primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was
visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium
bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash
Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with
ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating
genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e
(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first
regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell
apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress
exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is
an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the
responses of fish to petroleum exposure
2
IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Ficha catalograacutefica
Pinheiro Luciano Ricardo Braga
Expressatildeo gecircnica diferencial em TambaquisColossoma macropomum (Cuvier
1818) expostos ao petroacuteleo e a hipoxia
xi - 66p
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA)
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) 2007
1 Expressatildeo gecircnica 2 Petroacuteleo 3 DD RT-PCR 4 Amazocircnia 5Peixes
ldquo permitida a coacutepia total ou parcial deste documento desde que citada a fonte ndash o autorrdquo
vi
RESUMO
A exploraccedilatildeo de petroacuteleo na Bacia Amazocircnica jaacute eacute uma realidade As condiccedilotildees
de pH sedimentos precipitados vegetaccedilatildeo oxigenaccedilatildeo e vazatildeo neste ambiente satildeo
tatildeo peculiares que eacute difiacutecil avaliar com precisatildeo quais os reais impactos de um
vazamento de oacuteleo em aacuteguas interiores na Amazocircnia Neste trabalho o Tambaqui
peixe endecircmico da Bacia Amazocircnica foi avaliado como alternativa de biomarcador de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo Por meio da teacutecnica de DD RT-PCR investigamos o
padratildeo de expressatildeo gecircnica em juvenis de Tambaquis expostos a concentraccedilotildees
subletais e o dobro da concentraccedilatildeo letal de oacuteleo cru nos intervalos de tempo de 3 6
e 12 horas sendo este uacuteltimo tempo o periacuteodo proposto para recuperaccedilatildeo sob
condiccedilotildees de normoacutexia e hipoacutexia Apoacutes os experimentos os animais foram
sacrificados e o fiacutegado imediatamente congelado em nitrogecircnio liacutequido para posterior
extraccedilatildeo do RNA A siacutentese da fita complementar de cDNA foi feita por 3 iniciadores
poli-T ancorados com nucleotiacutedeos terminais CG ou A A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo se
deu combinando os iniciadores poliT com outros 5 iniciadores heteroacutelogos de 13
nucleotiacutedeos O produto amplificado foi revelado em gel de agarose 25 e corado
com brometo de etiacutedium sendo as bandas diferencialmente expressas eluiacutedas e
clonadas com Ecoli com Vetor P-gen easy sistem para posterior sequumlenciamento e
comparaccedilatildeo com bancos puacuteblicos de ESTacutes Foram identificados 4 genes (i) RAG2
(recombination-activating genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR
(glutathione reductase) e (iv) CFTR Os trecircs uacuteltimos estatildeo amplamente reportados
como agentes do processo de desintoxicaccedilatildeo enquanto que o primeiro eacute um
regulador na formaccedilatildeo de ceacutelulas do sistema imune RAG2 e ERK tambeacutem estatildeo
envolvidos em mecanismos de apoptose celular (morte programada da ceacutelula) GR no
processo antioxidante em condiccedilotildees de estresse ambiental e CFTR como regulador
de Caacutelcio em bracircnquias de peixes O meacutetodo de DD RT-PCR mostrou-se eficiente no
processo de identificar vias bioquiacutemicas que habilitem organismos da Bacia
Amazocircnica como biomarcadores de poluiccedilatildeo ambiental causada por petroacuteleo
1
ABSTRACT
Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH
along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and
floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict
all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the
effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species
Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes
between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations
twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours
under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed
and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then
extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with
terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T
primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was
visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium
bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash
Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with
ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating
genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e
(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first
regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell
apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress
exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is
an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the
responses of fish to petroleum exposure
2
IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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69
RESUMO
A exploraccedilatildeo de petroacuteleo na Bacia Amazocircnica jaacute eacute uma realidade As condiccedilotildees
de pH sedimentos precipitados vegetaccedilatildeo oxigenaccedilatildeo e vazatildeo neste ambiente satildeo
tatildeo peculiares que eacute difiacutecil avaliar com precisatildeo quais os reais impactos de um
vazamento de oacuteleo em aacuteguas interiores na Amazocircnia Neste trabalho o Tambaqui
peixe endecircmico da Bacia Amazocircnica foi avaliado como alternativa de biomarcador de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo Por meio da teacutecnica de DD RT-PCR investigamos o
padratildeo de expressatildeo gecircnica em juvenis de Tambaquis expostos a concentraccedilotildees
subletais e o dobro da concentraccedilatildeo letal de oacuteleo cru nos intervalos de tempo de 3 6
e 12 horas sendo este uacuteltimo tempo o periacuteodo proposto para recuperaccedilatildeo sob
condiccedilotildees de normoacutexia e hipoacutexia Apoacutes os experimentos os animais foram
sacrificados e o fiacutegado imediatamente congelado em nitrogecircnio liacutequido para posterior
extraccedilatildeo do RNA A siacutentese da fita complementar de cDNA foi feita por 3 iniciadores
poli-T ancorados com nucleotiacutedeos terminais CG ou A A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo se
deu combinando os iniciadores poliT com outros 5 iniciadores heteroacutelogos de 13
nucleotiacutedeos O produto amplificado foi revelado em gel de agarose 25 e corado
com brometo de etiacutedium sendo as bandas diferencialmente expressas eluiacutedas e
clonadas com Ecoli com Vetor P-gen easy sistem para posterior sequumlenciamento e
comparaccedilatildeo com bancos puacuteblicos de ESTacutes Foram identificados 4 genes (i) RAG2
(recombination-activating genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR
(glutathione reductase) e (iv) CFTR Os trecircs uacuteltimos estatildeo amplamente reportados
como agentes do processo de desintoxicaccedilatildeo enquanto que o primeiro eacute um
regulador na formaccedilatildeo de ceacutelulas do sistema imune RAG2 e ERK tambeacutem estatildeo
envolvidos em mecanismos de apoptose celular (morte programada da ceacutelula) GR no
processo antioxidante em condiccedilotildees de estresse ambiental e CFTR como regulador
de Caacutelcio em bracircnquias de peixes O meacutetodo de DD RT-PCR mostrou-se eficiente no
processo de identificar vias bioquiacutemicas que habilitem organismos da Bacia
Amazocircnica como biomarcadores de poluiccedilatildeo ambiental causada por petroacuteleo
1
ABSTRACT
Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH
along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and
floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict
all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the
effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species
Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes
between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations
twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours
under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed
and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then
extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with
terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T
primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was
visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium
bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash
Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with
ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating
genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e
(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first
regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell
apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress
exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is
an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the
responses of fish to petroleum exposure
2
IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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ZHANG R TAN Z LIANG P (2000) Identification of a Novel Ligand-Receptor
Pair Constitutively Activated by ras Oncogenes Journal of Biological Chemistry 275(32) 24436ndash24443
69
ABSTRACT
Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH
along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and
floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict
all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the
effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species
Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes
between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations
twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours
under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed
and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then
extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with
terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T
primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was
visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium
bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash
Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with
ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating
genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e
(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first
regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell
apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress
exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is
an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the
responses of fish to petroleum exposure
2
IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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IacuteNDICE
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14
161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4
17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19
Sequumlecircncias 20
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23
3 ndash RESULTADOS 23
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
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1 INTRODUCcedilAtildeO
11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo
Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de
decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao
longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do
petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos
aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural
linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias
ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de
natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias
e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do
petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos
Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois
aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e
atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser
subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do
oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da
combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na
biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo
naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre
aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos
aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do
petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem
4
ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo
2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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2004)
12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica
A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila
sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da
populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos
do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia
nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento
populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19
Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal
com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos
agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante
ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento
baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)
como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda
da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente
marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e
Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do
consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo
dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta
pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para
aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com
derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo
5
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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sediments and caged carp Chemosphere 541675ndash1689
WANG X LI J HE S (2007) Molecular evidence for the monophyly of East Asian
groups of Cyprinidae (Teleostei Cypriniformes) derived from the nuclear
68
recombination activating gene 2 sequences Molecular Phylogenetics and Evolution 42 157ndash170
XUE W WARSHAWSKY D(2005) Metabolic activation of polycyclic and
heterocyclic aromatic hydrocarbons and DNA damage A review Toxicology
and Applied Pharmacology 206 73ndash 93
YANG S LIANG P (2004) Global analysis of gene expression by differential
display J Mol Biotec 27(3) 197-208
ZHANG R TAN Z LIANG P (2000) Identification of a Novel Ligand-Receptor
Pair Constitutively Activated by ras Oncogenes Journal of Biological Chemistry 275(32) 24436ndash24443
69
incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou
industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando
no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado
de excelente qualidade
A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram
realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a
responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente
mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de
exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e
soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada
em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos
(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a
partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na
proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo
eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado
pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem
de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os
royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$
1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)
13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos
Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes
lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A
6
regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s
correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
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correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior
diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA
2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de
transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na
primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo
O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por
sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo
erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo
dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de
renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como
alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes
compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos
capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute
significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de
defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos
Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar
complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto
aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para
expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo
petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a
heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo
bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH
7
oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees
ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees
respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e
diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o
desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de
resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em
longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de
tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a
geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do
petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados
do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os
compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis
que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o
balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda
funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et
al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e
seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos
danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como
os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru
em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al
2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem
certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas
continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas
interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de
35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da
8
concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente
tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
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tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara
no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude
da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com
maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de
sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros
apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas
interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo
em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os
rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos
e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria
de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam
coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no
substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o
derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a
ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes
berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e
arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de
mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de
aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para
colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando
assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O
homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo
Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua
formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que
9
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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69
aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto
o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos
aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a
toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem
interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway
2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais
toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos
como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz
inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas
liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar
no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos
sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os
organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao
conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na
mitigaccedilatildeo de impactos ambientais
14 - O tambaqui como um modelo biomarcador
Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)
o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado
potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para
piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente
distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute
essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de
comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um
peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de
10
gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo
amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe
correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus
(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta
na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de
Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos
rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie
(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens
tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie
(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo
devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de
comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas
durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para
reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que
se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial
reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de
mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia
econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies
altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o
Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)
O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar
as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica
apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees
de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de
captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal
11
1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar
um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou
que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais
significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea
facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se
diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute
et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente
homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica
candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de
ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees
preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e
genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias
inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003
Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da
identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e
com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos
organismos aquaacuteticos
15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular
A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente
100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando
focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de
12
regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
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regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos
vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo
aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern
blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da
abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees
(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero
limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais
recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo
mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda
poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios
especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA
amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de
bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos
uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de
outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta
teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de
interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos
ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes
substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale
et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da
Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial
contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de
variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos
orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de
13
mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999
Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos
de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode
ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo
de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo
das populaccedilotildees expostas ao agente indutor
16 - Objetivos
161 - Objetivo Geral
O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos
transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo
do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para
a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de
monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de
acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema
da bacia amazocircnica
162 - Objetivos Especiacuteficos
a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos
diferentes ambientes da bacia amazocircnica
b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo
de peixes no ambiente amazocircnico
c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias
espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo
14
d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a
diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru
17 - Justificativa
O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da
contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente
insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al
2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do
meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os
indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde
a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de
acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no
ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos
vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras
liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos
pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido
utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e
comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes
(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel
molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)
estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos
organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o
momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de
estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute
15
dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de
se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
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se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo
promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva
(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP
1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias
divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre
possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al
(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser
potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem
conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes
amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar
resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo
petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos
iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias
da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo
de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de
rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas
metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e
adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos
envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes
ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na
bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e
econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram
adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar
as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave
16
toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies
certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente
toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie
aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica
podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com
diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de
Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia
amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser
utilizada como modelo investigativo
2 MATERIAIS E MEacuteTODOS
21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui
Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem
de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo
Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde
foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas
vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada
com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada
em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h
que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da
alimentaccedilatildeo
17
22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo
221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo
A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves
concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob
aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h
e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto
por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de
temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle
foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento
da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em
ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica
em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no
caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua
do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo
procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia
222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido
Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de
Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As
amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas
em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise
18
23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR
231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol
Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido
hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e
centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para
microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex
por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento
garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma
contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra
contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500
microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O
sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de
etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min
Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por
incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-
inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura
da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260
(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)
232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)
Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do
RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa
19
foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na
concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O
RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes
resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo
(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1
microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um
volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees
contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita
complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura
25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al
2000)
Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`
Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar
(cDNA)
233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios
Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido
apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo
tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2
16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de
2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo
20
ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e
Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s
46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C
por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)
Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias
Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`
Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3
TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3
osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3
Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3
Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose
Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC
30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante
de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas
amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi
envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida
revelado
235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas
Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com
agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos
em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL
Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL
21
dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada
uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x
12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento
recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo
de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s
60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de
manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)
com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento
236 ndash Clonagem dos produtos amplificados
Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T
easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram
transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli
competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata
transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB
liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas
transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido
para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl
thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante
sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito
por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o
controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi
utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram
um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas
22
em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou
feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C
237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas
Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de
interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme
instruccedilotildees do fabricante
A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico
MEGA Bace
A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)
para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das
sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em
formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por
BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia
por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas
(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO
3 ndash RESULTADOS
31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose
Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal
(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e
recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A
mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio
dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro
23
Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes
tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3
COacuteDIGO DO
TRATAMENTO
IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS
T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h
de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia
Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no
gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos
24
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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heterocyclic aromatic hydrocarbons and DNA damage A review Toxicology
and Applied Pharmacology 206 73ndash 93
YANG S LIANG P (2004) Global analysis of gene expression by differential
display J Mol Biotec 27(3) 197-208
ZHANG R TAN Z LIANG P (2000) Identification of a Novel Ligand-Receptor
Pair Constitutively Activated by ras Oncogenes Journal of Biological Chemistry 275(32) 24436ndash24443
69
312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1
T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG
BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco
Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta
25
500 pb
1A
1B
1
2
3
3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5
T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG
BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia
26
500 pb
2A
2B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis
27
500pb
3A
3B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo
28
500 pb
4A
4B
12
3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem
29
500pb
500 pb
5A
5B
3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG
Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor
30
500 pb
6A
6B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH
AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50
31
500 pb
7A
7B
3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG
CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG
Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
32
500 pb
8A
8B
T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH
BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco
Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose
33
500 pb
9A
9B
333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os
arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a
Figura abaixo
Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos
diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa
sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs
satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados
satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)
funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum
processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para
determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo
armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que
compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes
em outros bancos de dados da web
EST (NCBI)1500000
AnotaccedilatildeoMYSQL
(banco de dados da NL)
Sim Natildeo
Blast2GOGO
BP MF and CC
Blast2GOBLASTn x
tBLASTx
Mapa metaboacutelico
Files esd do sequenciador
PhredPhrapCAP3
Search Keywords GO gi etc
1
2
3
5
4
6
34
De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AAS E BAUSSANT T BALK L LIEWENBORG B ANDERSEN O K (2000) PAH
metabolites in bile cytochrome P4501A and DNA adducts as environmental risk
parameters for chronic oil exposure a laboratory experiment with Atlantic cod
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De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um
resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme
mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo
Oligo
dTX
13mers
Relaccedilatildeo com o banco de
EST(Blast X)
Homologia Paracircmetros de expressatildeo
Oxigecircnio
dissolvido
Concentraccedilatildeo
de petroacuteleo
Tempo de
exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB1 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC PAI2 Natildeo
encontrada
- - x -
dTC MOB5 GR 71 x - -
dTG OSTEO CFTR 75 x x x
dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo
indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo
natildeo interferiu
De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos
MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a
oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de
exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente
coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco
de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os
esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo
Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs
Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva
para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de
maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de
hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui
estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees
de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST
tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para
35
o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel
por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com
mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou
controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas
de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos
1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento
alinhado
e-value
gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122
gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119
gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118
gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117
gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117
gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117
gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116
gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116
gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115
gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114
gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114
gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114
Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2
BLASTX
gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]
Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122
Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
36
118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 326
gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]
Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]
Length Score bits Expect 429 398 1102 7e-119
Identities = 204209 (97) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
115 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 174
37
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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69
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
175 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 234
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE
295 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 323
gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]
Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118
Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324
gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]
Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)
2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181
ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR
118 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177
38
182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361
PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT
178 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 237
362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541
Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV
238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297
542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628
SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE
298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326
39
Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico
Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a
funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute
complexa
40
V(D)J recombinationGO 0033151
Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562
Somatic cell DNA recombinationGO 00016444
DNA recombinationGO 0006310
Somatic diversification of immune receptors
GO 0002200
DNA metabolic processGO 0006259
Immune system development GO 0002520
Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process
GO0006739
Biopolymer Metabolic processes GO
00043283
System developmentGO 0048731
Immune System process
GO 0002376
Cellular metabolic process
GO 0044237
Primary metabolic Process
GO 0044238
Macromolecule metabolic process
GO 0043170
Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856
Multicellular organismal development GO 0007275
Cellular ProcessGO 0009987
Metabolic ProcessGO 0008152
Developmental ProcessGO 0032502
Multicellular organismal process
GO 0032501
Biological ProcessGO 0008150
allall
Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel
2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
Blastx
dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]
Length Score bits Expect 369 122 307 2e-32
Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]
Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32
Identities = 6595 (68) Positives = 6795 (70)
65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244
P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ
16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75
245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349
RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV
76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110
41
Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas
42
Mapa metaboacutelico natildeo identificado
3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os
seguintes resultados
BlastX
Acesso
GeneBank
Espeacutecie de
homologia
Tamanho do
fragmento
alinhado
e-value
ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25
emb|CAG083131| Tetraodon
nigroviridis
101 2e-20
gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20
ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20
Tabela 5 Valores de Blast X para GR
ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]
Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25
Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)
23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202
M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT
1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60
203 STHAEYLHDH 232
STHAEYLHDH
61 STHAEYLHDH 70
62
emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]
Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205
+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +
6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65
43
206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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206 THAEYLHDHA 235
HAEYLHDH+
66 VHAEYLHDHS 75
gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]
Length Score bits Expect 524 994 246 6e-20 Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127
ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]
Length Score bits Expect 522 994 246 6e-20
Identities = 5074 (67) Positives = 6174 (82) Gaps = 074 (0)
14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193
G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM
54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113
194 WNTSTHAEYLHDHA 235
WNT+ H+E++HDHA
114 WNTAVHSEFMHDHA 127
Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico
44
45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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45
Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Mapa metaboacutelico
46
4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados
BlastX
ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)
Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN
203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295
dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44
Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0)
1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN
115 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 174
181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG
175 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 207
ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member
Length Score bits Expect 1358 145 366 7e-34
Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180
+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN
10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69
47
181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279
Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG
70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103
Gene Ontology funccedilatildeo molecular
48
Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Gene ontology processo bioloacutegico
49
50
4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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4 DISCUSSAtildeO
Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos
baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo
transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases
(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se
mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo
ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para
investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de
quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo
comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo
(Duncan 1998 Matsuo 2004)
A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash
PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior
sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-
obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)
relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo
de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da
documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de
agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a
proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C
no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo
em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a
sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de
37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a
temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o
ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo
contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada
variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas
temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de
ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo
a possibilidade de resultados natildeo repetitivos
51
Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser
identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo
apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No
presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo
apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este
resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade
de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de
ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes
animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental
Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em
tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram
analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto
natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-
PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute
uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes
expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia
Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm
sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de
genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em
especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir
novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo
termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos
experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes
importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo
A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da
Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs
aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da
aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de
procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo
eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes
52
A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo
identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR
elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete
clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a
contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a
mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune
Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do
desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a
tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear
processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos
receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas
por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em
humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene
homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma
independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o
mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes
satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de
rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um
homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a
formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da
expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou
que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos
linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces
provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos
explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de
oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a
expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por
hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T
conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma
situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos
com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia
53
Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo
mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo
celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico
e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em
mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de
eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o
processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral
metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas
transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso
de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo
ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para
outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com
respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento
montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as
concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com
hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey
et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por
hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk
Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu
mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo
oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo
de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas
expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido
dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No
entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada
quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute
importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente
associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a
hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante
da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio
volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais
livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres
principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em
54
condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
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condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os
produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene
GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode
ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo
exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de
contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos
cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo
de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback
negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para
a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada
tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro
deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido
nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso
apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador
claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR
associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et
al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute
uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um
passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com
fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse
O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)
CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de
cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A
literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de
salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies
eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo
satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos
estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia
parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para
usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie
migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de
seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas
das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com
55
baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees
satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito
embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo
osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute
expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece
nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia
prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica
possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos
dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que
alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)
Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos
com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste
gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste
trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que
eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande
quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al
2002)
4 ndash CONCLUSAtildeO
A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes
induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre
as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos
de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de
contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo
satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e
hipoacutexia
56
5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o
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nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp
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possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante
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dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra
caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das
bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de
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contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em
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