Embed Size (px)
Citation preview
25/9/2012
1
Danos em DNA e Reparo
Pesquisadores do IQ
Danos em DNA e Reparo
Prof. Paolo Di Mascio
Profa. Marisa H. G. Medeiros
Prof. Nadja C.S.P. Lardner
25/9/2012
2
DNA damaging agents • High energy sources
– UV-light, X-rays,
– Radioactive material
• Chemical agents – Benzenes, aldehydes (cigarette smoke)
– Alkylating agents (ethylmethane sulfonate = EMS)
– PAHs and HAs (agents formed by heating food) • PAH = polycyclic aromatic hydrocarbon
• HAs = heterocyclic amines
– N-nitroso compounds, nitrosamines (food additives)
– Numerous pesticides, insecticides, fungicides
• Natural mutagens – viruses
– plant alkaloids, plant toxins, aflatoxin B1 (AFB1)
25/9/2012
3
DNA Oxidation
Society For Free Radical Biology and Medicine Schafer 5
Components of
DNA and RNA
Pyr imidines:
Pur ines
thymine
HN
NH
O
O
CH3
cytosine
N
NH
O
NH2
5-methylcytosine
N
NH
O
NH2
CH3
uraci l
HN
NH
O
O
N
NH
H
N
N
NH2
H
adenine
N
NH
H
HN
N
O
H2N
guanine
bases
sugars
HO
OH
OCH2
H
OH
H
H
-D-2-Deoxyr ibose
HO
OH
OCH2
H
OH
H
OH
-D-Ribose
phosphate back bone
Lesões espontâneas: Desaminação de Bases
25/9/2012
4
Lesões espontâneas: Desaminação de Bases
DNA uracil arises by hydrolytic deamination 100–500 times per human cell per day…
Lesões espontâneas: Depurinação e Despirimidinação
• Perda de purinas e pirimidinas do DNA
Aproximadamente 10 000 purinas são perdidas por geração
celular em mamíferos.
Sítio Abásico
25/9/2012
5
Danos oxidativos em DNA
PHOTOSENSITIZATION IONIZING RADIATION OXIDATIVE METABOLISM
UV LASER PULSES XENOBIOTICS
1) Bases Modificadas (oxidadas e adutos)
2) Quebras de fita simples e dupla
3) Cross-links DNA-Proteína
4) Formação de dímeros
MORTE CELULAR MUTAÇÃO CANCER ENVELHECIMENTO
1O2 - e- HO H2O2 O2
Sítios preferenciais de modificação
Guanina
R
R
R
Timina
R
R
R
-
1'4'
3'2'
NH
N
O
NH2
1
8
76
23
4
5
9
N
NO
O
P O CH2O
O
PO
O
O
O CH2
-
4
53
2 61
CH3
O
O N
HN
1'4'
3'2'
O
OH
5’
Quebra de fita
8-OHG FAPyG
Timina glicol 5OH-metil-uracil
25/9/2012
6
O2
O2- DNA
H2 O2
SOD Metais livres
(FeIII, CuII)
H O
ONOO-
NO
NO2
Radiações
Ionizantes
ROO /RO
Aldeídos ROS/RNS
H-O-H
H
Base e- + Base +
1) A-Oxidação de Bases
Adapted from: von Sonntag C. (1987)
The Chemical Basis of Radiation Biology.
Taylor & Francis London, NY.
HO• attack on purines
N
NH
N
HN
O
H2N H
Guanine
+ HO.
.N
NH
N
HN
O
H2N H
OH
.N
NH
N
HN
O
H2N HOH
1
23
4
56
7
89
.N
NH
N
HN
O
H2N HHO
Adenina
FAPy-G
HN
N
OHN
O
NHH2N
H
Redução
8-OH-G
HN
N
O
N
N
OH
H2NH
Oxidação
8-OH-G é produto comum de várias espécies reativas
incluindo o oxigênio singlete
25/9/2012
7
Adapted from: von Sonntag C. (1987)
The Chemical Basis of Radiation Biology.
Taylor & Francis London, NY.
HO• attack on pyrimidines
reducing
oxidizing
12
34
5
6
Thymine
HN
NH
O
O
CH3
H
+ HO.
HN
NH
O
O
CH3
H
OH
.
HN
NH
O
O
CH3
HOH
.
HN
NH
O
O
CH2
H
.
HN
N
OOH
HOH
O
dR
timina glicol
HN
N
OOH
HH
O
dR
5-hidroxi-6-hidrotimina
60%
30%
10%
Citosina
1) A-Oxidação de Bases
NH
N
OOH
HOH
O
dR
timina glicol
N
N
NH
N
O
O
NH2
H
dR
8-oxodG
NH
N
O
CH2OH
O
dR
5-hidroximetiluracila
N
N
NH2
OHO
dR
6-hidroxi-5,6-dihidrocitosina
NH
N
OOH
O
dR
5-hidroxiuracila
NH
N
OOH
H
H
OHO
dR
uracila glicol
N
N
N
N
O
NH2
H
dR
8-oxodA
N
N
NH2
O
dR
OH
5-hidroxi-desoxicitidina
1) A-Oxidação de Bases
(>80 lesões identificadas)
25/9/2012
8
COOH
PUFA
O O
O OH
LPO
O
O
COOH
OOH
COX
Proteins
Carbohydrates
Other compounds
MDA
N
N
NN
N
dR
O
HN
NN
N
dR
HN
O
M1G M1A
DNA Proteins
PUFA-OOH
N -(2-propenal)lysine
Lys N O
LysLys NH
N
1-amino-3-iminopropene
Lys N
CHO
CH3
CHO
Lys N
CHO
CHO
NLys
dihydropyridinelysine
pyridyl–dihydropyridine
Metal ions, other oxidants Arachdonic acid
1) B: Formação de adutos de DNA
25/9/2012
9
DNA Oxidation Society For Free Radical Biology and Medicine
Schafer 17
2) Quebra de Fita
DNA single strand breaks result because of the collapse of the
sugar. They are the most common damage inflicted by ROS.
.O
4'
Base
sugar
P
O
O O
O
CH2O N
- -
OCH2 N O
Base
sugar
OCH2 N
Base
sugar
OP
O PP
OP
PO O
O
CH2O N
Base
sugar
R RH
3) DNA-Protein-Crosslinking (DPC): Tirosina
Produced by UV Light or HO• Attack
+
HN
NO
O
DNA
H
CH2
Tyr
OH
CH2
Protein
OH
CH2
Protein
HN
NO
O
CH2
DNA
H
ThyHN
NO
O
DNA
H
CH2
OH
CH2
Protein
H
CH2
H
DNA
O
O N
HN
OH
CH2
Protein
H
H+-e--
Action spectrum for the
relative induction of DNA-
protein crosslinks by UV
and visible radiations
Peak GJ, Peak M J, Sikorski RS,
Jones CA. (1985) Photochem
Photobiol. 41:295-302.
25/9/2012
10
N
N
N
N H
O
N H 2
s s D N A
N H O
N H
K K
N
N
N
N H
O
N H 2
s s D N A
N
N
N
N H
O
N H 2
ss D N A
N H O
N H 2
K K
- e -
+.
TGT A B
Nucleophilic addition of a free amino group at C8 of the guanine radical cation
(Perrier et al, JACS, 2006)
8
3) DNA-Protein-Crosslinking (DPC): Lisina
Formação de Dímeros induzida por UV:
Dímeros de TIMINA
25/9/2012
11
N
N O
N H 2 N H 2
O N
N N
N O
N H 2 N H 2
O N
N N
N O
N H 2
N
N O
N H 2
N
N O
N H 2
N
N O
N H 2
N
N O
N H 2 N H 2
O N
N
O H
H N
N O
O O
O N
N H
water (deamination)
UVB/UVC UVB
UVB/UVC UVB/UVC
cyclobutane dimer
UU cyclobutane dimer cytosine hydrate
CC sequence (6-4) photoproduct
Dewar valence isomer
Formação de Dímeros induzida por UV:
Dímeros de CITOSINA
Consequências dos danos ao DNA por espécies reativas?
25/9/2012
12
CONSEQUÊNCIAS A LONGO PRAZO
Envelhecimento Cancer Doenças
REPARO DE DNA
CONSEQUÊNCIAS A CURTO PRAZO
CRESCIMENTO E METABOLISMO ANORMAIS
Disfunção Fisiológica
MORTE CELULAR
Proliferação
celular diminuída
Sinalização celular
defeituosa
Expressão de
genes/proteínas
prejudicados
Instabilidade
Genômica
DNA DAMAGE
SFRBM Education Program Herbert/Mistry 23 DNA Oxidation: Repair 5/2003
Transição substituição de uma purina por
outra purina ou de uma pirimidina por outra
pirimidina G----C A----T
A----T G----C
Transversão substituição de uma purina
por uma pirimidina ou de uma pirimidina por
uma purina G----C T----A
A----T C----G
Oxidação pode resultar em MUTAÇÕES
25/9/2012
13
DNA Oxidation Society For Free Radical Biology and Medicine
Schafer 25
Pareamento errôneo
(GC AT transversion).
N
N
O
H2N
HN N
N O
H
H
N
N
O
H2N
HN N
N OHH
N
NH
HHN
N
OH2N
NN
O
H
H
HH
H
N
NN
Adenine
8 OH-Gua (enol) 8 oxo-Gua (keto)
Basepairs
A T
G C
8 OHdG A
8 OH-Gua
8-hydroxyguanine
Exemplo: Oxidação de Guanina formando 8-OH-G (oG)
REPARO DE DNA
1) Reparo direta do dano: Ex. Reparo de Dímeros
2) Reparo de bases oxidadas antes da incorporação no DNA
3) Reparo por Excisão de Bases e Nucleotídeos (BER e NER)
4) Reparo de Pareamento Errôneo (Mismatch Repair)
5) Reparo de Quebra de Fita Dupla
25/9/2012
14
Friedberg 2003 DNA damage and Repair. Nature 421, 436
1) Reparo direta do dano: Ex. Reparo de Dímeros
EMBO reports (2003) 4, 479 – 483
doi:10.1038/sj.embor.embor838
2) Reparo de bases oxidadas antes da incorporação no DNA
25/9/2012
15
Friedberg 2003 DNA damage and Repair. Nature 421, 436
3) Reparo por Excisão de Bases e Nucleotídeos (BER e NER)
4) Reparo de Pareamento Errôneo (Mismatch Repair)
Glicosilase
Endonuclease
Polimerase
Ligase
25/9/2012
16
5) Reparo de Quebra de Fita Dupla
Homologous Recombination (HR)
Non-Homologous
End-Joining
(NHEJ)
Reparo de 8-OH-G (oG)
MutM
(bactéria)
DNA glicosilase
MutT
(bactéria)
25/9/2012
17
Como monitorar danos em DNA?
• Medidas de quebra de fita (Métodos: ensaio cometa, ensaio usando
plasmídeos, etc. Tabela 5.10 p. 310)
• Medida de fragmentação da desoxiribose (Métodos: medida de
MDA)
• Medida de oxidação de bases modificadas (bases oxidadas e adutos) (Métodos: medida de 8-oxodG por HPLC-detector eletroquímico e
HPLC-MS/MS)
“O ideal é avaliar diferentes danos”
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/cancer-research/learning-center/cancer-research-protocols/comet-assay.html
25/9/2012
18
Artefatos?
• Medida de 8-oxodG
- Níveis são dependentes do ambiente em que a lesão é gerada (estado redox e quantidade de metais).
- 8-oxodG pode sofrer novas oxidações
- 8-oxodG pode ser gerado durante o processo de isolamento (fenol contem metais), hidrólise de DNA (exposição a [O2] e metais livres) e análise (reações de derivatização
para CG)
Como prevenir artefatos?
• Evitar uso de fenol na extração
• Adicionar antioxidantes (ex. BHT) e quelantes (ex. DTPA, Desferal) nas amostras
• Extrair sob nitrogênio
